CN106084063A - 一种新型基因工程重组trail融合蛋白及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用腺病毒纤维蛋白片段作为三聚体模序与TRAIL融合表达,获得稳定性和活性提高的重组蛋白,作为抗肿瘤治疗药物。还提供融合蛋白表达纯化及活性检测的方法。具体为:第一步;设计并构建融合基因,利用大肠杆菌系统低温诱导表达;第二步:采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白,利用凝血酶酶切位点切除His标签,获得最终目的蛋白;第三步:体外检测融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤活性和对正常细胞的毒性,第四步:不同条件下检测融合蛋白的稳定性,第五步:裸鼠模型上检测融合蛋白的体内抗肿瘤活性。有益效果:发明了2个腺病毒纤维蛋白片段作为三聚体模序的TRAIL融合蛋白。提供了一种简单,快速的获得高稳定性TRAIL蛋白的方法,可应用于TRAIL蛋白的抗肿瘤研究和应用。解决了TRAIL蛋白稳定性差,活性低的弊端。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及制备方法和用途,特别涉及一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白及制备方法和用途。
背景技术
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是TNF超家族一员,具有广谱抗癌的功能,且其对与正常的组织和细胞几乎是无毒的。有活性的TRAIL是三聚体状态,由三聚体中心的锌离子与各个单体上的半胱氨酸通过螯合作用维持。但TRAIL本身半衰期短、稳定性差、生物活性不强、并且有研究表明引入标签后可溶性TRAIL三聚体结构秩序会改变从而产生肝毒性。
发明内容
本发明的目的是为了解决TRAIL本身半衰期短、稳定性差以及生物活性不强的问题而提供的一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白及制备方法和用途。
本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白包含可溶性TRAIL蛋白片段和腺病毒纤维蛋白片段,其中可溶性TRAIL蛋白片段进一步选自N端截短94个氨基酸的人TRAIL蛋白,其核酸序列如SEQ ID NO:1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白中包含的腺病毒纤维蛋白片段分别是人血清5型腺病毒和禽1型腺病毒纤维蛋白的Tail及Shaft片段,其包含人血清5型腺病毒纤维蛋白片段的核酸序列如SEQ ID NO:3所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,其包含禽1型腺病毒纤维蛋白片段的核酸序列如 SEQ ID NO:5所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示
本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白的制备方法,其方法如下所述:
步骤一、取工程菌接种于LB培养基,37℃摇菌培养至OD600达到0.2-1.2时,加入诱导剂(0.3-1.2mM IPTG)培养4-20h,诱导培养温度为20℃;
步骤二、收集菌体,裂解(用含有蛋白酶抑制剂的PBS重悬菌体沉淀,4℃超声破碎20min),收集上清,分离纯化,切除标签,分离纯化采用镍柱亲和层析,其中洗涤液是含有50mM咪唑的基础液(NaH2PO4 50mM;NaCl 500mM;pH=8.0),洗脱液是含有250mM咪唑的基础液,消化His标签是利用载体上的凝血酶位点,将纯化的蛋白与凝血酶混合1-18小时,混合比例为1mg蛋白使用1-100U凝血酶,混合条件为4℃。
本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白稳定性的检测方法:取具有相同杀伤活性融合蛋白,使用蛋白浓度为sTR:100nM,FA1FT:50nM,HA5ST:50nM,包括以下方法:
1)将蛋白样品置于缓冲体系中0h-24h,缓冲体系为4℃的PBS。
2)将蛋白样品置于缓冲体系中0h-24h,缓冲体系为37℃的PBS。
3)将蛋白样品置于血浆中0h-24h,血浆为37℃裸鼠血浆。
4)将蛋白样品反复冻融,冻融方法为循环置于37℃10min与-80℃10min。
