CN103503737A - 一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法。该方法通过人工接种评价梨树资源和品种的抗病性，解决梨树抗病育种中高抗资源材料早期发现难与快速评价问题，为梨树抗腐烂病育种奠定基础。该方法按照如下步骤进行：（1）梨苗培育与准备；（2）菌种培养；（3）梨苗接种；（4）病情调查与评价。本发明采用人工接种技术，为病原菌提供了很好的发病条件，保证了试验材料感染病菌的机会，使用本发明的方法能快速准确地进行梨树腐烂病抗性鉴定及筛选，使用该接种方法较自然发病调查鉴定的结果准确性、可靠性提高。
Description
技术领域
本发明属于植物病害抗性鉴定的技术领域，具体涉及一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法。
背景技术
梨树是我国主要果树树种之一，我国南北方均可种植，目前发展面积，产量均具世界第一位。据统计，我国梨树面积100万公顷，产量1300万吨。
梨树在栽培过程中，病虫害种类繁多，危害严重。其中梨树腐烂病是梨树生产中第一大毁灭性病害，该病在我国主要梨产区均有分布，尤其是在易发生冻害的地区或年份，造成梨树死树死枝普遍，严重果园病株率高达70%-80%以上，对梨树产业构成严重威胁。
目前我国主栽品种库尔勒香梨、酥梨、雪花梨等多为高感品种。生产上均需要采取多种措施控制该病害的发生，目前采用化学防治，一般于萌芽前喷铲除性杀菌剂，发病后进行病斑刮治并结合涂抹高浓度化学药剂处理是主要的防病措施。但长期依靠药剂防治，难度逐年加大，且效果并不理想。若能推出高抗梨树腐烂病的优质品种，替代现有的大批感病品种，减少或不用化学药剂，将从根本上解决此病的防治问题，且可减少农药的使用，对环境、生态带来安全，并会显著提高经济和社会效益，有利于梨树产业的稳定与发展，是非常有意义的工作。而抗病育种的关键，就是要有抗原材料。而抗原材料的获得需要从大量梨树品种、梨树杂交组合或野生资源中发现和获取，再通过常规或分子育种富集培育，做进一步的筛选与利用。梨树腐烂病抗病性检测，目前国内采用自然调查的方法，自然调查会受到试验地区，试验果园，年份、气候等影响，一般很难反映特定材料的抗性实际水平，仅能作为抗性育种中的参考。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法，不仅简便、快速，且准确性和可靠性提高。
为实现上述目的，本发明采用技术方案如下：
一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法，该方法按如下步骤进行：
（1）梨苗培育与准备：按照常规的土肥水管理及病虫害控制措施培育和管理梨苗。
（2）菌种培养：将室内低温保存的梨树腐烂病菌菌种接种在PSA培养基上，于20℃下培养7天，再用直径5mm打孔器打成菌饼备用。
（3）梨苗接种：接种时先对待接种梨苗的枝条表面消毒，再用直径5mm打孔器在枝条上打孔，将步骤（2）得到菌饼接种至枝条的孔中，再用脱脂棉沾无菌水缠绕，外用封口膜缠绕保湿培养。
（4）病情调查与评价：于接种后第30天，调查每个接种点发病情况，记录病斑扩展直径或长度、枝条死亡状况，按以下分级标准进行每个接种点的病情级数调查，并计算出每株的病情指数：
0级不发病
1级病斑长度在1cm以下
2级病斑直径在1-2cm之间
3级病斑直径在2-4cm之间
4级病斑直径在4cm以上或枝条死亡或叶片枯萎。
病情指数=[Σ(各级病点数×相应病级)／调查总点数×最高病级]×100
免疫（I） 0.00
高抗（HR） 0.00＜病情指数≤20.00
抗病（R） 20.00＜病情指数≤30.00
感病（S） 30.00＜病情指数≤40.00
高感（HS） 病情指数>40.00。
进一步，上述步骤（3）在接种时先对待接种梨苗的枝条表面用70%乙醇溶液或5%次氯酸钠溶液消毒，再用直径5mm打孔器在枝条上每间隔7-10cm打孔，打4个孔，孔深至木质部，每孔上各接一个菌饼，再用脱脂棉沾无菌水缠绕，外用宽1厘米左右的封口膜缠绕保湿培养。
进一步，上述步骤（3）梨苗接种于当年9-10月、第二年4-5月共进行2次。
