CN103980366B - 一种白介素融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种白介素融合蛋白及其制备方法和应用。所述白介素融合蛋白包括：(1)白介素IL‑24；(2)解离素多肽CN；以及(3)位于所述白介素IL‑24和所述解离素多肽CN之间的由0‑20个氨基酸构成的连接肽。本发明首次提供且制备出IL‑24与CN的融合蛋白，且所述白介素融合蛋白在本发明中所述宿主细胞中以可溶形式表达；所述白介素融合蛋白与单独的IL‑24和CN相比具有更高的与肿瘤细胞的相互作用力，可显著诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的迁移或侵袭，且对正常细胞无毒副作用；本发明所述的白介素融合蛋白具有比白介素IL‑24更显著更优异的抗肿瘤活性，且可用于多种肿瘤的治疗。

Description

一种白介素融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和生物化学工程领域，更具体地涉及一种白介素融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤，又称癌症，已成为人类发病率和致死率最高的一种疾病，不仅严重地危害人类的生命健康，也给病人、家庭和社会带来极大的痛苦和负担。世界卫生组织公布的数据显示，2012年全球约有1400万人确诊患上癌症，且未来20年癌症患者人数将以每年2200万的速度增长。由于人口增加和老龄化，死于癌症的人数也将由每年的820万增长至每年1300万。

肿瘤细胞不仅可通过改变细胞信号转导途径逃避人体免疫杀伤和程序性细胞过程而在体内无限增殖，还能够通过迁移和侵袭过程在组织间发生转移形成转移灶，进而破坏更多的组织器官功能使癌症患者致死。研究表明，约有90％的癌症病人死于癌转移，癌转移是造成各种肿瘤疾病致死的主要原因。

白细胞介素-24(Interleukin-24，IL-24)是一种属于IL-10家族的新型细胞因子，具有选择性抑制多种肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，包括黑色素瘤、多形性胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、鼻咽癌及前列腺癌等，但对正常细胞没有生长抑制的影响。IL-24的这一特点使其在治疗肿瘤疾病方面有较大的应用潜力，成为近年来研究的热点。

IL-24原名为黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation-association gene-7,mda-7)，是由P.B.Fisher等用差示杂交的方法从人干扰素β和瑞香素(mezerein,MEZ)诱导的人类黑色素瘤细胞cDNA文库中筛选得到的一种新型细胞因子，在正常的黑色素细胞和初期黑色素瘤细胞中均有表达，且在黑色素瘤细胞生长和转移的进展过程中表达量呈进行性降低，以致检测不到IL-24的表达，证明具有抑制黑色素瘤增生和促进终末分化的能力。研究表明，腺病毒介导的IL-24在肿瘤细胞的异常表达可诱导多种肿瘤细胞的凋亡。这种诱导凋亡作用可能是通过多种信号途径调控的。IL-24的异常表达可激活URP/内质网应激效应，激活p38MAPK信号途径，诱导GADD家族蛋白GADD153、GADD45α、GADDγ和GADD34等的表达，最终导致细胞的凋亡。Pataer et al.研究结果显示Ad.IL-24可激活肺癌细胞中PKR的活性，进而激活下游信号分子eIF2α、TYK2、STAT1/STAT3及p38MAPK等的磷酸化，发挥生长抑制和诱导凋亡的活性。文献报道，Ad.IL-24可诱导胞内ROS的累积，ROS水平的升高可负调控线粒体的功能，促进凋亡的发生。胞内神经酰胺水平的提高可促进Ca2+依赖的ROS的生成，促进自分泌信号通路，结合旁分泌信号最终导致肿瘤细胞死亡。Bhutia etal.研究发现IL-24可激活GSK3β，促进蛋白酶体对β-catenin的降解和抑制Akt的活性降低β-catenin的磷酸化，诱导乳腺癌干细胞的凋亡抑制其生长，但对正常乳腺干细胞的生长没有影响。另外，有研究证明自噬作用在肿瘤细胞的存活和死亡过程中发挥重要作用。Sauaneet al.研究揭示重组表达的IL-24同样具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