本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白在肿瘤或癌症治疗中的应用。
本发明的有益效果:
本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白不依赖于锌原子的TRAIL三聚体,方法简单,纯度高,无肝肾毒性,具有较好的抗肿瘤或癌细胞活性。
附图说明
图1.新型基因工程重组TRAIL融合蛋白设计示意图。
图2.表达重组TRAIL融合蛋白的质粒鉴定结果。
图3.TRAIL融合蛋白诱导表达和纯化。
图4.TRAIL融合蛋白切除His标签鉴定图。
图5.切除标签后的TRAIL融合进行非还原性SDS-PAGE。
图6.不同浓度的TRAIL融合蛋白对多种肿瘤细胞的杀伤作用。
图7.不同浓度的TRAIL融合蛋白对正常细胞的杀伤作用。
图8.Annexin V/PI检测细胞凋亡。
图9.TRAIL融合蛋白的稳定性评价。
图10.腹腔注射原位注射TRAIL融合蛋白的抗肿瘤效果比较。
具体实施方式
本说明书和权利要求书所使用的缩写的含义如下所示:
本发明实施例中未说明来源的试剂和仪器均为普通市售品。
下面以具体的实施例,对本发明的技术方案做进一步的技术说明;但本发明并不限于这些实施例。
实施例1腺病毒Fiber-TRAIL融合蛋白原核表达载体的构建
1.目的基因的获得
以实验室保存的带有TRAIL基因的质粒pDC316-TRAIL(人源,aa95-281)为模板进行PCR,反应条件为:95℃预变性10min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环;72℃延伸10min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。用Vector NTI Suited 6软件根据Genebank提供的人TRAIL基因序列TRAIL引物如下:
上游引物序列:5’-GCTAGCATGACCTCTGAGGAAACCATTTCTAC-3’,含Nhe I酶切位点。
下游引物序列:5’-AAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’,含Hind IIl酶切位点。
2.表达载体的构建
以实验室存有的禽类1型腺病毒(Fowl Ad1)骨架质粒和上述获得的TRAIL基因为模板进行overlap-PCR,将Fowl Ad1基因的C端(包括tail基底蛋白和全长的shaft,不包括knob蛋白)与TRAIL的N端连接(如图1,左图),用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,为方便将基因克隆入表达载体pET-28a,引物中添加相应的酶切位点。
上游引物:5’-GCTAGCATGGCTGACCAGAAAAGGAAGCTG-3’,含Nhe I酶切位点。
下游引物:5’-AAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’,含Hind III酶切位点。
融合蛋白Fowl Ad1fiber sTR(FA1FT)的核酸编码序列如SEQ ID NO:1,氨基酸序列如SEQ ID NO:2。
以实验室存有的人类5型腺病毒(Human Ad5)骨架质粒和上述获 得的TRAIL基因为模板进行overlap-PCR,将Human Ad5的N端shaft(只包含Shaft的C端一个螺旋,不包含knob)与TRAIL的N端连接(如图1),用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。
上游引物:5’-GCTAGCATGGGTGCCATTACAGTAGGAAAC-3’,含Nhe I酶切位点。
下游引物:5’-AAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3’,含Hind IIl酶切位点。
融合蛋白Human Ad5fiber sTR(HA5ST)的核算编码序列如SEQ ID NO:3,氨基酸序列如SEQ ID NO:4。
将上述FA1FT和HA5ST的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)。PCR产物用琼脂糖胶回收试剂盒(TAKARA)回收,与平末端载体Peasy(北京全式金)连接,经测序正确后,利用Nhe I和Hind III酶切位点,将融合基因进行双酶切,用琼脂糖胶回收试剂盒回收DNA片段,再与经同样双酶切的pET28-a载体相连接,链接产物转化至DH5α感受态细胞,通过卡纳抗性筛选和质粒双酶切鉴定(图2),阳性克隆进一步通过DNA序列分析进行验证,坚定正确的质粒分别命名为pET-28a-sTR、pET-28a-FA1FT、pET-28a-HA5ST。
