CN114164126B - 一株米根霉xerf-1及其在减轻苹果连作障碍中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株米根霉XERF‑1及其在减轻苹果连作障碍中的应用，属于农业微生物技术领域。所述米根霉XERF‑1的生物保藏号为：CGMCC No.15268，该菌株是一株内生菌，且对苹果连作障碍专化型层出镰孢菌MR5和多种病原菌均具有拮抗作用；在盆栽和大田试验条件下，把固体菌肥或液体菌肥施加到连作苹果园土壤中，均显示该菌肥能促进连作苹果树地上部及地下部的生长；显著降低土壤中除XERF‑1外其它真菌数量；提高苹果连作土壤中土壤酶活性、根系保护性酶活性和叶片光合参数；减少植物的氧化损伤；在减轻苹果连作障碍方面具有优异的效果，可用于苹果连作障碍的防治。

Description

一株米根霉XERF-1及其在减轻苹果连作障碍中的应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株米根霉XERF-1及其在减轻苹果连作障碍中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
苹果连作障碍是果树生产上普遍存在的问题，对世界主要苹果种植区构成了严重威胁(Winkelmann et al.,2018)，普遍认为土壤微生物群落结构失衡是造成苹果连作障碍的主要原因(Mazzola和Manici,2012；Manici et al.,2018)。前期研究表明，镰孢菌是引起环渤海湾地区苹果连作障碍的主要病原菌(Wang et al.,2018)，而实验室最近筛选和鉴定的与苹果连作障碍相关的专化型层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)MR5对苹果植株具有高致病性。轮作、化学熏蒸和生物防治是目前预防苹果连作障碍的主要措施(Koronetal.,2014)。种植前土壤溴甲烷熏蒸消除土传病原菌是国内外公认的防治苹果连作障碍的最佳手段。但是，由于它会造成污染和环境危害，正逐步的被禁止使用(Manici etal.,2013)。轮作又耗时长，生产上不易推广。而生物防治是一种环境保护性控制方法，利用有益微生物抑制土壤中病原体的数量或干扰植物病原体的感染(Gerbore et al.,2014)。因此，随着人们环保意识的增强，轮作、化学熏蒸等措施逐渐被生物防治措施所取代，以节省时间，最大限度地减少对环境的污染(Hyakumachi et al.,2013)。
植物内生真菌在植物体内具有稳定的生存空间，不易受环境条件的影响，可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递，常与宿主形成一种共性关系。不同于分离自土壤或植物根际的微生物，植物内生菌作为生防因子具有独特优势，它能够稳定的在植物体内定殖与运转，且能产生与宿主植物代谢相同或相似的生理活性物质，因而具有更好的抑菌效果(邓振山等，2016；牛春林等，2018)。有些内生真菌可以竞争吸收病原菌生长所需的营养物质，导致病原菌因营养不足、生长能力不足而生长缓慢或停止生长。在一些植物组织或器官中，内生真菌和病原菌的生态位是相同的，因此内生真菌可以通过抢占病原菌的生长空间来提高宿主植物的抗性，从而起到防治作用(张永华等，2021)。还有的内生真菌可以产生抗生素类、生物碱类和植物生长调节剂类物质，拮抗病原菌、改善土壤环境，促进根系养分吸收。
米根霉(Rhizopus oryzae)是根霉属中的一种重要真菌，研究表明，米根霉(Rhizopus oryzae)可以大量产生壳聚糖、富马酸等促生抑菌物质。在农业方面壳聚糖被认为是一种新型的植物生长调节剂、植物病害抑制剂，它可以促进植物生长，提高产品品质，诱导植物的抗病性。富马酸在生产上常被作为一种防霉剂，对真菌有一定的抑制作用。米根霉还可以分泌果胶酶和蛋白酶等降解真菌细胞壁的物质，促进真菌寄生。另外，米根霉具有环境适应能力强、营养要求简单、酶系丰富、可积累多种天然产物的特点，在绿色农业中显示出巨大的发展潜力，但尚未见其对引起苹果连作障碍专化型镰刀菌生防作用的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株米根霉XERF-1及其在减轻苹果连作障碍中的应用。发明人从连作果园健康的苹果根中分离得到一株米根霉XERF-1，该菌株是一株内生菌，且对苹果连作障碍专化型层出镰孢菌MR5和多种病原菌均具有拮抗作用；在连作土盆栽和大田试验条件下，把固体或液体菌肥加到连作苹果园土壤中，均显示该菌肥能促进连作苹果树地上部及地下部的生长；一定程度上提高土壤中细菌含量，降低土壤中除XERF-1外其它真菌数量；提高苹果连作土壤中土壤酶活性和根系保护性酶活性；在减轻苹果连作障碍方面具有优异的效果，可用于苹果连作障碍的防治。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一方面，提供一株米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1，该菌株已于2018年01月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC No.15268。
