CN107849518A - 从稻根际分离的新植物内生细菌稻生芽孢杆菌以及使用其开发用于天然植物保护和植物增强的制剂 - Google Patents

Abstract

公开了具有微生物肥料效果并且可用作新生物杀虫剂的新菌株：通过分离可广泛抑制植物病原真菌和细菌的生长并且特别作用于作为宿主植物的稻从而保持疾病抗性诱导效果和植物生长促进效果两者的多功能植物内生细菌，然后将其大量培养和配制。本发明提供了新微生物稻生芽孢杆菌或相对于所述稻生芽孢杆菌具有70％以上的DNA‑DNA相关性值的稻生芽孢杆菌。

Description

从稻根际分离的新植物内生细菌稻生芽孢杆菌以及使用其开 发用于天然植物保护和植物增强的制剂

技术领域

本发明涉及植物内生微生物和包含所述植物内生微生物的微生物制剂，更具体地，涉及新微生物稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)和包含所述稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)的微生物制剂。

本发明从作为以下项目的一部分进行的研究推断得到：2010年由食品、农业、林业和渔业部门支持的“下一代生物杀虫剂开发项目(Next-Generation BiopesticideDevelopment Project)”(项目文件号10044909,项目名称：下一代微生物材料的开发以用于利用拮抗微生物而进行的植物疾病控制(Development of next-generationmicroorganism material for plant disease control using antagonistmicroorganisms))和2013年由工业和贸易部门支持的“产业融合核心技术开发项目(Industrial Convergence Core Technology Development Project)”(项目文件号808015-3-2,项目名称：具有持续效力的广谱益生素作物保护性制剂的开发Developmentof broad spectrum probiotic crop protective agent having sustained effects(2010-2013))。

背景技术

近几十年以来，全世界为了提高农作物如谷物、绿色菜类、水果等的产量已经使用大量的化学肥料和农业杀虫剂来控制疾病和害虫以及杂草控制。由于这样连续使用化学肥料和农业杀虫剂，一些问题一直在凸显，例如土壤酸化、土壤肥力损失、环境污染、生态灭绝、哺乳动物毒性、造成疾病和害虫以及杂草的抗农药性等。此外，由于大气二氧化碳量的增加引起的异常气候变化，持续干旱和农业用地中盐的积累现正危及着农作物的稳定生产。

为了克服上述问题，国内外已经努力减少所使用的化学肥料和农业杀虫剂的量，特别是，自1999年初始建立支持生态友好农业行动(Act on the Support ofEnvironmentally-friendly Agriculture)以来，韩国政策现在已经向第三环境友好农业推广前进。该计划的目的是截止2015年，实现化学肥料和农业杀虫剂的使用量与2011年相比降低约15％。同时，随着社会方面生活水平提高使得对安全食品的社会需求增加，以及面向保护农业生产环境和自然生态系统的环境友好农业如有机农业或天然农业的快速扩大，使得对能够代替现有化学肥料和杀虫剂的使用微生物的新肥料和生物杀虫剂的开发的研究也迅速增加。熟知使用化学肥料和杀虫剂的局限性的跨国公司最近已经开发和分发了生物制剂，即，能够补偿上述局限性的植物活性增强剂。另一方面，跨国公司进行了甚至能够在一些严重干旱或盐积累的区域生长和发育的抗旱作物的种子开发。通过从自然环境中选择具有特定功能的微生物并且将其大量培养来配制如此开发的微生物产品。配制的微生物产品可用于叶喷或作为颗粒剂用于土壤处理以预防疾病和害虫，或相反，也可以用作微生物肥料或植物增强剂(参见非专利文献1)。

本文使用的微生物广泛分布在自然环境如土壤、植物根际、海洋等中，并且具有物种多样性和分泌不同类型的代谢物，因此有效用于环境友好农业。所述微生物的使用一般可分为三类，包括：直接使用微生物本身；使用通过微生物发酵产生的代谢物；以及使用微生物代谢物作为用于杀虫剂的新合成的先导化合物等。其中，最常用的方法是直接使用能够抑制植物病原体的拮抗微生物、促进植物生长的根际细菌(PGPR)和内生(endophytic)微生物来促进植物生长。特别地，已经对于这些微生物的植物疾病抗性进行了大量研究。

在各种微生物中，近十年来国内外对内生细菌进行了积极的研究。在本文中，内生细菌定义为存在于健康的活植物组织中提供多种优点而对植物没有任何重大损害的细菌。一般来说，已知内生细菌可存在于植物细胞之间的空隙或细胞内，直接或间接诱导对疾病、害虫和应激的抗性，并且对植物生长具有重大影响。更特别地，推测内生细菌诱导固氮、磷酸增溶、含铁细胞(siderophore)的产生、产生活性激素、产生抗菌物质或植物的疾病抗性，因此预防病原体感染并促进植物生长(参见非专利文献1至4)。这样的内生细菌与宿主植物关系密切并且可在宿主植物的组织中形成共生关系，而不被认为是病原菌(参见非专利文献5)。一些特定内生细菌可通过同时使用一种以上机制提供植物生长促进效果和疾病控制效果。另外，在植物生命的不同时期可使用不同机制。细菌的存在可改变植物基因，这样改变的基因偶尔可留下植物中内生细菌效果的线索(参见非专利文献6)。内生细菌在细胞中增殖，其中细菌的整个密度在根和茎的开始部分较高，而向着植物的更高部分如茎、叶等逐渐降低。在玉米叶的情况下，已经发现细菌的密度在约1×10³至1×10⁷cfu/g的范围内。对于迄今为止分离的内生细菌，已经发现了约50个属的约130个物种，包括例如芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Enterobacter)、农杆菌(Agrobacterium)等。这些细菌可帮助经济重要的作物如番茄、马铃薯、玉米和稻的生长，同时抑制疾病的发作，因此提高作物产量。

稻是世界上最重要的5种作物之一，但是涉及多种疾病造成的产量损失。其中，由病原真菌造成的损失，例如稻瘟病、稻纹枯病等造成了重大的作物产量损失，因此迄今已经通过开发抗性品种和开发化学农药来有效预防。但是，除了上述疾病以外，由种子传播细菌疾病引起的细菌疾病恶苗病、谷粒腐烂和白叶枯病等在一些地区也经常发生，并且造成重大损失。近年来，这些疾病难以控制。这些病原体在稻田或周围杂草的组织中过冬，并且特别地，由于稻在温暖潮湿条件下易受病原体的攻击，所有如果疾病一旦开始发展，就难以控制疾病。病原体的控制通常依赖于化学杀虫剂，但是，使用大部分这样的化学杀虫剂导致如环境污染或哺乳动物毒性的问题。因此，对于能够代替上述化学杀虫剂的环境友好的生物杀虫剂越来越感兴趣。

目前已经开发了数十个物种的用于预防植物疾病的生物杀虫剂，并且可在国内外市场商购。其中，一些有效的生物杀虫剂主要使用细菌芽孢杆菌(Bacillus)和真菌如木霉属(Trichoderma)制备(参见非专利文献7至10)。芽孢杆菌(Bacillus)型产品可包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，已知这些菌株中的大部分具有分泌抗生素物质(即，环肽(cyclicpeptide)如伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)等)以直接抑制病原体或者诱导宿主的疾病抗性。芽孢杆菌属(Bacillus sp.)形成芽孢(endospores)并且即使在恶劣自然环境下也长时间存活，并且由于相当高的抗菌能力，许多研究人员已经研究并公开了其关于植物疾病生物防治的结果(参见非专利文献10)。除了上述那些以外，最近已经报道了研究新内生细菌(即，甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotropicus))的一些结果。这种菌株于2010年在韩国初次分离且以命名法定义，并且已经被鉴定为具有植物生长促进能力(参见非专利文献1)。在这之后，在中国从人参、番茄和马铃薯根际分离了上述细菌并且被报道具有病原体抑制能力和植物生长促进效果(参见非专利文献11至13)。但是，除了上述菌株对植物病原体的抗菌能力以外，这些研究不包括关于诱导宿主植物的疾病抗性或抑制其它疾病的结果。对于稻的内生微生物的研究主要由研究人员在稻的栽培区域进行，即，韩国、中国等，并且已经公开了对于每个生长时期与最近实践和免耕的水稻的根际菌落的比较进行的研究。根据这些研究结果，报道了属于变形菌门(Proteobacteria)的菌落在免耕水稻中更常见，而根据实践农业，属于厚壁菌门(Firmicutes)的各种细菌，特别芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，以相对高比例发现于稻根际(参见非专利文献14)。此外，据报道已经从稻根际分离出芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的多个物种，其抑制病原体如稻瘟病和恶苗病的生长(参见非专利文献15)。尽管已经部分地进行了对存在于稻根际的多种不同细菌物种的这样的研究，但是依然没有公开如本发明提出的具有不同功能同时特别作用于稻的新细菌的研究。此外，对由特定环境分离的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的类型进行了许多研究，但是，仅其几个物种已经商业化并且现在有效用于植物控制(参见非专利文献16和17)。这个事实的一个原因推测是害虫控制效果可能相对低，这是因为抑制病原体的机制仅在分离拮抗菌时作为标准。因此，为了更有效预防疾病同时表现出上述菌株的特征，有必要研究和开发能够同时赋予宿主植物诱导疾病抗性的能力和促进宿主植物生长的效果从而增强宿主植物的新多功能微生物。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Madhaiyan,M.,Poongguzhali,S.,Kwon,S.W.和Sa,T.M.(2010).Bacillus methylotrophicus sp.nov.,a methanol-utilizing,plant-growth-promoting bacterium isolated from rice rhizosphere soil.Int J Syst EvolMicrobiol 60:2490-2495.

非专利文献2:Chert,C.,Bauske,E.M.,Musson,G.,Rodriguez-Kabana,R.和Kloepper,J.W.(1995).Biological control of Fusarium whilt of cotton by use ofendophytic bacteria.Biol Cont5:10-16.

非专利文献3:Costa,J.M.,&Loper,J.E.(1994).Characterization ofsiderophore production by the biological control agent Enterobactercloacae.Mol.Plant-Microbe Interact.7:440-448

非专利文献4:Wakelin,S.A.,Warren,R.A.,Harvey,P.R.,Ryder,M.H.(2004).Phosphate solubilization by Penicillium spp.closely associated with wheatroots.Biology and Fertility of Soils 40:36-43.

非专利文献5:Rosenblueth,M.,&Martinez-Romero,E.(2006).Bacterialendophytes and their interactions with hosts.Molecular Plant-MicrobeInteractions 19:827-837.

非专利文献6:de Matos Nogueira,E.,Vinagre,F.,Masuda,H.P.,Vargas,C.,deP,V.L.M..,da Silva,F.R.,dos Santos,R.V.,Baldani,J.I.,Gomes Ferreira,P.C.和Hemerley.(2001).Expression of sugarcane genes induced by inoculation withGluconacetobacter diazotrophicus and Herbaspirillumrubrisubalbicans.Genet.Mol.Biol.24:199-206.

非专利文献7:Bibi,F.,Yasir,M.,Song,G.C.,Lee,S.Y.和Chung,Y.R.(2012).Diversity and characterization of endophytic bacteria associated with tidalflat plants and their antagonistic effects on oomycetous plantpathogens.Plant Pathol J 28:20-31.

非专利文献8:Cao,C.,Park,S.和McSpadden,G.(2010).Biopesticide controlsof plant diseases:resources and products for organic farmers in Ohio.FactSheet,Agricultural and Natural Resources.SAG-18-10The Ohio State University.

非专利文献9:Lee,S.K.,Sohn,H.B.,Kim,G.G.和Chung,Y.R.(2006).Enhancementof biological control of Botrytis cinerea on cucumber by foliar sprays andbed potting mixes of Trichoderma harzianum YC459and its application on tomatin the greenhouse.Plant Pathol J22:283-288.

非专利文献10:朴庆锡(2011).微生物农业杀虫剂的发展现状和芽孢杆菌属微生物的重要性,工业化学发展前景 14(4):1-11.

非专利文献11:Kim,B.K.,Chung,J.H.,Kim,S.Y.,Jeong,H.,Kang,S.G.,Kwon,S.K.,Lee,C.H.,Song,J.Y.,Yu,D.S.,Ryu,C.M.和Kim,J.F.(2012).Genome sequence ofthe leaf-colonizing bacterium Bacillus sp.strain 5B6,isolated from a cherrytree.J Bacteriol194:3758-3759

非专利文献12:Ma,L.,Cao,Y.H.,Cheng,M.H.,Huang,Y.,Mo,M.H.,Wang,Y.,Yang,J.Z.和Yang,F.X.(2013).Phylogenetic diversity of bacterial endophytes of Panaxnotoginseng with antagonistic characteristics towards pathogens of root-rotdisease complex.Ant van Leeuwen103:299-312.

