CN105695389A - 一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，包括以下步骤：步骤1：病原菌的培养；步骤2：产孢装置；步骤3：接种叶片；步骤4：分生孢子的诱导：3d左右以后，当菌丝侵染叶片形成明显肉眼可见的病斑后，随即去除菌饼，继续喷雾保湿，于接种后6d左右在病斑处产孢，10d后每个叶片上产生的分生孢子达10⁴个左右，分生孢子产生后若要使用应及时将其用无菌水洗下，每个产孢的叶片用移液器吸取1mL无菌水进行冲洗即可，每个叶片可得到1mL的分生孢子悬浮液。与现有技术相比，本发明的有益效果为：在较短的时间内获得可供科学试验研究的槭菌刺孢的分生孢子，确保试验的稳定性、可操作性和可重复性。

Description

一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法。

背景技术

槭菌刺孢Mycocentrosporaacerina(R.Hartig)Deighton[＝Centrosporaacerina(R.Hartig)A.G.Newhall]，其分类地位为子囊菌门Ascomycota座囊菌纲Dothideomycetes球腔菌科Mycosphaerellaceae菌刺孢属Mycocentrospora，可寄生于淡水流域的沉水植物上也侵染陆地寄主植株引起植物病害，该菌寄主范围广泛，危害严重，在国外主要引起三色堇叶斑病、欧芹储藏期腐烂病、胡萝卜根腐病、牛蒡溃疡病及冠腐病等病害，该病原于上世纪90年代初传入我国，侵染药用植物细辛，引起细辛叶枯病。据调查报道1993年开始侵染三七植株，导致三七圆斑病，此后三七圆斑病逐年扩大，目前已成为三七病害中的重要叶部病害之一。

三七(Panaxnotoginseng)为五加科人参属多年生草本宿根植物，是一种原产我国的名贵中药材，在传统露天荫棚的三七种植园中三七圆斑病在雨季普遍发生，一旦发病，从开始发病到发病高峰期病程短，发病迅猛、毁灭性强，常年平均发病率在30％左右，雨季来临时若管理不善发病率可高达60％以上，严重时发病率高达70％以上，甚至毁园。因此，槭菌刺孢是一种重要的病原。随着三七生产种植范围的逐年扩大，该病的发生也愈加普遍，在化学防治方面，每年的农药施用量也出现了增加，该病原是否发生了变异未有相关报道。目前暂无关于槭菌刺孢侵染三七的病理学报道，由于其分生孢子的人工诱导不易，从而滞后了槭菌刺孢Mycocentrosporaacerina分类学和生物学等领域的研究进展。

槭菌刺孢分生孢子的产生方式特殊，其分生孢子的诱导一直以来都是难题，槭菌刺孢在人工培养基上不易产生分生孢子，偶见国外学者报道槭菌刺孢在人工培养基如(PDA、1/4PDA、V8汁培养基等)上可产生分生孢子的研究报道，但并没有详细的描述；而国内学者则普遍认为槭菌刺孢在人工培养基上不能产生分生孢子。虽然已有文献报道了多种产孢方法可诱导分生孢子的产生，但都存在局限性、重复性差、产孢量少等问题。

现有已报道的槭菌刺孢的产孢技术方案：

①翻转培养基法：有学者认为将已长满菌落的培养基翻转，使菌丝穿过培养基生长可以产生分生孢子。

②新鲜罹病组织保湿法：Neergaard(1951)将田间发病植株的罹病组织才回室内后，取小块罹病组织保湿培养，可产生大量的分生孢子。

③低温紫外培养法：Lawrie(1999)将培养在PDA平板上的槭菌刺孢菌落经低温18℃紫外光连续照射培养10d后可产生大型分生孢子。

④菌块水滴保湿法：傅俊范(1995)采用PDA或V8汁培养基平板菌块切割，水滴保湿培养方法，成功诱导了分生孢子的产生，但并未说明产生了多少分生孢子，陆宁(2005)年采用此方法在18℃全光照的条件下48h诱导了47个分生孢子。

