CN107619853A - 一种小麦赤霉病抗性鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种小麦赤霉病抗性鉴定方法。本发明利用小麦离体穗子，在环境条件可控的情况下短时间内高通量的鉴定小麦赤霉病抗性。本发明的优点是发现了一种新的赤霉病抗性评价标准，根据接菌处是否产生黑色致密坏死斑评价小麦赤霉病抗性。利用该标准可以不受外界环境条件的限制，4‑5天时间内即可简单快速地鉴定小麦赤霉病抗性。该方法表型鉴定直观可靠，重复性好，可以短时间内完成大量批材料的抗性鉴定，对全世界小麦赤霉病抗性遗传和育种研究工作具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及赤霉病抗病性鉴定方法，尤其涉及一种小麦赤霉病抗性鉴定方法。
背景技术
小麦（Triticum aestivum L.）作为世界三大粮食作物之一，其产量仅次于玉米和水稻。然而，在小麦整个生长发育过程中，各种生物胁迫和非生物胁迫严重威胁着小麦的产量和品质。其中，非生物胁迫因素主要包括盐碱、干旱、冻害和干热风等；生物胁迫因素主要包括小麦三锈病害（包括条锈、叶锈和秆锈）、小麦赤霉病和小麦白粉病等，这三大病害是威胁小麦生长最为严重的三大真菌病害。其中，真菌病原菌不仅能够影响小麦的产量，而且在侵染小麦的过程中能够分泌许多对人类和家畜有害的毒素和代谢产物，严重影响小麦的品质。
赤霉病(FusariumHead Blight, FHB)是一种由多种镰刀菌引起的世界范围重大真菌病害，该病害主要发生在湿润和半湿润地区，主要危害作物包括小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻和黑麦等多种禾谷类作物。小麦赤霉病主要是由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的穗部重大真菌病害，每年都给世界范围内小麦生产带来较大的损失。此外，赤霉菌在侵染过程中还会产生多种真菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等，不仅影响小麦的品质及商品价值，还可使人、畜中毒，严重危害人畜健康。随着赤霉病的频繁爆发和危害面积的不断扩大，赤霉病害已引起了人们的广泛关注。
小麦赤霉病抗性可能受多基因控制，抗病机制复杂，其发病程度易受环境条件影响，遗传力低，抗性鉴定困难，抗性资源匮乏，目前尚未发现对赤霉病免疫的种质资源，这些都在一定程度上影响了小麦赤霉病抗性的遗传和育种工作。
现在小麦赤霉病鉴定方法主要是单花滴注法，其主要步骤是：在小麦扬花期对穗中部小穗的基部小花接种10μL禾谷镰刀菌悬浮液，孢子浓度为每亳升1×105个，每个材料需要做20-30个重复，接种后套透明塑料袋保湿，待赤霉病发病后（大约接种后72小时）去除塑料袋。接种后21天观察并统计发病小穗数和总小穗数，并计算出每穗感病率，通过统计学分析方法判断小麦的赤霉病抗性。该方法具有抗病鉴定周期长，鉴定时期要求特殊，鉴定结果不稳定、易受环境条件和个人主观因素的影响等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，与大田接种相比，本发明避免了气候条件的不适宜、环境中其它病虫害影响等因素，在室内进行抗病性筛选条件容易控制、标准一致、发病迅速、操作简便、结果可靠，节省大量人力物力，适合大批量的育种材料高通量的鉴定。
本发明提供一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，包括如下步骤：在小麦扬花期，选取抽穗整齐的穗子，在茎基部剪断，将离体穗子置于含有6-苄氨基腺嘌呤的无菌水中；在小麦扬花期对穗中部小穗的基部小花接种10μL禾谷镰刀菌悬浮液，孢子浓度为每亳升2×105个，每个材料需要做20-30个重复，接种后，将穗子置于25℃，高湿的环境中；接种后48-72小时后，接菌穗子出现症状，去除保鲜膜，置于室温下，每天统计过轴数和发病小穗数，连续统计3-5天；感病品种在接种5天后，接菌穗出现断轴现象，下部小穗延展严重，可以达到4-5个小穗；抗病品种在接菌5天后，会在接菌穗周围产生黑色致密坏死斑，无断轴现象和下部小穗几乎无延展，或出现断轴现象和下部小穗延展不严重，可以达到2-3个。
