CN109305996A

CN109305996A - 禾谷镰刀菌分泌型蛋白激发子FgHrip1及其应用

Info

Publication number: CN109305996A
Application number: CN201811306382.5A
Authority: CN
Inventors: 曾洪梅; 庄慧千; 邱德文; 杨秀芬; 郭立华; 李广悦; 袁京京; 王双超
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-05
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2038-11-05
Also published as: CN109305996B

Abstract

本发明公开了一种禾谷镰刀菌分泌型蛋白激发子FgHrip1及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，可以诱导小麦、烟草等同类植物产生抗性反应，提高抗性能力；减少烟草灰霉病和烟草花叶病毒对烟草的危害，减轻赤霉病对小麦的危害。该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗性，浓度低，起效快，作用时间长。FgHrip1为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

Description

禾谷镰刀菌分泌型蛋白激发子FgHrip1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)分泌型蛋白激发子。

背景技术

镰刀菌引起的麦类赤霉病(Fusarium head blight,FHB)在世界范围内危害严重，在亚洲、欧洲和北美洲暴发流行。麦类赤霉病是小麦和大麦的主要病害，在麦类收获的前几周时间内，赤霉病毒发展迅速，阻碍籽粒的正常生长并促成籽粒萎缩，严重影响产量。另外，镰刀菌产生的毒素能够污染谷物，威胁人畜安全。引起麦类赤霉病的病原物有19种，在我国引起小麦赤霉病的主要致病菌是禾谷镰刀菌。

目前对赤霉病的防治主要采取化学防治。但是化学防治往往存在着无法摒除的弊端，并不符合当今世界的发展潮流和趋势，大规模的化学农药的使用不仅造成了环境的污染，也会使病原菌产生抗病性。随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，愈发受到关注。因此，寻找新的蛋白激发子，对于丰富小麦赤霉病的防治手段，减少化学农药的使用具有重要的意义。

激发子是一种重要的效应分子，它通过识别并作用植物细胞表面的受体分子来传递病原菌侵染的信号，激发植物的防卫系统，诱导植物的防御反应，使植物最终产生系统获得性抗性。所有已公开发表的文献表明，植物病原菌确实可以产生能够引起植物的防御反应，提高植物抗性的激发子，其性质和种类各不相同。到目前为止，并没有来源于禾谷镰刀菌的蛋白激发子的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够提高植物抗性及防御性的禾谷镰刀菌分泌蛋白激发子及其基因序列和明确该蛋白及其基因的在小麦蛋白质互作中的用途。。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)分泌型蛋白激发子FgHrip1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的蛋白激发子FgHrip1在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。

本发明所述的蛋白激发子FgHrip1在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，所述植物为禾谷镰刀菌侵染的作物，优选为小麦和玉米。

本发明所述的蛋白激发子FgHrip1在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，当用于诱导减少烟草灰霉病和烟草花叶病毒的危害时，所述FgHrip1的诱导浓度为100μM；当用于小麦对于禾谷镰刀菌的抗性时，所述FgHrip1的诱导浓度为10μM。

一种fghrip1基因，其核苷酸序列为下列所述之一：

(1)编码如SEQ ID NO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；

(2)与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。

本发明所述的fghrip基因，其多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种原核表达载体，含有上述的fghrip基因。

本发明所述的原核表达载体，所述载体为在pET‐32‐M3C中插入fghrip1基因的原核表达载体。

一种遗传工程的宿主细胞，含有上述的原核表达载体。

本发明所述遗传工程的宿主细胞，所述宿主细胞为含有上述原核表达载体的大肠杆菌。

FgHrip1基因可用于转化表达，表达载体优选，表达载体可用大肠杆菌Transetta(DE3)表达。得到分子量约28-kDa的融合表达蛋白(His-FgHrip1)，可以诱导小麦、烟草等同类植物产生抗性反应，提高抗性能力；减少烟草灰霉病和烟草花叶病毒对烟草的危害，减轻赤霉病对小麦的危害。

本发明所述的蛋白激发子可以通过基因工程手段表达获得原核表达蛋白。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗性，浓度低，起效快，作用时间长。FgHrip1为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

微生物保藏信息

编号CGMCC No.16484，命名Fusarium graminearum，菌株HN10-11F，2018年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)分泌型蛋白激发子FgHrip1作进一步说明。

附图说明

图1为蛋白质激发子FgHrip1提高烟草对灰霉病的抗性。

图2为蛋白质激发子FgHrip1提高烟草对烟草花叶病毒的抗性。

具体实施方式

实施例1禾谷镰刀菌的培养及发酵液制备

将禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)菌株HN-10接种于马铃薯土豆培养基平板，28℃培养1周，挑去菌落边缘处接种于1L盛有YPD液体培养基的2L三角瓶中，26℃、200r/min培养7天，得到禾谷镰刀菌的发酵液。

