CN113322189B - 一株不产毒的黄曲霉HuBXY33及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株不产毒的黄曲霉HuBXY33及其应用，特别涉及微生物技术领域。本发明提供了一株不产毒的黄曲霉HuBXY33，所述黄曲霉HuBXY33的保藏编号为CCTCC NO:M 2020519。本发明所述黄曲霉HuBXY33不产黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素，是一株安全性高、繁殖能力强的生防菌株，具有高效的竞争抑制产毒黄曲霉菌生长、繁殖和产毒能力，能够显著降低花生等农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素的含量。

Description

一株不产毒的黄曲霉HuBXY33及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株不产毒的黄曲霉HuBXY33及其应用。

背景技术

黄曲霉(Aspergillus flavus)侵染农作物后能产生黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)、黄曲霉震颤毒素(Aflatrem)、杂色曲霉毒素(Sterigmatocystin，ST)等有毒次生代谢产物，严重威胁消费安全和人民生命健康。黄曲霉毒素具有急慢性毒性，可致癌、致畸、致突变，是迄今为止发现的污染农产品毒性最大、致癌力最强的一类真菌毒素。黄曲霉震颤素是一种吲哚二萜类真菌毒素，具有致肿瘤特性和急性神经毒性效应，会引起动物震颤。杂色曲霉毒素是黄曲霉合成黄血霉毒素过程后期的中间产物，因结构与黄曲霉毒素相似，因此其毒性和致癌性受到世界各国的高度重视。我国地处黄曲霉毒素污染较严重地区，花生、玉米、大米、坚果等农产品及食品中均有报道检出，且存在与黄曲霉震颤素、杂色曲霉毒素等混合污染现象，威胁我国农产品消费安全、限制产业发展和出口贸易。其中，花生、玉米最易受黄曲霉侵染和黄曲霉毒素等真菌毒素污染。因此，研究农产品黄曲霉污染的田间防控，从源头降低黄曲霉侵染及其产生的真菌毒素污染，对保障我国农产品质量安全和提升我国农产品国际竞争力具有重要意义。

生物防控具有不破坏农产品原有品质，安全高效、环境友好等优点，是黄曲霉及黄曲霉毒素绿色控制的有效途径。利用不产毒的黄曲霉菌来竞争抑制田间产毒黄曲霉菌生长、繁殖，从而减少产毒菌菌群数量，降低黄曲霉毒素污染水平，是源头控制花生、玉米等农产品中黄曲霉毒素污染非常有效的生物防治方法。我国对不产毒黄曲霉生防菌的研究处在起步阶段，尚无在田间成功推广应用的案例。现有报道的用作生物防治的不产毒黄曲霉及其用途(如CN 110157626 A、CN 110305796 A、CN 110129212 A、CN 107177516、CN104789480 A)，只是针对不产生黄曲霉毒素，田间应用后可能带来黄曲霉震颤素、杂色曲霉毒素等真菌毒素污染风险。因此，筛选、开发与利用不产黄曲霉毒素、黄曲霉震颤毒素、杂色曲霉毒素等多种真菌毒素的安全性高的黄曲霉，于农作物收获前进行毒素污染防控，在有效降低黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素、杂色曲霉毒素等进入食物链风险，提高农产品质量安全水平方面具有广阔的应用前景。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株不产毒的黄曲霉HuBXY33及其应用。本发明所述黄曲霉HuBXY33是一株不产黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素的生防菌株，具有安全性高、广谱性和繁殖能力强的优势，能够显著降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素等真菌毒素的含量。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株不产毒的黄曲霉(Aspergillus flavus)HuBXY33，所述黄曲霉HuBXY33的保藏编号为CCTCC NO:M 2020519。

优选的，所述黄曲霉HuBXY33不产黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素。

优选的，所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁和黄曲霉毒G₂。

本发明提供了上述的黄曲霉HuBXY33在竞争抑制产毒黄曲霉菌产毒素中的应用。

优选的，所述毒素包括黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素。

本发明提供了上述的黄曲霉HuBXY33在降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素污染中的应用。

优选的，所述农产品包括花生和玉米等。

本发明提供了一种降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素污染的方法，包括以下步骤：

利用上述的黄曲霉HuBXY33的悬浮液进行灌根处理。

优选的，所述黄曲霉HuBXY33的悬浮液的分生孢子浓度为1×10³～1×10⁶个/ml，用量为70～100L/亩。

本发明提供了一种黄曲霉的产毒抑制剂，所述抑制剂包括上述的黄曲霉HuBXY33；所述黄曲霉HuBXY33的分生孢子浓度为1×10³～1×10⁶个/ml。

有益效果：一株不产毒的黄曲霉(Aspergillus flavus)HuBXY33，所述黄曲霉HuBXY33的保藏编号为CCTCC NO:M 2020519。本发明所述菌株能够显著降低花生等农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素的含量，具有安全性高、广谱性、繁殖力强的优势。实验结果显示，本发明所述菌株对标准菌株3.4408(公开于《利用PCR-RFLP方法鉴别黄曲霉毒素产毒菌株》，中国农业科学，2014，购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心)以及不同花生产地分离出来的产毒黄曲霉的黄曲霉毒素抑制效果好；培养5天菌落直径为7.57cm，产孢量为5.0×10⁸个；经产毒能力测定，结果为不产黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素。由此可以看出，本发明所述菌株是一株安全性高、竞争优势强的生防菌株，能显著抑制产毒黄曲霉侵染农产品、降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素等真菌毒素污染。

