ES2632345T3 - Inhibición de la señalización AXL en terapia antimetastásica - Google Patents

Inhibición de la señalización AXL en terapia antimetastásica Download PDF

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Abstract

Un polipéptido variante de AXL soluble, en donde dicho polipéptido carece del dominio transmembrana AXL y tiene un conjunto de modificaciones de aminoácido de la secuencia de AXL de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1), seleccionado del grupo que consiste en: 1) Gly32Ser, Asp87Gly, Val92Ala y Gly127Arg, 2) Glu26Gly, Val79Met, Val92Ala y Gly127Glu; y 3) Gly32Ser, Ala72Val, Asp87Gly, Val92Ala y Gly127Arg; en donde dicha modificación aumenta la afinidad de unión del polipéptido AXL a la proteína 6 específica de parada de crecimiento (GAS6); y en donde la posición de cada modificación de aminoácido está representada como n, y n+7 equivale a la numeración de SEQ ID NO: 1.

Description

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de la presente invención se pueden combinar también con otras proteínas como el Fc de un isotipo IgG, que se puede unir como complemento con una toxina, como ricina, abrina, toxina de la difteria, o similares, o con agentes de unión específicos que permiten el direccionamiento a fracciones específicas de una célula diana.
En algunas realizaciones, la variante de sAXL de la presente invención es una proteína de fusión, p.ej., fusionada en fase de lectura con un segundo polipéptido. En algunas realizaciones, el segundo polipéptido es capaz de aumentar el tamaño de la proteína de fusión, p.ej., para que la proteína de fusión no sea despejada de la circulación rápidamente. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es parte o constituye toda la región Fc. En otras realizaciones, el segundo polipéptido es cualquier polipéptido adecuado que sea sustancialmente similar al Fc., p.ej., al proporcionar un mayor tamaño y/o una unión o interacción adicional con las moléculas Ig. En otras realizaciones más, el segundo polipéptido es parte o constituye toda la proteína albúmina, p.ej., proteína albúmina de suero humano.
En otras realizaciones, el segundo polipéptido es útil para manipular variantes de sAXL, p.ej., purificación de las variantes de sAXL, o para aumentar su estabilidad in vitro o in vivo. Por ejemplo, las variantes de sAXL de la presente invención se pueden combinar con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), con el resultado de polipéptidos quiméricos o de fusión. Dichas proteínas de fusión facilitan la purificación y presentan un mayor ciclo vital in vivo. Un ejemplo notificado describe proteínas quiméricas que consisten en los primeros dos dominios de polipéptido CD4 humano y varios dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de mamífero. Patente europea EP A 394,827; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86, 1988. Las proteínas de fusión que tienen estructuras diméricas por enlace disulfuro (debido a la IgG) también pueden ser más eficaces para la unión y neutralización de otras moléculas distintas a la proteína secretada monomérica o el fragmento de proteína en solitario. Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964,1995.
En otras realizaciones más, el segundo polipéptido es una secuencia marcadora, como un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. Por ejemplo, la secuencia de aminoácido marcadora, puede ser un péptido hexa-histidina, como la marca proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre otros, muchos de los cuales están disponibles en el mercado. Tal como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 821-824, 1989, por ejemplo, hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otra marca de péptido útil para la purificación, la marca “HA” corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del virus influenza. Wilson et al., Cell 37: 767, 1984.
En algunas realizaciones más, el segundo polipéptido es una entidad útil para mejorar las características de las variantes de sAXL de la presente invención. Por ejemplo, se puede añadir una región de aminoácidos adicional, aminoácidos con una carga en particular, en el N-término del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia durante la purificación de la célula huésped o la manipulación y el almacenamiento posteriores. Asimismo, se pueden añadir fracciones de péptido a las variantes de sAXL de la presente invención para facilitar la purificación y eliminarse a continuación antes de la preparación final del polipéptido. La adición de fracciones de péptido para facilitar la manipulación de los polipéptidos constituye técnicas de rutina conocidas en la técnica.
