KR20170095284A - 종양 항원 펩티드 - Google Patents

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토시히코 토리고에
요시히코 히로하시
타카유키 카나세키
시오 미야모토
비탈리 코친
마사시 고토
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훗카이도 코리츠 다이가쿠 호진 삿포르 이카 다이가쿠
다이니뽄 스미토모 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 암 줄기세포를 특이적으로 검출할 수 있는 검출제, 암 줄기세포 특이적으로 제시되는 종양 항원 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및/또는 치료에 유용한 의약 조성물, 및 소요 종양 항원 펩티드를 스크리닝하는 방법 등을 제공하는 것을 목적으로 한다. Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드, 상기 펩타이드 중 적어도 하나를 에피토프 펩타이드의 하나로 포함, 여러 에피토프 펩타이드를 연결한 폴리에피토프 펩타이드, 상기 펩타이드 또는 폴리에피토프 펩티드의 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, CTL을 유도하는 것을 특징으로 하는 암 예방 및/또는 치료제 등을 제공함으로써 상기 과제가 해결되었다.

Description

종양 항원 펩티드{TUMOR ANTIGEN PEPTIDE}
본 발명은 암 줄기세포에 특이적으로 발현하는 유전자를 이용한 암 줄기세포를 검출하는 검출제 및 암의 예방 및/또는 치료제로서 유용한, 상기 유전자 유래의 종양 항원 펩티드 및 그 이용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 종양 항원 펩티드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
지금까지 개발된 항암제의 치료 효과는 충분하지 않고 암을 완치할 수 있는 확률은 매우 낮다. 그 원인으로 암 조직의 근간을 이루는 세포를, 기존의 치료제가 선택적으로 타겟팅할 수 없는 것을 들 수 있다. 최근에는 그러한 “암 조직의 근간을 이루는 세포”로써 암 줄기세포의 존재가 보고되고 있다. 암 줄기세포는 암의 발생, 재발 및 전이에 관련된 원인 세포로 간주하고 있고, 따라서 암 줄기세포를 타겟팅할 수 있다면 암의 증식, 재발 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 가능성이 높은 것으로 예상된다. 즉, 암 줄기세포의 검출 기술과 암 줄기세포를 표적으로 하는 새로운 치료제의 개발은 암 의료에 있어서 중요한 과제가 되고 있다.
한편, 생체에 의한 종양 세포와 바이러스 감염 세포 등을 제거에는 세포성 면역, 특히 세포 독성 T 세포(CTL)가 중요한 역할을 하고 있다. 예를 들어 종양 세포의 제거의 경우, CTL은 종양 세포의 항원 펩티드(종양 항원 펩티드)와 주요 조직 적합성 복합체(MHC : Major Histocompatibility Complex) 클래스 I 항원(인간의 경우 HLA 클래스 I 항원이라 칭함)의 복합체를 인식하고 종양 세포를 공격·파괴한다. 즉 종양 항원 펩티드는 종양에 특유의 단백질, 즉 종양 항원 단백질이 세포 내에서 합성된 후, 프로테아제에 의해 세포 내에서 분해됨으로써 생성된다. 그리고 생성된 종양 항원 펩티드는 소포체 내에서 MHC 클래스 I 항원(HLA 클래스 I 항원)과 결합하여 복합체를 형성하여 세포 표면에 옮겨져 항원 제시된다. 이 항원 제시에 따른 복합체를 종양 특이적인 CTL이 인식하고 세포 독성 작용과 림포카인(Lymphokine)의 생산을 통해 항종양 효과를 나타낸다. 이러한 일련의 작용의 해명에 따라 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 이른바 암 면역요법제(암 백신)으로 이용함으로써 암 환자의 체내의 암 특이적 CTL을 증강시키는 치료법이 개발되고 있다.
그 중에서도 특히 암 줄기세포를 면역적으로 제거할 수 있는 새로운 암 백신의 개발이 요구되고 있다(예를 들면 특허문헌 1).
ASB4(Ankyrin repeat and SOCS box-containing 4)는 원래 각인 유전자 스크리닝 과정에서 확인된 유전자의 하나이지만, 최근에는 재프로그래밍(reprograming)에 관련된 유전자로 식별되고 인간의 정상 조직에서는 특정 분화 단계의 정집(정소)을 제외하고 발현은 보이지 않는 것으로 알려져 있다. ASB4 및 암 관련 사건(event)으로 지금까지 간암세포에서 발현하고 있는 것이나, ASB4 유전자의 발현과 종양의 침윤성과 정확하게 상관하는 것 등이 보고되고 있다(예를 들면 비특허문헌 1 ~ 4).
[특허문헌 1] 국제 공개 제 2010/050268 호 팜플렛
[비특허문헌 1] Mizuno Y, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Feb 8; 290 (5):1499-505. [비특허문헌 2] Yang CS, et al. Cell Rep. 2014 Jul 24; 8 (2):327-37. [비특허문헌 3] Kim SK, et al. Mol Cells 2008 Apr 30; 25 (2):317-21. [비특허문헌 4] Au V, et al. Biosci Trends 2014 Apr; 8 (2):101-10.
본 발명의 목적은 암 줄기세포를 특이적으로 검출할 수 있는 검출제, 암 줄기세포 특이적으로 제시되는 종양 항원 펩티드, 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및/또는 치료에 유용한 의약 조성물, 및 이러한 종양 항원 펩티드를 스크리닝하는 방법 등을 제공하는 데 있다.
종양 세포, 특히 암 줄기세포에 특이적으로 항원 제시되는 펩타이드를 탐색하던 중, 암 줄기세포에 특이적으로 발현하는 단백질의 서열 중에 HLA와 결합할 것으로 예상되는 에피토프 영역이 복수 존재했을지라도, 해당 단백질의 어느 부분이 실제로 생체 내에서 HLA와 결합하여 세포 표면에 항원 제시될 수 있는지 식별하는 것은 쉽지 않다. 이에 본 발명자들은 이와 같은 문제를 해결하기 위해 실제로 암 줄기세포에 항원 제시되는 펩타이드(자연 펩티드; Natural peptide)을 직접 식별하는 방법을 개발하고, 여러 자연 펩타이드를 동정했다. 그리고 이러한 펩타이드 중 암 줄기세포에만 특이적으로 항원 제시되는 펩타이드가 ASB4 단백질 유래의 펩타이드임을 발견, 예의 연구를 계속하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기 열거하는 것에 관한 것이다:
[1] Y0-X0-Z0
로 표시되는 암 줄기세포 특이적인 항원 펩티드로서,
X0가 하기의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나이고:
(1) ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 내지 14 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신(Leucine), 이소류신(isoleucine) 또는 메티오닌(methionine)이며, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린(valine), 류신 또는 이소류신인 펩타이드;
(2) (1)의 부분 펩티드에 있어서, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 펩타이드;
(3) ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 내지 14 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신(Tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine) 또는 트립토판(tryptophan)이며, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌인 펩타이드; 또는
(4) (3)의 부분 펩티드에 있어서, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 펩타이드;
Y0 및 Z0가, 서로 독립적으로 0개에서 복수의 아미노산으로 구성된 펩티드인, 항원 펩티드.
[2] X0가 하기의 (1') 내지 (4') 중 하나이고:
(1') ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 내지 11 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌이며, 및/또는, C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신인 펩타이드;
(2') (1')의 부분 펩티드에서, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 펩타이드;
(3') ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 내지 11 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌인 펩타이드; 또는
(4') (3')의 부분 펩티드에서, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 펩타이드;
Y0 및 Z0가, 서로 독립적으로 0개 또는 1개의 아미노산이거나; 또는,
0 내지 3개의 아미노산으로 구성된 펩티드이며, 여기서 Y0-X0-Z0가 전체 9 내지 14 아미노산 길이인 ASB4 단백질의 부분 펩티드 또는 이의 X0 상동체(homologue);
인 것을 특징으로 하는, [1]의 항원 펩티드.
[3] X0가, 서열번호 3 내지 7, 9 내지 19, 21 내지 28, 30 내지 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, [1] 또는 [2]의 항원 펩티드.
[4] X0가, 서열번호 3 내지 7, 9 내지 19, 21 내지 28, 30 내지 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지며, Y0 및 Z0이 존재하지 않는, [1] 또는 [2]의 항원 펩티드.
[5] X0가 서열번호 3 내지 7, 9 내지 11, 13 내지 19, 21 내지 23 및 26 내지 28, 30 내지 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 2번째 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 이소류신으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 발린 또는 이소류신으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지며, Y0 및 Z0이 존재하지 않는, [1] 또는 [2]의 항원 펩티드.
[6] X0가, 서열번호 3, 5 내지 7, 9 내지 14, 16, 19, 21 내지 26, 28, 30 내지 32, 34 내지 37 및 39 내지 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 2번째 아미노산이 메티오닌 또는 티로신으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지며, Y0 및 Z0이 존재하지 않는, 항원 펩티드.
[7] X0가, [4] 내지 [6]의 X0이며, Y0 또는 Z0 중 어느 한 쪽이 1개의 아미노산이며, 다른 하나는 존재하지 않는, [1] 또는 [2]의 항원 펩타이드.
[8] Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 4, 6, 7, 10, 14, 15, 17 내지 19, 21 내지 23, 26, 28, 31, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, [1] 내지 [3]의 항원 펩티드.
[9] Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 9, 21, 25, 30, 32, 35 및 37 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, [1] 내지 [3]의 항원 펩티드.
[10] Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 4 내지 12 및 15 내지 23 중 어느 하나로 기재는 아미노산 서열로 이루어진, [1] 내지 [3]의 항원 펩티드.
[11] Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 3 내지 9, 13, 14, 25, 26 및 28 내지 30 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, [1] 내지 [3]의 항원 펩티드.
[12] Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 4 내지 9 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, [1] 내지 [3]의 항원 펩티드.
[13] 복수의 에피토프 펩타이드가 결합된 폴리에피토프 펩티드로, 상기 에피토프 펩티드로서 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩타이드를 적어도 하나 포함하는, 상기 폴리에피토프 펩티드.
[14] ASB4 유전자의 발현 산물을 검출하기 위한 ASB4 검출제를 포함하는, 암 줄기세포 검출제.
[15] 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 전립선, 고환, 난소, 소장, 대장 및 혈액 이루어진 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 생체 시료에서 유래하는 세포를 포함하는 세포 집단에 있어서 암 줄기세포를 검출하기 위한, [14]의 암 줄기세포 검출제.
[16] ASB4 유전자의 발현 산물이 mRNA 및/또는 내인성 폴리펩티드인, [14] 또는 [15]의 암 줄기세포 검출제.
[17] ASB4 유전자의 발현 산물이 mRNA이며, RT-PCR 법에 의해 검출하는 것을 포함하는, [14] 내지 [16]의 암 줄기세포 검출제.
[18] ASB4 유전자의 발현 산물이 내생 폴리펩티드이며, 상기 내인성 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 ASB4 검출제에 의해 검출하는 것을 포함하는, [14] 내지 [16]의 암 줄기세포 검출제.
[19] ASB4 검출제가 항체인, [18]의 암 줄기세포 검출제.
[20] ASB4 검출제가 ASB4 유전자의 발현 산물인 mRNA를 검출하기 위한 상기 유전자에 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브 및/또는 프라이머인, [14] 내지 [17]의 암 줄기세포 검출제.
[21] [14] 내지 [20]의 암 줄기세포 검출제를 사용하여 검사 대상에서 암 줄기세포를 검출하는 방법.
[22] (i) 암 치료제 후보 화합물을, 대상에 투여하기 전에, 상기 대상에서 ASB4 유전자의 발현 산물의 검출량 A를 측정하는 단계;
(ii) 상기 후보 화합물을 상기 대상 세포 집단에 투여한 후, 상기 대상에서 ASB4 유전자의 발현 산물의 검출량 B를 측정하는 단계, 및
(iii) 상기 검출량 A와 B를 비교하여 상기 검출량 A가 B보다 유의하게 큰 경우, 상기 후보 화합물을 암 줄기세포를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 암 치료제 후보라고 판정하는 단계를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
[23] [1] 내지 [12]의 항원 펩티드 또는 [13]의 폴리에피토프 펩티드 중 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
[24] [23]의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
[25] [24]의 발현 벡터를 포함하는 유전자 도입용 조성물.
[26] 하기의 (a) 내지 (d) 중 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물:
(a) [1] 내지 [12]의 항원 펩티드 또는 [13]의 폴리에피토프 펩타이드,
(b) [23]의 폴리뉴클레오티드,
(c) [24]의 발현 벡터,
(d) ASB4 단백질, ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
[27] [1] 내지 [12]의 항원 펩타이드 및/또는 [13]의 폴리에피토프 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, [26]의 약학적 조성물.
[28] 보조제(adjuvant)를 더 포함하는 [26] 또는 [27]의 약학적 조성물.
[29] 암의 예방 및/또는 치료제인 [26] 내지 [28]의 약학적 조성물.
[30] 암의 예방 및/또는 치료용 백신인 [26] 내지 [29]의 약학적 조성물.
[31] 하기의 (a) 내지 (d) 중 어느 하나를 유효성분으로 함유하는, 세포 독성 T 세포(Cytotoxic T cells)의 유도제:
(a) [1] 내지 [12]의 항원 펩티드 또는 [13]의 폴리에피토프 펩타이드,
(b) [23]의 폴리뉴클레오티드,
(c) [24]의 발현 벡터,
(d) ASB4 단백질, ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
[32] (A) [1] 내지 [12]의 항원 펩티드 또는 [13]의 폴리에피토프 펩타이드, 또는
(B) 상기 (A)의 펩타이드 및/또는 폴리에피토프 펩티드의 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 항원 제시 능력을 갖는 세포를, in vitro에서 접촉시키는 단계를 포함하는 항원 제시 세포의 제조 방법.
[33] (A) [1] 내지 [12]의 항원 펩티드 또는 [13]의 폴리에피토프 펩타이드, 또는
(B) 상기 (A) 항원 펩타이드 및/또는 폴리에피토프 펩티드의 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 말초 혈액 림프구를, in vitro에서 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 독성 T 세포의 유도 방법.
[34] [1] 내지 [12]의 항원 펩티드와 HLA를 포함하는, HLA 멀티머(multimers).
[35] [34]의 HLA 멀티머를 포함하는 진단약.
[36] [1] 내지 [12]의 항원 펩타이드를 인식하는 항체.
[37] [1] 내지 [12]의 항원 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는, T 세포 수용체 유사 항체(T cell receptor-like antibody).
[38] [36]의 항체 및/또는 [37]의 T 세포 수용체 유사 항체를 함유하는 종양 검출제.
[39] [1] 내지 [12]의 항원 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는, 키메라 항원 수용체.
[40] [1] 내지 [12]의 항원 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는, T 세포 수용체를 포함하는, 인공 CTL.
[41] [26] 내지 [30]의 약학적 조성물을 이용한 암 치료법이 효과적인 치료 대상 환자를 선택하기 위한 진단약으로서, [14] 내지 [20]의 암 줄기세포 검출제, [34]의 HLA 멀티머, [36]의 항체 및/또는 [37]의 T 세포 수용체 유사 항체를 포함하는, 상기 진단약.
[42] 서열번호 3 내지 30 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, 암 줄기세포 특이적인 항원 펩티드.
본 발명에 의해, 암 줄기세포를 특이적으로 공격하는 CTL의 유도제로 유용한 종양 항원 펩티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및/또는 치료에 유용한 의약 조성물 등을 제공 한다.
[도 1] 도 1은 회흐스트(Hoechst) AG 33342/PI 염색한 인간 대장암세포주(SW480)의 베라파밀(Verapamil) 유무에 따른 유동 세포 계측법의 결과를 나타낸다.
[도 2-1] 도 2-1은 SW480-SP 클론 세포주 및 SW480-MP 클론 세포주에서 각각 분리된 1 세포를 배양하여 회흐스트 AG 33342/PI 염색한 유동 세포 계측법의 결과를 나타낸다.
[도 2-2] 도 2-2는 SW480-SP 클론 세포주 및 SW480-MP 클론 세포주 각각의 공초점 현미경 사진을 나타낸다.
[도 3] 도 3은, SW480-SP 클론 세포주 및 SW480-MP 클론 세포주 각각을 마우스에 이식하여 형성된 종양을 평가한 결과를 나타낸다.
[도 4] 도 4는 SW480-SP 클론 세포주 및 SW480-MP 클론 세포주 각각의 용해물에서 항 HLA-A24 항체를 이용하여 HLA와 펩타이드의 복합체를 면역 침강한 다음 분리된 펩타이드를 질량(mass) 스펙트로메트리(spectrometry)를 이용하여 서열분석한 결과를 나타낸다.
[도 5] 도 5는 SW480-SP 및 SW480-MP 각각의 mRNA를 추출하여 RT-PCR에 의한 유전자 발현의 검토를 실시했을 때의 전기영동 사진을 나타낸다. SW480-SP 클론 세포주에 특이적인 유전자로 ASB4 유전자가 확인되었다.
[도 6] 도 6은 ASB4 인간 성인 정상 조직 유래 mRNA를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
[도 7] 도 7은 ASB4의 다양한 암세포주 유래 mRNA를 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
[도 8] 도 8은 ASB4 펩타이드(IV9; 서열번호 3)의 HLA-A24에 대한 결합능을 나타낸다. IV9 및 HIV(서열번호 51), GK12(서열번호 52) 등 각종 합성 펩타이드를 T2-A24 세포에 펄스하여 유동 세포 계측법을 이용한 HLA-A24 발현량을 평가했다.
[도 9] 도 9는 IFN-γ를 코팅한 ELISPOT 플레이트를 이용한 다양한 펩타이드에 의해 펄스한 T2-A24 세포 ELISPOT 분석 결과를 나타낸다.
[도 10] 도 10은 PBMC에서 유도한 이펙터 세포(CTL), 다양한 펩타이드를 펄스한 T2-A24 세포 및 펄스하지 않은 SW480-SP 세포에 대한 세포 독성 활성을 평가한 결과를 나타낸다. 이펙터 세포는 서열번호 3으로 표시되는 ASB4 펩타이드 IV9에서 유도한 것을 사용하였다. 음성 대조군으로 MHC 클래스 I 발현을 제외한 K562 세포를 사용하였다.
[도 11] 도 11은 서열번호 4로 표시되는 펩티드(As80_9)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축은 일정한 파종 세포수 당 스팟의 수를 나타낸다. A는 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스, B는 HLA-A*24:02 유전자 도입 마우스를 이용한 시험 결과를 나타낸다. 또한 검은 막대(“w/peptide”) 및 흰 막대(“w/o”)는 각각 펩타이드 투여 마우스 유래의 비장 세포를 투여 펩타이드의 존재와 부재 하에 재자극 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 검은 막대와 흰 막대 값의 차이는 각 펩티드의 투여에 의해 마우스 생체 내에서 유도된 펩타이드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
[도 12] 도 12는 서열번호 5로 표시되는 펩티드(As82_10)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 13] 도 13은 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드(As124_10)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 14] 도 14은 서열번호 7로 표시되는 펩티드(As125_9)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 15] 도 15는 서열번호 8로 표시되는 펩티드(As184_12)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 16] 도 16은 서열번호 9로 표시되는 펩티드(As135_10)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 17] 도 17은 서열번호 10로 표시되는 펩티드(As83_10)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 18] 도 18은 서열번호 11로 표시되는 펩티드(As87_9)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 19] 도 19는 서열번호 12로 표시되는 펩티드(As307_10)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 20] 도 20은 서열번호 13로 표시되는 펩티드(As301_11)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 21] 도 21은 서열번호 14로 표시되는 펩티드(As405_9)의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 22] 도 22는 서열번호 3으로 표시되는 펩타이드 IV9의 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 23] 도 23은 서열번호 15로 표시되는 펩티드(As35_10)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 24] 도 24는 서열번호 16로 표시되는 펩티드(As92_10)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 25] 도 25는 서열번호 17로 표시되는 펩티드(As152_9)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 26] 도 26은 서열번호 18로 표시되는 펩티드(As186_10)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 27] 도 27은 서열번호 19로 표시되는 펩티드(As236_10)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 28] 도 28은 서열번호 20로 표시되는 펩티드(As265_10)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 29] 도 29는 서열번호 21로 표시되는 펩티드(As280_10)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 30] 도 30은 서열번호 22로 표시되는 펩티드(As383_10_5L)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 31] 도 31은 서열번호 23로 표시되는 펩티드(As416_10)의 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 32] 도 32는 서열번호 24로 표시되는 펩티드(As76_10)의 HLA-A*24 : 02 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 33] 도 33은 서열번호 25로 표시되는 펩티드(As192_10)의 HLA-A*24 : 02 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 34] 도 34는 서열번호 26로 표시되는 펩티드(As211_10)의 HLA-A*24 : 02 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 35] 도 35는 서열번호 27로 표시되는 펩티드(As289_10)의 HLA-A*24 : 02 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 36] 도 36은 서열번호 28로 표시되는 펩티드(As318_10)의 HLA-A*24 : 02 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 37] 도 37은 서열번호 29로 표시되는 펩티드(As365_12)의 HLA-A*24 : 02 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 38] 도 38은 서열번호 30로 표시되는 펩티드(As365_9)의 HLA-A*24 : 02 유전자 도입 마우스를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서의 CTL 유도 능력 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 11과 같다.