进一步，上述步骤（2）菌种准备包括：将室内低温保存的梨树腐烂病菌菌种接种在PSA培养基上，置于培养箱中20℃下培养7天，再用直径5mm打孔器打成菌饼备用；其中，PSA培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml。
上述打孔器的尺寸为5mm。
本发明通过人工接种评价梨树抗病性，解决梨树抗病育种中高抗资源材料早期发现难与快速评价问题，为梨树抗腐烂病育种奠定基础。
本发明与自然发病调查比较，因为自然发病评价受菌源量、气候等多种因素影响，不利于抗病品种的筛选，本发明采用人工接种技术，为病原菌提供了很好的发病条件，保证了试验材料感染病菌的机会，使用本发明的方法能快速准确地进行梨树腐烂病抗性鉴定及筛选，使用该方法筛选出想要的高抗、抗病品种，因此准确性、可靠性提高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例的梨树腐烂病抗性鉴定的方法，该梨树腐烂病抗性鉴定的方法包括以下步骤：
（1）梨苗培育与准备：按照常规的土肥水管理及病虫害控制措施培育和管理梨苗；
（2）菌种培养：将室内低温保存的梨树腐烂病菌菌种接种在PSA培养基上，于20℃下培养7天，再用直径5mm打孔器打成菌饼备用；
（3）梨苗接种：接种时先对待接种梨苗的枝条表面消毒，再用直径5mm打孔器在枝条上打孔，将步骤（2）得到菌饼接种至枝条的孔中，再用脱脂棉沾无菌水缠绕，外用封口膜缠绕保湿培养。
（4）病情调查与评价：于接种后第30天，调查每个接种点发病情况，记录病斑扩展直径或长度、枝条死亡状况，按以下分级标准进行每个接种点的病情级数调查，并计算出每株的病情指数：
0级不发病
1级病斑长度在1cm以下
2级病斑直径在1-2cm之间
3级病斑直径在2-4cm之间
4级病斑直径在4cm以上或枝条死亡或叶片枯萎。
病情指数=[Σ(各级病点数×相应病级)／调查总点数×最高病级]×100
免疫（I） 0.00
高抗（HR） 0.00＜病情指数≤20.00
抗病（R） 20.00＜病情指数≤30.00
感病（S） 30.00＜病情指数≤40.00
高感（HS） 病情指数>40.00。
作为本发明实施例的一优化方案，上述步骤（3）在接种时先对待接种梨苗的枝条表面用70%乙醇溶液或5%次氯酸钠溶液消毒，再用直径5mm打孔器在枝条上每间隔7-10cm打孔，打4个孔，孔深至木质部，每孔上各接一个菌饼，再用脱脂棉沾无菌水缠绕，外用宽1厘米左右的封口膜缠绕保湿培养。
作为本发明实施例的一优化方案，上述步骤（3）梨苗接种于当年9-10月、第二年4-5月共进行2次。
作为本发明实施例的一优化方案，上述步骤（2）菌种准备包括：将室内低温保存的梨树腐烂病菌菌种接种在PSA培养基上，置于培养箱中20℃下培养7天，再用直径5mm打孔器打成菌饼备用；其中，PSA培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1（梨树腐烂病抗性鉴定及筛选）
实施例1按如下步骤进行：
1试验方法
（1）梨苗培育与准备：选用的梨苗是中国农业科学院郑州果树研究所梨资源课题组提供的4000株实生苗，按照常规的土肥水管理及病虫害控制措施培育和管理梨苗。
（2）菌种培养：将室内低温保存的梨树腐烂病菌菌种接种在PSA培养基上，置于培养箱中20℃下培养7天，再用直径5mm打孔器打成菌饼备用；其中，PSA培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml。
（3）梨苗接种：于当年9-10月共接种4000株实生苗，每棵苗接种一个枝条，接种时先对待接种梨苗的枝条表面用70%乙醇或0.5%次氯酸钠溶液消毒，再用直径5mm打孔器在枝条上每间隔7-10cm打孔，打4个孔，每孔上各接一个步骤（2）得到菌饼，再用脱脂棉沾无菌水缠绕，外用宽1厘米左右的封口膜缠绕保湿培养。
（4）病情调查与评价：于接种后第30天调查，调查每个接种点发病情况，记录病斑扩展直径或长度、枝条死亡状况，按以下分级标准进行每个接种点的病情级数调查，并计算出每株的病情指数：
0级不发病
1级病斑长度在1cm以下
2级病斑直径在1-2cm之间
3级病斑直径在2-4cm之间
4级病斑直径在4cm以上或枝条死亡或叶片枯萎；
病情指数=[Σ(各级病点数×相应病级)／调查总点数×最高病级]×100
免疫（I） 0.00
高抗（HR） 0.00＜病情指数≤20.00
