CN115948320B - 一种水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法，属于生物领域。其包括以下步骤：(1)米粉培养基的制备；(2)病原菌的活化和培养；(3)分生孢子的洗脱。本发明还提供了所述培养方法采用的培养基及其应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法，属于生物领域。
背景技术
水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)是水稻生产面临的重要病害之一，发病田块一般减产10％-30％，严重者减产50％以上甚至绝收。该病害分布于世界各地，孟加拉国曾因本病的流行，造成稻谷失收而引起灾荒。1949年以前，该病害在我国发生普遍且严重，南北稻区均有发生，成为我国水稻生产上的三大病害之一[1]。通常认为水肥的缺乏是引起该病害的主要原因[2]。1949年新中国成立后，随着农业栽培技术的不断提高，水肥条件的不断改善，该病害的危害逐渐减轻。近年来，随着耕作方式的改变和气候变化等因素，该病害在我国主要水稻产区又出现严重为害的情况[1]，再次进入国内外学者的研究视野。
近年来，研究人员围绕水稻胡麻叶斑病的发生流行规律、侵染为害机制和绿色防控技术等开展了大量的研究工作[2]。例如，在机制研究方面，通过基因敲除、RNA干扰等技术手段解析病原菌的侵染致病机制[4,5]；在病害防控技术方面，开展了大量化学农药及生防菌剂的防控效应及机制研究[3]。水稻胡麻叶斑病菌的产孢培养在上述研究中具有重要作用，但现有的培养方法均有耗时长、效率低等问题，分生孢子的培养和获取始终是困扰相关科研工作者的问题。
非专利文献Hau,F.C.,and M.C.Rush."A system for inducing sporulation ofBipolaris oryzae."Plant disease 64(1980):788-789.研究发现使用RFA培养基培养水稻胡麻叶斑病菌能够获得较多的分生孢子，但是产生的分生孢子的数量最高只达到9.8×105个/皿；另一方面，RFA培养基较难制作或购买，而且培养时间较长。如果需要大量的分生孢子，则需要制作大量的RFA培养基，所需要的培养时间也较长，不利于相关试验的开展和推进。
非专利文献Kumar,Peeyush,Vaishali Anshu,and Sundeep Kumar."Morpho-pathological and Molecular Characterization of Bipolaris oryzae in Rice(Oryzae sativa)."Journal of Phytopathology 159.1(2011):51-56.使用了常见的容易制作的PDA培养基，培养时间也缩短到7天，但是获得的分生孢子量最高仅达1.03×105个/皿。如果需要大量的分生孢子，则需要制作大量的RFA培养基。
非专利文献Nayak,Meghana S.,and S.V.Hiremath."Cultural,morphologicaland molecular characterization of Bipolaris oryzae causing brown leaf spot ofrice in Northern Karnataka."Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 8.2(2019):1235-1239.同样利用PDA培养基对水稻胡麻叶斑病菌进行培养，获得的分生孢子数量也很少。如果需要大量的分生孢子，则需要制作大量的PDA培养基。
上述这些方法时间和经济效率都较为低下，大大制约了相关研究工作的开展。因此，本领域一直存在如何提高水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养产孢效率的技术难题，这对相关研究工作的开展和效率提升具有重要作用。
参考文献
[1]陈洪亮，彭陈，王俊伟，袁艺，郭士伟。水稻胡麻叶斑病病原菌的分离及鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2012,40(08):83-88.
[2]Sunder S,Singh R A M,Agarwal R.Brown spot of rice:an overview[J].Indian Phytopathology,2014,67(3):201-215.
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[4]Moriwaki A,Kihara J,Kobayashi T,et al.Insertional mutagenesis andcharacterization of a polyketide synthase gene(PKS1)required for melaninbiosynthesis in Bipolaris oryzae[J].FEMS microbiology letters,2004,238(1):1-8.
[5]Nakayashiki H,Hanada S,Quoc N B,et al.RNA silencing as a tool forexploring gene function in ascomycete fungi[J].Fungal Genetics and Biology,2005,42(4):275-283.