所述米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1，分离自连作苹果园健康果树根系，具有如下特征：
在PDA固体培养基上生长时，菌落稠密，最初呈白色，后变为黑褐色。生长特别迅速，其菌丝1-2天即可长满整个培养皿。在60倍普通光学显微镜下观察时，孢子呈卵圆形。孢子囊呈球形，老后呈黑色。假根发达，分枝呈根状。孢囊梗直立，与假根对生，呈褐色。囊轴呈球形、卵圆形，呈淡褐色。
含有上述米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的菌剂也属于本发明的保护范围。
所述菌剂中，米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1可以以被培养的活菌、孢子悬液或者发酵液的形式存在。
作为优选，米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的孢子悬液由如下方法制备而成：
将米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1置于PDA培养基上28℃培养5天后，用无菌水冲洗孢子，制成孢子悬液。
作为优选，米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的发酵液由如下方法制备而成：
将米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1孢子悬浊液接种到发酵培养基中，在34℃温度下180r/min摇床发酵培养72h；
所述发酵培养基的组成为：葡萄糖50.00g，(NH4)2SO4 2.00g，KH2PO4 0.30g，NaH2PO4 0.08g，MgSO4·7H2O 0.30g，ZnSO4·7H2O 0.08g，CaCO3 10.00g(CaCO3用锡箔纸包着单独灭菌后加入发酵液平衡pH)，蒸馏水1000mL。
进一步的，所述菌剂中除包含米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1外，还可包括辅料或载体基质等；如海藻糖、葡萄糖、羟甲基纤维素、糊精、可溶性淀粉、牛粪、农作物秸秆等。
所述菌剂的剂型可以为液剂、乳剂、悬浮剂、颗粒剂、粉剂、可湿性粉剂或水分散剂。
本发明的第二方面，提供上述米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1或者含有米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的菌剂在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
(1)抑制植物病原菌的生长；
(2)制备用于抑制植物病原菌的产品；
(3)防治由植物病原菌所致病害；
(4)制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品。
优选的，所述植物病原菌为所述植物病原菌为ARD专化型层出镰孢菌(Fusariumproliferatum f.sp.malus domestica)MR5、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)。
本发明的第三方面，提供米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1在产纤维素酶和果胶酶中的应用。
本发明的第四方面，提供上述米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1或者含有米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的菌剂在如下(1)或(2)中的应用：
(1)减轻苹果连作障碍；
(2)制备减轻苹果树连作障碍的生防制剂。