实施例2腺病毒Fiber-TRAIL融合蛋白原核表达载体的构建
1.原核表达
将上述3个原核表达质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(大连宝生物),涂于含有卡纳青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上,置于37℃恒温箱中过夜培养。在上述平板中挑取单菌落,接于10mLLB液体培养基中过夜培养。将得到的菌液接种于1L LB液体培养基中, 37℃振荡大量培养。菌体的OD600值达到0.8时,加入终浓度1mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,北京鼎国),20℃诱导表达16小时。诱导前和诱导后的菌体留样进行SDS-PAGE电泳,如图3。
2.蛋白纯化
将大量诱导后菌体在4℃下,以4000rpm离心30min收菌,超声破碎20min,在4℃下,以12000rpm离心30min得上清、沉淀,分别取样电泳。上清经0.22μm滤膜过滤后,进行镍离子亲和柱(美国Invitrogen)纯化。先以基础液(NaH2PO4 50mM;NaCl 500mM;pH=8.0)平衡镍离子亲和柱,再将滤后上清液挂柱。然后用基础液、含50mM咪唑的基础液、含250mM咪唑的基础液、含300mM咪唑的基础液依次进行洗脱2个柱体积。每个梯度用1.5mL Ep管接样10个EP管(每管1mL)。再用基础液和双蒸水分别洗2个柱体积,然后以20%乙醇洗一个柱体积,20%乙醇封柱,4℃保存,取0.5mg/ml的纯化后样品进行SDS-PAGE电泳,鉴定浓缩后蛋白纯度较高(图3)还原性SDS-PAGE电泳:向30μL收获的蛋白样品中加入10μL 4×上样缓冲液(0.35MTris-HCl(PH=6.8),30%甘油,10%SDS,0.012%溴酚蓝,6%β-巯基乙醇),充分混匀,100℃煮沸20min后,4℃12000×g,离心10min,取20μL离心上清加载至13.5%SDS-PAGE凝胶中,120V电泳1.5h。
表1.重组TRAIL蛋白单体分子质量的理论值与电泳结果比较
重组TRAIL蛋白 | 分子量理论值 | 电泳结果 |
FA1FT | 43.48kDa | ~44kDa |
HA5ST | 23.04kDa | ~23kDa |
切除His标签:将纯化后的蛋白浓缩除去咪唑,然后按照酶:蛋白=10U:1mg的比例加入凝血酶(经科化学),4℃搅拌12h。再利用镍 柱与His标签的亲和性除去切下来的片段。切除标签后的蛋白进行western blot,分别使用TRAIL抗体和His标签抗体鉴定,antiTRAIL的结果显示,切除标签的重组TRAIL蛋白分子量略有减小,蛋白有约20%的损失。antiHis的结果显示,凝血酶处理后的蛋白不能被染出条带,证明成功去除标签,结果如图4。为了更好的保护未经修饰重组TRAIL蛋白,即sTR的稳定性及活性,在最终得到的sTR蛋白样品中,加入ZnCl2加入比例为0.46mol锌/mol蛋白,同时为了避免蛋白发生高聚,每组蛋白样品中加入1mM DTT。
除标签后的融合蛋白进行非还原性GDS-PAGE电泳鉴定Fiber-TRAIL融合蛋白在溶液中呈三聚体状态(图5)。非还原性SDS-PAGE电泳:向30μL收获的蛋白样品中加入10μL 4×非还原性上样缓冲液(0.35M Tris-HCl(PH=6.8),30%甘油,10%SDS,0.012%溴酚蓝),充分混匀,4℃,12000×g,离心10min,取20μL离心上清加载至13.5%SDS-PAGE凝胶中,120V电泳1.5h。
实施例3Fiber-TRAIL融合蛋白对肿瘤细胞杀伤作用的检测
肿瘤细胞株:
乳腺癌细胞:ZR-75-30,MCF7;肺癌细胞:A549;肝癌细胞:SMMC-7721;结肠癌细胞:SW480;宫颈癌细胞:Hela;乳腺正常细胞:MCF-10A;肝正常细胞:Chang Liver。
1)FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤作用