[도 39] 도 39는 서열번호 4로 표시되는 펩티드(As80_9)의 HLA-A*02:01 양성 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서 의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축은 파종 세포수 (약 1×105 개) 당 스팟이 수를 나타낸다. 검은 막대 (“w/peptide”) 및 흰 막대(“w/o”)는 각각 펩타이드의 존재와 부재 하에 자극 배양한 결과를 나타낸다. 즉, 검은 막대와 흰 막대 값의 차이는 각 펩타이드의 첨가에 의해 유도된 펩타이드 특이적 CTL의 수를 나타낸다.
[도 40] 도 40은 서열번호 5로 표시되는 펩티드(As82_10)의 HLA-A*02:01 양성 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서 의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 39와 같다.
[도 41] 도 41은 서열번호 6으로 표시되는 펩타이드(As124_10)의 HLA-A*02:01 양성 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서 의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 39와 같다.
[도 42] 도 42는 서열번호 8로 표시되는 펩티드(As184_12)의 HLA-A*02:01 양성 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서 의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 39와 같다.
[도 43] 도 43은 서열번호 9로 표시되는 펩티드(As135_10)의 HLA-A*02:01 양성 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서 의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 39와 같다.
[도 44] 도 44는 서열번호 5로 표시되는 펩티드(As82_10)의 HLA-A*24:02 양성 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서 의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 39와 같다.
[도 45] 도 45는 서열번호 8로 표시되는 펩티드(As184_12)의 HLA-A*24:02 양성 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 인터페론 γ ELISPOT 분석에 따른 in vivo에서 의 CTL 유도 능력의 평가 결과를 나타낸다. 세로축, A, B, 검은 막대 및 흰 막대는 각각 도 39와 같다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에서 "에피토프 펩타이드"는 MHC (인간에서는 HLA)와 결합하여 세포 표면에 항원 제시하며 항원성을 갖는(T 세포에 인식될 수 있음) 펩타이드를 의미한다. 에피토프 펩티드는 MHC 클래스 I과 결합하여 항원 제시되어 CD8 양성 T 세포에 인식된 에피토프 펩티드인 CTL 에피토프 펩티드 및 MHC 클래스 II와 결합하여 항원 제시되고 CD4 양성 T 세포에 인식되는 에피토프 펩티드인 헬퍼 에피토프 펩타이드가 포함된다.
에피토프 펩타이드 중 종양 세포에서 특이적으로 또는 과도하게 발현되는 단백질 유래 펩타이드를, 특히 종양 항원 펩티드라 한다. 항원 제시란, 세포 내에 존재하는 펩티드가 MHC와 결합할 경우, 이 MHC/항원 펩타이드 복합체가 세포 표면에 국재화(Localization)하는 현상을 말한다. 상술한 바와 같이, 세포 표면에 제시된 항원은 T 세포 등으로 인식된 후 세포성 면역과 체액성 면역을 활성화하는 것으로 알려져 있으며, MHC 클래스 I에 제시된 항원은 세포성 면역을 활성화하고, 나이브(naive) T 세포의 T 세포 수용체에 인식되어, 나이브 T 세포를 세포 독성 활성을 갖는 CTL로 유도하기 위해 면역 요법에 이용되는 종양 항원 펩티드로는 MHC 클래스 I과 결합하여 항원 제시되는 펩타이드가 바람직하다.
본 발명에서 "종양 (tumor)"은 양성 종양과 악성 종양(암, 악성 신생물)을 포함한다. 암(cancer)은 조혈 종양, 상피 악성 종양(암, carcinoma)과 비 상피 악성 종양(육종, sarcoma)를 포함한다. 본 발명에 있어서 "암 줄기세포"는 암 조직에 존재하는 세포 중 줄기세포 모양의 성질을 나타내는 세포를 말하나 암의 발생, 재발 및 전이에 관련된 원인 세포로 간주할 수 있는 세포이다. 일반적으로 '암 줄기세포'는 암 조직에서 소량밖에 존재하지 않기 때문에 다른 세포와 구별하기 어렵지만, 당해 기술 분야에서 암 줄기세포를 단리/농축하는 방법은 공지되어 있고, 예를 들어 SP 분획법 등을 들 수 있다. 따라서 본 발명에 있어서 "암 줄기세포"는 공지의 암 줄기세포 분리/농축법에 의해 분리/농축된 세포 집단을 의미하고 있다.
본 발명은 실제로 세포 표면에 항원 제시되는 자연 펩타이드를 단리/동정할 수 있는 하기의 방법을 사용함으로써, 본 발명의 자연 펩타이드를 단리/동정하였다. 또한, 본 발명에서 "자연 펩타이드”는 실제로 세포 표면에 항원 제시되는 펩타이드를 말한다. 또한 "자연 항원 펩티드"는 자연 펩타이드 중 항원성을 확인할 수 있는 것을 말한다. 이 자연 항원 펩티드를 암세포에서 분리하여 배열 및 그 유래를 결정하는 것으로, CTL을 이용한 암의 표적 치료에 유용한 지식을 얻는 것이 가능하다.
본 발명에서 이용한 자연 펩타이드의 분리/동정 방법은 자연 펩타이드를 제시하고 있는 암 줄기세포를 용해하고 용해 물질(Lysate)에서 MHC와 자연 펩타이드의 복합체를 분리하는 단계, 분리된 복합체를 MHC 분자와 자연 펩타이드로 분리하여 자연 펩타이드를 분리하는 단계, 분리된 자연 펩타이드를 동정하는 단계이 포함된다.
MHC와 자연 펩타이드 복합체의 분리는 MHC에 대한 특이 항체를 이용한 면역 침강법에 의한 펩타이드/MHC 복합체의 추출법을 채용했다.
적절한 항 MHC 항체로서 항 HLA-A02 항체, 항 HLA-A24 항체 등의 HLA 클래스 I에 대한 항체를 사용했다.
복합체를 MHC 분자와 자연 펩타이드로 분리하는 단계은 약산성을 이용한 펩타이드 분리를 실시했다.
또한, 상기 분리 자연 펩타이드의 서열을 액체 크로마토그래피와 탠덤 질량 스펙트럼메 트리와 결합한 단백질 서열 분석 방법을 이용하여 분석하고 실제로 세포 표면에 항원 제시되는 자연 펩타이드를 동정했다.
상기에 의해 분리된 자연 펩티드 항원을 확인하는 방법으로 세포 독성 시험, ELISPOT 분석, TCR 상 항체(TCR like antibody)를 이용한 분석 등을 이용했다.
본 발명자들은 상기 방법으로 인간 암 줄기세포에서 항원 제시되는 자연 항원 펩티드를 분석했다. 그 결과 암 줄기세포에서 항원 제시되는 자연 항원 펩티드로서 ASB4 단백질 유래 펩타이드(서열번호 3)가 확인되었다. 여러 지식을 바탕으로 더욱 연구를 진행한 결과, ASB4 유전자가 암 줄기세포에서 특이적으로 높은 발현을 하고 암 줄기세포에 대한 분자 표적 치료의 유용한 후보 유전자임을 발견하였다. ASB4이 종양 항원인 것, 더욱이 ASB4 유래 펩타이드가 종양 세포 표면에 HLA 클래스 I 항원과 결합하여 복합체를 형성하여 세포 표면에 옮겨져 항원 제시되는 것은 지금까지 전혀 알려지지 않은 새로운 연구 결과이다.
<1> 본 발명의 펩타이드
본 발명에서 "인간 ASB4 단백질"은 Mizuno Y, et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Feb 8; 290 (5):1499-505이나 Yang CS, et al. Cell Rep. 2014 Jul 24; 8 (2):327-37에서 보고된 공지의 단백질을 의미하며, 구체적으로는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열(Genbank Accession No:NP_057200; ASB4 isoform a)로 표시되는 단백질, 그의 동형단백질(Isoform) 및 그 상동체(homologue)를 말한다. 상기 동형단백질로는, 예를 들면 접합 변형 개체 차이에 따른 SNP 등의 변형 등을 들 수 있다. 구체적으로는 (1) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에서 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 단백질, (2) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열에서 1 이상, 바람직하게는 1 ~ 복수 개, 더욱 바람직하게는 1 ~ 10개, 1 ~ 5개, 1 ~ 3개, 1 또는 2개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 들 수 있다. 이러한 변형으로 ASB4 isoform a 접합 변종(Splicing variant)인 Genbank Accession No.:NP_665879로 등록되어 있는 동형단백질형 (ASB4 isoform b)과 17번째 아미노산이 발린(V)에서 류신(L)으로 치환된 dbSNP RefSNP No.: rs35047380의 SNP 등을 예시할 수 있다. 본 명세서에서 단순히 "ASB4 단백질"이라는 경우는 별도의 설명이 없는 한 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 인간 ASB4 단백질을 의미한다.
인간 ASB4 단백질로서, 바람직하게는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 상기 단백질에서 1 ~ 3개, 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 펩티드는 한 구체예에서, 인간 ASB4 단백질의 부분 펩티드이며, MHC 특히 HLA와 결합하는 펩타이드, 바람직하게는 MHC 특히 HLA 의해 항원 제시되는 펩타이드, 더욱 바람직하게는 MHC 특히 HLA 의해 항원 제시되어 CTL을 유도할 수 있는 펩티드를 포함한다. HLA는 여러 형태가 존재하지만, 본 발명의 펩티드는 바람직하게는 HLA 클래스 I에 결합 가능하며, 보다 바람직하게는 HLA-A02 또는 HLA-A24 결합 가능하며, 더욱 바람직하게는 HLA- \A02 및 HLA-A24에 모두 결합 가능(즉 듀얼 결합성)하다. 본 발명의 펩티드는 MHC에 결합하기 전에 프로세싱 등의 처리를 거쳐도 좋고, 그 처리 결과 에피토프 펩티드를 생성하는 펩타이드도 본 발명의 펩티드에 포함된다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 에피토프 펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 배열이면, 아미노산 길이는 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 본 발명의 펩타이드 자체가 에피토프 펩티드인 것이 바람직하고, 따라서 아미노산 길이는 약 8 ~ 14 아미노산 정도가 바람직하고, 약 8 ~ 11 아미노산 정도가 보다 바람직하고, 약 9 ~ 약 11 아미노산 정도가 특히 바람직하다.
인간의 MHC 클래스 I인 HLA 클래스 I와 결합하는 에피토프 펩타이드는 약 8 ~ 14 아미노산 길이, 바람직하게는 약 9 ~ 11 아미노산 길이이고, 그 배열에서 결합하는 HLA 특유의 결합 모티브를 가지는 것이 알려져 있다. 예를 들어 HLA-A02과 결합하는 펩티드는 N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌이며, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신이라는 결합 모티브를 가지며, HLA- A24과 결합하는 펩티드는 N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이며, 및/또는 C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌이라는 결합 모티프가 있다.
따라서 본 발명의 펩타이드는 바람직한 일 구체예에서, ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 ~ 14 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌이며, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신인 펩타이드인 에피토프 펩타이드를 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 에피토프 펩타이드 자체이다. 그 중에서도 특히 바람직한 것은 서열번호 4, 6, 7, 10, 14, 15, 17 ~ 19, 21 ~ 23, 26, 28, 31, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프 펩타이드이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 부분 펩티드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 대체되는 펩티드인 에피토프 펩타이드를 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 에피토프 펩타이드 자체이다. 그 중에서도 특히 바람직한 것은 서열번호 4, 6, 7, 10, 14, 15, 17 ~ 19, 21 ~ 23, 26, 28, 31, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 에피토프 펩타이드이다.
본 발명의 펩타이드는 다른 바람직한 구체예에서, ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 ~ 14 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌 메티오닌 또는 트립토판이며, 및/또는 C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌인 펩타이드인 에피토프 펩타이드를 포함하고, 보다 바람직하게는 상기 에피토프 펩타이드 자체이다. 그 중에서도 특히 바람직한 것은 서열번호 9, 21, 25, 30, 32, 35 및 37 중 어느 하나에 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 에피토프 펩타이드이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 부분 펩티드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 타이로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌 치환된 펩타이드인 에피토프 펩타이드를 포함하며, 보다 바람직하게는 상기 에피토프 펩티드 그 자체이다. 그 중에서도 특히 바람직한 것은 서열번호 9, 21, 25, 30, 32, 35 및 37 중 하나에 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 에피토프 펩타이드이다.
본 발명의 펩타이드는 다른 바람직한 구체예에서, 상기 부분 펩티드 또는 치환된 부분 펩티드에서, 또한 N 말단 및/또는 C 말단에 1개에서 여러 개의 아미노산이 부가된 펩타이드이다.
그 중에서도 특히 바람직한 것은 서열번호 4, 6, 7, 10, 14, 15, 17 ~ 19, 21 ~ 23, 26, 28, 31, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 상기 펩타이드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 펩타이드, 서열번호 9, 21, 25, 30, 32, 35 및 37 중 어느 하나에 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 또는 상기 펩타이드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 펩타이드에서 또한 N 말단 및/또는 C 말단에 1개 또는 몇 개의 아미노산이 부가된 펩타이드이다.
따라서, 본 발명의 펩티드는 한 구체예에서,
Y0-X0-Z0
로 나타낼 수 있다. 여기서, X0, Y0 및 Z0는 모두 펩타이드이다.
관련된 구체예에서, X0는 하기 (1) ~ (4)에서 선택되는 펩티드이다:
(1) ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 ~ 14 아미노산, 바람직하게는 8 ~ 11 아미노산 이루어지고, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌이고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신인 펩타이드;
(2) (1) 부분 펩티드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 펩타이드;
(3) ASB4 단백질의 부분 펩티드이며, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 ~ 14 아미노산, 바람직하게는 8 ~ 11 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이며, 및/또는 C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌인 펩타이드; 또는
(4) (3) 부분 펩티드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 펩타이드;
여기에서 (2)는 (1)의 치환 상동체이며, (4)는 (3)의 치환 상동체이기 때문에 X0이 (2) 또는 (4)의 펩타이드인 Y0-X0-Z0를 특히 "X0 상동체”라고 한다.
또한 Y0 및 Z0는 서로 독립적으로 0에서 몇 개의 아미노산으로 이루어진 임의의 펩타이드이다. 여기서 "0에서 몇 개의 아미노산"은 구체적으로는 0 ~ 5개의 아미노산을 의미하며, 예를 들어 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 0개, 1개, 2개 또는 3개의 아미노산을 들 수 있고, 특히 바람직한 것은 0개 또는 1개이다. 본 발명에서 Y0 및/또는 Z0가 '존재하지 않는다'의 경우 Y0 및/또는 Z0이 0개의 아미노산 이루어진 펩타이드인 경우를 의미한다.
여기서 Y0 및/또는 Z0을 구성하는 아미노산은 특별히 한정이 없고, 단백질을 구성하는 천연 아미노산 20종류의 임의의 것을 들 수 있는데, 바람직하게는 생체 내에 존재하는 효소에 의해 절단될 수 있는 아미노산을 들 수 있다. 또한 ASB4 단백질의 아미노산 서열에서 상기 부분 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단의 아미노산 서열에 상당하는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.
따라서 그 중에서도 더욱 특히 바람직한 것은 X0가 서열번호 4, 6, 7, 10, 14, 15, 17 ~ 19, 21 ~ 23, 26, 28, 31, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 하나에 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 상기 펩타이드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 펩타이드 서열번호 9, 21, 25, 30, 32, 35 및 37 중 하나에 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 또는 상기 펩티드에서 N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 펩타이드 중 하나이며, 또한 Y0 및/또는 Z0이 1개의 아미노산인 경우이며, 더욱 바람직하게는 Y0 또는 Z0의 어느 한쪽이 1개의 아미노산이며, 다른 하나는 존재하지 않는 경우이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, X0가 8-11 아미노산으로 이루어진 상기 (1) ~ (4) 중 하나이며, Y0 및/또는 Z0가 서로 독립적으로 0 ~ 3 개의 아미노산으로 구성되는 펩티드이며, Y0-X0-Z0가 전체로 9 ~ 14의 아미노산 길이인 ASB4 단백질의 부분 펩티드 또는 X0 상동체를 구성하는 경우를 들 수 있다. 관련된 양태로는 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 X0가 서열번호 3 ~ 7 및 9 ~ 19, 21 ~ 28, 30 ~ 46 중 어느 하나에 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드이며, 관련한 X0의 N 말단 및/또는 C 말단에 0-3개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 Y0 및/또는 Z0이 부가되어 있지만, 이러한 Y0-X0-Z0 또한 ASB4 단백질의 부분 펩티드가 될 경우를 들 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 바람직한 일 구체예에서, X0가 서열번호 3 ~ 7, 9 ~ 28 및 30의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함한다. 이러한 양태에서, 보다 바람직하게는 본 발명의 펩타이드 (즉 Y0-X0-Z0)가 모두 상기 ASB4 단백질의 부분 펩티드이다. 이러한 보다 바람직한 예에 있어서, 예를 들어 본 발명의 펩타이드는 서열번호 3 ~ 30의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다.
서열번호 3 ~ 30로 표시되는 펩타이드는 각각 상기 ASB4의 아미노산 위치 319번째 ~ 327번째에 해당하는 9 아미노산(서열번호 2), 80번째 ~ 88번째에 해당하는 9 아미노산(서열번호 4), 82 ~ 91번째 10 아미노산(서열번호 5), 124 ~ 133번째 10 아미노산(서열번호 6), 125 ~ 133번째 9 아미노산(서열번호 7), 184 ~ 195번째 12 아미노산(서열번호 8), 135 ~ 144번째 10 아미노산(서열번호 9), 83 ~ 92번째 10 아미노산(서열번호 10), 87 ~ 95번째 9 아미노산(서열번호 11), 307 ~ 316번째 10 아미노산(서열번호 12), 301 ~ 311번째 11 아미노산(서열번호 13) 및 405 ~ 413번째 9 아미노산(서열번호 14), 3 ~ 44번째 10 아미노산(서열번호 15), 92 ~ 101번째 10 아미노산(서열번호 16), 152 ~ 160번째 9 아미노산(서열번호 17), 186 ~ 195번째 10 아미노산(서열번호 18), 236 ~ 245번째 10 아미노산(서열번호 19), 265 ~ 274번째 10 아미노산(서열번호 20), 280 ~ 289번째 10 아미노산(서열번호 21), 383 ~ 392번째 10 아미노산(서열번호 22), 416 ~ 425번째 10 아미노산(서열번호 23), 76 ~ 85번째 10 아미노산(서열번호 24), 192 ~ 201번째 10 아미노산(서열번호 25), 211 ~ 220번째 10 아미노산(서열번호 26), 289 ~ 70-298번째 10 아미노산(서열번호 27), 318 ~ 327번째 10 아미노산(서열번호 28), 365 ~ 376번째 12 아미노산(서열번호 29), 365 ~ 373번째 9 아미노산(서열번호 30)으로 구성된 펩티드이며, 이 중 어느 펩타이드도 HLA-A02 및/또는 HLA-A24과 결합 가능하다는 것은 본 발명자들에 의해 발견된 것이다. 특히 서열번호 3 ~ 23, 25, 26 및 28 ~ 30로 표시되는 펩티드는 또한 CTL 유도능을 갖는 것이 본 발명자들에 의해 발견되었다.
더 바람직한 구체예에서, X0가 서열번호 4 ~ 7, 9 ~ 12 및 15 ~ 19 및 21 ~ 23의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함한다. 이러한 양태에서, 보다 바람직하게는 본 발명의 펩타이드 (즉 Y0-X0-Z0)가 모두 상기 ASB4 단백질의 부분 펩티드이다. 이러한 보다 바람직한 구체예에서, 예를 들어 본 발명의 펩타이드는 서열번호 4 ~ 12 및 15 ~ 23의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다.
서열번호 4 ~ 12 및 15 ~ 23로 표시되는 어느 하나의 펩타이드도 HLA-A02와 결합 가능하며, 한편으로 CTL 유도능을 갖는 것이 본 발명자들에 의해 발견된 것이다.
다른 더 바람직한 구체예에서, X0가 서열번호 3 ~ 7, 9, 13, 14, 18, 24 ~ 28 및 30의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함한다. 이러한 양태에서, 보다 바람직하게는 본 발명의 펩타이드 (즉 Y0-X0-Z0)가 모두 상기 ASB4 단백질의 부분 펩티드이다. 이처럼 보다 바람직한 구체예에서, 예를 들어 본 발명의 펩타이드는 서열번호 3 ~ 9, 13, 14, 25, 26 및 28 ~ 30에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다.