马铃薯土豆培养基的制备方法为：取马铃薯200克，加水800毫升煮沸15分钟，滤去土豆残渣，加葡萄糖20克，补足水至1000毫升，加琼脂15克，溶化后分装，121℃灭菌30分钟。

YPD液体培养基的制备方法为：10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖(北京化工厂，分析纯)，加去离子水至1L，115℃灭菌20分钟。

实施例2粗蛋白质激发子的制备和生物活性监测

取实施例1中所得的发酵液，在4℃、10000rpm条件下离心45min，收集上清液，用0.45mm的滤膜(Whatman产)抽滤两次，直至没有菌体，得到发酵上清液。加入硫酸铵粉末,使发酵上清液中硫酸铵终浓度为80％来沉淀目标蛋白质，4℃透析48h并冻干，得到除盐后的胞外蛋白质，即粗蛋白。

生物活性的监测：以生长2个月，具有5-7片真叶的烟草为材料，分别以0.05M、pH8.0的Tris-HCl缓冲液和10μM牛血清蛋白溶液为对照，粗蛋白溶液浓度为10μM，利用1mL不带针头的注射器，将100μLTris-HCl缓冲液、50μL BSA溶液、50μL粗蛋白溶液从叶子背面分别注射进叶片中去。经过24h观察是否有坏死斑形成。

结果：注射粗蛋白溶液的叶片，注射部位6h后出现水渍斑，12h后注射处叶片变得透明较薄一些，24h后可以呈现典型的过敏反应，有坏死斑形成。对照并无任何反应，和正常叶片一样。

实施例3蛋白质激发子FgHrip1的分离纯化及序列确定

使用 explore 10(GE Healthcare)蛋白质纯化仪对所得的粗蛋白进行进一步纯化，样品首先通过HP Q HiTrapTM阴离子交换柱(GE Healthcare)，用NaCl进行线性洗脱(0％-100％，30min)，获得到蛋白质洗脱峰，将各蛋白质洗脱峰组分进行生物活性的检测，将可以强烈的引起烟草的过敏反应的蛋白质组分再通过高效液相色谱仪进行进一步的纯化，收集得到多个组分，利用冷冻干燥的方法除去乙腈后，分别按照实施例2的方法检测活性，观察是否产生坏死斑。对产生坏死斑的组分进行质谱分析和序列比对，得到蛋白激发子序列，其在NCBI上的登录号为XP_011328141.1的推测蛋白。该蛋白质共有170个氨基酸，理论分子量18.764KDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将其命名为FgHrip1(Fusariumgraminearum Hypersensitive response-inducing protein 1)。

结果：分离纯化的FgHrip1可以使烟草形成过敏反应的坏死斑。

实施例4FgHrip1基因表达

(1)FgHrip1表达载体的构建

根据蛋白质激发子FgHrip1的序列设计其编码基因的特异性引物，引入保护碱基和酶切位点，正向引物：5’-GGATCCGCCTCTGTTGACATGTGG-3’,(下划线为BamH1的酶切序列),反向引物：5’-AAGCTTTCACTTCGGATCTCGAAC-3’,(下划线为HindIII的酶切序列)，如SEQ IDNO:3-4所示。扩增全长fghrip1基因(94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，35cycles；72℃10min；4℃∝)，如SEQ ID NO:1所示。先将FgHrip1基因目的片段克隆到pMD18-T simple克隆载体，测序确认正确后，经BamH1和HindIII酶切，将fghrip1片段克隆到pET-32-M3C表达载体(Novagen)的BamH1/和HindIII位点，热激转化到大肠杆菌Trans 1-T1(Transgene),挑取阳性克隆，摇菌并提取质粒，酶切并测序验证。

(2)FgHrip1的原核表达

将步骤(1)中所获得表达载体用热激发转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中。质粒提取及转化表达宿主菌株的方法同(1)，验证正确后，进行表达。将验证正确的表达菌株过夜活化，同时取含有pET-32-M3C空质粒的菌株作为对照。分别取1mL过夜培养液加入到含有100μg/mL氨苄的100mL LB液体培养基中(1％接种量)，37℃，200r/min振荡培养2～3h培养至OD600为0.6～0.8。加入诱导剂IPTG(终浓度为1mmol/L)，16℃，220r/min继续振荡培养16h，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集菌体加入缓冲液。经超声破碎菌体后，4℃高速离心，收集上清，得到表达蛋白液。取20μL上清液，加入5μL 5×SDS上样缓冲液(变性)重悬菌体，沸水浴中加热10min，13000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。

结果：经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约28-kDa的包含组氨酸的表达蛋白(His-FgHrip1)。