发明内容
本发明第一方面是提供一种水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法，包括以下步骤：
(1)米粉培养基的制备：取带壳的稻谷磨成粉状，加入水煮沸，过单层医用纱布，加入酵母浸粉，混匀后再加入15g琼脂粉，灭菌后待用；
(2)病原菌的活化和培养：将水稻胡麻叶斑病菌在米粉培养基上活化收获菌块，将菌块转移到新的米粉培养基上，培养5-7天；待菌丝长满培养皿后，用灭菌的载玻片将培养基表面的菌丝全部刮除，并在相同条件下继续培养；
(3)分生孢子的洗脱：向培养皿中加入无菌水，然后将培养基表面的分生孢子刮涂下来；将刮涂的孢子液经过滤后制成悬浮液；收获分生孢子。
在一种实施方案中，所述方法还包括：(4)分生孢子进行持续洗脱：步骤(3)培养皿在刮凃12h后即可再次产生大量分生孢子可供洗脱，洗脱后置于相同环境下继续培养；每间隔24h可重复洗脱一次，每个培养皿共可重复洗脱7-10次，并在第2次时达到产孢高峰。
在另一种实施方案中，所述米粉培养基的制备方法为：取20g带壳的稻谷磨成粉状，加入800mL水煮沸，过滤，加入2g酵母浸粉，混匀后装入三角瓶内，再加入15g琼脂粉，加水定容至1000mL，灭菌后待用。
在又一种实施方案中，在步骤(2)中，所述用灭菌的载玻片将培养基表面的菌丝全部刮除在整个产孢培养过程中只刮除一次。
本发明第二方面是一种所述培养方法使用的培养基，所述培养基组分包括：10-50g的粉状带壳稻谷、1-5g酵母、10-30g琼脂粉，加水定容至1000ml。
在一种实施方案中，所述培养基制备方法为：取带壳的稻谷磨成粉状，加入水煮沸，过滤，加入酵母浸粉，混匀后装入三角瓶内，再加入琼脂粉，加水定容至1000mL，灭菌后待用。
在优选的实施方案中，所述培养基组分包括：20g的粉状带壳稻谷、2g酵母、15g琼脂粉，加水定容至1000ml。
本发明的第三方面是提供所述培养基在培养水稻胡麻叶斑病菌孢子中的应用。
本发明所述水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法所带来的有益效果为：
(1)本发明中所使用的培养基为米粉培养基，相较于RFA培养基，米粉培养基更容易制作；相较于PDA培养基，水稻胡麻叶斑病菌菌丝生长茂密，能够在较短的时间内长满培养皿；
(2)现有技术的研究中都没有刮涂菌丝这一操作，本发明中在培养5-7后将培养基上的菌丝全部刮除，诱导水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的产生；
(3)现有技术开发的培养基产孢效率较低，且仅能利用一次，本发明的培养基在洗脱获得分生孢子悬浮液后，培养基可继续培养，并重复洗脱7-10次，可以极大程度提高培养效率，简化工作流程并节约时间和物料。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：不同时间点的水稻胡麻叶斑病菌分生孢子数量；数据以均值±标准差的形式表示，***代表刮涂后不同时间点褐斑病菌分生孢子数量与未刮涂的相比具有极显著差异(Student's t-test,P<0.01)。
图2：不同培养基培养所获得的水稻胡麻叶斑病菌分生孢子数量；其中，PDA：马铃薯葡萄糖琼脂培养基；RPA：细米粉培养基；CMA：玉米粉琼脂培养基；RFA：兔粮琼脂培养基；Rice：实施例1使用的米粉培养基。数据以均值±标准差的形式表示，***代表与Rice培养基相比，其他培养基产生的褐斑病菌分生孢子数量具有极显著差异(Student's t-test,P<0.001)。
图3：刮涂次数对水稻胡麻叶斑病菌分生孢子培养的影响
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1水稻胡麻叶斑病菌分生孢子培养
1)材料
供试菌株：试验中使用的水稻胡麻叶斑病菌(Bipolaris oryzae)分离自云南省红河州元阳梯田。
2)分生孢子的大量培养
a)制备米粉培养基
取20g带壳的稻谷磨成粉状，加入800mL水自来水煮沸，过单层医用纱布，加入2g酵母浸粉，混匀后装入三角瓶内，再加入15g琼脂粉，加水定容至1000mL，灭菌后待用；
b)培养分生孢子