非专利文献13:Yan,X.,He,L.,Song,G.和Wang,R.(2011).Antagonisticbioactivity of endophytic strains isolated from Salvia mitiorrhiza.Afr JBiotech 10:15117-15122.

非专利文献14:Aslam,Z.,Yasir,M.,Yoon,H.S.,Jeon,C.O.和Chung,Y.(2013).Diversity of the bacterial community in the rice rhizosphere managed underconventional and no-tillage practices.J Microbiol 51:747-756.

非专利文献15:Yang,J.H.,Liu,H.X.,Zhu,G.M.,Pan,Y.L.,Xu,L.P.和Guo,J.H.(2008).Diversity analysis of antagonists from rice-associated bacteria andtheir application in biocontrol of rice diseases.J Appl Microbiol 104:91-104.

非专利文献16:Gatson,J.W.,Benz,B.F.,Chandrasekaran,C.,Satomi,M.,Venkateswaran,K.和Hart,M.E.(2006).Bacillus tequilensis sp.nov.,isolated froma 2000-year-old Mexican shaft-tomb,is closely related to Bacillussubtilis.Int J Syst Evol Microbiol 56:1475-1484.

非专利文献17:Sumpavapol,P.,Tongyonk,L.,Tanasupawat,S.,Chokesajjawatee,N.,Luxananil,P.和Visessanguan,W.(2010).Bacillus siamensiasp.nov.,isolated from salted crab(poo-khem)in Thailand.Int J Syst EvolMicrobiol 60:2364-2370.

发明内容

技术问题

因此，为了克服上述缺点，本发明的目的是通过分离可广泛抑制植物病原真菌和细菌的生长并且特别作用于作为宿主植物的稻从而保留疾病抗性诱导效果和植物生长促进效果两者的新多功能植物内生细菌，然后将其大量培养和配制来开发和提供具有微生物肥料效力、植物增强效力和植物保护效力全部的新微生物制剂。

技术方案

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了新微生物稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)或相对于上述稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)具有70％以上的DNA-DNA相关性值(relatedness value)的稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)。

在本文中，稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)可包含具有由SEQ ID NO:1或SEQID NO:2表示的碱基序列的16S rRNA。

此外，稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)可以是稻生芽孢杆菌(Bacillusoryzicola)YC7007(保藏号：KCCM11275P)或稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)YC7010(保藏号：KACC18228)。

此外，稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)可具有植物疾病抗性诱导效力。

此外，植物疾病可以是选自由谷粒腐烂、白叶枯病、穗枯病和恶苗病组成的组的至少一种。

此外，稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)可还具有植物病原体抑制效力、植物生长促进效力和植物增强效力。

另外，植物生长促进效力可以是关于稻的植物生长促进效力。

根据本发明的另一个方面，提供了用于肥料、植物保护和植物增强用途的微生物制剂，其包含作为活性成分的上述微生物及其培养溶液或培养滤液。

技术效果

根据本发明，通过使用多功能细菌稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)，可以提供包含多功能细菌的优异的微生物制剂，与本领域报道的现有细菌相比，所述多功能细菌可同时具有天然植物保护剂、植物增强剂和微生物肥料的作用，多功能细菌稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)可以同时抑制作物中重要的植物病原真菌和细菌的生长，并且不仅具有诱导宿主植物的疾病抗性效果，还具有促进宿主植物生长的效果，其以所述制剂可以分泌抗生素物质和用于促进宿主生长和诱导宿主的系统获得性疾病抗性的物质为特征，因此直接抑制植物病原体，并且可特别作用于稻以表现生长促进能力和系统获得疾病抗性诱导能力。

附图说明

图1是示出了(a)YC7007菌株和(b)YC7010菌株的16S rRNA基因的碱基序列的图。

图2是示出了通过分析YC7007菌株的16S rRNA基因序列形成的系统发生树的图。

图3是示出了与类似菌株相比，通过基因分析(即，BOX-PCR)的YC7007菌株的分析结果的照片。

图4是示出了处理的区别和比较的照片，以说明稻粒腐烂预防效果。

图5是示出了处理的区别和比较的照片，以说明白叶枯病预防效果。

图6是示出了每个培养时期YC7007菌株培养溶液的抗菌效果的(a)图和(b)照片。

图7是示出为了每个处理温度YC7007菌株培养溶液的抗菌效果的图。

图8是示出了YC7007菌株培养溶液对于主要种子传播细菌病原体的生长抑制性能的图。

图9是示出了相对于YC7007菌株诱导对于稻白叶枯病(bacterial blight)和穗枯病(panicle blight)的系统获得抗性的活性的研究结果的(a)照片和(b)图。

具体实施方式

在下文中，将参照实施例来详细描述本发明。在这之前，在本说明书的详细描述和权利要求中使用的术语和词语不限于其常见含义或字典含义。相反，在发明人可适当地定义术语的概念以便以最佳方式解释他自己或她自己的发明的原则基础上，这些必须解释为具有根据本发明的技术精神的含义和概念。因此，本说明书中阐述的实施例的配置仅是本发明的优选实施方案，而不代表本发明全部技术精神。因此，将理解的是，在提交本申请时，可存在多种可替代的等同物和修饰。

本发明人通过分离可广泛抑制植物病原真菌和细菌的生长同时特别作用于作为宿主植物的稻从而表现疾病抗性诱导效果和植物生长促进效果两者的多功能植物内生细菌，然后将其大量培养和配制，发现了可用作新形式的具有微生物肥料效力的生物杀虫剂的新菌株。

换言之，作为研究从稻田分离的细菌的结果，发现了具有全部上述效力的细菌的新物种。此外，作为进行16S rRNA基因的碱基序列的确定和分析、DNA-DNA同源性实验等的结果，其被鉴定为属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)种的新微生物，因此命名为“稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)YC7007”。

本发明中所述的这样的新微生物不仅包括稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)，还应解释为，如果在Goris等人的文章(Goris,J.,Konstantinidis,K.T.,Klappenbach,J.A.,Coenye,T.,Vandamme,P.和Tiedje,J M.(2007).DNA-DNA hybridization valuesand their relationship to whole-genome sequence similarities.Int J Syst EvolMicrobiol 57:81-91)的基础上具有DNA-DNA杂交，表现出70％以上的DNA-DNA相关性值(relatedness value)的一些微生物也包括在根据本发明的稻生芽孢杆菌(Bacillusoryzicola)中。换言之，如果根据Goris等人文章中提出的标准进DNA-DNA杂交，表现出70％以上的DNA-DNA相关性值的微生物可以作为与本发明稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)相同的微生物对待。

根据本发明的一个优选实施方案，稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)可包含具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2限定的碱基序列的16S rRNA，所述稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)可以是稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)YC7007(保藏号：KCCM11275P)或稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)YC7010(保藏号：KACC 18228)。

在下文中，将参照实施例更详细描述本发明。在本发明的实施例中，将通过分别集中于YC7007菌株的实验的实施例1和集中于YC7010菌株的实验的实施例2给出描述。

实施例1

YC7007菌株的分离和鉴定

(1)YC7007菌株的分离

YC7007菌株从位于韩国晋州市国立庆尚大学试验田的稻田土壤中生长的稻的根内部组织分离。首先，为了分离植物内生细菌，通过将根切片在1％次氯酸钠(NaOCl)溶液中浸泡10分钟来对切块表面灭菌。在将这些切片放在1/10TSA培养基(胰蛋白酶大豆培养基(Triptic Soy Broth)3g，琼脂16g/1l蒸馏水)上后，将切片培养2至3天，然后检查表面灭菌同时观察细菌生长。取1.0g具有灭菌表面的根切片放到高压灭菌器中，然后向其中加入9.0ml无菌蒸馏水，并且用无菌碗和研钵研磨混合物。取0.1ml研磨材料放到0.9ml无菌蒸馏水中，然后，稀释10倍(10^-3)，然后将其依次以10倍进行额外稀释(10^-4和10^-5)。将稀释的溶液分成三个等份并且分配到1/10TSA培养液上，然后均匀涂抹其上。将该孵育器在28℃孵育2至3周，纯化分离生长的单菌落并且命名为YC7007菌株。

(2)YC7007菌株的鉴定

为了鉴定分离出的YC7007菌株，按如下研究形态特征、生理特征和生物化学特征。标准菌株(模式物种(type species))与分离的YC7007菌株类似地进行，使用扫描电子显微镜研究形态特征，同时分别根据本发明人开发的特定分析方法和任何典型分析方法研究生理特征和生物化学特征(参见非专利文献7)。

分离的YC7007菌株是革兰氏(Gram)阳性并且均有流动性，细胞是棒形(宽0.6μm，长1.8-2.6μm)，形成内生孢子并且无法在厌氧条件下生长。下表1中示出了与相似模式物种相比该菌株的生理特征和生物化学特征的研究结果，下表2示出了DNA-DNA相关性值。表1中使用的所有菌株的结果已经由根据上述分析方法的研究获得。

表1

^a分类群：1.菌株YC7007；2.菌株YC7010^T；3.西姆芽孢杆菌KACC 15859^T；4.甲基营养型芽孢杆菌KACC 13105^T；5.枯草芽孢杆菌亚种inaquosorum KACC 17047^T；6.解淀粉芽孢杆菌亚种plantarum KACC17177^T；7.特基拉芽孢杆菌KACC 15944^T。

+:阳性；-：阴性；w：弱阳性；ND：未测定

相关模式菌株的数据来自本研究，除非另有说明。

^bSumpavapol等人，2010.

参照表1，作为比较YC7007菌株与其它相似芽孢杆菌(Bacillus)物种的生理特征和生物化学特征的结果，依据在pH 4.5和pH 12下的生长、14％盐溶液中的生长、60℃的生长、明胶降解、羧甲基纤维素未降解、API试剂盒测试中熊果素、二乳糖、淀粉、糖原或龙胆二糖的降解，萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、N-乙酰基-β-葡萄糖胺酶等的重要表型特性，可以确认YC7007菌株不同于近亲种。

同时，在确定YC7007菌株中16S rRNA基因的碱基序列后(1513bp，参见图1)，通过与GenBank/EMBL/DDBJ数据库比较进行同源性研究来检查碱基序列的系统位置。图2示出了通过分析YC7007菌株的16S rRNA基因序列形成的系统发生树。在图2中，交叉点的数目表示从1000个重复得到的引导值(bootstrap value)。

为了确认YC7007与近亲种之间的差异，研究DNA-DNA杂交(DNA-DNAhybridization)，其结果示出在下表2中。使用DIG DNA标记和检测试剂盒(Roche AppliedScience)并且参照Lee等人的文章进行实验(Lee,S.H.,Shim,J.K.,Kim,J.M.,Choi,H.K.&Jeon,C.O.(2011).Henriciella litoralis sp.nov.,isolated from a tidal flat,transfer of Maribaculum marinum Lai等人.2009to the genus Henriciella asHenriciella aquimarina nom.nov.and emended description of the genusHenriciella.Int J Syst Evol Microbiol 61:722-727)。将提取的基因DNA(基因组DNA(genomic DNA))以不同浓度稀释并且向其中加入氢氧化钠(NaOH)溶液，然后在80℃加热以使基因变性。然后，使变性基因以三个重复重复地附着于Hybond-N+尼龙膜(AmershamPharmacia Biotech)。在用限制酶HaeIII消化后，将经处理DNA片段用作菌株间交叉杂交(hybridization)的标记的DNA探针(Labelled DNA probe)。杂交和洗涤(washing)温度根据指示说明使用。用地高辛(DIG)-dUTP标记随机引物DNA(Labelled random primed DNA)并且使用高效DNA地高辛标记试剂盒(Roche Applied Science)通过酶免疫测定(enzymeimmunoassay)在尼龙膜(nylon membrane)上检测(detect)杂交体(hybrids)。使用扫描仪(HP Scanjet 3770)和Adobe Photoshop(v.7.0)确定和分析杂交信号(hybridizationsignals)。捕捉100％的靶DNA(Target DNA)和探针(Probe)的杂交信号(hybridizationsignals)。由通过稀释的自身杂交(self-hybridization)信号(signal)的强度计算DNA-DNA相关性(relatedness)值。结果，尽管YC7007菌株与YC7010菌株的相关性值为91.5％，YC7007菌株与其它物种如解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)、西姆芽孢杆菌(B.siamensis)、枯叶草芽孢杆菌(B.subtilis)、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)的相关性值为50.4％以下。因此，证实这种菌株不同于上述物种。即，仅当相似物种之间的所述DNA-DNA相关性值为70％以上时，才认为这些物种是彼此相同的物种。如果上述值小于上述水平，认为这样的物种是不同物种(Goris,J.,Konstantinidis,K.T.,Klappenbach,J.A.,Coenye,T.,Vandamme,P.,和Tiedje,J M.(2007).DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole-genomesequence similarities.Int J Syst Evol Microbiol 57:81-91)。