附图说明

图1为黄曲霉HuBXY33在DG-18培养基及AFPA培养基背面菌落形态，其中A为黄曲霉HuBXY33在DG-18培养基背面菌落形态，B为黄曲霉HuBXY33在AFPA培养基背面菌落形态；

图2为不同分生孢子浓度的黄曲霉HuBXY33对产毒黄曲霉AFT及AFB₁的抑制率，其中不产毒菌为黄曲霉HuBXY33，产毒菌为黄曲霉标准菌株3.4408，AFT为黄曲霉毒素总量，AFB₁为黄曲霉毒素B₁；且图2中A为不同分生孢子浓度的黄曲霉HuBXY33对产毒黄曲霉AFT的抑制率，B为不同分生孢子浓度的黄曲霉HuBXY33对产毒黄曲霉AFB₁的抑制率。

生物保藏信息

黄曲霉(Aspergillus flavus)HuBXY33，于2020年9月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020519。

具体实施方式

本发明提供了一种不产毒的黄曲霉(Aspergillus flavus)HuBXY33，所述黄曲霉HuBXY33的保藏编号为CCTCC NO:M 2020519。本发明所述黄曲霉HuBXY33的来源优选为湖北襄阳花生种植地。

本发明所述黄曲霉HuBXY33是从分离自我国不同花生产区的1600株黄曲霉中通过菌株产毒能力评价以及竞争抑制效果试验筛选而出；对1600个菌株进行黄曲霉毒素产毒能力测定后，选择97株不产黄曲霉毒素的黄曲霉，分别在花生籽粒、花生粉末两种基质上与标准菌株3.4408以及8株不同地区分离出的产毒黄曲霉进行共培养和产毒抑制效果评价后筛选获得的1株不产黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素以及杂色曲霉毒素等次生代谢产物的不产毒黄曲霉。

本发明所述黄曲霉HuBXY33的ITS基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.1所示：

TTTCCTCCGCCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAGATTGATTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAGAGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCAGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTCACCCTACGGAAGGATCATTACCGAGTGT。

本发明黄曲霉HuBXY33的ITS基因序列与黄曲霉菌(Aspergillus flavus)18S核糖体RNA基因序列的相似性99.51％。

本发明所述黄曲霉HuBXY33的钙调蛋白的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.2所示：

TTTTTCTTTAGGCCGATTTTTTTACTGAAGAACAGGTCTCCGAGTACAAGGAGGCCTTCTCCCTATTCGTAAGTAGTTATCGTCGTTCGTGAAAATTGGTTTTGTTAGTCGTCATGATTTGAACACAAGCTGACTTGGCTTTTCTTGGGTTTCCTATAGGACAAGGACGGTGATGGTTAGTACAGTTTATTTTATTCATTCTCCCTTCAAATGCGATCAATATGTTTTAGCCGCCATAATTTTATCCAGTTTCTGTTCGATCGGCTGAAGTCTTGGCATTGATGAATTGACTTGATATGCAGGCCAGATCACCACCAAGGAGTTGGGCACTGTCATGCGCTCTCTGGGCCAAAACCCCTCTGAGTCGGAACTCCAGGACATGATTAACGAGGTTGACGCCGACAACAATGGCACCATTGACTTCCCTGGTACGAGACGGCTTCCGTACGATTCATAAATGAAATAGCTGTTAATGTTCAAATAGAGTTCCTTACGATGATGGCGAGAAAGATGAAGGATACCGACTCTGAGGAGGAGATCCGGGAGGCTTTCAAGGTTTTCGACCGCGATAACAACGGCTTCATCTCCGCTGCCGAATTGCGCCACGTCATGACCTCCATCGGCGAGAAGCTTACCGATGATGAAGTTGATGAGATGATCCGCGAGGCGGATCAGGATGGTGACGGCCGGATTGACTGTACGTTTCGCGAAGCCCACCCAGACCCATTGCGGCTGTAAAAATGGTGATACTGACCGATTTTAGACAACGAGTTTGTCCAACTAGGAATGCAAAAAAACAGGTTGGGGGA。

本发明所述黄曲霉HuBXY33的钙调蛋白基因序列与黄曲霉菌(Aspergillusflavus)钙调素A基因序列的相似性98.60％。

本发明所述黄曲霉HuBXY33的菌落形态优选为：在PDA培养基上产生白色菌丝和绿色孢子；在DG-18培养基上长出黄绿色孢子；在AFPA培养基上背面呈亮橙色的特征性菌落，根据形态学和分子生物学鉴定结果，本发明提供的黄曲霉HuBXY33为黄曲霉(Aspergillusflavus)。