将胡麻叶斑病菌在米粉培养基上活化，放置于25℃培养箱中光暗交替(12h/12h)培养5-7天，然后用灭菌的载玻片将培养基表面的菌丝全部刮除，并在相同条件下继续培养，整个过程只有这一次刮除操作；对照组不进行刮除菌丝操作，并在相同条件下继续培养；
c)洗脱分生孢子
对洗脱分生孢子过程中涉及到的所有器具及试验环境进行杀菌处理；每皿培养皿中加入5mL灭菌后的ddH2O，用L型细胞涂棒将培养基表面的分生孢子轻轻刮涂下来，保证培养基的整个表面都被刮涂到；取一只无菌的50mL离心管，在其上面放置一个无菌漏斗，并在漏斗内铺无菌双层医用纱布；用无菌水将L型细胞涂棒上的孢子冲洗下来，将L型细胞涂棒刮涂后的孢子液倒入漏斗经过滤后制成孢子悬浮液。分别于刮涂后18h、30h、48h、336h及504h统计每个培养皿中分生孢子的数量。
d)分生孢子量浓度测定
取1μL待测分生孢子液于血球计数板上，于显微镜下统计并计算分生孢子的数量和浓度。分生孢子量取4次检测的平均值。
e)数据分析
分生孢子量均值和分生孢子量的差异均用R软件(V4.1.3)进行分析。
3)结果与分析
a)分生孢子量
刮除菌丝后的不同时间点的分生孢子量的结果见图1。刮除菌丝后的任意时间点的分生孢子量均比未刮除的分生孢子量多，且随着时间的推移呈现出逐渐增多的趋势。刮除菌丝后分生孢子量是未刮除的(对照组)50-150倍。
实施例2不同培养基对水稻胡麻叶斑病菌分生孢子培养的影响
材料与方法同实施例1，区别仅在于分别用PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)、RPA(细米粉培养基)、CMA(玉米粉琼脂培养基)或RFA(兔粮琼脂培养基)来替换实施例1中所使用的米粉培养基，刮除菌丝后24小时计算分生孢子数量
结果如图2所示，采用PDA、RPA、CMA或RFA培养基所获得的分生孢子数量明显低于实施例1中所使用的米粉培养基所获得的分生孢子数量，米粉培养基组与其他各组之间在分生孢子数量上存在极显著统计学差异。
实施例3刮涂次数对水稻胡麻叶斑病菌分生孢子培养的影响
材料与方法同实施例1，区别在于刮除菌丝后，分别在12h、36h、60h、84h、108h、132h、156h、180h、204h和228h各时间点分别刮涂收获孢子一次并计算分生孢子数量，以考察等时间间隔下刮涂次数对分生孢子培养的影响，即该培养方法的连续生产孢子的能力。
结果如图3所示，结果表明经刮除菌丝后，该培养方法具有连续生产孢子的能力，并在48h(即第二次刮涂时)达到分生孢子产量峰值。
Claims (4)
1.一种水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法，包括以下步骤：
（1）米粉培养基的制备：取带壳的稻谷磨成粉状，加入水煮沸，过单层医用纱布，加入酵母浸粉，混匀后再加入15g琼脂粉，灭菌后待用；
（2）病原菌的活化和培养：将水稻胡麻叶斑病菌在米粉培养基上活化收获菌块，将菌块转移到新的米粉培养基上，培养5-7天；待菌丝长满培养皿后，用灭菌的载玻片将培养基表面的菌丝全部刮除，并在相同条件下继续培养；
（3）分生孢子的洗脱：向培养皿中加入无菌水，然后将培养基表面的分生孢子刮涂下来；将刮涂的孢子液经过滤后制成悬浮液；收获分生孢子。
2.如权利要求1所述水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法，其特征在于，所述方法还包括：（4）分生孢子进行持续洗脱：步骤（3）培养皿在刮凃12h后即可再次产生大量分生孢子可供洗脱，洗脱后置于相同环境下继续培养；每间隔24h可重复洗脱一次，每个培养皿共可重复洗脱7-10次，并在第2次时达到产孢高峰。
3.如权利要求1所述水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法，其特征在于，所述米粉培养基的制备方法为：取20g带壳的稻谷磨成粉状，加入800mL水煮沸，过滤，加入2g酵母浸粉，混匀后装入三角瓶内，再加入15g琼脂粉，加水定容至1000mL，灭菌后待用。
4.如权利要求1-3任一项所述水稻胡麻叶斑病菌分生孢子的培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述用灭菌的载玻片将培养基表面的菌丝全部刮除在整个产孢培养过程中只刮除一次。
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