本发明所述方法能实现禾谷镰刀菌在穗部均匀，快速，一致的发病，并向周围组织蔓延，有效消除重复间差异。
本发明所述方法利用扬花期小麦穗子。选健壮的，抽穗整齐一致的穗子进行抗病性鉴定。相同材料可以选用多棵扬花期小麦穗子进行赤霉病鉴定，单株的抗病鉴定可以选用扬花期小麦不同分蘖穗子进行抗病性鉴定，这样不仅能保证有足够的穗子进行重复试验，而且能有效缩短抗病鉴定周期，避免长时间的栽培影响植株生长状态进而降低抗病鉴定结果的稳定性和准确性。
本发明使用禾谷镰刀菌孢子悬浮液的浓度为2×105个/mL，使用禾谷镰刀菌孢子悬浮液的体积为8-10uL，所述方法满足接种总孢子量的需求，加快穗部病症发生速度，提高鉴定效率和结果稳定性。适宜环境下，使用禾谷镰刀菌孢子接种浓度高于2×105个/mL，则病害发展过快无法鉴定品种间抗性差异。本发明所述方法在接种完成后将离题穗子转移至25℃，保鲜膜封口的塑料桶，鉴定效果最好，温度高于28℃会导致接种部位菌丝大量繁殖，影响判定结果的准确性。
优选的，所述无菌水中含有浓度为25mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。6-苄氨基腺嘌呤为保绿剂，加入后可以有效减缓穗子脱绿速度，延长穗子活性时间，提高鉴定结果的稳定性和准确性。
所述禾谷镰刀菌按照下述步骤培养：首先将禾谷镰刀菌在马铃薯葡萄糖固体培养基上进行活化培养，25℃恒温培养，待菌丝布满马铃薯葡萄糖固体培养基后，切取带菌丝的马铃薯葡萄糖固体培养基，放入40-50mL无菌绿豆汤液体培养基中，25℃、200rpm条件下振荡培养3天，过滤，用无菌去离子水清洗4-5次，用无菌去离子水配制禾谷镰刀菌孢子悬浮液。
所述马铃薯葡萄糖固体培养基按照下述步骤制备：蒸馏水加热至沸腾，加入处理好的马铃薯小块200g/L，煮沸20分钟，纱布过滤，加葡萄糖20g/L，琼脂10g/L，高温高压灭菌20分钟，冷却至60℃后倒平板，4℃冰箱保存备用。所述马铃薯葡萄糖固体培养基有利于禾谷镰刀菌菌丝的生长，缩短鉴定周期。
所述无菌绿豆汤液体培养基按照下述步骤制备：选取种皮完好的绿豆，待蒸馏水沸腾后，加入绿豆40g/L，煮沸10分钟，立即用两层纱布过滤，121℃，高温高压灭菌20分钟，冷却后4℃冰箱保存备用。所述无菌绿豆汤液体利于快速繁殖禾谷镰刀菌孢子，缩短鉴定周期。
所述小麦按照下述步骤种植，准备用于鉴定抗性：将待鉴定的小麦种子秋播在大田，每个材料种植20行，来年，挑选抽穗整齐一致的穗子进行赤霉病抗病性鉴定。
优选的，所述禾谷镰刀菌悬浮液，接种前在振荡器上涡旋禾谷镰刀菌孢子悬浮液1-2min，剧烈颠倒混匀数次。颠倒混匀禾谷镰刀菌孢子悬浮液，能显著提高同一待检测小麦材料不同重复发病情况的均一性。
优选的，所述禾谷镰刀菌菌种编号为SDAU-F.g-04-4。该菌种在本发明中能够准确鉴定不同小麦材料的赤霉病抗性，鉴定结果感抗差异显著，易于判断。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：提供一种赤霉病抗性评价标准，根据接菌处是否产生黑色致密坏死斑和发病穗的过轴率及延展程度评价小麦赤霉病抗性，利用该评价方法可以不受外界环境条件的限制，简单快速地鉴定小麦赤霉病抗性；表型直观可靠，重复性好，对全世界小麦赤霉病抗性遗传和育种研究工作具有重要意义。
与单花滴注法相比，本发明方法可以在小麦扬花期利用离体穗子进行赤霉病抗性鉴定，同时具有鉴定周期短，操作简单，重复性好和能够将数量性状转变成质量性状鉴定等优点。
附图说明
图1为实施例1本发明所述方法用于济麦22和苏麦3号的鉴定结果；
图2为实施例2本发明所述方法用于济麦22和济麦22-Fhb7抗赤霉病改良系的鉴定结果。
具体实施方式
下面用实施例进一步描述本发明，以利于对本发明及其优点、效果更好的了解，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1