表2

进行YC7007菌株与近亲种之间的脂肪酸分析，其结果示出在下表3中。参照表3，YC7007菌株具有与近亲种相似的整体模式，但是，未发现C_16:1ω7c醇和C_16:1ω11c，其它脂肪酸的量与近亲种有一点区别。

表3

注：

总特征包括未通过气相色谱分析的C_17:1ISO I/ANTEI

-1:YC7007

-2:YC7010^T

-3:解淀粉芽孢杆菌亚种plantarum KACC 17177^T

-4:甲基营养型芽孢杆菌KACC 13105^T

-5:西姆芽孢杆菌KACC 15859^T

--:未发现

图3示出了通过基因分析(BOX-PCR)与近亲种相比YC7007菌株的比较和分析结果。用于基因分析(BOX-PCR)的聚合酶(polymerase)是高保真Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)，而使用BOXAR1(5'-CATCGGCAAGGCGACGCTGACG-3')作为引物(primer)。PCR条件包括在95℃初始变性(initial denaturation)7分钟，分别在90℃变性(denaturation)30秒、40℃退火(annealing)1分钟和72℃延伸(extension)3分钟，其为35个重复过程的系列，并且通过将菌株在72℃反应10分钟来进行最终延伸，以扩增基因。使用1％LE琼脂糖凝胶(Seakem)确定所得PCR产物的扩增。在图3中，分别地M表示1kb标记物(marker)，1表示YC7007菌株，2表示甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)KACC13105菌株，3表示西姆芽孢杆菌(B.siamensis)PD-A10^T菌株。

如图3中所示，为了将YC7007菌株与同YC7007菌株具有相同学名的标准菌株进行详细比较，进行基因分析(BOX-PCR)。结果，清楚地YC7007菌株不同于近亲种。

因此，考虑到上文获得的生理和生物化学以及分子生物学结果，本发明的微生物被确定为一种新菌株，命名为稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)YC7007菌株，于2012年4月18日保藏在韩国微生物培养中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)，其保藏号KCCM 11275P。

可以如下给出新稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)的分类学描述。

上述细菌是革兰氏阳性的需氧细菌，其能够形成内生孢子(0.6-1.0×2.5-2.8μm)，其细胞单独或成对存在。当细菌在1/10TSA培养基上培养24小时，菌群具有乳白色(creamy white)颜色并且形成为在中央凸起(convex)且具有规则边缘(regular edge)形式。这种细菌可以在20℃至60℃的温度、pH 4.5至pH 12和0至13％NaCl浓度下生长。作为抗生素抗性测试的结果，发现本发明细菌耐受30μg/ml浓度的氯霉素(chloramphenicol)，但是，对于10μg/ml氨苄青霉素(ampicillin)、庆大霉素(gentamicin)和青霉素(penicillin)以及30μg/ml四环素(tetracyclin)、链霉素(streptomycin)、万古霉素(vancomycin)和卡那霉素(kanamycin)不表现出耐受性。主要脂肪酸是反式异-C_15:0和异-C_15:0。

在孵育器中测定YC7007菌株对于病原真菌和细菌的抑制效力

为了检查包括YC7007菌株的包括10个物种的分离植物内生细菌对病原真菌和细菌的抑制效果，按如下研究抗菌活性。

根据对重要植物病原真菌(藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)(恶苗病)、终极腐霉(Pythium ultimum)(立枯病)、稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)(稻褐斑病)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(稻瘟病))4个物种以及(谷枯病菌(Burkholderia glumae)(谷粒腐烂)、白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)、白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)(白叶枯病))3个物种的对抗性生物测定(confrontation bioassay)，通过研究研究生长抑制来确定内生细菌YC7007的抗菌活性。

在分别包含5g马铃薯琼脂糖培养基(PDB,Difco)(16g琼脂/1l蒸馏水)的1/5PDA和1/10TSA生长培养基中，通过纸盘法(paper disc method)对病原真菌和YC7007菌株进行生长抑制效果的研究。将纸盘(直径为5mm)以距孵育器周边1cm的相等距离放置，在用100μl菌株培养溶液充分渗透纸盘之后，将具有病原真菌菌丝在PDA培养基中生长4天的盘(6mm)放在其中央，然后根据病原体在24℃至28℃下孵育4至6天。

按如下进行病原细菌的抑制研究：将在28℃下培养过夜的病原细菌悬浮在无菌蒸馏水中(O.D₆₀₀＝0.1)并且将0.1ml悬液涂抹到培养基上，然后测量YC7007菌株的病原体生长抑制程度。使用滤液确定YC7007菌株产生的培养滤液的病原体抑制效果，所述滤液通过在不含琼脂的液体培养基上于28℃进行摇动培养72小时(120rpm)，离心分离培养溶液并且通过微孔滤器(millipore filter)过滤来制备。为了监测对培养滤液的温度的反应，在保持在各处理温度的温水中处理10分钟之后，研究所述抑制效果。

下表4示出了研究YC7007菌株对主要植物病原真菌和主要植物病原细菌的抗菌活性的结果。

表4

注

-抑制距离:+,<3mm；++,4-5mm；+++,6-8mm；++++,>8mm。

参照表4，可以看到，尽管内生细菌YC7007菌株对于植物病原真菌的抗菌活性根据培养基而有一些变化，但是表现出了3至10mm的菌丝生长抑制效果。

另外，参照表5，可以看到，在内生细菌YC7007菌株对植物病原细菌的抗菌活性1/10TSA中，培养溶液表现出4至10mm的生长抑制效果，而培养滤液表现出3至8mm的生长抑制效果。

表5

注

-抑制距离+,<3mm；++,4-5mm；+++,6-8mm；++++,8-10mm

从上述结果可以理解，相比于迄今已知的任何其它拮抗菌，本发明菌株具有更广泛和优秀的病原体抑制效果。

测定YC7007菌株对病原真菌的盆栽试验杀虫剂控制效果

基于在根据实施例2的实验孵育器中测试的抑制效果，通过用C7007菌株直接处理相应植物进行了YC7007菌株对7个物种的主要植物疾病的杀虫剂控制效果的研究。控制效力测定由韩国化学工艺研究所(Korea Research Institute of Chemical Technology，KRICT)要求而进行，进行这样测定的植物疾病是稻瘟病、稻纹枯病、番茄灰霉病腐烂、番茄晚疫病(病原体：致病疫霉(Phytophthora infestans)、小麦叶锈病(病原体：隐匿柄锈菌(Puccinia recondita))、大麦白粉病(病原体：大麦白粉病菌(Blumeria graminisf.sp.hordei))和红辣椒炭疽病(病原体：马铃薯炭疽病菌(Colletotrichum coccodes))等。

按如下进行处理：在用YC7007悬液接种之前将每种植物病两盆放在旋转盘上1天，在旋转盘的同时用喷枪(1kg/cm²)将悬液喷到植物上以使悬液均匀粘附到植物上。按如下研究疾病抗性诱导效果：在用病原体接种之前用5ml菌株浸透每种宿主植物的三个盆7天来浸透菌株悬浮液，在室温下培养宿主植物1周，然后检查疾病发作程度。通过将菌株在1/10TSB培养基中于28℃下摇晃培养过夜，离心分离，然后使细菌细胞悬浮在10mM MgSO₄溶液中以将其浓度调节至2×10⁶cfu/ml来制备菌株悬液。通过向各宿主植物接种7个物种的病原体孢子和菌丝来进行病原体接种和疾病发作的研究。如下所述进行各植物疾病的具体实验程序。

按如下制备稻瘟病(RCB)：用病原体稻瘟病菌(M.grisea)KJ201菌株接种米糠琼脂培养基，将其在孵育器中于25℃培养2周以形成孢子，然后在无菌蒸馏水中培养以提供具有预定浓度(3×10⁵孢子/ml)的孢子悬液。将制备的RCB充分喷雾，以足以从施药的NakDong稻(3至4片主叶时期)流下。将接种的稻在保湿室中于黑暗状态培养24小时，并且在80％以上相对湿度、26℃温度的空调室中进行疾病发作4天，然后研究感染叶面积比。

按如下制备稻纹枯病(RSB)：将期望量的糠放到1l培养瓶中、灭菌并且用病原体立枯丝核菌(R.solani)AG1菌株接种，然后将经处理产物在孵育器中于25℃培养7天。通过将培养的菌丝块研磨成小片，并且用研磨的片接种一盆4至5片叶时期的施药并且成长的NakDong稻，将其在保湿室(25℃)中培养7天以引起疾病发作，然后研究鞘(sheath)中形成的感染叶面积比。

按如下制备番茄灰霉病腐烂(TGM)：用病原体灰葡萄孢菌(B.cinerea)接种马铃薯琼脂培养基，将其培养在24℃的恒温器中以形成孢子并且用作接种物。通过培养孢子，使用血球计数器将其浓度调节至3×10⁵孢子/ml，然后喷雾接种施药的番茄幼苗(2至3片叶时期)来进行病原体接种。将接种的番茄幼苗放在20℃(95％以上相对湿度)的保湿橱柜中以诱导疾病发作3天，然后研究感染的叶面积比。

按如下制备番茄晚疫病(TLB)：用病原体致病疫霉(P.infestans)菌株接种燕麦片培养基，将其培养在20℃的孵育器中以形成游动孢子囊。按如下进行病原体接种：将形成的游动孢子囊添加到无菌蒸馏水中，培养，然后制备孢子浓度为3×10⁴孢母细胞/ml的孢子悬液；将制备的悬液保持在冰箱中以冷冻并且释放游动孢子，从而制备游动孢子悬液；以及利用制备的悬液喷雾接种施药的番茄幼苗(2至3片叶时期)。将病原体接种的番茄幼苗在20℃的保湿室中进行结露处理，然后在空调室中进行疾病发作，然后在接种后第3天研究叶上出现的感染叶面积比。

小麦叶锈病(WLR)具有病原体隐匿柄锈菌(P.recondita)作为活体寄生物。因此，这里使用的接种物是在小麦幼苗中形成的夏孢子并且将其直接在实验室的植物上传代培养。为了研究菌株的药用效果，将5粒小麦种子(植物品种：Eunpa)播种到一次性花盆(直径：4.5cm)中，在温室中培养8天以形成一叶幼苗，然后向幼苗施药并且用接种物(0.11g/l孢子)喷雾接种。对接种的小麦幼苗在20℃的保湿室中进行结露处理1天，然后转移到相对湿度为70％的20℃的空调室中以诱导疾病发作，然后在接种后7天研究感染叶面积比。

大麦白粉病(BPM)具有病原体大麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)作为活体寄生物。因此，这里使用的接种物是在大麦中形成的孢子并且在实验室的大麦幼苗上传代培养。为了研究菌株的药用效果，将5粒大麦种子(植物品种：冬大麦)播种到一次性花盆(直径：4.5cm)中，在温室中培养8天以形成一叶幼苗，然后向幼苗上喷雾药物，在温室中风干并且在施药大麦上散布白粉病孢子以对其接种。将接种的大麦幼苗保持在相对湿度为60％的20℃至23℃的空调室中以诱导疾病发作7天，然后研究感染叶面积比。

按如下产生红辣椒炭疽病(RPA)：用病原体马铃薯炭疽病菌(C.coccodes)接种燕麦片培养基，将其在25℃培养10天以形成孢子，培养，调节其浓度以达到2×10⁵孢子/ml，从而提供孢子悬液。用制备的孢子悬液喷雾接种施药的红辣椒幼苗(3至4片叶时期)，放在保湿室(25℃)中，在空调室(25℃,75％RH)中进行结露处理2天以诱导疾病发作。接种后3天，研究感染叶面积比。

根据以下方程1由通过研究疾病获得的感染叶面积比计算控制值。

[方程1]