由于肿瘤细胞转移是造成癌症病人死亡的主要原因，开发一种既可抑制肿瘤细胞增殖又能抑制肿瘤细胞转移的药物显得尤为重要。有文献报道一种解离素多肽contortrostatin(CN)是唯一最具潜力用于治疗转移性癌症的蛇毒素提取物。

CN是从铜头蝮蛇毒素中提取的一种同源二聚体解离素，其分子量为13.5kDa。CN的每条链由65个氨基酸组成，在柔性环前端具有RGD序列。CN富含半胱氨酸，每个亚基含有十个半胱氨酸，形成四对链内二硫键桥和两对链间二硫键桥，通过复杂的折叠过程形成稳定的三级结构。CN可通过二聚体外侧暴露的两个RGD序列与肿瘤细胞和血管内皮细胞的高亲和力相互作用，抑制肿瘤细胞的粘附和转移与抑制肿瘤诱导的血管生成。因此，将CN应用于高效抑制肿瘤转移具有很大潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种白介素融合蛋白及其制备方法和应用，从而解决现有技术中对既可抑制肿瘤细胞增殖又能抑制肿瘤细胞转移的药物的缺乏。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种白介素融合蛋白，所述白介素融合蛋白包括：(1)白介素IL-24；以及(2)解离素多肽CN。该白介素融合蛋白可以用IL-24-CN进行表示。

优选地，所述白介素融合蛋白IL-24-CN还包括：(3)位于所述白介素IL-24和所述解离素多肽CN之间的由1-20个，较佳的为1-15个，更佳的为1-10个，最佳的为1-4个(如2-3个)氨基酸构成的连接肽。

所述白介素融合蛋白IL-24-CN基本上由(1)、(3)、(2)或(2)、(3)、(1)相连接而构成。更佳地，所述的融合蛋白由(1)、(3)、(2)相连接构成。优选地，所述融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

所述白介素IL-24是：(a)SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白或者SEQ ID NO：3所示的碱基序列编码的蛋白；(b)SEQ ID NO：2中第2-159位所示氨基酸序列的蛋白；或(c)将(a)或(b)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)所限定的蛋白功能的由(a)或(b)衍生的蛋白。

优选地，所述白介素IL-24是：将SEQ ID NO：2中第2-159位所限定的蛋白的氨基酸序列经过1-10个(较佳的1-6个，更佳的1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO：2中第2-159位所限定的蛋白功能的由其衍生的蛋白。

所述解离素多肽CN是：(i)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白或者是SEQ IDNO：5所示的碱基序列编码的蛋白；(ii)SEQ ID NO：2中第170-237位所示氨基酸序列的蛋白；或(iii)将(i)或(ii)所限定的蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(i)或(ii)所限定的蛋白功能的由(i)或(ii)衍生的蛋白。

优选地，所述解离素多肽CN是：将SEQ ID NO：2中第170-237位所示氨基酸序列经过1-10个(较佳的1-6个，更佳的1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO：2中第170-237位所限定的蛋白功能的由其衍生的蛋白。

较佳的，所述的解离素多肽CN位于融合蛋白的羧基端；所述的白介素IL-24位于融合蛋白的氨基端。

根据本发明的第二方面，还提供一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的白介素融合蛋白IL-24-CN。

根据本发明的第三方面，还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有所述核酸分子。

根据本发明的第四方面，还提供一种基因工程化的细胞，所述细胞含有所述重组表达载体，或所述细胞的基因组中整合有所述核酸分子。

根据本发明的第五方面，还提供一种白介素融合蛋白IL-24-CN的制备方法，所述制备方法包括：提供白介素IL-24的蛋白编码基因；采用PCR逐步扩增的方法将CN编码基因合成至所述白介素IL-24蛋白编码基因上获得含有编码白介素融合蛋白IL-24-CN的DNA序列；将所述DNA序列与经过同样酶切的质粒载体连接，并转入宿主细胞中挑选阳性克隆，获得基因工程化的细胞；以及培养所述基因工程化的细胞，表达和分离出所述白介素融合蛋白IL-24-CN。