서열번호 3 ~ 9, 13, 14, 25, 26 및 28 ~ 30로 표시되는 중 펩타이드도 HLA-A024과 결합 가능하며, 한편 CTL 유도능을 갖는 것이 본 발명자들에 의해 발견된 것이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, X0가 서열번호 4 ~ 7, 9 및 18의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함한다. 이러한 양태에서, 보다 바람직하게는 본 발명의 펩타이드(즉 Y0-X0-Z0)가 모두 상기 ASB4 단백질의 부분 펩티드이다. 이와 같은 보다 바람직한 구체예에서, 예를 들어 본 발명의 펩타이드는 서열번호 4 ~ 9에 기재된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다.
서열번호 4 ~ 9로 표시되는 어느 하나의 펩타이드도 HLA-A02 및 HLA-A24 모두와 결합 가능하며, 한편 CTL 유도능을 갖는 것이 본 발명자들에 의해 발견된 것이다. 그 중에서도 특히 서열번호 4 ~ 6, 8 및 9로 표시되는 펩티드가 바람직하고, 서열번호 5 및 8로 표시되는 펩타이드가 가장 바람직하다.
본 발명의 펩티드는 N 말단 및/또는 C 말단이 수식되어 있어도 좋다. 해당 수식으로서 구체적으로는, N-alkanoyl화 (예를 들어, 아세틸화), N-alkyl화 (예를 들면, 메틸화), C 말단 알킬 에스테르(C-terminal alkyl ester) (예를 들면, 에틸 에스테르), C 말단 아미드(C-terminal amide)(예 카르복사미드(Carboxamide)) 등을 들 수 있다.
본 발명의 펩타이드 합성은 일반적으로 펩타이드 화학에서 사용되는 기존 방법에 준하여 수행할 수 있다. 이러한 알려진 방법으로는 문헌(Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; 펩타이드 합성, Maruzen (주), 1975; 펩티드 합성의 기초 실험, Maruzen (주), 1985; 의약품 개발 계속 제 14 권, 펩티드 합성, 히로카와 서점, 1991, 이 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성) 등에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 펩티드는 후술하는 CTL 유도 방법이나 인간 모델 동물을 이용한 분석 (WO02/47474 호 공보, Int J. Cancer : 100,565-570 (2002)) 등으로 제공하여 in vivo에서의 활성을 확인할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 다른 일 양태에서 HLA-A02 및/또는 HLA-A24에 결합하는 펩타이드를 포함한다. 구체적으로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 서열번호 3 ~ 30 중 어느 하나에 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 들 수 있다. 이러한 펩티드는 반드시 HLA-A02 또는 HLA-A24 결합 모티프를 갖는 것은 아니지만, 본 발명자들에 의해 실제로 HLA-A02 및/또는 HLA-A24에 결합하는 것으로 확인된 펩타이드이다. 특히 서열번호 3 ~ 23, 25, 26 및 28 ~ 30 중 어느 하나에 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드는 또한 CTL 유도능을 갖는 것이 확인되고 있어 바람직하다.
본 발명의 펩티드는 또한, 상기 본 발명의 펩타이드를 적어도 하나 포함하는 복수개의 에피토프 펩타이드를 연결한 펩타이드(폴리에피토프 펩티드)도 포함된다. 따라서, 상기 폴리에피토프 펩티드이며, CTL 유도 활성을 가지는 펩타이드도 본 발명의 펩티드의 구체적인 예로서 예시할 수 있다.
본 발명의 폴리에피토프 펩티드는 구체적으로는,
(i) 본 발명의 펩타이드(에피토프 펩티드) 및 임의의 본 발명의 펩티드 이외의 1 또는 2 이상의 CTL 에피토프 펩티드를 직접 또는 적절한 스페이서를 통해 연결한 펩타이드,
(ii) 본 발명의 펩타이드 및 임의의 1 또는 2 이상의 헬퍼 에피토프 펩티드를 직접 또는 적절한 스페이서를 통해 연결한 펩타이드, 또는,
(iii) 상기 (i)에 기재된 폴리에피토프 펩타이드에 다시 1 또는 2 이상의 헬퍼 에피토프 펩티드를 직접 또는 적절한 스페이서를 통해 연결한 펩타이드이고,
항원 제시 세포 내에서 프로세싱을 받아 생긴 에피토프 펩타이드가 항원 제시 세포에 제시되어 CTL 유도 활성을 이끄는 펩타이드로 정의될 수 있다.
여기에서 (i)의 본 발명의 펩티드 이외의 CTL 에피토프 펩타이드로는 특별히 제한은 없지만, 구체적으로는, 예를 들어 본 발명에 포함되지 않은 다른 사람 ASB4 유래의 에피토프 펩티드와 인간 OR7C1, 인간 DNAJB8 유래의 에피토프 펩티드(예를 들면, 국제 공개 제 2010/050190 호에 기재된 펩타이드), 인간 FAM83B 유래의 에피토프 펩타이드(국제 출원 제 PCT/JP2014/076625 호) 등을 들 수 있다.
스페이서로는 항원 제시 세포 내에서 프로세싱에 악영향을 미치지 않는 것이면 특별히 한정되지 않고, 바람직하게는 각각의 에피토프 펩티드 및 펩티드 결합으로 연결되는 링커이며, 예를 들어 일부 아미노산이 결합된 펩티드 링커와 양쪽에 아미노기와 카르복실기를 갖는 링커 등을 들 수 있다. 구체적으로는 글리신 링커 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 링커 등을 들 수 있고, 글리신 링커로는 폴리글리신 (예를 들면 글리신 6개로 구성된 펩타이드; Cancer Sci, vol.103, p150-153)을 들 수 있고, PEG 링커로는 PEG의 양쪽에 아미노기와 카르복시기를 갖는 화합물 유래의 링커를 들 수 있다(예를 들어, H2N-(CH2)2-(OCH2CH2)3-COOH; Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7551-7556).
본 발명의 폴리에피토프 펩타이드에 포함된 본 발명의 에피토프 펩티드는 1종 또는 2종 이상이 선택될 수 있다. 즉, 동일한 에피토프 펩타이드가 복수 연결되어 있어도 좋고, 서로 다른 에피토프 펩타이드가 결합된 것이어도 좋다. 물론 2종 이상의 에피토프 펩타이드가 선택되는 경우에도 선택된 에피토프 펩타이드 중 1종 또는 2종 이상이 복수 연결되어 있다. 본 발명의 펩티드 이외의 에피토프 펩티드에 대해서도 여러 종 및/또는 복수의 에피토프 펩타이드가 연결되어 있다. 본 발명의 폴리에피토프 펩타이드는 2 ~ 12개의 에피토프 펩타이드가 결합된 것으로서 주로, 바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 10개, 11개, 12개 에피토프 펩타이드가 연결되어 있으며, 가장 바람직하게는 2개의 에피토프 펩타이드가 연결되어 있다.
여기서, 본 발명의 펩타이드에 연결시키는 에피토프 펩타이드가 헬퍼 에피토프 펩타이드의 경우 사용되는 헬퍼 에피토프 펩타이드로는, 예를 들어 B형 간염 바이러스 유래의 HBVc128-140 및 파상풍 독소 유래 TT947-967 등을 들 수 있다. 또한 해당 헬퍼 에피토프 펩티드의 길이로는 13 ~ 30 아미노산 정도, 바람직하게는 13 ~ 17 아미노산 정도를 들 수 있다.
이러한 복수의 에피토프 펩타이드를 연결시킨 펩티드(폴리에피토프 펩티드) 또한 전술한 바와 같이 일반적인 펩타이드 합성법에 의해 제조할 수 있다. 또한 이러한 여러 에피토프 펩타이드를 연결시킨 폴리에피토프 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 정보에 따라 정상적인 DNA 합성 및 유전자 공학 기술을 이용하여 제조할 수도 있다.
즉 해당 폴리뉴클레오티드를 주지의 발현 벡터에 삽입하여 얻은 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하여 제작된 형질 전환체를 배양하고, 배양물로부터 목적의 복수 에피토프를 연결시켜 폴리에피토프 펩티드를 회수함으로써 제조할 수 있다. 이러한 방법은 전술한 바와 같이 문헌(Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS (1985))에 기재된 방법 등에 준하여 수행할 수 있다.
이상에서와 같이 제조된 복수의 에피토프 펩타이드를 연결시킨 폴리에피토프 펩티드를 상술하는 in vitro 분석 및 국제 공개 제 02/47474 호 및 Int J. Cancer:100,565-570 (2002)(이 문헌들은 인용에 의해 본원의 일부를 구성)에 기술하는 인간 모델 동물을 이용한 in vivo 분석에 제공하는 것 등에 의해 CTL 유도 활성을 확인할 수 있다.
본 발명의 펩티드(폴리에피토프 펩티드를 포함)는 본 명세서에 기재된 바와 같이 암의 예방 및/또는 치료 등에 유용하며 약학 조성물의 유효성분으로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 것이어도 좋다. 또한, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 펩티드의 이용에 관한 것이다.
<2> 본 발명의 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 본 발명의 펩타이드를 적어도 하나 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 cDNA 나 mRNA, cRNA 또는 합성 DNA 중 하나가 될 수 있다. 또한 1가닥, 두 가닥 중의 어떠한 형태일 수 있다. 구체적으로는, 이에 한정하는 것은 아니지만 예를 들어, MHC와 펩티드 결합 예측 프로그램인 BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/) 및 IEDB(MHC-I processing predictions; http : //www.iedb.org/) 등을 이용하여 예측된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 3 ~ 46에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 3 ~ 46에서 선택되는 임의의 2 이상의 펩타이드, 또는 서열번호 3 ~ 46 에서 선택되는 펩타이드 및 헬퍼 에피토프를 연결시킨 폴리에피토프 펩타이드를 각각 발현 가능하도록 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 등을 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 1가닥 및 2가닥 중의 어떠한 형태도 취할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 2가닥의 경우, 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 삽입하여 본 발명의 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다. 즉 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 범주는 본 발명의 2 가닥형 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터에 삽입하여 제작된 재조합 발현 벡터도 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 암의 예방 및/또는 치료 등에 유용하며 약학 조성물의 유효성분으로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 것이어도 좋다. 또한, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 사용에도 관한다.
본 발명에서 사용하는 발현 벡터는 사용할 숙주와 목적 등에 따라 다양한 것을 사용할 수 있고, 당업자라면 적당히 선택할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 발현 벡터로는, 예를 들어 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 예를 들어, 숙주가 대장균의 경우 벡터로는 pUC118, pUC119, pBR322, pCR3 등의 플라스미드 벡터, λZAPII, λgt11 등의 파지 벡터를 들 수 있다. 숙주가 효모의 경우 벡터로는 pYES2, pYEUra3 등을 들 수 있다. 숙주가 곤충 세포의 경우에는 pAcSGHisNT-A 등을 들 수 있다. 숙주가 동물 세포의 경우에는 pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV, pRc/CMV 등의 플라스미드 벡터 및 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 들 수 있다.
상기 벡터는 발현 유도 가능한 프로모터, 시그널 서열을 암호화하는 유전자, 선택용 마커 유전자, 터미네이터 등의 요소를 적절히 가지고 있어도 좋다. 또한 분리 정제가 용이하도록 티오레독신(Thioredoxin), His 태그 또는 GST (글루타티온 S-전이 효소) 등과의 융합 단백질로 발현하는 서열이 부가되어 있어도 좋다. 이 경우 숙주 세포 내에서 기능하는 적절한 프로모터 (lac, tac, trc, trp, CMV, SV40 초기 프로모터 등)을 갖는 GST 융합 단백질 벡터 (pGEX4T 등)와 Myc, His 등의 태그 서열을 갖는 벡터 (pcDNA3.1/Myc-His 등), 또한 티오레독신 및 His-tag의 융합 단백질을 발현하는 벡터 (pET32a) 등을 사용할 수 있다.
상기에서 제작된 발현 벡터로 숙주를 형질 전환하여 해당 발현 벡터를 함유하는 형질 전환 세포를 제작할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 유전자 도입용 조성물이 포함된다.
형질 전환에 사용되는 숙주로는 본 발명의 폴리펩티드가 가지는 기능을 해치지 않는 한 어떠한 세포를 이용해도 좋고, 예를 들면 대장균, 효모, 곤충 세포, 동물 세포 등을 들 수 있다. 대장균으로는 E.coli K-12 계통의 HB101 주, C600 주, JM109 , DH5α주, AD494 DE3) 등을 들 수 있다. 또한 효모로는 Saccharomyces cerevisiae 등을 들 수 있다. 동물 세포로는 L929 세포, BALB/c3T3 세포, C127 세포, CHO 세포, COS 세포, Vero 세포, HeLa 세포, 293-EBNA 세포 등을 들 수 있다. 곤충 세포로는 sf9 등을 들 수 있다.
숙주 세포에 발현 벡터의 도입 방법으로는, 상기 숙주 세포에 적합한 통상의 도입 방법을 사용하면 된다. 구체적으로는 인산 칼슘법, DEAE-덱스트란 법, 일렉트로포레이션법, 유전자 도입용 리피드(Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL 사)를 이용하는 방법 등이 있다. 도입 후 선택 마커를 포함하는 일반 배지에서 배양함으로써, 상기 발현 벡터가 숙주 세포 중에 도입된 형질 전환 세포를 선택할 수 있다.
상기와 같이 얻어진 형질 전환 세포를 적합한 조건 하에서 배양을 계속하여 본 발명의 펩타이드를 제조할 수 있다. 얻어진 펩타이드는 일반적인 생화학 정제 수단에 의해 더욱 분리 및 정제할 수 있다. 여기에서 정제 수단으로는 염석(Salting out), 이온 교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 또한 본 발명의 펩티드를 상기 티오레독신이나 His 태그, GST 등의 융합 단백질로서 발현시킨 경우 이러한 융합 단백질과 태그의 성질을 이용한 정제법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 DNA의 형태일 수도 RNA의 형태일 수도 있다. 이러한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열 정보 및 그로 인하여 암호화되는 DNA의 서열 정보에 근거하여 당해 기술 분야에 공지된 통상의 방법을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 구체적으로는 일반적으로 DNA 합성과 PCR에 의한 증폭 등으로 제조할 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 상기 에피토프 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
<3> 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 하는 CTL 유도제 /약학 조성물
본 발명의 펩티드는 CTL 유도 활성을 가지며, 종양 항원 펩티드로서 CTL 유도제가 될 수 있다. 또한 상술한 바와 같이, 본 발명자들에 의해 ASB4 단백질이 종양 항원인 것, ASB4 단백질 유래의 펩타이드가 종양 세포 표면에 HLA 클래스 I 항원과 결합하여 복합체를 형성하여 세포 표면에 옮겨져 항원 제시되고 있는 것이 처음 발견되었다. 따라서 ASB4 단백질 자체도 CTL 유도제가 될 수 있다.
즉, HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원이 양성인 사람에서 말초 혈액 림프구를 단리하여, in vitro에서 본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질을 첨가하여 자극함으로써, 상기 펩티드를 펄스한 HLA-A02 항원 양성 세포 또는 HLA-A24 항원 양성 세포를 특이적으로 인식하는 CTL을 유도할 수 있다(J.Immunol. 154, p2257,1995). 여기서 CTL의 유도 여부는 예를 들면, 항원 펩티드 제시 세포에 반응하여 CTL이 생산하는 다양한 사이토 카인(예를 들면 IFN-γ)의 양을, 예를 들어 ELISA 법 등으로 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한 51Cr로 표지한 항원 펩티드 제시 세포에 대한 CTL의 독성을 측정하는 방법(51Cr 자료 분석, Int.J.Cancer 58 : p317,1994)으로도 확인할 수 있다.
또한 Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med 333, 1038-1044, 1995 등에 기재된 방법에 따라 CTL 클론을 수립할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질에 의해 유도된 CTL은 본 발명의 펩타이드 및/또는 다른 ASB4 단백질 유래의 에피토프 펩티드를 항원으로 제시하는 세포에 대한 독성 작용과 림포카인의 생산 능력이 있다. 본 발명의 펩타이드는 상술한 바와 같이 종양 항원 펩티드이며, 또한 ASB4 단백질은 세포 내에서 분해되어 종양 항원 펩티드를 발생하기 때문에 그 기능을 통해 항종양 작용, 바람직하게는 항암 작용을 발휘할 수 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질 및 이를 통해 유도된 CTL은 암의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 및 약학 조성물의 유효성분으로 할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질을 유효성분으로 함유하는 CTL 유도제를 암 환자에게 투여하면 항원 제시 세포의 HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원에 본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질 유래의 에피토프 펩티드가 제시되고, HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원과 제시된 펩타이드의 결합 복합체 특이적 CTL이 증식하여 암세포를 파괴할 수 있으며, 그 결과 암을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질을 유효성분으로 하는 CTL의 유도제는 바람직하게는 HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원 양성의 대상이며, ASB4 양성암에 걸려 있는 대상에 사용할 수 있다. ASB4 양성암으로는, 예를 들어 대장암, 폐암, 유방암, 구강암, 자궁 경부암, 갑상선암, 고환암, 난소암 등의 암(종양) 등이 열거될 수 있고, 본 발명의 CTL 유도제는, 이러한 암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
여기에 암 "예방"은 환자의 암에 이환의 예방뿐만 아니라 수술에 의해 원발소의 종양을 절제한 환자에서 재발 예방, 수술, 방사선 요법이나 약물 요법 등의 암 치료에 의해 완전히 제거하지 못한 종양의 전이 방지 등이 포함된다. 또한 암 "치료"는 암을 축소시키는 암 치료 및 증상 개선뿐 아니라 암세포의 증식, 종양의 확대 또는 원발소에서 암세포의 전이를 억제하는 진행 방지 등이 포함된다.
본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질을 유효성분으로 하는 CTL 유도제, 예를 들어 서열번호 2에 기재된 ASB4 양성암을 앓고 있는 HLA-A02 또는 HLA-A24 양성암 환자에 대해 특히 효과적이다. 구체적으로는, 예를 들어, 대장암, 폐암, 난소 암 등의 암(종양)의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 약학 조성물은 바람직하게는 암의 예방 및/또는 치료용 조성물, 즉 암의 예방 및/또는 치료제이다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 암세포(바람직하게는 암 줄기세포)에 특이적인 CTL을 유도, 즉 암세포 특이적인 세포성 면역을 활성화함으로써 암을 예방 및/또는 치료하는 것이기 때문에, 바람직하게는 암의 예방 및/또는 치료용 백신이다.
본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 하는 약학 조성물은 하나의 CTL 에피토프(본 발명의 펩타이드)을 유효성분으로 하는 것으로도 좋고, 또 다른 펩타이드 (CTL 에피토프 및 헬퍼 에피토프)와 연결된 폴리에피토프 펩타이드를 유효성분으로 하는 것이어도 좋다. 최근 여러 CTL 에피토프(항원 펩티드)을 연결한 폴리에피토프 펩타이드가 in vivo에서 효율적으로 CTL 유도 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어 Journal of Immunology 1998, 161:3186-3194(본 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성)에는 암 항원 단백질 PSA 유래의 HLA-A2, -A3, -A11, -B53 구속성 CTL 에피토프 (항원 펩티드)을 연결한 약 30mer의 폴리에피토프 펩타이드가 in vivo에서 각각의 CTL 에피토프에 특이적인 CTL을 유도한 것으로 기재되어 있다. 또한 CTL 에피토프와 헬퍼 에피토프를 연결시킨 폴리에피토프 펩타이드에 의해 효율적으로 CTL이 유도될 수도 있다. 이러한 폴리에피토프 펩타이드 형태로 투여한 경우, 폴리에피토프 펩타이드가 항원 제시 세포에 채워진 후 세포 내 분해를 받아 생긴 개별 항원 펩티드가 HLA 항원과 결합하여 복합체를 형성하고 상기 복합체가 항원 제시 세포 표면에 고밀도로 제시되고 이 복합체에 특이적인 CTL이 체내에서 효율적으로 증식하여 암세포를 파괴한다. 이렇게하여 암의 치료 또는 예방이 추진된다.
본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질을 유효성분으로 하는 약학 조성물은 세포성 면역이 효과적으로 성립하도록, 의약으로서 허용되는 담체, 예를 들면 적당한 보조제와 혼합하여 투여하거나 병용하여 투여할 수 있다.