控制值(％)＝(1–处理组中感染叶面积比/未处理组中感染叶面积比)×100

下表6示出了对于YC7007菌株对主要植物疾病的控制效果的研究结果

表6

参照图6，对于7个物种的主要植物疾病的控制效果，可以看到，在稻瘟病、小麦叶锈病、大麦白粉病和红辣椒炭疽病的情况下，控制值在70％至83％的范围，而稻纹枯病、番茄灰霉病腐烂和番茄晚疫病表现出36％以下的低控制值。特别地，在土壤浸透后通过诱导疾病抗性的控制效果在稻中为35％，因此，确认了YC7007菌株对稻具有宿主特异性特性。

测定YC7007菌株通过诱导疾病抗性的谷粒腐烂预防效力

为了检查YC7007菌株通过诱导疾病抗性的稻粒腐烂预防效力，按如下进行控制效果的研究：

在将培养在植物生长室(28℃至30℃，相对湿度为80％以上)5周的稻幼苗(DongJin 1)移植到无菌或非无菌床土壤中用于稻培养后，立即将10ml菌株悬液(2×10⁷cfu/ml)分散其上(120g)。YC7007菌株悬液按如下制备：在1/10TSB培养基中于28℃摇晃培养过夜，离心，使细菌细胞悬浮在10mM MgSO₄溶液中，然后适当地调整其浓度。处理5天后，通过用稻粒腐烂病原体谷枯病菌(B.glumae)悬液(5×10⁷cfu/ml,OD₆₀₀＝0.1)涂抹接种探针并且接种20片叶来进行接种，每种处理三个重复。在R2A培养基中培养24小时后，将病原体悬液离心，细菌细胞悬浮在10mM MgSO₄溶液中并且通过适当调整其浓度来使用。在病原体接种之后，将经处理产物放在生长室中5天，然后研究感染叶的坏死程度。将疾病发作程度分为0至3(0：没有疾病症状；1：小的坏死斑点，2：多个坏死斑点形成的大褐斑；3：整个区域坏死)，并且通过计算与对照组相比的疾病抑制程度来评估控制值。本文使用的用于诱导稻疾病抗的控制组试剂是1mM苯并噻二唑(benzothiadiazole(BTH))溶液。

下表7示出了通过使用YC7007菌株进行土壤处理的稻粒腐烂预防效果的研究结果，图4是示出了处理的区别和比较的照片，以说明稻粒腐烂预防效果。

表7

参照表7和图4，其证明，作为在用YC7007菌株悬液处理土壤后5天用病原体接种土壤并且研究控制效果的结果，菌株处理组的感染叶长度为2.0mm，疾病发作程度为1.1，而仅使用病原体处理的对照组的感染叶长度为17.4mm，疾病发作程度为2.4，因此与对照组相比表现出相当大的降低值。此外，54％的控制值一般类似于BTH作为对照组试剂的情况下的57％，因此证明相同范围的疾病抗性诱导效果。

测定YC7007菌株通过诱导疾病抗性的白叶枯病预防效力

为了检查YC7007菌株通过诱导疾病抗性的白叶枯病预防效力，按如下进行控制效果的研究：

在将培养在植物生长室(28℃至30℃，相对湿度为80％以上)5周的稻幼苗(DongJin 1)移植到无菌或非无菌床土壤中用于稻培养后，立即将10ml菌株悬液(2×10⁷cfu/ml)分散其上(120g)。处理后5天，通过用白叶枯病病原体(稻白叶枯病菌(X.oryzaepv.oryzae))悬液(1×10⁷cfu/ml,OD₆₀₀＝0.1)涂抹接种探针并且接种20片叶来进行接种，每种处理三个重复。白叶枯病病原体悬液用与上文对于稻粒腐烂所述相同的程序制备。在病原体接种之后，将经处理产物放在生长室中5天，然后研究感染叶的坏死程度。将疾病发作程度分为0至9(0：没有疾病症状；1：小的坏死斑点，2至4：由多个坏死斑点组成的中等大小的褐斑；5至8：由多个坏死斑点组成的大褐斑；9：整个区域坏死)，并且通过计算与对照组相比计算疾病抑制程度来评估控制值。

下表8示出了通过使用YC7007菌株进行土壤处理的白叶枯病预防效果的研究结果，图5是示出了处理的区别和比较的照片，以说明稻白叶枯病预防效果。

表8

(*)疾病发作程度范围为0至9；其它英文符号意指通过Dunkin多重验证可能存在显著性差异(p＝0.05)

参照表8和图5，其证明，作为在用YC7007菌株悬液处理土壤后5天用病原体接种土壤并且研究控制效果的结果，尽管针刺型和裁剪型接种之间具有小的差异，但是YC7007菌株处理组的疾病发作程度分别为2.3和2.2，相比之下仅使用病原体的对照组的疾病发作程度分别为7.4和5.67，因此表现出分别为69％和61％(平均65％)的高控制值。因此，确认了优异的宿主疾病抗性诱导效果。

测定YC7007菌株通过诱导疾病抗性的稻恶苗病预防效力

为了检查YC7007菌株通过诱导疾病抗性的稻恶苗病预防效力，按如下进行控制效果的研究：

在将培养在植物生长室(28℃至30℃，相对湿度为80％以上)2周的稻幼苗(DongJin 1)移植到无菌或非无菌床土壤中用于稻培养后，立即将15ml菌株悬液(10⁵至10⁷cfu/ml)分散其上(150g)。处理3天后，通过以三个重复重复地接种幼苗来进行接种，使得每个重复的10株幼苗以1.5g/盆的稻恶苗病病原体(藤仓赤霉(G.fujikuroi))(5×10⁵cfu/ml)接种。在病原体接种之后，将经处理产物放在生长室中10至30天，然后研究感染叶的坏死程度。将疾病发作程度分为0至5(0：没有疾病症状；1：稍微发黄的叶和扭曲茎，2至4：发黄叶和高茎，5：整个区域坏死)，并且通过计算与对照组相比计算疾病抑制程度来评估控制值。

下表9示出了通过使用YC7007菌株进行土壤处理的稻恶苗病预防效果的研究结果。

表9

(*)疾病发作程度范围为0至5；其它英文符号意指通过Dunkin多重验证可能存在显著性差异(p＝0.05)

参照表9，其证明，作为在用YC7007菌株悬液处理土壤后3天用病原体接种土壤并且研究控制效果的结果，仅使用病原体处理的对照组的疾病发作程度为3.4，而菌株处理组的疾病发作程度为1.4，因此表现出58.5％的控制值。因此，确认了宿主疾病诱导效果。

测定YC7007菌株处理的稻生长促进效力

为了检查通过YC7007菌株处理的稻生长促进效力，按如下进行植物生长促进效力的研究：

在将1kg稻株栽培土壤与200ml菌株悬液(2×10⁷cfu/ml)均匀混合之后，将发芽的稻种播种于其中。在播种之后，在将稻种培养在植物生长室(28℃至30℃，相对湿度为80％以上)的同时，分别研究10天(苗期)、30天(分蘖期)和75天(孕穗期)的茎和根生长程度。作为对照组，使用仅与相同量的10mM MgSO₄缓冲溶液混合的土壤。为了在接种后30天以及分蘖期保持细菌密度，使用5ml YC7007菌株悬液再次浸透稻根部分的土壤。每种处理重复三次，每个重复使用10株植物。

下表10示出了通过使用YC7007菌株的稻生长促进效力的研究结果

表10

(*)其它英文符号意指通过Dunkin多重验证可能存在显著性差异(p＝0.05)

参照图10，其证明，作为用YC7007菌株处理稻培养床土壤、在花盆中培养以及研究每个时期的生长促进效果的结果，YC7007菌株处理组在苗期具有19.3cm和7.7cm的显著更长的茎和根，相比之下未处理组为11.7cm和2.7cm。类似地，分蘖期的茎长增加27.4％，分蘖数也增加约52％。此外，在孕穗期，YC7007菌株处理组表现出增加10.8％的茎长和增加约32％的分蘖数。因此，确认了通过YC7007菌株处理的稻生产促进效力。

抗菌物质的产生和病原体抑制效果的研究

为了确认通过产生抗菌物质出现的YC7007菌株之病原体抑制，研究了1/10TSB液体培养基中是否产生抗菌物质。通过测量根据盘扩散法(disc diffusion method)在纸盘周围形成的真菌菌丝或细菌细胞的生长抑制距离，来确定抗菌物质抑制效果的程度。在将YC7007菌株在液体培养基中于28℃摇晃培养(180rpm)72小时并且以9000g离心分离10分钟之后，通过微孔滤器(millipore filter，0.2μm)过滤培养滤液，然后测定每个培养时间的抗菌活性。

图6是示出了每个培养时期YC7007菌株培养溶液的抗菌效果的(a)图和(b)照片，而图7是示出了每个处理温度YC7007菌株培养溶液的抗菌效果的图。

首先，参照图6，对于每个培养时期菌株培养滤液的抗菌效果，可以看到，在稻病原体细菌(谷枯病菌(B.glume)、稻白叶枯病菌(X.oryzae))和恶苗病细菌(藤仓赤霉(G.fujikuroi))的情况下，抑制效果随着菌株培养时间的延长而提高，因此，在60小时的培养滤液中实现了最佳抑制效果。但是，发现在72小时的培养滤液中效果稍微降低。

另外，参照图7，作为培养滤液的热稳定性的研究结果，抗菌活性保持至90℃的处理，但是，如果温度超过100℃，抑制效果稍微降低。从该结果可以理解，由YC7007菌株产生的抗菌物质对于热可能相对稳定。

YC7007菌株的配制

为了在储存期间保持YC7007菌株的活性和密度，按如下将YC7007菌株配制成粉末和液体的形式。

将通过在大尺寸发酵罐(1吨以上)中孵育菌株获得的细菌培养溶液或离心分离后获得的真菌体与任何粘土矿物如高岭土(kaolin)、膨润土(bentomite)、泥炭(peat)等以1:100比例混合，在低温下干燥，然后均匀研磨以制备粉末形式的固体材料。同时，也将真菌培养产物与粘土矿物以1:100比例混合以制备液体悬液形式。

作为检查如上所述配制的样品的密度的结果，发现大部分制剂包含10⁸cfu/g以上量的菌株，与粘土矿物混合和配制的液体悬液的密度为10⁸cfu/ml以上。

实施例2

据推测稻是全世界超过一半人口的主粮，2013年的产量为约7.45亿吨。稻主要在亚洲地区生产，但是，由于作为主要限制因素的疾病的影响，每年有24％至41％的损失(Annonymous 2014.Rice market monitor.In:Monthly report,Food and AgricultureOrganization of the United Nations,第17卷,第1期,第1-4页(http://www.fao.org/3/a-i3735e.pdf).；Savary,S.,Willocquet,L.,Elazegui,F.A.,Castilla,N.P.和Teng,P.S.2000.Rice pest constrainsts in tropical Asia:Quantification of yieldlosses due to rice pests in a range of production situations.Plant Dis.84:357-369.)。对于稻，已经报道了由真菌、细菌、病毒和线虫(nematodes)引起的至少70种疾病。特别地，稻瘟病(rice blast)、白叶枯病(bacterial leaf blight)、谷粒腐烂(grainrot)和恶苗病(bakanae)是降低产量的最严重的种子感染疾病(Ou,S.H.1985.Ricedisease.第2版.Commonwealth Mycol.Inst.,第361页.Key,England.)。例如，由稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的白叶枯病(bacterial blight)根据环境可使总稻产量降低10％至50％，因此对于社会具有重要影响(Mew,T.W.1992.Foliardisease,bacterial blight.在:Compendium of Rice Diseases,R.K.Webster和P.S.Gunnell编辑,第10-11页.)。或者，其它细菌性疾病，例如由水稻细菌性谷枯病菌(Burkholderia glumae)引起的苗枯萎和腐烂(seedling blight and rot)、叶鞘腐烂(leaf sheath rot)、叶褐变(leaf browning)、穗枯萎(panicle blight)、细菌性萎蔫(bacterial wilt)和谷粒腐烂(grain rot)有时候甚至可使产量降低75％(Croplife2015.Bacterial panicle blight,the disease with the greatest impact on ricecrops.(http://www.croplifela.org/en/disease-of-the-month.html？id＝182).；Kim,J.,Kang,Y.,Kim,J.G.,Choi,O.和Hwang,I.2010.Occurrence of Burkholderia glumaeon rice and field crops in Korea.Plant Pathol.J.26:271-272.；Ura,H.,Furuya,N.,Iiyama,K.,Hidaka,M.,Tsuchiya,K.和Matsuyama,N.2006.Burkholderia gladioliassociated with symptoms of bacterial grain rot and leaf-sheath browning ofrice plants.J.Gen.Plant Pathol.72:98-103)。此外，据估计由稻恶苗病菌(Fusariumfujikuroi)引起的恶苗病(bakanae)导致亚洲地区稻栽培区域的产量降低约10％至50％(Bonman,J.M.1992.Root and crown disease,bakanae.在:Compendium of RiceDiseases,R.K.Webster和P.S.Gunnell编辑,第27页.)。对于上述疾病的杀虫剂防治，最近几十年大部分亚洲国家已经广泛使用了化学杀菌剂，但是，由于耐受性的出现，杀菌效力最近已经降低(Yang,Y.R.,Kim,Y.C.,Lee,S.W.,Lee,S.W.,An,G.G.和Kim,I.S.2012.Involvement of an efflux transporter in prochloraz resistance ofFusarium fujikuroi CF245causing bakanae.J.Korean Soc.Appl.Biol.Chem.55:571-574.)。此外，化学杀虫剂的滥用可能对农业环境和工作人员产生不利影响。因此，已经尝试开发能够代替上述化学杀菌剂的新杀虫剂控制方法，特别是在亚洲国家，其使用拮抗菌的生物防治(Gnanamanickam,S.S.2009.An overview of progress in biologicalcontrol.在:Biological control of rice diseases,Progress in biologicalcontrol,S.S.Gnanamanickam编辑,第8卷,第43-51页.Springer,Netherlands.)。