优选将CN编码基因合成至所述白介素IL-24蛋白编码基因的3′端。

所述PCR逐步扩增的方法包括依次采用引物R-1，F-1，F-2，F-3，F-4，F-5将CN编码基因合成至所述白介素IL-24蛋白编码基因的3′端；其中，引物R-1具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，F-1具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，F-2具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，F-3具有SEQ IDNO：10所示的氨基酸序列，F-4具有SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，F-5具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。

根据本发明的第六方面，还提供一种白介素融合蛋白IL-24-CN在制备诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞迁移或侵袭的药物组合物中的应用。

根据本发明的第七方面，还提供一种抗肿瘤的组合物，所述的组合物含有：(A)有效量的根据权利要求1-6中任意一项所述的白介素融合蛋白IL-24-CN；(B)药学上可接受的载体。

本发明还提供一种增强白介素IL-24与肿瘤细胞相互作用力的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将解离素多肽CN与白介素IL-24融合，获得融合蛋白；(b)将(a)的融合蛋白与肿瘤细胞共孵育或接触，从而提高白介素与肿瘤细胞的结合。

在另一优选例中，所述获得融合蛋白的方法包括：

(i)提供一构建物，所述的构建物中含有一基因表达盒，所述基因表达盒含有以下操作性相连的元件：白介素IL-24编码基因与解离素多肽CN编码基因。

(ii)将(i)的构建物导入细胞表达系统，从而表达和纯化获得所述融合蛋白。

本发明人经过长期的文献研究和试验验证，发现白介素IL-24和解离素多肽CN融合在一起形成的融合蛋白不仅很好地保留了白介素IL-24诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖的活性，又显著提高了白介素IL-24与肿瘤细胞的相互作用力，从而增强白介素对肿瘤细胞的杀伤作用，另外所述融合蛋白还能够抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭过程，抑制肿瘤细胞的转移。

IL-24蛋白是通过与肿瘤细胞表面特异性受体IL-20R1/IL-20R2或IL-22R1/IL-20R2相互作用而激活肿瘤细胞内相关蛋白的活性，进而发挥调控肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。为了增强这种相互作用，本发明人尝试了多种方法，结果发现，将白介素IL-24与解离素多肽CN进行融合表达所获得的融合蛋白效果最好。更佳地，将白介素IL-24与SEQ ID NO：2中第170-237位所示的氨基酸序列的CN蛋白融合，其形成的融合蛋白对白介素IL-24与肿瘤细胞相互作用力的提高效果最好，发挥抗肿瘤生长和转移的作用。

白介素IL-24

IL-24是一种新型白介素(关于白介素IL-24蛋白，具体可参见文献：于明磊，依莫安等人的“人白介素24(IL-24)的表达与纯化及其初步活性评价”，药物生物技术，2013年04期)，属于IL-10家族成员。与IL-10家族其它成员相同，IL-24可以通过与细胞表明受体结合激活信号转导途径，发挥免疫调节作用。但是，研究表明IL-24是唯一一个具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长作用的细胞因子，体内外活性研究均显示其具有显著的抗肿瘤作用，且对正常细胞没有毒性作用。

本发明可用IL-24的全长蛋白或其变构体蛋白。任何一种IL-24蛋白的变构体蛋白都可以应用到本发明中。在这里，IL-24蛋白的变构体蛋白的含义是指：(1)IL-24蛋白的生活活性片段，即作为一种蛋白片段，其仍然能保持完整的IL-24蛋白的全部或部分功能(如至少50％的生物活性，较佳的至少70％的活性，更佳的至少90％的活性)；(2)经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的IL-24的氨基酸序列。所述的IL-24的变构体蛋白与CN融合后也具有增强的与肿瘤细胞的相互作用力，且具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞迁移或侵袭的作用。本发明也可采用经修饰或改良的IL-24蛋白，比如，可采用为了延长其半衰期、改善其稳定性而改良的IL-24蛋白。

作为本发明的一种优选方式，所述的IL-24的氨基酸序列可以与SEQ IDNO：4所示的序列基本上相同。更优选的IL-24的氨基酸序列可以与SEQ IDNO：2中2-159位所示的序列基本相同。