보조제로는 문헌(예를 들어, Clin Infect Dis.:S266-70 2000)에 기재된 것 등 당해 기술 분야에서 알려진 보조제가 적용 가능하며, 구체적으로는 예를 들어, 젤 타입으로 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 및 인산 칼슘 등 균체 유형으로 CpG, 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A; MPL), 콜레라 독소, 대장균 용이 열성 독소, 백일해 독소 및 무라밀디펩티드(Muramyl dipeptide; MDP) 등 기름 유탁액 타입(에멀젼 제제)으로 Freund 불완전 보조제, MF59 및 SAF와 같은 고분자 나노 입자 유형으로 면역 자극 복합체(Immunostimulatory complex; ISCOMs), 리포좀, 생분해성 마이크로 스피어(Biodegradable microsphere) 및 사포닌 유래의 QS-21 등 합성 타입으로써 비이온성 블록 코폴리머, 무라밀 펩티드 아날로그(Muramyl peptide analogue), 폴리포스파젠(Polyphosphazene) 및 합성 폴리뉴클레오티드 등 사이토카인 유형으로 IFN-γ, IL-2 및 IL-12 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질을 유효성분으로 하는 CTL 유도제/약학 조성물의 제형으로는 특별히 제한은 없지만, 기름 유탁액(에멀젼 제제), 고분자 나노 입자, 리포좀 제제, 직경 수 μm의 구슬에 결합시킨 미립자 제제, 리피드를 결합시킨 제제, 마이크로 스피어 제제, 마이크로 캡슐 제제 등을 들 수 있다.
투여 방법은 피내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여, 정맥 주사 등의 알려진 모든 투여 방법이 있다. 제제 중 본 발명의 펩티드의 투여량은 치료 목적의 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 일반적으로 0.0001mg ~ 1000mg, 바람직하게는 0.001mg ~ 1000mg, 더욱 바람직하게는 0.1mg ~ 10mg이며, 이를 며칠 내지 몇 달에 1회 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩티드를 실제로 의약으로 작용시키는 방법으로는 해당 펩타이드를 직접 체내에 도입하는 in vivo 법 외에 인간에서 특정 세포를 채집하여 체외에서 본 발명의 펩티드를 작용시켜 그 세포를 체내에 되돌리는 ex vivo 법이 있고(Nikkei Science, 1994년 4월호, 20-45 쪽, 월간 약사, 36 (1), 23-48 (1994) 실험 의학 증간, 12(15)(1994) 및 이들의 인용 문헌 등이 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성) 당업자라면 그러한 방법으로 적절한 세포 투여 방법, 투여 형태 및 투여량을 선택할 수 있다.
<4> 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 CTL 유도제 /약학 조성물
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킨 세포는 본 발명의 펩타이드 및/또는 다른 ASB4 단백질 유래의 에피토프 펩티드를 항원으로 제시하는 세포가 되기 때문에 T 세포 수용체를 통해 T 세포에 인식되는 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또한 CTL의 유도제가 될 수 있다. 유도된 CTL은 본 발명의 펩타이드 및/또는 ASB4 단백질에 의해 유도된 CTL과 마찬가지로 세포 독성 작용과 림포카인의 생산을 통해 항종양 작용, 바람직하게는 항암 작용을 발휘할 수 있다. 따라서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 및 약학 조성물의 유효성분으로 할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 CTL의 유도제 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 암 환자에게 투여하여 발현시킴으로써 암을 치료 및/또는 예방할 수 있는 것이다.
예를 들어 발현 벡터에 삽입된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 다음의 방법으로 암 환자에게 투여하면 항원 제시 세포에서 종양 항원 펩티드가 고발현 한다. 이후 생긴 종양 항원 펩티드가 HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원과 결합하여 복합체를 형성하고 상기 복합체가 항원 제시 세포 표면에 고밀도로 제시됨으로써 암 특이적 CTL 이 체내에서 효율적으로 증식하여 암세포를 파괴한다. 이상과 같이하여 암의 치료 또는 예방이 달성된다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물도 또한 본 발명에 포함된다. 이 같은 약학 조성물은 바람직하게는 암의 예방 및/또는 치료용 조성물, 즉 암의 예방 및/또는 치료제이다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 암세포 (바람직하게는 암 줄기세포)에 특이적인 CTL을 유도, 즉 암세포 특이적인 세포성 면역을 활성화함으로써 암을 예방 및/또는 치료하는 것이기 때문에, 바람직하게는 암의 예방 및/또는 치료용 백신이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로하는 CTL 유도제/약학 조성물은 바람직하게는 HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원 양성의 대상이며, ASB4 양성암에 걸린 대상에 사용할 수 있다. ASB4 양성암으로, 예를 들어 대장암, 폐암, 유방암, 구강암, 자궁 경부암, 갑상선암, 고환암, 난소암 등의 암(종양) 등이 본 발명의 CTL 유도제는 이러한 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하여 세포 내에 도입하는 방법으로는 바이러스 벡터에 의한 방법 및 기타 방법 (Nikkei Science, 1994년 4월호, 20-45 쪽, 월간 약사, 36 (1), 23-48 (1994) 실험 의학 증간, 12 (15), (1994), 및 이의 인용 문헌 등, 이 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성)의 어느 방법도 적용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유된다.
바이러스 벡터에 의한 방법으로는, 예를 들어 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스, 수두 바이러스(Pox virus), 폴리오 바이러스, 신드비스 바이러스(Sindbis virus) 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 본 발명의 DNA를 통합하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 우두 바이러스 등을 이용한 방법이 특히 바람직하다.
다른 방법으로는 발현 플라스미드를 직접 근육 내에 투여하는 방법 (DNA 백신법), 리포솜법, 리포펙틴(Lipofectin) 법, 마이크로 인젝션법, 인산 칼슘법, 일렉트로 포레이션법 등을 들 수 있고 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 실제로 의약으로 작용하려면 해당 폴리뉴클레오티드를 직접 체내에 도입하는 in vivo 법 및 인간에서 어떤 종류의 세포를 채집하여 체외에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 상기 세포에 도입하여 그 세포를 체내에 되돌리는 ex vivo 법이 있다(Nikkei Science, 1994년 4월호, 20-45 쪽, 월간 약사, 36 (1), 23-48 (1994 ) 실험 의학 증간, 12 (15), (1994), 및 이의 인용 문헌 등, 이 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성). in vivo 법이 보다 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 in vivo 법으로 투여하는 경우에는 치료 목적의 질환, 증상 등에 따라 적절한 투여 경로 및 투여 형태를 적절히 선택하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육 등에 주사 가능한 형태로 투여할 수 있다. in vivo 법으로 투여하는 경우, 예를 들어, 액제 등의 제제 형태를 취할 수 있지만, 일반적으로는 유효성분인 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 주사제 등으로 필요에 따라 의약에 허용되는 캐리어(담체)을 첨가해도 좋다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 리포솜 또는 막 융합 리포솜(센다이 바이러스(HVJ)-리포솜 등)에서는 현탁제, 동결 방지제, 원심 분리 농축 동결 방지제 등의 리포좀 제제의 형태로 할 수 있다.
제제 중 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 함량은 치료 목적의 질환, 환자의 연령, 체중 등에 따라 적절히 조정할 수 있지만, 일반적으로 폴리뉴클레오티드의 함량으로 0.0001mg ~ 100mg, 바람직하게는 0. 001mg ~ 10mg 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 며칠 내지 몇 달에 1회 투여하는 것이 바람직하다.
당업자라면 바람직한 세포, 벡터, 투여 방법, 투여 형태 및 투여량을 적절히 선택하는 것이 가능하다.
또한 최근 여러 CTL 에피토프(종양 항원 펩티드)을 연결한 폴리에피토프 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 CTL 에피토프와 헬퍼 에피토프를 연결시킨 폴리에피토프 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 in vivo에서 효율적으로 CTL 유도 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어 Journal of Immunology 1999, 162:3915-3925 (본 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성)은 HBV 유래 HLA-A2 구속성(restricted) 항원 펩티드 6 종류, HLA-A11 구속 항원 펩티드 3종류, 및 헬퍼 에피토프를 연결한 에피토프 펩타이드를 암호화하는 DNA (Mini Gene)가 in vivo에서 각각의 에피토프에 대한 CTL을 효과적으로 유도 한 것이 기재되어 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 1종 또는 2종 이상의 연결시킴으로써 또 경우에 따라서는 다른 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드도 연결시킴으로써 제조된 폴리뉴클레오티드를 적당한 발현 벡터에 통합하여 CTL의 유도제의 유효성분으로 할 수 있다. 이러한 CTL의 유도제도 상기와 같은 투여 방법 및 투여 형태를 취할 수 있다.
<5> 본 발명의 항원 제시 세포
상기 본 발명의 펩타이드 및 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 다음과 같이 in vitro에서 이용할 수 있다. 즉 본 발명의 펩타이드 및 폴리뉴클레오티드 중 하나와 항원 제시 능력을 갖는 세포를 in vitro에서 접촉시킴으로써 항원 제시 세포를 제작할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 구체예에서, 세포 표면에 HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원 및 본 발명의 펩타이드 복합물을 제시시킨 항원 제시 세포 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 및 폴리뉴클레오티드는 암을 예방 및/또는 치료에 이용하는 것이 가능하다. 따라서 본 형태의 항원 제시 세포 또는 그 제조 방법은, 바람직하게는 암 환자 유래의 분리된 세포를 이용하는 것이다. 구체적으로는 암 환자 유래의 고립된 항원 제시 능력을 갖는 세포와 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 하나를 in vitro에서 접촉시킴으로써, 해당 세포의 세포 표면에 HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원 및 본 발명의 펩타이드 복합물을 제시시킨 항원 제시 세포를 제조한다.
여기서 "항원 제시 능력을 갖는 세포"는 본 발명의 펩티드를 제시 가능한 MHC, 바람직하게는 HLA, 더욱 바람직하게는 HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원을 세포 표면에 발현하는 세포라면 특별히 한정되지 않지만, 이들 중 전문(professional) 항원 제시 세포가 바람직하고, 특히 항원 제시 능력이 높다고 여겨지는 수지상 세포가 보다 바람직하다.
또한, 상기 항원 제시 능력을 갖는 세포에서 본 발명의 항원 제시 세포를 준비하기 위해 첨가되는 물질로는 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 어느 것이라도 좋다.
본 발명의 항원 제시 세포, 예를 들어 암 환자에서 항원 제시 능력을 갖는 세포를 단리, 상기 세포에 본 발명의 펩티드를 in vitro에서 펄스하여 HLA-A02 항원 또는 HLA-A24 항원과 본 발명의 펩타이드 복합물을 제시함으로써 얻어진다(Cancer Immunol.Immunother. 46:82,1998, J.Immunol., 158, p1796,1997, Cancer Res., 59, p1184,1999). 수지상 세포를 이용하는 경우, 예를 들어 암 환자의 말초 혈액에서 피콜(Ficoll)법에 의해 림프구를 분리한 후 비 부착 세포를 제외하고 부착 세포를 GM-CSF와 IL-4 존재 하에서 배양하여 수지상 세포를 유도하고 해당 수지상 세포를 본 발명의 펩타이드와 함께 배양하여 펄스하는 것 등에 의해, 본 발명의 항원 제시 세포를 제조할 수 있다.
또한, 상기 항원 제시 능력을 갖는 세포에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 본 발명의 항원 제시 세포를 제조하는 경우에는 해당 폴리뉴클레오티드는 DNA의 형태여도 좋고 RNA의 형태여도 좋다. 구체적으로는 DNA의 경우 Cancer Res., 56 : p5672,1996 및 J.Immunol., 161 : p5607,1998 (이 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성) 등을 참고로 하여 수행할 수 있고, 또한 RNA의 경우 J.Exp.Med., 184 : p465,1996 (본 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성) 등을 참고로하여 수행할 수 있다.
상기 항원 제시 세포는 CTL 유도제의 유효성분으로 할 수 있다. 해당 항원 제시 세포를 유효성분으로 함유하는 CTL의 유도제는 항원 제시 세포를 안정적으로 유지하기 위해 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 배지 등을 포함하는 것이 바람직하다. 투여 방법은 정맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여 등을 들 수 있다. 이러한 항원 제시 세포를 유효성분으로 함유하여 이루어지는 CTL의 유도제를 환자의 체내에 되돌리는 것으로, ASB4 양성암을 앓고 있는 환자의 체내에서 본 발명의 펩티드를 항원 제시 암세포에 특이적인 CTL이 효율적으로 유도되고, 결과적으로 본 발명의 펩티드를 항원 제시 ASB4 양성암을 치료할 수 있다.
<6> 본 발명의 세포 독성 T 세포 ( CTL )
본 발명의 펩타이드 및 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 다음과 같이 in vitro에서 이용할 수 있다. 즉 본 발명의 펩타이드 및 폴리뉴클레오티드 중 하나와 말초 혈액 림프구를 in vitro에서 접촉시킴으로써, CTL을 유도할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 펩티드를 항원 제시 세포를 특이적으로 독성을 보이는 CTL 및 그 유도 방법을 제공하는 것이다. 상술 한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 및 폴리뉴클레오티드는 암을 예방 및/또는 치료에 이용하는 것이 가능하다. 따라서 본 형태의 CTL 및 그 유도 방법은 바람직하게는 암 환자 유래의 말초 혈액 림프구를 이용하는 것이다. 구체적으로는 암 환자 유래의 말초 혈액 림프구와 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 중 하나를 in vitro에서 접촉시킴으로써 본 발명의 펩티드를 항원 제시 세포를 특이적으로 부상하는 CTL을 유도한다.
예를 들면 흑색종에서는 환자 본인의 종양에 침투 T 세포를 체외에서 대량으로 배양하고 이를 환자에게 돌려주는 양자 면역 요법에 치료 효과가 인정되고 있다(J.Natl.Cancer.Inst. 86:1159,1994). 또한 마우스 흑색종에서는 비장 세포를 in vitro에서 종양 항원 펩티드 TRP-2에 의해 자극하여 종양 항원 펩티드에 특이적인 CTL을 증식시키고, 상기 CTL을 흑색종 이식 마우스에 투여하면 전이 억제가 인정되고 있다(J.Exp.Med., 185:453,1997). 이것은 항원 제시 세포의 MHC와 종양 항원 펩타이드 복합물을 특이적으로 인식하는 CTL을 in vitro에서 증식시킨 결과에 따른 것이다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 in vitro에서 환자 말초 혈액 림프구를 자극하여 종양 특이적으로 CTL을 늘린 후에 이 CTL을 환자에게 되돌리는 치료는 유용하다고 생각된다.
해당 CTL은 암의 치료제 또는 예방제의 유효성분으로 할 수 있다. 상기 치료제 또는 예방제는 CTL을 안정적으로 유지하기 위해 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 배지 등을 포함하는 것이 바람직하다. 투여 방법은 정맥 내 투여, 피하 투여, 피내 투여 등을 들 수 있다. 이러한 CTL을 유효성분으로 함유하는 암의 치료 또는 예방제를 환자의 체내에 되돌리는 것으로, 본 발명의 ASB4 양성암에 걸린 환자의 체내에서 CTL에 의한 암세포의 독성 작용이 촉진되어 암세포를 파괴하여 암을 치료할 수 있다.
본 발명의 CTL은 종양 세포에 항원 제시되는 본 발명의 펩티드와 HLA의 복합체를 대상으로 세포 독성 활성을 발휘할 수 있다. 즉 본 발명의 CTL의 T 세포 수용체 (TCR)는 본 발명의 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는 것이다. 최근 CTL에 발현하는 특정 펩타이드-HLA 복합체를 인식하는 TCR 유전자를 클로닝하여 해당 TCR 유전자를 암 환자로부터 채취한 CD8+ T 세포에 유전자 도입하여 인공적으로 CTL을 제작하고, 대량 배양 후 환자 체내에 다시 양자 면역 요법이 고안되고 있다(예를 들면 Ochi et al., Blood 2011 Aug 11; 118 (6):1495-503 등). 본 발명에서 "인공 CTL"라고 하는 경우, 전술한 바와 같이 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는 TCR을 암호화하는 유전자를 T 세포에 유전자를 도입하여 제작된 CTL을 의미하며 또한 상기 천연 CTL과 마찬가지로 암 치료에 사용될 수 있는 것이다. 따라서 이러한 인공 CTL 또한, 본 발명의 CTL에 포함된다. 이러한 구체예에서, 인공 CTL에 유전자 도입되는 본 발명의 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는 TCR은 상기 복합체에 대한 결합 친화력과 세포 독성 활성을 높이기 위해 적절하게 개질되어도 좋다 . 따라서 "인공 CTL"는 본 발명의 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는 TCR을 암호화하는 유전자를 적절히 유전자 조작한 후 환자 유래의 T 세포에 유전자를 도입하여 제작된 CTL도 포함된다. 인공 CTL의 제작에는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
<7> 본 발명의 펩타이드를 이용한 종양 특이적 CTL 검출제
본 발명의 펩티드는 종양 특이적 CTL에 인식될 수 있기 때문에 종양 특이적 CTL 검출제의 성분으로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 펩티드를 포함하는 종양 특이적 CTL 검출제에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 종양 특이적 CTL 검출제는 본 발명의 펩티드와 HLA-A02 또는 HLA-A24를 함유하는 HLA 멀티머(모노머(monomer), 다이머(dimer), 테트라머(tetramer), 펜타머(pentamer) 및 덱스트라머(dextramer))를 포함한다.
예를 들어, HLA 테트라머는 HLA의 α 사슬과 β2 마이크로 글로불린 펩타이드(에피토프 펩타이드)와 회의시킨 복합체(HLA 모노머)를 비오틴화하고 아비딘에 결합시킴으로써 4량체 화한 것을 가리킨다(Science 279:2103-2106 (1998), Science 274 : 94-96 (1996)). 현재는 다양한 항원 펩타이드를 함유하는 HLA 테트라머가 시판되고 있으며(예를 들어(주) 의학 생물학 연구소) 본 발명의 펩티드와 HLA-A02 또는 HLA-A24를 함유하는 HLA 테트라머를 쉽게 제작할 수 있다. 또한 HLA-dimer 및 HLA 펜타머도 동일한 원리에 기초하고 있으며, 이러한 면에서는 각각 상기 HLA 모노머가 2량체화와 5량체화 되고 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드와 HLA-A02 또는 HLA-A24를 함유하는 HLA 멀티머 또한, 본 발명의 일 양태이다.
구체적으로는, 예를 들면 서열번호 3 ~ 14의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 HLA-A02 또는 HLA-A24를 함유하는 HLA 테트라머를 들 수 있다. 해당 HLA 테트라머는 유동 세포 계측법, 형광 현미경 등의 알려진 검출 수단에 의해 결합된 CTL을 쉽게 선별 또는 검색할 수 있도록 형광 표식되어 있는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들어 피코에리스린(Phycoerythrin; PE), 플루오레세인이소티오시안산염(Fluorescein isothiocyanate; FITC), 페리디닌클로로필 단백질(Peridinin chlorophyll protein; PerCP) 등으로 표지된 HLA 테트라머를 들 수있다.
HLA 테트라머 제법 예로는 예를 들어, Science 279:2103-2106(1998), Science 274:94-96(1996) 등의 문헌에 기재된 것을 들 수 있고, 쉽게 언급하면 다음과 같다.
우선 단백질을 발현할 수 있는 대장균이나 포유동물 세포에서 HLA-A24 또는 HLA-A02의 α 쇄 발현 벡터 및 β2 마이크로 글로불린 발현 벡터를 도입하여 발현시킨다. 여기에서는 대장균(예 : BL21)을 이용하는 것이 바람직하다. 얻어진 단량체 HLA-A24 또는 HLA-A02 복합체 및 본 발명의 펩타이드를 혼합하여 즉석 HLA-펩타이드 복합체를 형성시킨다. 다음 HLA-펩타이드 복합체의 HLA-A02 또는 HLA-A24의 α 쇄의 C 말단 부위의 배열을 BirA 효소에 의해 비오틴화 한다. 이 비오틴화된 HLA-펩타이드 복합체와 형광 표지된 아비딘을 4:1의 몰비로 혼합하여 HLA 테트라머를 제조할 수 있다. 또한, 상기 각 단계에서 겔 여과 등에 의한 단백질 정제하는 것이 바람직하다.
<8> 암 줄기세포 검출제
상술 한 바와 같이, 본 발명자들은 ASB4가 암 줄기세포에서 특이적으로 높은 발현하고 있는 것을 처음 발견하였다. 즉 본 발명자에 의해 ASB4는 암 줄기세포를 포함하지 않는 암세포와 정상 체세포에서는 발현이 보이지 않지만, 암 줄기세포에서 높은 발현하는 유전자임이 처음으로 분명해졌다. 이 같은 지식에서 ASB4는 암세포, 특히 암 줄기세포를 식별하기 위한 마커로 이용 가능함이 밝혀졌다. 따라서 본 발명은 일 측면에서 ASB4의 발현 산물을 검출하기 위한 ASB4 검출제를 포함하는 암 줄기세포 검출제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 단순히 ASB4라고 하는 경우, 달리 명시되지 않는 한 ASB4 유전자를 의미한다. 바람직하게는 인간 ASB4 유전자이지만, 그 상동체여도 좋다.
본 발명에서 "유전자의 발현"이란 해당 유전자의 전사를 기점으로 하는 일련의 생체 반응을 말하며, "발현 산물"이란 예를 들면 mRNA와 내생 폴리펩티드 등이 일련의 생체 반응에 의해 생성되는 분자를 말한다. 유전자의 발현 산물인 내인성 폴리펩티드는 바람직하게는 해당 유전자의 발현에 의해 최종적으로 생산되는 단백질이다.