⑤胡萝卜产孢法(此方案是与本技术发明最相近似的方案)：Louarn(2012)将槭菌刺孢菌饼接至经高温蒸汽灭菌的胡萝卜主根上，于装有100mL无菌水的无菌锥形瓶中20℃培养3周后产生分生孢子。

现有技术的产孢技术方案的缺陷为：

①翻转培养基法

缺点：傅俊范(1994)认为该种方法只对新鲜分离的病原菌有效。

②新鲜罹病组织保湿法

缺点：此种方法具有时限性。

③低温紫外培养法

缺点：经紫外线处理后的菌株可能会导致变异。

④菌块滤纸保湿法

缺点：采用该种方法产孢量过少，短暂性，不能满足常规的试验研究需要，对于不同的分离菌株不稳定，仅对于部分菌株有效，且不易将产生的分生孢子洗下，且48h后分生孢子已全部萌发，菌块失去产孢能力。

⑤胡萝卜产孢法

缺点：此种方法的培养周期时间长，比本技术发明的产孢时间要长1个月左右，且分生孢子在产孢的过程中很容易萌发，且对于不同的菌株此法不一定都有效。

发明内容

本发明的目的是克服现有方法在槭菌刺孢产孢方面的不稳定性、周期长和产孢量过少等问题，通过研究其分生孢子的产生对环境条件的需求特性，找出一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，以期通过此方法在短时间内稳定地有效诱导出较多的分生孢子。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，包括以下步骤：

步骤1：病原菌的培养:无菌条件下，用打孔器分别打取槭菌刺孢单孢菌株的菌饼接种至培养基上，置于一定温度下光照培养箱中全光照连续培养15d，以供产孢接种使用；

步骤2：产孢装置：挑选健康无病的一年生三七植株，用75％乙醇进行喷雾表面消毒，再用无菌水冲洗干净，将消毒好的三七植株移栽至盛有灭菌基质的育苗盆中，接种后用将容器和植株一同罩住的自封袋袋口朝上套上即可，小型喷雾器喷雾保湿后，密封好自封袋的袋口；

步骤3：接种叶片：取按照步骤一培养好的纯培养菌株，用打孔器打取的菌饼，在步骤二的叶片中央用无菌针刺伤一个小点，将打好的菌饼移至已刺伤的叶片中央，用无菌水对已接种的叶片进行喷雾保湿，置于20℃光照培养箱中，全光照培养，持续保湿；

步骤4：分生孢子的诱导：2-3d以后，当菌丝侵染叶片形成明显肉眼可见的病斑后，随即去除菌饼，继续喷雾保湿，于接种后6d开始在病斑处产孢，10d后每个叶片上产生的分生孢子达10⁴个左右，分生孢子产生后若要使用应及时将其用无菌水洗下，每个产孢的叶片用移液器吸取1mL无菌水进行冲洗即可，每个叶片可得到1mL的分生孢子悬浮液。

优选地，所述步骤1中的培养基为PDA培养基、V8汁培养基、胡萝卜培养基、麦芽浸膏培养基、三七煎汁培养基中的一种或几种混合物。

优选地，所述步骤1中的温度条件为4℃、8℃、12℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、28℃或32℃。

优选地，所述步骤1中的打孔器孔直径为5mm。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：在较短的时间内有效获得可供科学试验研究的槭菌刺孢的分生孢子，确保试验的稳定性、可操作性和可重复性。本技术将为槭菌刺孢的分类鉴定学研究、药效试验及病理学研究等科学试验提供基础技术支撑。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。

1、步骤一——病原菌的培养：无菌条件下，用打孔器(Ф＝5cm)分别打取槭菌刺孢单孢菌株的菌饼接种至PDA平板上，置于20℃光照培养箱中全光照连续培养15d，以供产孢接种使用。

