CN106222178A

CN106222178A - 一种重组干扰素λ4编码cDNA序列及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106222178A
Application number: CN201610644512.0A
Authority: CN
Inventors: 侯炜; 李宁; 陈清宙; 罗凡; 熊海蓉; 冯勇; 王辉; 谢林林
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2016-08-08
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2016-12-14

Abstract

本发明涉及一种可在原核表达系统高效表达的重组人干扰素λ4编码cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明还提供了该cDNA序列在制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物中的应用；本发明提供了一种制备重组人干扰素λ4的方法和应用，用所述含人干扰素λ4编码cDNA的原核表达载体转化大肠杆菌和诱导表达，获得较多可溶性干扰素λ4的最佳诱导温度为18℃，摇菌速度为120 rpm，诱导时间为4h，IPTG浓度为0.1 mM。通过本方法制备的产品为研究人干扰素λ4生物活性及其作用机理提供了基础，也可在治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物中应用。

Description

一种重组干扰素λ4编码cDNA序列及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种可在原核表达系统中高效表达的重组干扰素λ4编码cDNA序列及其在制备抗汉滩病毒（HTNV）药物中应用。

背景技术

干扰素（Interferon，IFN）通过结合靶细胞上的同源受体复合物而发挥抗病毒活性。研究发现一种细胞因子与III型干扰素（IFN-λ）的序列相似，并通过激活JAK-STAT途径诱导干扰素刺激基因（IFN-stimulated gene，ISG）的表达从而引起抗病毒反应，相关组织将其命名为IFN-λ4（基因IFN-λ4）。

干扰素λ4（IFN-λ4）是最近发现的III型干扰素新成员，其核苷酸序列类似于IFN-λ3，但两者只有约30％氨基酸序列是一致的。目前国际上干扰素λ4尚未商品化，在国外关于IFN-λ4研究中，均是通过体外合成IFN-λ4，然后对其作用进行探索，当前已发现IFN-λ4可通过IFN-λ受体复合物传递信号，并通过JAK-STAT途径诱导ISG的表达，发挥抗病毒作用。

汉滩病毒属布尼亚病毒科，是单股负链RNA病毒，基因组分为大（L）、中（M）、小（S）三个基因片段，其引起的肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是一种经啮齿类动物传播的急性自然疫源性疾病，人可通过气溶胶吸入、伤口、消化道等途径感染，该病死亡率高，危害性大，曾被世界卫生组织（WHO）列为潜在生物武器。中国的发病人数占世界总发病人数的90.94%，是HFRS的重疫区。已报道，在HFRS早期使用利巴韦林，可减轻病毒血症，降低死亡率，因此利巴韦林是目前公认的治疗HFRS有效的药物，但在临床应用中，发现其存在引起溶血，降低血红蛋白，患者不能耐受治疗等副作用，因此研发新的抗汉滩病毒药物具有重要现实意义。

IFN-λ4只存在于携带IFNL4-ΔG等位基因（rs368234815）的个体。IFN-λ4蛋白是一个弱分泌肽，IFN-λ4主要存在细胞内，携带IFNL4-ΔG等位基因的个体低表达IFN-λ4,难以大量获得，严重的阻碍了对IFN-λ4的开发应用。因此体外纯化制备IFN-λ4蛋白，有助于对其生物学活性和功能的研究。

发明内容

为了解决现有技术的不足，我们对编码IFN-λ4的密码子进行优化，使密码子最佳化，以增加蛋白的表达。

本发明的一个目的在于提供一种原核生物特别是大肠杆菌中高效表达的重组人干扰素λ4编码cDNA序列，如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一个目的在于提供包含本发明人干扰素λ4编码cDNA序列的质粒表达载体和宿主。

根据本发明的一个方面，新的可表达重组人干扰素λ4多肽的编码cDNA序列构建是根据IFN-λ4（NM_001276254）基因的基因组信息，进行编码区（CDS区，大小为540 bp）的密码子优化，并在其氨基末端加入一个6*His标签和一个TEV切割位点，如图1所示，最后在其两端分别加入酶切位点EcoRI 和 XhoI，合成相应的序列。

根据本发明的另一个方面，将以上合成的序列克隆到原核表达载体 pET30a 中，得到表达质粒pIFNL4。将质粒pIFNL4转化至感受态菌BL21（DE3），37℃摇菌至OD值为0.6~0.8，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂IPTG，18℃下，摇菌速度降为120 rpm，诱导时间为4h，然后收集细菌，经RIPA裂解液重悬细菌，再用超声破碎仪裂解细菌，在4℃低温下12000 g离心15 min，取上清，经过镍柱纯化得到较多量可溶性的目的蛋白。

