ES2582208T3

ES2582208T3 - Marcador molecular para células madre cancerosas

Info

Publication number: ES2582208T3
Application number: ES09823303.4T
Authority: ES
Inventors: Toshihiko Torigoe; Yoshihiko Hirohashi; Noriyuki Satoh; Kenjiro Kamiguchi; Rena Morita; Satoshi Nishizawa; Akari Takahashi
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd; Sapporo Medical University
Current assignee: Sapporo Medical University; Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2008-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2016-09-09
Anticipated expiration: 2029-10-27
Also published as: JP2016127820A; US8541544B2; EP2361988A4; WO2010050190A1; CN102203290A; JPWO2010050190A1; CN102203290B; EP3118326B1; US20190054141A1; EP2361988A1; US10080776B2; US9399760B2; US20110262358A1; EP2361988A9; EP3118326A3; HK1212245A1; JP5960946B2; EP3118326A2; EP2361988B1; US20140044686A1

Abstract

Un péptido Or7c1_93: que tiene la secuencia TYAGCLSQIF (SEQ. ID. NO: 75).

Description

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DESCRIPCION

Marcador molecular para celulas madre cancerosas Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un marcador molecular para detectar celulas madre cancerosas en una poblacion celular como una diana de deteccion, detectandose el marcador molecular en celulas madre cancerosas contenidas en la diana de deteccion, pero no detectandose en celulas normales o en celulas cancerosas diferentes de celulas madre cancerosas.

Tecnica anterior

Se cree que las celulas madre cancerosas son la causa principal de recidiva o metastasis del cancer, y se ha senalado la importancia de abordar las celulas madre cancerosas en terapia contra el cancer. Sin embargo, la proporcion de celulas madre cancerosas en tejido tumoral es muy baja (documento no de patente 4), y es muy diflcil reconocer especlficamente y tratar las celulas madre cancerosas. El desarrollo de tecnicas para detectar las celulas madre cancerosas y nuevas terapias que aborden las celulas madre cancerosas son cuestiones importantes en los cuidados contra el cancer.

Actualmente, se conocen marcadores moleculares tales como CD133, CD24, y CD44 como marcador de celulas madre cancerosas (documentos no de patente 1 a 7), pero se dice que son eficaces solamente en unas pocas clases de celulas cancerosas y es necesario identificar nuevos marcadores moleculares para detectar celulas madre cancerosas en una mayor diversidad de canceres.

Documentos de la tecnica anterior

[Documento de patente] US7 358 231 (Pancreatic cancer secreted targets and uses thereof)

[Documento no de patente 1] Shu Zhang et al., Cancer Res. 68: (11) 4311-4320, 2008 [Documento no de patente 2] Shih-Hwa Chiou et al., Clin. Cancer Res. 14(13) 4085-4095, 2008 [Documento no de patente 3] Gang-Ming Zou, J. Cell. Physiol. 217: 598-604, 2008 [Documento no de patente 4] Cheong J. Lee et al., J Clin Oncol 26: 2806-2812, 2008 [Documento no de patente 5] Madhuri Kakarala et al., J Clin Oncol 26: 2813-2820, 2008 [Documento no de patente 6] Craig D. Peacock et al., J Clin Oncol 26: 2883-2889, 2008 [Documento no de patente 7] Xing Fan et al., J Clin Oncol 26: 2821-2827, 2008

Sumario de la invencion

Problemas a revolver por la invencion

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un marcador molecular util para detectar celulas madre cancerosas.

Medio para resolver los problemas

Aunque los presentes inventores han estado realizando una investigacion intensiva para resolver los problemas mencionados anteriormente, han apreciado un nuevo hallazgo de que, con respecto a al menos un tejido, preferiblemente una pluralidad de tejidos en terminos de mayor utilidad, es indispensable que no se exprese un gen marcador de celulas madre cancerosas en celulas normales derivadas del tejido pero que se exprese en celulas madre cancerosas; es decir, que se exprese poco en tejidos normales en una muestra, ya que la muestra para identificar un gen de celulas madre cancerosas habitualmente contiene tejido normal. Tambien se ha descubierto que casi todos los genes marcadores de celulas madre cancerosas, presentados hasta ahora, se expresan en tejido normal a un alto nivel, y como resultado de investigaciones adicionales por los presentes inventores se ha descubierto que el gen de la region de determinacion del sexo Y-box2 (Sox2), que se conoce como un factor de transcripcion, no se expresa en celulas normales adultas, pero se expresa inesperadamente en celulas madre cancerosas. Como resultado de investigaciones adicionales, se ha descubierto que otros genes, incluyendo el gen de la protelna rica en cistelna asociada con mitocondrias de esperma (Smcp), se expresa poco en celulas normales adultas, pero se expresa en celulas madre cancerosas, y la presente invencion por tanto se ha conseguido.

Es decir, la presente invencion se refiere a un marcador molecular para detectar celulas madre cancerosas en una poblacion celular como diana de deteccion, donde el marcador molecular se detecta en celulas madre cancerosas contenidas en la diana de deteccion, pero no se detecta en celulas madre o celulas cancerosas diferentes a celulas madre cancerosas.

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Ademas, la presente invencion se refiere al marcador molecular, donde la diana de deteccion es una o mas poblaciones de celulas derivadas de celulas o tejido seleccionadas del grupo que consiste en corazon, cerebro, placenta, pulmon, hlgado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testlculo, ovario, intestino delgado, leucocitos, colon, estomago, medula osea, intestino grueso, y celulas mononucleares de sangre periferica.

Ademas, la presente invencion se refiere al marcador molecular, donde no se detecta en celulas normales o celulas cancerosas diferentes a celulas madre cancerosas para todas las dianas de deteccion.

Ademas, la presente invencion se refiere al marcador molecular, donde el marcador molecular es un producto de expresion de uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en Or7c1, Dnajb8, Sox2, Smcp, Intsl, Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Rasl11b, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, y Scgb3a1.

Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para determinar la presencia o ausencia de celulas madre cancerosas en una diana de determinacion usando el marcador molecular como indicador.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, donde la poblacion celular contiene celulas normales y/o celulas cancerosas diferentes a celulas madre cancerosas.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, donde la poblacion celular se obtiene de una o mas celulas o tejidos seleccionados del grupo que consiste en corazon, cerebro, placenta, pulmon, hlgado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testlculo, ovario, intestino delgado, leucocitos, colon, estomago, medula osea, intestino grueso, y celulas mononucleares de sangre periferica.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, donde se determina que las celulas madre cancerosas estan presentes cuando se detecta un producto de expresion de uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en Or7c1 Dnajb8, Sox2, Smcp, Ints1 Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Rasl11b, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, y Scgb3a1.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, donde el producto de expresion del gen es ARNm y/o polipeptido endogeno.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, donde el producto de expresion del gen es ARNm, y el metodo comprende detectar ARNm por un metodo de RT-PCR.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, donde el producto de expresion del gen es polipeptido endogeno, y el metodo comprende detectar polipeptido endogeno mediante un reactivo que reaccione especlficamente con el mismo.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo donde el reactivo es un anticuerpo.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, donde la determinacion se realiza in vitro o in vivo.

Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para detectar un agente terapeutico contra el cancer donde el metodo incluye

i) una etapa de medicion de una cantidad detectada "A" del marcador molecular antes de administrar un compuesto candidato a una poblacion celular,

ii) una etapa de administracion de un compuesto candidato a la poblacion celular,

iii) una etapa de medicion de una cantidad detectada "B" del marcador molecular medido en i) despues de administrar el compuesto candidato a la poblacion celular, y

iv) una etapa de determinacion de que un compuesto candidato es un candidato para un agente terapeutico contra el cancer cuando A es significativamente mas grande en comparacion con B.

Ademas, la presente invencion se refiere a un kit para determinar la presencia o ausencia de celulas madre cancerosas, donde el kit incluye un reactivo para detectar el marcador molecular.

Ademas, la presente invencion se refiere al kit, donde el reactivo para la deteccion es una sonda y/o un cebador para detectar ARNm que es un producto de expresion de uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en Or7c1, Dnajb8, Sox2, Smcp, Ints1, Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Rasl11b, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, y Scgb3a1, donde la sonda y/o cebador comprende una secuencia de nucleotidos complementaria al gen.

Ademas, la presente invencion se refiere al kit, donde el reactivo para la deteccion es un anticuerpo para detectar un polipeptido que es un producto de expresion de uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en Or7c1,

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Dnajb8, Sox2, Smcp, Intsl, Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Raslllb, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, y Scgb3a1.

Ademas, la presente invention se refiere a un metodo para determinar un cancer empleando el kit.

Ademas, la presente invencion se refiere a un polipeptido que puede usarse como antlgeno para inhibir la funcion de celulas madre cancerosas o eliminar celulas madre cancerosas, donde el polipeptido es un polipeptido codificado por Or7c1, Dnajb8, Sox2, Smcp, Ints1, Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Rasl11b, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, o Scgb3a1, o una parte de los mismos, o un polipeptido en que uno o varios aminoacidos en el polipeptido o una parte del mismo estan delecionados, sustituidos o anadidos.

Ademas, la presente invencion se refiere a un anticuerpo que reacciona especlficamente con un epltopo derivado de un producto de expresion de uno o mas genes seleccionados del grupo que consiste en Or7c1, Dnajb8, Sox2, Smcp, Ints1, Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Rasl11b, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, y Scgb3a1.

Ademas, la presente invencion se refiere a una composition farmaceutica que comprende al menos uno del polipeptido y/o el anticuerpo.

Ademas, la presente invencion se refiere a la composicion farmaceutica, donde la composicion farmaceutica se usa para tratar o prevenir el cancer.

Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para inhibir la funcion de celulas madre cancerosas o eliminar celulas madre cancerosas usando el polipeptido como antlgeno.

Ademas, la presente invencion se refiere al metodo, donde el metodo emplea el anticuerpo.

Ademas, la presente invencion se refiere a un acido nucleico que codifica el polipeptido.

Ademas, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende el acido nucleico.

Ademas, la presente invencion se refiere a la composicion farmaceutica, donde la composicion farmaceutica es para una vacuna de ADN o ARN.

Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para detectar un peptido que se presenta en un complejo principal de histocompatibilidad como antlgeno, donde el metodo incluye

i) una etapa de preparation de un peptido que tiene una longitud apropiada en que esta fragmentado un polipeptido diana,

ii) una etapa de cultivo en conjunto del peptido fragmentado obtenido en i), celulas presentadoras de antlgeno, y celulas T sensibilizadas contra el polipeptido diana y/o el peptido fragmentado obtenido en i),

iii) una etapa de medicion del nivel de activation de las celulas T obtenidas en ii), y

iv) una etapa de selection de un peptido fragmentado que tiene celulas T activadas en iii),

y el polipeptido diana es el polipeptido anterior.

Ademas, la presente invencion se refiere a un acido nucleico usado para suprimir la expresion de un gen en celulas madre cancerosas seleccionado del grupo que consiste en Or7c1, Dnajb8, Sox2, Smcp, Ints 1, Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Rasl11b, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, y Scgb3a1.

Ademas, la presente invencion se refiere al acido nucleico, donde el acido nucleico es ADN y/o ARN.

Ademas, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende al menos uno del acido nucleico.

Ademas, la presente invencion se refiere a la composicion farmaceutica, donde la composicion farmaceutica es para tratar el cancer.

Ademas, la presente invencion se refiere a un metodo para inhibir la funcion de celulas madre cancerosas usando el acido nucleico.

Efectos de la invencion

El marcador molecular proporcionado por la presente invencion puede discriminar entre celulas madre cancerosas contenidas en celulas cancerosas y celulas cancerosas diferentes a celulas madre cancerosas. Ademas, como la

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discriminacion puede realizarse por deteccion de un unico marcador molecular, las celulas madre cancerosas pueden discriminarse muy facilmente.

Ademas, como el marcador molecular de la presente invencion puede usarse en comun para una pluralidad de celulas madre cancerosas tales como celulas cancerosas pulmonares, celulas cancerosas de mama, y celulas cancerosas colorrectales, es muy eficaz como marcador molecular versatil para celulas madre cancerosas.

Ademas, como el marcador molecular de la presente invencion no se detecta en absoluto o se detecta poco en celulas normales, es util para la discriminacion de celulas madre cancerosas y, ademas, para la discriminacion de tejido tumoral que contiene celulas madre cancerosas.

Ademas, el marcador molecular de la presente invencion tiene alta relevancia para la tumorigenicidad y es util en inmunoterapia de celulas madre cancerosas, terapia dirigida molecular o terapia de transferencia genica dirigida a ese sitio, as! como la deteccion de farmacos, peptido, etc. que pueden usarse en terapia contra el cancer.

Breve descripcion de los dibujos

[FIG. 1] La FIG. 1 es un diagrama que muestra el resultado de analisis SP de llneas celulares de cancer pulmonar. Las partes rodeadas por una llnea corresponden a las fracciones SP respectivas, y % indica la proporcion de celulas de la fraccion SP en las celulas totales.

[FIG. 2] La FIG. 2 es un diagrama que muestra el resultado de un experimento de tumorigenicidad en ratones NOD/SCID. a) es una fotografla de un raton 8 semanas despues del implante. b) es una tabla que muestra el valor promedio del tamano del tumor ± desviacion tlpica de todos los ratones a los que se ha implantado LHK2 (celulas de cancer pulmonar) y la cantidad de ratones con tumor que sobreviven/la cantidad total de ratones con implante. c) muestra graficos del valor promedio del tamano del tumor cada semana para los grupos a los que se ha implantado 1500 celulas de LHK2 (celulas de cancer pulmonar), MCF7 (celulas de cancer de mama), y SW480 (celulas de cancer colorrectal).

[FIG. 3] La FIG. 3 es un diagrama que muestra la expresion de Sox2 en a) celulas normales adultas humanas y b) en la fraccion SP y la fraccion MP de llneas celulares cancerosas.

[FIG. 4] La FIG. 4 es un diagrama que muestra la expresion de Smcp y FLJ13464 en a) celulas normales adultas humanas y b) en la fraccion SP y la fraccion MP de llneas celulares cancerosas.

[FIG. 5] La FIG. 5 es un diagrama que muestra un grafico de expresion en cada una de las celulas para los genes que se examinaron. En el diagrama, cuando no se observaba expresion se da como negativo, cuando se observaba expresion se da como positivo, y cuando, aunque habla muy ligera expresion, era una cantidad traza de expresion que no podia decirse que fuera expresion significativa se da como falso positivo. Los que son falsos positivos se determinan como "no detectados". En el diagrama, LHK2 es cancer pulmonar, MFH03 es sarcoma de tejido blando, MCF7 es cancer de mama, LHK2-SOX2 es la linea celular LHK2 con el gen SOX2 sobreexpresado, y SW480 y KM12 son lineas celulares de cancer colorrectal grande.