苏麦3号自1974年育成以来，经国内外学者多年多点鉴定和利用，一致认为不仅对赤霉病抗性强而稳定，而且遗传传递力强，配合力好，是目前在小麦赤霉病育种及遗传研究中应用最为广泛的抗源。其所携带的Fhb1基因，属于赤霉病II型抗性主效QTL，位于小麦3BS染色体，具有很强的抗赤霉病延展能力，是现在研究最为广泛和深入的抗赤霉病基因之一。济麦22是山东省农业科学院作物研究所最新育成的超高产、多抗、优质中筋小麦新品种，属于我国现阶段主要推广品种之一，但其对赤霉病表现为感性。我们以这两个品种作为研究材料，运用该发明办法对其赤霉病抗性进行鉴定，其主要操作步骤如下：
1.赤霉菌分生孢子的培养：选用典型的强致病力禾谷镰刀菌(菌种编号：SDAU-F.g-04-4)为抗性鉴定菌种，首先将该菌株在马铃薯葡萄糖（PDA）固体培养基上进行活化培养，25℃恒温培养，待菌丝布满培养基后，利用手术刀切取适量带菌丝的上述培养基，放入40-50mL无菌绿豆汤液体培养基中，25℃、200rpm条件下振荡培养3d，然后通过显微镜检测孢子产生情况。将含有足够孢子量的菌液经灭菌纱布过滤后，利用无菌去离子水清洗孢子4-5次，然后利用无菌去离子水将其配制成孢子浓度为2×105个/mL的孢子悬浮液。
所述马铃薯葡萄糖固体培养基的制备：蒸馏水加热至沸腾，加入处理好的马铃薯小块200g/L，煮沸20分钟，纱布过滤，加葡萄糖20g/L，琼脂10g/L，高温高压灭菌20分钟，冷却至60℃后倒平板，4℃冰箱保存备用。所述无菌绿豆汤液体培养基的制备：选取种皮完好的绿豆，待蒸馏水沸腾后，加入绿豆40g/L，煮沸10分钟，立即用两层纱布过滤，121℃，高温高压灭菌20分钟，冷却后4℃冰箱保存备用。
2.鉴定材料的准备：将苏麦3号和济麦22的小麦种子秋播在大田，每个材料种植20行。来年，挑选抽穗整齐一致的穗子进行赤霉病抗病性鉴定。
3.赤霉病抗性鉴定：挑选抽穗整齐一致的扬花期穗子。将小麦穗子从茎基部剪下，去除叶片，将离体穗子置于含有6-苄氨基腺嘌呤的无菌水中。然后，采用单花滴注法在穗子中部小穗接种禾谷镰刀菌孢子10ul，保鲜膜封口。为了提高鉴定结果准确性，每份鉴定材料分别鉴定30个以上穗子，三次实验重复。接种完成后密封鉴定塑料桶并水平转移至25℃培养箱中，培养2-3天，待穗部接菌部位出现明显病症后，接开保鲜膜，连续五天统计过轴率和发病小穗数，最终，根据统计结果，评价材料的赤霉病抗性。
4.赤霉病抗性的鉴定：在接菌处理后5天左右，不同赤霉病抗性的小麦材料会出现非常明显的表型差异。如图1所示，感病品种济麦22在接种5天后，接菌穗出现断轴现象，下部小穗延展严重，可以达到4-5个小穗。抗病品种苏麦3号在接菌5天后，会在接菌穗周围产生黑色致密坏死斑，无断轴现象和下部小穗几乎无延展。
实施例2
抗赤霉病基因Fhb7来自十倍体长穗偃麦草，本实验室通过多年在温室及大田对遗传改良材料的抗赤霉病鉴定，结果表明该基因在不同遗传背景材料中均表现出对赤霉病的稳定、高效抗性，因此该基因对小麦抗赤霉病的遗传改良具有重要意义。特别是其对济麦22的抗赤霉病改良系材料，不仅保留了济麦22的优异产量性状，而且显著提高了济麦22的赤霉病抗性。我们以这两个近等基因系作为研究材料，运用该发明办法对其赤霉病抗性进行鉴定，其主要操作步骤如下：
1.赤霉菌分生孢子的培养：选用典型的强致病力禾谷镰刀菌(菌种编号：SDAU-F.g-04-4)为抗性鉴定菌种，首先将该菌株在马铃薯葡萄糖（PDA）固体培养基上进行活化培养，25℃恒温培养，待菌丝布满培养基后，利用手术刀切取适量带菌丝的上述培养基，放入40-50mL无菌绿豆汤液体培养基中，25℃、200rpm条件下振荡培养3d，然后通过显微镜检测孢子产生情况。将含有足够孢子量的菌液经灭菌纱布过滤后，利用无菌去离子水清洗孢子4-5次，然后利用无菌去离子水将其配制成孢子浓度为2×105个/mL的孢子悬浮液。所述马铃薯葡萄糖固体培养基的制备：蒸馏水加热至沸腾，加入处理好的马铃薯小块200g/L，煮沸20分钟，纱布过滤，加葡萄糖20g/L，琼脂10g/L，高温高压灭菌20分钟，冷却至60℃后倒平板，4℃冰箱保存备用。所述无菌绿豆汤液体培养基的制备：选取种皮完好的绿豆，待蒸馏水沸腾后，加入绿豆40g/L，煮沸10分钟，立即用两层纱布过滤，121℃，高温高压灭菌20分钟，冷却后4℃冰箱保存备用。
2.鉴定材料的准备：将济麦22-Fhb7抗赤霉病改良系和济麦22的小麦种子秋播在大田，每个材料种植20行。来年，挑选抽穗整齐一致的穗子进行赤霉病抗病性鉴定