(3)表达蛋白的纯化

利用 explorer10蛋白纯化仪进行蛋白的纯化。选用HisTrap HP pre-packed柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和柱；取步骤(2)离心后的表达蛋白液5mL进样，流速为1mL/min，淋洗至基线平稳后，用洗脱缓冲液进行洗脱；收集洗脱峰，利用超滤管将洗脱峰组分除盐，后进行SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。

生物活性测定：采用实施例2中方法测定原核表达蛋白质对烟草的活性。

结果：获得纯化的约28-KDa的表达蛋白(His-FgHrip1)。

实施例5表达蛋白FgHrip1能引起烟草抗性反应

(1)胼胝质的沉积、酚类物质和木质素的积累

烟草叶片处理方法如实施例2生物活性监测中的的方法，经50μM的FgHrip1处理24h后的叶片，将叶片放入缓冲液(1％戊二醛，5mM柠檬酸，90mM磷酸氢二钠(北京化工，分析纯)pH 7.4)过夜。然后放入无水乙醇中水浴加热10min，再放入50％乙醇中，接着转入缓冲液(67mM磷酸氢二钾(北京化工，分析纯)，pH 12)。在染色液(0.1％苯胺蓝(Sigma)，67mM磷酸氢二钾(北京化工，分析纯)，pH 12)染色1h，放入70％甘油固定观察。在电子显微镜下发现经过FgHrip1处理后的烟草叶片有大量的胼胝质产生。

(2)表达蛋白FgHrip1提高抗性相关基因的表达

采用荧光定量PCR方法，对烟草抗性相关基因转录水平进行分析。取所需的样品液氮研磨成粉，采用TransGen公司的RNA提取试剂盒，加入相应量的BB6，12000g离心3分钟，吸取沉淀后加入无水乙醇，混匀后加入离心柱中，12000g离心30s，用CB6和WB除去杂质12000g离心30s后加入DEPC水室温静置2分钟后离心得到RNA，所得到的RNA在-80℃保存。

第一链cDNA的合成，采用TransGen公司的TransScript Two-Step RT-PCR Kit。取500ng总RNA,按照试剂盒说明书，用TransScript RT/RI Enzyme Mix,以Anchored Oligo(dT)18为引物,42℃孵育30min，85℃加热5min使酶失活。取1uL反转录产物做PCR,β-actin为内标基因，以抗性相关基因特异引物做PCR(PR1-a基因F:5′-GATGCCCATAACACAGCTCG-3′，R:5′-CGAGGTTACAATCTGCAGCC-3′；PR1-b基因F：5′-GACAAGTTGGTGTTGGTCCC-3′，R：GGCTAGGTTTTCGCCGTAAG-3′；PR5基因F：5′-AGTGGCCGAGGTAATTGTGA-3′，R：5′-CATTGGTCGGGCTGAATTCC-3′；分别如SEQ ID NO:5-10所示)观察抗性相关基因的表达情况。

结果：经过荧光定量PCR结果可见FgHrip1在处理烟草叶片后24小时，可以提高抗性相关基因的表达。

实施例6表达蛋白FgHrip1诱导植物提高抗病性

(1)提高烟草对灰葡萄孢菌的抗性

用纯化后的FgHrip1溶液(100μM)从叶子背面注入不同的烟草叶片中。以相同浓度的BSA(缓冲液为50mM Tris-HCl，pH 8.0)作为对照，每处理10株，重复3次。诱导3d后，取然后用消毒的剪刀剪下处理后烟草系统叶片(下部叶片注射FgHrip1蛋白，上部叶片为系统叶)，置于含有1.5％琼脂的培养基的培养皿中，叶柄插入培养基，打孔器取灰霉菌菌块接种于每一片烟草叶片中央，将培养基放置在高湿培养箱中，96h后测量病斑直径。

结果：结果如图1所示，蛋白FgHrip1可提高烟草对灰霉菌的抗性，病斑面积减少约30％。

(2)提高烟草对烟草花叶病毒的抗性

烟草花叶病毒经过处理和改造后带GFP标签，将带有标签的烟草花叶病毒的叶片研磨后用水稀释后利用摩擦接种的方法接种在烟草叶片上。一周之后，在紫外光下观察病毒的侵染情况。结果如图2所示，发现经过FgHrip1处理的烟草植株中的绿色荧光即病毒的数目明显少于未经过处理的烟草植物，说明了FgHrip1提高了烟草植株对于烟草花叶病毒的抗性。

(3)提高小麦对禾谷镰刀菌的抗性

将10mL、纯化后的FgHrip1(10μM)溶液均匀喷洒在15株小麦片上，三天后接种禾谷镰刀菌，以喷洒Tris-HCl缓冲液并在三天后接种禾谷镰刀菌的15株小麦叶片作对照。禾谷镰刀菌的接种方法为：取预先制备好的禾谷镰刀菌孢子加缓冲液，该缓冲液中含1％Tween20，使禾谷镰刀菌孢子浓度为3×10⁵个孢子/ml，均匀喷洒在小麦植株上。14天后统计植株发病数。

