CN113355245B - 内生真菌fo-r20在防治水稻穗颈瘟中的应用 - Google Patents

内生真菌fo-r20在防治水稻穗颈瘟中的应用 Download PDF

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    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Abstract

本发明公开了内生真菌FO‑R20在防治水稻穗颈瘟中的应用，属于微生物应用技术领域。本发明将保藏号为CCTCC M 2021505的Falciphoraoryzae FO‑R20制备成种衣剂或固体菌肥，应用于水稻种子上，在培育过程中，菌种定殖于水稻根部，显著增强水稻对穗颈瘟的抗病性，防治效果达到86.91％‑90.85％，病情指数下降了64.92‑72.07。内生真菌Falciphoraoryzae FO‑R20对水稻穗颈瘟的生物防治作用在农业领域内的推广应用具有巨大价值。

Description

内生真菌FO-R20在防治水稻穗颈瘟中的应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及Falciphora oryzae FO-R20在防治水稻穗颈瘟中的应用。
背景技术
稻瘟病又名稻热病，是世界性重要稻病，与纹枯病、白叶枯病被列为水稻三大病害。该病为通过气流传播的流行病，对水稻生产威胁极大，危害程度因品种、栽培技术以及气候条件不同有差别，一般减产10％-20％，局部田块绝收。稻瘟病在整个水稻生育期都会发生，根据受害时间不同和部位不同，可以分为苗瘟、叶瘟、叶枕瘟、节瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等，其中穗颈瘟对产量影响最大。
目前，预防该病发生的最经济有效的途径是种植水稻抗病品种。但是长期种植抗病基因单一的水稻品种，抗病性会因为病菌小种变异或适应而丧失，造成病害再次流行。此外，化学药剂防治也是防治稻瘟病的常用方法。但是，长期过量使用化学农药不仅提高水稻生产成本，而且还会造成稻米质量安全与生态环境的污染。因此，寻求高效、环保、绿色、安全的生物防治措施已成为植物病害防控的研究热点。
生物防治是利用有益微生物对病原菌产生各种不利作用(例如，抗菌，溶菌、竞争、重寄生等)，降低病原菌的数量或致病性；同时，用于生物防治的有益微生物还能诱导植物抗病性增强，提高植物免疫力，延缓、减轻或者抑制病害的发生。
在自然生态系统中藏匿着大量的有益微生物，其中植物内生真菌就是其中之一。植物内生真菌是指至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌，普遍存在于生态系统中，且与宿主植物进行着非常稳定的长期互作关系。在植物内生真菌与寄主形成互惠共生关系的过程中，一方面植物内生真菌从寄主中获取水分、矿物营养等生长所需的养分，另一方面植物内生真菌赋予植物丰富多样的生物学功能，例如促进植物生长，提高植物生物量，增强寄主植物的抗生物和非生物胁迫的能力。
申请号为201910044093.0的发明专利公开了保藏号为CGMCC No.2737的真菌菌株稻瓶霉(Phialophora oryzae)在防治水稻白叶枯病中的应用。目前尚无报道指出野生稻内生真菌菌株在防治水稻穗颈瘟方面的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高水稻对穗颈瘟抗性的内生真菌，将其应用到水稻穗颈瘟的防治当中。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明从云南疣粒野生稻根系中分离得出一株新的瓶霉属内生真菌，经鉴定分析鉴定该菌株属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，粪壳纲Sordariomycetes，巨座壳科Magnaporthaceae，瓶霉属Phialophora，并将其命名为Falciphora oryzae FO-R20。于2021年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏号CCTCC M2021505，其分类命名为Falciphora oryzae。
本发明研究发现，将内生真菌Falciphora oryzae FO-R20定殖于水稻根部组织中，可以显著增强水稻对穗颈瘟的抗病性，防治效果达到90.85％。
因此，本发明提供了保藏号为CCTCC M 2021505的内生真菌Falciphora oryzaeFO-R20在防治水稻穗颈瘟中的应用。
所述应用为将内生真菌Falciphora oryzae FO-R20与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中。
进一步的，所述应用包括：所述应用包括：将内生真菌Falciphora oryzae FO-R20菌丝与壳聚糖溶液混匀后制备成种衣剂，再与水稻种子混合，置于阴凉通风处晾干制得包衣种子，然后将包衣种子通过直播的方式播种于大田，培育至收获。
基于种衣剂用量少，方便使用，便于推广的优点，本发明将内生真菌Falciphoraoryzae FO-R20以种衣剂的形式应用于水稻种子上，显著提高定殖效果，包衣种子通过直播的方式施用大田，操作简单便捷。
优选的，将活化的内生真菌Falciphora oryzae FO-R20接种于液体发酵培养基中，25℃培养，获得菌丝，然后菌丝与质量百比分浓度为1％的壳聚糖溶液按照1g：10L的比例混合制得种衣剂；菌丝质量以干重计，1％壳聚糖溶液由1g壳聚糖溶于100mL的1％醋酸溶液制得。
所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4％豆饼粉、1％玉米粉、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾。
液体发酵之前，将内生真菌Falciphora oryzae FO-R20菌株接种于PDA培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。
进一步的，所述应用包括：将内生真菌Falciphora oryzae FO-R20接种于无菌大麦粒上，黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，制得FO-R20固体菌肥，再混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获。
本发明将Falciphora oryzae FO-R20制备成固体菌肥，通过基质育秧的方式施用到水稻根部，使其定殖于水稻根部，
优选的，将活化的内生真菌Falciphora oryzae FO-R20接种于液体发酵培养基中，25℃培养，获得发酵液，发酵液与无菌大麦粒按照100mL：500g的比例混合，25℃黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，即得FO-R20固体菌肥；
所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4％豆饼粉、1％玉米粉、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾。