本发明的第五方面，提供上述米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1或者含有米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的菌剂在如下(1)-(6)至少一项中的应用：
(1)促进连作苹果幼苗地上部及地下部的生长；
(2)抑制土壤中引起苹果连作障碍的病原菌的生长；
(3)提高连作土壤中细菌含量；
(4)降低连作土壤中除米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1外其它真菌数量；
(5)提高苹果连作土壤中土壤脲酶、磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性。
(6)提高苹果连作土壤中根系保护酶活性，降低丙二醛含量。
本发明的第六方面，提供一种减轻苹果连作障碍的方法，包括以下步骤：
将米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1或者含有米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的菌剂施于苹果连作土壤中。
本发明的有益效果：
本发明首次从连作苹果园健康果树根系中分离得到一株内生米根霉(Rhizopusoryzae)XERF-1，其对引起苹果连作障碍的专化型层出镰孢菌MR5以及尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、串珠镰孢菌四种主要病原菌的抑制率均在80％左右；并且具有促生能力。在盆栽和大田试验条件下，把固体菌肥或液体菌肥施加到连作苹果园土壤中，均显示该菌肥能促进连作苹果树地上部及地下部的生长；一定程度上提高土壤中细菌含量，降低土壤中除XERF-1外其它真菌数量；提高苹果连作土壤中土壤酶活性和根系保护性酶活性；减少植物的氧化损伤，在减轻苹果连作障碍方面具有优异的效果，可用于苹果连作障碍的防治。
附图说明
图1：XERF-1菌株拮抗实验图：XERF-1与层出镰孢菌Fusarium proliferatumMR5对峙实验(A)，XERF-1与串珠镰孢菌Fusarium moniliforme对峙实验(B)，XERF-1与腐皮镰孢菌Fusarium solani对峙实验(C)，XERF-1与尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum对峙实验(D)。
图2：XERF-1菌株形态图：PDA培养基菌落形态(A)，孢子形态(B)，球形孢子囊形态(C)，假根形态(D)。
图3：基于ITS序列构建的系统发育树。本发明中获得的真菌物种序列以XERF-1显示，该序列与GenBank数据库中已登录的米根霉(Rhizopus oryzae，MF491815.1)ITS序列同源性达100％。
图4：纤维素酶活力图。
图5：果胶酶活力图。
图6：XERF-1菌肥处理对苹果连作土壤酶活性的影响。连作对照(CK1)，溴甲烷熏蒸对照(CK2)，空白载体处理(T1)，米根霉菌肥处理(T2)。
图7：XERF-1菌肥处理对根系保护性酶及丙二醛活性的影响。连作对照(CK1)，溴甲烷熏蒸对照(CK2)，空白载体处理(T1)，米根霉菌肥处理(T2)。
图8：XERF-1菌肥处理对土壤中真菌的影响。连作土对照(A)，溴甲烷熏蒸连作土对照(B)，菌肥载体(C)，XERF-1菌肥(D)。
图9：XERF-1菌肥处理对土壤中细菌的影响，连作土对照(A)，溴甲烷熏蒸连作土对照(B)，菌肥载体(C)，XERF-1菌肥(D)。
图10：XERF-1菌肥处理对苹果连作土壤尖孢镰孢菌基因拷贝数的影响。连作对照(CK1)，溴甲烷熏蒸对照(CK2)，空白载体处理(T1)，米根霉菌肥处理(T2)。
图11：XERF-1菌肥处理盆栽植株图。连作对照(CK1)，溴甲烷熏蒸对照(CK2)，空白载体处理(T1)，米根霉菌肥处理(T2)。
图12：XERF-1菌肥处理大田植株图。连作对照(CK1)，溴甲烷熏蒸对照(CK2)，空白载体处理(T1)，米根霉菌肥处理(T2)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，苹果连作障碍会造成苹果果实产量和品质下降、病虫害加重、树势衰弱甚至死亡，对果农造成严重的经济损失。目前还没有米根霉作为生防菌相关研究，在防治苹果连作障碍方面的研究更是没有相关报道。
