CN114806895B - 内生真菌m-b927在提高水稻谷粒产量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了内生真菌M‑B927在提高水稻谷粒产量中的应用，属于微生物应用技术领域。所述应用包括：将保藏号为CCTCC NO:M 2021503的内生真菌Magnaporthaceae sp.M‑B927与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中。本发明提供了壳状巨座壳菌M‑B927在促进水稻生长，增加谷粒产量方面的新用途，通过将内生真菌M‑B927定殖于水稻根部组织，可以显著提升水稻种苗素质、增加水稻产量，内生真菌M‑B927对水稻显著的共生互作效果在农业领域内的推广应用具有巨大价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种壳状巨座壳菌M-B927在提高水稻种苗素质和谷粒产量中的应用。
背景技术
水稻作为我国最重要的粮食作物，实现水稻的稳定高产是我国可持续发展的基础。近年来随着人们对植物微生态系统的深入认识，发现植物的表型除了受自身遗传特性的影响外，还受周围有益微生物的积极调控。植物与内生真菌的共生互作就是其中典型的例子，内生真菌不仅能够促进植物营养生长、增加生物量、而且能够提高寄主抗生物和非生物胁迫的能力，随着对内生真菌研究的逐渐关注，植物与内生真菌共生互作机制研究已成为新的国际研究热点。利用野生稻内生真菌重建有益的水稻-内生真菌共生体系是促进水稻生长、提高产量与抗逆性的有效途径之一。
专利文献CN 101486970 A公开了一种真菌菌株，保藏号为：CGMCC2737的稻瓶霉(Phialophora oryzae)R5-6-1，该菌株能够促进水稻的生长和增加其生物量。目前，我国水稻机械化插秧迅速推广普及，“秧好一半谷”，提高秧苗素质，健苗壮秧是促进水稻高产的重要技术措施。然而，水稻生长过程分为营养生长和生殖生长，促进水稻生长与营养生长有关；谷粒的增产则是与生殖生长有关，营养生长为生殖生长提供所需养分，生殖生长为下一代的营养生长提供条件；两者又相互制约，存在养分竞争关系，当营养生长过旺时则生殖生长受到抑制，当生殖生长过旺时，则营养生长不良。
因此，挖掘对水稻营养生长及生殖生长均有促进作用的内生真菌用于建立水稻共生体系，有望实现水稻的稳定高产。
专利文献CN 113388526 A公开了一株从云南疣粒野生稻根系中分离得出的瓶霉属内生真菌Falciphora oryzae FO-R20，保藏号CCTCC M 2021505，通过将内生真菌FO-R20定殖于水稻根部组织，可以显著提升水稻种苗素质，并且对增加水稻谷粒产量的效果明显。
在自然生态系统中藏匿着大量的有益微生物，挖掘更多的野生稻内生真菌资源，建立内生真菌与水稻的互惠共生体，对于水稻的产量、农业的可持续发展具有重要的意义。目前尚未有报道指出壳状巨座壳菌具有提高水稻秧苗素质及稻谷产量方面的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够促进水稻生长，增加谷粒产量的野生稻内生真菌，利用其与水稻的共生互作实现水稻的稳定高产。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927在提高水稻种苗素质中的应用，所述内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927的保藏号为CCTCC NO:M 2021503。
内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927分离自云南疣粒野生稻根系，属于壳状巨座壳菌Magnaporthiopsis incrustans。本发明研究发现，将内生真菌Magnaporthaceaesp.M-B927与水稻共培养对水稻生长具有促进作用，可以显著提高水稻种苗素质，表现为植株叶绿素含量、株高、根长、鲜重和干重等方面显著提高。
所述应用包括：内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927与水稻种子共培养，使其定殖于水稻幼苗根部组织中。
本发明还提供了内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927在提高水稻谷粒产量中的应用。
本发明研究发现，内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927定殖于水稻根部组织后，对水稻谷粒增产效果显著，实际增产达到5.72％。