[FIG. 6] La FIG. 6 es un diagrama que muestra la expresion de Sox2 en otras lineas celulares cancerosas.

[FIG. 7] La FIG. 7 es un diagrama que muestra la expresion de Smcp en otras lineas celulares cancerosas. Muestra los resultados cuando se realizo investigation estableciendo los ciclos de PCR a 35 ciclos y 40 ciclos respectivamente. En el diagrama, Caki-1, ACHN, y SMKTR-1 a -4 son llneas celulares de cancer de celulas renales, Sq1 es una llnea celular de cancer pulmonar de celulas escamosas, 1-87, A549, y LHK2 son lineas celulares de adenocarcinoma pulmonar, LC817 es una linea celular de cancer pulmonar microcltico, 86-2 y Lu99 son llneas celulares de cancer pulmonar no microcltico, HPC3 es una linea celular de cancer pancreatico, y LCC (raton) son celulas de cancer pulmonar de raton.

[FIG. 8] La FIG. 8 a) es un diagrama que muestra la expresion de Ints1 en celulas normales y en la fraccion SP y la fraccion MP de lineas celulares cancerosas SW480, KM12, LHK2, y MCF7. b) es un diagrama que muestra la expresion de Ints1 en llneas celulares cancerosas. En el diagrama, las llneas celulares cancerosas son las mismas que en la FIG. 6 Y FIG. 7.

[FIG. 9] La FIG. 9 es un diagrama que muestra el resultado de tincion inmunohistoquimica en tejido de cancer pulmonar. El Caso 1 y Caso 2 son imagenes de tejido de cancer pulmonar escamoso tenido obtenido de diferentes pacientes con cancer. Una parte azul indica un nucleo tenido por tincion con hematoxilina, y una parte marron indica proteina antigenica SOX2 tenida por anticuerpo anti-SOX2.

[FIG. 10] La FIG. 10 es un diagrama que muestra los resultados de tincion inmunohistoquimica en tejido de cancer de mama. El Caso 1 muestra imagenes de tincion del patron citoplasmatico, el Caso 2 muestra imagenes de tincion del patron nuclear, CK5 muestra imagenes tenidas por anticuerpo anti-CK5, y SOX2 muestra imagenes tenidas por anticuerpo anti-SOX2. Una parte azul indica un nucleo tenido por tincion con hematoxilina, y una parte marron indica proteina antigenica tenida por anticuerpo anti-CK5 o anticuerpo anti-SOX2.

[FIG. 11] La FIG. 11 es un diagrama que muestra los resultados de tincion inmunohistoquimica en a) cerebro, b) pulmon, c) pancreas, y d) estomago. Una parte azul indica un nucleo tenido por tincion con hematoxilina, y una parte marron indica proteina antigenica SOX2 tenida por anticuerpo anti-SOX2. Una parte mostrada por flecha negra indica celulas ligeramente tenidas por anticuerpo contra SOX2.

[FIG. 12] La FIG. 12 es un grafico que muestra un cambio en la capacidad tumorigenica por expresion forzada de SOX2. La fotografla a la izquierda es una fotografla de un raton 9 semanas despues del implante del tumor. El grafico a la derecha es un grafico del valor promedio para el tamano del tumor en 9 semanas de un grupo al que se

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han implantado 10000 celulas. En el grafico, los cuadrados negros indican celulas LHK2 en que se expreso de forma forzada SOX2, y los rombos negros indican celulas LHK2 transfectadas de forma simulada.

[FIG. 13] La FIG. 13 es un grafico que muestra la tasa de supervivencia del paciente para pacientes con cancer de mama SOX2 positivo y pacientes con cancer de mama SOX2 negativo.

[FIG. 14] La FIG. 14 a) da los resultados de investigacion del nivel de expresion del gen SOX2 por un metodo de RT- PCR en celulas transfectadas con el gen sh-SOX2 y celulas transfectadas con sh-EGFP. b) es un grafico que muestra la tasa de supervivencia celular a cada concentracion de cisplatino cuando se cultivaban celulas respectivas en un medio que contenla cisplatino durante 24 horas.

[FIG. 15] La FIG. 15 es un diagrama que muestra el resultado de un ensayo de union a HLA-A24 de peptido derivado del polipeptido SOX2. Se identifica un peptido que mostraba un MFI al mismo nivel o cercano al de un peptido usado como control positivo como un peptido de union a HLA-A24.

[FIG. 16] La FIG. 16 es un diagrama que muestra el resultado de un ensayo de citotoxicidad de peptido SOX2_109. Se detecto un nivel extremadamente alto respecto al peptido derivado de VIH, que era un control negativo.

[FIG. 17] La FIG. 17 es un diagrama que muestra el resultado de un ensayo ELISPOT del peptido SOX2_109. No se detecto liberacion de IFNy para el peptido derivado de VIH como control negativo, pero se detecto liberacion de IFNy para el peptido SOX2_109.

[FIG. 18] La FIG. 18 a) es un diagrama esquematico de un plasmido usado para la transferencia del gen SMCP y un diagrama esquematico de un raton con implante, y b) es una fotografla de un raton 5 semanas despues de que se implantaran celulas LHK2 transfectadas con el gen de expresion SMCP y celulas LHK2 transfectadas de forma simulada. c) es un grafico del tamano del tumor medido cada semana despues de que se implantara a los ratones 1000 y 10000 celulas LHK2 transfectadas con el gen SMCP y celulas LHK2 transfectadas de forma simulada. En el grafico, los rombos negros indican celulas LHK2 en que se expreso de forma forzada el gen SMCP, y los cuadrados negros indican celulas LHK2 transfectadas de forma simulada.

[FIG. 19] La FIG. 19 a) es el resultado de investigacion del nivel de expresion del gen SMCP por un metodo de RT- PCR, en dos tipos de ARNip contra celulas transfectadas con SMCP y celulas transfectadas con "Stealth RNAi (marca registrada) siRNA Negative Control Hi GC n.° de catalogo 12935-400 (Invitrogen)" como control negativo. b) es un grafico que muestra el cambio en la cantidad de celulas cuando se cultivaban las celulas respectivas en las mismas condiciones. En el grafico, los cuadrados negros indican celulas LHK2 como control negativo, los triangulos negros indican celulas LHK2 transfectadas con SMCP1, y los clrculos negros indican celulas LHK2 transfectadas con SMCP3.

[FIG. 20] La FIG. 20 es un grafico de la medicion del tamano del tumor cada semana despues de que a ratones NOD/SCID se les implantara 200000 celulas transfectadas por cada uno de dos tipos de ARNip contra SMCP y celulas transfectadas con "Stealth RNAi (marca registrada) siRNA Negative Control Hi GC n.° de catalogo 12935-400 (Invitrogen)" como control negativo, respectivamente. En el grafico, los cuadrados negros indican celulas LHK2 como control negativo, los triangulos negros indican celulas LHK2 transfectadas con SMCP1 y los clrculos negros indican celulas LHK2 transfectadas con SMCP3.

[FIG. 21] La FIG. 21 da los resultados de RT-PCR de DNAJB8 en celulas de tejido humano y celulas cancerosas cultivadas. Se uso G3PDH como control positivo.

[FIG. 22] La FIG. 22 da los resultados del analisis de citometrla de flujo de celulas ACHN, MCF7, y RenCa y los resultados de RT-PCR de DNAJB8 con respecto a SP y MP de las celulas cancerosas respectivas.

[FIG. 23] La FIG. 23 es un grafico que muestra la relacion entre el tiempo y el volumen del tumor cuando se implanto en ratas la fraccion SP de RenCa, la fraccion MP, y RenCa sin fraccionar.

[FIG. 24] La FIG. 24 a) es un mapa de una construccion plasmldica. Cada secuencia simulada, de survivina, y DNAJB8 se ha insertado en el sitio de la ventana cuadrada. b) es el resultado de transferencia de Western de un sobrenadante de cultivo de celulas que tienen el plasmido de a) introducido en las mismas.

[FIG. 25] La FIG. 25 es un grafico que muestra la relacion entre el tiempo y el volumen del tumor implantado en ratones que tienen vacunas plasmldicas administradas a los mismos. El circulo indica el resultado de un raton al que sea administrado PBS en lugar de la vacuna (control negativo), los cuadrados indican un raton al que se ha administrado un plasmido con nada insertado en el mismo, los triangulos indican un raton al que se ha administrado

un plasmido con survivina insertada en el mismo, y las barras verticales indican un raton al que se ha administrado

plasmido con DNAJB8 insertado en el mismo.

[FIG. 26] La FIG. 26 a) da graficos que muestran el cambio en la fluorescencia del anticuerpo contra HLA-A24 cuando se expone a cada peptido, y b) es un grafico que muestra la intensidad de fluorescencia media.

[FIG. 27] La FIG. 27 es un diagrama que muestra el cambio en la fraccion SP en celulas ACHN transfectadas de

forma simulada y celulas ACHN en que se expreso de forma forzada DNAJB8.

[FIG. 28] La FIG. 28 da los resultados de rT-PCR de or7c1 en celulas de tejido maduro humano, celulas de tejido fetal, y celulas cancerosas cultivadas. Se uso G3PDH como control positivo.

[FIG. 29] La FIG. 29 da imagenes de la morfologla de celulas Sw480 transfectadas de forma simulada, celulas Sw480 que expresan de forma constitutiva or7c1, y celulas Sw480 que tienen or7c1 inactivado por ARNip observado por un microscopio de contraste de fase, y un diagrama que muestra los resultados de RT-PCR con respecto a or7c1 de las celulas anteriores. Se uso G3PDH como control positivo para RT-PCR.

[FIG. 30] La FIG. 30 es un diagrama que muestra los resultados de analisis de citometrla de flujo con respecto a la fraccion SP de celulas Sw480 de tipo silvestre y celulas Sw480 que tienen or7c1 inactivado por ARNip.

[FIG. 31] La FIG. 31 da graficos que muestran el cambio en el tiempo en el volumen del tumor cuando se implanto a los ratones celulas Sw480 transfectadas de forma simulada y celulas Sw480 que expresan de forma constitutiva or7c1, y un grafico que muestra el cambio en el tiempo en el volumen del tumor cuando se implanto a los ratones

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celulas que tenlan or7c1 inactivado por ARNip y celulas que emplean ARNip negativo.

[FIG. 32] La FIG. 32 da graficos que muestran el cambio en la fluorescencia del anticuerpo contra HLA-A24 cuando se expone a cada peptido.

[FIG. 33] La FIG. 33 es un diagrama que muestra los resultados del ensayo ELISPOT usando peptidos para los que se observo union en el Ejemplo experimental 32.

[FIG. 34] La FIG. 34 es un grafico que muestra la relacion entre la relacion E/T y la tasa de eliminacion en un ensayo de liberacion de 51Cr.

Mejor modo para realizar la invencion

La presente invencion se explica en detalle a continuacion.

El marcador molecular de la presente invencion es un marcador molecular para detectar celulas madre cancerosas en una poblacion celular como diana de deteccion, detectandose el marcador molecular en celulas madre cancerosas contenidas en la diana de deteccion, pero no detectandose en celulas normales o celulas cancerosas diferentes a las celulas madre cancerosas. Por lo tanto, se usa tlpicamente para detectar celulas madre cancerosas a partir de una poblacion de celulas cancerosas. Ademas, por ejemplo, cuando se recoge una poblacion arbitraria de celulas como diana de deteccion, las celulas normales a veces estan mezcladas en y se convierte en una poblacion celular en que estan mezcladas las celulas madre cancerosas, celulas cancerosas diferentes a celulas madre cancerosas, y celulas normales, e incluso en dicho caso pueden detectarse correctamente las celulas madre cancerosas.

Las "celulas madre cancerosas" mencionadas en la presente invencion son celulas que, entre las celulas cancerosas, tienen propiedades de celulas madre. Las celulas madre son celulas que mantienen el potencial de diferenciacion despues de la division celular. Cuando las celulas madre cancerosas se tinen con un colorante fluorescente Hoechst (Hoechst33342) y se someten a deteccion por citometrla de flujo usando un laser UV (longitud de onda de aproximadamente 350 nm) como luz de excitacion, se concentran en una fraccion de poblacion lateral (SP). La fraccion SP mencionada aqul indica una fraccion que no se tine por el colorante fluorescente Hoechst, como resultado de que el colorante se elimina de la celula mediante un transportador ABC, etc., en contraste con una fraccion de poblacion principal (MP) que se tine por el colorante.

Las "celulas normales" mencionadas en la presente invencion significan celulas que tienen funcion normal en la actividad de un organismo o tejido vivo. Las celulas normales pueden contener celulas madre somaticas, pero son preferiblemente celulas maduras.

El marcador molecular de la presente invencion se detecta preferiblemente en comun en celulas madre cancerosas de una pluralidad de tipos de cancer, y puede usarse como marcador unico en una pluralidad de tipos de cancer. Se expresa en comun en celulas madre cancerosas de una pluralidad de tipos de cancer derivados de celulas o tejido de, por ejemplo, corazon, cerebro, placenta, pulmon, hlgado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testlculo, ovario, intestino delgado, leucocitos, colon, estomago, medula osea, intestino grueso, celulas mononucleares de sangre periferica, etc., y, por lo tanto, puede detectarse.

Ademas, el marcador molecular de la presente invencion no se detecta en celulas cancerosas diferentes a celulas madre cancerosas o en celulas normales. Preferiblemente, no se detecta en celulas cancerosas diferentes a celulas madre cancerosas o en celulas normales en al menos uno de, por ejemplo, corazon, cerebro, placenta, pulmon, hlgado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testlculo, ovario, intestino delgado, leucocitos, colon, estomago, medula osea, intestino grueso, y celulas mononucleares de sangre periferica.

El marcador molecular de la presente invencion puede expresarse o detectarse en celulas madre cancerosas, pero no puede expresarse o detectarse en celulas normales, y, por lo tanto, es posible detectar celulas madre cancerosas en una poblacion celular recogida de forma arbitraria de celulas o tejido que contienen celulas madre cancerosas.

Para usarlo como marcador molecular versatil, es preferible usarlo como marcador unico en una pluralidad de tipos de cancer, y tlpicamente no se detectan celulas normales de al menos dos tipos de celulas o tejido de corazon, cerebro, placenta, pulmon, hlgado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testlculo, ovario, intestino delgado, leucocitos, colon, estomago, medula osea, intestino grueso, celulas mononucleares de sangre periferica, etc., y no se detecta preferiblemente en al menos tres de los mismos. Muy preferiblemente no se detecta en celulas normales de todos los tipos de celulas o tejido.

La "expresion genica" mencionada en la presente memoria descriptiva significa una serie de reacciones biologicas con la transcripcion genica como punto de partida, y el "producto de expresion" significa una molecula tal como, por ejemplo, ARNm o polipeptido endogeno, generada por esta serie de reacciones biologicas.