本发明进一步将纯化获得的IFN-λ4用于抗汉坦病毒的感染。

通过以下方案确定其作用：

1、IFN-λ4对HTNV感染靶细胞（A549细胞）的毒性：A549细胞加入不同浓度（1 ng/mL、10ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL）的IFN-λ4，培养72 h，通过MTT法检测IFN-λ4的细胞毒性作用，选择无毒或弱毒浓度的IFN-λ4进行随后的抗HTNV作用研究。

2、IFN-λ4（100 ng/mL）预处理A549细胞24h，HTNV 76-118株感染2h后用PBS洗三次，再加入含2%胎牛血清的DMEM（V/V）培养基，37℃ 5%CO₂培养；分别于感染第1天、第4天、第7天和第10天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，来判断IFN-λ4抗HTNV作用的时间效应。

3、不同浓度IFN-λ4（浓度分别为1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL）预处理A549细胞24 h，HTNV 76-118株感染2 h后用PBS洗三次，再加入含2%胎牛血清的DMEM（V/V）培养基，37℃ 5%CO₂培养；于感染第7天收集相应细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，来判断IFN-λ4抗HTNV作用的剂量效应。

4、IFN-λ4处理A549后诱导产生的抗病毒因子：IFN-λ4（100 ng/mL）处理A549细胞24 h，应用实时定量RT-PCR检测抗病毒因子OAS、ISG-56、MxA和MxB的表达，用于判断IFN-λ4预处理A549细胞以后可能发挥作用的细胞因子。

以上结果证明本发明获得的人干扰素λ4可以用于制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物。

由于目前人干扰素λ4难于获得，这成为了对其深入研究和实际应用的障碍。为了大量且低成本的获得人干扰素λ4，促进其基础研究和在医药上的应用、并实现其产业化，本发明参考大肠杆菌密码子的偏好性，设计并人工合成了人干扰素λ4全长编码cDNA序列SEQID NO:1，结果发现密码子替换后能在大肠杆菌中高效表达人干扰素λ4，为研究原核系统表达的人干扰素λ4的相关性质和进一步开发应用奠定了基础。本发明制备重组人干扰素λ4的方法中，为使得可溶性蛋白表达增多，优化了诱导温度、时间和IPTG浓度。纯化后得到的重组人干扰素λ4具有抗汉坦病毒的作用，因此，为制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物提供新的策略。

附图说明

图1是优化后的IFNL4的基因序列及其编码的氨基酸序列。

图2是应用Western blot确定原核表达的IFN-λ4蛋白大小。

图3是通过优化条件经镍柱纯化后得到IFN-λ4蛋白。

图4是MTT法检测IFN-λ4的细胞毒性。

图5是RT-PCR检测HTNV感染IFN-λ4预处理的A549细胞后不同时间点的HTNV S基因的表达

*表示P＜0.05。

图6是RT-PCR检测HTNV感染不同浓度IFN-λ4预处理的A549细胞后的HTNV S基因的表达

*表示P＜0.05。

图7是RT-PCR检测IFN-λ4预处理的A549细胞后的抗病毒因子OAS、ISG-56、MxA和MxB的表达结果图

**表示P＜0.01。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】IFN-λ4表达质粒pIFNL4的构建

根据IFN-λ4（NM_001276254）基因的基因组信息，进行编码区（CDS区，大小为540 bp）的密码子优化，并在其氨基末端加入一个6*His标签和一个TEV切割位点，如图1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。最后在其两端分别加入酶切位点EcoRI 和 XhoI，合成相应的序列，然后克隆到原核表达载体 pET30a 中，得到表达质粒pIFNL4。所得质粒pIFNL4经上海生工生物工程股份有限公司测序证明其序列正确，且编码的氨基酸序列与原序列一致。

【实施例2】将质粒pIFNL4转化至感受态菌BL21（DE3）

事先将恒温水浴锅调至42℃，制冰机制取碎冰些许。

从-80℃冰箱中取一管（100 μl）感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上冰浴5~10 min。

加入质粒DNA溶液（一般50~100 ng），体积不超过10 μl，轻轻摇匀，冰上放置30min。

42℃水浴中放置90 s热休克（勿摇动），然后迅速置于冰上静置2 min。

向管中加入37℃预热的LB液体培养基500 μl（不含卡那霉素），轻轻混匀后37℃振荡培养1 h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Kana）

