CN107002073A - 肿瘤抗原肽 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供用于特异性检测癌症干细胞的检测剂、被癌症干细胞特异性地递呈的肿瘤抗原肽、含有该肿瘤抗原肽作为有效成分的可用于癌症的预防和/或治疗的医药组合物以及筛选所述肿瘤抗原肽的方法等。通过提供以Y0‑X0‑Z0表示的肽，包含所述肽中的至少一种作为表位肽之一的将多条表位肽连结而成的多表位肽，编码所述肽或多表位肽中的至少一种的多聚核苷酸，以及含有这些作为有效成分的医药组合物，以诱导CTL为特征的癌症的预防和/或治疗剂等，从而解决了上述课题。

Description

肿瘤抗原肽
技术领域
本发明涉及利用癌症干细胞中特异性表达的基因的用于检测癌症干细胞的检测剂、及可用作癌症的预防和/或治疗剂的来源于该基因的肿瘤抗原肽以及它们的应用。本发明还涉及筛选所述肿瘤抗原肽的方法。
背景技术
至今为止开发的抗癌剂的治疗效果不充分，可完全治愈癌症的几率极低。作为其原因，可举出以往的治疗剂无法选择性地靶向形成癌组织的根基的细胞。近年来，作为所述“形成癌组织的根基的细胞”，报道了癌症干细胞的存在。癌症干细胞被认为是与癌症的发生、复发和转移相关的病原细胞，因此如果可以靶向癌症干细胞，则期待很有可能可以有效地抑制癌症的增殖、复发和转移。即，癌症干细胞的检测技术和以癌症干细胞为靶的新型治疗剂的开发成为了对于癌症医疗非常重要的课题。
另一方面，生物体对肿瘤细胞和病毒感染细胞等的排斥中，细胞免疫、特别是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)起到重要的作用。例如肿瘤细胞排斥的情况下，CTL识别肿瘤细胞上的抗原肽(肿瘤抗原肽)与主要组织相容性复合物(MHC:Major HistocompatibilityComplex)的复合物，对肿瘤细胞进行攻击和破坏。即，肿瘤抗原肽是通过肿瘤特有的蛋白质、即肿瘤抗原蛋白质在细胞内合成后由蛋白酶在细胞内分解而生成。另外，生成的肿瘤抗原肽在内质网内与MHC I类抗原(HLA I类抗原)结合而形成复合物，并被运送至细胞表面进行抗原递呈。肿瘤特异性CTL识别该涉及抗原递呈的复合物，通过细胞毒性作用和淋巴因子的产生而显示抗肿瘤效果。随着这一系列作用的揭示，不断地开发出通过将肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽用作所谓的癌症免疫疗法制剂(癌症疫苗)来使癌症患者体内的癌症特异性CTL增强的治疗法。
其中，特别是希望开发出能够以免疫方式排除癌症干细胞的新型癌症疫苗(例如专利文献1)。
ASB4(Ankyrin repeat and SOCS box-containing 4，含锚蛋白重复序列-细胞因子信号抑制物盒蛋白家族4)原本是在印迹基因筛选的过程中被鉴定的基因之一，近年来又被鉴定为与重编程相关的基因，已知人的正常组织中除了特定的分化阶段的睾丸之外未发现表达。作为与ASB4和癌症相关的现象，目前为止报道了在肝癌细胞中有表达、ASB4基因的表达与肿瘤的浸润性呈正相关等(例如非专利文献1～4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/050268号文本
非专利文献
非专利文献1:Mizuno Y等Biochem Biophys Res Commun.2002 Feb8；290(5):1499-505.
非专利文献2:Yang CS等Cell Rep.2014Jul 24；8(2):327-37.
非专利文献3:Kim SK等Mol Cells.2008Apr 30；25(2):317-21.
非专利文献4:Au V等Biosci Trends.2014Apr；8(2):101-10.