解离素多肽CN

解离素(disintegrin)是一类富含半胱氨酸的小分子多肽，广泛分布于蛇毒毒液和水蛭毒素中，其解离素样结构域中含有特征序列，如RGD序列和Lys-Gly-Asp(KGD)序列。研究较多的解离素多肽有：accutin、contortrostatin、echistatin和rhodostomin等。解离素为整合素家族的特异性抑制剂，可竞争性抑制整合素受体与细胞外基质蛋白如层粘蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白、玻连蛋白、血小板、纤维蛋白原受体、骨桥蛋白等的结合，改变信号转导并发挥作用，包括：抑制血小板的聚集、抑制细胞间粘附、抑制肿瘤血管的生成、发挥信号转导因子的作用等，进而抑制肿瘤细胞的转移和进展。

本发明人发现，白介素IL-24特别适合于与解离素多肽CN的融合，形成的融合蛋白不仅易于表达，而且分离纯化获得的融合蛋白具有更高的与肿瘤细胞的相互作用力，可显著诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的迁移或侵袭。本发明可用的全长蛋白或其的变构体蛋白。任何一种CN的变构体蛋白都可以应用到本发明中。在这里，CN的变构体蛋白的含义是指：(1)经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的CN氨基酸序列；(2)将CN蛋白中的作用元件与其它解离素多肽中的作用元件进行置换获得的变构体。术语“作用元件”是指在解离素多肽与细胞结合的过程中发挥作用的氨基酸序列，如特征性序列(如，RGD序列，KGD序列等)，羧基端氨基酸序列等。所述的变构体CN蛋白与白介素IL-24融合后也具有增强的与肿瘤细胞的相互作用力，且具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞迁移或侵袭的作用。

作为本发明的一种优选方式，所述的CN的氨基酸序列可以与SEQ IDNO：6所示的序列基本上相同。更优选的CN的氨基酸序列可以与SEQ IDNO：2中170-237位所示的氨基酸序列基本相同。

融合蛋白

本发明提供一种白介素融合蛋白IL-24-CN，所述融合蛋白包括白介素IL-24(或其变构体蛋白)和解离素多肽CN(或其变构体蛋白)。术语“IL-24-CN”、“融合蛋白”以及“白介素融合蛋白IL-24-CN”等可互换使用，都是指所述的融合蛋白。

所述的IL-24和CN之间可以直接相连接，或通过连接肽连接。作为本发明的一种优选的方式，所述的IL-24和CN之间是通过连接肽连接，从而形成融合蛋白。所述的连接肽包括1-20个氨基酸，较佳地为1-15个氨基酸，更佳地为1-10个氨基酸，最佳地是1-4个氨基酸，如2-3个。

作为一种优选的方式，所述的IL-24蛋白位于融合蛋白的氨基端，所述的CN多肽位于融合蛋白的羧基端。可选择地，也可互换两种蛋白所处的位置。

此外，可选择地，所述的融合蛋白的氨基端(或羧基端)还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是GST、FLAG、His-tag、Trx等。这些标签可用于促进融合蛋白的可溶表达或对融合蛋白进行纯化。一个具体的例子是在融合蛋白的氨基端连接有His-tag。本领域人员应理解，可以在蛋白标签氨基酸序列与融合蛋白IL-24-CN序列之间设置可酶切的结构，从而可将标签从融合蛋白上去除。

另一方面，本发明还提供了编码所述的融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。

编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以是全序列人工合成的，也可以是通过PCR扩增的方法(1)分别获得编码IL-24和CN氨基酸序列的DNA序列，然后将其拼接起来(2)将编码CN氨基酸序列的DNA序列逐步扩增至IL-24氨基酸序列编码基因的3′-端，形成编码本发明所述融合蛋白的DNA序列。

在获得了编码本发明所述融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的融合蛋白。

因此，本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。

在本发明中，任何合适的载体都可以使用，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体。可选用本领域已知的载体如市售的载体，或经过改造的市售载体。作为本发明的一种优选方式，所述的载体为原核载体，如pET载体。