En otras realizaciones más, las variantes de sAXL de la presente invención tienen una actividad de unión a GAS6 que es al menos igual o mejor que la del AXL de tipo silvestre. En otras realizaciones, las variantes de sAXL de la presente invención tienen una actividad de unión o afinidad a GAS6 que es al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, o 6 veces mayor que la del AXL de tipo silvestre. En otras realizaciones, las variantes sAXL de la presente invención tiene una actividad de unión o afinidad a GAS6 de al menos aproximadamente 1x10-6, 1x10-7 , 1x10-8 o 1x10-9 M. En otras realizaciones más, las variantes de sAXL de la presente invención son capaces de inhibir, inhiben o compiten con la unión de AXL de tipo silvestre a GAS6 in vivo o in vitro o ambos. En otras realizaciones más, las variantes de sAXL de la presente invención inhiben o compiten con la unión de AXL S6-1, AXL S6-2, y/o AXL S6-5 tal como se proporciona en el Ejemplo 2 de la presente invención. En otras realizaciones más, las variantes de sAXL de la presente invención inhiben o compiten con la unión de cualquier variante de sAXL proporcionada en el Ejemplo 2 de la presente solicitud.
La capacidad de una molécula de unirse a GAS6 se puede determinar por ejemplo, por la capacidad de unión del ligando putativo a GAS6 revestido en una placa de ensayo. En una realización, la actividad de unión de variantes de sAXL de la presente invención a GAS6 se puede determinar movilizando o bien el ligando, p.ej., GAS6 o bien la variante sAXL. Por ejemplo, el ensayo puede incluir la inmovilización de GAS6 fusionada con una marca His sobre perlas de resina NTA activadas con Ni. Se pueden añadir agentes en un tampón apropiado e incubar las perlas durante un período de tiempo y a una temperatura determinados. Después de los lavados para eliminar el material sin unir, se puede liberar la proteína unida por ejemplo con SDS, tampones con pH alto, y similares, y analizar.
En otras realizaciones más, las variantes sAXL de la presente invención tienen una mejor estabilidad térmica que la estabilidad térmica de un AXL de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de las variantes sAXL de la presente invención es al menos 5 °C, 10 °C, 15 °C, o 20 °C más que la temperatura de fusión del AXL de tipo silvestre.
De acuerdo con la presente invención, las variantes sAXL de la presente invención también pueden incluir una o
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un beneficio terapéutico sin causar una sustancial toxicidad.
La toxicidad de las proteínas descritas en el presente documento se puede determinar por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos de células o animales experimentales, p.ej., determinando la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) o la LD100 (la dosis letal para el 100 % de la población). La relación entre el efecto tóxico y el efecto terapéutico de la dosis es el índice terapéutico. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos con cultivos celulares y estudios animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosis que no sea tóxico para su uso en seres humanos. La dosis de las proteínas descritas en el presente documento se encuentra preferentemente en el intervalo de concentraciones en la circulación que incluyen la dosis eficaz con un mínimo de toxicidad o sin ella. La posología puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación, ruta de administración y posología exactas quedarán al criterio del médico en particular a la vista del estado del paciente. (Véase, p.ej., Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1).
Se describen también kits que comprenden las composiciones (p.ej., variantes de AXL soluble y formulaciones de los mismos) de la invención e instrucciones para su uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional. Los kits incluyen normalmente una etiqueta en la que se indica el uso pretendido del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier signo escrito o material registrado suministrado sobre el kit o adjunto al kit de otra forma.
Se describen también métodos para determinar la capacidad de un tumor de invadir o y/o producir metástasis detectando y/o determinado el nivel de actividad de AXL o actividad de GAS6 en una muestra biológica de un sujeto de interés. En algunos casos, el nivel de actividad de AXL o actividad de GAS6 se mide por el nivel de expresión de ARNm, el nivel de expresión de proteína, el nivel de activación de proteína o cualquier indicador adecuado que corresponde a la actividad de AXL o GAS6 directa o indirectamente. En algunos casos, el nivel de actividad de AXL
o actividad de GAS6 en una muestra biológica se compara además con un nivel predeterminado, p.ej., un nivel normal obtenido estableciendo niveles o intervalos normales de actividad de AXL o actividad de GAS6 sobre la base de una población de muestras de tumores que no desarrollan invasión tumoral o metástasis tumoral o de tejidos normales. Por ejemplo, un aumento de la actividad de AXL o la actividad de Gas6 por encima del nivel predeterminado o el nivel normal es indicativo de la predisposición del tumor de invasión tumoral o metástasis tumoral.