发明的概要
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供用于特异性检测癌症干细胞的检测剂、被癌症干细胞特异性地递呈的肿瘤抗原肽、含有该肿瘤抗原肽作为有效成分的可用于癌症的预防和/或治疗的医药组合物以及筛选所述肿瘤抗原肽的方法等。
解决技术问题所采用的技术方案
在探索被肿瘤细胞、特别是癌症干细胞特异性地抗原递呈的肽的过程中，即使癌症干细胞特异性表达的蛋白质的序列中存在多个预测与HLA结合的表位区域，要鉴定该蛋白质的哪个部分可实际在体内与HLA结合而被抗原递呈至细胞表面并不容易。于是，本发明人为了解决所述课题，开发出直接鉴定实际被癌症干细胞抗原递呈的肽(天然肽)的方法，鉴定了若干个天然肽。并且，发现所述肽中仅被癌症干细胞特异性抗原递呈的肽是来源于ASB4蛋白质的肽，进一步继续认真研究，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下所示的发明。
[1]一种以
Y0-X0-Z0
表示的癌症干细胞特异性抗原肽，其中，
X为以下的(1)～(4)：
(1)由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，
(2)(1)的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽，
(3)由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，或者
(4)(3)的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽
中的任一个；
Y0和Z0相互独立为由0个～数个氨基酸形成的肽。
[2]如[1]的抗原肽，其特征在于，
X为以下的(1')～(4')：
(1')由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～11个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，
(2')(1')的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽，
(3')由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～11个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，或者
(4')(3')的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽
中的任一个；
Y0和Z0相互独立
为0个或1个氨基酸、或者
为由0～3个氨基酸形成的肽；在此，Y0-X0-Z0整体为长度9～14个氨基酸的ASB4蛋白质的部分肽或者其X0同源物。
[3]如[1]或[2]的抗原肽，其中，X0由以序列编号3～7、9～19、21～28、30～46中的任一个表示的氨基酸序列形成。
[4]如[1]或[2]的抗原肽，其中，X0由以序列编号3～7、9～19、21～28、30～46中的任一个表示的氨基酸序列形成，Y0和Z0不存在。
[5]如[1]或[2]的抗原肽，其中，X0由以序列编号3～7、9～11、13～19、21～23和26～28、30～46中的任一个表示的氨基酸序列中自N末端起第2个的氨基酸被置换为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸的氨基酸序列形成，Y0和Z0不存在。
[6]如[1]或[2]的抗原肽，其中，X0由以序列编号3、5～7、9～14、16、19、21～26、28、30～32、34～37和39～46中的任一个表示的氨基酸序列中自N末端起第2个的氨基酸被置换为甲硫氨酸或酪氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的氨基酸序列形成，Y0和Z0不存在。
[7]如[1]或[2]的抗原肽，其中，X0为[4]～[6]的X0，Y0或Z0中的任一方为1个氨基酸，另一方不存在。
[8]如[1]～[3]的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号4、6、7、10、14、15、17～19、21～23、26、28、31、33、36、39、41、42、45和46中的任一个表示的氨基酸序列形成。
[9]如[1]～[3]的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号9、21、25、30、32、35和37中的任一个表示的氨基酸序列形成。
[10]如[1]～[3]的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号4～12和15～23中的任一个表示的氨基酸序列形成。
[11]如[1]～[3]的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号3～9、13、14、25、26和28～30中的任一个表示的氨基酸序列形成。
[12]如[1]～[3]的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号4～9中的任一个表示的氨基酸序列形成。
[13]一种多条表位肽连结而成的多表位肽，其中，作为该表位肽，包含至少1条[1]～[12]的抗原肽。
[14]一种癌症干细胞检测剂，其中，包含用于检测ASB4基因的表达产物的ASB4检测剂。
[15]如[14]的癌症干细胞检测剂，其中，该检测剂用于在包含来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠和血液的1种或2种以上的活体试样的细胞的细胞群中检测癌症干细胞。