基于此，本发明从连作苹果园健康果树根系中分离得到一株内生真菌XERF-1，根据形态学、生理生化特征检测和基于ITS的系统发育分析，鉴定该菌为米根霉(Rhizopusoryzae)。与现有报道的米根霉不同的是，本发明筛选分离的米根霉是一种极具开发潜力的新型生防菌，其集拮抗抑菌、产胞外酶、分泌促生长因子、促进苹果砧木生长、减轻苹果树连作障碍等多种功效于一体。本发明采用平板对峙法研究其对引起苹果连作障碍的专化型层出镰孢菌、尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、串珠镰孢菌等多种病原菌的拮抗效果，米根霉XERF-1对多种病原菌均具有较强的拮抗抑制效果，且对苹果连作障碍镰孢属四种主要病原菌的抑制率均在80％左右。另外，米根霉具有产纤维素酶和果胶酶等胞外酶的活性，这些物质的存在有助于你是真菌在作物体内的定殖，强化菌株的生防期。还有根据双皿对扣法实验显示，该菌株的挥发性物质可能也具有一定的抑菌能力。盆栽条件下，将米根霉XERF-1菌肥施加到连作土壤中，可减少平邑甜茶幼苗(苹果砧木)氧化损伤的程度，提高土壤酶活性，促进根系保护性酶的活性并降低MDA的含量，提高净光合速率，同时促进植物生长，说明XERF-1菌株在减轻苹果连作障碍方面具有良好效果。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：
PDA培养基：去皮马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
LB培养基：蛋白胨10.0g,酵母浸粉5.0g,氯化钠10.0g,蒸馏水1000mL。
发酵培养基：葡萄糖50.00g，(NH4)2SO4 2.00g，KH2PO4 0.30g，NaH2PO4 0.08g，MgSO4·7H2O 0.30g，ZnSO4·7H2O 0.08g，CaCO3 10.00g(CaCO3用锡箔纸包着单独灭菌后加入发酵液平衡pH)，蒸馏水1000mL。
ARD专化型层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)MR5，其分类命名也称为“层生镰刀菌”，MR5菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.22426，保藏时间为2021年5月17日，记载在专利CN113817613A中。菌株MR5仅对苹果砧木具有致病性，属于苹果专化型。
实施例1：菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离纯化：
采用改良的贴根段法从山西省运城市临猗县北辛乡王申村连作果园中收集健康苹果树的根系，带回实验室立刻进行内生拮抗真菌的筛选。先用自来水冲洗根部5min去除粘附的土壤颗粒，然后在75％乙醇中浸渍2min进行表面灭菌，后用无菌水冲洗3次，然后在5％的次氯酸钠溶液浸泡5min，最后用无菌水冲洗5次。适当干燥后，将表面灭菌的根切成1cm的根段，转移到含有千分之四青霉素链霉素(100×)的PDA培养基中分离内生真菌，每个培养皿中放置四根，培养皿在28℃下保持一周。此外，将最后一次冲洗根系的无菌水涂布到相同的培养基上放置到相同环境下培养，确认根部是否已经完全消毒。结果显示涂布的平板上没有杂菌产生，健康苹果根系在表面消毒后培养3-4天后，菌丝逐渐从根样品的切割端生长出来。挑取菌丝至新的不添加抗生素的PDA平板上继续培养，共分离出内生真菌30多个真菌种类。
2.菌株的筛选：
通过根系研磨液的平板稀释涂布法，检测发现有30多个内生真菌种类，以串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)和ARD专化型层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)MR5为供试病原菌进行对峙试验，反复筛选得到1株对供试病原菌拮抗效果最好的菌株，标记为XERF-1。
该株菌XERF-1生长特别迅速，其菌丝1-2天即可长满整个培养平板，极大的限制其它有害菌生长，且该菌株XERF-1产孢快、产孢能力强，孢子易脱落,这些特点也有利于提高该菌株的定殖能力，所以决定对该株XERF-1菌株进行深入研究。菌株XERF-1与四种苹果连作障碍主要病原菌的平板对峙实验见图1。此菌株对层出镰孢菌、串珠镰孢菌、尖孢镰孢菌和腐皮镰孢菌的抑制率均达到80％左右，拮抗系数为Ⅰ级。
综上，说明XERF-1是良好的拮抗内生菌，特别是对苹果连作障碍专化型层出镰孢菌MR5具有显著的拮抗作用。
3.菌株的鉴定：
(1)形态学鉴定：
在PDA培养基上生长时，菌落稠密，最初呈白色，后变为黑褐色。生长特别迅速，其菌丝1-2天即可长满整个培养平板。在普通光学显微镜下观察时，孢子呈卵圆形。孢子囊呈球形，老后呈黑色。假根发达，分枝呈根状。孢囊梗直立，与假根对生，呈褐色。囊轴呈球形、卵圆形，呈淡褐色。PDA培养基菌落形态(图2A)，孢子形态(图2B)，球形孢子囊形态(图2C)，假根形态(图2D)。