优选的，制备混合基质中，固体菌肥与育苗基质按照质量比1:9进行混合。
本发明具备的有益效果：
本发明将Falciphora oryzae FO-R20制备成种衣剂或固体菌肥，应用于水稻种子上，在培育过程中，菌种定殖于水稻根部，显著增强水稻对穗颈瘟的抗病性，防治效果达到86.91％-90.85％，病情指数下降了64.92-72.07。内生真菌Falciphora oryzae FO-R20对水稻穗颈瘟的生物防治作用在农业领域内的推广应用具有巨大价值。
附图说明
图1为内生真菌FO-R20在水稻根部的定殖。
图2为实施例2中内生真菌FO-R20种衣剂对穗颈瘟的田间防效。其中A-B：FO-R20种衣剂处理组和对照组植株穗颈瘟的发病情况；C：FO-R20菌株种衣剂处理组和对照组水稻穗颈瘟病级指数频率分布；D：FO-R20菌株种衣剂处理组与对照组的水稻病情指数，图中数据为平均数±标准误。显著水平(t-test)：***P<0.0001。
图3为实施例3中内生真菌FO-R20固体菌肥对穗颈瘟的田间防效。其中A-B：FO-R20菌株接种处理组和对照组植株穗颈瘟的发病情况；C：FO-R20菌株接种处理组和对照组水稻穗颈瘟病级指数频率分布；D：FO-R20菌株接种处理组与对照组的水稻病情指数，图中数据为平均数±标准误。显著水平(t-test)：***P<0.0001。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。若无特别说明，实施中采用的技术手段均为本领域常规技术手段，试剂均为市售商品。
实施例1内生真菌FO-R20的分离和鉴定
一、内生真菌FO-R20的分离纯化
内生真菌FO-R20分离自云南疣粒野生稻(从中国云南省西双版纳采集)根系。具体分离方法为：首先，用自来水连续冲洗野生稻根系，仔细去除土壤颗粒和附属物。选取健康根组织，进行表面消毒处理，75％乙醇浸泡1-2min，1％次氯酸钠4-5min，再用无菌去离子水清洗3次。将根组织块切成0.5cm小段，然后放入2％麦芽粉琼脂培养基(MEA，malt extractagar，OXOID；培养基中加入50mg/L的氯霉素抑制内生细菌的生长)平板上孵育，25℃黑暗培养。培养至第5天，从组织切口边缘处长出内生真菌菌丝，用接种针小心将其挑出后转接到新鲜PDA培养基上纯化培养并记录菌株编号FO-R20。
PDA培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15g/L。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯(200g/L)，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。
二、菌株鉴定
1、形态鉴定
FO-R20菌株经过分离纯化后，接种到PDA培养基上，25℃培养7天。用挑针挑取少量菌体，制成玻片，在显微镜下观察，测量。其形态特征为：菌株FO-R20在PDA平板上菌落生长缓慢，25℃生长10天后菌落直径为6cm；气生菌丝不发达，匍匐状贴于培养基表面，菌落为褐色，菌丝透明或深褐色，宽1.0-2.5μm；分生孢子梗呈酒瓶状，单生，不分支，5.0-13.5×2.5-3.0μm；分生孢子镰刀形，无色，无隔膜，7.0-9.0×0.8-1.2μm。
2、分子鉴定
(1)DNA提取
①在PDA平板上25℃培养FO-R20菌株7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300μL提取缓冲液(1M KCl，100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH＝8.0；)1.5mL离心管中；
②用电磨机研碎，剧烈震荡2min；
③10000rpm离心10min；
④吸取上清液，转移至另一新的离心管中，弃沉淀；
⑤在上清液中加入等体积的异丙醇(分析纯)，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心10min，沉淀核酸；
⑥轻轻倒去上清液，将含有沉淀的离心管倒置在吸水纸上排干水分；
⑦再加入300μL 70％乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min；
⑧轻轻倒去上清液，重复步骤⑦一次；
⑨将离心管倒置在吸水纸上排干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；
⑩用50μL ddH2O重悬沉淀，得到FO-R20基因组DNA，浓度达到30ng/μL。
(2)真菌ITS rDNA基因的PCR扩增
PCR扩增在50μL反应体系中进行，体系中含有：上下游引物各2μM，dNTPs 200μM，MgCl2 1.5mM，10×PCR buffer 5μL，模版DNA 2μL，Taq酶2U。
上游引物ITS1序列为：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，
下游引物ITS4序列为：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行。反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。
(3)PCR产物的回收纯化
PCR反应结束后，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行。
(4)基因的测序和序列分析
经电泳检测后的已经纯化回收的目的DNA片段送至上海生工用ABIPRISMA377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如SEQ ID No.1所示的长度为527bp的DNA片段序列。
在NCBI网站上，将测得的核苷酸序列用BLAST在GenBank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。经过BLAST比对，该序列与登录号为NR_153972.1序列覆盖率100％，相似度达到100％，属于瓶霉属。
上述分子鉴定与形态鉴定结果表明，新分离的菌株属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，粪壳纲Sordariomycetes，巨座壳科Magnaporthaceae，瓶霉属Phialophora。将其命名为Falciphora oryzae FO-R20，于2021年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉、武汉大学，保藏号CCTCC M 2021505。
实施例2 FO-R20菌株包衣剂在防治水稻穗颈瘟中的作用
供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，浙粳88。
1、FO-R20菌株培养与液体发酵
将保存于滤纸片上的FO-R20菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d。用直径0.5cm的打孔器打取菌饼，将菌饼(5个)接种至含有500ml液体发酵培养基的三角瓶中，置于摇床中(25℃，转速150)培养7d。然后将液体发酵液真空抽滤，去除培养基，得到菌丝。称取0.1g菌丝，测定含水率为80％，以备计算菌丝干重。