[16]如[14]或[15]的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4基因的表达产物为mRNA和/或内源性多肽。
[17]如[14]～[16]的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4基因的表达产物为mRNA，包括通过RT-PCR法进行检测。
[18]如[14]～[16]的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4基因的表达产物为内源性多肽，包括通过与该内源性多肽特异性反应的ASB4检测剂进行检测。
[19]如[18]的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4检测剂为抗体。
[20]如[14]～[17]的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4检测剂是用于检测作为ASB4基因的表达产物的mRNA的具有与所述基因互补的碱基序列的探针和/或引物。
[21]一种在检查对象中检测癌症干细胞的方法，其中，使用[14]～[20]的癌症干细胞检测剂。
[22]一种癌症治疗药的筛选方法，其中，包括：
(i)在将癌症治疗药的候选化合物给予对象之前，测定该对象中的ASB4基因的表达产物的检测量A的工序；
(ii)在将所述候选化合物给予所述对象的细胞群之后，测定该对象中的ASB4基因的表达产物的检测量B的工序；以及
(iii)比较所述检测量A与B，该检测量A显著大于B的情况下，将所述候选化合物判定为具有以癌症干细胞为靶的特征的候选癌症治疗药的工序。
[23]一种多聚核苷酸，其中，该多聚核苷酸编码[1]～[12]的抗原肽或[13]的多表位肽中的至少1个。
[24]一种表达载体，其中，该表达载体包含[23]的多聚核苷酸。
[25]一种基因导入用组合物，其中，该组合物包含[24]的表达载体。
[26]一种医药组合物，其中，包含以下的(a)～(d)中的任一个作为有效成分：
(a)[1]～[12]的抗原肽或[13]的多表位肽，
(b)[23]的多聚核苷酸，
(c)[24]的表达载体，
(d)ASB4蛋白质、编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸或包含该多聚核苷酸的表达载体。
[27]如[22]的医药组合物，其中，包含[1]～[12]的抗原肽和/或[13]的多表位肽作为有效成分。
[28]如[26]或[27]的医药组合物，其中，还包含佐剂。
[29]如[26]～[28]的医药组合物，其中，该组合物是癌症的预防和/或治疗剂。
[30]如[26]～[29]的医药组合物，其中，该组合物是癌症的预防和/或治疗用疫苗。
[31]一种细胞毒性T淋巴细胞的诱导剂，其中，含有以下的(a)～(d)中的任一个作为有效成分：
(a)[1]～[12]的抗原肽或[13]的多表位肽、
(b)[23]的多聚核苷酸、
(c)[24]的表达载体、
(d)ASB4蛋白质、编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸或包含该多聚核苷酸的表达载体。
[32]一种抗原递呈细胞的制造方法，其中，包括使
(A)[1]～[12]的抗原肽或[13]的多表位肽、或者
(B)编码所述(A)的肽和/或多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸
与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触。
[33]一种细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法，其中，包括使
(A)[1]～[12]的抗原肽或[13]的多表位肽、或者
(B)编码所述(A)的肽和/或多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸
与外周血淋巴细胞在体外接触。
[34]一种HLA多聚体，其中，包含[1]～[12]的抗原肽和HLA。
[35]一种诊断药物，其中，包含[34]的HLA多聚体。
[36]一种抗体，其中，该抗体识别[1]～[12]的抗原肽。
[37]一种T细胞受体样抗体，其中，该抗体识别[1]～[12]的抗原肽与HLA的复合物。
[38]一种肿瘤检测剂，其中，含有[36]的抗体和/或[37]的T细胞受体样抗体。
[39]一种嵌合抗原受体，其中，该受体识别[1]～[12]的抗原肽与HLA的复合物。
[40]一种人工CTL，其中，包含识别[1]～[12]的抗原肽与HLA的复合物的T细胞受体。
[41]一种用于筛选使用[26]～[30]的医药组合物的癌症处置方法有效的治疗对象患者的诊断药物，其中，包含[14]～[20]的癌症干细胞检测剂、[34]的HLA多聚体、[36]的抗体和/或[37]的T细胞受体样抗体。
[42]一种癌症干细胞特异性的抗原肽，其中，该抗原肽由以序列编号3～30中的任一个表示的氨基酸序列形成。
发明的效果
通过本发明，能提供可用作对癌症干细胞特异性攻击的CTL的诱导剂的肿瘤抗原肽、和含有该肿瘤抗原肽作为有效成分的可用于癌症的预防和/或治疗的医药组合物等。
附图的简单说明
图1表示经Hoechst 33342/PI染色后的人大肠癌细胞株(SW480)的基于维拉帕米(Verapamil)有无的流式细胞分析的结果。
图2-1表示对分别从SW480-SP克隆细胞株和SW480-MP克隆细胞株分离的1个细胞进行培养，经Hoechst 33342/PI染色后的流式细胞分析的结果。