生产融合蛋白的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有IL-24-CN融合蛋白编码核酸的重组细胞。所述方法可包括让细胞表达编码的融合蛋白，以及所述表达的融合蛋白的分离和/或纯化。可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。所述纯化可采用超滤浓缩、亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等的一种或不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。

本发明的融合蛋白可用于制备抑制肿瘤生长和转移的组合物，从而用于杀伤肿瘤细胞，用于治疗肿瘤。本发明的融合蛋白具有优异的与肿瘤细胞结合的能力，且可显著诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞迁移或侵袭，从而抑制肿瘤的发展。因此，本发明的融合蛋白具有比IL-24更优异的肿瘤杀伤效果，从而可用于开发高效的抗肿瘤药物。

本发明所述“肿瘤”可以是多种类型的，如肿瘤细胞表面可表达细胞因子受体或表整合素受体，如可包括但不限于：黑色素瘤细胞A375和乳腺癌细胞MCF-7等。

组合物

本发明还提供一种抑制肿瘤细胞生长和转移的组合物，所述的组合物含有：(1)有效量(如摩尔浓度为1-100μM；更佳的是1-1000nM)的本发明所述的IL-24与CN的融合蛋白；和(2)药学上可接受的载体。所述载体是指这样一些药剂载体：他们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

可将所述的组合物制成各种适合于哺乳动物(如人)给药的剂型，如所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

在用于抑制哺乳动物肿瘤时，所述的融合蛋白可全身性施用，或局部施用，具体可视肿瘤的种类、生长部位、进展程度等因素决定。

本发明的组合物可直接用于杀伤肿瘤细胞。此外，还可同时与其它治疗剂或辅助剂联合使用。

本发明相对现有技术的优点主要在于：

(1)首次提供且制备出IL-24与CN的融合蛋白，且所述白介素融合蛋白IL-24-CN在本发明中所述宿主细胞中以可溶形式表达；

(2)所述白介素融合蛋白IL-24-CN与单独的IL-24和CN相比具有更高的与肿瘤细胞的相互作用力，可显著诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的迁移或侵袭，且对正常细胞无毒副作用；

(3)本发明所述白介素融合蛋白IL-24-CN具有比IL-24更显著更优异的抗肿瘤活性，且可用于多种肿瘤的治疗。

附图说明

图1示出了获得IL-24-CN基因的PCR步骤；

图2示出了pET32a-IL24-CN的构建策略；

图3示出了IL-24-CN基因的扩增结果，其中，M：Marker；1-5：各步骤PCR产物；

图4示出了重组质粒PCR鉴定结果(A)和双酶切鉴定结果(B)，其中，M：Marker；1-6：单菌落PCR产物；7：重组质粒的双酶切消化产物；

图5示出了SDS-PAGE检测IL-24-CN在基因工程菌中的表达的结果，其中，M：Marker；1：全细胞；2：上清液；3：沉淀；

图6示出了SDS-PAGE检测IL-24-CN融合蛋白的镍离子亲和纯化的结果，其中，M：Marker；1：破碎上清；2：穿出液；3：洗杂液；4：50mM咪唑浓度洗脱液；5：100mM咪唑浓度洗脱液；6：200mM咪唑浓度洗脱液；7：500mM咪唑浓度洗脱液；

图7示出了SDS-PAGE检测肠激酶酶切去除Trx-tag的结果，其中，M：Marker；1：Trx-IL24-CN；2：酶切反应24h；3：镍离子亲和柱穿出液；4：洗脱液；

图8示出了MTT法检测IL-24-CN融合蛋白对A375生长的抑制作用；

图9示出了流式细胞术检测IL-24-CN融合蛋白对A375细胞的凋亡作用；

图10示出了伤口愈合实验检测IL-24-CN融合蛋白对A375细胞迁移的影响；

图11示出了Transwell检测IL-24-CN融合蛋白对A375细胞迁移和侵袭的影响；

图12示出了细胞粘附实验分析IL-24-CN对A375细胞的亲和力。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1IL-24-CN融合蛋白的构建及重组基因工程菌的制备