本发明提供的黄曲霉HuBXY33优选不产黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素，具有快速生长和繁殖的特点；所述黄曲霉毒素优选包括黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁和黄曲霉毒G₂；而且本发明所述黄曲霉HuBXY33能高效的竞争抑制产毒黄曲霉菌产毒，具有降低花生等农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素含量的能力。

本发明实施例优选此采用ITS扩增引物对和/或钙调蛋白编码基因扩增引物对鉴定上述黄曲霉HuBXY33；所述ITS扩增引物对包括上游引物ITS1和下游引物ITS4；所述上游引物ITS1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；所述下游引物ITS4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示：TCCTCCGCTTATTGATATGC；所述钙调蛋白编码基因扩增引物对包括上游引物CF1和下游引物CF4，所述上游引物CF1的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示：AGGCCGAYTCTYTGACYGA；所述下游引物CF4的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示：TTTYTGCATCATRAGYTGGAC；所述ITS扩增引物对和钙调蛋白编码基因扩增引物对优选由北京擎科生物科技有限公司武汉分公司合成。本发明所述引物组中ITS扩增引物对能够用于扩增全部真菌ITS区和5.8S rDNA，是真菌通用鉴定引物，可区分同属不同种的变异；本发明所述引物组中钙调蛋白编码基因扩增引物对能够用于扩增钙调蛋白编码基因，能够更有效区分黄曲霉(Aspergillus flavus)、集峰曲霉(Aspergillus nomius)、溜曲霉(Aspergillustamarii)这三种真菌。

在本发明实施例中，鉴定黄曲霉HuBXY33的方式优选包括以下步骤：

以黄曲霉HuBXY33基因组DNA为模板，与上述引物组混合后，进行PCR。

在本发明实施例中，所述PCR的程序优选包括：94℃预变性5min；94℃变性30s，57～58℃退火30s，72℃延伸30s～60s，35个循环；72℃延伸10min。在本发明中，当模板与ITS扩增引物对混合时，PCR的反应程序优选为94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；所述PCR的反应体系以50μL计，优选包括1μL模板DNA、上游引物ITS11μL、下游引物ITS4 1μL，PCR Mix 25μL和余量的双蒸水；所述上游引物ITS1和下游引物ITS4的工作浓度优选均为10μM；当模板与钙调蛋白扩增引物对混合时，PCR的反应程序优选为94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s(1min)，35个循环；72℃延伸10min；所述PCR的反应体系以50μL计，优选包括1μL模板DNA、上游引物CF1 1μL、下游引物CF4 1μL、PCR Mix25μL和余量的双蒸水；所述上游引物CF1和下游引物CF4的工作浓度优选均为10μM。

本发明提供了上述黄曲霉HuBXY33在竞争抑制产毒黄曲霉菌产毒素中的应用。在本发明中，所述毒素包括黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁和黄曲霉毒素G₂。

本发明提供了上述黄曲霉HuBXY33在降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素污染中的应用。在本发明中，所述农产品优选包括花生和玉米等。本发明所述黄曲霉HuBXY33的分生孢子浓度在5×10²～5×10⁵个/ml的情况下，黄曲霉HuBXY33对黄曲霉标准菌株3.4408的抑制率为43.9％～96.4％，，花生盆栽试验(盆栽面积0.3m²，每盆4株花生，按80L/亩用量，每株9mL浓度为1×10⁶个/mL的分生孢子悬浮液于花生根际处灌根处理)对AFT、AFB₁的产毒抑制效果显著，抑制率分别为60.8％、72.5％，本发明所述黄曲霉HuBXY33能够降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素等真菌毒素的含量。

本发明提供了一种降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素污染的方法，包括以下步骤：

利用上述的黄曲霉HuBXY33的悬浮液进行灌根处理。

本发明所述农产品包括花生；所述黄曲霉HuBXY33的悬浮液的分生孢子浓度优选为1×10³～1×10⁶个/ml，更优选为1×10⁴～1×10⁶个/ml，最优选为1×10⁶个/ml；所述黄曲霉HuBXY33的悬浮液用量优选为70～100L/亩，更优选为76～95L/亩，最优选为80L/亩；所述黄曲霉HuBXY33的悬浮液的灌根处理的时间优选为花生开花下针期。

本发明提供了一种黄曲霉的产毒抑制剂，所述抑制剂包括上述黄曲霉HuBXY33。本发明所述黄曲霉HuBXY33的分生孢子浓度优选为1×10³～1×10⁶个/ml，更优选为1×10⁴～1×10⁶个/ml，最优选为1×10⁶个/ml。在此浓度下，黄曲霉HuBXY33对CGMCC No:3.4408菌株的抑制率达到43.90％～96.4％。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株不产毒的黄曲霉HuBXY33及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、分离与纯化