1.1技术方案设计

1.1.1病原菌培养温度条件筛选用打孔器(Φ＝5mm)从上述方法培养的槭菌刺孢单孢菌落边缘处打取菌饼，将菌饼朝下移至PDA平板的中央，分别置于4℃、8℃、12℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、28℃、32℃共10个温度条件下暗培养，共11个温度处理，每处理接5个培养皿，重复3次。纯生长量＝菌落平均直径—菌饼直径。

1.1.2光照条件筛选设全光照、光暗交替、全黑暗共3个处理，供试菌株为按照1.1.1中培养的槭菌刺孢单孢菌株，每处理接5个培养皿，重复3次，8d后测量菌落直径。

1.1.3产孢培养基筛选设常见的PDA培养基、V8汁培养基、胡萝卜培养基(CA)、麦芽浸膏培养基(MEA)、三七煎汁培养基共5种供试产孢培养基处理，供试菌株为按照1.1.1中培养的槭菌刺孢单孢菌株，每处理20个培养皿，重复3次，培养条件为20℃全光照培养，进行槭菌刺孢在人工培养基的诱导分生孢子观察试验。

1.2结果

适宜于槭菌刺孢菌丝生长的最佳温度为20-22℃(如表1所示)，全光照和光暗交替培养均可促进菌丝的生长，二者无显著差异(如表2所示)。PDA培养基和V8汁在20℃全光照培养下可使槭菌刺孢产生分生孢子，但在试验中产孢量并不稳定、可重复性差，产孢时间具有较强的随机性、周期长(如表3所示)。因此在人工培养基使槭菌刺孢产孢的方法不可行，需要进行下一步的产孢试验探索。但基于此试验可知PDA和V8汁培养基为较好的产孢培养基，并且通过显微观察可知分生孢子主要是由其中的厚垣孢子产生分生孢子梗发育而来的。而相比V8汁的制作，PDA是一种制作非常简易方便的培养基，因此筛选出PDA培养基为最佳的槭菌刺孢菌落培养基。

表1不同温度对槭菌刺孢菌丝生长的影响

注：用SPSS17.0对不同温度下槭菌刺孢菌丝生长速率进行差异显著性分析，不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05，N＝5)。

表2不同光照条件对槭菌刺孢菌丝生长的影响

注：用SPSS17.0对不同光照条件下槭菌刺孢菌丝生长直径进行差异显著性分析，不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05，N＝5)。

表3在不同培养基上的槭菌刺孢产生分生孢子情况

注：表中“+”为可在对应培养基上可产生分生孢子；“—”为不能在对应培养基上产生分生孢子。

原理说明：槭菌刺孢在全光照培养下，接种6d前的菌丝体中一般不产生厚垣孢子，典型的槭菌刺孢菌丝体大多可分泌色素而使培养基染成番茄色或橙色等，产生厚垣孢子及类似厚垣孢子的厚壁菌丝体后，菌落中的色素减退，逐渐向褐绿色或墨绿色转变，因此根据菌落颜色的变化可对是否产生厚垣孢子进行辨别。病原真菌侵染寄主植物除了依靠分生孢子外，还可通过厚垣孢子进行侵染，培养6d后厚垣孢子陆续产生，培养15d后菌落中产生了丰富而成熟的厚垣孢子，另外槭菌刺孢分生孢子的产孢梗大多是由厚垣孢子及类似厚垣孢子的厚壁菌丝体上发育而来的，因此在培养15d的槭菌刺孢菌落上打取菌饼用以接种可增强侵染能力及后续的产孢能力。

2.步骤二——产孢装置：挑选健康无病的一年生三七植株，用75％乙醇进行喷雾表面消毒，再用无菌水冲洗干净，将消毒好的三七植株移栽至盛有灭菌基质的育苗盆中(每盆移栽的三七植株不宜过多，依育苗盆体积而定和每株植株间的叶片不交叉为宜，育苗盆体积不宜过大)，接种后用能够将容器和植株一同罩住的自封袋袋口朝上套上即可，小型喷雾器喷雾保湿后，密封好自封袋的袋口，以便下次喷雾。