将上述菌液摇匀后取100 μl涂布于含卡那霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养过夜。

【实施例3】 SDS-PAGE胶分析IFN-λ4蛋白的表达

挑取单菌落接种到5 ml的LB培养基（不含抗生素）上，37℃温度下200 rpm摇过夜，然后按1%的体积比（V/V）接种到含30 μg/ml卡那霉素的LB培养基上，37℃温度下200 rpm摇菌至其OD值在0.6~0.8之间，加入终浓度为1 mM诱导剂IPTG，37℃诱导12 h，然后离心收集细菌，经RIPA裂解液重悬细菌，再用超声破碎仪裂解细菌，在4℃低温下12000 g离心15 min，留取上清，取等量的上清，在两块12%的SDS-PAGE上电泳，其中一块用考马斯亮蓝染色，另一块用于转膜并完成Western blot实验。由于缺乏IFN-λ4抗体，特设计在5‘氨基末端添加His标签，因此用His标签的抗体可检测出相应蛋白，由此可以确定IFN-λ4蛋白在PAGE胶上的位置。结果显示，IFN-λ4的条带位于15kDa~25kDa之间，靠近25kDa位置，与文献报道IFN-λ4大小一致（图2）。

【实施例4】 IFN-λ4蛋白的纯化

挑取单菌落接种到5 ml的LB培养基（不含抗生素）上，37℃温度下200 rpm摇过夜，然后按1%的体积比（V/V）接种到含30 μg/ml卡那霉素的LB培养基上，37℃温度下200 rpm摇菌至其OD值在0.4~0.6之间，加入终浓度为0.1 mM诱导剂IPTG，摇菌速度调为120 rpm，18℃诱导4 h，然后离心收集细菌，按每克湿菌加入10 ml平衡缓冲液（配方：300 mM NaCl，50 mMNaH₂PO₄，10 mM Tris base，10 mM 咪唑，pH=8.0)重悬细菌，然后用低温高压破碎仪破碎细菌，离心留取上清，用0.45 μm 的滤器过滤上清，然后上样至镍柱，用冲洗缓冲液( 300 mMNaCl，50 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris base，20 mM 咪唑, pH=8.0)洗脱杂蛋白, 用洗脱缓冲液( 300 mM NaCl，50 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris base，150 mM L 咪唑, pH=8.0)洗脱目的蛋白。纯化得到的目的蛋白洗脱液直接进行SDS-PAGE分析和 Western blot鉴定。结果显示，通过优化蛋白诱导条件经镍柱纯化得到了大量的目的蛋白（图3）。说明经过镍柱纯化成功获得了目的蛋白：IFN-λ4，每升菌体大约获得0.1mg目的蛋白。

【实施例5】MTT法检测IFN-λ4的细胞毒性作用

DMEM（含10%胎牛血清，V/V）培养的A549细胞用胰酶消化后稀释成1～3×10⁵个/mL，每孔100 μL接种于96孔板。细胞长成单层后，加入用DMEM（含2%胎牛血清，V/V）稀释的不同浓度（1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL）的IFN-λ4，培养72 h，通过MTT法检测IFN-λ4的细胞毒性作用，结果显示，IFN-λ4浓度从1 ng/mL到1000 ng/mL对A549细胞毒性均小于10%，统计分析无显著差异，因此可认为IFN-λ4对A549细胞无毒性（图4）。

【实施例6】 IFN-λ4体外抗HTNV感染具有时间效应和剂量效应

（1）IFN-λ4体外抗HTNV感染具有时间效应

DMEM（含10%胎牛血清，V/V）培养的A549细胞用胰酶消化后稀释成1～3×10⁵个/mL，每孔400 μL接种于24孔板。细胞长成单层后，加入用DMEM（含2%胎牛血清，V/V）稀释的IFN-λ4（100 ng/mL）预处理A549细胞24 h，HTNV 76-118株感染2 h（MOI=5），后用PBS洗三次，再加入DMEM（含2%胎牛血清，V/V）培养基，37℃ 5%CO₂（V/V）培养；分别于感染第1天、第4天、第7天和第10天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达，GAPDH为内参。引物如下：