Ademas, "que se expresa" mencionado en la presente memoria descriptiva significa que un producto de expresion puede identificarse por un metodo conocido para un experto en la materia, tal como, por ejemplo, RT-PCR, hibridacion in situ, inmunoensayo, o un metodo cromatografico. Ademas, "que no se detecta" significa que no se

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identifica producto de expresion por los metodos mencionados anteriormente para identificar un producto de expresion. Ademas, incluso si existe una senal detectada por un metodo de deteccion que tiene muy alta sensibilidad tal como, por ejemplo, RT-PCR, cuando hay una gran diferencia en las intensidades de senal, o cuando esta por debajo del nivel de deteccion en un metodo de deteccion tal como un inmunoensayo que tiene suficiente sensibilidad desde el punto de vista de la viabilidad en la realizacion de la presente invencion, se incluye en la definicion "que no se detecta" en la presente memoria descriptiva.

Un producto de expresion de un gen detectado por la presente invencion es preferiblemente un producto de expresion de un gen que tiene una secuencia conocida, pero puede ser un homologo de la misma. Es preferiblemente un producto de expresion de un gen que tiene una de las siguientes secuencias de ARNm o ADNc.

Sox2: N.° de acceso del gen NM_003106 Smcp: N.° de acceso del gen NM_030663 Intsi: N.° de acceso del gen NM_001080453 Kox12: N.° de acceso del gen NM_152907 Mdfl: N.° de acceso del gen NM_005586 FLJ13464: N.° de acceso del gen AK023526 667J232: N.° de acceso del gen AL833225 Surf6: N.° de acceso del gen NM_006753 Pcdh19: N.° de acceso del gen NM_001105243 Dchs2: N.° de acceso del gen NM_017639 Pcdh21: N.° de acceso del gen NM_033100 Gal3st1: N.° de acceso del gen NM_004861 Raslllb: N.° de acceso del gen NM_023940 Hes6: N.° de acceso del gen NM_018645 Znf415: N.° de acceso del gen NM_018355 Nkx2-5: N.° de acceso del gen NM_004387 Pamci: N.° de acceso del gen NM_005447 Pnmt: N.° de acceso del gen NM_002686 Scgb3a1: N.° de acceso del gen NM_052863 Or7c1: N.° de acceso del gen NM_198944 Dnajb8: N.° de acceso del gen NM_153330

La diana de determinacion en la presente invencion es preferiblemente un tejido humano, derivado de ser humano, y/o celulas derivadas de ser humano, pero puede ser un animal diferente a un ser humano (por ejemplo, roedores tales como raton, rata, cobaya o hamster, primates tales como chimpances, artiodactilos tales como ganado bovino, cabra, u oveja, perisodactilos tales como caballos, conejo, perro, gato, etc.), dicho tejido derivado de animal, y/o dichas celulas derivadas de animal.

Con respecto a la determinacion, cuando se detecta el marcador molecular de la presente invencion, se determina que hay celulas madre cancerosas, y la diana de determinacion puede contener celulas normales y/o celulas cancerosas diferentes a celulas madre cancerosas. Desde el punto de vista de la capacidad de utilizarse como marcador unico en una pluralidad de tipos de cancer, la determinacion se realiza detectando preferiblemente productos de expresion de Sox2, Smcp, Ints 1, Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Rasl11b, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, Scgb3a1, Or7c1, y Dnajb8, y muy preferiblemente un producto de expresion de Sox2.

Cuando el marcador molecular de la presente invencion es ARNm, se usa un reactivo que se une especlficamente a ARNm tal como una sonda o un cebador para la deteccion del mismo. Desde el punto de vista del nivel de sensibilidad de deteccion o simplicidad de funcionamiento, se detecta por un metodo de RT-PCR.

Cuando el marcador molecular de la presente invencion es un polipeptido endogeno, se usa un reactivo que se une especlficamente a un peptido tal como un anticuerpo o un ligando para la deteccion del mismo. Por ejemplo, con respecto a un anticuerpo, puede usarse un anticuerpo policlonal y/o un anticuerpo monoclonal. Desde el punto de vista de una reaccion no especlfica que es inferior, es preferible usar un anticuerpo monoclonal.

La determinacion puede realizarse in vivo o in vitro. "Determinacion in vitro" mencionado en la presente memoria descriptiva significa determinacion que se realiza despues de que se haya cultivado tejido o celulas recogidas de un organismo vivo en un entorno fuera de un organismo vivo, tal como, por ejemplo, un llquido de cultivo. En contraste con ello, "determinacion in vivo" significa determinacion que se realiza directamente dentro de un organismo vivo o, despues de recoger tejido o celulas de un organismo vivo, determinacion que se realiza inmediatamente o despues de la inmovilizacion. La recogida de tejido o celulas se realiza por, aunque sin limitation, por ejemplo, incision, succion de celulas, recogida de sangre, recogida de orina, etc.

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Cuando la determination se realiza in vivo, puede emplearse un metodo de detection in vivo conocido para los expertos en la materia. La determinacion in vivo puede realizarse por un metodo de deteccion conocido tal como un ensayo de sangre, hibridacion in situ, PCR in situ, o tincion inmunohistoqulmica.

Cuando la determinacion se realiza in vitro, puede realizarse por, aunque sin limitation, por ejemplo, un metodo de deteccion in vitro conocido para los expertos en la materia tal como tincion inmunohistoqulmica o RT-PCR. Cuando se realiza RT-PCR, la cantidad de ciclos es preferiblemente 30 a 35 ciclos. La determinacion en tejido tumoral despues de cultivar el tejido, tambien se incluye en determinacion in vitro.

Como el marcador molecular de la presente invention se expresa especlficamente en celulas madre cancerosas, se espera que la cantidad detectada tenga una correlation con la cantidad de celulas madre cancerosas. Por lo tanto, antes y despues de administrar un compuesto candidato a una diana, si la cantidad del marcador molecular de la presente invencion detectada ha disminuido, puede esperarse que la cantidad de celulas madre cancerosas haya disminuido. Es decir, comparando la cantidad de marcador molecular detectada antes de la administration y la de despues, es posible detectar compuestos que son candidatos para un agente terapeutico para celulas madre cancerosas. Por lo tanto, dicho metodo de deteccion tambien se incluye en la presente invencion.

Ademas, la presente invencion incluye un kit que contiene un reactivo para detectar el marcador molecular. El kit contiene, por ejemplo, para detectar ARNm, un reactivo que detecta especlficamente ARNm, tal como una sonda o un cebador y, para detectar polipeptido, un reactivo que detecta especlficamente polipeptido, tal como un ligando o un anticuerpo. El kit contiene al menos uno de los reactivos mencionados anteriormente. El kit puede contener un reactivo adjunto adecuado para la forma de aplicacion, tal como, por ejemplo, un tampon de reaction o un promotor de reaccion.

Desde el punto de vista de un unico kit que se utiliza en una pluralidad de tipos de cancer, preferiblemente contiene un reactivo que detecta un producto genico de la secuencia genica Sox2, Smcp, Intsi, Kox12, Mdf1, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Raslllb, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, Scgb3a1, Or7c1, o Dnajb8, y muy preferiblemente Sox2.

La "sonda y/o cebador que tiene una secuencia de nucleotidos complementaria a un gen" mencionada en la presente invencion es ADN o ARN que tiene una secuencia complementaria para que se una especlficamente a una secuencia parcial de la secuencia genica, y puede estar opcionalmente marcado con, por ejemplo, un marcador fluorescente o un marcador de radioisotopo.

Tambien se incluye en la presente invencion un metodo para determinar si una diana de determinacion es un cancer o no detectando celulas madre cancerosas usando el kit mencionado anteriormente.

Puede usarse un polipeptido que funciona como un marcador molecular de la presente invencion como antlgeno para inhibir la funcion de celulas madre cancerosas o eliminarlas. Estos polipeptidos pueden tener un sitio funcional tal como, por ejemplo, un sitio de reconocimiento de anticuerpo o un sitio de union a protelna, que puede tener una longitud de, por ejemplo, 9 a 11 aminoacidos. En un caso en que aparece un sitio funcional despues de alguna modification o transformation, tal como, por ejemplo, un caso en que se reconoce una estructura tridimensional proteica por un anticuerpo, un caso en que se reconoce un multlmero por un anticuerpo, o un caso en que se forma un sitio de reconocimiento de anticuerpo por la union de un grupo de modificacion, los polipeptidos tambien pueden tener esta estructura de sitio funcional. Estos polipeptidos se obtienen preferiblemente de productos de expresion de genes seleccionados del grupo que consiste en Sox2, Smcp, Intsi, Kox12, Mdfl, FLJ13464, 667J232, Surf6, Pcdh19, Dchs2, Pcdh21, Gal3st1, Rasl11b, Hes6, Znf415, Nkx2-5, Pamci, Pnmt, Scgb3a1, Or7c1, y Dnajb8.

Ejemplos del metodo para eliminar celulas madre cancerosas usando estos polipeptidos como antlgeno incluyen, aunque sin limitacion, un metodo que implica induction de CTL, un metodo en que se causa una inmunorreaccion utilizando un anticuerpo especlfico de polipeptido, y un metodo en que se inhibe o antagoniza la funcion por union a un polipeptido.

Cuando un epltopo derivado de un producto de expresion del gen de la presente invencion se une a un anticuerpo que reacciona especlficamente con el mismo, el anticuerpo unido se convierte en una senal para activar as! una inmunorreaccion. Como el propio epltopo es un marcador molecular o una estructura parcial del mismo que se expresa especlficamente en celulas madre cancerosas, esto sugiere fuertemente que la union de un anticuerpo especlfico posibilita una cascada inmunitaria que reconoce especlficamente celulas madre cancerosas a activarse. Ademas, tambien es posible usar un anticuerpo conjugado con un farmaco que ataca celulas cancerosas, etc. Posibilitan la aplicacion a la terapia llamada de proyectil en que se abordan celulas madre cancerosas.

Por lo tanto, un anticuerpo usado en el metodo mencionado anteriormente y una composition farmaceutica que contiene un polipeptido y/o un anticuerpo tambien se incluyen en la presente invencion.

Ejemplos de la composicion farmaceutica incluyen, aunque sin limitacion una vacuna contra el cancer y un agente antineoplasico. Estas composiciones pueden contener, ademas del polipeptido y/o anticuerpo de la presente

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invention, por ejemplo, un farmaco que tiene actividad antitumoral, un adyuvante, un vehlcuio farmaceuticamente aceptable, etc., segun lo necesario.

Ademas, un acido nucleico que codifica el polipeptido mencionado anteriormente y una composition farmaceutica que contiene el acido nucleico tambien se incluyen en la presente invencion. Ejemplos de la composicion farmaceutica que contiene el acido nucleico incluyen, aunque sin limitation, una vacuna de ADN. Estas composiciones pueden contener ademas del acido nucleico de la presente invencion, por ejemplo, un farmaco que tiene actividad antitumoral, un adyuvante, un vehlculo farmaceuticamente aceptable, etc., segun lo necesario.

Entre los fragmentos polipeptldicos que son el marcador molecular de la presente invencion, estan aquellos que se presentan como antlgeno por una protelna llamada complejo principal de histocompatibilidad (molecula MHC). Las celulas T citotoxicas (CTL) reconocen un antlgeno especlfico unido a una molecula MHC clase I y causan una inmunorreaccion que induce apoptosis de las celulas presentadoras de antlgeno.

Como resultado de la investigation por los presentes inventores, se ha descubierto que, entre los polipeptidos derivados del marcador molecular de la presente invencion, una parte de los polipeptidos muestra una alta afinidad por HLA-A24. Que es una de las moleculas MHC humanas, y se ha descubierto adicionalmente que algunos de ellos tienen la capacidad de inducir CTL y conducir a las celulas a apoptosis. Este resultado sugiere fuertemente que el polipeptido de la presente invencion puede dar memoria inmunologica con respecto a celulas madre cancerosas. Esto muestra sustancialmente que el polipeptido de la presente invencion puede aplicarse a un metodo para tratar especlficamente celulas madre cancerosas.

Se sugiere que, como el marcador molecular de la presente invencion se expresa especlficamente en celulas madre cancerosas, alguna parte del polipeptido se presenta como antlgeno mediante moleculas MHC. La detection de polipeptidos (peptidos epitopicos) que se presentan como antlgeno mediante moleculas MHC es util en el tratamiento del cancer. Por lo tanto, dicho metodo de deteccion tambien se incluye en la presente invencion.

La deteccion puede emplear un metodo de mapeo de epltopos normal. Por ejemplo, despues de preparar una pluralidad de tipos de peptido fragmentado que tiene una longitud apropiada a partir de un polipeptido diana, el polipeptido diana y/o el peptido fragmentado, las celulas presentadoras de antlgeno, y las celulas T se cultivan juntos para sensibilizar de ese modo las celulas T. Las celulas T sensibilizadas, las celulas presentadoras de antlgeno, y el peptido fragmentado despues se cultivan juntos, reestimulando de ese modo las celulas T. El grado de activation de las celulas T entonces se mide, se seleccionan los peptidos que tienen un alto grado de activation y se determina una secuencia epitopica. En este caso, el grado de activacion puede determinarse segun lo apropiado por un metodo conocido para los expertos en la materia tal como medicion de la actividad citotoxica o cantidad de citoquina producida. Ademas, especificando el tipo HLA de las celulas T, se selecciona un peptido antigenico que esta restringido por el tipo especlfico de HLA.

El ADN que funciona como marcador molecular de la presente invencion es ADN que se expresa especlficamente en celulas madre cancerosas, y se cree que suprimiendo la expresion del mismo puede suprimirse la funcion de las celulas madre cancerosas. Por lo tanto, un acido nucleico para suprimir la expresion de ADN que funciona como marcador molecular de la presente invencion tambien se incluye en la presente invencion.

Ejemplos del metodo para suprimir la expresion incluyen, aunque sin limitacion, iARN o expresion de un represor. Por lo tanto, ejemplos de acidos nucleicos para suprimir la expresion de ADN incluyen, aunque sin limitacion, ARNip, ARNhc, y ADNhc. El acido nucleico puede tener cualquier longitud siempre que sea una cantidad suficiente de bases para suprimir la expresion de aDn.

Diferente al ADN y el ARN, el acido nucleico puede incluir un analogo de acido nucleico, pero desde el punto de vista de la versatilidad es preferiblemente ADN y/o ARN.

Se sugiere que existe la posibilidad de que las celulas madre cancerosas, se vean atacadas de forma especlfica y/o eficaz por la supresion de la expresion del ADN que funciona como marcador molecular de la presente invencion. Es decir, se sugiere que el acido nucleico mencionado anteriormente puede aplicarse para terapia de transferencia genica. Por lo tanto, una composicion farmaceutica que contiene el acido nucleico de la presente invencion tambien se incluye en la presente invencion.