GeneBank已报道白介素IL-24的蛋白编码基因(Accession NO.BT007156.1)，如SEQ ID NO：3所示。CN多肽的编码基因如SEQ ID NO：5所示，采用PCR逐步扩增的方法将CN编码基因合成至IL-24蛋白编码基因的3′端。在上游引物R-1中引入Kpn I位点，下游引物F-5中引入Xho I位点(序列中斜体加粗显示)，便于克隆到pET-32a(+)的Kpn I和Xho I位点之间。为了在表达纯化之后将Trx-Tag切除，在上游引物R-1中引入肠激酶(Enterokinase,EK)识别位点DDDDK，以下划线标出。引物(由上海杰李生物技术有限公司合成)如下：

R-1：CGGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCCAGGGCCAAGAAT

F-1：AGCACGGATTTGCAGGAGCGTCACTTCCACCTCCACCACTTCCACCTCCACC

F-2：CAGTCCATCTGCACACTGTGACCCTGTTGTCAGTTTACATGTTGCAGCATCGC

F-3：CCTTGCTCTCCGGCATACTGTTCCTTCTTTCATAAATTTGCACTGGTCACAACA

F-4：AGCCAGCAGATATGCCATTGCAGTAATCATCCAGGTCATCACC

F-5：CCGCTCGAGTCAGGTAGCTGGACCCTTGTGGGGATTTCTGGGACAGCCAGCAGATATGC

PCR逐步扩增方法见图1。通过PCR反应，获得含有编码IL-24-CN融合蛋白的DNA序列，核酸序列见SEQ IDNO：1，所编码的融合蛋白见SEQIDNO：2。PCR反应体系为50μL：模板DNA1μL，上、下游引物(10μM)各1μL，Mix DNA Polymerase25μL，补加去离子水至50μL。反应条件如下：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸47s，30个循环；72℃延伸5min，1个循环；4℃保存。PCR结果见图3。

将如上所获得的IL-24-CN融合蛋白基因的PCR产物纯化后，用Nde I和Xho I限制性内切酶进行双酶切，并将酶切产物克隆入经同样双酶切的质粒载体pET-32a(+)，构建策略见图2，获得重组质粒pET32a-IL24-CN。将重组表达载体转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，分别进行菌落PCR、质粒双酶切和DNA测序进行验证，结果见图4。选择测序完全无误的单克隆为表达IL-24-CN融合蛋白的基因工程菌。

实施例2IL-24-CN融合蛋白的诱导表达和分离纯化

(1)IL-24-CN融合蛋白的诱导表达

将上述基因工程菌接种于LB培养基(100μg/mL Amp)，置于37℃摇床200rmp培养。当菌液生长至OD600为0.6-0.8时，加入0.5mM诱导剂IPTG，30℃诱导6h。收获发酵液，经8000rpm离心15min收集诱导表达的重组菌菌体。用Tris-HCl缓冲液洗涤一次菌体。将菌体重悬于TE缓冲液，置于冰上进行超声破碎，超声功率设为300W，超声时间为3×100次(超声3s，暂停6s)。取全细胞，10000rpm离心30min后取上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，通过凝胶成像系统分析目的蛋白表达情况。结果见图5。

(2)IL-24-CN融合蛋白的纯化

构建本发明所述融合蛋白时，在其氨基端融合有His-tag，因此本发明首先采用Ni²⁺亲和柱对上述融合蛋白粗体液进行初步纯化，获得高纯度的融合蛋白。用肠激酶对融合蛋白进行酶切，获得IL-24-CN与含有Trx-tag和His-tag的融合标签片段，再次通过Ni²⁺亲和层析或离子交换层析可去除被切下的融合标签片段，分离纯化得到高纯度的IL-24-CN融合蛋白。结果见图6和图7。