본 발명에서 "ASB4 검출제"이라 함은 ASB4 유전자 또는 발현 산물을 질적 및/또는 정량적으로 검출하는 물질을 의미한다.
본 발명의 암 줄기세포 검출제는 ASB4의 발현 산물을 검출하기 위한 ASB4 검출제를 포함한다. 검출 대상에서 ASB4의 발현 산물이 검출된 경우, 검출 대상이 암 줄기세포를 함유하고 있다, 즉 암 줄기세포가 발견되었다고 결정할 수 있다. 본 발명의 암 줄기세포 검출제는 in vivo 에서도 in vitro 에서도 사용이 가능하지만, 바람직하게는 생물 개체(검사 대상)에서 채취된 생체 시료 유래의 세포 집단(검색 대상)에 대해 in vitro에서 사용한다. 이 경우, 검출 대상인 생체 시료 유래의 세포 집단에서 암 줄기세포가 발견된 것은 곧 검사 대상인 생체 시료가 채취된 생물 개체에서도 암 줄기세포가 발견된, 즉 상기 생물 개체가 암 줄기세포를 갖는 것을 의미한다. 따라서, 후술하는 바와 같이, 본 발명의 암 줄기세포 검출제를 사용하여 검사 대상에서 암 줄기세포를 검출하는 방법도 본 발명에 포함된다.
검사 대상인 생물 개체는 종양을 가질 수 있는 생물 개체라면 어떠한 생물 개체도 좋지만, 바람직하게는 인간과 비 인간 포유동물(예, 마우스, 쥐, 기니피그, 햄스터 등의 설치류, 침팬지 같은 영장류, 소, 염소, 양 등의 우제목(artiodactyla), 말 등의 기제목, 토끼, 개, 고양이 등)의 개체이며, 보다 바람직하게는 인간 개체이다.
검출 대상의 세포 집단은 상기 검사 대상에서 얻은 모든 생체 시료 유래의 세포 집단에 이용하는 것이 가능하다, 바람직하게는 인간에서 얻은 생체 시료에서 유래하는 세포 집단이며, 보다 바람직하게는 조직의 세포에서 ASB4가 거의 발현하지 않는 것으로 확인되는, 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 전립선, 고환, 난소, 소장, 대장 및 혈액으로 이루어진 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 생체 시료에서 유래하는 세포를 포함하는 세포 집단이다.
본 발명의 암 줄기세포 검출 물질에 포함되는 ASB4 감지 물질은 검출하는 발현 산물에 의거하여 변화하여 얻는, 당업자라면 적절히 최적의 것을 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 발현 산물이 mRNA인 경우, 당해 기술 분야에서 공지되어 있는 모든 mRNA 검출 방법을 이용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 RT-PCR 법, in situ 혼성화법, 노던블랏법(Northern blotting), Real Time RT-PCR 등을 들 수 있으며, 그 중에서도 검출 감도의 높이, 실험 기법의 간편함 등으로 인해 RT-PCR 법이 바람직하다. 예를 들어 발현 산물이 내생 폴리펩티드(바람직하게 ASB4 단백질)인 경우는 이에 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 웨스턴블랏법(Western blotting), 면역조직 염색법 등을 들 수 있다. 이용하는 ASB4 검출제는 검출하는 발현 산물과 채용하는 검출법에 따라 달라질 수 있고 당업자는 적절한 최적의 것을 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 내생 폴리펩티드를 검출하는 경우 ASB4 특이 항체(바람직하게는 단클론 항체) 등 mRNA를 검출하는 경우는 서열번호 1에 기재된 염기 서열(Genbank Accession No:NM_016116.2 72 ~ 1352번째)의 일부에 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브 및/또는 프라이머 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 감지하는 발현 산물은 단일 발현 산물이어도 좋고 여러 발현 산물을 조합하여 사용해도 좋다.
<9> 본 발명의 펩타이드를 인식하는 항체
상술 한 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 암세포, 특히 암 줄기세포에 의해 CTL 에피토프 펩타이드로 제시된다. 이때 MHC와 복합체를 형성하여 세포 표면에 제시된다. 따라서 본 발명의 펩티드와, 상기 복합체를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하는 것으로, 본 발명의 펩티드를 종양 마커 및 항체 의약의 표적으로 이용할 수 있다. 이러한 항체로는 예를 들어, 본 발명의 펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 (바람직하게는 단클론 항체) 본 발명의 펩티드와 HLA의 복합체, 바람직하게는 HLA-A24 또는 HLA-A02와의 복합체를 인식하는 TCR (T 세포 항원 수용체) 유사 항체를 들 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 펩타이드를 인식하는 항체 및 상기 펩타이드와 MHC의 복합체를 인식하는 T 세포 항원 수용체 유사 항체(T cell antigen receptor-like antibody)에 관한다.
본 발명에서 "항체"라는 경우 면역 글로불린 분자뿐만 아니라 Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, scFv, dsFv, Diabody와 sc(Fv)2 등의 항체의 기능적인 단편도 포함된다. 또한 이러한 기능적 단편의 다량체(예를 들어, 다이머, 트리머, 테트라머, 폴리머)도 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명에서 "TCR 유사 항체"는 단편화된 항원 유래의 펩타이드 및 주요 조직 적합성 항원 복합체(MHC) 분자와의 복합체(pMHC)에 대해 TCR 유사 결합력(항원 인식 기능)을 갖는 분자이다. 예를 들어, Eur J Immunol. 2004; 34:2919-29 등에서 보고된 바와 같이, 종양 항원 유래의 펩타이드와 MHC의 복합체를 인식하는 TCR 유사 항체는 CTL이 표적으로 할 수 있는 종양 항원 펩티드를 제시하고 있는 암세포, 암세포를 탐식하고 MHC 클래스 I에 종양 항원 펩티드를 제시하고 있는 수지상 세포 등을 인식할 수 있다.
또한 바이러스 등 유래의 펩타이드와 MHC의 복합체를 인식하는 상기 TCR 유사 항체는 제시 한 항원이 감염된 세포에서 어떠한 제시 동태 및 CTL 응답 등을 나타내는지를 정량적 및 경시적으로 해석할 수 있다.
상기 TCR 유사 항체는 Eur J Immunol. 2004; 34:2919-29 등에서 기재되어 있는 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, MHC와 펩티드 복합체를 마우스 등의 동물에 면역하여 복합체 특이적인 항체를 얻을 수 있다. 또한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 복합체 특이적 항체를 얻을 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드와, 상기 펩티드를 제시하는 MHC 복합체를 인식하여 해당 MHC 복합체를 세포 표면에 제시하는 종양 세포를 검출하는 것이 가능하다. 따라서 본 발명은 상기 항체 또는 TCR 유사 항체를 포함하는 종양 검출제에 관한다. 또한 본 발명의 펩티드는 종양 세포 이외, 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포 등의 전문 항원 제시 세포에도 동일하게 제시되기 때문에 상기 항체는 본 발명의 펩티드를 제시하는 항원 제시 세포 등의 검색에도 유용하다.
또한 상술한 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 암세포, 특히 암 줄기세포에 의해 CTL 에피토프 펩타이드로 제시되기 때문에, 본 발명의 펩티드와, 상기 펩티드와 HLA의 복합체, 바람직하게는 HLA-A24 또는 HLA -A02의 복합체를 인식하는 항체 또는 TCR 유사 항체는 대상의 암 예방 및/또는 치료제로 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 및/또는 TCR 유사 항체를 포함하는 암 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드는 종양 세포에 의해 CTL 에피토프 펩타이드로 제시되기 때문에, 본 발명의 펩티드와, 상기 펩티드와 HLA의 복합체, 바람직하게는 HLA-A24의 복합체를 인식하는 항체 및/또는 TCR 유사 항체는, 대상에서 세포 표면에 존재하는 상기 펩티드 및/또는 상기 복합체와 결합할 수 있다. 항체가 종양 세포 표면에 결합하면 상기 항체의 Fc 부위에 대식 세포와 NK 세포 등의 이펙터 세포의 Fc 수용체가 결합하고, 상기 이펙터 세포가 종양 세포를 공격하는 항체 의존성 세포 독성(ADCC) 활성이 발생하여 종양을 처리할 수 있다. 따라서 상기 항체 및/또는 TCR 유사 항체는 암의 예방 및/또는 치료제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
또한 최근에는 2가지 항원 결합 부위를 가지고 서로 다른 항원과 결합하도록 개변된 이중 특이성 항체가 개발되고 있다. 하나의 항원 결합 부위에서 항원 제시된 펩타이드와 MHC-항원 펩타이드 복합체 등의 암세포 표면 항원을 인식하고, 다른 항원 결합 부위에서 CD3 등의 림프구 표면 항원을 인식하는 이중 특이성 항체는 암세포 근처에 CTL과 이펙터 세포 등의 림프구 표면 항원을 갖는 세포를 구속, 집적화하는 것이 가능해진다. 암세포 근방에 구속된 림프구는 자신이 ADCC 활성 등의 항종양 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 사이토카인 등의 분비에 의해 암세포 주변의 나이브(naive) 면역 세포를 항종양성으로 활성화하는 방관자 효과(Bystander effect)를 발휘하는 것으로 암세포를 공격할 수 있다.
따라서 본 발명은, 본 발명의 펩타이드 및/또는 상기 펩티드와 HLA의 복합체와, 림프구 표면 항원과 특이적으로 인식하는 이중 특이성 항체도 포함한다. 특이적으로 인식하는 림프구 표면 항원은 림파구의 표면에 특이적으로 발현되는 항원이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 CD3, CD16, CD64 등을 들 수 있다. 특히 CD3는 CTL의 세포 독성 활성의 유도에 관여하는 세포 표면 항원이며, CD3 항체가 결합하면 HLA-암 항원 복합체를 인식하지 않고 HLA 비구속적으로 CTL을 활성화할 수 있고, 강력한 세포 독성 활성을 발휘할 것을 기대할 수 있기 때문에 바람직하다.
또한 최근에는 종양 항원에 특이적인 단클론 항체의 일부에 유전자 조작을 가해 변형한 키메라 항원 수용체(CAR)를 환자 유래의 T 세포에 유전자 도입하고, 이 유전자 변형 T 세포를 체외에서 증폭 배양한 후 환자에게 수혈하는 새로운 면역 세포 치료법이 고안되어 있다(Nat Rev Immunol. 2012; 12:269-81). 구체적으로는 환자로부터 채취된 말초 혈액 단핵구를 항 CD3 항체와 IL-2 등의 존재 하에서 배양함으로써 T 세포를 활성화한 후, 레트로 바이러스 벡터 또는 렌티 바이러스 벡터 등의 형질 전환용 벡터를 이용하여 CAR를 코드하는 유전자를 T 세포에 도입하여 유전자 변형 T 세포를 제작한다.
본 발명에서 "키메라 항원 수용체"는 암세포의 세포 표면에 존재하는 분자를 인식하는 항체의 항체 가변 영역의 경쇄 및 중쇄를 직렬로 결합시킨 단일 사슬 항체(scFv)를 N 말단에, T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체를 구성하는 분자 중 CD3ζ 사슬을 C 말단에 갖도록 설계된 키메라 단백질 분자이다. 이 키메라 항원 수용체는 scFv 영역에서 특정 항원을 인식하면 CD3ζ 사슬을 통해 T 세포의 활성화가 생긴다. T 세포의 활성화를 강화하기 위하여, scFv와 ζ 사슬 사이에 1 또는 2 이상의 공동 자극 분자(예를 들면 CD28,4-1BB, ICOS 등)을 포함할 수 있다. 본 발명에서는 scFv로써, 본 형태의 TCR 유사 항체(TCR 유사 항체에서 설계될 수 있는 항체 분자 또는 그 단편을 포함)을 이용하여 CAR를 제작할 수 있다. 종양 항원 유래의 펩타이드와 MHC의 복합체를 인식하는 CAR는 CTL이 표적으로 할 수 있는 종양 항원 펩티드를 제시하고 있는 암세포, 암세포를 탐식하고 MHC 클래스 I에 종양 항원 펩티드를 제시하고 있는 수지상 세포 등을 인식할 수 있기 때문에, 상기 CAR를 도입한 유전자 변형 T 세포는 인공 CTL과 마찬가지로, 상기 종양 항원에 특이적인 암의 예방 및/또는 치료제로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 종양 항원 유래의 펩타이드와 MHC의 복합체를 인식하는 CAR를 도입한 유전자 변형 T 세포 또는 인공 CTL을 포함하는, 암 예방 및/또는 치료제에 관한 것이다.
<10> 종양의 검출 방법 (시험 방법, 진단 방법)
본 발명은 상술한 본 발명의 CTL 검출제, 또는 암 줄기세포 검출제 또는 종양 검출제를 이용한 종양의 검출 방법(시험 방법, 진단 방법)을 제공하는 것이다.
본 발명의 CTL 검출제를 사용하는 본 발명의 검출 방법(진단 방법)은 일반적으로 피험자의 혈액을 채취하거나 혹은 종양이 의심되는 피험 조직의 일부를 생검(biopsy) 등에서 채취하여 거기에 포함된 ASB4 유래의 종양 항원 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 인식하는 CTL의 양을, 본 발명의 CTL 검출제에 의해 검출 또는 측정함으로써 대장암, 폐암, 신장암, 유방암, 구강암 자궁 경부암, 갑상선암, 고환암, 난소암 등의 ASB4 양성암(종양)의 이환 여부 또는 그 정도를 검출, 검사 또는 진단하는 것이다.
본 발명의 암 줄기세포 검출제를 사용하는 본 발명의 검출 방법(시험 방법, 진단 방법)은 일반적으로 피험자의 혈액을 채취하거나 혹은 종양이 의심되는 피험 조직의 일부를 생검 등에서 채취하여 거기에 포함된 ASB4 발현 산물의 양을 본 발명의 암 줄기세포 검출제를 이용하여 검출 또는 측정함으로써 대장암, 폐암, 유방암, 구강암, 자궁 경부암, 갑상선암, 고환암, 난소암 등의 ASB4 양성암(종양)의 이환 여부 또는 그 정도를 검출, 검사 또는 진단하는 것이다.
본 발명의 종양 검출제를 사용하는 본 발명의 검출 방법(시험 방법, 진단 방법)은 일반적으로 피험자의 혈액을 채취하거나 혹은 종양이 의심되는 피험 조직의 일부를 생검 등에서 채취하고 거기에 포함된 ASB4 유래의 종양 항원 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 제시하는 세포의 양을 본 발명의 종양 검출제를 이용하여 검출 또는 측정함으로써 대장암, 폐암, 유방암, 구강암, 자궁 경부암, 갑상선암, 고환암, 난소암 등의 ASB4 양성암(종양)의 이환 여부 또는 그 정도를 검출, 검사 또는 진단하는 것이다.
본 발명의 검출(검사, 진단) 방법, 예를 들어 종양을 가진 환자에서, 상기 종양의 개선을 위해 약물을 투여한 경우에 있어서, 상기 종양의 개선의 유무 또는 정도를 검출(검사, 진단)할 수 있다. 또한 본 발명의 검출(검사, 진단) 방법은 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 의약을 효율적으로 적용할 수 있는 치료 대상 환자의 선택과 해당 의약 치료 효과의 예측 및 판정 등에도 유효하다. 또한, 본 발명의 종양 검출제를 사용하는 양태에서, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 하는 암 백신을 투여함으로써 환자 생체 내에서 유도된 CTL이 실제로 표적으로 할 수 있는 종양 항원 펩티드를 제시하고 있는 암세포를 검출하는 것이 가능하다.
본 발명의 CTL 검출제를 사용하는 본 발명의 검출(검사) 방법의 특정 양태는 다음의 (a)와 (b), 및 임의로 (c) 단계을 포함하는 것이다:
(a) 피험자로부터 얻어진 생체 시료와 본 발명의 CTL 검출제를 접촉시키는 단계,
(b) 상기 생체 시료 중의 ASB4 유래의 종양 항원 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 인식하는 CTL의 양을 상기 CTL 검출제가 결합된 세포의 양을 지표로 측정하는 단계;
(c) (b)의 결과를 바탕으로 암의 발병을 판단하는 단계.
본 발명의 CTL 검출제를 사용하는 본 발명의 진단 방법의 특정 양태는, 상기 (a), (b) 및 (c) 단계을 포함한다.
본 발명의 암 줄기세포 검출제를 사용하는 본 발명의 검출(검사) 방법의 특정 양태는 다음의 (d) 및 (e), 및 임의로 (f)의 단계를 포함하는 것이다:
(d) 피험자로부터 얻은 생체 시료와 본 발명의 암 줄기세포 검출제와 접촉시키는 단계,
(e) 상기 생체 시료 중의 ASB4 발현 산물의 양을 측정하는 단계;
(f) (e)의 결과를 바탕으로 암의 발병을 판단하는 단계.
본 발명의 암 줄기세포 검출제를 사용하는 본 발명의 진단 방법의 특정 양태는 상기 (d), (e) 및 (f)의 단계를 포함한다.
본 발명의 암 줄기세포 검출제를 사용하는 암 줄기세포를 검출하는 방법의 양태는 상기 (d), (e) 단계 및 (f) 대신 하기 (f')의 단계를 포함한다:
(f') (e)의 결과를 바탕으로 생체 시료 중의 암 줄기세포의 존재 또는 부존재를 결정하는 단계.
여기에 사용되는 생체 시료로는 피험자의 생체 조직(암세포의 존재가 의심되는 조직과 그 주변 조직이나 혈액 등)에서 제조되는 시료를 들 수 있다. 구체적으로는, 상기 조직에서 채취된 조직 세포를 포함하는 시료 등을 들 수 있다.
본 발명의 종양 검출제를 사용하는 본 발명의 검출(검사) 방법의 특정 양태는 하기의 (g) 및 (h), 및 임의로 (i)의 단계를 포함하는 것이다:
(g) 피험자로부터 얻은 생체 시료와 본 발명의 종양 검출제를 접촉시키는 단계,
(h) 상기 생체 시료 중의 ASB4 유래의 종양 항원 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 제시하는 세포의 양을 상기 종양 검출제가 결합된 세포의 양을 지표로 측정하는 단계;
(i) (h)의 결과를 바탕으로 암의 발병을 판단하는 단계.
본 발명의 종양 검출제를 사용하는 본 발명의 진단 방법의 특정 양태는 상기 (g), (h) 및 (i) 단계를 포함한다.
여기에 사용되는 생체 시료로는 피험자의 생체 조직(암세포의 존재가 의심되는 조직과 그 주변 조직이나 혈액 등)에서 제조되는 시료를 들 수 있다. 구체적으로는, 상기 조직에서 채취된 조직 세포를 포함하는 시료 등을 들 수 있다.
본 발명의 CTL 검출제를 사용하는 본 발명의 검출 방법(시험 방법, 진단 방법)의 한 양태는 생체 시료 중의 본 발명의 펩타이드 특이적 CTL을 감지하고 그 양을 측정함으로써 수행된다. 구체적으로는 문헌(Science, 274 : p94,1996 본 문헌은 인용에 의해 본원의 일부를 구성)에 기재된 방법에 따라 형광 표지된 HLA 항원 및 본 발명의 펩타이드 복합체의 4량체(HLA 테트라머)를 제작하고, 이를 이용하여 암이 의심되는 환자의 말초 혈액 림프구 중의 항원 펩타이드 특이적 CTL을 유세포 측정기에 의해 정량함으로써 수행할 수 있다.
종양의 유무를 예측 판정, 결정 또는 진단은, 예를 들어, 피험자의 혈액과 종양이 의심되는 피험 조직에서 본 발명의 펩타이드 특이적 CTL의 양 또는 본 발명의 펩티드를 제시하는 세포의 양을 측정하는 것으로부터 수행할 수 있다. 그 때, 경우에 따라서는 정상적인 대응 조직의 ASB4 유전자 발현 수준, 본 발명의 펩타이드 수준 또는 CTL 수준 등을 기준으로, 상기 기준치와 피험자에서 얻어진 시료에서 상기 수준과 비교하여 양자의 차이를 판정하여 수행할 수 있다.
여기에서 피험자의 피험 조직과 정상적인 대응 조직과 상기 수준의 비교는 피험자의 생체 시료와 정상인의 생체 시료를 대상으로 한 측정을 동시에 수행함으로써 실시할 수 있다. 병행하여 수행하지 않는 경우에는, 복수(적어도 2 개, 바람직하게는 3 이상, 보다 바람직하게는 5 이상)의 정상적인 조직을 이용하여 균일한 측정 조건에서 측정하여 얻어진 본 발명의 펩타이드 특이적 CTL 양 또는 본 발명의 펩티드를 제시하는 세포의 양의 평균 또는 통계적 중간값을 정상인의 값 즉 참조값으로 하여 비교에 사용할 수 있다.