所述应用包括：内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中。
进一步的，所述应用包括：将内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927制备成种衣剂，再与水稻种子混合，置于阴凉通风处晾干制得包衣种子，然后将包衣种子通过直播的方式播种于大田，培育至收获；
或者，将内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927制备成固体菌肥，再混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获。
本发明还提供了一种提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法，包括以下步骤：
(1)将保藏号为CCTCC NO:M 2021503的内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927接种至液体发酵培养基中，培养获得M-B927菌丝，再与壳聚糖溶液混匀后制得种衣剂；
(2)将种衣剂与水稻种子混合，制得包衣种子，然后将包衣种子通过直播的方式播种于大田，培育至收获；
或者，
a、将保藏号为CCTCC NO:M 2021503的内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927接种至液体发酵培养基中，培养获得发酵液，再将发酵液接种于无菌大麦粒上，黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，制得M-B927固体菌肥；
b、将M-B927固体菌肥混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获；
所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4％豆饼粉、1％玉米粉、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾。
进一步的，步骤(1)或步骤a中，液体发酵之前，先将内生真菌Magnaporthaceaesp.M-B927菌株接种于PDA培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。
进一步的，液体发酵的条件为25℃，转速150rpm，培养7天。
进一步的，步骤(1)中，菌丝与质量百比分浓度为1％的壳聚糖溶液按照1g：10L的比例混合制得种衣剂。
步骤a中，发酵液与无菌大麦粒按照100mL：500g的比例混合，25℃黑暗培养至菌丝生长布满麦粒。
进一步的，步骤(2)中，制备包衣种子时，消毒后的种子与种衣剂按照2.5g:1mL的比例混匀，包衣后置于15-28℃的阴凉通风处晾干。
步骤b中，制备混合基质中，固体菌肥与育苗基质按照质量比1:9进行混合。
进一步的，步骤(2)中，利用1％次氯酸钠对水稻种子进行表面消毒10min。
步骤b中，将水稻种子用25％氰烯菌酯3000倍液浸泡2天进行种子消毒，随后放于30℃黑暗恒温箱中催芽1-2天。
本发明具备的有益效果：
本发明提供了壳状巨座壳菌M-B927在促进水稻生长，增加谷粒产量方面的新用途，通过将内生真菌M-B927定殖于水稻根部组织，可以显著提升水稻种苗素质、增加水稻产量，内生真菌M-B927对水稻显著的共生互作效果使其在农业领域内的推广应用具有巨大价值。
附图说明
图1为内生真菌M-B927的菌落形态图(A)、在光学显微镜下分生孢子形态(B，标尺为10μm)、菌丝形态(C，标尺为20μm)、瓶状产孢梗形态(D，标尺为1μm)。
图2为内生真菌M-B927对水稻秧苗素质的影响，(A)和(B)为水稻秧苗照片，(C)-(H)分别为叶绿素含量、株高、根长、地上部鲜重、地下部鲜重、干重；显著性采用t-test，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图3为共培养过程中M-B927菌株在根系中相对生物量(即Fungal/plant DNAratio，FPDR)的测量结果。
图4为内生真菌M-B927在缺氮条件下的菌落生长情况，其中(A)为实物图，(B)为菌落直径比较图。
图5为内生真菌M-B927在不同氮源培养基中的生长情况，其中(A)为实物图，(B)为菌落直径比较图。
图6为内生真菌M-B927包衣剂对水稻谷粒的影响，其中control为对照组，未使用M-B927包衣剂，A9-2-7为实验组，使用M-B927包衣剂。