使用拮抗菌的生物防治可通过环境安全和综合疾病管理来呈现。多个微生物属如芽孢杆菌(Bacillus)、伯克氏菌(Burkholderia)、溶杆菌(Lysobacter)、泛菌(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)已经用作许多农作物疾病的生物制剂。但是，对于稻疾病的生物防治，仅报道了数个研究(Bouizgarne,B.2013.Bacteria forplant growth promotion and disease management.在:Bacteria in agrobiology,Disease management,由D.K.Maheshwari编辑,第15-34页.Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg.；McSpadden Gardener,B.2010.Biocontrol of plant pathogens and plantgrowth promotion by Bacillus.在:Recent developments in management of plantdiseases,Plant pathology in the 21st Century.由U.Gisi,I.Chet和M.L.Gullino编辑,第6章,第71-79页.Springer-Amsterdam.)。已经尝试将拮抗菌链霉菌(Streptomyces)和芽孢杆菌(Bacillus)的多用途用于控制稻纹枯病(rice sheath blight)(Sung,K.C.和Chung,Y.R.1997.Enhanced suppression of rice sheath blight using combinationof bacteria which produce chitinases or antibiotics.在:Proceedings of the 4thinternational workshop on plant growth promoting rhizobacteria present statusand future prospects,由A.Ogoshi,K.Kobayashi,Y.Homma,F.Kodama,N.Konodo和S.Akino编辑,第370-373页.OECD,巴黎.)。死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)EXTN-1和两种拮抗菌(即，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)mc75和pc78)有效预防稻瘟病和纹枯病(Choi,G.J.,Kim,J.C.,Park,E.J.,Choi,Y.H.,Jang,K.S.,Lim,H.K.,Cho,K.Y.和Lee,S.W.2006.Biological control activity of two isolates of Pseudomonasfluorescens against rice sheath blight.Plant Pathol.J.22:289-294.；Park,K.S.,Paul,D.和Yeh,W.H.2006.Bacillus vallismortis EXTN-1mediated growth promotionand disease suppression in rice.Plant Pathol.J.22:278-282.)。串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、稻恶苗病菌(F.fujikuroi)和拮抗菌如荧光假单胞菌(P.fluorescens)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereu)也预防稻的恶苗病(bakanae)和苗腐烂(seedling rot of rice)(Kazempour,M.N.和Elahinia,S.A.2007.Biological controlof Fusarium fujikuroi,the causal agent of bakanae disease by rice associatedantagonistic bacteria.Bulg.J.Agric.Sci.13:393-408.；Rosales,A.M.和Mew,T.W.1997.Suppression of Fusarium moniliforme in rice by rice-associatedantagonistic bacteria.Plant Dis.81:49-52.)。在各种拮抗菌中，已经开发出不同的芽孢杆菌属作为市售可得的生物杀虫剂。所述开发的原因是芽孢杆菌属可产生内生孢子并且在处理后在自然环境中保持长的时期(Hu,X.,Roberts,D.P.,Maul,J.E.,Emche,S.E.,Liao,X.,Guo,X.,Liu,Y.,McKenna,L.F.,Buyer,J.S.和Liu,S.2011.Formulations of theendophytic bacterium Bacillus subtilis Tu-100 suppress Sclerotiniasclerotiorum on oilseed rape and improve plant vigor in field trialsconducted at separate locations.Can.J.Microbiol.57:539-546.)。

在其它宿主中的许多植物疾病的生物防治中广泛使用的芽孢杆菌属可包括例如解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巴斯德芽孢杆菌(Bacillus pasteurii)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、短小芽孢杆菌(BacillusPumilus)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)(Kloepper,J.W.,Ryu,C.M.和Zhang,S.2004.Induced systemic resistance andpromotion of plant growth by Bacillus spp.Phytopathology 94:1259-1266.；McSpadden Gardener,B.2010.Biocontrol of plant pathogens and plant growthpromotion by Bacillus.在:Recent developments in management of plant diseases,Plant pathology in the 21st Century.由U.Gisi,I.Chet和M.L.Gullino编辑,第6章,第71-79页.Springer-Amsterdam.)。已经证明枯草芽孢杆菌(B.subtilis)GB03和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)IN937可预防细菌病原体，即，拟南芥(Arabidopsis)中软腐欧文氏菌亚种软腐病菌(Ryu等人,2004)。此外，蜡样芽胞杆菌AR156和枯草芽孢杆菌被证明诱导对拟南芥中丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)的耐受和防治(Niu,D.D.,Liu,H.X.,Jiang,C.H.,Wang,Y.P.,Wang,Q.Y.,Jin,H.L.和Guo,J.H.2011.The plant growth promoting rhizobacterium Bacillus cereusAR156induces systemic resistance in Arabidopsis thaliana by simultaneouslyactivating salicylate-and jasmonate/ethylene dependent signalingpathways.Mol.Plant-Microbe Interact.24:533-542.)。这些芽孢杆菌属物种中的一些在抗真菌特性、抗细菌特性、植物生长促进和耐受性诱导活性方面具有特定特征(Park,K.S.,Paul,D.,Kim,J.S.和Park,J.W.2009.L-alanine augments Rhizobacteria inducedsystemic resistance in cucumber.Folia Microbiol.54:322-326.；Ryu,C,M.2013.Promoting plant protection by root-associated microbes.PlantPathol.J.29:123-124.)。已经从多种陆生植物和盐生植物中分离出了不同的芽孢杆菌属物种，其中一些表现为内生性(参见非专利文献7)。目前芽孢杆菌属包括299个物种，近5年来在多方面研究(包括16S rRNA基因测序、DNA-DNA杂交测定、脂肪酸谱以及物理和生物化学实验)的基础上已经报道了超过30种新物种(LPSN.2015.List of prokaryotic nameswith standing in nomenclature.(http://www.bacterio.net/bacillus.html))。

在本实施例中，对于从稻根分离的两种不同的芽孢杆菌菌株YC7007和YC7010，讨论了具有多功能活性的新生物杀虫剂制剂的开发，并且根据多方面方法对其分类进行了表征。另外，不仅通过促进稻生长，还通过诱导对白叶枯病(bacterial blight)和穗枯萎(panicle blight)的耐受性研究了新YC7007菌株和YC7010菌株的控制效力。

材料和方法

(1)内生细菌的分离和培养

从由国立庆尚大学(晋州市，韩国)的农场稻田土壤中收集的稻根中分离出内生细菌菌株。为了分离菌株，将样品切片用流水洗涤数次，用70％乙醇进行表面灭菌5分钟，用1.2％次氯酸钠(NaOCl)灭菌10分钟。最后，将样品用无菌蒸馏水洗涤数次。对了确认灭菌，将洗涤的碎片放在1/10TSA(十分之一强度胰蛋白酶大豆肉汤琼脂(one-tenth strengthtryptic soy broth agar))中于28℃下3天，然后观察细菌生长。在确认不存在细菌菌落之后，将样品碎片再用70％乙醇灭菌数秒，将高压无菌水供给到高压灭菌器中，然后利用无菌碗和研钵研磨(参见非专利文献7)。将含有经研磨碎片的一部分液体用高压无菌水以10倍依次稀释，然后将其一部分(0.1ml)放在补充有放线菌酮(cycloheximide)的1/10TSA培养基中在板上于30℃培养3天。根据菌落的清楚形式选择培养基上生长的细菌菌落。将纯化分离的细菌菌株在1/10TSA培养基中传代培养并且储存在-70℃用于随后使用。为了进行细菌菌株培养，制备每升蒸馏水含有10g蛋白酶蛋白胨(protease peptone)、10g酵母提取物、4g氯化铵、4g硫酸镁、10g葡萄糖和15g琼脂的培养基。

(2)对真菌和细菌病原体的拮抗活性

对于内生细菌，使用主要植物真菌病原体如人参黑斑病菌(Alternaria panax)KACC 42461、稻恶苗病菌(F.fujikuroi)KACC 44022、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)KCTC16909、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)GSCC 50501、终极腐霉(Pythium ultimum)GSCC 50651、稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)KACC 40853、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)KCTC 6973、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)KACC 40415、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)GSCC 50201和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)KCTC 40101进行实验。通过使用体外控制活体测试测量马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基中真菌病原体的菌丝生长抑制区域来评估细菌菌株的拮抗活性(参见非专利文献7)。对于抗菌实验，使谷枯病菌(B.glumae)KACC10359和白叶枯病菌(X.oryzaepv.oryzae)KACC 10208分别生长在R2A(二分之一强度R2A(one-half strength R2A))和YGC培养基(每升蒸馏水10g葡萄糖,30g CaCO3,5g酵母提取物和15g琼脂)中，并且通过扩散纸盘法(diffusion paper disc method)进行抑制活性的实验。由另一培养时间的培养溶液经离心分离(5,000g,10分钟)和微孔滤器(0.2μm)的超滤制备细菌菌株YC7007的培养滤液。

(3)诱导对细菌病原体的抗性的测定

对于诱导YC7007物种对分别由白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)KACC 10208和谷枯病菌(B.glumae)引起的白叶枯病(bacterial blight)和穗枯萎(panicle blight)的抗性，进行盆栽测试(pot test)。在对稻种(Oryza sativa L.栽培种DongJin(Oryzasativa L.cultivar Dongjin))分别在1.2％次氯酸钠溶液中表面灭菌10分钟和70％乙醇中灭菌5分钟之后，将灭菌稻种用无菌蒸馏水冲洗三次并且储存在30℃的暗室中3天以便发芽，每天换水。将发芽种子播种到苗圃土壤((nursery soil)Dasuran Sangto,YoungnongSun Up,韩国)中，然后放在温室用于培养。之后，将2周大的稻芽移植到包含150g土壤的塑料花盆(9.5×8×7cm³)中，所述土壤已在121℃、高压下以每天20分钟的比率灭菌2天。为了制备YC7007的细菌悬液，将细菌细胞在液体大量培养基(liquid mass culture medium)中培养(160rpm,28℃)2天，然后离心(5,000g,10分钟)，然后取悬液在缓冲液(10mM MgSO4)中调节至不同浓度(5.6×10⁵,3.6×10⁶,2×10⁷CFU/ml)。在移植2周龄稻时，将YC7007的细胞悬液(15ml)浸透包含高压灭菌土壤(150g)的塑料花盆中。具有最佳浓度(2×10⁷CFU/ml)的YC7007用于对白叶枯病(bacterial blight)和穗枯病(panicle blight)的额外抗性诱导测试。将由60h培养滤溶液以10倍在10mM硫酸镁中10倍稀释而制备的YC7007菌株的培养滤液注射到叶上直到在其上形成液滴，以便研究控制效果。然后，在YC7007处理后5天，接种细菌病原体。缓冲液用作对照组，所有实验使用10株植物进行，每种处理三个重复。

