CN106591418A - 一种利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的方法，包括灰叶斑病菌的培养，菌液的收集，离体番茄叶片处理和接种等步骤。本发明主要利用培养的灰叶斑病菌，通过离体叶片接种病菌，鉴定不同番茄材料对该病菌的抗性。该方法在室内利用一片叶片，就可以鉴定材料的抗病性，操作简单，可控性好，效率高，是一种简便有效的接种鉴定方法。通过该方法能科学高效准确地鉴定出不同品种番茄对灰叶斑病的抗性。

Description

一种利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的鉴定方法
技术领域
本发明涉及番茄灰叶斑病，更具体地说是一种利用灰叶斑病菌接种到番茄离体叶片上的抗性评价方法。
背景技术
番茄灰叶斑病在全世界范围内均有发生，灰叶斑病只为害叶片，在适宜条件下，传播很快，从发病到全株叶片感染只需2-3天，大量的落叶严重降低番茄产量和品质。
近年来，番茄灰叶斑病等病害在番茄生产中产生的危害越来越严重，且随着近年来气候的异常变化和复种指数的提高，病害兼发的频率越来越高，市场对品种多抗性的要求越来越迫切。所以亟需加强包括灰叶斑病等多种病害抗病种质资源的创新研究。
植物病害鉴定方法包括田间成株鉴定、室内苗期鉴定、离体鉴定及分子鉴定等。自然发病条件下的田间鉴定是鉴定抗病性的最基本方法。它能对育种材料或品种的抗性进行最全面、严格的鉴定。它的优点是能较全面准确地反应被鉴定材料的抗病性，操作方便。缺点是占用较多的土地，费用较高，而且没有均匀的发病条件就难以对植物品种资源的抗病性做出可靠的鉴定。温室或田间接种鉴定这种方法是将病原菌孢子或病毒直接接种到温室或田间植株的叶片、果实或根上，它适合对所有植物进行抗病性鉴定。接种的方法有点滴法、喷雾法、浸根法、摩擦法及注射法等。与田间鉴定方法相比，室内离体鉴定较少受外界环境因素影响、占用空间小、无需独立病圃、可便捷地同时鉴定多种病害，并有利于珍稀基因资源的保存。而与分子标记检测方法相比，室内离体鉴定不需要大量昂贵设备投入、操作简便、经济、快速、高效、准确实用。因此建立一套番茄离体抗性鉴定方法可以降低育种成本、提高抗病性筛选效率、加速番茄育种进程。
发明内容
本发明解决上述技术上检测周期长，成本高，受环境影响的缺点，利用番茄离体叶片接种灰叶斑菌，在精确的实验条件下评价病害发生程度，检测不同品种番茄灰叶斑病的抗性。灰叶斑病菌接种到不同品种番茄离体叶片上，不同品种番茄抗性不同，病情指数不同，通过比较病情指数差异来检测不同番茄灰叶斑病抗性。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：
一种利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）番茄种植：种植不同品种番茄，待生长至6叶期，剪取生理状态一致的叶片，进行灰叶斑病接种。
2）灰叶斑病菌培养：在本地番茄田间典型发病植株采集灰叶斑病叶经分离纯化后得到灰叶斑菌，放在冰箱内保存，在接种前1周将该菌株接种在PDA培养基上，置于25℃恒温下培养箱中培养，待菌落长满培养皿时用直径为5mm的打孔器，将病原菌打成大小一致的菌饼待用。
3）离体番茄叶片菌饼接种法：
切取带有4-5片小叶的番茄叶片，将切口处用灭菌的脱脂棉包裹，放置在铺有滤纸的搪瓷盘内，然后用无菌水浇灌滤纸和脱脂棉使其吸满水，以保证番茄离体叶片的鲜活，将准备好的菌饼用灭菌的牙签挑出放置在番茄叶面上，每个叶片放上菌片，进行培养。接种后观察病斑。
4）抗性划分标准：高抗：病情指数≤20；中抗：20<病情指数≤40；感病：40<病情指数≤60；高感：60<病情指数。