选择DG-18培养基(货号：HB0296，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)作为黄曲霉的分离培养基。对采自湖北襄阳花生种植地的土壤样品进行植物残渣及大颗粒石子去除、土壤研磨、混匀等处理。

称取磨碎后的10.0g土壤样品加入90mL灭菌水中，放入摇床震荡2h，制成100ml样品悬浮液。取50μl悬浮液液，加入DG-18培养基平板上，用涂布棒涂布均匀。然后将涂布好的平板放入恒温培养箱，28±1℃、相对湿度90％及黑暗条件下培养。

5天后挑取外观长有黄绿色孢子的菌落转接至新的DG-18培养基平板上进行二次划线纯化培养，直至得到单菌落，黄曲霉HuBXY33菌落直径为7.57cm，产孢量为5.0×10⁸个，为霉菌的纯培养物。相同条件下的黄曲霉标准菌株3.4408菌落直径为7.0cm，产孢量为4.25×10⁸个。可见，本发明提供的黄曲霉HuBXY33具有快速生长和繁殖的优势。

2、形态鉴定

从DG-18培养基上挑取长有黄绿色孢子的菌落(图1中A)转接至选择性培养基AFPA(货号：HB6276，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，曲霉素琼脂，Aspergillusflavus and Aspergillus parasiticus Agar)上，28±1℃、相对湿度90％及黑暗条件下培养。

5天后观察菌落背面颜色，将AFPA培养基背面呈亮橙色特征菌落(图1中B)初步鉴定为黄曲霉菌或寄生曲霉。然后从AFPA培养基中挑取呈亮橙色菌落的菌丝到DG-18培养基上，28±1℃、相对湿度90％及黑暗条件下培养5天，直至得到黄绿色孢子，进行进一步分子生物学鉴定。

本发明菌株HuBXY33在DG-18培养基上长出黄绿色孢子，在AFPA培养基上产生亮橙色的颜色反应(图1)。

3、分子生物学鉴定

通过真菌ITS基因序列以及钙调基因序列对菌株HUBXY33进行分子鉴定。

黄曲霉基因组ITS扩增所用的引物为：

ITS1(SEQ ID No.3)：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

ITS4(SEQ ID No.4)：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

黄曲霉基因组钙调蛋白扩增所用引物为：

CF1(SEQ ID No.5)：5′-AGGCCGAYTCTYTGACYGA-3′

CF4(SEQ ID No.6)：5′-TTTYTGCATCATRAGYTGGAC-3′

ITS基因序列PCR扩增体系为：1μL模板DNA，10μM引物(ITS1和ITS4)各1μl，PCR Mix25μL，双蒸水补足至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃最后延伸10min。扩增后，产物保存于4℃。送至北京擎科生物科技有限公司武汉分公司测序，测序结果在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)上进行比对分析。

钙调蛋白基因序列PCR扩增体系为：1μL模板DNA，10μM引物(CF1和CF4)各1μl，PCRMix 25μL，双蒸水补足至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃最后延伸10min。扩增后，产物保存于4℃。送至北京擎科生物科技有限公司武汉分公司测序，测序结果在NCBI网站(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行比对分析。

经测序可知，本发明菌株HUBXY33的ITS基因的核苷酸序列如下SEQ ID No.1：

TTTCCTCCGCCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAAAGATTGATTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTGGGGCCCGTCCCCCCCGGAGAGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCAGACAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGCTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGAGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTCACCCTACGGAAGGATCATTACCGAGTGT。

经测序可知，本发明菌株HUBXY33的钙调蛋白的编码基因的核苷酸序列如下SEQID No.2：

TTTTTCTTTAGGCCGATTTTTTTACTGAAGAACAGGTCTCCGAGTACAAGGAGGCCTTCTCCCTATTCGTAAGTAGTTATCGTCGTTCGTGAAAATTGGTTTTGTTAGTCGTCATGATTTGAACACAAGCTGACTTGGCTTTTCTTGGGTTTCCTATAGGACAAGGACGGTGATGGTTAGTACAGTTTATTTTATTCATTCTCCCTTCAAATGCGATCAATATGTTTTAGCCGCCATAATTTTATCCAGTTTCTGTTCGATCGGCTGAAGTCTTGGCATTGATGAATTGACTTGATATGCAGGCCAGATCACCACCAAGGAGTTGGGCACTGTCATGCGCTCTCTGGGCCAAAACCCCTCTGAGTCGGAACTCCAGGACATGATTAACGAGGTTGACGCCGACAACAATGGCACCATTGACTTCCCTGGTACGAGACGGCTTCCGTACGATTCATAAATGAAATAGCTGTTAATGTTCAAATAGAGTTCCTTACGATGATGGCGAGAAAGATGAAGGATACCGACTCTGAGGAGGAGATCCGGGAGGCTTTCAAGGTTTTCGACCGCGATAACAACGGCTTCATCTCCGCTGCCGAATTGCGCCACGTCATGACCTCCATCGGCGAGAAGCTTACCGATGATGAAGTTGATGAGATGATCCGCGAGGCGGATCAGGATGGTGACGGCCGGATTGACTGTACGTTTCGCGAAGCCCACCCAGACCCATTGCGGCTGTAAAAATGGTGATACTGACCGATTTTAGACAACGAGTTTGTCCAACTAGGAATGCAAAAAAACAGGTTGGGGGA。