(2)ITS序列分析及系统发育分析：
利用真菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio Cat#D2300)提取XERF-1菌株的DNA，然后通过引物对ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)扩增ITS的片段，扩增流程如下：94℃预变性1min，94℃变性1min，50℃退火1min，74℃延伸90s，30个循环，最后74℃延伸7min；并通过引物对tef1fw(5’-GTGAGCGTGGTATCACCCATCG-3’)和tef1rev(5’-GCCATCCTTGGAGACCAGC-3’)扩增tef1片段，扩增流程如下：94℃预变性1min，94℃变性1min，59℃退火1min，74℃延伸50s，30个循环，最后74℃延伸7min。引物合成及扩增片段测序均由上海生工有限公司完成。测序结果通过国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸数据库进行BLAST比对，用MEGA7软件，采用邻接法N-J聚类分析对分离的拮抗菌进行序列分析并构建系统发育树，自展值(bootstrap value)1000次重复检验。菌株的rDNA-ITS序列长度为595bp。经Blast比对分析发现，该序列与GenBank数据库中已登录的米根霉(Rhizopus oryzae，MF491815.1)ITS序列同源性达100％。利用MEGA7.0软件与GenBank数据库中登录的部分Rhizopus属序列构建的系统发育树揭示，菌株XERF-1与米根霉(Rhizopusoryzae)的同源性最高，聚为一个分枝(图3)。结合形态学分析的结果，表明XERF-1菌株是米根霉(Rhizopus oryzae)。
基于上述对XERF-1菌株的形态学及功能分析和ITS同源性分析结果，将分离得到的XERF-1菌株鉴定为米根霉(Rhizopus oryzae)。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：
菌种名称：米根霉
拉丁名：Rhizopus oryzae
菌株编号：XERF-1
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年01月25日
保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.15268。
实施例2：米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的功能鉴定
1.产胞外酶：
纤维素酶测定参照张晓丽等，饲料中纤维素酶活力的测定方法研究[J].中国饲料，2019(17):104-107.果胶酶测定参照王小敏等.分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究[J].食品工业科技，2007(05):227-229。分别测定了24h、48h、96h、120h、144h的纤维素酶(图4)和果胶酶活性(图5)。
结果显示，XERF-1发酵液中含有较高含量的纤维素酶和果胶酶，并且两种酶活力都是先升后降的趋势，72h时酶活力最高，72h时纤维素酶活力达到432.01U.ml-1，果胶酶活力72h时达到773.02U.ml-1。
2.广谱抑菌效果：
以串珠镰孢菌、腐皮镰孢菌、尖孢镰孢菌和层出镰孢病原菌为供试病原菌进行对峙试验，反复筛选得到1株对供试病原菌拮抗效果最好的菌株，标记为XERF-1。菌株XERF-1与四种苹果连作障碍主要病原菌的平板对峙实验见图1。将XERF-1菌株与有害镰孢菌接入PDA培养平板后，XERF-1菌株菌丝快速生长，并产生大量孢子，迅速包围镰孢菌，与镰孢菌接触后会继续生长，直至菌丝长满整个培养平板，此菌株对层出镰孢菌、串珠镰孢菌、尖孢镰孢菌和腐皮镰孢菌的抑制率分别为76.5％、77.6％、75.0％和82.4％，拮抗系数为Ⅰ级。
抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％
进一步研究发现：米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1的生防方式主要是利用其极快的生长速度快和良好的环境适应性能快速在根系和土壤中定殖，并迅速大量繁殖，带走病原菌生长所需的营养物质，导致病原菌因营养不足、生长能力不足而生长缓慢或停止生长。内生真菌米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1和苹果连作障碍病原真菌生态位是相同的，因此XERF-1可以通过抢占病原菌的生长空间、抑制病原菌的生长繁殖，来提高宿主植物的抗性，从而起到防治苹果连作障碍的作用。所以米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1对真菌具有普遍的生态位竞争关系，因此具有广谱抑菌活性。