PDA培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15g/L。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯(200g/L)，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。
液体发酵培养基：豆饼粉0.4％，玉米粉1％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，按比例配制，加水至250ml；120℃湿热灭菌15min。
2、FO-R20种衣剂制备：将菌丝与1％壳聚糖溶液按照1：10000的比例(干重：体积)混合均匀，即干重为1g的菌丝与10L 1％壳聚糖溶液混合，制成种衣剂。因真空抽滤后的菌丝含水率不同，所以每次制备种衣剂按照菌丝干重来计算。
1％壳聚糖溶液配方如下：1g壳聚糖溶于100ml的1％醋酸溶液。
3、种子包衣处理：用1％次氯酸钠对水稻种子表面消毒10分钟，清水冲洗干净，沥干，然后将消毒后的种子与种衣剂按照2.5:1的比例(重量：体积)混匀，即每2.5g种子使用1mL种衣剂，得到包衣种子。将包衣后的种子平铺于无菌纱布上，置于阴凉通风处(15-28℃)晾干2-3天。
4、将包衣种子通过人工直播方式均匀播种于大田，正常水肥管理，整个生育期不施用任何杀菌剂，培育至收获。种子每亩用量为4kg。
同时，为确保真菌能够定殖于根部，在播种15天后将秧苗拔出，清洗根系，剪少量样品，置于LSM780荧光共聚焦显微镜(Carl Zeiss Inc.,Jena，Germany)下进行观察，镜检根部FO-R20真菌定殖情况(图1)。
5、穗颈瘟防效调查
待水稻生长至成熟期调查。每小区对角线五点取样调查，总共调查2000穗，以穗为单位记载分级。
病情指数和防治效果计算公式为：
Figure BDA0003103893510000071
Figure BDA0003103893510000072
按照方中达等(1990)的标准(表1)对病穗进行分级统计，并计算病情指数和防治效果。
表1水稻穗颈瘟病情分级标准
Figure BDA0003103893510000073
Figure BDA0003103893510000081
通过对水稻穗颈瘟发病情况调查，发现：对照组水稻植株穗颈瘟发病严重(图2A)，穗颈部变褐，造成枯白穗或秕谷。仅有25.3％的水稻植株没有感病(图2C)，74.7％的水稻植株感病病级为9级，病情指数为74.7(图2D)。
相比之下，根部接种FO-R20菌株的水稻植株发病较轻(图2B)，90.2％的水稻植株没有发病，仅有9.75％的水稻穗颈瘟病级为9级(图2C)，伴随零星白穗或秕谷，病情指数仅为9.78(图2D)，对水稻穗颈瘟的防治效果达到86.91％。
实施例3 FO-R20固体菌肥在防治水稻穗颈瘟中的作用
供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，浙粳88。
1、FO-R20菌株培养与发酵
将保存于滤纸片上的FO-R20菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d。用直径0.5cm的打孔器打取菌饼，将菌饼(5个)接种至含有500ml液体发酵培养基的三角瓶中，置于摇床中(25℃，转速150)培养7d。然后将液体发酵液接种于装有无菌麦粒培养瓶中(500g麦粒/瓶，100ml发酵液：500g麦粒)，25℃黑暗培养箱中培养10-15d，待菌丝生长布满麦粒，备用。
PDA培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15g/L。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯(200g/L)，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。
液体发酵培养基：豆饼粉0.4％，玉米粉1％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，按比例配制，加水至250ml；120℃湿热灭菌15min。
2、FO-R20固体菌肥的基质育秧
将发酵好的固体菌肥与常规育苗基质混合后，平铺于育苗盘中，每育苗盘含有10g固体菌肥。将水稻种子用25％氰烯菌酯3000倍液浸泡2天进行种子消毒，随后放于30℃黑暗恒温箱中催芽1-2天。待种子露白，将其均匀播种于育苗盘中，放入秧田育苗培养，正常浇水管理。
3、水稻秧苗移栽
待秧苗在育苗盘中生长23-25天后，将秧苗拔出，移栽至大田。移栽时，每丛3株苗，每丛株距10-15cm，行距30cm。正常水肥管理，整个生育期内不施用任何杀菌剂，培育至收获。
4、穗颈瘟防效调查
待水稻生长至成熟期调查。每小区对角线五点取样调查，共查600穗，以穗为单位记载分级。按照表1对病穗进行分级统计，并计算病情指数和防治效果。
通过对水稻穗颈瘟发病情况调查，发现：对照组水稻植株穗颈瘟发病严重(图3A)，穗颈部变褐，造成枯白穗或秕谷。仅有20.67％的水稻植株没有感病(图3C)，79.33％的水稻植株感病病级为9级，病情指数为79.33(图3D)。
相比之下，根部接种FO-R20菌株的水稻植株发病较轻(图3B)，92.33％的水稻植株没有发病，仅有6.50％的水稻穗颈瘟病级为9级(图3C)，伴随零星白穗或秕谷，病情指数仅为7.26(图3D)，对水稻穗颈瘟的防治效果达到90.85％。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 内生真菌FO-R20在防治水稻穗颈瘟中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 527
<212> DNA
<213> Falciphora oryzae
<400> 1
cggagggatc attaaagagt tgaaaaactc caacccctgt gaaccttacc tttactgttg 60
cttcggcgga cgacggccct tcgtggcccg aggccgccgg aggttccaaa ctctaaatct 120
ttagtgtatc tctgaggaaa ataaaccaat aattaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 180
ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag 240
tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccgccggt attccggcgg gcatgcctgt 300
tcgagcgtca tttcaccact caagcccagc ttggtgttgg ggcacccggc cgcccggcgg 360
tcggggcccc caagtacatc ggcggtctcg ctaggaccct gagcgcagta actcgcggta 420
aaacgcgcct cgctcggaag ttcccagcgg gcttccagcc gctaaacccc ccctaatttt 480
cttaggttga cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaagca 527