ITS扩增序列在NCBI网站经BLASTN数据库比对可知，本发明菌株HuBXY33的ITS基因序列与黄曲霉菌(Aspergillus flavus)18S核糖体RNA基因(Sequence ID:MT497446.1)序列的相似性99.51％。

钙调蛋白扩增序列在NCBI网站经BLASTN数据库比对可知，本发明菌株HuBXY33的钙调蛋白基因序列与黄曲霉菌(Aspergillus flavus)钙调素A基因(Sequence ID:AY974340.1)序列的相似性98.60％。

根据形态学和分子生物学鉴定结果，将本发明菌株HuBXY33鉴定为黄曲霉(Aspergillus flavus)。

实施例2

1、菌株产毒培养

将待测不产毒黄曲霉菌株HuBXY33接种于DG-18固体培养基活化。28±1℃黑暗条件下培养5天后，用已灭菌的0.1％吐温80洗取获得平板上的黄曲霉分生孢子，得到分生孢子悬浮液。

用血球计数板确定分生孢子悬浮液浓度。

取一定量的分生孢子悬浮液注入装有已灭菌的30ml液体沙氏培养基的三角瓶中，使其终浓度为4×10⁵个/ml。将三角瓶置于摇床上28±1℃，200rpm黑暗培养。

2、菌株毒素含量测定

5天后，用灭菌纱布过滤菌丝球培养液，弃去菌丝球，收集产毒培养液于离心管中保存，静置1h，移取500μl产毒培养液于2ml离心管中，加入500μl甲醇，涡旋均匀，20000rmp离心10min，用1ml注射器将管中上清液小心吸出(避免针头接触管底沉淀)，将注射器中毒素提取液过0.22μm有机系滤膜，装入进样瓶中，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)测定黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素、杂色曲霉毒素等有毒代谢产物含量，其中，色谱条件：色谱柱为C₁₈(100mm×2.1mm，3μm)；柱温为40℃，进样体积2μl，样品盘温度10℃；流动相A(后续简称A)为甲醇:水(V:V＝5:95)，流动相B(后续简称B)为甲醇:水(V:V＝5:95)，均含有0.1％甲酸和10mM甲酸铵，流速0.3ml/min；梯度洗脱程序：0～1min:85A，1～3min:85～50％A，3～5min：50～30％A，5～10min:30～0％A，10～13min:0％A，13～15min:0～85％A，15～20min:85％A；质谱条件：ESI(+)模式：气帘气20ml/min；雾化器温度450℃；雾化器20ml/min；辅助加热气压力40ml/min。定量模式为选择离子检测(SIM)；分析软件Analyst 1.14。色谱柱：WatersSymmetry C18柱(2.1×150mm，3.5μm)；流动相A(后续简称A)为10mM乙酸水溶液；流动相B(后续简称B)为100％甲醇；柱温40℃；流速0.3ml/min；梯度程序：B在0min为50％，在0～10min增至90％，在10～15min从90％降低为50％，检测结果见表1。

表1.黄曲霉HuBXY33的产毒特性

注：^aAFT为黄曲霉毒素的缩写(为黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁和黄曲霉毒G₂的含量总和)；

^bST为杂色曲霉毒素(Sterigmatocystin)；^cAflatrem为黄曲霉震颤素；

^dND表示未检出。

由表1可知，本发明提供的黄曲霉HuBXY33不产黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素，是一株安全性高的生防菌。

实施例3

1、分生孢子悬浮液制备

将待测不产毒黄曲霉菌株HuBXY33和产毒黄曲霉标准菌株3.4408以及从不同地区分离出的产毒黄曲霉菌(Aspergillus flavus)，其编号分别为(SCPA-32-12(四川蓬安)、XZCY-24-6(西藏察隅)、LNFX-25-1(辽宁阜新)、HBHA-129-1(湖北红安)、HBYL-12-7(湖北阳逻)、HBTS-94-2(河北唐山)、JXZS-118-9(江西樟树)和JXZS-69-3(江西樟树)分别接种于DG-18固体培养基活化。28±1℃黑暗条件下培养5天后，用已灭菌的0.1％吐温80洗取获得平板上的黄曲霉分生孢子于10ml离心管中，得到分生孢子悬浮液。