实施例3：盆栽试验
1.试验设计：
盆栽试验于2021年3-10月在山东农业大学南校区国家苹果工程实验中心进行，供试植株为平邑甜茶(Malus hupehensis Rehd.)实生苗。将平邑甜茶种子于4℃层积30d左右，种子露白后播种于装有育苗基质的培养钵中进行育苗。待幼苗长至5～6片真叶时选取长势一致、无病虫害植株，于5月初移栽至装有6.5kg不同处理土壤的泥瓦盆中(上直径25cm、下直径为17cm、高18cm)。
盆栽试验用土取自山东省泰安市满庄滩清湾35年老苹果园，自距树干80cm，深10～40cm的区域，多点随机取土，混匀。土壤类型为沙壤土，有机质含量为10.46g·kg-1，速效氮31.46mg·kg-1，速效钾102.64mg·kg-1，速效磷17.36mg·kg-1，土壤pH 5.75。
盆栽试验所用菌肥，由本实验室提供拮抗菌株及制作技术，由德州创迪微生物资源有限公司负责制作，具体制备方法如下：
将米根霉(Rhizopus oryzae)XERF-1孢子悬浊液接种到发酵培养基中，所述发酵培养基的组成为：葡萄糖50.00g，(NH4)2SO4 2.00g，KH2PO4 0.30g，NaH2PO4 0.08g，MgSO4·7H2O 0.30g，ZnSO4·7H2O 0.08g，CaCO3 10.00g(CaCO3用锡箔纸包着单独灭菌后加入发酵液平衡pH)，蒸馏水1000mL；在34℃温度下180r/min摇床发酵培养48h，得到液体菌剂。
将液体菌剂与灭菌后的载体按1ml：10g混合均匀，32℃发酵培养12天，即制备得到米根霉XERF-1菌肥。
所述载体为牛粪和玉米秸秆按重量比3:1混合而成。
所制备的米根霉XERF-1菌肥中，活菌量2.00×109cfu·g-1，有效氮含量0.41mg·g-1，有效磷含量1.22mg·g-1，有效钾含量0.98mg·g-1。
试验共设置4个处理：
连作对照(CK1)：直接使用取自35年老苹果园的连作土进行盆栽试验；
溴甲烷熏蒸处理(CK2)：对取自35年老苹果园的连作土采用溴甲烷进行熏蒸处理之后再进行盆栽试验；
菌肥载体处理(T1)：在取自35年老苹果园的连作土中添加空白菌肥载体(牛粪和玉米秸秆按重量比3:1混合而成)并充分混匀，空白菌肥载体的添加量为连作土质量的1％。
米根霉XERF-1菌肥处理(T2)：在取自35年老苹果园的连作土中添加米根霉XERF-1菌肥并充分混匀，米根霉XERF-1菌肥的添加量为连作土质量的1％。
每处理20盆，每盆定植1株幼苗，统一肥水管理。
2.测定指标
生物量测定：植株株高和地径分别用米尺和游标卡尺测量，测鲜质量时先用自来水洗净地上部茎叶和地下部根系，晾干后用电子天平测定，然后80℃烘至恒重后测质量。
土壤微生物的测定：采用平板稀释涂布法分别用LB和PDA培养基测定土壤中可培养细菌、真菌数量(沈萍和陈向东，2007)。
土壤酶的测定：取平邑甜茶幼苗根际新鲜土壤，参照关松荫等(1986)的方法，将取回来的土壤晾干，过2mm筛。脲酶活性测定采用靛酚蓝比色法，中性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法，蔗糖酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法，过氧化氢酶活性利用高锰酸钾滴定法测定。
平邑甜茶幼苗根系抗氧化物酶的提取、活性测定及丙二醛含量测定：取盆栽平邑甜茶幼苗植株，用自来水把根部杂质冲洗干净，选取2g左右新鲜的白根装入封口袋、标号，放入液氮罐中，带回实验室，进行根根酶提取。根酶提取前需提前把研钵放冰箱降温，整个提取过程需将研钵放在冰上进行，具体参照(李家家，2016)的方法。
土壤微生物群落结构的测定；土壤DNA参考E.Z.N.ATM土壤DNA提取试剂盒(OmegaBio-tekOmc.USA)说明书步骤进行提取。利用CFX96TMThermal Cycler(Bio-Rad)对土壤中尖孢镰孢菌(Fusarium solani)的基因拷贝数进行实时荧光定量分析。土壤真菌多样性的测定参照王义坤等(2019)的方法。
光合速率测定:CIRAS-3便携式光合仪器(PP System，UK)测量了平邑甜茶幼苗的细胞间CO2浓度(Ci)、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr).