Claims (7)

1.保藏号为CCTCC M 2021505的内生真菌Falciphora oryzae FO-R20在防治水稻穗颈瘟中的应用，其特征在于，所述应用包括：将内生真菌Falciphora oryzae FO-R20与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将内生真菌Falciphoraoryzae FO-R20菌丝与壳聚糖溶液混匀后制备成种衣剂，再与水稻种子混合，置于阴凉通风处晾干制得包衣种子，然后将包衣种子通过直播的方式播种于大田，培育至收获。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将活化的内生真菌Falciphora oryzae FO-R20接种于液体发酵培养基中，25℃培养，获得菌丝，然后菌丝与质量百比分浓度为1％的壳聚糖溶液按照1g：10L的比例混合制得种衣剂；
所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4％豆饼粉、1％玉米粉、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，液体发酵之前，将内生真菌Falciphoraoryzae FO-R20菌株接种于PDA培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将内生真菌Falciphoraoryzae FO-R20接种于无菌大麦粒上，黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，制得FO-R20固体菌肥，再混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，将活化的内生真菌Falciphora oryzae FO-R20接种于液体发酵培养基中，25℃培养，获得发酵液，发酵液与无菌大麦粒按照100mL：500g的比例混合，25℃黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，即得FO-R20固体菌肥；
所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4％豆饼粉、1％玉米粉、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，制备混合基质中，固体菌肥与育苗基质按照质量比1:9进行混合。
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Assignee: Zhejiang Jinghe Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences

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Denomination of invention: Application of endophytic fungus FO-R20 in the prevention and control of rice neck blast

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