实验方法:细胞培养在含10%小牛血清的,100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素的培养基中,37℃,5%CO2条件下培养。将1×104个细胞接种于96孔板中,贴壁过夜,然后将培养基换为含2%小牛血清的培 养基,加入不同浓度梯度(0.01,0.1,1,10和100nM)的实例2中获得的融合蛋白。作用过夜后,加入20μl的MTT溶液,反应4小时后,弃去上清液,加入150μl的DMSO溶解沉淀,然后用酶标仪测定490nm吸光值。以未经过蛋白处理的细胞存活率为100%来计算蛋白处理的细胞存活率。
实验结果:如图6所示,随着蛋白浓度提高,FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤能力逐渐增强,细胞存活率降低。ZR-75-30,SMMC-7721,Hela三种细胞对融合TRAIL蛋白均较敏感,当蛋白浓度为1~10nM时,细胞存活率在50%左右。MCF-7,A549,SW480,对FA1FT和HA5ST的敏感性稍弱,当蛋白浓度为10~100nM时,细胞存活率在50%左右。正常肝细胞,乳腺细胞对蛋白不敏感,即使蛋白浓度达到100nM时,细胞存活率仍然在90%以上。
这些结果表明,FA1FT和HA5ST可以选择性的杀伤肿瘤细胞,如乳腺癌,肺癌,肝癌细胞,结肠癌,宫颈癌,而对正常细胞无毒性(图7)。
2)FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤途径的检测
实验方法:取对数生长期的ZR-75-30细胞,调整细胞悬液浓度为5×105/ml,以每孔2ml铺6孔板,过夜培养。调整蛋白样品终浓度为10nM,37℃,5%CO2培养4h;胰酶消化细胞。用1ml预冷的PBS重悬细胞。用100~500μl的Annexin-V(FITC)/PI试剂盒中的1×Bidingbuffer重悬,300目纱网过滤后上机检测。
实验结果:如图8所示,10nM的FA1FT组中,有61.3%的细胞进入凋亡状态,HA5ST组中有66.8%的细胞进入凋亡状态,是sTR组(34.1%)的2倍。
综上,本发明通过对肿瘤细胞和正常细胞的存活率检测,FA1FT和 HA5ST对肿瘤细胞的杀伤活性是在凋亡水平实现的,并未导致细胞坏死。
实施例4Fiber-TRAIL融合蛋白体外稳定性检测
1)FA1FT和HA5ST在PBS中的稳定性
实验方法:取具有相同杀伤能力的各组蛋白作为起始点。即:sTR(100nM),FA1FT(50nM),HA5ST(50nM)。将各组蛋白用PBS稀释,放置于4℃或37℃环境中,在不同时间点取样进行MTT实验,检测剩余活性。
实验结果:如图9所示,37℃环境下,未经改造的sTR在2h时已经完全丧失了活性,4℃环境中逐渐丧失活性。而FA1FT和HA5ST对ZR-75-30细胞的杀伤能力在24h内一直维持稳定,几乎没有损失,与sTR相比有显著性差异(*,P<0.1;**,P<0.01;***,P<0.001)。
2)FA1FT和HA5ST在血浆中的稳定性
实验方法:将各组蛋白与裸鼠血浆混合孵育,置于37℃环境中,在不同时间点取样进行剩余活性的检测。
实验结果:如图9所示,在37℃血浆环境中,sTR在0.5h是活性降低一半,1h已经丧失全部杀伤活性。FA1FT和HA5ST的杀伤能力在6h内维持稳定,随后蛋白活性逐渐降低,但在24h时仍具有40%的杀伤力,与sTR相比有显著性差异。
3)FA1FT和HA5ST反复冻融后的稳定性
实验方法:将FA1FT和HA5ST融合蛋白分别置于-80℃和37℃反复冻融,取不同冻融次数的蛋白样品进行剩余活性的检测。
实验结果:如图9所示,sTR在一次冻融后就失去三聚体构象,不能诱导ZR-75-30细胞凋亡。虽然FA1FT和HA5ST随冻融次数的增加逐渐失去杀伤活性,与sTR比较,在稳定性上仍然有显著性差异(*,P<0.1;**, P<0.01;***,P<0.001)。
实施例5Fiber-TRAIL融合蛋白(实施例2制备)体内抗肿瘤检测
1)腹腔注射FA1FT和HA5ST的抗肿瘤效果
实验方法:收集生长状态良好的ZR-75-30细胞,离心除去培养基,无菌PBS洗涤两次,最后用适量的预冷的PBS重悬细胞,使细胞数为1×107个/ml,冰上暂存。选7周龄的BALB/c雌性裸鼠,在背部右后处皮下注入100μl的ZR-75-30细胞,1×106个/ml。约14天,肿瘤体积长到约150mm3时,腹腔给药,0.1nmol/只,连续注射8天。对照组注射相同体积的PBS,每天记录瘤体积。以治疗第1天的初始瘤体积为100%,计算每组每只鼠的相对瘤体积为纵坐标。(每组8只鼠。*,P<0.1;**,P<0.01;***,P<0.001)。