抗病（R） 20.00＜病情指数≤30.00
感病（S） 30.00＜病情指数≤40.00
高感（HS） 病情指数>40.00。
（5）重复：于第二年4-5月，对第一年接种获得的高抗和抗病单株进行第二次接种和调查。方法同上。
2试验结果
实生苗接种结果：于当年9-10月，共接种4000株实生苗。接种后30天调查数据计算所得结果如下：高抗（HR）单株39株，抗病单株（R）69株，感病或高感单株共3892株，分别占1%、1.7%和97.3%。第二年4-5月对第一年所得的39株高抗单株，69株抗病单株，进行第二次接种。仍有10株高抗（HR）单株不发病，抗性稳定。抗病（R）单株有43株，其它的则是感病或高感单株。调查结果表明4000株实生苗接种后腐烂病抗性差别明显，能够较好的区分抗、感个体，为抗性个体筛选奠定了基础。
实施例2（对多个梨树品种腐烂病抗性鉴定）
1试验方法
（1）梨树培育与准备：选用的梨苗是中国农业科学院郑州果树研究所梨资源课题组提供的147个梨树品种，表1为147个梨树品种，按照常规的土肥水管理及病虫害控制措施培育和管理梨苗。
（2）菌种培养：将室内低温保存的梨树腐烂病菌菌种接种在PSA培养基上，置于培养箱中20℃下培养7天，再用直径5mm打孔器打成菌饼备用；其中，PSA培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml。
（3）梨树接种：于当年9-10月共接种147个品种，每个品种接1棵，每个接4个枝条，每个枝条接4个点，接种时先对待接种梨苗的枝条表面用70%乙醇或0.5%次氯酸钠溶液消毒，再用直径5mm打孔器在枝条上每间隔7-10cm打孔，打4个孔，每孔上各接一个步骤（2）得到菌饼，再用脱脂棉沾无菌水缠绕，外用宽1厘米左右的封口膜缠绕保湿培养。
（4）病情调查与评价：于接种后第30天调查，调查每个接种点发病情况，记录病斑扩展直径或长度、枝条死亡状况，按以下分级标准进行每个接种点的病情级数调查，并计算出每株的病情指数：
0级不发病
1级病斑长度在1cm以下
2级病斑直径在1-2cm之间
3级病斑直径在2-4cm之间
4级病斑直径在4cm以上或枝条死亡或叶片枯萎；
病情指数=[Σ(各级病点数×相应病级)／调查总点数×最高病级]×100
免疫（I） 0.00
高抗（HR） 0.00＜病情指数≤20.00
抗病（R） 20.00＜病情指数≤30.00
感病（S） 30.00＜病情指数≤40.00
高感（HS） 病情指数>40.00。
（5）重复：于第二年4-5月，对第一年接种获得的高抗和抗病品种进行第二次接种和调查。方法同上。
2试验结果
调查计算结果：于当年9-10月，共接种147个品种。接种后30天调查计算结果表明高抗（HR）品种有2个，分别是香水和恩梨；抗病（R）的有10个，分别为冬果梨、冀蜜、甘泉、雪芳、二宫白、中梨三号、早香酥、大头梨、香麻、彬县老遗生。高抗、抗病、感病和高感品种分别占接种品种的1.4%、6.8%、13.6%和78.2%，说明在现有的梨树资源中，主要以感病品种为主，无免疫品种。于第二年4-5月重复鉴定，试验结果与第一年的结果趋势类似。
选用高抗、抗病、感病等不同抗性水平的梨树品种成龄梨树进行田问自然发病调查，并与早期幼树接种结果比较，结果看出：人工接种的幼树与田问自然观察的成龄果树发病趋势一致，说明利用早期接种鉴定可反映田问成龄梨树的抗性水平。
表1147个梨树品种
| 品种 | 品种 | 品种 |
| 香水 | 恩梨 | 855 |
| 922 | 甘泉 | 雪芳 |
| 二宫白 | 中梨三号 | 早香酥 |
| 彬县老遗生 | 香麻 | 大头梨 |
| 文山红雪梨 | 69 | 天皇 |
| 新鸭梨 | 园黄 | 新杭 |
| 云南无名梨 | 新水 | 早酥 |
| 雅青 | 油酥 | 雪青 |
| 酥梅 | 宝珠梨 | 鸭广 |
| 富源黄梨 | 杭青 | 苹香梨 |
| 红茄梨+金花 | 日面红 | 冀蜜 |
| 砀山酥梨 | 黄县长把 | 索美 |
| 栖霞大香水 | 幸水 | 红太阳 |
| 长寿 | 青松 | 晚秀 |
| 金水二号 | 樊山 | 华山 |
| 华梨2号 | 红蓓蕾沙 | 红酥脆 |
| 八月红 | 重阳红 | 新雪 |
| 雪花 | 新梨7号 | 鲁南黄皮水 |
| 苍溪雪梨 | 早酥蜜 | 巴梨 |