实施例3不带有解离素多肽CN的白介素IL-24的制备

本发明设置非融合表达的IL-24(命名为nrIL-24)作为IL-24-CN的对照。

实施例4纯化获得的IL-24-CN融合蛋白具有抑制肿瘤细胞生长的活性

采用MTT比色法检测细胞活力和生长。收集A375对数生长期细胞(购自中科院上海生命科学研究院)，调整细胞悬液浓度为10⁵个/mL，每孔加入100μl，即实验细胞浓度为10000个/孔。边缘孔每孔加入100μl PBS缓冲液。将96孔板置5％CO₂培养箱，37℃培养至细胞铺满孔底，加入浓度梯度的药物蛋白，每组设置6个复孔。5％CO₂培养箱，37℃孵育24、48小时，倒置显微镜下观察。每孔加入20μl5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h，取出96孔板终止孵育，小心吸去孔内培养基。每孔加入150μl DMSO，置摇床震荡10min，使结晶物充分溶解。用微孔酶标仪测定各孔在490nm处的吸光值。

实验结果见图8。结果显示，nrIL-24和IL-24-CN可显著抑制A375细胞的生长，且在一定范围内随着给药浓度的增加抑制率呈上升趋势，说明nrIL-24和IL-24-CN呈浓度依赖性抑制A375细胞的生长。而用PBS处理的对照组对A375细胞的生长抑制不明显。另外，IL-24-CN对A375细胞的抑制活性要高于nrIL-24，说明IL-24与CN的融合表达提高了其抗肿瘤活性。

实施例5流式细胞术检测IL-24-CN融合蛋白对肿瘤细胞的诱导凋亡作用

将Annexin-V与PI结合使用，对肿瘤细胞进行荧光染色，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。以1.5×106个/孔的细胞数接种肿瘤细胞于6孔板，置于5％CO₂培养箱，37℃培养。待细胞贴壁后，加入不同浓度的药物处理，以PBS作为阴性对照。5％CO₂培养箱37℃培养24h，将A375细胞用胰酶消化，PBS清洗3次。用Annexin-bingdingbuffer重悬细胞，调整细胞浓度约为1×106个/mL，取100μL用于分析。加入5μL AnnexinV和1μL100μg/mL PI工作液，室温孵育15min。加入400μL Annexin-bingdingbuffer，轻轻混匀，置于冰上用于检测。

实验结果见图9。结果显示，与PBS对照组相比，nrIL-24和IL-24-CN均能显著诱导A375细胞的凋亡，其凋亡率分别为16.8％和26.8％。且IL-24-CN融合蛋白诱导A375细胞凋亡的作用强于野生型nrIL-24，说明IL-24与CN能发挥协同作用促进肿瘤细胞的凋亡。

实施例6IL-24-CN融合蛋白具有抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的活性

(1)伤口愈合实验

细胞伤口愈合实验是在单层培养细胞间制作划痕以产生愈伤区域，然后监控该伤口周围细胞向划痕迁移的现象，一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。用直尺和记号笔在6孔板背后均匀地划5条定位线，间隔0.5-1cm为宜，作为细胞划痕的参考线，划痕与定位线的交叉点作为观察的基准点。每孔加入约2-3×10⁵个细胞，置于5％CO₂培养箱，37℃培养至细胞铺满孔底。比着直尺用10μl枪头垂直于定位线划痕，枪头不能倾斜。用PBS缓冲液清洗细胞3次，去除脱落细胞。用含10μg/ml丝裂霉素C的无血清培养基培养2h。加入含有不同药物蛋白浓度的无血清培养基。置于5％CO₂培养箱，37℃培养。培养24h取样拍照，以0h作为基准。

细胞迁移距离=初始划痕宽度-作用后划痕宽度

实验结果见图10。由图可见，24h后用PBS处理的对照组划痕明显变小，与实验组相比A375细胞有明显的迁移。用nrIL-24处理的A375细胞划痕距离也有减小，通过图像软件对划痕距离进行测量之后得出，相对迁移率为26.59％，较对照组的33.07％小，说明nrIL-24对肿瘤细胞的迁移也有一定的抑制作用，迁移抑制率为19.59％。用IL-24-CN处理的肿瘤细胞划痕距离减小最少，A375细胞相对迁移率为16.82％，说明IL-24-CN对肿瘤细胞的迁移有显著的抑制作用，迁移抑制率为49.14％。