其中所述的灰叶斑菌品种指的是：茄匐柄霉《露地番茄灰叶斑流行表现与防治方法》，文章编号：1672-6820（2006）08-0021-2。所述的灰叶斑菌是从番茄田间典型发病植株采集灰叶斑病叶经分离纯化后活的菌株。所述的番茄品种指的是 “绿顶”和“长丰5”。
本发明进一步公开了通过利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性方法在有效区分不同番茄品种对灰叶斑病抗性方面的应用，实验结果显示：采用本发明的鉴定方法，可以很好的区别两种番茄对灰叶斑病的抗性，例如绿顶病情指数为8.3，为高抗灰叶斑品种，长丰5病情指数为61.7，为感病品种。
本发明更加详细的描述如下：
一种利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的鉴定方法，包括以下步骤：
1）番茄种植：种植不同品种番茄，待生长至6叶期，剪取生理状态一至的叶片，进行灰叶斑病接种。
2）灰叶斑病菌培养：在本地番茄田间典型发病植株采集灰叶斑病叶在PDA培养基分离纯化，并置于25℃恒温下培养箱中培养。待菌落长满培养皿时用直径为5mm的打孔器，将病原菌打成大小一致的菌饼待用。
3）离体番茄叶片菌饼接种法：切取带有4-5片小叶的番茄叶片，将切口处用灭菌的脱脂棉包裹，放置在铺有滤纸的搪瓷盘内，然后用无菌水浇灌滤纸和脱脂棉使其吸满水，以保证番茄离体叶片的鲜活。将准备好的菌饼用灭菌的牙签挑出放置在番茄叶面上，每个叶片放上菌片，然后用保鲜膜将搪瓷盘封住，防止水分的散失。光照16h，温度21℃，湿度90%，在光照培养箱进行培养。
4）离体叶片接种后病情统计: 以病情指数作为衡量病害严重程度的评价指标。0级：病斑直径无扩展；1级：病斑直径为≤7mm，侵染点变黄；2级：7mm<病斑直径为≤8mm，病斑变褐；3级：8mm<病斑直径为≤10mm，病斑变褐腐烂；4级：10mm<病斑直径，叶片大面积腐烂。
抗性划分标准：高抗：病情指数≤20；中抗：20<病情指数≤40；感病：40<病情指数≤60；高感：60<病情指数。
本发明公开的利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的鉴定方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）与田间鉴定方法相比，利用离体叶片鉴定较少受外界环境因素影响、占用空间小、无需独立病圃、可便捷地同时鉴定多种病害，并有利于珍稀基因资源的保存。
（2）与分子标记检测方法相比，利用离体叶片鉴定不需要大量昂贵设备投入。
（3）利用离体叶片鉴定操作简便、经济、快速、高效、准确实用。
附图说明：
图1为番茄离体叶片接种图；
图2 番茄离体叶片发病图；其中上部为发病叶，下部为对照叶片。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用到的番茄品种“绿顶”和“长丰5”均有市售。茄匐柄霉在本地番茄田间典型发病植株采集灰叶斑病叶经分离纯化后得到灰叶斑菌病菌，也可以按照文章编号：1672-6820（2006）08-0021-2）的方法获得。
实施例1
灰叶斑病菌培养方法、步骤如下：
PDA培养基：将新鲜的马铃薯去皮，切成小方块，称取200g，加入500ml水，煮沸半小时，从纱布过滤，加入葡萄糖10g，琼脂20g，最后加水补足至1000mL，倒入2000ml的三角瓶中，高压锅蒸汽灭菌，120℃下20min，趁热倒入培养皿。冷却后备用。
取材培养：取田间典型发病番茄叶，选择典型的单个病斑，用剪刀剪取病斑小块（3mm×3mm）4-6片，将剪取的病叶组织放入75%酒精消毒3～5s，将病叶组织移入0.1%升汞液中进行表面消毒，消毒30s，然后放入无菌水中连续漂洗5-6次，把病叶组织接入培养皿，4天后观察分离的病叶组织处真菌菌落的特征，然后在无菌条件下，用接种环自菌落边缘沾取少许菌丝移入新的培养基上，采取画线法，在25℃左右的恒温箱内培养，继续纯化，反复分离3次。所得到的灰叶斑病菌与茄匐柄霉在生理、生化特性方面相同。