피험자가 암을 앓고 있는지 여부의 판단은, 예를 들어 상기 피험자의 조직에서 본 발명의 펩타이드 특이적 CTL의 양 또는 본 발명의 펩티드를 제시하는 세포가 정상인의 그 수준과 비교하여, 예를 들면 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상 많다는 것을 지표로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 투여되는 피험자에 있어서, 본 발명의 펩타이드 특이적 CTL의 양을 측정함으로써 실제로 CTL이 유도되어 있는지 아닌지를 판정하는 것도 가능하다. 예를 들어, 해당 피험자의 조직에서 본 발명의 펩타이드 특이적 CTL의 양이 정상인의 그 수준과 비교하여 예를 들어 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상 많다는 것을 지표로 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의한 치료가 유효하다고 판정할 수 있다.
<11> 암 예방 및/또는 치료 방법
본 발명은 또한 대상의 암을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 본 발명의 펩타이드, 폴리뉴클레오티드, CTL 항원 제시 세포, 항체 및/또는 TCR 유사 항체, 인공 CTL, 유전자 변형 T 세포로 이루어진 군에서 선택되는 유효성분의 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 "대상"은, 암을 앓고 있는 생물 개체라면 어떠한 생물 개체도 좋지만, 바람직하게는 인간과 비 인간 포유동물(예, 마우스, 쥐, 기니피그, 햄스터 등의 설치류, 침팬지 등의 영장류, 소, 염소, 양 등의 우제목(artiodactyla), 말 등의 말목, 토끼, 개, 고양이 등)의 개체이며, 보다 바람직하게는 인간 개체이다. 본 발명에서 대상은 정상인이라도 좋고, 어떤 질환을 앓고 있어도 좋지만, 암의 예방 및/또는 치료가 도모되는 경우에는 일반적으로 암으로 이환하고 있거나 발병할 위험이 있는 대상을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에서, 대상은 HLA-A02 양성 또는 HLA-A24 양성이다. 본 발명의 일 구체예에서, 대상은 ASB4 양성암을 앓고 있거나 발병할 위험이 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 대상은 HLA-A02 양성 또는 HLA-A24 양성이고 또한 ASB4 양성암을 앓고 있거나 발병할 위험이 있다.
본 발명의 예방/치료 방법에 사용하는 본 발명의 펩타이드, 폴리뉴클레오티드, CTL 항원 제시 세포, 항체 및/또는 TCR 유사 항체, 인공 CTL 및 유전자 변형 T 세포로는 본 명세서에 기재된 모든 것을 들 수 있다. 본 발명의 유효량은 예를 들어, 암의 증상을 줄이고, 또는 그 진행을 지연 또는 중지하는 양이며, 바람직하게는 암을 억제 또는 치료하는 양이다. 또한 투여에 의한 이익을 초과하는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 이러한 양은 배양 세포 등을 이용한 in vitro 시험 및 마우스, 쥐 등의 동물 모델에서 시험에 따라 적절히 결정할 수 있으며, 이러한 시험법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 유효성분의 구체적인 복용량은 그것을 필요로 하는 대상에 관한 다양한 조건, 예를 들어, 증상의 경중도, 대상 일반 건강 상태, 연령, 체중, 대상의 성별, 식사, 투여시기 및 빈도, 병용하고 있는 의약, 치료에 대한 반응, 제형 및 치료에 대한 적합성 등을 고려하여 결정될 수 있다.
구체적인 용량으로는 예를 들어, 본 발명의 펩티드의 경우 일반적 0.0001mg ~ 1000mg, 바람직하게는 0.001mg ~ 1000mg, 더욱 바람직하게는 0.1mg ~ 10mg이며, 이를 며칠 내지 몇 달에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 경우 일반적으로 0.0001mg ~ 100mg, 바람직하게는 0.001mg ~ 10mg이며, 이를 며칠 내지 몇 달에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 항체 및/또는 TCR 유사 항체의 경우 일반적으로 0.0001mg ~ 2000mg, 바람직하게는 0.001mg ~ 2000mg이며, 이것을 1주일 ~ 4주에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 유전자 변형 T 세포 또는 인공 CTL의 경우 일반적으로 1×104 ~ 1×108, 바람직하게는 1×105 ~ 1×107이며 이를 1일 ~ 4주에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 또한 투여 방법은 피내 투여, 피하 투여, 근육 내 투여, 정맥 주사 등의 알려진 임의의 적절한 투여 방법을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드와 뉴클레오티드를 직접 체내에 투여하는 in vivo 법의 다른 인간에서 특정 세포를 채집하여 체외에서 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 CTL과 항원 제시 세포를 유도한 후 이 세포를 체내에 되돌리는 ex vivo 법을 이용할 수도 있다.
본 발명의 예방/치료 방법의 한 양태는 투여하는 단계 전에 HLA-A02 양성 또는 HLA-A24 양성의 대상을 예방/치료의 대상으로 선택하는 단계를 더 포함한다. 본 발명의 이 양태는 상기 선택하는 단계 전에 대상 HLA 형을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 대상의 HLA 형의 결정은 알려진 어떤 방법에 의해 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 예방/치료 방법의 한 양태는 투여하는 단계 전에 ASB4 양성암을 갖는 대상을 예방/치료의 대상으로 선택하는 단계를 더 포함한다. 본 발명의 이 양태는 상기 선택하는 단계 전에 대상에서 ASB4 양성암을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 대상의 ASB4 양성암의 검출은 상기 <9>에 기재된 종양의 검출 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 예방/치료 방법의 한 양태는 투여하는 단계 전에 HLA-A02 양성 또는 HLA-A24 양성이고 또한 ASB4 양성암을 갖는 대상을 예방/치료의 대상으로 선택 단계를 더 포함한다. 본 발명의 이 양태는 상기 선택하는 단계 전에 대상 HLA 형을 결정하는 단계 및 대상의 ASB4 양성암을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
<12> 암 줄기세포를 표적으로 하는 암 치료제의 스크리닝 방법
본 발명의 암 줄기세포 검출제를 사용하는 구체예에서, 검출 대상의 ASB4 발현 산물의 발현량은 검출 대상 중 암 줄기세포의 양과 상관관계가 있는 것으로 생각된다. 따라서, 검출 대상에 암 치료제 후보 화합물을 투여 전후의 ASB4 발현 산물의 발현량을 비교하여 투여한 후보 화합물이 암 줄기세포를 표적으로 하는 암 치료제로서 유용 있는지 여부를 판정할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 다음 단계 (I), (II) 및 임의로 (III)을 포함하는 것이다:
(I) 암 치료제 후보 화합물을 대상에 투여하기 전에, 상기 대상에서 ASB4 유전자의 발현 산물의 검출량 A를 측정하는 단계;
(II) 상기 후보 화합물을 상기 대상 세포 집단에 투여한 후, 상기 대상에서 ASB4 유전자의 발현 산물의 검출량 B를 측정하는 단계, 및
(III) 상기 검출량 A와 B를 비교하고 상기 검출량 A가 B보다 유의하게 큰 경우, 상기 후보 화합물을 암 줄기세포를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 암 치료제 후보라고 판정하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법의 특정 양태는 상기 단계 (I) ~ (III)을 포함한다. 여기서 단계 (I) 및 (II)의 검출량을 측정하는 단계는 각각 상기 검출(검사, 진단) 방법의 단계 (d) 및 (e)를 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 모든 특허 출원 및 기타 간행물은 그 전체를 참조하여 본 명세서에 원용한다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되지 않는다.
실험예 1 : 인간 대장암세포의 SP 분획의 검출 및 클로닝
a) 시약의 조제
배지로 5% 소 태아 혈청(FCS(HyClone Laboratories 사)) 보충 DMEM(Sigma-Alldrich 사) 배지를 조제하고, 37℃로 예열했다. 베라파밀(Sigma-Aldrich 사)는 50mM 조정하고 5% FCS 보충 DMEM 배지에서 5mM 희석했다. 회흐스트(Hoechst) AG 33342 (Lonza 사)는 5% FCS 보충 DMEM 배지에서 250μg/mL로 조정했다. DNase I(Qiagen 사)는 DDW에서 1mg/mL로 조정하고 0.2μm의 필터로 여과 멸균했다.
b) 유동 세포 계측법(FACS)에 대한 세포의 조정
인간 대장암세포주 (SW480 (ATCC))를 4mL의 5% FCS 보충 DMEM 배지에 현탁하여 세포 수를 세었다. 5% FCS 보충 DMEM 배지를 첨가하여 세포 농도를 10×106 개/mL로 조정하고, 검체를 얻었다. 검체의 일부를 이용하여 분주하고, 주 검체는 베라파밀을 첨가하지 않고(베라파밀 (-) 샘플), 부 검체는 베라파밀을 최종 농도 75μM이 되도록 첨가하였다(베라파밀 (+) 검체). 그 후, 베라파밀 (+) 검체 및 베라파밀 (-) 검체에 회흐스트 AG 33342의 최종 농도 5.0μM가 되도록 회흐스트 AG 33342 용액을 첨가하였다.
양 검체를 37℃에서 90분간 진탕 배양 후 얼음으로 냉각하였다. 1500rpm, 4℃에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거했다. 5% FCS 보충 1×PBS에 현탁하여 냉각해둔 FACS 튜브로 옮겼다. 다시 1500rpm, 4℃에서 5 분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 5% FCS 보충 1×PBS에 현탁했다. 마찬가지로 세척을 1회 반복한 후, 2mM의 EDTA들이 2% FCS 보충 1×PBS 2mL에서 정치했다. DNase I 액을 2μL 더해 혼합한 후, FACS 용 필터(벡톤 디킨슨 (BD) 사)에서 세포집 덩어리를 제거했다. 1mg/mL의 요오드화 물(propidium iodide; PI)(Sigma-Aldrich 사)를 2μL 첨가한 후 유세포 측정기로 BD FACS Aria II special edition (등록 상표)(BD 사)를 이용하여 유동 속도 1000 ~ 2000 개/초로 분석했다.
c) 유동 세포 계측법(FACS)
FACS의 작업 지침에 따라 실시했다.
먼저, 베라파밀 (-) 검체의 세포를 분석하고 주체가 되는 세포군(main population (MP))과 비교하여 발광 강도가 낮은 세포군(side population (SP)) 세포를 발견했다(도 1). SP 세포가 ABC 트랜스포터 특이적으로 회흐스트 AG 33342 색소 저염색성임을 확인하기 위해 베라파밀 (+) 검체를 동일한 조건에서 분석하고 SP 세포가 소실되는 것을 확인 하였다(도 1).
SP 세포를 단리 세포를 4℃, 1500rpm에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 100 ~ 200μL의 1×PBS에 현탁했다.
d) 단일 세포 수준에서의 클로닝
SW480 유래 SP 세포를 상기 c)에서 감지하고 SP와 MP 세포 분획을 각각 96 웰 플레이트에 1 세포/1 웰이되도록 싱글 셀 정렬을 실시했다(도 2-1). 각 웰에는 1% 페니실린 스트렙토마이신 첨가 10% FCS 보충 DMEM 배지를 미리 넣어 두었다.
2 ~ 3주간 배양 후 각 웰에서 증식 세포주를 각각 SW480-SP 클론 세포주 SW480-MP 클론 세포주로 하였다. "SW480-SP-X" 또는 "SW480-MP-Y”의 X 및 Y는 각각 클론 번호로 한다.
공초점 현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, MP 클론 세포주는 주로 단층으로 증식하고 각 세포는 방추형을 보여 주었다. 한편, SP 클론 세포주는 중층화 경향을 나타내고 각 세포는 원형 내지 비슷한 원형을 나타냈다. 얻어진 대표적인 SP 복제 및 MP 클론의 현미경 사진을 도 2-2에 나타내었다.
실험예 2 : 종양 형성능 실험
실험예 1에서 얻어진 SW480-SP 및 SW480-MP 클론 세포주 각각의 in vivo에서의 구조 종양 기능을 확인하기 위해 SP 복제 및 MP 클론 각각의 대표적인 3 클론을 이용하여 NOD/SCID 면역 결핍 마우스(오리엔탈 공방 사)에 이식했다.
구체적으로는 동일한 수의 SP와 MP 복제 세포를 각각 얼음에 100μL의 1×PBS에 현탁하여 100μL의 마트리젤(BD 사)과 혼합했다. 100μL 세포 마트리젤 혼합액을 NOD/SCID 마우스 (오리엔탈 공방 사) 등 뒤 피하에 SP와 MP 복제 세포를 각각 100개, 1000개, 10000개, 각 그룹 5마리로 접종하여 종양 형성을 관찰했다. 종양 장경 및 단경의 길이를 측정하여 종양 체적을 (부피=장경×짧은 형태 2/2)의 계산식으로 산출했다. 10000개 이식한 마우스의 종양 성장 곡선을 도 3에 나타낸다.
그 결과, 10000개 세포 이식군에서 세포 접종 후 8주에서 SW480-MP 복제 이식군에서는 종양 형성이 전혀 보이지 않았다. 한편, SW480-SP 복제 이식군에서는 모든 마우스에서 종양 형성이 관찰되어 만들어진 종양의 부피는 SW480-MP 클론군에 비해 유의하게 높았다(도 3). 이것은 암 줄기세포가 종양 형성의 큰 요인이며, SP 복제 세포에 암 줄기세포가 농축된다는 견해(Kondo T, Setoguchi T, Taga T. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. Proc Natl Acad Sci US A. 20 : 781-786, 2004)와 일치한다.
실험예 3 : 인간 대장암 SP 세포의 HLA -A24 결합 자연 펩타이드의 동정
다음 단계에서 인간 대장암세포주 SW480의 SP 분획 세포에만 특이적으로 제시되는 HLA-A24 결합 자연 펩타이드의 용출과 서열 분석을 수행하였다.
a) 세포주
상기 대장암세포주 유래 클론인 SW480-MP 및 SW480-SP 계통은 10% FCS 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco 사)을 첨가한 DMEM 배지에서 배양하여 세포 수를 각각 1.5×109 ~ 1.8×109 개의 범위로 하였다.
b) 항체
항 HLA-A24 항체 (C7709A2)를 생산하는 하이브리도마는 P-G. Coulie 박사(de Duve Institute, Brussel)로부터 공여된 것이다. 하이브리도마를 10% FCS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 55μM의 2-메르캅토 에탄올(Gibco 사), 1mM의 피루브산 나트륨(Gibco 사), 2mM의 L-글루타민 (Sigma-Aldrich 사) 및 20mM의 HEPES(Gibco 사)를 첨가한 RPMI-1640(Sigma-Aldrich 사) 배지에서 배양하고, 배양 상청액으로부터 셀룰로오스 튜브 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG-20000)를 이용한 역삼투압법에 의해 농축 항체를 얻었다. 농축 항체는 0.03% 아지드화 나트륨 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Diagnostics 사)를 첨가하여 4℃에서 보관했다.
c) 항체와 구슬의 결합
30 ~ 40mL의 농축 항체를 3mL의 단백질 A 세파로스비즈(GE Healthcare 社)와 4℃에서 밤새 교반하여 결합시킨 후 0.1M 붕산과 0.2M의 트리에탄올 아민 완충액(pH8.2)으로 세척했다. 항체와 구슬과 20mM의 DIMETHYL PIMELIMIDATE DIHYDROCHLORIDE 함유 트리에탄올 아민 완충액 (pH 8.3)에서 60 ~ 90분간 실온에서 교반하여 공유 결합시켰다.
d) HLA-A24 결합 펩타이드의 면역 침강
0.5% NP-40,50mM 트리스염산 (pH 8), 150mM 염화나트륨 및 프로테아제 저해제를 포함한 완충액을 이용하여 실험예 3a)의 세포(SW480-SP 및 SW480-MP)을 각각 용해하였다. 세포 용해액은 단계적으로 원심분리하고 (2000g에서 10분 동안 38000g에서 30분간 100000g 90분), 상청액을 회수했다. 회수한 상층액은 0.5mL의 단백질 A 세파로스 현탁액 컬럼을 통과시켜 단백질 A 세파로스와 특이적으로 결합하는 성분을 제거한 후, 실험예 3c)에서 제작 한 항체 결합 단백질 A 세파로스비즈와 혼합하여 4℃에서 하룻밤 천천히 교반하면서 자연 펩티드와 HLA-A24 분자의 복합체를 항체 비즈에 결합시켰다.
그 후, 항체 비즈는 4종류의 완충액([1] 0.005%의 NP-40, 50mM 트리스 염산(pH 8.0), 150mM 염화나트륨, 5mM의 EDTA 및 프로테아제 저해제; [2] 50mM 트리스 염산(pH8.0) 및 150mM의 염화나트륨; [3] 50mM 트리스 염산(pH 8.0) 및 450mM의 염화나트륨 및 [4] 50mM 트리스 염산(pH 8.0))을 이용하여 단계적으로 세척한 후, 항체에 결합한 펩타이드 및 HLA-A24 분자를 10% 초산 처리에서 용출시켰다. 이어 목적으로 하는 펩타이드 만을 3kDa 컷오프 필터(Millipore 사)에 의해 추출하였다. 이 펩티드 함유 추출액을 농축 건조하여 0.1% 포름산을 용매로 다시 용해하여 샘플로 했다.
e) 용출 펩타이드 서열 분석
실험예 3d)에서 얻어진 샘플을 나노후로 HPLC(Kya Technologies Corporation 사)로 분획하여, MALDI 기질에 spot한 후 질량 분석기(Applied Biosystems 사; MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF)에서 분석했다. 질량 스펙트로메트리 분석 및 단백질 서열 분석은 Applied Biosystems 4000 Series Explorer software(ver. 3.5.3) ProteinPilot 3.0 소프트웨어 (Applied Biosystems 사) 및 ipi.HUMAN FASTA 단백질 데이터베이 (ver. 3.71)을 사용했다. 얻어진 단백질 서열 중 SW480-SP에 특이적이었던 것들 중, 실험예 4 이상에서 후술하는 ASB4 유전자에서 유래 펩타이드 서열 및 분석 스펙트럼을 도 4에 나타낸다.
f) 고찰
항 HLA-A24 항체에 의한 면역 침강과 질량 스펙트로메트리 분석을 조합한 방법에 의해, HLA-A24 결합 펩타이드의 식별이 가능했다. 이들은 대장암세포 표면에 제시되는 자연 펩타이드인 것으로 생각된다. 또한 MP 분획 세포에서도 같은 방법을 이용하여 분석한 후 양자를 비교함으로써 SP 분획 세포에 특이적으로 항원 제시되는 자연 펩타이드로서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 자연 펩타이드 등이 확인되었다.
실험예 4 : HLA -A24 결합 자연 펩타이드를 코딩하는 유전자의 발현
a) SP 특이적인 유전자 발현
실험예 3e)에서 SP 분획 세포에 특이적인 HLA-A24 결합 자연 펩타이드가 복수 동정되었다. 이 펩타이드는 크게 두 그룹으로 분류되는 것으로 생각된다. 즉, 펩타이드를 코딩하는 유전자가 SP 분획 세포 특이적으로 발현하는 그룹과 펩타이드를 코딩하는 유전자는 SP 분획 세포, MP 분획 세포 모두 발현하고 있지만, 단백질 발현 수준 또는 펩티드 처리의 차이에서 MP는 자연 펩타이드로 HLA-A24에 의해 항원 제시되지 않는 그룹이다.
위에서 확인된 자연 펩타이드를 이 분류 목적으로 분류하기 위해 SW480-SP 및 SW480-MP 각각의 mRNA를 추출하여 RT-PCR에 의한 유전자 발현의 검토를 실시한 결과, SP 분획 세포 특이적으로 발현하는 유전자 중 하나로 ASB4 유전자를 확인했다. 유전자 발현 분석 결과를 도 5에 나타낸다. mRNA 추출 및 역전사에는 각각 TRIzol (Invitrogen 사) 및 SuperScript (등록 상표) III Reverse Transcriptase (Invitrogen 사)를 제품에 첨부된 설명서에 따라 사용했다. RT-PCR에 사용한 프라이머 및 온도 사이클의 조건을 아래 표에 나타내었다. RT-PCR 산물은 1.5% 아가로오스 겔을 사용하여 100V에서 25 분간 전기영동을 실시했다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
b) 정상 세포에서 ASB4 유전자 발현
실험예 4a)에서 확인된 ASB4 대해 인간 성인 정상 세포에서 발현을 조사했다. 인간 성인 정상 조직 유래 mRNA 패널을 클론테크 사로부터 입수하고 이를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. mRNA 패널은 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 전립선, 고환, 난소, 소장, 대장, 말초 혈액 단핵구의 각 성인 정상 세포 및 조직 유래 mRNA가 포함되어 있다.