图7为内生真菌M-B927固体菌肥对水稻谷粒的影响，其中control为对照组，未使用M-B927固体菌肥，A9-2-7为实验组，使用M-B927固体菌肥。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
菌株Magnaporthaceae sp.M-B927为发明人前期研究中从云南疣粒野生稻根系中分离获得，属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，粪壳纲Sordariomycetes，巨座壳科Magnaporthaceae，壳状巨座壳菌Magnaporthiopsis incrustans。已保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2021503，参见申请号为202110529909.6的中国发明专利。
实施例1 M-B927菌株促进水稻盆栽苗的生长
1、将纯化培养五代的内生真菌M-B927接种在PDA培养基上，发现内生真菌气生菌丝不发达，匍匐贴在培养基表面，菌落初期为白色，后期菌落中间变黑，外圈白色。菌丝宽度2.0-4.0μm，分生孢子梗单生，不分枝。分生孢子椭圆形，无隔膜，11-15×3.5-6.5μm(图1)。
2、将内生真菌M-B927与水稻(供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，CO39)在组培瓶中进行无菌共培养14天，测量水稻的叶绿素含量和水稻植株高度。
结果如图2所示：M-B927菌株与水稻共培养对水稻生长的促进作用。与对照植株相比，M-B927菌株处理的水稻幼苗生长得更好、更强，其叶绿素含量、株高、根长、鲜重和干重分别提高了23.39％、32.82％、19.22％、33.3％和42.15％。
3、选取共培养时间节点，对M-B927菌株在根系中相对生物量(即Fungal/plantDNA ratio，FPDR)进行测量，用于评估真菌的生长和相应的植物反应。结果发现，10天内，FPDR从0.043±0.007到1.254±0.808出现早期增加，随后在20天内显著增加到27.285±7.198(图3)。
实施例2 M-B927菌株对氮源营养的利用测试
1、为了解内生真菌对氮元素的吸收利用情况，尤其是M-B927对氮源的利用情况，进行了缺氮培养：将内生真菌菌株在PDA培养基上培养5d后，用直径为5mm打孔器在菌落边缘打取新鲜菌丝块，接种在直径为7cm的不同条件的培养基上。具体培养基如下：
1)基本培养基MM(N源：硝酸钠，含N量为100mM；C源：1％葡萄糖)。
2)缺氮培养基(缺NaNO3)：以MM-NaNO3表示，N源：硝酸钠，含N量为1mM；C源：1％葡萄糖。
3)缺氮培养基，(缺(NH4)2SO4)：以MM-(NH4)2SO4表示，N源：硫酸铵，含N量为1mM；C源：1％葡萄糖。
黑暗条件下，25℃培养5-7d，拍照，测量菌落直径。五个重复，三次生物学重复。
结果如图4所示：在正常培养基(MM培养基)上培养的对照组菌株平均直径为3.79cm。在缺氮条件下，接种在MM-NaNO3培养基中的内生真菌M-B927菌株直径显著高于对照组，平均直径为4.25cm，这表明了该内生真菌对氮源较为敏感，氮素含量越低，生长越好。这个结果表明M-B927能够在缺氮(营养贫瘠)环境下，帮助水稻生长的能力强。
2、因为M-B927菌株对N源较为敏感，所以检测了它在以MM培养基为基础的不同氮源培养基上的生长情况。以基本培养基MM(硝酸钠含量0.6％)为空白对照，将MM培养基中的硝酸钠等质量分别替换为硫酸铵、酵母提取物、麦芽提取物、酪蛋白氨基酸和胰蛋白胨。
结果如图5所示，M-B927菌株在不同培养基上形态差异不大，M-B927菌株在含酪蛋白氨基酸培养基(0.6％Casamini Acids)上菌落平均直径显著高于对照组菌株直径(0.6％NaNO3)，平均直径为5.42cm。
实施例3 M-B927菌株包衣剂对水稻产量的影响
供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，春优927。
1、M-B927菌株培养与液体发酵
将保存于滤纸片上的M-B927菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d。用直径0.5cm的打孔器打取菌饼，将菌饼(5个)接种至含有500ml液体发酵培养基的三角瓶中，置于摇床中(25℃，转速150)培养7d。然后将液体发酵液真空抽滤，去除培养基，得到菌丝。称取0.1g菌丝，测定含水率为80％，以备计算菌丝干重。