在显微镜下用血球计数板确定分生孢子悬浮液浓度，无菌水稀释分生孢子浓度至1×10⁶个/ml待用。

2、竞争抑制培养

秤取10.0g花生粉末于无菌培养皿中(9cm)，设置对照组和处理组：

分别制备黄曲霉标准菌株3.4408(1×10⁶个/ml)、SCPA-32-12黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、XZCY-24-6黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、LNFX-25-1黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、HBHA-129-1黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、HBYL-12-7黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、HBTS-94-2黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、JXZS-118-9黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)和JXZS-69-3黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)与无菌水等体积混合(各250μl)的分生孢子悬浮液，依次记为：对照1组、对照2组、对照3组、对照4组、对照5组、对照6组、对照7组、对照8组和对照9组。

分别制备黄曲霉HuBXY33(1×10⁶个/ml)与黄曲霉标准菌3.4408和不同花生产地分离的产毒黄曲霉菌(SCPA-32-12、XZCY-24-6、LNFX-25-1、HBHA-129-1、HBYL-12-7、HBTS-94-2、JXZS-118-9和JXZS-69-3)(1×10⁶个/ml)等体积混合(各250μl)的分生孢子悬浮液，依次记为处理1组、处理2组、处理3组、处理4组、处理5组、处理6组、处理7组、处理8组和处理9组。

将混合后的分生孢子悬浮液均匀的接种于花生粉末上，每个处理做3个生物学重复，样品放入恒温培养箱中，在28±1℃，相对湿度90％的条件下连续黑暗培养14天。

3、黄曲霉毒素含量测定

培养结束后，将培养皿中的花生粉末转移至50ml离心管中，加入15ml 70％甲醇溶液(含4％NaCl)，涡旋混匀，置于振荡器上震荡2h，4500r/min离心，取1ml上清液过有机滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的含量。黄曲霉毒素总量(AFT)为以上4种黄曲霉毒素的总和，检测结果见表2。

HPLC条件：C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温为35℃；流动相：甲醇：水(V:V＝45:55)；流速0.8mL/min；柱后光化学衍生法，光化学衍生器254nm；荧光检测器(激发波长360nm，发射波长440nm)，进样量10μl，测定时间22min。

产毒抑制率计算公式：抑制率(％)＝[1-(处理组黄曲霉毒素含量)/(对照组黄曲霉毒素含量)]×100，式I。

表2不产毒黄曲霉HuBXY33在花生粉末上对产毒黄曲霉菌产毒抑制效果

注：AFT为黄曲霉毒素总量(由黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁和黄曲霉毒G₂组成)。

由表2可以看出，以花生粉末为基质，黄曲霉HuBXY33对产毒菌3.4408的AFB₁的产毒抑制率为99.63％，对分离自不同花生产地产毒菌株AFT、AFB₁、AFB₂的产毒抑制率范围分别为91.7％～98.0％、92.7％～98.8％和43.2％～99.2％，表明该黄曲霉HuBXY33具有高效的竞争抑制产毒黄曲霉菌的产毒能力，从而降低花生中黄曲霉毒素含量。

实施例4

1、分生孢子悬浮液制备

同实施例3。

2、竞争抑制培养

选取成熟、饱满、健康、无虫口病斑、种皮完整且大小均匀、颜色正常的花生种子。

将花生籽粒用70％乙醇溶液浸泡2min进行表面消毒后用无菌蒸馏水冲洗3次，以冲洗掉花生表面残留的酒精，并保证花生种子的水分在20％左右，13.0min以内完成。

设置对照组和处理组：

分别制备黄曲霉标准菌株3.4408(1×10⁶个/ml)、XZCY-24-6黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、JXZS-118-9黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、HBHA-129-1黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)、SCPA-32-12黄曲霉菌(1×10⁶个/ml)与无菌水等体积混合(各12.5ml)的分生孢子悬浮液，依次记为：对照1组、对照2组、对照2组、对照4组、对照5组。

分别制备黄曲霉HuBXY33(1×10⁶个/ml)与黄曲霉标准菌株3.4408和不同花生产地分离的产毒黄曲霉菌(XZCY-24-6、JXZS-118-9、HBHA-129-1、SCPA-32-12，1×10⁶个/ml)等体积混合(各12.5ml)的分生孢子悬浮液，依次记为处理1组、处理2组、处理2组、处理4组和处理5组。

将10粒花生籽粒放入其中浸泡5min，然后用无菌镊子夹出置于无菌培养皿中。每个处理做3个生物学重复，样品放入恒温培养箱中，在28℃±1，相对湿度90％的条件下连续黑暗培养7天。

黄曲霉毒素含量测定

将培养结束后的花生籽粒高温高压灭菌(121℃，30min)，经过恒温干燥箱干燥(110℃，1h)，待冷却后，使用咖啡机磨碎成花生粉末，秤取1.0g花生粉末样品装入离心管中，加入5ml 70％甲醇溶液(含4％NaCl)，涡旋混匀，置于振荡器上震荡2h，4500r/min离心，过免疫亲和柱和有机滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的含量。黄曲霉毒素总量(AFT)为以上4种黄曲霉毒素的总和，检测结果见表3和表4。