먼저 SuperScript (등록 상표) III 역전사 효소(인비트로젠 사 제품)를 이용하여 장비의 프로토콜에 따라 mRNA에서 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 순행(Fw) 프라이머 및 역행 (Rv) 프라이머(표 1)를 이용하여 RT-PCR에 의해 ASB4의 cDNA를 증폭했다. 또한 컨트롤로 GAPDH의 cDNA를 같은 방법으로 증폭했다. PCR 조건을 표 2-3에 나타낸다. 증폭된 증폭물에 1.5% 아가로오스 겔을 사용하여 100V에서 25 분간 전기영동을 실시했다. 결과를 도 6에 나타낸다.
c) 암세포주에서 ASB4 유전자 발현
대장암 세포주 3종류(SW480, SW620, HTC116), 폐암 세포주 4종류(A549, LHK2, LK79,86-9), 신장 세포암 2종(Caki 1 ACHN), 유방암 세포주 2종류(MDAMB468, MCF7), 난소암 2종(ES2, Tov21G), 자궁 경부암 세포주 1종류(HeLa), 방광암 세포주 1종류(UMUC3), 골육종 1종류(U205), 구강암 세포주 2종류(OSC70, HSC2)의 ASB4 유전자 발현을 실험예 4b)와 같은 방법에 의해 확인되었다. 결과를 도 7에 나타낸다.
d) 고찰
대장암세포의 줄기세포인 SW480SP 특이적으로 HLA-A24 펩타이드 제시되는 ASB4 단백질의 유전자 발현을 확인하였다(도 5). 이 유전자는 사망자 수가 국내 및 세계적으로 많은 대장암 및 폐암 등의 상피 악성 종양 세포주에서 발현이 확인된 반면 각종 장기의 정상 세포에 발현을 볼 수 없다(도 6 및 도 7). 즉 ASB4 유전자 및 그 산물인 펩타이드는 암 치료 표적으로 이상적인 자질을 가지고 있다고 생각된다.
실험예 5 : 펩타이드 결합 분석
질량 스펙트로메트리 분석에서 얻어진 ASB4 단백질 유래 펩타이드 (IV9 : 서열번호 3)의 HLA-A24 결합 능력을 검증했다. 우선 T2-A24 세포를 24℃에서 하룻밤 배양하고 다음날 도 8에 나타낸 농도 범위(0.3μM, 1μM, 3.3μM 및 10μM)에서 펩티드를 펄스 동일한 온도를 유지하여 3시간, 계속하여 37℃에서 2.5 시간 동안 배양하였다. 양성(positive) 컨트롤로 HIV584 -594 펩티드(아미노산 서열: RYLRDQQLLGI; 서열번호 51), 음성(negative) 대조군으로 GK12 펩티드 (아미노산 서열: GYISPYFINTSK; 서열번호 52)를 사용하였다. 원심 분리 (15000rpm, 5 분)하여 상청을 제거, 격리 세포 성분을 HLA-A24 항체(C7709A2.6) 처리(4℃, 1시간 반응)했다. 그 후 PBS로 세척하고 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 이차 항체 (Goat anti-MouseIgG, FITC) 처리 (4℃, 30분간 인큐베이션)했다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고 1% 파라포름 알데히드 인산 완충액을 가하여 세포를 고정하였다. 유세포 측정기 (FACScan)를 이용하여 FITC 형광 강도를 측정하여 세포 표면에 발현하는 합성 펩티드와 HLA-A24의 복합체의 양을 정량하였다. 결과를 도 8에 나타낸다. 도 8에 표시된 대로 ASB4 단백질 유래 펩타이드 IV9는 HLA-A24에 대한 결합활성을 갖는 것으로 나타났다.
실험예 6 : 세포 독성 T 세포 ( CTL ) 유도
a) 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 분리
통보를 받은 HLA-A24 양성 대장암 환자 또는 HLA-A24 양성 정상인의 말초 혈액을 헤파린 첨가 50mL 주사기로 채혈했다. 전혈을, 인포프렙(Nycomed 사)을 13mL 첨가 한 50mL 튜브(팔콘 사)에 중층하고, 2000rpm, 30 분간 원심분리하였다. 인포프렙 층에 침전된 PBMC 층을 피펫으로 회수하고 PBS로 3회 세척하고 인간 PBM로 하였다.
b) CD8 양성 세포(CD8+) 및 CD8 음성 세포(CD8-)의 분리
상기와 같이 분리된 PBMC를 10mL의 AIM-V 배양액 (Life Technologies 사)에 현탁 후 10cm 플라스틱 배양 접시에서 약 2시간 37℃에서 배양하였다. 10cm 접시를 부드럽게 흔들어 부유 세포를 AIM-V 배양액과 함께 회수하고 15mL 튜브에서 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 얻어진 펠렛에 160μL의 2mM의 EDTA 첨가 0.1% BSA 보충 PBS에 현탁하여 40μL의 CD8 마이크로 비즈(Miltenyi Biotec 사)를 첨가, 혼합한 후 4℃에서 15분간 배양하고, 2mM의 EDTA 첨가 0.1% BSA 보충 PBS5mL로 세척하고 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 펠렛, 2mM의 EDTA 첨가 0.1% BSA 보충 PBS1mL를 첨가, 혼합하여 자석 장착 컬럼에 첨가하고, 2mM의 EDTA 첨가 0.1% BSA 보충 PBS에 의해 5회 세척 후 컬럼을 자석에서 탈착하여 CD8+ 세포를 회수하였다. 컬럼에 부착하지 않은 세포를 CD8- 세포로 하였다.
c) 합성 펩타이드에 의한 CD8+ 세포 자극
CD8- 세포와 CD8+ 세포를 10% 인간 AB 혈청(HS) 첨가 AIM-V 배양액에서 배양하였다. 일부 CD8- 세포에 1mg/mL의 피토헤마글루티닌(Phytohaemagglutinin; PHA) (WAKO chemicals 사) 및 100U/mL의 인터루킨 2(IL-2) (타케다약품공업 사)를 첨가하여 7일간 배양하고 PHA-blast 세포를 제작했다. PHA-blast 세포에 실험예 3e)에서 식별된 ASB4 유래의 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드 IV9 서열번호 3)를 20μg/mL 첨가하여 실온에서 1시간 배양하였다. 펩타이드 펄스 PHA-blast 세포를 방사선 조사기(Softex 사)에서 100Gy 조사하여 10mL의 PBS 첨가한 후 1500rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 펠렛을 1mL의 10% HS 첨가 AMI-V 현탁하여 세포 농도를 계산하였다. 4×105 개의 PHA-blast 세포를 2×106 개의 CD8+ 세포에 첨가하여 1mL의 10% HS 첨가 AIM-V에서 1주간 37℃에서 배양하였다. 7일째 뿐만 아니라 펩타이드 펄스한 PHA-blast 세포를 100Gy의 방사선으로 조사하여 CD8+ 세포에 첨가하였다. 8 일째, CD8+ 세포에 20U/mL의 IL-2를 첨가하였다. 비슷한 PHA-blast 세포에 의한 자극을 14 일에 실시했다.
실험예 7 : 인터페론 ( IFN )-γ ELISPOT 분석
a) ELISPOT 플레이트 제작
실험은 Human IFNγ ELISPOT set (BD 사)를 사용하여 수행하였다. ELISPOT 플레이트에 200배 희석한 항 IFNγ 항체를 4℃에서 하룻밤 정치하여 코트했다. 10% FCS 보충 RPMI (Sigma-Aldrich 사)에서 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양 차단하고 ELISPOT 플레이트로 하였다.
b) 세포 배양
20μg/mL의 농도에서 각 펩타이드를 인간 림프구 세포 T2 세포(Human lymphoblastoid cell T2 cell)에 HLA-A2402 유전자를 도입하여 발현시킨 세포주인 T2-A24 세포(Mr. Katsushima, 아이치현 암센터로부터 공여)에 실온에서 1시간 펄스했다. 펩타이드 펄스군은 [1] 펩타이드 펄스 없음, [2] HIV 펩타이드 펄스, [3] ASB4 펩타이드 펄스의 3군으로 하였다. 펩타이드 펄스 후 PBS 첨가, 1500rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 5×105 개/mL가 되도록 현탁하여 ELISPOT 플레이트에 각 웰 5×104 개씩 파종했다. CTL을 각 웰 5×104 개 파종하고 37℃에서 하룻밤 배양하였다.
c) 스팟의 검출
하룻밤 배양한 ELISPOT 플레이트에서 배양액과 세포를 제거 후, Milli Q 물에서 2번 wash buffer로 3회 세척하였다. 각 웰에 250배 희석한 비오틴화 검출 항체를 첨가, 실온에서 2시간 동안 배양하였다. Wash buffer로 3회 세척 후 100배 희석한 HRP 표지 스트렙타비딘을 각 웰에 첨가, 실온에서 1시간 배양하였다. Wash buffer로 3회 세척 및 PBS로 2회 세척 후 발색 시약을 각 웰에 첨가, 실온에서 15 ~ 30분간 발색 반응을 수행하였다. 충분한 가시 스팟 형성을 확인 후, Milli Q 물로 세척하여 반응을 종료했다. 니트로셀룰로오스 막을 건조 후 KS ELISPOT (ZEISS 사)에서 감지 촬영했다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, ASB4 펩타이드 펄스군에서 IFNγ 스팟이 검출되었다.
실험예 8 : 세포 독성 시험
T2-A24 세포, SW480-SP, SW480-MP 및 HLA-class I 결실의 백혈병 세포 K562(ATCC로부터 입수)을 1×106 개/mL의 세포 농도로 10% FBS 보충 RPMI에 현탁했다. 10mL의 10% FBS 보충 RPMI로 3회 세척하였다.
T2-A24 세포에 20μg/mL의 농도에서 IV9 펩타이드 및 T2-A24 세포 결합 양성 컨트롤로 HIV584 -594 펩타이드를 실온에서 1시간 펄스했다. 음성 대조군으로는 펩타이드 펄스 없는 군을 사용하였다. T2-A24 세포의 실험군은 [1] 펩타이드 펄스 없음 [2] HIV584 -594 펩타이드 펄스 [3] IV9 펩타이드 펄스의 3군으로 하였다. 또한 K562에도 같은 조건에서 IV9 펩티드를 펄스했다. SW480-SP 및 SW480-MP의 양 군는 펩타이드 펄스 없이 사용하였다. 펩타이드 펄스 후 PBS로 2 회 세척하였다. 각 군 세포를 1×105 개/100μL에서 각 웰에 파종했다.
이펙터 세포 (CTL)를 이펙터/목표 비율 (E/T ratio) 1, 3, 9가 되도록 각 개수의 CTL을 각 웰에 파종했다. 자연 유리 웰로 이펙터 세포(CTL)를 파종했다. 최대 유리 웰에는 타겟 세포에 최종 농도 2%가 되도록, 4%의 NP-40 첨가 PBS를 첨가하였다. 37℃에서 6시간 배양 후 원심 분리하여 상층액 100μl를 새로운 접시에 옮겨 LDH Cytotoxitity Detection Kit 반응 액(다카라 바이오 주식회사)를 각 웰에 100μl 첨가하였다. 10분 후, 각 웰의 형광 강도를 테라 스캔(Tera Scan)에서 측정했다. 세포 독성 활성을 아래 계산식으로 계산했다.
세포 독성 활성 = (실험군의 유리양 - 실험군의 자연 유리양)/(실험군의 최대 유리양 - 실험군의 자연 유리양)×100
도 10과 같이 CTL은, [1] 펩타이드 펄스 없는 군, [2] HIV 펩타이드 펄스 군, IV9 펩타이드 펄스 K562 군에 비해 [3] IV9 펩타이드 펄스군에 대해 높은 세포 독성 활성을 나타냈다. 이는 CTL이 ASB4 펩타이드에 특이적 세포 독성 활성을 나타내는 것을 시사한다. 또한 SW480-SP 군은 펩타이드 펄스 없이도 [3] IV9 펩타이드 펄스군과 동등한 세포 독성 활성을 나타낸 한편, SW480-MP 군은 [1] 펩타이드 펄스 없는 군 및 [2] HIV 펩타이드 펄스군과 같은 정도의 세포 독성 활성 밖에 보이지 않았다. 이것은 SW480 세포주가 SP 분획 세포에서만 IV9 펩타이드를 세포 표면에 항원 제시하고 있음을 시사한다.
실험예 9 : HLA -A*02:01 및 HLA -A*24:02 결합 모티프를 갖는 ASB4 유래 펩타이드
MHC와 펩티드 결합 예측 프로그램인 BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/) 및 IEDB(MHC-I processing predictions; http://www.iedb.org/) 등을 이용하여 HLA-A*02:01 및/또는 HLA-A*24:02에 결합이 예상되는 ASB4 유래 펩타이드(서열번호 4 ~ 46로 표시되는 펩타이드)을 추출하였다. 이러한 펩타이드를 Fmoc 법으로 합성했다. 합성한 펩타이드를 다음 표 4에 나타낸다. Start는 합성한 펩티드의 N 말단 아미노산의, ASB4(서열번호 2)의 아미노산 위치를 나타내고 End는 합성한 펩타이드의 C 말단 아미노산의, ASB4(서열번호 2)의 아미노산 위치를 나타낸다. Length는 합성한 펩티드의 아미노산 수를 나타낸다.
Figure pct00004
실험예 10 : ASB4 유래 펩티드의 HLA -A*02:01 또는 HLA -A*24:02 연결성 평가
ASB4 유래 펩타이드의 각 HLA 분자에 결합성 평가는 MHC 클래스 I 발현 안정화 시험으로 실시했다. 본 시험에서는 인간 림프아구성(lymphoblastoid) 세포주인 T2-A24 세포를 이용했다. T2 세포는 세포질에서 소포체로 펩타이드의 수송에 관여하는 항원 펩티드 수송체(TAP; transporter associated with antigen processing)가 결손되어 있다. MHC 클래스 I 분자 (HLA-A*02:01 및 HLA-A*24:02)은 펩타이드가 결합하지 않은 상태(empty MHC class I)에서는 구조가 불안정하다는 것을 알 수 있다. 일반적으로 T2 세포는 세포 표면에 낮은 수준의 empty MHC class I 분자밖에 발현하지 못한다. 그러나 MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있는 펩타이드를 첨가하면 empty MHC class I 분자는 상기 펩타이드와 결합하여 세포 표면에서 안정화하여 존재할 수 있다. 따라서 세포 표면 MHC 클래스 I 발현 수준은 펩티드의 MHC 클래스 I 결합 친화력에 의존하게 된다.
T2-A24 세포는 37℃, 5% CO2 하에서 계대배양 하였다. 펩티드는 ASB4 유래 펩타이드(표 4에 기재된 펩타이드), HLA-A02 양성 컨트롤로 Melan A A27L 펩티드(아미노산 서열: ELAGIGILTV; 서열번호 47), HLA-A24 양성 컨트롤로 HIV584 -592 펩티드(아미노산 서열: RYLRDQQLL; 서열번호 48), HLA-A02 음성 대조군으로 MAGE-1161-169 펩티드(아미노산 서열: EADPTGHSY; 서열번호 49), HLA-A24 음성 대조군으로 VSV52 -59 펩티드(아미노산 서열: RGYVYQGL; 서열번호 50) 를 각각 100μg/mL의 농도로 사용하여 연결성을 평가했다. 이러한 펩티드는 DMSO에 용해되고, 또한 RPMI160 배지에서 200 배로 희석되었다. 세포 현탁액과 펩티드 용액을 혼합하고 5% CO2, 26℃의 조건에서 16 ~ 18시간 배양하였다. 온도를 37℃로 하여 또한 3시간 공배양한 후 원심 분리하여 상청을 제거하고 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 3% FBS를 포함한 PBS로 세척하고, FITC 형광 표지된 항 HLA-A02 항체(clone: BB7.2; 의학 생물학 연구소) 또는 항 HLA-A24 항체(clone : 17A10; 의학 생물학 연구소)를 첨가하여 실온에서 30 분 방치했다. 그 후, 세포를 3% FBS를 포함한 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드 인산 완충액을 첨가하여 실온에서 10분간 방치하여 세포를 고정하였다. 고정된 세포는 유세포 측정기(FACScan)에서 FITC 형광 강도를 측정했다. 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity; MFI)의 용매 비율을 산출했다.
HLA 결합 시험의 결과를 표 5에 나타낸다. 표 5와 같이 서열번호 4 ~ 23로 표시되는 펩티드의 HLA-A*02:01에 대한 MFI가 1.5 이상을 보였고, 서열번호 3 ~ 14 및 24 ~ 30으로 표시되는 펩티드의 HLA -A*24:02에 대한 MFI가 1.5 이상을 보였으며, 서열번호 4-14로 표시되는 펩티드의 HLA-A*02:01 및 HLA-A*24:02의 양쪽에 대한 MFI는 1.5 이상을 보여 주었다.
Figure pct00005
실험예 11 : HLA -A*02:01 유전자 도입 마우스 및 HLA -A*24:02 유전자 도입 마우스를 이용한 in vivo에서의 CTL 유도능의 평가
실험예 10에서 HLA-A*02:01 및/또는 HLA-A*24:02에 대한 MFI가 1.5 이상의 ASB4 유래 펩타이드에 대해, 그 CTL 유도능을 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스 및/또는 HLA-A*24:02 유전자 도입 마우스를 이용한 in vivo의 CTL 유도 시험에 의해 평가했다.
HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스(C57BL/6CrHLA-A2.1DR1)는 마우스의 MHC를 결손시, 인간의 MHC인 HLA-A*02:01 및 HLA-DRB1*01:01을 발현하는 마우스이며, 해당 마우스를 이용하는 것으로, 인간 CTL을 유도할 수 있는 펩티드의 선택이 가능하다. 또한 HLA-A*24:02 유전자 도입 마우스는 인간의 MHC인 HLA-A*24:02을 발현하는 마우스이며, 해당 마우스를 이용하는 것으로, 인간 CTL을 유도할 수 있는 펩티드의 선택이 가능하다. 그래서 각 펩타이드가 CTL 유도 활성을 갖는 여부는 상기 마우스에 펩타이드 투여에 의해 투여 펩티드에 반응할 수 있는 T 세포가 유도되는지 여부로 판단했다.
구체적으로는 다음과 같이 실시하였다. 먼저 펩타이드를 디메틸설폭사이드로 80mg/mL에 용해시킨 후 주사 용수에 희석하여, 같은 양의 불완전 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)(ISA51VG)와 혼합하여 에멀젼화시켰다. 에멀젼화시킨 펩타이드는 마우스의 능선부 피부에 250μg/개소의 용량으로 2개소 투여했다. 1주일 후에 마우스를 CO2 가스에 의해 안락사시킨 후 비장을 적출하여 비장 세포를 제조하였다. IFNγ 생산의 측정은 IFNγ ELISPOT 분석 키트(벡톤 디킨슨 사)를 사용하였다. 비장 세포 조제 전날, ELISPOT 플레이트 항 IFNγ 항체로 처리하고 당일에 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 차단했다. 조제한 비장 세포를 0.25 ~ 1.0×106 개/웰에서 차단한 ELISPOT 플레이트에 파종했다. 투여한 ASB4 유래 펩타이드를 DMSO에서 40mg/mL에 용해하고, 10% RPMI1640 배지에서 20μg/mL에 희석했다. 희석한 펩타이드를 50μL/웰에서 그 펩타이드를 투여한 동물에서 유래하는 비장 세포에 첨가하였다. 펩타이드를 첨가한 비장 세포를 16 ~ 18시간 동안 37℃, 5% CO2 하에서 배양하여 in vitro에서 펩타이드 다시 자극을 더했다. 배양 후 상청을 제거, ELISPOT 플레이트를 첨부한 프로토콜에 따라 발색시켰다. 발색한 스팟의 수는 KS-ELISPOT에 의해 측정했다.
IFNγ ELISPOT 분석 결과는 도 11 ~ 38에 나타낸다.
본 시험의 결과 HLA-A*02:01 유전자 도입 마우스 유래의 비장 세포에서 펩타이드 특이적 IFNγ 생산이 확인된 것으로부터 서열번호 4 ~ 12 및 15 ~ 23로 표시되는 ASB4 유래 각 펩타이드가 CTL 유도능을 가지는 것으로 나타났다. 또한 HLA-A*24:02 유전자 도입 마우스 유래의 비장 세포에서 펩타이드 특이적 IFNγ 생산이 확인된 것으로부터 서열번호 4 ~ 9, 13, 14, 25, 26 및 28 ~ 30로 표시되는 ASB4 유래 펩타이드가 CTL 유도능을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 서열번호 4 ~ 9로 표시되는 ASB4 유래의 각 펩타이드가 HLA-A02 형 및 HLA-A24 형의 두 대상에서 CTL 유도능을 갖는 것이 나타났다.
실험예 12 : 인간 말초 혈액 단핵 세포를 이용한 CTL 유도능의 평가
실험예 11에서 HLA-A02 형 및 HLA-A24 형의 두 대상에서 CTL 유도능을 갖는 것으로 확인된 서열번호 4 ~ 9로 표시되는 6 종류의 펩티드에 대해 해당 펩타이드의 자극에 의해 건강한 사람 유래 말초 혈액 단핵 세포에서 펩타이드 특이적 T 세포가 유도되는지 평가했다.