Todas las publicaciones y patentes que se citan en la presente memoria descriptiva son para divulgar y describir los métodos y/o materiales en conexión con la materia por la que se los cita. La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de registro y no deberá interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención anterior. Asimismo, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden estar pendientes de confirmación de forma independiente.
Cualquiera de los métodos citados se puede llevar a cabo en el orden de eventos recitado o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible. Los ejemplos que se ofrecen a continuación servirán para ilustrar las partes de la invención.
Parte experimental
Ejemplo 1
El bloqueo terapéutico de señalización de AXL inhibe la progresión metastásica de tumor
La demostración de AXL como diana terapéutica para enfermedad metastásica sigue inexplorada en gran medida y, es más, no se han demostrado correlatos de direccionamiento a AXL in vivo. Los inventores demuestran que AXL es un marcador de metástasis en pacientes humanos con cáncer de mama y de ovarios y que la gravedad de la enfermedad en estos pacientes está correlacionada con la cantidad de proteína AXL en el tumor primario. Cabe destacar sobre todo que los inventores han demostrado que la metástasis tumoral se puede tratar con éxito en ratones con metástasis preexistente por administración de ectodominios de AXL soluble. De manera mecánica, la inhibición de la señalización de AXL en animales con enfermedad metastásica tiene como resultado una disminución de la invasión con actividad de MMP. Los hallazgos de los inventores demuestran que la inhibición de la cascada de señalización de AXL en células tumorales a través de la administración de ectodominios de AXL soluble es suficiente para inhibir la progresión tumoral metastásica.
En este estudio, los inventores han determinado por ensayo si AXL es un factor crítico para la metástasis de cáncer humano y que el bloqueo terapéutico de la señalización de AXL puede constituir un tratamiento eficaz para enfermedad metastásica. Han utilizado enfoques tanto genéticos como terapéuticos para evaluar directamente el papel de AXL en el inicio y progresión de cáncer de mama y de ovario metastásico.
AXL es un marcador de la progresión tumoral y metástasis en cáncer humano. Los inventores han comprado la
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repitieron dos veces.
Transfecciones transitorias y retroviral. Se realizaron transfecciones de ADN transitorias con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectó 0,1 mg de ADNc MMP-2 (OpenBiosystems) en un plato de 6 pocillos.
siARN: las secuencias de siARN dirigidas a AXL o el control fueron adquiridas de Dharmacon. Todas las transfecciones de siARN fueron realizadas utilizando Dharmacon Smart Pools con reactivo de transfección Dharmafect 1 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Dharmacon, Lafayette, CO).
shARN: Se sintetizaron oligos para la degradación específica de ARN AXL 5’-GATTTGGAGAACACACTGA-3’ tal como se ha descrito anteriormente. Se utilizó una secuencia desordenada (scramble) como shARN sin direccionamiento 5’-AATTGTACTACACAAAAGTAC-3’. Se clonaron estos oligos en el vector RNAi-Ready pSiren RetroQ (BD Bioscience) y se transdujeron retroviralmente células SKOV3ip.1, MDA-231, y OVCAR-8 con estos vectores. Se seleccionaron células infectadas en puromicina (Sigma) y se sometieron a ensayo las poblaciones policlonales para determinar el descenso de los niveles de expresión de AXL por análisis de transferencia de western.
Plásmidos. Se amplificó el ectodominio de AXL correspondiente a los aminoácidos 1-451 desde ADNc de AXL humano (Open Biosystems) y se clonó en el vector lanzadera adenoviral pADD2 activado con CMV. Las transfecciones de ADN transitorias con vector control o AXL 1-451 fueron realizadas con Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante en células HCT116. Se recogieron los medios acondicionados 48-72 horas después de la transfección.