(2)Transwell实验

制备Transwell小室，将小室用50μL一定浓度的基质胶包被用于侵袭实验，未包被基质胶的小室用于迁移实验。将A375细胞用胰酶消化，PBS清洗3次，重悬于无血清RPMI1640培养基，调整细胞浓度至6×10⁵个/mL。吸出小室中的溶液，并加入100μl细胞悬液。在下室加入600μl细胞悬液。设置加不含趋化因子或血清培养基的孔作为背景对照；其余的孔加含趋化因子或血清的培养基为实验组。孵育培养24h。孵育时间依赖于细胞的迁移和侵袭能力。染色前将小室内没有转移或侵袭的细胞去除，避免被固定和染色。吸取培养基，小心用棉签擦拭小室，不要弄破膜或触碰到膜的底部。用PBS洗小室(200ul)和下室(400ul)两次。加入结晶紫染液染色10min，体积同上。用水清洗小室，并室温风干，显微镜观察。随机区域计数，统计实验结果。

实验结果见图11。结果显示，nrIL-24对A375细胞的迁移和侵袭都有一定的抑制作用，相对抑制率分别为24.68％和13.56％。IL-24-CN对A375细胞的迁移和侵袭有明显的抑制作用，相对抑制率分别为51.95％和45.76％。

实施例7细胞粘附实验

在High Binding Polystyrene96孔板表面包被PBS(pH7.4)稀释的IL-24-CN，每孔100μl，轻拍96孔板使其充分混匀，4℃过夜。弃去包被溶液，每孔加150μl含2％BSA的PBS溶液封闭孔表面。只包被2％BSA的孔作为背景对照。置37℃孵育2h。弃去封闭液，将PBS沿孔壁轻轻加入，避免直接加到孔底表面，以免破坏已经包被到孔底表面的蛋白。将A375细胞用胰酶消化，PBS清洗3次，重悬于含2％胎牛血清的RPMI1640培养基，加入已包被蛋白的微孔中(3×104cells/well in100ul，最佳细胞数应使孔底尽量铺满)，置培养箱孵育1-2h；弃去培养基，用PBS轻轻地清洗3次，除去没有粘附的细胞。每孔加入200μl4％的多聚甲醛，室温孵育10min。弃去多聚甲醛溶液，用PBS清洗2次，每孔加入60μl的结晶紫染液，室温孵育30min。弃去染色液，用PBS清洗3次，将残留的结晶紫染液去除干净。加入150μl33％的醋酸溶液，570nm测每孔的吸光值。

实验结果见图12。结果显示，只包被BSA的孔板几乎没有A375细胞的粘附，包被重组蛋白nrIL-24的孔板有少许A375细胞被粘附于板底，这可能是由于nrIL-24与肿瘤细胞的表明的受体结合而使细胞粘附于板底。包被IL-24-CN的孔底对A375细胞的粘附数量显著增多，这也说明CN对肿瘤细胞有较强的亲和力，通过与CN的融合表达可提高IL-24到肿瘤细胞表面的靶向性。可能由于IL-24对肿瘤细胞亲和力的提高而增强其对肿瘤细胞生长的抑制。

实施例8药物组合物

将实施例2中纯化获得的融合蛋白100mg配制于100mL的常规的PBS缓冲液中，获得浓度为1mg/mL的含融合蛋白的药物组合物。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (6)

1.一种白介素融合蛋白，其特征在于，所述白介素融合蛋白包括：

(1)白介素IL-24；

(2)解离素多肽CN；以及

(3)位于所述白介素IL-24和所述解离素多肽CN之间的连接肽；

其中，所述白介素融合蛋白是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码根据权利要求1所述的白介素融合蛋白。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种根据权利要求1所述的白介素融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将编码根据权利要求1所述的白介素融合蛋白的DNA序列与经过同样酶切的质粒载体连接，再转入宿主细胞中挑选阳性克隆，获得基因工程化的细胞；以及

培养所述基因工程化的细胞，表达和分离出所述白介素融合蛋白。

5.一种根据权利要求1所述的白介素融合蛋白在制备诱导黑色素瘤细胞A375凋亡以及抑制黑色素瘤细胞A375迁移和侵袭的药物组合物中的应用。

6.一种抗黑色素瘤的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

(A)有效量的根据权利要求1所述的白介素融合蛋白；

(B)药学上可接受的载体。