3.赤霉病抗性鉴定：挑选抽穗整齐一致的扬花期穗子。将小麦穗子从茎基部剪下，去除叶片，将离体穗子置于含有6-苄氨基腺嘌呤的无菌水中。然后，采用单花滴注法在穗子中部小穗接种禾谷镰刀菌孢子10ul，保鲜膜封口。为了提高鉴定结果准确性，每份鉴定材料分别鉴定30个以上穗子，三次实验重复。接种完成后密封鉴定塑料桶并水平转移至25℃培养箱中，培养2-3天，待穗部接菌部位出现明显病症后，接开保鲜膜，连续五天统计过轴率和发病小穗数，最终，根据统计结果，评价材料的赤霉病抗性。
4.赤霉病抗性的鉴定：在接菌处理后5天左右，不同赤霉病抗性的小麦材料会出现非常明显的表型差异。如图1所示，感病品种济麦22在接种5天后，接菌穗出现断轴现象，下部小穗延展严重，可以达到4-5个小穗。抗病品种济麦22-Fhb7抗赤霉病改良系在接菌5天后，会在接菌穗周围产生黑色致密坏死斑，出现断轴现象和下部小穗延展不严重，可以达到1-2个。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (8)
1.一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，包括如下步骤：在小麦扬花期，选取抽穗整齐的穗子，在茎基部剪断，将离体穗子置于含有6-苄氨基腺嘌呤的无菌水中；在小麦扬花期对穗中部小穗的基部小花接种10μL禾谷镰刀菌悬浮液，孢子浓度为每亳升2×105个，每个材料需要做20-30个重复，接种后，将穗子置于25℃，高湿的环境中；接种后48-72小时后，接菌穗子出现症状，去除保鲜膜，置于室温下，每天统计过轴数和发病小穗数，连续统计3-5天；感病品种在接种5天后，接菌穗出现断轴现象，下部小穗延展严重，可以达到4-5个小穗；抗病品种在接菌5天后，会在接菌穗周围产生黑色致密坏死斑，无断轴现象和下部小穗几乎无延展，或出现断轴现象和下部小穗延展不严重，可以达到2-3个。
2.根据权利要求1所述一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述无菌水中含有浓度为25mg/L的6-苄氨基腺嘌呤。
3.根据权利要求1所述一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述禾谷镰刀菌按照下述步骤培养：首先将禾谷镰刀菌在马铃薯葡萄糖固体培养基上进行活化培养，25℃恒温培养，待菌丝布满马铃薯葡萄糖固体培养基后，切取带菌丝的马铃薯葡萄糖固体培养基，放入40-50mL无菌绿豆汤液体培养基中，25℃、200rpm条件下振荡培养3天，过滤，用无菌去离子水清洗4-5次，用无菌去离子水配制禾谷镰刀菌孢子悬浮液。
4.根据权利要求3所述一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述马铃薯葡萄糖固体培养基按照下述步骤制备：蒸馏水加热至沸腾，加入处理好的马铃薯小块200g/L，煮沸20分钟，纱布过滤，加葡萄糖20g/L，琼脂10g/L，高温高压灭菌20分钟，冷却至60℃后倒平板，4℃冰箱保存备用。
5.根据权利要求3所述一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述无菌绿豆汤液体培养基按照下述步骤制备：选取种皮完好的绿豆，待蒸馏水沸腾后，加入绿豆40g/L，煮沸10分钟，立即用两层纱布过滤，121℃，高温高压灭菌20分钟，冷却后4℃冰箱保存备用。
6.根据权利要求1所述一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述小麦按照下述步骤种植，准备用于鉴定抗性：将待鉴定的小麦种子秋播在大田，每个材料种植20行，来年，挑选抽穗整齐一致的穗子进行赤霉病抗病性鉴定。
7.根据权利要求1所述一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述禾谷镰刀菌悬浮液，接种前在振荡器上涡旋禾谷镰刀菌孢子悬浮液1-2min，剧烈颠倒混匀数次。
8.根据权利要求1所述一种小麦赤霉病抗性鉴定方法，其特征在于：所述禾谷镰刀菌菌种编号为SDAU-F.g-04-4。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180123 |