| 新高 | 新雅 | 墨梨 |
| 长清小白梨 | 桂冠 | 意大利3号 |
| s4 | 新世纪 | OHF31 |
| 金星 | 考西亚 | OHF51 |
| 锦丰 | 法兰西 | 红茄梨 |
| 甘梨早 | 火把 | 玛利亚 |
| 芝麻梨 | 尤日卡 | 考西亚 |
| 鸭梨 | 盛马 | Moscal.o |
| 清沟沙疙瘩 | 考蜜斯 | 冬果梨 |
| 满果香 | 鲁沙 | 好本号 |
| 白皮酥 | 老卢库介 | 鲜美 |
| 花盖 | 软儿梨 | 博多青 |
| 大叶雪 | 小冬果梨 | 水洞瓜 |
| 软枝青 | 安宁村无名梨一号 | 金花早 |
| 桔蜜 | 早黄金 | t-47 |
| 海棠梨 | 甘川 | 孝义伏 |
| 白花罐 | 红蜜宝 | 黄花 |
| 水红宵 | 甘梨早8 | 太白 |
| 祗园 | 秋荣 | 张掖长把犁 |
| 五香 | 孔德梨 | 秋白梨 |
| 八里香 | 红安久7号 | 绿云 |
| 玉露香 | 大巴梨 | 鹅梨 |
| 崇化大梨 | 派克汉姆 | 新鸭梨 |
| 黄金梨+金花 | 威廉姆斯 | 奥莎甘世纪 |
| 库尔勒 | 2号红梨 | 凤县鸡腿 |
| 黄冠 | 红康弗伦斯 | 龙香 |
| 金花 | 早红考蜜斯 | 庶梨 |
| 八月酥 | 红考蜜斯 | 花长把 |
| 薄山池梨 | 意大利4号 | 伏茄梨 |
| 酥 | 宝石克 | 七月酥 |
Claims (4)
1.一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法，其特征在于：该方法按如下步骤进行：
（1）梨苗培育与准备：按照常规的土肥水管理及病虫害控制措施培育和管理梨苗；
（2）菌种培养：将室内低温保存的梨树腐烂病菌菌种接种在PSA培养基上，于20℃下培养7天，再用直径5mm打孔器打成菌饼备用；
（3）梨苗接种：接种时先对待接种梨苗的枝条表面消毒，再用打孔器在枝条上打孔，将步骤（2）得到菌饼接种至枝条的孔中，再用脱脂棉沾无菌水缠绕，外用封口膜缠绕保湿培养；
（4）病情调查与评价：于接种后第30天调查，调查每个接种点发病情况，记录病斑扩展直径或长度、枝条死亡状况，按以下分级标准进行每个接种点的病情级数调查，并计算出每株的病情指数：
0级不发病
1级病斑长度在1cm以下
2级病斑直径在1-2cm之间
3级病斑直径在2-4cm之间
4级病斑直径在4cm以上或枝条死亡或叶片枯萎；
病情指数=[Σ(各级病点数×相应病级)／调查总点数×最高病级]×100
免疫（I） 0.00
高抗（HR） 0.00＜病情指数≤20.00
抗病（R） 20.00＜病情指数≤30.00
感病（S） 30.00＜病情指数≤40.00
高感（HS） 病情指数>40.00。
2.根据权利要求1所述的一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法，其特征在于：接种时先对待接种梨苗的枝条表面用70%乙醇或0.5%次氯酸钠溶液消毒，再用直径5mm打孔器在枝条上每间隔7-10cm打孔，打4个孔，孔深至木质部，每孔上各接一个菌饼，再用脱脂棉沾无菌水缠绕，外用宽1厘米的封口膜缠绕保湿培养。
3.根据权利要求1或2所述的一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法，其特征在于：梨苗接种于当年9-10月、第二年4-5月共进行2次。
4.根据权利要求1所述的一种梨树腐烂病抗性鉴定的方法，其特征在于：菌种培养包括：将室内低温保存的梨树腐烂病菌菌种接种在PSA培养基上，置于培养箱中20℃下培养7天，再用打孔器打成5mm菌饼备用；其中，PSA培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂15～20g，蒸馏水1000ml。
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| CN103503737B (zh) | 2015-12-09 |
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Granted publication date: 20151209 Termination date: 20161009 |