La composicion farmaceutica mencionada anteriormente puede usarse como, por ejemplo, un agente terapeutico contra el cancer tal como un agente antineoplasico, un inhibidor de la metastasis, o una vacuna contra el cancer tal como una vacuna de ADN, pero no se limita a ello. Estas composiciones farmaceuticas pueden contener, ademas del acido nucleico de la presente invencion, por ejemplo, un farmaco que tiene actividad antitumoral, un adyuvante, un vehlculo farmaceuticamente aceptable, etc., segun lo necesario.

Ademas, un metodo de supresion de la expresion del ADN que funciona como marcador molecular de la presente invencion en celulas madre cancerosas usando el acido nucleico de la presente invencion tambien se incluye en la presente invencion.

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Los siguientes ejemplos experimentales son para explicar la presente invencion mas especlficamente, pero no limitan el alcance de la presente invencion. Un experto en la materia que tiene conocimientos y habilidades habituales puede modificar en una diversidad de formas las realizaciones mostradas en los siguientes Ejemplos experimentales siempre que las modificaciones no se alejen del esplritu de la presente invencion, y dichas realizaciones modificadas tambien se incluyen en la presente invencion.

[Ejemplo 1]

Ejemplo experimental 1: aislamiento de la fraccion SP de celulas cancerosas

a) Preparacion de reactivo

Se preparo un medio DMEM que contenla antisuero bovino fetal (FCS) al 5 %, y se calento hasta 37 °C. Se preparo Verapamil 50 mM, y se diluyo a 5 mM con FCS al 5 % + DMEM. Se ajusto Hoechst 33342 a 250 pg/ml con FCS al 5 % + DMEM. Se ajusto DNasal a 1 mg/ml con DDW, y se sometio a esterilizacion por filtracion usando un filtro de 0,2 pm.

b) Preparacion de celulas para citometria de flujo (FACS)

Se suspendieron las celulas en 4 ml de FCS al 5 % + DMEM, y se conto la cantidad de celulas. Ademas, se ajusto la concentracion de celulas a 1 x 106 recuentos/ml anadiendo FCS al 5 % + DMEM, y se muestreo 1 ml en un tubo Falcon para verapamil (+). Las celulas verapamil (+) y las celulas restantes (para verapamil (-)) se incubaron en un bano de agua a 37 °C durante 10 minutos. Despues de la incubacion, se anadio una solucion de verapamil a verapamil (+) de modo que la concentracion final de verapamil llegara a ser de 50 a 75 pM y despues se anadio una solucion de Hoechst 33342 a verapamil (+) y verapamil (-) de modo que la concentracion final de Hoechst 33342 llegara a ser de 2,5 pM a 5,0 pM.

Las celulas se incubaron a 37 °C durante 90 minutos con agitacion, inmediatamente seguido por enfriamiento en hielo. La centrifugacion se realizo a 1100 hasta 1500 r.p.m. a 4 °C durante 3 minutos y se retiro el sobrenadante. Las celulas se suspendieron con 1 x PBS + FCS al 5 %, y la suspension e transfirio a un tubo FACS enfriado en hielo. La centrifugacion se realizo de nuevo a 1100 hasta 1500 r.p.m. a 4 °C durante 3 minutos, se retiro el sobrenadante, y las celulas se suspendieron con 1 x PBS + FCS al 5 %. La centrifugacion se realizo una vez mas a 1100 hasta 1500 r.p.m. a 4 °C durante 3 minutos, se retiro el sobrenadante, y las celulas se suspendieron con 500 pl de 1 x PBS + FCS al 5 % al que se anadio EDTA a una concentracion final de 2 mM. Se anadieron 0,5 pl de solucion de DNasal, se realizo el pipeteo, y se paso a traves de un filtro para FACS. Se anadieron 0,5 pl de 1 mg/ml de yoduro de propidio (PI), y se realizo FACS a un caudal de 1000 hasta 2000 recuentos/s.

c) Citometria de flujo (FACS)

El citometro de flujo usado fue un BD FACS Aria II edicion especial (marca registrada) (Becton, Dickinson and Company). La operacion FACS se realizo de acuerdo con el manual de instrucciones. En primer lugar, se confirmo si podlan detectarse o no celulas de la fraccion SP pasando celulas de verapamil (-); despues de la confirmacion, se pasaron celulas verapamil (+) sincronizando la fraccion SP, confirmando de ese modo si desapareclan las celulas de la fraccion SP o no. Si desapareclan, se determino que las celulas de la fraccion eran celulas de la fraccion SP, y entonces se aislaron las celulas de la fraccion. Las celulas aisladas se sometieron a centrifugacion a 4 °C y 1500 r.p.m. durante 15 minutos, retirando el sobrenadante, y se suspendieron con 100 a 200 pl de 1 x PBS, y se conto la cantidad de celulas.

A partir de los resultados, se detectaron las celulas de la fraccion SP en adenocarcinoma A549 y LHK2 y cancer de celulas escamosas Lc817. Los resultados se muestran en la FIG. 1.

Analisis

La deteccion de las celulas de la fraccion SP en adenocarcinoma y cancer de celulas escamosas que son de un tipo en que aparece facilmente metastasis entre canceres pulmonares, coincide con el hallazgo de que las celulas madre cancerosas son la causa principal de metastasis.

[Ejemplo 2]

Ejemplo experimental 2: experimento de tumorigenicidad

La tumorigenicidad se confirmo inoculando ratones con celulas SP fraccionadas y celulas MP usando cada una de las llneas celulares LHK2, MCF7, y SW480 por el mismo metodo que en el Ejemplo experimental 1. Se suspendio la misma cantidad de celulas SP y celulas MP en 100 pl de 1 x PBS en hielo y se mezclaron con 100 pl de Matrigel. Se inocularon ratones NOD/SCID (obtenido de Oriental Kobo Co., Ltd.) por via subcutanea en la piel dorsal con 100 pl de un llquido de mezcla de celulas-Matrigel a 1500 celulas por sitio de cada una de celulas SP y MP; cuando

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empezo a formarse un tumor, se midieron las longitudes del diametro mas largo y el diametro mas corto, y se calculo el volumen aproximado a un esferoide y se comparo. Los resultados se muestran en la FIG. 2.

A partir de los resultados, se descubrio que, en comparacion con las celulas MP, que no formaban un tumor en ni siquiera un raton cuando se le implantaba 150 celulas, las celulas SP fraccionadas de LHK2 tenlan tumorigenicidad mucho mayor de modo que 2 de 5 ratones formaron un tumor cuando se les implantaba solamente 15 celulas y los 5 ratones formaron un tumor cuando se les implantaban 150 celulas. Esto coincidio con el hallazgo de que las celulas madre cancerosas son el factor principal en la formacion de tumores y las celulas madre cancerosas se concentran en celulas de la fraccion SP. (Referencia Kondo T, Setoguchi T, Taga T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 20: 781-786, 2004.)

[Ejemplo 3]

Ejemplo experimental 3: confirmacion de la expresion por microserie de ADN

a) Extraccion de ARNm

Se centrifugaron celulas SP y celulas MP aisladas por el mismo metodo que en el Ejemplo experimental 1 a temperatura ambiente a 1500 r.p.m. durante 5 minutos, y se retiro el sobrenadante. La extraccion de ARNm se realizo usando un kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del kit.

b) Amplification y marcaje de ARNm

El ARNm extraldo se sometio a amplificacion de ARNm usando un kit de amplificacion de ARN obtenido de Sigma Genosys, y el ARNm amplificado se sometio a marcaje usando un kit de marcaje de ARNm obtenido de Sigma Genosys de modo que el material extraldo de la fraccion SP se marco con Cy5 y el material extraldo de la fraccion MP se marco con Cy3, y se intercambiaron los colorantes, y lo extraldo de la fraccion SP se marco con Cy3 y lo extraldo de la fraccion MP se marco con Cy5.

c) Microserie

El ARNm derivado de la fraccion SP y el ARNm derivado de la fraccion MP, que se hablan marcado con diferentes colorantes, se mezclaron, y se analizaron para la expresion de ARNm usando un chip de ADN (Panorama (marca registrada) Micro Array, Human) obtenido de Sigma Genosys hibridado de acuerdo con el protocolo del kit de la microserie. A partir de los resultados, se confirmo que el gen Sox2, el gen Smcp, el gen Ints1, el gen Kox12, el gen Mdf1, el gen FLJ13464, el gen 667J232, el gen Surf6, el gen Pcdh19, el gen Dchs2, el gen Pcdh21, el gen Gal3st1, el gen Raslllb, el gen Hes6, el gen Znf415, el gen Nkx2-5, el gen Pamci, el gen Pnmt, el gen Scgb3a1, el gen Or7c1, y Dnajb8 se expresaban en la fraccion SP, pero no se expresaban en la fraccion MP o a un nivel insignificante, si acaso.

[Ejemplo 4]

Ejemplo experimental 4: expresion de Sox2

a) Cebador usado en RT-PCR

Se muestra una lista de cebadores usados en RT-PCR en los Ejemplos experimentales en la Tabla 1

[Tabla 1]

: Cebador directo Cebador inverso

Sox2: acttttgtcggagacggaga gttcatgtgcgcgtaactgt

Smcp: tgtgtgaccagacaaaacacag gttgggctcagactccatgt

Ints1: tgtccagcatgagcaaactc aaaccgtagcagggtcacac

Kox12 (Znf19): atgtggaaaagcaccaggac tcctctggtgccgaattaac

Mdf1: caggaagactgctgtgtcca atgcagatctccaggcagtc

FLJ13464: tgcataacaccaaaggtcca gacctggccaatacaatgct

667J232: aggacatgcctgggtgatag cccaatcctgagttcttcca

Surf 6: cgactgcatgagaagatcca gaggaggttggtccacttca

Pcdh19: cccaaggtcaacagcgttat cacaccaggggactctttgt

Dchs2: gaaggagatcaaggggaagg atcaaagggggtggaaaaac

Pcdh21: atgcagaggaacccaacaac tgagtaaggctgtggtgctg

Gal3st1: ggcctgcttcaacatcatct gctgttgtcatagcccaggt

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: Cebador directo Cebador inverso

Raslllb: tgtggtgatcgttttctcca agggaggttcttcgcttctc

Hes6: agctcctgaaccatctgctc agcaggagcctgactcagtt

Znf415: cttgcaaggcattggagaat taggcttgaatgcacactga

Nkx2-5: acgcccttctcagtcaaaga ttttcggctctagggtcctt

Pamci (Rassf9): tgatcatttcccaggaccat cccttccgcatcttcattta

Pnmt: gaatgctggcaggataagga cttgtagccactacgcacca

Scgb3a1: ctccgctgctgctttcttag ccagctcagccacacactt

Or7c1 (Tpcr86): agctctgtggactgctggtt ggacgccagttgcaaagtat

Dnajb8: ccgacaagaaccctgacaat aggtggatgagaaggtggtg

G3PDH: accacagtccatgccatcac tccaccaccctgttgctgta

b) Expresion de Sox2 en celulas normales

Para confirmar adicionalmente la utilidad de Sox2, que se habia confirmado en el Ejemplo experimental 3c), se examino la expresion del mismo en celulas normales adultas humanas. Se realizo RT-PCR usando un panel de ARNm derivado de tejido normal adulto humano obtenido de Clontech. El panel de ARNm incluye ARNm derivado de celula o tejido normal adulto de cada uno de corazon, cerebro, placenta, pulmon, higado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testiculo, ovario, intestino delgado, intestino grueso, y celulas mononucleares de sangre periferica.

En primer lugar, se sintetizo el ADNc a partir del ARNm usando una enzima de transcripcion inversa Superscript (marca registrada) III (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del kit.

El ADNc asi sintetizado se sometio a amplificacion de ADNc de Sox2 por RT-PCR usando el cebador directo y el cebador inverso (vease la Tabla 1). Como control, se amplifico el ADNc de G3PDH por el mismo metodo. Las condiciones de PCR se muestran en la Tabla 2.

: Tabla 2

CD o o: 2 min -

CD o o: 15 s

58 °C a 60 °C: 30 s 30 a 35 ciclos

72 °C: 30 s

72 °C: 2 min -

El producto de amplificacion asi amplificado se sometio a electroforesis a 100 V durante 25 minutos usando gel de agarosa al 1,5 %. Los resultados se muestran en la FIG. 3a).

c) Expresion de Sox2 en linea celular cancerosas

La linea celular de cancer pulmonar LHK2, las lineas celulares de cancer colorrectal SW480 y KM12LM, y la linea celular de cancer de mama MCF7 se separaron en la fraccion SP y la fraccion MP del mismo modo que en el Ejemplo experimental 1. Se extrajo el ARNm de la fraccion SP y la fraccion MP de lo anterior del mismo modo en el Ejemplo experimental 3a) y el ADNc se sintetizo del mismo modo que en el Ejemplo experimental 4b). Se amplifico el ADNc de Sox2 usando un cebador de Sox2 (vease la Tabla 1) en las condiciones de la Tabla 2, y el producto de amplificacion se sometio a electroforesis a 100 V durante 25 minutos usando gel de agarosa al 1,5 %. Los resultados se muestran en la FIG. 3b).

Analisis

No se observo de expresion de Sox2 en tejido normal adulto humano. Esto sugiere que Sox2 es un marcador que no reconoce celulas normales en el tejido, y tambien sugiere la posibilidad de tratar especificamente celulas tumorales mediante el uso de Sox2. Como resultado del examen de las celulas de las fracciones SP y MP de las 4 lineas LHK2, SW480, KM12LM, y MCF7, se observo fuerte expresion en las celulas de la fraccion SP para todas las lineas, pero apenas hubo algo de expresion en las celulas de la fraccion MP lo que sugiere la posibilidad de usar Sox2 como marcador que es especifico para celulas de la fraccion SP, es decir, celulas madre cancerosas.

[Ejemplo 5]

Ejemplo experimental 5: expresion de Smcp y FLJ13464

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Para confirmar adicionalmente la utilidad de Smcp y FLJ13464, que se confirmaron en el Ejemplo experimental 3c), se examino la expresion de los mismos en tejido normal adulto humano y otras celulas cancerosas. El tejido normal adulto humano empleado en este experimento, se obtuvo de un panel de ARNm de tejido normal adulto humano obtenido de Clontech que contenla corazon, cerebro, placenta, pulmon, hlgado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testlculo, ovario, intestino delgado, leucocitos, colon, estomago, y medula osea, y las celulas cancerosas empleadas fueron la llnea celular de cancer pulmonar LHK2, las llneas celulares de cancer colorrectal grande SW480 y KM12LM, la llnea celular de cancer de mama MCF7, y la llnea celular de histiocitoma fibroso maligno MFH03.