HTNV S基因上游引物：5’-GCATCATCGTCTATCTTACATC-3’，

HTNV S基因下游引物：5’-ATTGTT CGATACGATCACTCC-3’；

GAPDH上游引物：5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，

GAPDH下游引物：5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’。

具体过程为：取1 μL样品总RNA用RT system（Promega）进行逆转录，实验采用随机引物 37℃反应1 h，然后94℃ 5 min终止反应，产物4℃保存。逆转录产物cDNA作为实时定量RT-PCR的反应模板，取1.5 μL RNA逆转录产物cDNA、0.3 μL上下游引物（20 pmol）、7.5 μL SYBR green混合液，补水至总体积15 μL，在实时定量PCR仪（BioRad）上进行检测。反应程序为：95℃预变性3 min；95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s，40个循环。结果显示，感染后第7天IFN-λ4抑制HTNV感染效果仍旧明显（图5，P＜0.01）。说明IFN-λ4抑制HTNV在A549细胞中的复制和感染。

（2）IFN-λ4体外抗HTNV感染具有剂量效应

按照（1）中方法加入不同浓度的IFN-λ4（1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL）预处理A549细胞，HTNV 76-118株感染A549细胞后第7天收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测HTNV S基因的表达。结果显示，10 ng/mL即可明显抑制HTNV的复制和感染（图6，P＜0.01）。说明IFN-λ4能抑制HTNV在A549细胞中的复制和感染，呈现出剂量效应。

【实施例7】 IFN-λ4诱导产生的抗病毒因子

DMEM（含10%胎牛血清，V/V）培养的A549细胞用胰酶消化后稀释成1～3×10⁵个/mL，每孔400 μL接种于24孔板。细胞长成单层后，加入用DMEM（含2%胎牛血清，V/V）稀释的IFN-λ4（100ng/mL）预处理A549细胞，于处理后24 h收集细胞，应用实时定量RT-PCR检测抗病毒因子OAS、ISG-56、MxA和MxB的表达，GAPDH为内参，未加干扰素处理的作为对照组。引物如下：

OAS上游引物：5’-AGAAGGCAGCTCACGAAACC-3’，

OAS下游引物 5’-CCACCACCCAAGTTTCC TGTA-3’；

ISG-56上游引物：5’-GCTGAAGTGTGGAGGAAAGA-3’，

ISG-56下游引物 5’-AGCAAAGAAAATGGCTTGTG-3’；

MxA上游引物：5’-ACCTACAGCTGGCTCCT GAA-3’，

MxA下游引物：5’-GCACTCAAGTCGTCAGTCCA-3’；

MxB上游引物：5’-AGCAGTATCGAGGCAAGGAGC-3’，

MxB下游引物：5’-TGGCGAGACGTTTGCTGGTTTC-3’。

GAPDH上下游引物同实施例5。

RT-PCR具体过程同实施例5。结果显示，IFN-λ4预处理A549细胞以后，可诱导多种抗病毒因子的表达（图7）。

Claims

1.一种可在原核表达系统高效表达的重组人干扰素λ4编码cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种重组质粒载体，其特征在于，含有权利要求1所述重组人干扰素λ4编码cDNA序列。

3.根据权利要求2所述的重组质粒载体，其特征在于，所述质粒载体是在SEQ ID NO:1的氨基末端加入一个6*His标签和一个TEV切割位点获得SEQ ID NO:2，最后在其两端分别加入EcoRI 和 XhoI酶切位点，合成相应的序列，将该核苷酸序列与质粒pET30a连接构建而成。

4.含有权利要求1所述核苷酸序列的宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的原核细胞是将权利要求3所述的重组质粒载体转入大肠杆菌BL21（DE3）制备而成。

7.一种在大肠杆菌中表达人干扰素λ4基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）根据IFN-λ4（NM_001276254）基因的基因组信息，进行大小为540 bp编码区CDS区的密码子优化，获得核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的cDNA，并在其氨基末端加入一个6*His标签和一个TEV切割位点，如SEQ ID NO:2所示，最后在其两端分别加入EcoRI 和 XhoI酶切位点，合成相应的序列；

（2）将以上合成的序列克隆到原核表达载体 pET30a 中，进行测序鉴定，得到表达质粒pIFNL4；

（3）将质粒pIFNL4转化至感受态菌BL21（DE3）；

（4）确定原核表达系统中表达可溶性的人干扰素λ4的最佳诱导温度、摇菌速度、时间和IPTG浓度；

（5）人干扰素λ4基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的诱导表达。

8.根据权利要求7所示的在大肠杆菌中表达人干扰素λ4基因的方法，其特征在于，步骤（4）中所述最佳诱导温度、摇菌速度、时间和IPTG浓度为诱导温度18℃，摇菌速度为120rpm，诱导时间为4h，IPTG浓度为0.1 mM。

9.权利要求7或8所述方法获得的人干扰素λ4在制备治疗和/或预防汉滩病毒引起的肾综合征出血热的药物中的应用。