(4)细菌病原体接种物的制备

对于两种细菌病原体的接种物，按如下制备谷枯病菌(B.glumae)KACC10359和白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)KACC10208：分别将谷枯病菌(B.glumae)KACC10359和白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)KACC 10208培养在旋转振动器(160rpm,28℃)上的R2A和YGC培养基中，并且使用细胞悬液。对谷枯病菌(B.glumae)培养溶液进行离心分离(5,000g,10分钟)，细胞沉淀在缓冲液(10mM MgSO₄)中的悬液具有6×10⁷CFU/ml的经调节浓度。对于使用谷枯病菌(B.glumae)悬液的接种，进行生物测定，即针刺生物测定(pin-prickbioassay)。将3至4根钉/针的束放在悬液中，并且使用束中的针挑取叶。在用病原体接种5周龄稻后，在第5天按如下评估疾病发作程度。0＝无症状，1＝轻微感染，但是非常小的病变，2＝完全褐色的凝集素病变，3＝不能描述(Cottyn,B.,Cerez,M.T.,Van Outryve,M.F.,Barroga,J.,Swings,J.和Mew,T.W.1996.Bacterial diseases of rice.I.Pathogenicbacteria associated with sheath rot complex and grain discoloration of ricein the Philippines.Plant Dis.80:429-437.)。对于白叶枯病(bacterial blight)，根据与谷枯病菌(B.glumae)相同的程序制备白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)悬液，并且调节浓度为1.2×10⁷CFU/ml。白叶枯病(bacterial blight)采用的生物测定是裁剪生物测定(clipping bioassay)，其为使用包含悬液的剪刀切割上层叶子的方法。接种7天后，根据1至9点法评估疾病发作程度(Misra,J.K.,Mew,T.W.和Merca,S.D.1994.Field inspection.在:A manual of rice seed health testing,由T.W.Mew和J.K.Misra编辑,第52-55页.International Rice Research Institute,Philippines.)。根据以下方程2计算疾病的降低(％)。

[方程2]

疾病的降低(％)＝[(对照组的疾病发作程度–处理组的疾病发作程度)/(对照组的疾病发作程度)]×100

(5)生长促进的确定

在培养时期中研究使用YC7007菌株的细胞悬液(2×10⁷CFU/ml)处理的稻生长促进。在包含培养基(10ml具有0.8％琼脂1/2MS培养基)的试管(长18cm)中，将YC7007细胞悬液浸透5周龄稻的根际。细菌处理后7天，记录生长程度(第12天)。对于盆栽测试，将2周龄稻移植到包含150g高压灭菌土壤和15ml细菌悬液的塑料花盆中，然后在移植后第7天浸透。细菌处理后9天，记录生长程度(第30天)。另外，在分蘖期(tillering stage)(第30天)细菌悬液(15ml)浸透和分蘖期(booting stage)细菌处理后40天之后，记录孕穗期的生长程度(第70天)。在试管和盆栽测试中，使用10株植物进行处理，每种处理三个重复，以便进行生长促进活性的实验。在这里，使用缓冲液作为对照组。

(6)基于16S rRNA基因序列和DNA-DNA杂交的系统分析

使用引物(细菌通用引物(bacterial universal primer)27F和1492R)，由使用市售可得提取试剂盒(Intron Biotech,Seoul,Korea)提取的基因组DNA扩增16S rRNA基因。对纯化PCR产物进行测序(GenoTech Inc.,Daejeon,Korea)(Lane,D.J.1991.16S/23S rRNAsequencing.在:Nucleic acid techniques in bacterial systematics,由E.Stackebrandt和M.Goodfellow编辑,第115-175页.Chichester:Wiley)。为了鉴定新内生细菌与其它近亲种相比的系统位置，将所述菌株的16S rRNA基因序列与从数据库(NCBI和EzTaxon-e数据库服务器)获得的现有序列相比较(Kim,O.S.,Cho,Y.J.,Lee,K.,Yoon,S.H.,Kim,M.,Na,H.,Park,S.C.,Jeon,Y.S.,Lee,J.H.,Yi,H.,Won,S.和Chun,J.2012.Introducing EzTaxon-e:a prokaryotic 16S rRNA gene sequence databasewith phylotypes that represent unculturedspecies.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.62:716-721)。使用CLUSTAL_X软件进行多序列比对(Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Plewniak,F.,Jeanmougin,F.和Higgins,D.G.1997.TheCLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiple sequencealignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res.25:4876-4882.)，然后，根据BioEdit程序在其间编辑缺口(Hall,T.A.1999.BioEdit:a user friendlybiological sequence aligned editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucleic Acids Symp.Ser.41:95-98.)。为了从1000个重复形成具有引导值(bootstrapvalue)的系统发生树，使用MEGA 5.10软件中的邻接法(neighbor-joining method；Saitou,N.和Nei,M.1987.The neighbor-joining method:a new method forreconstructing phylogenetic trees.Mol.Biol.Evol.4:406-425.)、最大简约法(maximum-parsimony；Fitch,W.M.1972.Toward defining the course of evolution:minimum change for a specific tree topology.Syst.Biol.20:406-416.)和最大似然算法(maximum-likelihood algorithms；Tamura,K.,PetXSerson,D.,Peterson,N.,Stecher,G.,Nei,M.和Kumar,S.2011.MEGA5:molecular evolutionary geneticsanalysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimonymethods.Mol.Biol.Evol.28:2731-2739)等(Felsenstein,J.1985.Confidence limits onphylogenies:an approach using the bootstrap.Evolution 39:783-791)。为了确定菌株DNA-DNA之间的DNA-DNA相关性值，使用试剂盒(DIG DNA labeling and detection kit,Roche Applied Science)根据制造商的说明书以及上述方法进行DNA-DNA杂交(Lee,S.H.,Shim,J.K.,Kim,J.M.,Choi,H.K.和Jeon,C.O.2011.Henriciella litoralis sp.nov.,isolated from a tidal flat,transfer of Maribaculam marinum Lai等人.to thegenus Henriciella as Henriciella aquimarina nom.nov.and emended descriptionof genus Henriciella.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.61:722-727.)。

(7)形态学、表现和化学分类特征

使用在R2A培养基中于28℃生长24小时的细胞培养溶液，通过光学显微镜(Nikon,×1000)观察细胞的形态，通过透射电子显微镜(Hitachi,型号H-600)观察鞭毛的存在。使用试剂盒(bioMerieux Gram stain kit)，根据制造商的说明书研究革兰氏反应。使用酪蛋白、七叶苷(esculin)、明胶、淀粉、L-酪氨酸(L-tyrosine)、尿素(urea)、吐温20和吐温80根据标准方案进行菌株的水解实验(Smibert,R.M.和Krieg,N.R.1994.Phenotypiccharacterization.在:Methods for general and molecular bacteriology,由P.Gerhardt,R.G.E.Murray,W.A.Wood和N.R.Krieg编辑,第607-654页.American Societyfor Microbiology,Washington,DC.；Reichenbach,H.1992.The order Cytophagales.在:The Prokaryotes,由A.Balows,H.G.Truper,M.Dworkin,W.Harder和K.H.Schleifer编辑,第2版,第4卷,第3631-3675页.Springer,New York.)。对于酶活性，由各种糖产生的酸，多种菌株的吸收和在糖中的生长，使用市售可得的系统(分别为API ZYM、API 20E、API 20NE和API 50CH试剂盒)在28℃根据制造商(BioMerieux)的说明书进行。另外，对于不同温度和pH值(pH4.0-14.0，间隔0.5pH单位)下的生长，在使用期望缓冲液在R2A培养溶液中培养5天后进行研究(Xu,P.,Li,W.J.,Tang,S.K.,Zhang,Y.Q.,Chen,G.Z.,Chen,H.H.,Xu,L.H.和Jiang,C.2005.Naxibacter alkalitolerans gen.nov.,sp.nov.,a novel member of thefamily'Oxalobacteraceae'isolated from China.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.55:1149-1153.)。另外，在28℃下培养5天后，使用补充有1％至14％氯化钠(w/v，以1％间隔)的R2A培养溶液评估耐盐性。使用多种抗生素(10μg氨苄青霉素、30μg氯霉素、10μg青霉素、10μg庆大霉素、3μg卡那霉素、30μg万古霉素、30μg链霉素和30μg四环素)根据盘扩散法(滤纸盘扩散测定(filter-paper disc diffusion assays))进行一式二份的抗生素抗性实验(Duplicate antibiotic-sensitivity)(Yasir,M.,Aslam,Z.,Song,G.C.,Jeon,C.O.和Chung,Y.R.2010.Sphingosinicella vermicomposti sp.nov.,isolated fromvermicompost,and emended description of the genusSphingosinicella.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.60:580-584)。通过改进的Schleifer方法进行细胞壁的制备和肽聚糖的分析，其中使用纤维素片代替纸色谱进行TLC(Schleifer,K.H.1985.Analysis of the chemical composition and primary structure ofmurein.Methods Microbiol.18:123-156.)。为了分析细胞脂肪酸，将细菌菌株于28℃下培养在R2A培养溶液中，并且取得对数生长中期(mid-exponential growth phase)(OD₆₀₀＝0.4-0.5)的微生物细胞。根据微生物识别系统(microbial identification system)(MIDI；Microbial ID,Inc.)的说明书进行脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters)的分析。通过GC(Agilent 6890)分析提取物，并且使用由Sherlock软件(4.0版)提供的TSBA 40数据库比较和鉴定脂肪酸谱。通过Staneck和Roberts的方法提取和分析细菌菌株的全细胞水解物的氨基酸(Stanek,J.L.和Roberts,G.D.1974.Simplified approach toidentification of aerobic actinomycetes by thin-layerchromatography.Appl.Microbiol.28:226-231.)。通过Komagata和Suzuki的方法由反相(reverse-phase)HPLC提取和分析类异戊二烯奎宁(Isoprenoid quinones)(Komagata,K.和Suzuki,K.1987.Lipid and cell-wall analysis in bacterial systematics.MethodsMicrobiol.19:161-207.)。为了测量染色体DNA的G+C含量，通过Ausubel等人的方法提取和纯化YC7010菌株的基因组DNA(Ausubel,F.W.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A.和Struhl,K.1995.Current Protocols in MolecularBiology,New York:Wiley.)，然后通过反相C18柱(reverse-phase C18column)测量酶促分解的核苷和G+C含量(Mesbah,M.,Premachandran,U.和Whitman,W.B.1989.Precisemeasurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performanceliquid chromatography.Int.J.Syst.Bacteriol.39:159-167.)。根据改进的Minnikin等人的方法(1984)，使用Merck Kieselgel 60-HPTLC通过TLC提取和分离极性脂质。另外，在板上喷射茚三酮溶液(用水饱和的0.2％(w/v)茚三酮的丁醇溶液)之后，将板加热到105℃10分钟以检测氨基脂质(Ross,H.N.M.,Grant,W.D.和Harris,J.E.1985.Lipids inarchaebacterial taxonomy.在:Chemical Methods in Bacterial Systematics,由M.Goodfellow和D.E.Minnikin编辑,第289-300页.Academic Press,London.)。另外，通过在板上喷射Dittmer和Lester的Zinzadze试剂(Dittmer,J.C.和Lester,R.L.1964.Asimple,specific spray for the detection of phospholipids on thin-layerchromatograms.J.Lipid Res.15:126-127)来检测磷脂。另外，通过使用1-萘酚喷雾试剂加热3至5分钟来检测糖脂(Jacin,H.和Mishkin,A.R.1965.Separation of carbohydrateson borate impregnated silica gel G plates.J.Chromatogr.18:170-173.)。使用Dragendorff试剂进行磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)的检测(Sigma-Aldrich；St.Louis,Mo)。另外，在喷射磷钼酸溶液phosphomolybdic acid solution)(Sigma-Aldrich；St.Louis,Mo)之后，通过将板在150℃加热10分钟来检测总脂质谱。(

(8)统计学分析

在体外分析的情况下，使用具有完全随机单元素的分配设计分析来分析数据，而在体内分析的情况下使用完全随机区组设计分析。另外，通过Duncan的方法(Duncan多范围检验(Duncan's multiple range test，DMRT))进行平均差(mean differences)的比较。