Se sintetizo el ADNc a partir del ARNm de cada celula y tejido del mismo modo que en Ejemplo experimental 4b). El ADNc as! sintetizado se sometio a amplificacion de ADNc de Smcp y FLJ13464 usando el cebador directo y el cebador inverso de Smcp (vease la Tabla 1) y el cebador directo y el cebador inverso de FLJ13464 (vease la Tabla 1) en las condiciones de PCR mostradas en la Tabla 2. Como control, se amplifico el ADNc de G3PDH por el mismo metodo que el anterior. Los productos de amplificacion as! amplificados se sometieron a electroforesis a 100 V durante 25 minutos usando gel de agarosa al 1,5 %. Los resultados se muestran en la FIG. 4a).

Del mismo modo que en el Ejemplo experimental 4, se sintetizo el ADNc de las celulas de la fraccion SP y MP de SW480, KM12, LHK2, y MCF7, se amplifico el ADNc usando un conjunto de cebadores de amplificacion de Smcp y FLJ13464, y los productos de amplificacion se sometieron a electroforesis de agarosa. Los resultados se muestran en la FIG. 4B).

Analisis

No se observo expresion de Smcp y FLJ13464 en casi todo el tejido normal adulto humano; se expreso FLJ13464 en pancreas y estomago y se expreso Smcp en testlculo en algun grado. Esto sugiere que para casi todos los tejidos Smcp y FLJ13464 son marcadores que no reconocen celulas normales en tejido, lo que sugiere la posibilidad de un tratamiento especlfico de celulas tumorales en tejido donde no se observa expresion en celulas normales. Ademas, del mismo modo que para los resultados del Ejemplo experimental 4, como Smcp se expresaba especlficamente en las celulas de la fraccion SP de SW480, KM12, LHK2, y MCF7, y FLJ13464 se expresaba especlficamente en las celulas de la fraccion SP de MCF7, los resultados demuestran la posibilidad de usar Smcp y FLJ13464 como marcadores especlficos de celulas cancerosas.

[Ejemplo 6]

Ejemplo experimental 6: expresion de otros genes

Se confirmo la expresion de otros genes en celulas normales del mismo modo que en el Ejemplo experimental 5. Los resultados se muestran en la FIG. 5 como un diagrama.

[Ejemplo 7]

Ejemplo experimental 7: expresion de Sox2 en otras llneas celulares

Para examinar en detalle si se expresa Sox2 o no en llneas celulares cancerosas diferentes a las examinadas en el Ejemplo experimental 4, se confirmo la expresion de Sox2 del mismo modo que en el Ejemplo experimental 4 con respecto a 14 tipos de llneas celulares de cancer pulmonar, 3 tipos de llneas celulares de cancer de celulas renales, 1 tipo de llnea celular de cancer de prostata, y celulas HeLa que derivan de una llnea celular de cancer de cuello del utero. Se usaron celulas cerebrales fetales como control positivo, y se uso agua bidestilada como control negativo. Los resultados se muestran en la FIG. 6.

Analisis

Se confirmo la expresion de Sox2 en todas las llneas celulares cancerosas examinadas. Esto sugiere que Sox2 funciona como marcador molecular de celulas madre cancerosas para muchos mas tipos de llneas celulares cancerosas que otros marcadores moleculares de celulas madre cancerosas actualmente conocidos. Ademas, la expresion comun a una diversidad de llneas celulares sugiere que Sox2 puede llegar a ser una diana para terapia contra el cancer independientemente de la parte del organismo.

[Ejemplo 8]

Ejemplo experimental 8: expresion de Smcp en otras celulas cancerosas

Se examino en detalle si Smcp se expresa o no en otras llneas celulares cancerosas del mismo modo que en el Ejemplo experimental 5. Se confirmo la expresion de Smcp del mismo modo que en el Ejemplo experimental 5 usando 6 tipos de llneas celulares de cancer de celulas renales, 7 tipos de llneas celulares de cancer pulmonar, y 1 tipo de llnea celular de cancer de prostata como llneas celulares cancerosas. Se usaron celulas de testlculo como

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control positivo, y se usaron celulas de cancer pulmonar de raton como control negativo. Los resultados de la PCR realizada con numeros de ciclo de 35 ciclos y 40 ciclos se muestran en la FIG. 7.

Analisis

Se confirmo la expresion de Smcp en todas las llneas celulares cancerosas examinadas. Esto sugiere que, del mismo modo que para Sox2, Smcp funciona como un marcador molecular para muchos tipos de llneas celulares cancerosas que los marcadores moleculares de celulas madre cancerosas conocidos y que existe una posibilidad de su uso como diana en terapia.

[Ejemplo 9]

Ejemplo experimental 9: expresion de Ints1 en celulas normales, y otras celulas cancerosas, y llneas celulares cancerosas

a) Expresion en celulas normales y otras celulas cancerosas

Para confirmar adicionalmente la utilidad de Ints 1, que se confirmo en el Ejemplo experimental 3c), se examino la expresion en celulas normales adultas humanas y otras celulas cancerosas del mismo modo que en el Ejemplo experimental 5 usando el cebador directo y el cebador inverso de Ints1 (vease la Tabla 1). Los resultados se muestran en la FIG. 8 a).

b) Expresion en otras llneas celulares cancerosas

Se confirmo la expresion de Ints1 en otras llneas celulares cancerosas usando las mismas llneas celulares que en el Ejemplo experimental 8. Los resultados se muestran en la FIG. 8 b).

Analisis

Con respecto a celulas normales, no se confirmo la expresion de Ints1 diferente a una muy ligera expresion que se observa en el pancreas y el bazo. Este resultado sugiere que, en casi todos los tejidos, Ints1 es un marcador que no reconoce celulas normales en tejido, y existe una posibilidad de realizar terapia especlfica de celulas tumorales en tejido donde no se observaba expresion en celulas normales y tambien, en el pancreas y el bazo, donde se observo expresion, dependiendo de la sensibilidad de deteccion. Ademas, del mismo modo que en el resultado del Ejemplo experimental 4, SW480, KM12, LHK2, y MCF7 tambien, la expresion fue sustancialmente especlfica de celulas Sp, lo que sugiere que es util como marcador de celulas madre cancerosas.

Con respecto a otras llneas celulares, se confirmo la expresion para la mayorla de las llneas celulares cancerosas con pocas excepciones. Esto sugiere que Ints1 funciona como un marcador molecular para muchos mas tipos de llneas celulares cancerosas que los marcadores moleculares de celulas madre cancerosas conocidos y que existe una posibilidad de su uso como diana en terapia.

[Ejemplo 10]

Ejemplo experimental 10: tincion inmunohistoauimica de tejido de cancer pulmonar usando anticuerpo anti-SOX2

Se realizo tincion inmunohistoqulmica de tejido de cancer pulmonar usando un anticuerpo policlonal anti-SOX2 (ZYMED Inc.). Una seccion incrustada en parafina de cancer pulmonar humano fijada por una solucion de fijacion de formalina al 20 % se sometio a un tratamiento de desparafinizacion usando alcohol etllico. La seccion se sumergio en un tampon acido cltrico de 0,01 mol/l (pH 6,0) y se sometio a autoclave a 110 °C durante 5 minutos para realizar de ese modo la recuperacion del antlgeno. Se depositaron 0,5 ml de anticuerpo policlonal anti-SOX2 sobre la seccion, y la seccion se incubo a temperatura ambiente durante 1 hora. La seccion entonces se lavo con PBS-T (Tween 20 al 0,05 %/PBS, pH 7,4) tres veces. Como anticuerpo secundario, se deposito un anticuerpo anti-IgG de raton marcado con peroxidasa (Simple Stain MAX-PO, Nichirei Corporation) sobre la seccion, y la seccion se incubo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues se lavo con PBS-T tres veces. La seccion se sumergio en un llquido mixto de peroxido de hidrogeno acuoso y sustrato DAB (Simple Stain MAX-PO, Nichirei Corporation), realizando de ese modo una reaccion de color durante 1 a 2 minutos. La seccion despues se lavo con tampon de procesamiento durante 1 minuto, y se sometio a tincion nuclear con hematoxilina durante 1 a 2 minutos. Los resultados se muestran en la FIG. 9.

Analisis

La protelna antigenica SOX2 se tino de marron. Ademas de algunas de las celulas que se tinen de marron oscuro, una parte correspondiente al borde invasivo del tumor se tino ligeramente en forma de banda. Este resultado sugiere que la inmunotincion usando un anticuerpo anti-SOX2 posibilita aclarar la morfologla, la cantidad y la posicion de celulas madre cancerosas en tejido de cancer pulmonar.

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[Ejemplo 11]

Ejemplo experimental 11: tincion inmunohistoauimica de tejido de cancer de mama usando anticuerpo anti-SOX2

Tejido de cancer de mama de tipo basaloide se sometio a tincion inmunohistoquimica del mismo modo que en el Ejemplo experimental 10. Como ejemplo comparativo, tambien se realizo tincion para CK (citoqueratina), que es un marcador de celulas basales. Los resultados se muestran en la FIG. 10. Tambien se observo tincion marron de protelna antigenica SOX2 en el tejido de cancer de mama. Esto sugiere que SOX2 puede aclarar la morfologla, la cantidad y la posicion de celulas madre cancerosas tambien en cancer de mama. Es generalmente conocido que el cancer de mama de tipo basaloide tiene un mal pronostico y una alta tasa de metastasis, y se sugiere que SOX2 podrla estar implicado en el mismo.

[Ejemplo 12]

Ejemplo experimental 12: tincion inmunohistoquimica de tejido normal usando anticuerpo anti-SOX2

Se realizo tincion inmunohistoquimica de tejido normal de cerebro, pulmon, estomago, y pancreas del mismo modo que en Ejemplo experimental 10. Los resultados se muestran en la FIG. 11. Se observo una imagen tenida de oscuro del nucleo en solamente una parte muy pequena del estomago, pero no se observo expresion en los otros tejidos. Esto demuestra que SOX2 se expresa muy poco en tejido normal.

[Ejemplo 13]

Ejemplo experimental 13: cambio en la capacidad tumorigenica por expresion forzada de SOX2

Se inocularon ratones NOD/SCID de forma subcutanea en la piel dorsal de la izquierda y la derecha con 10000 celulas de cada tipo de celulas donde SOX2 se habla expresado de forma forzada (celulas LHK2-SOX2) y celulas transfectadas de forma simulada (celulas LHK2-simulado) como 100 pl de llquidos mixtos de celulas-Matrigel; cuando empezo a formarse un tumor, se midieron las longitudes del diametro mas largo y el diametro mas corto, y se calculo el volumen aproximado a un esferoide y se comparo. Los resultados se muestran en la FIG. 12.

Analisis

En tejido tumoral donde se habla expresado de forma forzada SOX2, en comparacion con el tejido tumoral donde no se habla forzado la expresion del mismo, se observo marcada tumorigenicidad. Este resultado demuestra que cuando se expresa SOX2, aumenta la capacidad tumorigenica de la celula. Se cree que este mecanismo esta relacionado con la transformacion cancerosa de celulas IPS.

[Ejemplo 14]

Ejemplo experimental 14: estudio de tasa de supervivencia de pacientes con cancer de mama SOX2-positivo

Tejido tumoral primario de cancer de mama se sometio a tincion inmunohistoquimica, y se clasificaron 201 casos de cancer de mama en 40 casos de cancer de mama SOX2-positivo y 161 casos de cancer de mama SOX2-negativo. La FIG. 13 es un grafico que muestra el cambio en el tiempo de la tasa de supervivencia en cada clasificacion. Los pacientes con cancer de mama SOX2-positivo tenian una tasa de supervivencia significativamente inferior en comparacion con los pacientes con cancer de mama SOX2-negativo.

[Ejemplo 15]

Ejemplo experimental 15: supresion de la expresion de SOX2

Se prepararon el plasmido sh-SOX2 y sh-EGFP a partir del vector RNAi-Ready pSIREN-RetroQ de acuerdo con el protocolo del vector insertando un oligonucleotido hibridado de las SEQ ID NO: 43, 44 para Sox2 y un oligonucleotido hibridado de las SEQ ID NO: 45, 46 para un control negativo como oligonucleotidos de ADNhc. Se transfecto la linea celular LHK2 con el plasmido sh-SOX2 y el plasmido sh-EGFP como control negativo y se cultivo en medio DMEM que contenia cisplatino a concentraciones de 0, 10, 30, y 100 pM a 37 °C durante 24 horas. Despues de esto, se midio la tasa de supervivencia celular por un metodo MTT. Los resultados se muestran en la FIG. 14.

Analisis

En las celulas transfectadas con sh-SOX2, la expresion del gen Sox2 estaba notablemente suprimida. Ademas, en comparacion con celulas en que no se habia suprimido la expresion del gen Sox2, las celulas en que estaba suprimida la expresion de Sox2 tenian una tasa de supervivencia significativamente inferior cuando se cultivaban en

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medio que contenla cisplatino. Esto demuestra que la supresion de la expresion del gen Sox2 potenciaba significativamente la sensibilidad de las celulas a cisplatino.

[Ejemplo 16]

Ejemplo experimental 16: ensayo de union al peptido HLA-A24 del peptido derivado de Sox2

Se muestra la secuencia de aminoacidos de Sox2 en la SEQ ID NO: 62. Se sabe que un peptido que se une a HLA- A24 tiene tirosina, triptofano, fenilalanina, o metionina como el segundo aminoacido, y el aminoacido C-terminal es leucina, isoleucina, triptofano, fenilalanina, o metionina. Entre las secuencias contenidas en la secuencia de aminoacidos de Sox2, se seleccionaron las secuencias que tienen de 9 a 11 aminoacidos que tienen este motivo de union a HLA-A24, y se sintetizaron los siguientes peptidos, un total de 13 tipos.

SOX2_1: MYNMMETEL (SEQ ID NO: 47)

SOX2_50: VWSRGQRRKM (SEQ ID NO: 48)

SOX2_58: KMAQENPKM (SEQ ID NO: 49)

SOX2_89: PFIDEAKRL (SEQ ID NO: 50)

SOX2_109: KYRPRRKTKTL (SEQ ID NO: 51)

SOX2_119: LMKKDKYTL (SEQ ID NO: 52)

SOX2_124: KYTLPGGLL (SEQ ID NO: 53)

SOX2_165: GWSNGSYSM (SEQ ID NO: 54)

SOX2_170: SYSMMQDQL (SEQ ID NO: 55)

SOX2_196: PMHRYDVSAL (SEQ ID NO: 56)

SOX2_209: SMTSSQTYM (SEQ ID NO: 57)

SOX2_216: YMNGSPTYSM (SEQ ID NO: 58)

SOX2_226: SYSQQGTPGM (SEQ ID NO: 59)

La celula T2-A24 es una llnea celular en que se ha transferido el gen de HLA-A2402 a celulas T2 linfoblastoides y se ha expresado. Se expresa un bajo nivel de molecula HLA-A24 sobre la superficie celular de esta celula, y puede detectarse por un citometro de flujo usando un anticuerpo monoclonal especlfico para HLA-A24. El nivel de expresion se cuantifica como una intensidad de fluorescencia media (MFI). Cuando se anade un peptido sintetico a esta celula en un tubo de ensayo, si el peptido anadido se une a una molecula HLA-A24, el nivel de expresion de HLA-A24 en superficie celular aumenta en relacion a la afinidad de union. Usando este sistema experimental, se analizo la afinidad de union a HLA-A24 de peptidos antigenicos de cancer derivado de SOX2 de la presente invencion.