Ensayos de adhesión. Se marcaron fluorescentemente células SKOV3ip.1 shSCRM y shAXL con 5um CMFDA (Molecular Probes). Se lavaron las células y se desprendieron con tampón no enzimático de disociación celular (Gibco). Se colocaron las células (5X10e5) en placas de 96 pocillos y se pre-revistieron con 50ug/ul de colágeno tipo I (BD Bioscience). Después de incubación durante 60 minutos a 37 ºC, se lavaron las células cuidadosamente 5 veces. Se midió la actividad fluorescente (excitación, 494 nm; emisión, 517nm) utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia. . Adhesión de SKOV3ip.1 a colágeno tipo I. Se marcaron fluorescentemente células SKOV3ip.1 shSCRM y shAXL con 5um CMFDA (Molecular Probes). Se lavaron las células y se desprendieron utilizando un tampón no enzimático de disociación (Gibco). Se colocaron células (5X10e5) por triplicado en una placa de 96 pocillos y se pre-revistieron con 50ug/ul de colágeno tipo I (BD Bioscience). Al cabo de 60 minutos de incubación a 37 ºC, se lavaron cuidadosamente las células 5 veces. Se midió la actividad fluorescente (excitación, 494 nm; emisión, 517nm) utilizando un espectrofotómetro fluorescente.
Adhesión de MDA-231 a proteínas ECM Proteínas. Se colocaron en placa células MDA-231 shSCRM y shAXL (0,5x10^6) por triplicado en pocillos que contenían una matriz de proteínas ECM incluyendo laminina, colágeno I y IV, fribronectina y fibrinógeno. Se incubaron las células a 37 ºC durante 1 h y se lavaron en PBS. Se tiñeron las células adherentes y se cuantificaron a DO de 560 de acuerdo con el protocolo del fabricante (CellBiolabs).
Ensayos de migración. Se examinó la migración celular in vitro tal como se ha descrito anteriormente. Brevemente, se privaron de suero las células durante 24 horas y se sembraron (2,5 x 104 células) por triplicado en insertos sin revestir (BD Biosciences), se trasladaron a cámaras que contenían FBS como quimioatrayente y se incubaron durante 24 horas. Después de separar las células no invasoras, se fijaron las células en la parte inferior de las membranas, se tiñeron y se contaron. Se contaron cinco campos para cada membrana. Se determinó el % de migración del siguiente modo: (Nº medio de células que migraron en células shAXL/Nº medio de células que migraron en células shSCRM) x 100. Se realizaron los experimentos por triplicado y se repitieron tres veces.
Ensayo de invasión de colágeno. Se realizaron ensayos de invasión de colágeno tal como se ha descrito anteriormente. Brevemente, se colocaron 533 células en colágeno tipo I sobre una placa de 48 pocillos. Se cultivaron las células en medios normales o en medios con la adición de medios de control acondicionado o medios acondicionados con sAXL durante 5-7 días y se tomaron fotografías. Se cuantificó la invasión a través de colágeno calculando el porcentaje de células tumorales que desplegaban un fenotipo ramificado por campo 20X. Se hizo el recuento de tres campos por muestra. Se llevaron a cabo los experimentos por triplicado y se repitieron 2 veces.
Zimografía en sustrato de gelatina. Se privaron de suero células SKOV3ip.1 shSCRM y shAXL durante 48 horas. Se colocaron 25.000 células en una placa de 96 pocillos y se recogieron los medios acondicionados 24 horas después. Se pusieron en marcha volúmenes iguales de medios acondicionados en condiciones no reductoras de geles de zimograma al 10 % (Invitrogen). Tras la electroforesis, se lavaron los geles en 2,5 % (v/v) Triton X-100 para eliminar SDS y se lavaron en 50 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, y 0,1% Triton X-100 (pH 7,8) y se incubó durante toda la noche a 37°C. Se tiñeron los zimogramas durante 30 min con 0,25% (p/v) de azul R250 brillante de Coomassie disuelto en 40 % de metanol y 10 % de ácido acético glacial. Se destiñeron los geles en 40 % de metanol y 10 % de ácido acético glaciar. Se realizaron los experimentos por duplicado y se repitieron tres veces.
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