实验结果

(1)分离菌株的拮抗活性

已证明，在从稻根际分离的250种细菌菌株中，15种内生细菌表现出对稻恶苗病菌(F.fujikuroi)的菌丝生长的2至20mm以上范围的抑制活性。基于16S rRNA基因序列，证实这些细菌与多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、西姆芽孢杆菌(Bacillussiamensis)、杰米拉芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)和大理芽孢杆菌(Bacillus daliensis)相关。经试验鉴定了这些分离的细菌，其属于近亲属，因为其相似性在99.27至100％的范围。特别地，在分离的细菌中，两个菌株，即YC7007和YC7010与西姆芽孢杆菌(Bacillussiamensis)具有最高相似性，因此对稻恶苗病菌(F.fujikuroi)表现出最强拮抗活性(>20mm抑制区)(参见下表11)。另外，YC7007对于另外的稻病原体(即，稻平脐蠕孢、稻瘟病菌、稻恶苗病菌和其它主要植物病原体)也表现出强的拮抗活性，PDA上的抑制区为10至29mm(参见下表12)。另外，在不同培养时间(different cultivation times)制备的YC7007菌株的培养滤液也表现出良好的生长抑制活性，不仅对稻恶苗病菌(F.fujikuroi)，也对谷枯病菌(B.glumae)和白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)，这是两种主要的来自种子的细菌病原体(参见图8)。60h龄的培养溶液的培养滤液对各培养基中的稻恶苗病菌(F.fujikuroi)、白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)和谷枯病菌(B.glumae)表现出最强抑制活性，分别为30mm、24mm和19.7mm抑制区。

表11

^a基于16S rRNA基因序列的部分分析

^bPDA上作为抑制区确定的拮抗菌对病原体的菌丝生长，+：2-10，++：10-15，+++：15-20，以及++++：>20mm

表12

(2)诱导对穗枯病(panicle blight)和白叶枯病(bacteiral blight)的系统获抗性

对于YC7007菌株，研究了对于白叶枯病(bacteiral blight)和穗枯病(panicleblight)的系统获抗性。作为以不同浓度的YC7007菌株(5.6×10⁵,3.6×10⁶和2×10⁷CFU/ml)浸透土壤的结果，发现与具有叶腐烂(leaf rot)的疾病发作程度(2.5)的对照组相比，上述菌株可相当大地降低疾病发作程度，分别至1.4、0.9和0.8(p<0.05)(参见图9)。但是，浓度10⁶与10⁷之间没有显著差异。当以2×10⁷CFU/ml浓度的YC7007菌株浸透根际土壤时，可以看到对穗枯病(panicle blight)和白叶枯病(bacteiral blight)的预防效果分别为65.2％和61.2％，因此是良好的。另外，在叶喷培养滤液的情况下，可以看到与对照组相比穗枯病(panicle blight)和白叶枯病(bacteiral blight)的疾病发作程度分别降低约70.8％和70.5％(参见下表13)。因此，可以看到与对照组相比，YC7007菌株极大降低穗枯病(panicle blight)和白叶枯病(bacteiral blight)的疾病发作程度(p<0.01)。

表13

不同字母表示通过Duncan多范围检验的显著性差异(p<0.01)的值，平均值±SE；使用每种处理三个重复的10株植物计算标准误

(3)YC7007的生长促进

与对照组相比，YC7007菌株在所有实验阶段，包括稻的苗期、分蘖期和孕穗期，经常表现出高生长促进活性(p<0.05)。在苗期，使用细菌悬液(2×10⁷CFU/ml)处理稻根际使得试管中芽的长度从11.67cm增加到19.33cm。类似地，芽长度分别在分蘖期从36.45cm增加到46.33cm，而在孕穗期从55.33cm增加到61.0cm。另外，在苗期主根长度从2.67cm增加到7.67cm，而在分蘖期和孕穗期分蘖的数量(numbers of tillers)分别从1.9增加到2.9以及从5.3增加到7.0(参见下表14)。

表14

不同字母表示通过学生t检验不同处理之间的显著性差异，平均值±SE；使用每种处理三个重复的10株植物计算标准误

(4)YC7007和YC7010拮抗菌的鉴定

通过多相方法对15种拮抗菌中具有最强拮抗活性的两种内生细菌YC7007和YC7010进行鉴定。这两种菌株分别具有持续延长1,513bp的16S rRNA基因序列，其中除了两个核苷酸外，这些以相同形式对齐，(GenBank/EMBL/DDBJ中数据库登录号KP203893(YC7007)和KP201498(YC7010T))(参见图1)。通过分析16S rRNA基因序列，证明这两种菌株存在于系统发生树中具有相同分枝长度的相同进化枝中，并且与西姆芽孢杆菌(B.siamensis)KACC 15859^T(99.67％)、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)KACC13105^T(99.65％)、解淀粉芽孢杆菌亚种plantarum(B.amyloliquefacienssubsp.plantarum)KACC 17177^T(99.60％)和特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)KACC 15944^T(99.45％)表现出最高相似度(参见上表11和图2)。YC7010和最相似的近亲菌株(即，西姆芽孢杆菌(B.siamensis)KACC15859^T)之间的DNA-DNA相关性值为50.4±3.5。但是，YC7007和YC7010之间的DNA-DNA相关性值为91.5±11.0％(参见上表2)。上述两种菌株是革兰氏阳性，以棒形具有流动性并且在13℃至16℃(最佳28℃至30℃)和pH 4至12(最佳pH 7)下表现出更佳地生长。这些菌株可在含有1％至13％(w/v)氯化钠的0.1TSA培养基上生长，但是生长未必需要氯化钠。菌株对浓度为30μg/ml的氯霉素(chloramphenicol)具有耐受性。另外，菌株包含内消旋二氨基庚二酸(meso-diaminopimelic acid)作为细胞壁肽聚糖中的拮抗二氨基酸，以及MK-7作为主要呼吸醌系统(major respiratory quinone system)。YC7007和YC7010菌株的其它生理学和生物化学特征示出在上表1中。可以看到YC7007和YC7010菌株的主要脂肪酸分别是反式异-C_15:0(38.4％和32.0％)和异C_15:0(28.1％和27.7％)。YC7010的其它细胞脂肪酸谱由以下组成：C_16:0(7.7％)、异C_17:0(6.4％)、反式异-C_17:0(5.3％)、异C_16:0(5.2％)、C_18:0(5.1％)、C_16:1ω7c醇(3.4％)、异C_14:0(2.9％)、异-C_17:1ω10c(1.7％)、C_16:1ω11c(1.4％)、C_14:0(1.1％)和C_20:1ω7c(0.2％)(参见上表3)。YC7007和YC7010菌株中基因组DNA的G+C含量分别为50.5mol％和51.2mol％。菌株表现出由以下组成的特定极性脂质谱：磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、二磷脂酰甘油(DPG)、未知糖基脂(GL)和未知氨基脂(AL1-2)。作为16S rRNA基因测序分析、DNA-DNA相关性值、脂肪酸的组成以及生物化学和生理学特征的结果，将YC7007和YC7010菌株鉴定为芽孢杆菌(Bacillus)属的新物种，因此被建议为稻生芽孢杆菌新物种(Bacillus oryzicola sp.nov.)。

(5)稻生芽孢杆菌YC7010^T新物种(Bacillus oryzicola sp.nov.YC7010^T)的说明

细胞是棒形(0.8-0.9×2.0-3.0μm)的革兰氏阳性。在R2A琼脂培养基中于28℃生长2天的菌落具有乳白色(white-cream)颜色，为圆形具有完整边缘(flat elevation withan entire margin)的平台形式。细胞是具有流动性的单一极性鞭毛。细胞壁是拮抗二氨基酸并且含有内消旋二氨基庚二酸。通常，细胞表现为过氧化氢酶阳性和氧化酶阴性，单独或成对，生长在13℃至60℃和pH 4至12.0。细胞是酪蛋白和明胶水解阳性的，但是为淀粉、吐温20、吐温80、酪氨酸(tyrosine)和羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)阴性。另外，细胞消耗D-葡萄糖(D-glucose)、D-果糖(D-fructose)、D-甘露糖(D-mannose)、D-甘露醇(D-mannitol)、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷(methyl-α-D-glucopyranoside)、N-乙酰基-葡萄糖胺(N-acetyl-glucosamine)、扁桃苷(amygdalin)、熊果素(arbutin)、七叶苷柠檬酸铁(esculin ferric citrate)、水杨苷(salicin)、D-纤维二糖(D-celiobiose)、D-麦芽糖(D-maltose)、D-乳糖(D-lactose)、D-蔗糖(D-saccharose)、D-海藻糖(D-trehalose)、D-棉子糖(D-raffinose)、淀粉、糖原(glycogen)、龙胆二糖(gentiobiose)、三钠(trisodium)、柠檬酸盐(citrate)和Kohn明胶。另外，作为API ZYM试剂盒的结果，细胞表现出对酯酶(esterase)(C4)、酯酶脂肪酶(esterase lipase)(C8)、萘酚-AS-Bl-磷酸水解酶(naphthol-AS-B1-phosphohydrolase)和N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-glucosaminidase)的酶活性，但是对于脂肪酶(lipase)(C-14)、亮氨酸芳基氨基酶(leucine arylamidase)、缬氨酸芳基氨基酶(valine arylamidase)、胱氨酸芳基氨基酶(cystine arylamidase)、胰蛋白酶(trypsin)、α-糜蛋白酶(α-chymotrypsin)、α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、α-甘露糖酶(α-mannosidase)和α-岩藻糖苷酶(α-fucosidase)不表现出活性。另外，细胞对30μg/ml浓度的氯霉素和链霉素具有耐受性，但是可接受10μg/ml浓度的氨苄青霉素(ampicillin)、青霉素(penicillin)和庆大霉素(gentamycin)以及30μg/ml浓度的卡那霉素(kanamycin)、万古霉素(vancomycin)和四环素(tetracycline)。可以在含有13％(w/v)氯化钠的R2A培养溶液中观察到细胞的生长，但是，在含有14％(w/v)氯化钠的相同培养溶液中没有。主要醌是MK-7。极性脂质可包括磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、二磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol,DPG)、未知糖脂(unknown glycolipid,GL)和未知氨基脂(unknown aminolipids,AL1-2)。模式株(type strain)的DNA G+C含量为51.2mol％。模式株YC7010^T(＝KACC18228^T)分离自稻根(晋州市，韩国)。