实施例2
番茄苗种植：将番茄品种“绿顶”、“长丰5”在温室进行育苗，育苗前将器具及50穴育苗盘洗净并用5％的次氯酸钠消毒，育苗用营养土为蛭石、珍珠岩、草炭(1:1:3)混配的复合土，经高温灭菌后双粒播种，每个品种25穴。待植株苗龄约5叶1心时备用。
灰叶斑病菌培养：在本地番茄田间典型发病植株采集灰叶斑病叶经分离纯化后在冰箱内保存，在接种前1周将菌株接种在PDA培养基上（PDA马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，水1000ml），连续光照，25℃恒温下培养箱中培养。待菌落长满培养皿时用直径为5mm的打孔器，将病原菌打成大小一致的菌饼待用。
离体番茄叶片菌饼接种:切取带有4-5片展叶的番茄，将切口处用灭菌的脱脂棉包裹，放置在铺有滤纸的搪瓷盘内，然后用无菌水浇灌滤纸和脱脂棉使其吸满水，以保证番茄离体叶片的鲜活。将事先准备好的菌饼用灭菌的牙签挑出放置在番茄叶面上，尽量选取大小一致的番茄叶片，每个叶片放上菌片，然后用保鲜膜将搪瓷盘封住，防止水分的散失。见图1。每个品种接种15片。并置于人工气候箱内光照16h，温度21℃，湿度90%以上。15d后统计发病情况。见图2。
5）离体叶片接种后病情统计: 以病情指数作为衡量病害严重程度的评价指标。抗性划分标准：高抗：高抗：病情指数≤20；中抗：20<病情指数≤40；感病：40<病情指数≤60；高感：60<病情指数。病害划分：0级：病斑直径无扩展；1级：病斑直径为≤7mm，侵染点变黄；2级：7mm<病斑直径为≤8mm，病斑变褐；3级：8mm<病斑直径为≤10mm，病斑变褐腐烂；4级：
结果分析：
通过病情指数统计，见表1:
通过统计分析， 绿顶病情指数为8.3，为高抗灰叶斑品种，长丰5病情指数为61.7，为感病品种。通过利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的方法可以区分这两种番茄对灰叶斑病的抗性。
实施例3
表2田间抗病性鉴定和离体叶片抗病性鉴定比较
利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的鉴定方法较少受外界环境因素影响，占用空间小、无需独立病圃，可便捷地同时鉴定多种病害。

Claims (5)

1.一种利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性的鉴定方法，其特征在于按如下的步骤进行：
1）番茄种植：种植不同品种番茄，待生长至6叶期，剪取生理状态一致的叶片，进行灰叶斑病接种；
2）灰叶斑病菌培养：在本地番茄田间典型发病植株采集灰叶斑病叶经分离纯化后得到灰叶斑菌，放在冰箱内保存，在接种前1周将该菌株接种在PDA培养基上，置于25℃恒温下培养箱中培养，待菌落长满培养皿时用直径为5mm的打孔器，将病原菌打成大小一致的菌饼待用；
3）离体番茄叶片菌饼接种法：
切取带有4-5片羽叶的番茄叶，将切口处用灭菌的脱脂棉包裹，放置在铺有滤纸的搪瓷盘内，然后用无菌水浇灌滤纸和脱脂棉使其吸满水，以保证番茄离体叶片的鲜活，将准备好的菌饼用灭菌的牙签挑出放置在番茄叶面上，每个叶片放上菌片，进行培养，接种后观察病斑。
2.权利要求1所述的鉴定方法，其中所述的灰叶斑菌品种指的是：茄匐柄霉。
3.权利要求1所述的鉴定方法，其中所述的灰叶斑菌是从番茄田间典型发病植株采集灰叶斑病叶经分离纯化后活的菌株。
4.权利要求1所述的鉴定方法，其中所述的番茄品种指的是 “绿顶”和“长丰5。
5.权利要求1所述通过利用离体叶片鉴定番茄灰叶斑病抗性方法在有效区分不同番茄品种对灰叶斑病抗性方面的应用。
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