数据处理：数据利用Microsoft Excel 2010和Graphpad Prism进行计算作图，用SPSS23.0进行比较均值、单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性比较(a＝0.05)。
3.试验结果：
(1)XERF-1菌肥对平邑甜茶幼苗的促进生长作用
由表1可以看出，在盆栽条件下与连作对照(CK1)相比，XERF-1菌肥处理(T2)可以促进平邑甜茶幼苗生物量的增加，7月株高、地径、鲜质量和干质量分别增加了60.8％、36.5％、133.3％和144.0％，9月份和7月份的趋势基本一致；虽然XERF-1菌肥处理(T2)的平邑甜茶幼苗的长势未能超过溴甲烷熏蒸处理(CK2)，但与连作对照处理(CK1)、菌肥载体处理(T1)形成了显著性差异。
表1：XERF-1菌肥处理对苹果连作土盆栽平邑甜茶幼苗生物量的影响
Figure BDA0003474140580000111
(2)XERF-1菌肥处理对苹果连作土盆栽平邑甜茶幼苗根系结构的影响
由表2可知，2021年7月，与连作对照(CK1)相比，施加米根霉XERF-1菌肥(T2)后根系长度、根表面积、根体积、根尖数分别较连作土增加64.2％、110.8％、47.4％、131.6％。XERF-1菌肥处理显著的提高了根系构型相关参数，而菌肥载体与连作处理相比差异不明显。
表2：XERF-1菌肥对平邑甜茶根系结构的影响
Figure BDA0003474140580000112
(3)XERF-1菌肥处理对苹果连作土盆栽平邑甜茶幼苗光合参数的影响
由表3可知，2021年7月，XERF-1菌肥处理(T2)的平邑甜茶幼苗叶片净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)，分别是连作对照(CK1)的1.53倍、1.04倍、1.35倍和1.37倍；XERF-1菌肥(T2)显著提高了除胞间CO2浓度(Ci)外的平邑甜茶幼苗的光合参数，但还未达到溴甲烷熏蒸处理(CK2)的效果。
表3：XERF-1菌肥对平邑甜茶幼苗叶片Pn、Ci、Tr、Gs的影响
Figure BDA0003474140580000121
(4)XERF-1菌肥处理对苹果连作土壤酶活性的影响
从图6可以看出，XERF-1菌肥处理(T2)可增加土壤的酶活性，其中7月的脲酶、蔗糖酶、中性磷酸酶和过氧化氢酶活性分别是对照(CK1)的2.64、1.91、1.37和1.79倍；9月份与7月份的土壤酶变化趋势基本一致，连作对照、菌肥载体形成了显著性差异。
(5)不同处理对根系保护性酶活性的影响
图7显示，连作苹果园土壤进行XERF-1菌肥处理(T2)后可显著提高根系保护酶活性，降低丙二醛MDA的含量。其中，7月份POD、CAT、SOD酶活性分别是连作对照(CK1)的1.72、1.58和1.6倍，丙二醛MDA的含量降低了42％。
(6)XERF-1菌肥处理对土壤中可培养微生物的影响
XERF-1菌肥处理四个月后的土壤中的真菌和细菌情况分别如图8和图9所示，由图8可以看出，XERF-1菌肥处理(T2)的PDA培养平板上除了米根霉XERF-1，几乎看不到其它真菌生长，而菌肥载体对照(T1)与连作对照(CK1)土壤真菌数量多、种类复杂。图9所示，与连作对照(CK1)相比,XERF-1菌肥处理(T2)在一定程度上提高细菌数量。
(7)XERF-1菌肥处理对苹果连作土壤中尖孢镰孢菌的影响
如图10所示，通过实时荧光定量PCR技术对土壤中的尖孢镰孢菌进行定量测定，其中7月份，与连作土对照(CK1)相比，溴甲烷熏蒸连作土(CK2)和XERF-1菌肥处理(T2)使尖孢镰孢菌的基因拷贝数显著降低，分别比连作土对照降低了82.2％和68.5％。XERF-1菌肥处理后土壤中尖孢镰孢菌的拷贝数大幅下降，说明米根霉XERF-1菌肥施入土壤后米根霉XERF-1大量繁殖，占据了大部分营养空间使尖孢镰孢菌的生长繁殖受到抑制，而菌肥载体处理(T1)与连作土对照(CK1)相比无显著差异。
实施例4：大田实验
1.实验设计
大田实验于2021年4月中旬分别在山东省烟台市栖霞市十里堡村、山东省烟台市莱州市沙河镇湾头村和山东省淄博市沂源县南麻街道朱家村三地进行，实验所用植株为两年生嫁接苗，砧木为M9T337，接穗为烟富9，选取长势一致的苗木栽植。栖霞试验点土壤类型为沙壤土，莱州试验点土壤类型为粘壤土，沂源试验点土壤类型为沙土。
每个试验点的大田实验均设4个处理，每个处理10棵树。4个处理分别为：连作对照(CK1)、溴甲烷熏蒸处理(CK2)、空白菌肥载体处理(T1)和XERF-1菌肥处理(T2)；其中，连作对照(CK1)分别采用的是3个试验点未进行任何处理的连作土壤；溴甲烷熏蒸处理(CK2)采用的是溴甲烷熏蒸处理的连作土壤；空白菌肥载体处理(T1)和XERF-1菌肥处理(T2)是在连作土壤中分别添加空白菌肥载体和XERF-1菌肥，菌肥和载体的使用量均为树穴挖出土方土壤质量的1％，栽植前将挖出土方与其充分混匀回填。
大田试验所用XERF-1菌肥，其制备方法同实施例3。空白菌肥载体为牛粪和玉米秸秆按重量比3:1混合而成。
2.测定指标及方法
测定大田两年生嫁接苗株高、地茎、发枝量和枝长等生物量指标。植株株高和地径分别用米尺和游标卡尺测量。
3.试验结果
表4：大田条件下XERF-1菌肥对连作苹果园两年生嫁接苗的影响
Figure BDA0003474140580000131
Figure BDA0003474140580000141