接种禾谷镰刀菌14天后，观察发病小穗数的情况

预先喷施过蛋白激发子的小麦接种禾谷镰刀菌后的发病粒数为5.1个。

未喷施过蛋白激发子的小麦接种禾谷镰刀菌后的发病粒数为9.5个。

说明该蛋白激发子显著提高了小麦对禾谷镰刀菌的抗性，使禾谷镰刀菌的侵染率降低46％。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 禾谷镰刀菌分泌型蛋白激发子FgHrip1及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 510

<212> DNA

<213> 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)

<400> 1

atgaagtctt ccctggctct tgctgttcta tcattctttg cctctcaggg cctttctgcc 60

tctgttgaca tgtggtcctc tcctctgtca gaaagaggcg cacccaacta caagcccatt 120

gaacccaaac tcatcaagtc tcgtctcggc actacaccac aagagaacag cgatggagat 180

cgaaaacccg gatctgttta cttctgccgt ggtgagaatt ggggacctcc atgtttcgag 240

taccagccag agctcgagta cacttgcact gaactgaacg gcaagctcca gaaccatgtt 300

ggctcagtct tttctgagcc tgagattatc tgccgtcttg ctacattcga gaaccgatgt 360

gttcccctca acatctttgg atggccagaa attgaaaagg gctcagctca tcttctccac 420

cagaaatctc caacaggacc cgatagcctt ggacattcgg tgactcattt cacctgtgcc 480

aaatgcacta actgtgttcg agatccgaag 510

<210> 2

<211> 170

<212> PRT

<213> 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)

<400> 2

Met Lys Ser Ser Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Phe Phe Ala Ser Gln

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Ser Val Asp Met Trp Ser Ser Pro Leu Ser Glu Arg

20 25 30

Gly Ala Pro Asn Tyr Lys Pro Ile Glu Pro Lys Leu Ile Lys Ser Arg

35 40 45

Leu Gly Thr Thr Pro Gln Glu Asn Ser Asp Gly Asp Arg Lys Pro Gly

50 55 60

Ser Val Tyr Phe Cys Arg Gly Glu Asn Trp Gly Pro Pro Cys Phe Glu

65 70 75 80

Tyr Gln Pro Glu Leu Glu Tyr Thr Cys Thr Glu Leu Asn Gly Lys Leu

85 90 95

Gln Asn His Val Gly Ser Val Phe Ser Glu Pro Glu Ile Ile Cys Arg

100 105 110

Leu Ala Thr Phe Glu Asn Arg Cys Val Pro Leu Asn Ile Phe Gly Trp

115 120 125

Pro Glu Ile Glu Lys Gly Ser Ala His Leu Leu His Gln Lys Ser Pro

130 135 140

Thr Gly Pro Asp Ser Leu Gly His Ser Val Thr His Phe Thr Cys Ala

145 150 155 160

Lys Cys Thr Asn Cys Val Arg Asp Pro Lys

165 170

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccgcct ctgttgacat gtgg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagctttcac ttcggatctc gaac 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgcccata acacagctcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgaggttaca atctgcagcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacaagttgg tgttggtccc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggctaggttt tcgccgtaag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtggccgag gtaattgtga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cattggtcgg gctgaattcc 20

Claims

1.一种禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)分泌型蛋白激发子FgHrip1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的蛋白激发子FgHrip1在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。

3.根据权利要求2所述的蛋白激发子FgHrip1在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，其特征在于：所述植物为禾谷镰刀菌侵染的作物，优选为小麦和玉米。

4.根据权利要求3所述的蛋白激发子FgHrip1在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，其特征在于：当用于诱导减少烟草灰霉病和烟草花叶病毒的危害时，所述FgHrip1的诱导浓度为100μM；当用于小麦对于禾谷镰刀菌的抗性时，所述FgHrip1的诱导浓度为10μM。

5.一种fghrip1基因，其特征在于：其核苷酸序列为下列所述之一：

(1)编码如SEQ ID NO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；

6.根据权利要求5所述的fghrip基因，其特征在于：其多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.一种原核表达载体，其特征在于：含有权利要求5或6所述的fghrip基因。

8.根据权利要求7所述的原核表达载体，其特征在于：所述载体为在pET-32-M3C中插入fghrip1基因的原核表达载体。

9.一种遗传工程的宿主细胞，其特征在于：含有权利要求7或8所述的原核表达载体。

10.根据权利要求9所述遗传工程的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为含有权利要求7所述原核表达载体的大肠杆菌。