原理说明：该产孢装置简单易于操作，为产孢提供了一个相对洁净的环境，并具有保持装置内空气湿度及叶面持露的功能。

3.步骤三——接种叶片：取按照步骤一培养好的纯培养菌株，用打孔器(Ф＝5cm)打取的菌饼，在步骤二的叶片中央用无菌针刺伤一个小点(避开叶面上的刺)，将打好的菌饼移至已刺伤的叶片中央(避开叶面上的刺，菌饼朝下)，用无菌水对已接种的叶片进行喷雾保湿，置于20℃光照培养箱中，全光照培养，持续保湿(2-3次人工喷雾/d)。

原理说明：刺伤叶片造成伤口后接种植株可加快病原菌侵染的速度。

4.步骤四——分生孢子的诱导：2-3d以后，当菌丝侵染叶片形成明显肉眼可见的病斑后(不同致病力的菌株形成侵染病斑的时间会不一样，以可观察到侵染的病斑为准)，随即去除菌饼(接种块)，继续喷雾保湿，于接种后6d开始在病斑处产孢(摘下叶片，利用光学显微镜10×物镜明场下即可观察叶片是否产孢)，10d后每个叶片上产生的分生孢子达10⁴个左右，分生孢子产生后若要使用应及时将其用无菌水洗下，每个产孢的叶片用移液器吸取1mL无菌水进行冲洗即可，每个叶片可得到1mL的分生孢子悬浮液。

4.1技术方案设计

4.1.1产孢温度筛选设4℃、8℃、12℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、28℃、32℃共10个不同的温度处理，每个温度处理接种10个接种植株，重复3次，于接种后10d分别将各处理接种的三七叶片平放在载玻片上并置于光学显微镜(10倍物镜)下进行显微观察，当观察到有分生孢子产生后，再分别用1mL无菌水将分生孢子洗下。由于槭菌刺孢的分生孢子个体较大(平均长100μm左右)，采用常规的血球板孢子计数法已不能准确地对产孢量进行计数。因此，对于每个叶片的产孢计数方法为：用移液器将上述的1mL的分生孢子悬浮液进行打吹混匀后，再用移液器分别随机吸取5次10μL的孢子悬浮液滴至载玻片上置于10倍物镜上进行计数，孢子数以10-100个/10μL为宜(如若过多，应再次稀释后计数)。

每个叶片上分生孢子总数的计算公式为：

(n＝每10μL孢子悬浮液中的孢子个数；A为稀释倍数)。

4.1.2接种处理试验设以下处理A、处理B、处理C共3个不同的接种试验处理(具体方法见下)，每个处理接种10株苗，重复3次。观察分生孢子产生量的稳定性。

处理A：菌饼接种2-3d以后叶片产生病斑，移除菌饼，其他步骤同本发明所述；

处理B：菌饼接种发病后不移除菌饼，其他步骤同本发明所述；

处理C：用刀片刮取培养15d菌落的菌丝至2mL无菌水中，经一层纱布过滤后，8000rpm离心2min去除上清，再加入2mL无菌水振荡摇匀后得到菌丝悬浮液接种后用小型喷雾器喷至三七植株的叶片上，其他步骤同本发明所述。

4.1.3不同产孢方法进行诱导分生孢子的稳定性比较设PDA、V8汁培养基、活体接种法(本技术发明所述方法)共3个试验处理，将按1.1.1方法培养的槭菌刺孢单孢菌株分别接至PDA平板、V8汁培养基平板和活体三七植株上，每个处理接30次，重复3次，观察分生孢子产生情况，分生孢子计算方法同4.1.1。