图2-2表示SW480-SP克隆细胞株和SW480-MP克隆细胞株各自的共聚焦显微镜图像。
图3表示对将SW480-SP克隆细胞株和SW480-MP克隆细胞株分别移植至小鼠而形成的肿瘤进行评价的结果。
图4表示从SW480-SP克隆细胞株和SW480-MP克隆细胞株各自的裂解液，使用抗HLA-A24抗体免疫沉淀HLA与肽的复合物，将由此分离的肽用质谱法进行序列分析的结果。
图5表示提取SW480-SP和SW480-MP各自的mRNA进行采用RT-PCR的基因表达的探讨时的电泳照片。作为对SW480-SP克隆细胞株特异性的基因，确认到ASB4基因。
图6表示使用ASB4的来源于人成人正常组织的mRNA进行RT-PCR的结果。
图7表示使用ASB4的来源于各种癌细胞株的mRNA进行RT-PCR的结果。
图8表示ASB4肽(IV9，序列编号3)对于HLA-A24的结合能力。将IV9和HIV(序列编号51)、GK12(序列编号52)等各种合成肽对T2-A24细胞进行脉冲，使用流式细胞仪对HLA-A24表达量进行了评价。
图9表示使用涂敷了IFN-γ的ELISPOT板的通过各种肽进行脉冲的T2-A24细胞的ELISPOT测试的结果。
图10表示对由PBMC诱导的效应细胞(CTL)对于用各种肽进行脉冲的T2-A24细胞和未进行脉冲的SW480-SP细胞的细胞毒性进行评价的结果。效应细胞使用通过以序列编号3表示的ASB4肽IV9诱导的细胞。作为阴性对照，使用缺失MHC I类表达的K562细胞。
图11表示以序列编号4表示的肽(As80_9)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴表示相对于一定的接种细胞数的斑点数。A表示利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的试验结果，B表示利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的试验结果。此外，黑柱(“w/peptide”)和白柱(“w/o peptide”)分别表示将来源于给肽小鼠的脾细胞在存在给予肽的条件下和不存在给予肽的条件下再次刺激培养的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过各肽的给予而在小鼠体内诱导的肽特异性CTL的数量。
图12表示以序列编号5表示的肽(As82_10)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图13表示以序列编号6表示的肽(As124_10)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图14表示以序列编号7表示的肽(As125_9)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图15表示以序列编号8表示的肽(As184_12)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图16表示以序列编号9表示的肽(As135_10)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图17表示以序列编号10表示的肽(As83_10)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图18表示以序列编号11表示的肽(As87_9)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图19表示以序列编号12表示的肽(As307_10)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图20表示以序列编号13表示的肽(As301_11)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图21表示以序列编号14表示的肽(As405_9)的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、A、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图22表示以序列编号3表示的肽IV9的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、B、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图23表示以序列编号15表示的肽(As35_10)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图24表示以序列编号16表示的肽(As92_10)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图25表示以序列编号17表示的肽(As152_9)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图26表示以序列编号18表示的肽(As186_10)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图27表示以序列编号19表示的肽(As236_10)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图28表示以序列编号20表示的肽(As265_10)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图29表示以序列编号21表示的肽(As280_10)