Se cultivaron celulas T2-A24 a 26 °C durante una noche. Las celulas despues se lavaron con PBS; se anadieron a las mismas el peptido sintetico derivado de SOX2, como controles positivos, peptido de VIH (SEQ ID NO: 60), que es un peptido derivado del virus de la inmunodeficiencia humana y peptido de EBV (SEQ ID NO: 61), que es un peptido derivado del virus Epstein-Barr, y como control negativo, el peptido SL8 (SEQ ID NO: 63), que es un peptido derivado de ovalbumina, y se co-cultivaron a 96 °C durante 3 horas. Despues de co-cultivarse a una temperatura de 37 °C durante 2,5 horas adicionales, las celulas se centrifugaron, se retiro el sobrenadante, y se aislaron las celulas. Se anadio un anticuerpo anti-HLA-A24 (C7709A2.6) a las celulas aisladas, y la mezcla se dejo reposar a 4 °C durante 1 hora y despues se lavo con PBS. Como anticuerpo secundario, se anadio un anticuerpo anti-IgG + IgM de raton marcado con fluorescencia, se dejo que la mezcla reposara a 4 °C durante 30 minutos, y las celulas se fijaron anadiendo formalina al 1 %. Las celulas fijadas se sometieron a medicion de intensidad de fluorescencia FITC por un citometro de flujo (BD FACS Calibur).

Los resultados se muestran en la FIG. 15. Se determino que ocho peptidos SOX2 que mostraban intensidad de fluorescencia a al menos el mismo nivel que o cercano al de los controles positivos eran peptidos de union a HLA- A24.

[Ejemplo 17]

Ejemplo experimental 17: induccion de CTL

Se centrifugaron 50 ml de sangre periferica de pacientes con cancer pulmonar HLA-A24-positivo que dieron consentimiento informado y sujetos sanos HLA-A24-positivos en un gradiente de densidad de Ficoll-Conray, y se separaron las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y se recogieron. Posteriormente, se separaron los linfocitos de PBMC en linfocitos CD8-positivos y linfocitos CD8-negativos usando perlas CD8 MACS.

En una placa de 96 pocillos, se mezclaron 200000 celulas/pocillo de linfocitos CD8-negativos y el peptido SOX2 de union a HLA-A24 mencionado anteriormente, y la mezcla se dejo reposar a temperatura ambiente durante 2 horas, y despues se sometio a un grado de tratamiento de radiacion con 100 Gy. Las celulas as! tratadas se co-cultivaron con 20 U/ml de IL-2 (Takeda Pharmaceutical Company Limited.) y 100000 celulas/pocillo de linfocitos CD8-positivos, se realizo estimulacion de los linfocitos CD8-positivos una vez a la semana para tres veces en total, y se indujeron

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CTL. Se evaluo la reactividad especlfica de peptido de los CTL inducidos por un ensayo de citotoxicidad o un ensayo ELISPOT.

[Ejemplo 18]

Ejemplo experimental 18: ensayo de citotoxicidad

Se anadio Cr51 a celulas T2A24, las celulas se cultivaron en medio RPMI a 37 °C durante 1 hora, se radiomarcaron, y se lavaron con medio RPMI 4 veces. Se mezclo T2A24 marcado con Cr con peptido SOX2 o peptido de control (peptido de VIH), y la mezcla se dejo reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se co-cultivaron 2000 celulas/pocillo de T2A24 pulsadas con peptido SOX2 o peptido de control y 14000 celulas/pocillo de linfocitos CD8+ inducidos en el Ejemplo 17 en medio RpMI a 37 °C durante 4 horas. Despues se recogio el sobrenadante, y se midio la dosis de rayos-gamma usando un contador gamma.

La dosis cuando se cultivo solamente medio RPMI y T2A24 pulsadas con peptido se definio como liberacion espontanea (SPR), la dosis cuando se cultivo el lisado celular (2 % de NP40) y T2A24 pulsadas con peptidos se definio como liberacion maxima (MXR), y se calculo la citotoxicidad celular como (valor medido - SPR) / (MXR - SPR) x 100.

A partir de los resultados, se detectaron CTL que danaban especlficamente T2A24 pulsadas con peptidos SOX_109. Los resultados se muestran en la FIG. 16. Con el peptido derivado de VIH, que era el peptido de control, se detecto casi ninguna radiacion debido a las celulas danadas, mientras que se detecto fuerte radiacion con peptido SOX2_109.

[Ejemplo 19]

Ejemplo experimental 19: ensayo ELISPOT

Se realizo un experimento usando un sistema ELISPOT de IFNy humano (BD). Se recubrio una placa ELISPOT con un anticuerpo anti-IFNY dejandolo reposar a 4 °C durante una noche. Se anadieron por separado peptido SOX2 y un peptido de control (peptido de VIH) a T2A24, y las mezclas se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Se co-cultivaron 50000 celulas T2A24 pulsadas con peptido y 10000 CTL inducidos en el Ejemplo 2 en la placa recubierta con anticuerpo anti-IFNY a 37 °C durante una noche. Despues de lavar con PBS 1x y Tween 20 al 0,05 %, se anadio un anticuerpo anti-IFNY marcado con biotina, y la mezcla se dejo reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Despues de lavar con PBS 1x y Tween 20 al 0,05 %, se anadio estreptavidina marcada con HPR, y la mezcla se dejo reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar con PBS 1x y Tween 20 al 0,05 %, se anadio un reactivo de color, y se conto la cantidad de manchas.

Los resultados se muestran en la FIG. 17. Se detectaron CTL que reaccionaron especlficamente con T2A24 pulsadas con peptido SOX2_109. Se confirmo que, para el peptido derivado de VIH, que era un peptido de control, no se detectaba liberacion de IFNy a partir de las celulas T, pero para el peptido SOX2_109 se liberaba una gran cantidad de IFNy.

[Ejemplo 20]

Ejemplo experimental 20: cambio en la tumorigenicidad por sobreexpresion de SMCP

Se inocularon ratones NOD/SCID de forma subcutanea en la piel dorsal de la izquierda y la derecha con 10000 o 1000 celulas que expresan SMCP (celulas LHK2-SMCP) y celulas LHK2-simulado, y 100 pl de mezcla de celulas- Matrigel; cuando empezo a formarse un tumor, se midieron las longitudes del diametro mas largo y el diametro mas corto, y se calculo el volumen aproximado a un esferoide y se comparo. Los resultados se muestran en la FIG. 18.

Analisis

En comparacion con las celulas transfectadas de forma simulada, se formo rapidamente un tumor de tamano grande para las celulas en que se sobreexpresaba SMCP. En particular, se mostro tumorigenicidad notablemente elevada incluso con una pequena cantidad de celulas, y esto sugiere que SMCP es un gen relacionado con la tumorigenicidad de celulas madre cancerosas.

[Ejemplo 21]

Ejemplo experimental 21: supresion de la expresion de SMCP

Como ARNip, se uso ARNip Stealth Select RNAi(marca registrada) (n.° de catalogo 1299003) (Invitrogen). SMCP1 indica OligoID HSS142897, y SMCP3 indica OligoID HSS142899. Como control negativo, se uso Stealth RNA (marca registrada) siRNA Negative Control Hi GC (12935-400). Se mezclaron 100 pmol de ARNip y 4 pl de

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Lipofectamine RNAiMAX, se realizo cultivo en un fluido de cultivo DMEM a 37 °C durante 2 dlas, y se midio el nivel de expresion de ARNm por RT-PCR. Los resultados se muestran en la FIG. 19 a). Ademas, se midio el aumento en la cantidad de celulas desde 1 dla hasta 4 dlas despues de la transferencia genica. Los resultados se muestran en la FIG. 19 b). 2 dlas despues de la transferencia genica, se inocularon los ratones NOD/SCID de forma subcutanea en la piel dorsal de la izquierda y la derecha con 200000 celulas transfectadas con SMCP1 (celulas LHK2-si-SMCP1) o celulas transfectadas con SMCP3 (celulas LHK2-si-SMCP3), y celulas transfectadas con control negativo (celulas LHK2-si-control), como 100 pl de una mezcla de celulas-Matrigel; cuando empezo a formarse un tumor, se midieron las longitudes del diametro mas largo y el diametro mas corto, y se calculo el volumen aproximado a un esferoide y se comparo. Los resultados se muestran en la FIG. 20.

Analisis

Las celulas en que se habla suprimido la expresion del gen SMCP mostraron una disminucion significativa en el potencial de proliferation celular y tumorigenicidad. Entre si-SMCP1 y si-SMCP3, que son diferentes en parte de la secuencia, existla una diferencia significativa en la disminucion del potencial de proliferacion y tumorigenicidad. Estos resultados sugieren la posibilidad de tratar el cancer suprimiendo la expresion del gen SMCP.

[Ejemplo 22]

Ejemplo experimental 2: RT-PCR de DNAJB8

DNAJB8 es un miembro de la familia DNAJ/HSP40 y es un gen que codifica una protelna de 26 kD, no ha habido informes detallados sobre su localization o funcion excepto que se expresa a alto nivel en testlculo. Se cree que muchos de la familia DNAJ/HSP40 tienen un dominio J en el extremo N-terminal, y este dominio J se une a HSP70 para promover as! la hidrolisis de ATP y para lograr un cambio en la estructura de una region de union a sustrato HSP70, controlando de ese modo la actividad de HSP70. La propia HSP40 tiene una region de union a peptido, y es una que tiene una funcion de entregar un peptido a HSP70.

Se usaron paneles de ADNc de multiples tejidos humanos I, II (Clontech) como ADNc de tejido normal, y se extrajo el ARN de llneas celulares cancerosas cultivadas usando un kit RNeasy Mini (Qiagen). La llnea celular cancerosa cultivada empleo llneas celulares de cancer renal ACHN, Caki-1, SMKTR2, y SMKTR3, la llnea celular de cancer renal de raton RenCa, las llneas celulares de cancer de vejiga SW780, LB905-BLC, UM-UC3, y T24, las llneas celulares de cancer de prostata DU145 y LN-CaP, y la llnea celular de cancer de mama MCF7. Se purifico el ADNc a partir de 2 pg del ARN extraldo usando una enzima de transcription inversa Superscript III y un cebador oligo (dT) (Invitrogen). Se realizo PCR usando un total de 20 pl que contenla 0,25 pg de ADNc, 0,1 pg de ADN polimerasa Taq (Qiagen), y 12 pmol de cebador. Las condiciones de PCR emplearon las condiciones mostradas en la Tabla 2 del Ejemplo experimental 4 b) con 35 ciclos. Las secuencias de los cebadores para detectar DNAJB8 de raton fueron TGACAGATGGAGAGCAGGTG (SEQ ID No: 64) y CCCTCATGAGCTTCTCCTTG (SEQ ID No: 65) para el cebador antisentido. El tamano del producto de PCR fue de 408 pb para DNAJB8 humana y 463 pb para DNAJB8 de raton. La secuencia de cebadores de G3PDH de control fue ACCACAGTCCATGCCATCAC (SEQ ID No: 66) y TCCACCACCCTGTTGCTGTA (SEQ ID No: 67) como cebador antisentido, y el tamano del producto de PCR fue de 452 pb.

Los resultados se muestran en la FIG. 21. Aparte de expresarse fuertemente en testlculo, casi no se observo expresion de DNAJB8 en celulas normales humanas. Por otro lado, en las llneas celulares cancerosas cultivadas mencionada anteriormente, se observo expresion en todas las llneas celulares, aunque hubo algun grado de diferencia en el nivel de expresion.

[Ejemplo 23]

Ejemplo experimental 23: analisis de citometria de flujo

Se cultivaron celulas ACHN, MCF7, y RenCa hasta una densidad del 80 %, y se realizo analisis por citometria de flujo del mismo modo que en el Ejemplo experimental 1. Los resultados se muestran en la FIG. 22.

Se aislo una fraction SP en los tres tipos de lineas celulares, y se confirmo que la expresion de DNAJB8 era mas intensa que para una fraccion MP.

[Ejemplo 24]

Ejemplo experimental 24: ensayo de tumorigenicidad

Se inocularon ratones Balb/c (hembra, 6 semanas) de forma subcutanea en la piel dorsal de la izquierda y la derecha con 104, 103, 102, y 101 celulas RenCa por el mismo metodo que en el Ejemplo experimental 2, y se midio el tamano del tumor cada semana. El volumen del tumor se calculo de forma aproximada como a continuation.

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Volumen del tumor (mm3) = diametro mas largo (mm) x diametro mas corte (mm2) x 1/2.

Los resultados se muestran en la FIG. 23. Las celulas SP de RenCa mostraron fuerte tumorigenicidad en comparacion con celulas MP o celulas antes de la separacion celular.

[Ejemplo 25]

Ejemplo experimental 25: experimento de inmunoprofilaxis con vacuna de ADN

a) Preparacion de plasmido de ADN

Se realizo clonacion a partir de ADNc de RenCa para preparar el plasmido que expresaba DNAJB8 y Survivina, y se realizo insertion en el sitio de la enzima de restriction entre BamHI y Xhol del vector de expresion pcDNA3.1(+) (Invitrogen). En el lado 5' del antlgeno, se inserto la secuencia senal 5'- ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGG TGAC-3' de cadena k de inmunoglobulina en el sitio de la enzima de restriccion entre Nhel y HindIII, y en el lado 3' del antlgeno, se inserto la secuencia FLAG 5'- GATTACAAGGATGACGACGATAAG-3' en el sitio de la enzima de restriccion entre Xbal y Pmel. Se amplifico el plasmido de ADN y se purifico usando el kit EndoFree Plasmid Giga (Qiagen), y se midio la concentration de ADN por la absorbancia a 260 nm.

b) Transferencia de Western

Se cultivaron celulas HEK293T hasta una densidad del 70 %. Se hizo transferencia genica del plasmido que contenla antlgeno a celulas HEK293T usando FuGENE HD (Roche). Despues de cultivar a 37 °C durante 48 horas, se recogio el sobrenadante de cultivo, se centrifugo a 1500 r.p.m. durante 5 minutos, y se muestreo su sobrenadante. Se anadio DTT 0,1 M al sobrenadante en una cantidad del 10 % de la cantidad total, y se calento a 100 °C durante 4 minutos.