色谱条件如实施例3所述。

产毒抑制率计算公式同实施例3所述公式，即式I。

表3黄曲霉HuBXY33在花生籽粒上对产毒黄曲霉菌产AFT及AFB抑制效果

表4黄曲霉HuBXY33在花生籽粒上对产毒黄曲霉菌产AFG₁及AFG₂抑制效果

从表3和表4可以看出，以花生籽粒为培养基质，黄曲霉HuBXY33对黄曲霉标准菌株3.4408的AFT、AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的产毒抑制率分别为99.2％、99.2％、99.2％、96.0％、92.6％，对分离自不同花生产地的黄曲霉产毒菌株AFT、AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的产毒抑制率范围分别为73.9％～94.3％、80.3％～93.6％、76.7％～97.4％、70.6％～100.0％、75.6％～93.8％，表明该不产毒菌HuBXY33能高效竞争抑制产毒黄曲霉菌的产毒能力，显著降低花生中黄曲霉毒素污染水平。

实施例5

分别制备分生孢子浓度为1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶个/ml的黄曲霉HuBXY33和1×10⁵个/ml产黄毒黄曲霉菌3.4408的分生孢子悬浮液，配制方法同实施例3。

设置对照组和处理组：

制备黄曲霉标准菌株3.4408(10⁵个/ml)与无菌水等体积混合(各12.5ml)的分生孢子悬浮液，得到含分生孢子数为5×10⁴个/ml的黄曲霉标准菌株3.4408(对照1组)

分别将系列浓度的黄曲霉HuBXY33与黄曲霉标准菌株3.4408以体积比为1:1进行混合，含分生孢子数为1×10³个/ml的黄曲霉HuBXY33和分生孢子数为1×10⁵个/ml的黄曲霉标准菌株3.4408的等体积混合液，即分生孢子浓度比为5×10²个/ml:5×10⁴个/ml(处理1组)、含分生孢子数为1×10⁴个/ml的黄曲霉HuBXY33和分生孢子数为1×10⁵个/ml的黄曲霉标准菌株3.4408的等体积混合液，即分生孢子浓度比为5×10³个/ml:5×10⁴个/ml(处理2组)、含分生孢子数为1×10⁵个/ml的黄曲霉HuBXY33和分生孢子数为1×10⁵个/ml的黄曲霉标准菌株3.4408的等体积混合液，即分生孢子浓度比为5×10⁴个/ml:5×10⁴个/ml(处理3组)和含分生孢子数为1×10⁶个/ml的黄曲霉HuBXY33和分生孢子数为1×10⁵个/ml的黄曲霉标准菌株3.4408的等体积混合液，即分生孢子浓度比为5×10⁵个/ml:5×10⁴个/ml(处理4组)。

将消毒冲洗后的花生籽粒分别浸泡于其中5min(对照1组和处理1组～4组)，然后用无菌镊子夹出置于无菌培养皿中，放入恒温培养箱中，在28±1℃，相对湿度90％的条件下连续黑暗培养7天。

将培养结束后的花生籽粒高温高压灭菌(121℃，30min)，经过恒温干燥箱干燥(110℃，1h)，待冷却后，使用咖啡机磨碎成花生粉末，秤取1.0g花生粉末样品装入离心管中，加入5ml 70％甲醇溶液(含4％NaCL)，涡旋混匀，置于振荡器上震荡2h，4500r/min离心，过免疫亲和柱和有机滤膜，用高效液相色谱检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的含量，色谱条件如实施例3所述。根据实施例3计算黄曲霉毒素抑制率，结果见表5、图2。

表5不同浓度HuBXY33对黄曲霉产毒抑制作用

由表5、图2可知，黄曲霉HuBXY33对黄曲霉标准菌株3.4408的产毒抑制率，随其分生孢子的浓度增加而增加，且在较低浓度比(处理1组，5×10²个/ml:5×10⁴个/ml)下对黄曲霉毒素含量抑制率为43.9％。当不产毒菌与产毒菌分生孢子浓度比为5×10³个/ml:5×10⁴个/ml时，对花生中黄曲霉毒素的抑制率为62.4％，分生孢子浓度比为5×10⁴个/ml:5×10⁴个/ml时，抑制率为73.2％，在分生孢子浓度比为5×10⁵个/ml:5×10⁴个/ml时，抑制率达到最高，为96.4％。

实施例6

1、不产毒黄曲霉菌HuBXY33盆栽施用方法

将花生秧苗从花生种植地中移入花盆(花生秧苗无损伤，根部带土)中种植。于花生开花下针期，将不产毒黄曲霉菌HuBXY33分生孢子悬浮液(1×10⁶个/mL)以80L/亩用量(花生盆面积0.3m²，每盆4株花生，每株花生用量9ml)灌根于花生根际处(试验组)，空白对照组施撒等体积的无菌水，其他日常管理试验组与空白对照组相同。试验设置3个生物学重复。