구체적으로는 HLA-A*02:01 양성 또는 HLA-A*24:02 양성 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포 (Cellular Technology Limited 사제)을 10% 사람 유래 혈청을 함유하는 AIM-V 배지에서 suspend 한 후, 96 구멍 U 바닥 플레이트의 각 웰에 약 1×105 개 파종하여 37℃, 5% CO2 하에서 배양하였다. 이 때, 인간 IL-2를 100U/mL 및 펩타이드를 20μg/mL에 첨가하였다. 3일 또는 4일마다 배지를 교환하고 약 2주 후에 IFNγ ELISPOT 분석을 실시했다. 분석 전날, ELISPOT 플레이트 항 IFNγ 항체로 처리하고 당일에 10% 우태아 유래 혈청을 포함한 RPMI1640 배지에서 약 2시간 동안 실온에서 차단했다. 배양 중인 인간 말초 혈액 단핵 세포를 10% 사람 유래 혈청을 함유하는 AIM-V 배지로 세척하고 차단한 ELISPOT 플레이트의 각 웰에 파종했다. 37℃, 5% CO2 하에서 배양하여 16 ~ 18시간 후에 상청을 제외하고, ELISPOT 플레이트를 첨부된 프로토콜에 따라 발색시켰다. 발색한 스팟의 수는 Cellular Technology Limited 사의 ELISPOT 분석기로 측정했다.
HLA-A*02:01 양성 PBMC를 이용하여 서열번호 4, 5, 6, 8 및 9에 대해 평가한 결과를 도 39, 40, 41, 42 및 43에 HLA-A*24:02 양성 PBMC 를 이용하여 서열번호 5 및 8에 대한 평가 결과를 도 44 및 45에 나타낸다. 세로축은 각 웰에서 인정된 스팟이 수를, 가로축은 양성 웰 번호를 나타낸다. 또한 검은 막대는 펩티드 자극 조건에서 검출된 스팟의 수를 흰 막대는 펩타이드 비 펄스 조건에서 검출된 스팟(컨트롤)의 수를 나타낸다. 즉, 검은 막대와 흰 막대의 차이가 펩타이드 특이적인 스팟임을 나타내고 있다.
본 시험의 결과, 서열번호 4, 5, 6, 8 및 9로 표시되는 펩티드는 HLA-A*02:01 양성 또는 HLA-A*24:02 양성의 정상인 유래의 말초 혈액 단핵 세포로부터, 이들의 펩타이드 특이적 CTL을 유도하는 것으로 나타났다.
또한 서열번호 5 및 8로 표시되는 ASB4 유래의 각 펩타이드가 HLA-A02 형 및 HLA-A24 형의 두 대상에서 CTL 유도능을 갖는 것이 나타났다.
본 발명은 암 줄기세포에 실제로 항원 제시되는 ASB4 유래 자연 펩타이드를 식별하여 펩티드 백신에 의해 유도된 CTL이 확실하게 암세포를 살상하고, 효율적인 암 백신의 개발에 기여하는 것이다. 또한 확인된 암 줄기세포 특이적 자연 펩타이드에서 암 줄기세포에서 특이적으로 ASB4가 발현하고 있음을 확인함으로써, ASB4를 마커로 암 줄기세포를 특정할 수 있게 된다. 또한 이 유전자 유래의 자연 항원 펩티드는 소량으로도 큰 효과를 갖는 암의 예방 및/또는 치료제로서 유용하다. 또한, 본 발명에 의해, CTL 유도 활성을 갖는 ASB4 유래의 종양 항원 펩티드 등이 제공된다. 본 발명의 펩티드는 암의 예방 및/또는 치료제로서 유용하다.
<110> Sumitomo Dainippon Pharma Co. Ltd. Sapporo Medical University <120> Tumor antigenic peptide <130> 2017FPI-05-003_JP <150> JP 2014-249169 <151> 2014-12-09 <150> PCT/JP 2015/084428 <151> 2015-12-08 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1281 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggacggca ccactgcccc tgtcactaaa tctggagctg ccaagttagt taagagaaat 60 ttccttgagg cgctaaagtc caatgacttc ggaaaattga aggctatttt gatccaaagg 120 caaatagatg tggacactgt ttttgaagtc gaagatgaga atatggtttt ggcatcttat 180 aaacaaggtt actggttgcc tagctataaa ttgaagtctt cctgggccac aggcctccat 240 ctctctgtct tgtttggcca tgtggaatgt cttctggtgc tactggacca caatgctaca 300 atcaactgta gacccaatgg gaaaacccct cttcacgtgg cttgtgaaat ggccaatgtg 360 gattgtgtta agatcctctg tgatcgtggg gcaaagctca attgctactc cttaagtgga 420 cacacagctt tgcacttttg tacaactcca agttccattc tctgtgccaa gcaattggtt 480 tggagagggg cgaatgtgaa catgaagacc aacaaccaag atgaggagac gcccttgcac 540 acggctgccc acttcggcct ttcggagctg gtggccttct acgtggaaca cggggccata 600 gtggacagcg tgaatgccca catggagacc cccctggcca 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Ile Asp Val Asp Thr Val Phe 35 40 45 Glu Val Glu Asp Glu Asn Met Val Leu Ala Ser Tyr Lys Gln Gly Tyr 50 55 60 Trp Leu Pro Ser Tyr Lys Leu Lys Ser Ser Trp Ala Thr Gly Leu His 65 70 75 80 Leu Ser Val Leu Phe Gly His Val Glu Cys Leu Leu Val Leu Leu Asp 85 90 95 His Asn Ala Thr Ile Asn Cys Arg Pro Asn Gly Lys Thr Pro Leu His 100 105 110 Val Ala Cys Glu Met Ala Asn Val Asp Cys Val Lys Ile Leu Cys Asp 115 120 125 Arg Gly Ala Lys Leu Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Gly His Thr Ala Leu 130 135 140 His Phe Cys Thr Thr Pro Ser Ser Ile Leu Cys Ala Lys Gln Leu Val 145 150 155 160 Trp Arg Gly Ala Asn Val Asn Met Lys Thr Asn Asn Gln Asp Glu Glu 165 170 175 Thr Pro Leu His Thr Ala Ala His Phe Gly Leu Ser Glu Leu Val Ala 180 185 190 Phe Tyr Val Glu His Gly Ala Ile Val Asp Ser Val Asn Ala His Met 195 200 205 Glu Thr Pro Leu Ala Ile Ala Ala Tyr Trp Ala Leu Arg Phe Lys Glu 210 215 220 Gln Glu Tyr Ser Thr Glu His His Leu Val Cys Arg Met Leu Leu Asp 225 230 235 240 Tyr Lys Ala Glu Val Asn Ala Arg Asp Asp Asp Phe Lys Ser Pro Leu 245 250 255 His Lys Ala Ala Trp Asn Cys Asp His Val Leu Met His Met Met Leu 260 265 270 Glu Ala Gly Ala Glu Ala Asn Leu Met Asp Ile Asn Gly Cys Ala Ala 275 280 285 Ile Gln Tyr Val Leu Lys Val Thr Ser Val Arg Pro Ala Ala Gln Pro 290 295 300 Glu Ile Cys Tyr Gln Leu Leu Leu Asn His Gly Ala Ala Arg Ile Tyr 305 310 315 320 Pro Pro Gln Phe His Lys Val Ile Gln Ala Cys His Ser Cys Pro Lys 325 330 335 Ala Ile Glu Val Val Val Asn Ala Tyr Glu His Ile Arg Trp Asn Thr 340 345 350 Lys Trp Arg Arg Ala Ile Pro Asp Asp Asp Leu Glu Lys Tyr Trp Asp 355 360 365 Phe Tyr His Ser Leu Phe Thr Val Cys Cys Asn Ser Pro Arg Thr Leu 370 375 380 Met His Leu Ser Arg Cys Ala Ile Arg Arg Thr Leu His Asn Arg Cys 385 390 395 400 His Arg Ala Ile Pro Leu Leu Ser Leu Pro Leu Ser Leu Lys Lys Tyr 405 410 415 Leu Leu Leu Glu Pro Glu Gly Ile Ile Tyr 420 425 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Ile Tyr Pro Pro Gln Phe His Lys Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 His Leu Ser Val Leu Phe Gly His Val 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Ser Val Leu Phe Gly His Val Glu Cys Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Lys Ile Leu Cys Asp Arg Gly Ala Lys Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Ile Leu Cys Asp Arg Gly Ala Lys Leu 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 His Phe Gly Leu Ser Glu Leu Val Ala Phe Tyr Val 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 Cys Tyr Ser Leu Ser Gly His Thr Ala Leu 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 10 Val Leu Phe Gly His Val Glu Cys Leu Leu 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 11 His Val Glu Cys Leu Leu Val Leu Leu 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 12 Cys Tyr Gln Leu Leu Leu Asn His Gly Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 13 Ala Ala Gln Pro Glu Ile Cys Tyr Gln Leu Leu 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 14 Pro Leu Leu Ser Leu Pro Leu Ser Leu 1 5 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 15 Ala Ile Leu Ile Gln Arg Gln Ile Asp Val 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 16 Leu Val Leu Leu Asp His Asn Ala Thr Ile 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 17 Ser Ile Leu Cys Ala Lys Gln Leu Val 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 18 Gly Leu Ser Glu Leu Val Ala Phe Tyr Val 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 19 Arg Met Leu Leu Asp Tyr Lys Ala Glu Val 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 20 His Val Leu Met His Met Met Leu Glu Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 21 Leu Met Asp Ile Asn Gly Cys Ala Ala Ile 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 22 Thr Leu Met His Leu Ser Arg Cys Ala Ile 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 23 Tyr Leu Leu Leu Glu Pro Glu Gly Ile Ile 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 24 Ala Thr Gly Leu His Leu Ser Val Leu Phe 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 25 Ala Phe Tyr Val Glu His Gly Ala Ile Phe 1 5 10 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 26 Pro Leu Ala Ile Ala Ala Tyr Trp Ala Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 27 Ile Gln Tyr Val Leu Lys Val Thr Ser Val 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 28 Arg Ile Tyr Pro Pro Gln Phe His Lys Val 1 5 10 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 29 Lys Tyr Trp Asp Phe Tyr His Ser Leu Phe Thr Val 1 5 10 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 30 Lys Tyr Trp Asp Phe Tyr His Ser Leu 1 5 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 31 Lys Leu Val Lys Arg Asn Phe Leu Glu Ala Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 32 Asp Phe Gly Lys Leu Lys Ala Ile Leu 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 33 Gln Ile Asp Val Asp Thr Val Phe Glu Val 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 34 Phe Glu Val Glu Asp Glu Asn Met Val Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 35 Gly Tyr Trp Leu Pro Ser Tyr Lys Leu 1 5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 36 Lys Leu Lys Ser Ser Trp Ala Thr Gly Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 37 His Phe Cys Thr Thr Pro Ser Ser Ile Leu 1 5 10 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 38 Lys Gln Leu Val Trp Arg Gly Ala Asn Val 1 5 10 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 39 Met Leu Glu Ala Gly Ala Glu Ala Asn Leu 1 5 10 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 40 Gln Tyr Val Leu Lys Val Thr Ser Val 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 41 Leu Leu Leu Asn His Gly Ala Ala Arg Ile 1 5 10 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 42 Leu Leu Asn His Gly Ala Ala Arg Ile 1 5 <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 43 Val Val Val Asn Ala Tyr Glu His Ile 1 5 <210> 44 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 44 Asp Phe Tyr His Ser Leu Phe Thr Val 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 45 Ala Ile Pro Leu Leu Ser Leu Pro Leu 1 5 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 46 Ser Leu Pro Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 47 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 48 Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 49 Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 50 Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu 1 5 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 51 Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 52 Gly Tyr Ile Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Thr Ser Lys 1 5 10 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 53 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 54 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 55 ctgtcttgtt tggccatgtg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 56 gcgtctcctc atcttggttg 20

Claims (42)

  1. Y0-X0-Z0
    로 표시되는 암 줄기세포 특이적인 항원 펩티드로서,
    X0가 하기의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나이고:
    (1) ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 내지 14 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신(Leucine), 이소류신(isoleucine) 또는 메티오닌(methionine)이며, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린(valine), 류신 또는 이소류신인 펩타이드;
    (2) (1)의 부분 펩티드에 있어서, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는 C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 펩타이드;
    (3) ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 내지 14 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신(Tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine) 또는 트립토판(tryptophan)이며, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌인 펩타이드; 또는
    (4) (3)의 부분 펩티드에 있어서, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 펩타이드;
    Y0 및 Z0가, 서로 독립적으로 0개에서 복수의 아미노산으로 구성된 펩티드인, 상기 항원 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, X0가 하기의 (1') 내지 (4') 중 하나이고:
    (1') ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 내지 11 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌이며, 및/또는, C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신인 펩타이드;
    (2') (1')의 부분 펩티드에서, N 말단에서 2번째 아미노산이 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 발린, 류신 또는 이소류신으로 치환된 펩타이드;
    (3') ASB4 단백질의 부분 펩티드로서, 상기 단백질의 아미노산 서열 중 연속하는 8 내지 11 아미노산으로 이루어지며, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌인 펩타이드; 또는
    (4') (3')의 부분 펩티드에서, N 말단에서 2번째 아미노산이 티로신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 펩타이드;
    Y0 및 Z0가, 서로 독립적으로 0개 또는 1개의 아미노산이거나; 또는,
    0 내지 3개의 아미노산으로 구성된 펩티드이며, 여기서 Y0-X0-Z0가 전체 9 내지 14 아미노산 길이인 ASB4 단백질의 부분 펩티드 또는 이의 X0 상동체(homologue);
    인 것을 특징으로 하는, 항원 펩티드.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, X0가 서열번호 3 내지 7, 9 내지 19, 21 내지 28, 30 내지 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, 항원 펩티드.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, X0가 서열번호 3 내지 7, 9 내지 19, 21 내지 28, 30 내지 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지며, Y0 및 Z0이 존재하지 않는, 항원 펩티드.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, X0가 서열번호 3 내지 7, 9 내지 11, 13 내지 19, 21 내지 23 및 26 내지 28, 30 내지 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 2번째 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 이소류신으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 발린 또는 이소류신으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지며, Y0 및 Z0이 존재하지 않는, 항원 펩티드.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, X0가 서열번호 3, 5 내지 7, 9 내지 14, 16, 19, 21 내지 26, 28, 30 내지 32, 34 내지 37 및 39 내지 46 중 하나로 기재되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 2번째 아미노산이 메티오닌 또는 티로신으로 치환되고, 및/또는, C 말단의 아미노산이 류신, 이소류신 또는 페닐알라닌으로 치환된 아미노산 서열로 이루어지며, Y0 및 Z0이 존재하지 않는, 항원 펩티드.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, X0가 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 X0이며, Y0 또는 Z0 중 어느 한 쪽이 1개의 아미노산이며, 다른 하나는 존재하지 않는, 항원 펩타이드.
  8. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 4, 6, 7, 10, 14, 15, 17 내지 19, 21 내지 23, 26, 28, 31, 33, 36, 39, 41, 42, 45 및 46 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, 항원 펩티드.
  9. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 9, 21, 25, 30, 32, 35 및 37 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, 항원 펩티드.
  10. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 4 내지 12 및 15 내지 23 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, 항원 펩티드.
  11. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 3 내지 9, 13, 14, 25, 26 및 28 내지 30 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, 항원 펩티드.
  12. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, Y0-X0-Z0로 표시되는 펩타이드가 서열번호 4 내지 9 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, 항원 펩티드.
  13. 복수의 에피토프 펩타이드가 결합된 폴리에피토프 펩티드로, 상기 에피토프 펩티드로서 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩타이드를 적어도 하나 포함하는, 상기 폴리에피토프 펩티드.
  14. ASB4 유전자의 발현 산물을 검출하기 위한 ASB4 검출제를 포함하는, 암 줄기세포 검출제.
  15. 제 14항에 있어서, 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 전립선, 고환, 난소, 소장, 대장 및 혈액 이루어진 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 생체 시료에서 유래하는 세포를 포함하는 세포 집단에 있어서 암 줄기세포를 검출하기 위한, 암 줄기세포 검출제.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, ASB4 유전자의 발현 산물이 mRNA 및/또는 내인성 폴리펩티드인, 암 줄기세포 검출제.
  17. 제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, ASB4 유전자의 발현 산물이 mRNA이며, RT-PCR 법에 의해 검출하는 것을 포함하는, 암 줄기세포 검출제.
  18. 제 14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, ASB4 유전자의 발현 산물이 내생 폴리펩티드이며, 상기 내인성 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 ASB4 검출제에 의해 검출하는 것을 포함하는 암 줄기세포 검출제.
  19. 제 18항에 있어서, ASB4 검출제가 항체인, 암 줄기세포 검출제.
  20. 제 14항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, ASB4 검출제가 ASB4 유전자의 발현 산물인 mRNA를 검출하기 위한 상기 유전자에 상보적인 염기 서열을 갖는 프로브 및/또는 프라이머인, 암 줄기세포 검출제.
  21. 제 14항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 기재된 암 줄기세포 검출제를 사용하여 검사 대상에서 암 줄기세포를 검출하는 방법.
  22. (i) 암 치료제 후보 화합물을, 대상에 투여하기 전에, 상기 대상에서 ASB4 유전자의 발현 산물의 검출량 A를 측정하는 단계;
    (ii) 상기 후보 화합물을 상기 대상 세포 집단에 투여한 후, 상기 대상에서 ASB4 유전자의 발현 산물의 검출량 B를 측정하는 단계, 및
    (iii) 상기 검출량 A와 B를 비교하여, 상기 검출량 A가 B보다 유의하게 큰 경우, 상기 후보 화합물을 암 줄기세포를 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 암 치료제 후보라고 판정하는 단계,
    를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
  23. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드 또는 제 13항에 기재된 폴리에피토프 펩티드 중 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제 23항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  25. 제 24항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 유전자 도입용 조성물.
  26. 하기의 (a) 내지 (d) 중 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물:
    (a) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드 또는 제 13항에 기재된 폴리에피토프 펩타이드,
    (b) 제 23항에 기재된 폴리뉴클레오티드,
    (c) 제 24항에 기재된 발현 벡터,
    (d) ASB4 단백질, ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  27. 제 26항에 있어서, 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩타이드, 및/또는 제 13항에 기재된 폴리에피토프 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 약학적 조성물.
  28. 제 26항 또는 제 27항에 있어서, 보조제(adjuvant)를 더 포함하는 약학적 조성물.
  29. 제 26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 예방 및/또는 치료제인 약학적 조성물.
  30. 제 26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 예방 및/또는 치료용 백신인 약학적 조성물.
  31. 하기의 (a) 내지 (d) 중 어느 하나를 유효성분으로 함유하는, 세포 독성 T 세포(Cytotoxic T cells)의 유도제:
    (a) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드 또는 제 13항에 기재된 폴리에피토프 펩타이드,
    (b) 제 23항에 기재된 폴리뉴클레오티드,
    (c) 제 24항에 기재된 발현 벡터,
    (d) ASB4 단백질, ASB4 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  32. (A) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드 또는 제 13항에 기재된 폴리에피토프 펩타이드, 또는
    (B) 상기 (A)의 펩타이드 및/또는 폴리에피토프 펩티드의 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 항원 제시 능력을 갖는 세포를, in vitro에서 접촉시키는 단계를 포함하는 항원 제시 세포의 제조 방법.
  33. (A) 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드 또는 제 13항에 기재된 폴리에피토프 펩타이드, 또는
    (B) 상기 (A) 항원 펩타이드 및/또는 폴리에피토프 펩티드의 적어도 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 말초 혈액 림프구를, in vitro에서 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 독성 T 세포의 유도 방법.
  34. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드와 HLA를 포함하는, HLA 멀티머(multimers).
  35. 제 34항에 기재된 HLA 멀티머를 포함하는 진단약.
  36. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩타이드를 인식하는 항체.
  37. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는, T 세포 수용체 유사 항체(T cell receptor-like antibody).
  38. 제 36항에 기재된 항체 및/또는 제 37항에 기재된 T 세포 수용체 유사 항체를 함유하는 종양 검출제.
  39. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는, 키메라 항원 수용체.
  40. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 기재된 항원 펩티드와 HLA의 복합체를 인식하는 T 세포 수용체를 포함하는, 인공 CTL.
  41. 제 26항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 기재된 약학적 조성물을 이용한 암 치료법이 효과적인 치료 대상 환자를 선택하기 위한 진단약으로서, 제 14항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 기재된 암 줄기세포 검출제, 제 34항에 기재된 HLA 멀티머, 제 36항에 기재된 항체 및/또는 제 37항에 기재된 T 세포 수용체 유사 항체를 포함하는, 상기 진단약.
  42. 서열번호 3 내지 30 중 어느 하나로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진, 암 줄기세포 특이적인 항원 펩티드.
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