Se separo la muestra por SDS-PAGE en un gel al 12 %, y se transfirio a una membrana de nitrocelulosa. Se bloqueo la membrana, se anadio, a la misma, anticuerpo primario diluido 5000 veces, se realizo una reaction a temperatura ambiente durante 30 minutos, y despues se realizo una reaccion usando anticuerpo secundario marcado con peroxidasa diluido 5000 veces a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se identifico el antlgeno por quimioluminiscencia usando reactivos de detection de transferencia de Western ECL (Amersham).

Los resultados se muestran en la FIG. 24. La FIG. 24 a) muestra un mapa de construction plasmldica, codificando la construction plasmldica DNAJB8 secretada. Ademas, tiene una secuencia de marca FLAG en el extremo 3' terminal. La FIG. 24 b) muestra el resultado de transferencia de Western. Se descubrio de este modo que esta construccion plasmldica expresaba DNAJB8 secretada y Survivina.

c) Experimento de inmunoprofilaxis con vacuna

De inocularon 5 ratones balb/c (6 semanas, hembra) por grupo a traves de la pata con 200 pg/animal de vacuna de plasmido de ADN para un total de 4 veces cada semana, y se inocularon por via subcutanea en la piel dorsal con 105/animal de RenCa 1 semana despues de la fecha de inoculation final. Se midio el tamano del tumor cada semana, examinando por tanto la inmunogenicidad de la vacuna de ADN.

Los resultados se muestran en la FIG. 25. Los ratones inoculados con DNAJB8 mostraron un efecto significativamente mayor en la supresion del aumento del tumor que los ratones inoculados con survivina.

[Ejemplo 26]

Ejemplo experimental 26: ensayo de union a peptido por fragmento peptidico derivado de DNAJB8

Se predijeron por BIMAS (
http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), secuencias peptldicas antigenicas codificadas por DNAJB8 restringida a HLA-A24, y se prepararon 4 peptidos.

DNAJB8(22-30): AYRKLALRW (SEQ ID No: 68)

DNAJB8(90-99): GYTFRNPEDI (SEQ ID No: 69)

DNAJB8(99-107): IFREFFGGL (SEQ ID No: 70)

DNAJB8(143-151): AFMEAFSSF (SEQ ID No: 71)

Se uso la llnea celulas T2A24 para la cual se habla hecho la transferencia genica de HLA-A2402 a celulas T2 deficientes en transportador peptidico en un ensayo, y se realizo el experimento del mismo modo que en el Ejemplo experimental 16. En este Ejemplo experimental, se uso SL-8 como control negativo, y se uso survivina-2B (SEQ ID No: 72) como control positivo.

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Los resultados se muestran en la FIG. 26. La FIG. 26 a) muestra la transicion de fluorescencia, y la FIG. 26 b) muestra la intensidad de fluorescencia media. Entre los cuatro peptidos disenados, tres mostraron union a HLA-A24. [Ejemplo 27]

Ejemplo experimental 27: preparacion de cepa de expresion constitutiva de DNAJB8

Se cultivo la llnea celular de cancer renal ACHN hasta el 70 %, y se hizo transferencia genica de un antlgeno por un vector retrovlrico. Despues de cultivar a 37 °C durante 48 horas, se anadio 1 pg/ml de puromicina, y se seleccionaron las celulas.

Los resultados se muestran en la FIG. 27. En una llnea celular que expresaba DNAJB8 de forma constitutiva, la cantidad de celulas de la fraccion SP aumento significativamente.

[Ejemplo 28]

Ejemplo experimental 28: RT-PCR de OR7C1

El miembro 1 de la subfamilia C de la familia 7 de receptores olfativos (OR7C1) es una protelna de siete dominios transmembrana acoplada a protelna G clasificada como una familia de receptores olfativos a partir de su estructura. Aparte de un informe de expresion en la lengua, hasta ahora no se han detallado informes sobre un ligando del mismo, etc.

Se usaron los paneles de ADNc de tejidos multiples humanos I, II (Clontech) como ADNc de tejido normal. Se extrajo el ARN de una llnea celular cancerosas cultivada usando un kit RNeasy Mini (Qiagen). Como llneas celulares cancerosas cultivadas, se usaron las llneas celulares de cancer colorrectal grande humano Sw480, HT29, HCT15, y KM12LM y la llnea celular de cancer pulmonar humano LHK2. Se purifico el ADNc a partir de 2 pg del ARN extraldo usando la enzima de transcripcion inversa Superscript III y cebador oligo (dT) (Invitrogen). Se realizo PCR usando un total de 20 pl que contenlan 0,25 pg de ADNc, 0,1 pg de ADN polimerasa Taq (Qiagen), y 12 pmol de cebador. Las condiciones de PCR emplearon las condiciones mostradas en la Tabla 2 del Ejemplo experimental 4b) con 35 ciclos. El tamano del producto de PCR fue 201 pb.

Los resultados se muestran en la FIG. 28. Entre las celulas normales maduras humanas y las celulas normales fetales humanas, fue solamente en testlculo de celulas normales maduras humanas que se detecto OR7C1. Por otro lado, en la llnea celular cancerosas cultivada SW480, se observo expresion particularmente fuerte en la fraccion SP. En las celulas HT29, HCT15, KM12LM, y LHK2 tambien se observo fuerte expresion en la fraccion SP.

[Ejemplo 29]

Ejemplo experimental 29: preparacion de la cepa de expresion constitutiva de or7c1 y la llnea de inactivacion de or7c1

Se cultivaron celulas PLAT-A hasta una densidad de aproximadamente el 50 % en una placa de 10 cm con medio DMEM que contenla FBS al 10 % al que se habla anadido 1 pg/ml de puromicina y 10 pg/ml de blasticidina. Se mezclaron 10 pg de vector retrovlrico pMXs-Ib que tenia or7c1 insertada en el mismo + 1000 pl de Opti-MEM (Invitrogen) y 40 pl de lipofectamine 2000 (Invitrogen) + 1000 pl de Opti-MEM incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos adicionales. Despues de esto, se realizo mezcla con el medio celular PLAT-A mencionado anteriormente, se realizo el cultivo a 37 °C, 24 horas despues de ello se realizo intercambio del medio con DMEM que contenia FBS al 10 %, y 24 horas despues de ello se recogio el sobrenadante como un liquido de virus. Se cultivaron 1,5 ml de este liquido de virus y 8 pg/ml de polibreno en una placa de 6 pocillos a 37 °C junto con 2 x 105 celulas Sw480, 8 horas despues de ello se anadio 1 ml de DMEM que contenia FBS al 10 % reciente, y se realizo el cultivo a 37 °C. 48 horas despues de ello se anadieron 2 pg/ml de puromicina, se seleccionaron las celulas, y se obtuvo una cepa de expresion constitutiva.

La preparacion de ARNip se contrato a Invitrogen (OR7C1 Stealth Select 3 RNAi (HSS120191; HSS178215; HSS178216), Stealth RNAi Negative control kit). Se mezclaron 100 pmol de ARNip + 250 pl de Opti-MEM (Invitrogen) y 5 pl de lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) + 250 pl de Opti-MEM incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos, y la mezcla se incubo a temperatura ambiente durante 20 minutos adicionales. Despues se anadio a una placa de 6 pocillos con Sw480 cultivadas a una densidad del 20 %, se realizo el cultivo en DMEM que contenia FBS al 10 % a 37 °C, y se usaron las celulas despues de 48 horas como una linea de inactivacion de or7c1.

Se muestran imagenes de microscopia de contraste de fase y los resultados de RT-PCR de la cepa de expresion constitutiva de or7c1, la linea de inactivacion de or7c1, y la linea celular Sw480 transfectada de forma simulada como una diana comparativa en la FIG. 29. Con respecto a la morfologia celular, no hubo diferencias en las caracteristicas entre las celulas Sw480 transfectadas de forma simulada y la cepa de expresion constitutiva, pero en la linea celular de inactivacion se perdio la adhesion entre las celulas individuales. Se confirmo a partir del resultado

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de RT-PCR que or7c1 se expresaba fuertemente en la cepa de expresion constitutiva, pero apenas se expresaba en la llnea de inactivacion.

Se examino el cambio en la fraccion SP de la llnea de inactivacion de or7c1 del mismo modo que en el Ejemplo experimental 1. Los resultados se muestran en la FIG. 30. Las celulas SP desaparecieron en la llnea celular de inactivacion.

[Ejemplo 30]

Ejemplo experimental 30: ensayo de tumorigenicidad

Se inocularon ratones NOD/SCID (hembra, de 5 semanas) de forma subcutanea en la piel dorsal de la izquierda y la derecha por el mismo metodo que en el Ejemplo experimental 2 con 104, 103, 102, y 101 celulas tumorales (cepa de expresion constitutiva de or7c1 de la llnea celular SW480) y celulas SW480 transfectadas de forma simulada como control negativo, y se midio el tamano del tumor cada semana. Del mismo modo, se realizo inoculacion de 107 celulas de inactivacion de or7c1 y la llnea de ARNip negativa como control negativo, y se midio el tamano del tumor cada semana.

Los resultados se muestran en la FIG. 31. Comparando Sw480 transfectada de forma simulada y la cepa de expresion constitutiva de or7c1, no hubo diferencia notable para 104 y 103, pero para 102 y 101 la tumorigenicidad fue mayor para la cepa de expresion constitutiva. Con respecto al ARNip negativo y la llnea de inactivacion de or7c1, para 104 la llnea de inactivacion de or7c1 mostro tumorigenicidad notablemente baja.

[Ejemplo 31]

Ejemplo experimental 31: ensayo de union a peptido por el fragmento peptidico derivado de or7c1

Los siguientes peptidos se prepararon del mismo modo que en el Ejemplo experimental 26, y se realizo un ensayo de union.

or7c1_34(10): MYLVTFTGNL (SEQ ID NO: 73) or7c1_59(10): MYFFlSNLSF (SEQ ID NO: 74) or7c1_93(10): TYAGCLSQIF (SEQ ID NO: 75) or7c1_131(10): HYTViMNPQL (SEQ ID NO: 76) or7c1_217(10): SYYKiVFSIL (SEQ ID NO: 77) or7c1_251(10): FYGTGFGVYL (SEQ ID NO: 78) or7c1_277(9): MYTMVTPML (SEQ ID NO: 79)

Los resultados se muestran en la FIG. 32. A partir de estos resultados, se observo union a HLA-A2402 para 277(9), 34(10), 251(10), 131(10), y 93(10).

[Ejemplo 32]

Ejemplo experimental 32: induccion de CTL

Se separo PBMC de sangre completa (heparina anadida) muestreada de un sujeto de ensayo usando Lymphoprep (Nycomed). Despues de cultivar las PBMC a 37 °C durante 24 horas, se realizo un experimento usando celulas no adherentes. Para obtener celulas CD8-positivas a partir de las celulas no adherentes, se separaron las celulas CD8- positivas y negativas usando un sistema magnetico de separacion celular (Miltenyi Biotech). Para celulas CD- negativas, se anadieron 100 U/ml de IL-2 y 1 pg/ml de PHA-P a medio AIM-V (Life Technologies) para dar PHA- blastos. Se cultivaron las celulas CD8-positivas en medio AIM-V a 37 ° C y se estimularon con 1/5 la cantidad de PHA-blastos tres veces cada 7 dlas (0 dla, 7° dla, 14° dla). Desde el 8° dla, se anadieron 50 U/ml de IL-2 al medio, y despues de ello cada 3 a 4 dlas se intercambio el medio, y se anadieron 50 U/ml de IL-2. Las celulas se sometieron como CTL a ELISPOT en el 21er dla y a un ensayo de liberacion de 51Cr en el 28° dla.

[Ejemplo 33]

Ejemplo experimental 33: ensayo ELISPOT

Para realizar ELISPOT, se usaron 5 z 105/ml de los CTL inducidos mencionados anteriormente como celulas efectoras. Se usaron celulas T2A24 y K562 (siendo K562 un control negativo) como diana. Durante dos horas se incubaron celulas T2A24 a temperatura ambiente, usando 5 pg/ml de cada uno de los peptidos que se hablan encontrado por el ensayo de union a peptido, mencionado anteriormente, para presentarse en HLA-A24. Las celulas diana se ajustaron a 5x105/ml. Se anadieron 100 pl/pocillo de 5 pg/ml de anticuerpo de captura de IFN-y (PharMingen) a una placa multitamiz de 96 pocillos (Millipore), y se sumergio en PBS a 4 °C y se dejo reposar durante una noche. Las celulas despues se lavaron una vez con 200 pl/pocillo de RPMI1640 (Sigma Chemical Co), y se fijaron con RPMI1640 durante 2 horas. Se anadieron 100 pl de cada una de las celulas efectoras/diana

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mencionadas anteriormente a los pocillos, se incubaron durante 40 horas, se retiraron las celulas por lavado, y despues se anadio un anticuerpo contra citoquina para la deteccion. Ademas, se anadio enzima marcada con estreptavidina y se realizo el recuento usando un lector ELISPOT.

Los resultados se muestran en la FIG. 33. En el peptido 93(10), se confirmo la liberation de IFN-y.

[Ejemplo 34]

Ejemplo experimental 34: ensayo de liberacion de 51Cr

En un ensayo para medir la citotoxicidad celular, se marcaron las celulas con 51Cr radiactivo, y se midio la citotoxicidad celular por CTL. Se usaron CTL como celulas efectoras, y T2A24, K562, Sw480, y Sw480 que expresaba de forma constitutiva or7c1 se usaron como celulas diana. En primer lugar, se recogieron 1 x 106 celulas diana, se anadieron de 10 a 100 pl de 51Cr, y se incubaron a 37 °C durante 1 hora, marcando de ese modo las celulas con Cr. Las celulas marcadas se lavaron con RPMI1640 cuatro veces, y se disolvieron en RPMI1640 para dar 1 x 105/ml (finalmente usadas a 2000 celulas diana/pocillo). Se pulso T2A24 con 5 pg/ml de peptido, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Por otro lado, se sembraron los CTL en una placa de 96 pocillos por disolucion con 100 pl de AIM-V de acuerdo con las relaciones E/T respectivas. Para el analisis de los datos, se colocaron 100 pl de AIM-V en un pocillo para medir la liberacion espontanea y 100 pl de NP-40 al 2 % en un pocillo para medir la liberacion maxima por anticipado en los pocillos. Se anadieron 100 pl de cada una de las celulas diana a los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenla el efector, y se cultivo a 37 °C durante 4 horas. Despues se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se sometieron a medicion usando un contador gamma. El analisis empleo la siguiente ecuacion.