PDA培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15g/L。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯(200g/L)，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。
液体发酵培养基：豆饼粉0.4％，玉米粉1％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，按比例配制，加水至250ml；120℃湿热灭菌15min。
2、M-B927种衣剂制备：将菌丝与1％壳聚糖溶液按照1：10000的比例(干重：体积)混合均匀，即干重为1g的菌丝与10L 1％壳聚糖溶液混合，制成种衣剂。因真空抽滤后的菌丝含水率不同，所以每次制备种衣剂按照菌丝干重来计算。
1％壳聚糖溶液配方如下：1g壳聚糖溶于100ml的1％醋酸溶液。
3、种子包衣处理：用1％次氯酸钠对水稻种子表面消毒10分钟，清水冲洗干净，沥干，然后将消毒后的种子与种衣剂按照2.5:1的比例(重量：体积)混匀，即每2.5g种子使用1mL种衣剂，得到包衣种子。将包衣后的种子平铺于无菌纱布上，置于阴凉通风处(15-28℃)晾干2-3天。
4、稻谷测产
将包衣种子通过直播方式播种，正常水肥管理，整个育苗期不施用任何杀菌剂，培育至收获。种子每亩用量为2kg。
内生真菌包衣剂育秧示范田位于浙江省杭州市良渚镇，总面积600亩，以未包衣的种子为对照。播种期5月22日，成熟日期10月23日。水稻成熟时，发现内生真菌包衣处理的水稻生长健壮，长势平衡，青杆黄熟，无明显病虫害发生，穗长增加，谷粒饱满(图6)。
理论测产：经过内生真菌包衣处理的水稻平均理论亩产为713.18kg/亩，未使用内生真菌包衣处理的对照组平均理论亩产为662.25/亩，理论增产7.68％(表1)。
表1内生真菌M-B927包衣剂对水稻的理论增产表
实际测产：内生真菌种衣剂处理的稻田和对照田各取1块田，面积分别为1.1261亩和1.1711亩。经全田机械收割、实测含水量，稻谷称重，按照1.0％扣除杂质，按籼粳杂交稻含水率13.5％的标准折算，内生真菌包衣剂直播水稻实收稻谷721.60公斤/亩，对照为682.55公斤/亩，实际增产5.72％。
百亩方测产：按农业农村部水稻产量测产验收办法，对内生真菌包衣处理直播单季稻百亩方进行测产，结果如表2，经算术平均，示范方平均亩产693.70公斤/亩。
表2内生真菌M-B927包衣剂百亩示范方测产结果
| 面积(亩) | 湿谷重(公斤) | 水分 | 杂质(％) | 折干谷产量(公斤) | |
| 田块1 | 1.0660 | 1098 | 20.22 | 1％ | 703.70 |
| 田块2 | 1.0360 | 1080 | 22.36 | 1％ | 693.11 |
| 田块3 | 1.0811 | 1106 | 21.89 | 1％ | 684.30 |
实施例4 M-B927固体菌肥对水稻产量的影响
供试植物：水稻Oryza sativa L.，常规品种，春优927。
1、M-B927菌株培养与发酵
将保存于滤纸片上的M-B927菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基上进行活化培养，25℃，黑暗培养7d。用直径0.5cm的打孔器打取菌饼，将菌饼(5个)接种至含有500ml液体发酵培养基的三角瓶中，置于摇床中(25℃，转速150)培养7d。然后将液体发酵液接种于装有无菌麦粒培养瓶中(500g麦粒/瓶，100ml发酵液：500g麦粒)，25℃黑暗培养箱中培养10-15d，待菌丝生长布满麦粒，备用。
PDA培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L，琼脂15g/L。根据待配培养基的体积称取所需马铃薯(200g/L)，水煮后捣碎溶解过滤，加入葡萄糖和琼脂，121℃高压蒸汽灭菌20min。
液体发酵培养基：豆饼粉0.4％，玉米粉1％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，按比例配制，加水至250ml；120℃湿热灭菌15min。
2、M-B927固体菌肥的基质育秧
将发酵好的固体菌肥与常规育苗基质混合后，平铺于育苗盘中，每育苗盘含有10g固体菌肥。将水稻种子用25％氰烯菌酯3000倍液浸泡2天进行种子消毒，随后放于30℃黑暗恒温箱中催芽1-2天。待种子露白，将其均匀播种于育苗盘中，放入秧田育苗培养，正常浇水管理。
3、水稻秧苗移栽
待秧苗在育苗盘中生长23-25天后，将秧苗拔出，移栽至大田。移栽时，每丛3株苗，每丛株距10-15cm，行距30cm。正常水肥管理，整个生育期内不施用任何杀菌剂，培育至收获。
4、稻谷测产