4.2结果采用本产孢技术，当温度在8℃-22℃范围内均可在三七叶片上诱导其分生孢子的产生，其中以20℃为其最佳的产孢温度，18℃的产孢量与20℃的产孢量无显著差异，平均产孢量均达到了每个叶片10⁴个分生孢子，但18℃的产孢量略低于20℃的，其次分别为16℃、22℃、12℃，产孢量最低的温度处理为8℃，而当培养温度低于8℃和24℃及其以上温度时，不能诱导槭菌刺孢在三七叶片上产生分生孢子。培养10d后不同温度的产孢量结果见表4所示。接种处理试验的结果表明，接种发病后及时移除菌饼有利于分生孢子的产生(见表5)，而不移除菌饼和采用菌悬液接种的在产孢上不稳定，其中菌悬液接种的发病慢，分生孢子产生少或不产生；不移除菌饼的产孢没有及时移除菌饼的稳定。由表6所示，由于产孢培养基PDA和V8汁平板上分生孢子产生的随机性，通过差异显著性分析，3个产孢处理并无显著性差异，但与产孢培养基相比，活体接种法具有较高稳定性，且产孢周期短；而产孢培养基分生孢子的产生具有较大的随机性且产孢周期较长。综上所述，活体接种是目前较好的一种诱导槭菌刺孢分生孢子产生的方法。

表4培养10d不同温度处理下槭菌刺孢在活体三七植株叶片上的产孢情况

注：用SPSS17.0对不同温度下槭菌刺孢在活体三七植株叶片上的产孢量进行差异显著性分析，不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05，N＝10)；其中表中“─”所示为在该温度下不能诱导分生孢子的产生。

表5不同接种处理对产孢的影响

注：处理A：菌饼接种3-4d后，移除菌饼；处理B：菌饼接种后不移除菌饼；处理C：菌丝接种。

表6不同产孢方法对诱导槭菌刺孢分生孢子产生的影响

注：用SPSS17.0对不同温度下槭菌刺孢在活体三七植株叶片上的产孢量进行差异显著性分析，不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05，N＝30)

原理说明：通过不同温度的诱导产孢试验可知，槭菌刺孢分生孢子产生的温度范围，从而的得出最佳的产孢温度，以获得最大量的分生孢子，活体接种中及时移除菌饼可减缓其菌丝营养生长阶段，促使其向生殖生长阶段转变，从而有利于分生孢子的产生。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：病原菌的培养:无菌条件下，用打孔器分别打取槭菌刺孢单孢菌株的菌饼接种至培养基上，置于一定温度下光照培养箱中全光照连续培养15d，以供产孢接种使用；

步骤2：产孢装置：挑选健康无病的一年生三七植株，用75％乙醇进行喷雾表面消毒，再用无菌水冲洗干净，将消毒好的三七植株移栽至盛有灭菌基质的育苗盆中，接种后用能够将容器和植株一同罩住的自封袋袋口朝上套上即可，小型喷雾器喷雾保湿后，密封好自封袋的袋口；

步骤3：接种叶片：取按照步骤一培养好的纯培养菌株，用打孔器打取的菌饼，在步骤二的叶片中央用无菌针刺伤一个小点，将打好的菌饼移至已刺伤的叶片中央，用无菌水对已接种的叶片进行喷雾保湿，置于20℃光照培养箱中，全光照培养，持续保湿；

步骤4：分生孢子的诱导：2-3d以后，当菌丝侵染叶片形成明显肉眼可见的病斑后，随即去除菌饼，继续喷雾保湿，于接种后6d开始在病斑处产孢，10d后每个叶片上产生的分生孢子达10⁴个左右，分生孢子产生后若要使用应及时将其用无菌水洗下，每个产孢的叶片用移液器吸取1mL无菌水进行冲洗即可，每个叶片可得到1mL的分生孢子悬浮液。

2.根据权利要求1所述的快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，其特征在于：所述步骤1中的培养基为PDA培养基、V8汁培养基、胡萝卜培养基、麦芽浸膏培养基、三七煎汁培养基中的一种或几种混合物。

3.根据权利要求1所述的快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，其特征在于：所述步骤1中的温度条件为4℃、8℃、12℃、16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、28℃或32℃。

4.根据权利要求1所述的快速获得三七圆斑病菌分生孢子的活体接种产孢方法，其特征在于：所述步骤1中的打孔器孔直径为5mm。