% de elimination = (liberacion medida - liberacion espontanea) x 100/(liberacion maxima - liberacion espontanea)

Los resultados se muestran en la FIG. 34. En comparacion con Sw480, la citotoxicidad celular fue mayor para Sw480 que expresaba de forma constitutiva or7c1. Con respecto a T2A24, para relaciones E/T de 20 y 6, una pulsada con peptido 93(10) mostro mayor citotoxicidad celular.

Aplicabilidad industrial

El marcador molecular proporcionado por la presente invencion para su uso en un metodo de determinacion habitualmente se expresa poco en celulas normales adultas, pero se expresa en muchas celulas madre cancerosas, y posibilita un diagnostico de precision mucho mayor que las tecnicas de diagnostico de cancer convencionales reconociendo especlficamente solo celulas tumorales en el organismo o el tejido. Ademas, como reconoce especlficamente celulas madre cancerosas en particular, se espera que contribuya ampliamente a la industria medica, tal como en el desarrollo de inmunoterapia contra el cancer, terapia contra dianas moleculares, terapia de transferencia genica, etc.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Japan Science and Technology Agency Sapporo Medical University <120> Marcadores moleculares para celulas madre cancerosas <130> 2378SI <160> 79

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

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<210>2 <211> 20 <212>ADN

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<210>3 <211> 22 <212>ADN <213> Artificial

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<223> cebador directo para protelna rica en cistelna asociada a mitocondrias de esperma de Homo sapiens, ARNm

<400>3

tgtgtgacca gacaaaacac ag 22

<210>4 <211> 20

<212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para protelna rica en cistelna asociada a mitocondrias de esperma de Homo sapiens, ARNm

<400>4

gttgggctca gactccatgt 20

<210>5 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para la subunidad 1 del complejo integrador de Homo sapiens, ARNm <400>5

tgtccagcat gagcaaactc 20

<210>6 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para subunidad 1 del complejo integrador de Homo sapiens, ARNm <400>6

aaaccgtagc agggtcacac 20

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<223> cebador inverso para protelna 19 de dedo de zinc de Homo sapiens, ARNm <400>8

tcctctggtg ccgaattaac 20

<210>9 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para inhibidor de la familia Myo-D de Homo sapiens, ARNm <400>9

caggaagact gctgtgtcca 20

<210> 10 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para inhibidor de la familia Myo-D de Homo sapiens, ARNm <400> 10

atgcagatct ccaggcagtc 20

<210> 11 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para ADNc FLJ13464 de Homo sapiens <400> 11

tgcataacac caaaggtcca 20

<210> 12 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para ADNc FLJ13464 de Homo sapiens <400> 12

gacctggcca atacaatgct 20

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<223> cebador directo para surfeit 6 de Homo sapiens, ARNm <400> 15

cgactgcatg agaagatcca 20

<210> 16 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para surfeit 6 de Homo sapiens, ARNm <400> 16

gaggaggttg gtccacttca 20

<210> 17 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para protocadherina 19 de Homo sapiens, variante de transcrito 1, ARNm <400> 17

cccaaggtca acagcgttat 20

<210> 18 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para protocadherina 19 de Homo sapiens, variante de transcrito 1, ARNm <400> 18

cacaccaggg gactctttgt 20

<210> 19 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

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<210> 21 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para protocadherina 21 de Homo sapiens, ARNm <400> 21

atgcagagga acccaacaac 20

<210> 22 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para protocadherina 21 de Homo sapiens, ARNm <400> 22

tgagtaaggc tgtggtgctg 20

<210> 23 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para galactosa-3-O-sulfotransferasa 1 de Homo sapiens, ARNm <400> 23

ggcctgcttc aacatcatct 20

<210> 24 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

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<223> cebador inverso para galactosa-3-O-sulfotransferasa 1 de Homo sapiens, ARNm <400> 24

gctgttgtca tagcccaggt 20

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65

<212> ADN <213> Artificial <220>

<210> 27 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para hirsuto y potenciador de la division 6 (Drosophila) de Homo sapiens, ARNm <400> 27

agctcctgaa ccatctgctc 20

<210> 28 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para hirsuto y potenciador de la division 6 (Drosophila) de Homo sapiens, ARNm <400> 28

agcaggagcc tgactcagtt 20

<210> 29 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para la protelna 415 de dedo de zinc de Homo sapiens, ARNm <400> 29

cttgcaaggc attggagaat 20

<210> 30 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para la protelna 415 de dedo de zinc de Homo sapiens, ARNm <400> 30

taggcttgaa tgcacactga 20

<210> 31 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para el factor relacionado con la transcripcion de NK2 de Homo sapiens, locus 5 (Drosophila), ARNm

<400> 31

acgcccttct cagtcaaaga 20

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<223> cebador inverso para el factor relacionado con la transcripcion de NK2 de Homo sapiens, locus 5 (Drosophila), ARNm

<400> 32

ttttcggctc tagggtcctt 20

<210> 33 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para interaccionador COOH-terminal de peptidilglicina alfa-amidante monooxigenasa de Homo sapiens, ARNm

<400> 33

tgatcatttc ccaggaccat 20

<210> 34 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para interaccionador COOH-terminal de peptidilglicina alfa-amidante monooxigenasa de Homo sapiens, ARNm

<400> 34

cccttccgca tcttcattta 20

<210> 35 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para feniletanolamina N-metiltransferasa de Homo sapiens, ARNm <400> 35

gaatgctggc aggataagga 20

<210> 36 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para feniletanolamina N-metiltransferasa de Homo sapiens, ARNm <400> 36

cttgtagcca ctacgcacca 20

<210> 37 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 38 <211> 19 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para secretoglobina de Homo sapiens, familia 3A, miembro 1, ARNm <400> 38

ccagctcagc cacacactt 19

<210> 39 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para receptor olfativo de Homo sapiens, familia 7, subfamilia C, miembro 1, ARNm <400> 39

agctctgtgg actgctggtt 20

<210> 40 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para receptor olfativo de Homo sapiens, familia 7, subfamilia C, miembro 1, ARNm <400> 40

ggacgccagt tgcaaagtat 20

<210> 41 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para homologo de ADNj de Homo sapiens, subfamilia B, miembro 8, ARNm <400> 41

ccgacaagaa ccctgacaat 20

<210> 42 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para homologo de ADNj de Homo sapiens, subfamilia B, miembro 8, ARNm <400> 42

aggtggatga gaaggtggtg 20

<210> 43 <211> 65 <212>ADN <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

gatccgccag ctcgcagacc tacatttcaa gagaatgtag gtctgcgagc tggttttttc 60

tagag 65

<210> 44 <211> 65 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotido de ADNhc para Sox2 <400> 44

aattctctag aaaaaaccag ctcgcagacc tacattctct tgaaatgtag gtctgcgagc 60

tggcg 65

<210> 45 <211> 65 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotido de ADNhc para EGFP <400> 45

gatccgcaac agccacaacg tctatttcaa gagaatagac gttgtggctg ttgttttttc 60 tagag 65

<210> 46 <211> 65 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotido de ADNhc para EGFP <400> 46

aattctctag aaaaaacaac agccacaacg tctattctct tgaaatagac gttgtggctg 60

ttgcg 65

<210> 47 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 47

Met Tyr A$n Met Met Glu Thr Glu Leu 1 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 48

Val Trp Ser Arg Gly Gin Arg Arg Lys Met 15 10

<210> 49 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 49

Lys Met Ala Gin Glu Asn Pro Lys Met 1 5

<210> 50 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 50

Pro Phe lie Asp Glu Ala Lys Arg Leu 1 5

<210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 51

Lys Tyr Arg Pro Arg Arg Lys Thr Lys Thr Leu 15 10

<210> 52 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Leu Met Lys Lys Asp Lys Tyr Thr Leu 1 5

<210> 53 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 53

Lys Tyr Thr Leu Pro Gly Gly Leu Leu 1 5

<210> 54

<211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 54

Gly Trp Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Met 1 5

<210> 55 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 55

Ser Tyr Ser Met Met Gin Asp Gin Leu 1 5

<210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 56

Pro Met His Arg Tyr Asp Val Ser Ala Leu 15 10

<210> 57 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 57

Ser Met Thr Ser Ser Gin Thr Tyr Met 1 5

<210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 58

Tyr Met Asn Gly Ser Pro Thr Tyr Ser Met 15 10

<210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de SOX2 <400> 59

Ser Tyr Ser Gin Gin Gly Thr Pro Gly Met

15 10

<210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> epltopo de union HLA-A24 de VIH <400> 60

Arg Tyr Leu Arg Asp Gin Gin Leu Leu Gly lie 15 10

<210> 61 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Ser Leu 1 5

<210> 62 <211> 317 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gin Gin 15 10 15

Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly 20 25 30

Asn Gin Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe 35 40 45

Met Val Trp Ser Arg Gly Gin Arg Arg Lys Met Ala Gin Glu Asn Pro

50 55 60

Lys Met His Asn Ser Glu lie Ser Lys Arg Leu Gly Ala Glu Trp Lys 65 70 75 80

Leu Leu Ser Glu Thr Glu Lys Arg Pro Phe lie Asp Glu Ala Lys Arg 85 90 95

Leu Arg Ala Leu His Met Lys Glu His Pro Asp Tyr Lys Tyr Arg Pro 100 105 110

10

Arg
Arg: Lys Thr Lys Thr Leu Met Lys Lys Asp Lys Tyr Thr Leu Pro


: 115 120 125

Gly
Gly: Leu Leu Ala Pro Gly Gly Asn Ser Met Ala Ser Gly Val
Gly

: 130 135 140

Val: Gly Ala Gly Leu Gly Ala Gly Val Asn Gin Arg Met Asp Ser Tyr

145: 150 155 160

Ala: His Met Asn Gly Trp Ser Asn Gly Ser Tyr Ser Met Met Gin Asp




: 165 170 175

Gin: Leu Gly Tyr Pro Gin His Pro Gly Leu Asn Ala His Gly Ala Ala



: 180 185 190

Gin: Met Gin Pro Met His Arg Tyr Asp Val Ser Ala Leu Gin Tyr Asn


: 195 200 205

Ser: Met Thr Ser Ser Gin Thr Tyr Met Asn Gly Ser Pro Thr Tyr
Ser

: 210 215 220

Met: Ser Tyr Ser Gin Gin Gly Thr Pro Gly Met Ala Leu Gly Ser
Met

225: 230 235 240

Gly: Ser Val Val Lys Ser Glu Ala Ser Ser Ser Pro Pro Val Val Thr




: 245 250 255

Ser
Ser
Ser: His Ser Arg Ala Pro Cys Gin Ala Gly Asp Leu Arg Asp



: 260 265 270

Met: He Ser Met Tyr Leu Pro Gly Ala Glu Val Pro Glu Pro Ala Ala


: 275 280 285

Pro: Ser Arg Leu His Met Ser Gin His Tyr Gin Ser Gly Pro Val
Pro

: 290 295 300

Gly: Thr Ala lie Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met

305: 310 315

<210> 63 <211>8

5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Epltopo de OVA

<400> 63

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ser He He Asn Phe Glu Lys Leu 1 5

<210> 64 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para ADNJB8 de raton <400> 64

tgacagatgg agagcaggtg 20

<210> 65 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para ADNJB8 de raton <400> 65

ccctcatgag cttctccttg 20

<210> 66 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador directo para G3PDH <400> 66

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 67 <211> 20 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> cebador inverso para G3PDH <400> 67

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210> 68 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de ADNJB8 <400> 68

Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Arg Trp 1 5

<210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<220>

<223> fragmento peptldico de ADNJB8 <400> 69

Gly Tyr Thr Phe Arg Asn Pro Glu Asp lie 15 10

<210> 70 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de ADNJB8 <400> 70

lie Phe Arg Glu Phe Phe Gly Gly Leu 1 5

<210> 71 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de ADNJB8 <400> 71

Ala Phe Met Glu Ala Phe Ser Ser Phe 1 5

<210> 72 <211>9 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de survivina <400> 72

Ala Tyr Ala Cy$ Asn Thr Ser Thr Leu 1 5

<210> 73 <211> 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de OR7C1 <400> 73

Met Tyr Leu Val Thr Phe Thr Gly Asn Leu 15 10

<210> 74

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de OR7C1 <400> 74

Met Tyr phe Phe Leu Ser A$n Leu Ser Phe 15 10

<210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de OR7C1 <400> 75

Thr Tyr Ala Gly Cys Leu Ser Gin lie Phe 15 10

<210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de OR7C1 <400> 76

His Tyr Thr Val lie Met Asn Pro Gin Leu 15 10

<210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de OR7C1 <400> 77

Ser Tyr Tyr Lys lie Val Phe Ser lie Leu 15 10

<210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de OR7C1 <400> 78

Phe Tyr Gly Thr Gly Phe Gly Val Tyr Leu 15 10

<210> 79 <211>9

5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> fragmento peptldico de OR7C1

10

<400> 79

Met Tyr Thr Met Val Thr Pro Met Leu 1 5

15

Claims

5

10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Un peptido Or7c1_93: que tiene la secuencia TYAGCLSQIF (SEQ. ID. NO: 75).
2. El peptido de la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento del cancer induciendo celulas T citotoxicas (CTL).
3. Un acido nucleico que codifica el peptido de acuerdo con la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento del cancer induciendo celulas T citotoxicas (CTL).
4. Un anticuerpo que reacciona especlficamente con un epltopo derivado del peptido de acuerdo con la reivindicacion 1, para su uso en el tratamiento del cancer inhibiendo una o mas funciones de celulas madre cancerosas o eliminando celulas madre cancerosas.
5. Una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento o prevencion del cancer, que comprende al menos uno de los principios activos seleccionados del grupo que consiste en los siguientes (1) a (3);

1) el peptido de acuerdo con la reivindicacion 1,

(2) el acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 3, o

(3) el anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 4.
6. Un metodo in vitro para detectar celulas madre cancerosas en una diana de deteccion, detectando la presencia de un producto de expresion de Or7c1.
7. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la diana de deteccion es una o mas poblaciones celulares derivadas de celulas o tejido seleccionadas del grupo que cosiste en corazon, cerebro, placenta, pulmon, hlgado, musculo esqueletico, rinon, pancreas, bazo, timo, prostata, testlculo, ovario, intestino delgado, leucocitos, estomago, medula osea, intestino grueso y celulas mononucleares de sangre periferica.
8. Un uso de un kit que comprende un reactivo para detectar al menos el producto de expresion de un gen de Or7c1 en la determinacion de la presencia o ausencia de celulas madre cancerosas.
9. El uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el reactivo para la deteccion es una sonda y/o un cebador para detectar ARNm que es un producto de expresion de un gen de Or7c1, en el que la sonda y/o el cebador comprende una secuencia de nucleotidos complementaria al gen.
10. El uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en el que el reactivo para la deteccion es un anticuerpo para detectar un polipeptido que es un producto de expresion de un gen de Or7c1.