如上所述，本实施例证明，在由稻根分离的各种内生菌株中，芽孢杆菌(Bacillus)属中6％是拮抗的并且可抑制植物病原体菌丝的生长。根据之前的研究，据报道从生活在沼泽地的植物分离的包含芽孢杆菌(Bacillus)属和其它革兰氏阴性菌的内生细菌中约9％对卵菌植物病原体(oomycetous phytopathogens)表现出拮抗活性(参见非专利文献7)。根据16S rRNA基因序列，在体外和体内实验中证明本发明属于芽孢杆菌(Bacillus)属的一些菌株对主要稻真菌和细菌病原体具有拮抗活性。在这些分离株中，与西姆芽孢杆菌(B.siamensis)具有最高相似性的YC7007和YC7010菌株对稻恶苗病菌(F.fujikuroi)的菌丝生长表现出强抑制活性，所述细菌是恶苗病病原体(bakanae pathogen)，是最有效的来自稻种的病原体。另外，YC7007的培养滤液也对稻的恶苗病(bakanae)、白叶枯病(bacterial blight)和谷粒腐烂(garin rot)具有强抑制活性，因此可以被认为是产生抗真菌物质的菌株。芽孢杆菌属中的一些可产生少量肽和脂肽，例如丰原素(fengycin)、伊枯草菌素(irurin)和表面活性素(surfactin)，并且据报道对植物病原体表现出良好的抑制效力(Bais,H.P.,Fall,R.和Vivanco,J.M.2004.Biocontrol of Bacillus subtilisagainst infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitatedby biofilm formation and surfactin production.Plant Physiol.134:307-319；Crane,J.M.,Gibson,D.M.,Vaughan,R.H.和Bergstrom,G.C.2013.Iturin levels onwheat spikes linked to biological control of Fusarium head blight by Bacillusamyloliquefaciens.Phytopathology 103:146-155.；Dimkic,I.,Zivkovic,S.,Beric,T.,Ivanovic,Z.,Gavrilovic,V.,Stankovic,S.和Fira,D.2013.Characterization andevaluation of two Bacillus strains,SS-12.6and SS-13.1,as potential agents forthe control of phytopathogenic bacteria and fungi.Biol.Control 65:312-321.)。从盆栽测试发现，可以通过用YC7007菌株的细胞悬液浸透来抑制穗枯病(penicle blight)和白叶枯病(bacterial blight)的发作，该结果可能意味着诱导系统耐受性。使用10⁵(CFU/ml)浓度的YC 7007菌株的处理降低了穗枯病(penicle blight)的疾病发作程度，并且在10⁶至10⁷CFU/ml的更高浓度下，疾病发作被抑制62％以上。另外，与对照组相比，YC7007培养滤液使穗枯病(penicle blight)和白叶枯病(bacterial blight)的疾病发作降低70％以上。还发现使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(2.5×10⁸CFU/ml)和蜡样芽胞杆菌(B.cereus)AR156(5×10⁸CFU/ml)的细胞悬液处理分别可控制拟南芥(Arabidopsis)根和叶的斑点病(speck disease)(Bais等人,2004；Niu,D.D.,Liu,H.X.,Jiang,C.H.,Wang,Y.P.,Wang,Q.Y.,Jin,H.L.和Guo,J.H.2011.The plant growth promotingrhizobacterium Bacillus cereus AR156induces systemic resistance inArabidopsis thaliana by simultaneously activating salicylate-and jasmonate/ethylene dependent signaling pathways.Mol.Plant-Microbe Interact.24:533-542.)。由于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和蜡样芽胞杆菌(B.cereus)AR156的细菌浓度是10⁸CFU/ml，为YC7007(10⁶CFU/ml)的100倍，在实践中通过农业农舍使用这些细菌不现实。为了开发作为生物杀虫剂的拮抗菌，当考虑用于用户最终使用的稀释因子时，最佳浓度应为10⁷CFU/ml以下的水平(Chen,X.H.,Scholz,R.,Borriss,M.,Junge,H.,Mogel,G.,Kunz,S.和Borriss,R.2009.Difficidin and bacilysin produced by plant associatedBacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blightdisease.J.Biotechnol.140:38-44.)。通过用对病原体具有拮抗活性的细菌悬液浸透稻根际以及叶喷培养滤液，YC7007菌株可直接和/或间接与病原体相互作用。可通过这样的浸透和叶喷处理预防穗枯病(penicle blight)和白叶枯病(bacterial blight)，由于YC7007菌株通过诱导的系统抗性(induced systemic resistance，ISR)或系统获得抗性(systemicacquired resistance，SAR)作用以抑制疾病(Ahn,I.P.,Lee,S.W.和Suh,S.C.2007.Rhizobacteria induced priming in Arabidopsis is dependent onethylene,jasmonic acid,and NPR1.Mol.Plant-Microbe Interact.20:759-768.；Niu等人,2011)，推测可实现这样的预防。对于SAR和ISR，需要在激素信号方面通过水杨酸(salicylic)、茉莉酸(jasmonic)或乙烯(ethylene)途径确定反应机制。

多种芽孢杆菌物种具有长时期的持续效力，即使在不适宜环境下也是如此，因此被商业化为生物杀虫剂。一些物种可诱导系统获得抗性，因此，实际作用于多种植物(Hu等人,2011；Kloepper等人,2004)。死谷芽孢杆菌(B.vallismortis)EXTN-1和蜡样芽胞杆菌(B.cereus)已用于预防稻瘟病(rice blast)、稻纹枯病(rice sheath blight)和恶苗病(bakanae disease)(Kazempour和Elahinia,2007；Park等人,2006)。认为根据本发明首次报道了这样的发现：芽孢杆菌菌株YC7007对主要细菌疾病如穗枯病(panicle blight)和白叶枯病(bacterial blight)具有长期持续活性。此外，通过在发芽后的苗期立即施用细菌悬液一次，证明了YC7007菌株对于促进稻生长有效。与对照组相比，YC7007菌株不仅在苗期、分蘖期和孕穗期使秧苗和根的长度延长了1.1至2.9倍，还在分蘖期和孕穗期增加分蘖数。这些发现意味着益生菌YC7007对于抗性诱导和生长促进的激活从苗期至孕穗期的长时间持续(Picard,C.,Baruffa,E.和Bosco,M.2008.Enrichment and diversity of plantprobiotic microorganisms in the rhizosphere of hybrid maize during fourgrowth cycles.Soil Biol.Biochem.40:106-115.)。已知诱导宿主抗性可不利地影响宿主植物，因为其抑制与植物生长激素如赤霉素酸和8-羟基喹啉相关的生长。通过经由至少部分地抑制赤霉素酸和8-羟基喹啉的油菜素内酯水杨酸来控制免疫系统，对赤霉素酸和8-羟基喹啉的一直是通过与稻和拟南芥(Arabidopsis)中的激素相互作用(负面相互作用)实现的(De Vleesschauwer,D.,Van Buyten,E.,Satoh,K.,Balidion,J.,Mauleon,R.,Choi,I.R.,Vera Cruz,C.,Kikuchi,S.和Hofte,M.2012.Brassinosteroids antagonizegibberellin and salicylate mediated root immunity in rice.Plant Physiol.158:1833-1846.；Wang,D,Mukhtar,K.P.,Culler,A.H.和Dong,X.2007.Salicylic acidinhibits pathogen growth in plants through repression of the auxin signalingpathway.Curr.Biol.17:1784-1790.)。水杨酸和苯并噻二唑(benzothiadiazole,BTH)的化学衍生物可通过稻、黄瓜、拟南芥和胡椒中的水杨酸信号网络诱导对活体营养病原体的系统获得抗性，同时抑制氧化反应而延缓植物生长。另一方面，一些根际细菌(包括芽孢杆菌属物种)可提高抗性的诱导而不会不利地影响植物生长(Ahn等人,2005；Ryu等人,2004；Yang,J.W.,Yu,S.H.和Ryu,C.M.2009.Priming of defense-related genes confersroot-colonizing Bacilli-elicited induced systemic resistance in pepper.PlantPathol.J.25:389-399.)。鉴于这些方面，认为YC7007菌株可能是开发稻中具有多种功能(例如，诱导抗性和生长促进)而无任何不利影响的生物杀虫剂的良好候选。另外。认为YC7007菌株通过产生抗菌物质而具有抗真菌和抗细菌活性。

根据本发明，基于多方面研究，包括16S rRNA基因序列、DNA-DNA杂交、脂肪酸分析和其它生理学和生物化学实验，更好地表征了被命名为YC7007和YC7010的两种内生菌株。这些菌株被鉴定为芽孢杆菌属的新物种，在系统发生树中具有相同分枝长度的相同进化枝(clade)中。这两种菌株彼此具有相同的全序列分支率，但是不同于系统发生树的进化枝中其它近亲种。YC7007和YC7010菌株彼此表现出100％相似性，还具有91.5％的非常高的DNA-DNA相关性值，因此证明这两种菌株是相同的芽孢杆菌物种。与YC7010型菌株相比，其它同类菌株如西姆芽孢杆菌(B.siamensis)、甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)、枯草芽孢杆菌亚种inaquosorum(B.subtilis subsp.inaquosorum)、解淀粉芽孢杆菌亚种plantarum(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)和特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)等的DNA-DNA杂交值通常小于70％。因此，可以理解，YC7010菌株是新物种(Goris,J.,Konstantinidis,K.T.,Klappenbach,J.A.,Coenye,T.,Vandamme,P.和Tiedje,J.M.2007.DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole genomesequence similarities.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.57:81-91；Stackebrandt,E.和Goebel,B.M.1994.Taxonomic Note:A place for DNA-DNA reassociation and 16s rRNAsequence analysis in the present species definition inbacteriology.Int.J.Syst.Bacteriol.44:846-849.)。另外，这两种菌株在使用API试剂盒的生理学和生物化学实验中表现出非常相似的应答，而对于其它参考模式株具有不同应答。因此，可以理解上述两种菌株不同于其它近亲芽孢杆菌菌株。由于对氯化钠的耐受性，两种菌株在13％氯化钠之前都能生存。另一方面，甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)即使在10％氯化钠下也不能生存(参见非专利文献1)。YC7007和YC7010的主要脂肪酸是反式异C_15:0和异C_15:0，这与芽孢杆菌属的其它近亲种的那些相同。另一方面，这两种菌株的少量其它脂肪酸不同于近亲种芽孢杆菌菌株的那些。个别细菌具有不同的脂肪酸谱，在细菌鉴定中有效利用了所述脂肪酸的分析(Kampfer,P.1994.Limitsand possibilities of total fatty acid analysis for classification andidentification of Bacillus species.Syst.Appl.Microbiol.17:86-98.)。与芽孢杆菌属的模式株一样，YC7007和YC7010菌株的主要类异戊二烯醌是甲基萘醌-7(menaquinone-7,MK-7)(Chen,J.H.,Tian,X.R.,Ruan,Y.,He,Z.Q.,Tang,S.K.,Li,W.J.,Shi,H.和Chen,Y.G.2015.Bacillus crassostreae sp.,nov.,isolated from an oyster in the SouthChina Sea.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.Doi:10.1099/ijs.0.000139.；Kang,H.,Weerawongwiwat,V.,Kim,J.H.,Sukhoom,A.和Kim,W.2013.Bacillus songkensissp.nov.,isolated from soil.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.6/3:4189-4195.)。两种菌株的DNA G+C含量彼此相似并且在50.5至51.2mol％范围，比其它芽孢杆菌物种中稍高(参见非专利文献1和非专利文献17)。两种菌株的主要极性脂质是PE、PG和DPG，其对应于西姆芽孢杆菌(B.siamensis)和Bacillus songkensis中那些(Kang等人,2013；非专利文献17)。

基于多方面研究的所有数据，YC7007和YC7010两种菌株属于芽孢杆菌属，因此，提议这些菌株YC7007和YC7010为新物种，命名为稻生芽孢杆菌YC7010^T新物种(Bacillusoryzicola YC7010^T sp.nov.)作为模式株。因此，内生菌株稻生芽孢杆菌YC7007(B.oryzicola YC7007)是具有多功能活性，表现为直接抑制真菌和细菌病原体，诱导系统获得抗性和植物生长促进效力，因此是农业农舍实践中适用的微生物接种剂。

已经提出了本发明的上述优选实施方案来解决常规技术问题，本领域技术人员将显然理解，在本发明的范围和精神内，多种改变、修饰和添加也是可能的。这些改变和修饰适当地包括在所附权利要求中。

1)SEQ ID NO:1示出了根据本发明的稻生芽孢杆菌(B.oryzicola)YC7007菌株的16S rRNA基因序列。

2)SEQ ID NO:2示出了根据本发明的稻生芽孢杆菌(B.oryzicola)YC7010菌株的16S rRNA基因序列。

序列表

<110> 株式会社第一格林

国立庆尚大学校产学协力团

<120> 从稻根际分离的新植物内生细菌稻生芽孢杆菌以及使用其开发用于天然植物保护和植物增强的制剂

<130> NP14-05084

<160> 2

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 1513

<212> RNA

<213> 稻生芽孢杆菌

<400> 1

cgagtttgat catggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aatactggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 1020

gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1080

agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1140

tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200

atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1260

aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acacgtaacc gta 1513

<210> 2

<211> 1513

<212> RNA

<213> 稻生芽孢杆菌

<400> 2

agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aatactggat ggttgtttga 180

accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 240

cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300

ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360

gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420

cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 600

gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 660

gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

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aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1320

tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1380

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1440

gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtgggacag atgattgggg tgaagtcgta 1500

acaaggtgcc gta 1513

Claims (8)

1.一种新微生物稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)或相对于上述稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)具有70％以上的DNA-DNA相关性值(DNA-DNA relatedness value)的稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)。

2.根据权利要求1所述的稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)，其中所述稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)包含具有由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2表示的碱基序列的16SrRNA。

3.根据权利要求1所述的稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)，所述稻生芽孢杆菌(Bacillusoryzicola)是稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)YC7007(保藏号：KCCM11275P)或稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)YC7010(保藏号：KACC18228)。

4.根据权利要求1所述的稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)，其中所述稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)具有植物疾病抗性诱导效力。

5.根据权利要求4所述的稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)，其中所述植物疾病是选自由粒腐病、白叶枯病、穗枯病和恶苗病组成的组的至少一种。穗枯病(Panicle blight)和白叶枯病(bacterial blight)

6.根据权利要求4所述的稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)，其中所述稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)还具有植物病原体抑制效力、植物生长促进效力和植物增强效力。

7.根据权利要求6所述的稻生芽孢杆菌(Bacillus oryzicola)，其中所述植物生长促进效力是关于稻的植物生长促进效力。

8.一种微生物制剂，用于肥料、植物保护和植物增强的用途，所述微生物制剂包含作为活性成分的根据权利要求1至7中任一项所述的微生物及其培养溶液或培养滤液。