结果如图10,PBS组肿瘤迅速增长,在成瘤后第12天,相对瘤体积已经超过2000,相比于sTR,HA5ST能够有效抑制肿瘤生长,在开始治疗后第24天,sTR组相对瘤体积在1409±200,HA5ST组相对瘤体积在199%±30%,FA1FT组相对瘤体积在第13天时,相对瘤体积达到1586%±300%。
2)原位注射FA1FT和HA5ST的抗肿瘤效果
实验方法:选7周龄的BALB/c雌性裸鼠,在背部右后处皮下注入100μl的ZR-75-30细胞,1×106个/ml。约14天,肿瘤体积长到约400mm3时,原位注射蛋白,注入体积不超过50μl,0.5nmol/只,连续注射8天。对照组注射相同体积的PBS,每天记录瘤体积。以治疗第1天的初始瘤体积为100%,计算每组每只鼠的相对瘤体积为纵坐标。(每组8只鼠。*,P<0.1;**,P<0.01;***,P<0.001)。
结果如图10,PBS组在成瘤后第9天,相对瘤体积超过平均值在405%, 治疗结束时sTR组相对瘤体积平均值在200%,FA1FT组相对瘤体积平均值在134%
综上,本发明成功获得了腺病毒fiber-TRAIL融合蛋白,其三聚体构象的维持不依赖于结构中心的锌离子,与天然的可溶性TRAIL蛋白相比,其稳定性显著提升,体内外抗肿瘤活性也显著增强,并且没有对正常组织细胞造成毒性。
Claims (10)
1.一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白,其特征在于:包含可溶性TRAIL蛋白片段和腺病毒纤维蛋白片段。
2.权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其中所述可溶性TRAIL蛋白片段选自人TRAIL蛋白可溶性胞外区。
3.权利要求2的重组TRAIL融合蛋白,其中所述可溶性TRAIL蛋白片段进一步选自N端截短94个氨基酸的人TRAIL蛋白,其核酸序列如SEQ ID NO:1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其中所述腺病毒纤维蛋白片段选自人腺病毒、禽腺病毒和猴、马、牛、羊、猪、狗、鼠等哺乳类动物腺病毒。
5.权利要求4的重组TRAIL融合蛋白,其中所述腺病毒纤维蛋白片段进一步选自人血清5型腺病毒和禽1型腺病毒。
6.权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其中所述腺病毒纤维蛋白片段进一步包含Tail和Shaft结构。
7.权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其包含人血清5型腺病毒纤维蛋白片段的核酸序列如SEQ ID NO:3所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,其包含禽1型腺病毒纤维蛋白片段的核酸序列如SEQ ID NO:5所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
8.权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9的核酸序列和选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
9.一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白的制备方法,其方法如下所述:
步骤一、取工程菌接种于LB培养基,37℃摇菌培养至OD600达到0.2-1.2时,加入诱导剂(0.3-1.2mM IPTG)培养4-20h,诱导培养温度为20℃;
步骤二、收集菌体,超声裂解,收集上清,分离纯化,切除标签,分离纯 化采用镍柱亲和层析,其中洗涤液是含有50mM咪唑的基础液(NaH2PO4 50mM;NaCl 500mM;pH=8.0),洗脱液是含有250mM咪唑的基础液,消化His标签是利用载体上的凝血酶位点,将纯化的蛋白与凝血酶混合1-18小时,混合比例为1mg蛋白使用1-100U凝血酶,混合条件为4℃。
10.一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白在肿瘤或癌症治疗中的应用。
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2016
- 2016-05-26 CN CN201610356325.2A patent/CN106084063B/zh active Active
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