2、收获期花生样品采集

花生收获期采集花生果样品，并晾晒干燥，四分法对样品进行缩分后，待检测黄曲霉毒素含量。

3、花生荚果产毒培养

将收获干燥的花生荚果放入培养皿中，每个培养皿放入5颗荚果，每个样品设3个重复。放入培养箱，在温度为28±1℃，相对湿度为90％条件下进行培养，20天后检测检测黄曲霉毒素含量。

4、花生中黄曲霉毒素含量检测和产毒抑制效果

将花生荚果经过恒温干燥箱干燥(110℃，1h)，待冷却后，使用咖啡机磨碎成花生粉末，秤取1.0g花生粉末样品装入离心管中，加入5ml 70％甲醇溶液(含4％NaCl)，涡旋混匀，置于振荡器上震荡2h，4500r/min离心，过免疫亲和柱和有机滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的含量。黄曲霉毒素总量(AFT)为以上4种黄曲霉毒素的总和。

色谱条件如实施例3所述。

毒素检测结果表明，收获干燥后的花生对照组与实验组均未检出黄曲霉毒素。

产毒抑制率计算公式同实施例3所述公式，即式I。结果见表6。

表6不产毒黄曲霉HUBXY33对花生黄曲霉毒素含量抑制效果

由表6记载的可知，在产毒培养条件下，空白对照组花生荚果中黄曲霉毒素含量69.3μg/kg，黄曲霉毒素B₁的含量40.3μg/kg；试验组花生荚果中黄曲霉毒素含量为27.2μg/kg，黄曲霉毒素B₁含量为11.1μg/kg。表明本发明的不产毒黄曲霉HuBXY33，具有高效的竞争抑制产毒菌生长、繁殖、降低产毒菌侵染农作物比例的能力，从而降低农产品中真菌毒素污染含量，对花生中AFT和AFB₁的抑制率分别为60.8％、72.5％。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一株不产毒的黄曲霉HuBXY33及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 616

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttcctccgc cttattgata tgcttaagtt cagcgggtat ccctacctga tccgaggtca 60

acctggaaaa agattgattt gcgttcggca agcgccggcc gggcctacag agcgggtgac 120

aaagccccat acgctcgagg atcggacgcg gtgccgccgc tgcctttggg gcccgtcccc 180

cccggagagg ggacgacgac ccaacacaca agccgtgctt gatgggcagc aatgacgctc 240

ggacaggcat gccccccgga ataccagggg gcgcaatgtg cgttcaaaga ctcgatgatt 300

cacggaattc tgcaattcac actagttatc gcatttcgct gcgttcttca tcgatgccgg 360

aaccaagaga tccattgttg aaagttttaa ctgattgcga tacaatcaac tcagacttca 420

ctagatcaga cagagttcgt ggtgtctccg gcgggcgcgg gcccggggct gagagccccc 480

ggcggccatg aatggcgggc ccgccgaagc aactaaggta cagtaaacac gggtgggagg 540

ttgggctcgc taggaaccct acactcggta atgatccttc cgcaggtcac cctacggaag 600

gatcattacc gagtgt 616

<210> 2

<211> 809

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttttcttta ggccgatttt tttactgaag aacaggtctc cgagtacaag gaggccttct 60

ccctattcgt aagtagttat cgtcgttcgt gaaaattggt tttgttagtc gtcatgattt 120

gaacacaagc tgacttggct tttcttgggt ttcctatagg acaaggacgg tgatggttag 180

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tgagtcggaa ctccaggaca tgattaacga ggttgacgcc gacaacaatg gcaccattga 420

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cgcgaggcgg atcaggatgg tgacggccgg attgactgta cgtttcgcga agcccaccca 720

gacccattgc ggctgtaaaa atggtgatac tgaccgattt tagacaacga gtttgtccaa 780

ctaggaatgc aaaaaaacag gttggggga 809

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttytgcatc atragytgga c 21

Claims (10)

1.一株不产毒的黄曲霉（Aspergillus flavus）HuBXY33，所述黄曲霉HuBXY33的保藏编号为CCTCC NO: M 2020519。

2.根据权利要求1所述的黄曲霉HuBXY33，其特征在于，所述黄曲霉HuBXY33不产黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素。

3.根据权利要求2所述的黄曲霉HuBXY33，其特征在于，所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒G2。

4.权利要求1~3任一项所述的黄曲霉HuBXY33在竞争抑制产毒黄曲霉菌产毒素中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述毒素包括黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素。

6.权利要求1~3任一项所述的黄曲霉HuBXY33在降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素污染中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述农产品包括花生和玉米。

8.一种降低农产品中黄曲霉毒素、黄曲霉震颤素和杂色曲霉毒素污染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用权利要求1~3任一项所述的黄曲霉HuBXY33的悬浮液进行灌根处理。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述黄曲霉HuBXY33的悬浮液的分生孢子浓度为1×10³~1×10⁶个/ml，用量为70~100L/亩。

10.一种黄曲霉的产毒抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括权利要求1~3任一项所述的黄曲霉HuBXY33；所述黄曲霉HuBXY33的分生孢子浓度为1×10³~1×10⁶个/ml。

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