由表4可以看出，在大田条件下与连作对照(CK1)相比，XERF-1菌肥处理(T2)可以促进苹果两年生嫁接苗生物量的增加，其中栖霞、莱州和沂源试验点的株高分别增加了33.3％、30.0％和44.3％，地茎分别增加36.2％、56.0％和36.0％。另外，三个试验点植株的发枝量和枝长也有不同程度提高。该结果也验证了XERF-1菌肥在大田环境的促生效果，证明了该株菌在大田实际生产中对减轻苹果重茬障碍方面表现优异，可用于苹果重茬障碍的防治。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一株米根霉XERF-1及其在减轻苹果连作障碍中的应用
<130> 2022
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgcgttct tcatcgatgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgagcgtgg tatcacccat cg 22
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gccatccttg gagaccagc 19

Claims (10)

1.一株米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1，其生物保藏号为：CGMCC No.15268。
2.含有权利要求1所述米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中，米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1以被培养的活菌、孢子悬液或者发酵液的形式存在。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为液剂、颗粒剂或粉剂。
5.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为水分散剂或可湿性粉剂。
6.权利要求1所述的米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1或者权利要求2-5任一项所述的含有米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1的菌剂在如下（1）-（4）至少一项中的应用：
（1）抑制植物病原菌的生长；
（2）制备用于抑制植物病原菌的产品；
（3）防治由植物病原菌所致病害；
（4）制备用于防治由植物病原菌所致病害的产品；
所述植物病原菌为保藏编号CGMCC NO.22426的ARD专化型层出镰孢菌（Fusarium proliferatum f.sp.malus domestica）MR5、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰孢菌（Fusarium solani）或串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）。
7.权利要求1所述的米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1在产纤维素酶和果胶酶中的应用。
8.权利要求1所述的米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1或者权利要求2-5任一项所述的含有米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1的菌剂在如下（1）或（2）中的应用：
（1）减轻苹果连作障碍；
（2）制备减轻苹果树连作障碍的生防制剂。
9.权利要求1所述的米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1或者权利要求2-5任一项所述的含有米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1的菌剂在如下（1）-（4）至少一项中的应用：
（1）促进连作苹果幼苗地上部及地下部的生长；
（2）抑制土壤中引起苹果连作障碍的病原菌的生长，所述病原菌为保藏编号CGMCCNO.22426的ARD专化型层出镰孢菌（Fusarium proliferatum f.sp.malus domestica）MR5、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰孢菌（Fusarium solani）或串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）；
（3）提高苹果连作土壤中土壤脲酶、中性磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性；
（4）提高苹果连作土壤中根系保护酶活性，降低丙二醛含量。
10.一种减轻苹果连作障碍的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1或者权利要求2-5任一项所述的含有米根霉（Rhizopus oryzae）XERF-1的菌剂施于苹果连作土壤中。
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