内生真菌菌肥育秧示范田位于浙江省杭州市良渚镇，总面积200亩，以常规营养土育秧机插为对照。播种期5月22日，成熟日期10月23日。水稻成熟时，发现内生真菌育秧机插连作晚稻生长健壮，长势平衡，青杆黄熟，无明显病虫害发生，穗长增加，谷粒饱满(图7)。
理论测产：经过内生真菌固体菌肥育秧的水稻平均理论亩产为737.44kg/亩，未使用内生真菌菌肥的对照组平均理论亩产为688.62kg/亩，理论增产7.09％(表3)。
表3内生真菌M-B927固体菌肥对水稻的理论增产表
实际测产：内生真菌固体菌肥育秧和对照各取1块田，面积分别为1.0657亩和1.0275亩。经全田机械收割、实测含水量，稻谷称重，按照1.0％扣除杂质，按籼粳杂交稻含水率13.5％的标准折算，内生真菌固体菌肥育秧机插实收稻谷732.50公斤/亩，对照为694.20公斤/亩，实际增产5.52％。
百亩方测产：按农业农村部水稻产量测产验收办法，对内生真菌基质育秧机插连作晚稻百亩方进行测产，结果如表4，经算术平均，示范方平均亩产724.26公斤/亩。
表4内生真菌M-B927固体菌肥百亩示范方测产结果
以上实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.内生真菌Magnaporthaceae sp. M-B927在提高水稻谷粒产量中的应用，其特征在于，所述内生真菌Magnaporthaceae sp. M-B927的保藏号为CCTCC NO:M 2021503。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：内生真菌Magnaporthaceae sp. M-B927与水稻共培养，使其定殖于水稻根部组织中。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将内生真菌Magnaporthaceae sp. M-B927制备成种衣剂，再与水稻种子混合，置于阴凉通风处晾干制得包衣种子，然后将包衣种子通过直播的方式播种于大田，培育至收获；
或者，将内生真菌Magnaporthaceae sp. M-B927制备成固体菌肥，再混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获。
4.一种提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将保藏号为CCTCC NO:M 2021503的内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927接种至液体发酵培养基中，培养获得M-B927菌丝，再与壳聚糖溶液混匀后制得种衣剂；
(2)将种衣剂与水稻种子混合，制得包衣种子，然后将包衣种子通过直播的方式播种于大田，培育至收获；
或者，
a、将保藏号为CCTCC NO:M 2021503的内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927接种至液体发酵培养基中，培养获得发酵液，再将发酵液接种于无菌大麦粒上，黑暗培养至菌丝生长布满麦粒，制得M-B927固体菌肥；
b、将M-B927固体菌肥混合到育苗基质中制得混合基质，水稻种子萌发后播种于混合基质中育苗，然后水稻秧苗移栽至大田，培育至收获；
所述液体发酵培养基以质量百分比计，每250mL含0.4%豆饼粉、1%玉米粉、0.05%硫酸镁、0.1%磷酸氢二钾。
5.如权利要求4所述的提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法，其特征在于，步骤(1)或步骤a中，液体发酵之前，先将内生真菌Magnaporthaceae sp.M-B927菌株接种于PDA培养基进行活化培养，25℃黑暗培养7天。
6.如权利要求4所述的提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法，其特征在于，步骤(1)中，菌丝与质量百比分浓度为1%的壳聚糖溶液按照1g：10L的比例混合制得种衣剂；
步骤a中，发酵液与无菌大麦粒按照100mL：500g的比例混合，25℃黑暗培养至菌丝生长布满麦粒。
7.如权利要求4所述的提高水稻种苗素质和谷粒产量的方法，其特征在于，步骤(2)中，制备包衣种子时，消毒后的种子与种衣剂按照2.5g: 1mL的比例混匀，包衣后置于15-28 ℃的阴凉通风处晾干；
步骤b中，制备混合基质中，固体菌肥与育苗基质按照质量比1:9进行混合。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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