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图30表示以序列编号22表示的肽(As383_10_5L)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图31表示以序列编号23表示的肽(As416_10)的利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图32表示以序列编号24表示的肽(As76_10)的利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图33表示以序列编号25表示的肽(As192_10)的利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图34表示以序列编号26表示的肽(As211_10)的利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图35表示以序列编号27表示的肽(As289_10)的利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图36表示以序列编号28表示的肽(As318_10)的利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图37表示以序列编号29表示的肽(As365_10)的利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图38表示以序列编号30表示的肽(As365_9)的利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图11相同的含义。
图39表示以序列编号4表示的肽(As80_9)的使用来源于HLA-A*02:01阳性的健康人的外周血单核细胞的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴表示相对于接种细胞数(约1×105个)的斑点数。黑柱(“w/peptide”)和白柱(“w/opeptide”)分别表示在存在肽的条件下和不存在肽的条件下刺激培养的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过各肽的添加而诱导的肽特异性CTL的数量。
图40表示以序列编号5表示的肽(As82_10)的使用来源于HLA-A*02:01阳性的健康人的外周血单核细胞的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图39相同的含义。
图41表示以序列编号6表示的肽(As124_10)的使用来源于HLA-A*02:01阳性的健康人的外周血单核细胞的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图39相同的含义。
图42表示以序列编号8表示的肽(As184_12)的使用来源于HLA-A*02:01阳性的健康人的外周血单核细胞的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图39相同的含义。
图43表示以序列编号9表示的肽(As135_10)的使用来源于HLA-A*02:01阳性的健康人的外周血单核细胞的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图39相同的含义。
图44表示以序列编号5表示的肽(As82_10)的使用来源于HLA-A*24:02阳性的健康人的外周血单核细胞的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图39相同的含义。
图45表示以序列编号8表示的肽(As184_12)的使用来源于HLA-A*24:02阳性的健康人的外周血单核细胞的采用干扰素γELISPOT测试的体内的CTL诱导能力的评价结果。纵轴、黑柱和白柱分别表示与图39相同的含义。
实施发明的方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明中，“表位肽”是指与MHC(人为HLA)结合而被抗原递呈至细胞表面，且具有抗原性(可被T细胞识别)的肽。表位肽中包括作为与MHC I类结合而抗原递呈并被CD8阳性T细胞识别的表位肽的CTL表位肽和作为与MHC II类结合而抗原递呈并被CD4阳性T细胞识别的表位肽的辅助表位肽。
表位肽中来源于肿瘤细胞中特异性或过度表达的蛋白质的肽特别成为肿瘤抗原肽。抗原递呈是指细胞内存在的肽与MHC结合，该MHC/抗原肽复合物集中分布于细胞表面的现象。如上所述，已知被递呈至细胞表面的抗原被T细胞等识别后，激活细胞免疫或体液免疫，被MHC I类递呈的抗原激活细胞免疫的同时，被初始T细胞的T细胞受体识别，将初始T细胞诱导为具有细胞毒性的CTL，因此作为用于免疫疗法的肿瘤抗原肽，较好是与MHC I类结合而抗原递呈的肽。
本发明中，“肿瘤(tumor)”包括良性肿瘤和恶性肿瘤(癌，恶性新生物)。癌(cancer)包括造血器官的肿瘤、上皮性的恶性肿瘤(癌，carcinoma)和非上皮性的恶性肿瘤(肉瘤，sarcoma)。本发明中，“癌症干细胞”是指存在于癌组织中的细胞中显示干细胞样性质的细胞，被认为是与癌症的发生、复发和转移相关的病原细胞。一般来说，“癌症干细胞”仅存在于癌组织，因此难以与其他细胞进行区分，但该技术领域中已知分离/浓缩癌症干细胞的方法，可例举例如SP分部分离法等。因此，本发明中，“癌症干细胞”可表示通过公知的癌症干细胞分离/浓缩法分离/浓缩的细胞群。
本发明中，通过使用可分离/鉴定实际被抗原递呈至细胞表面的天然肽的下述方法，分离/鉴定本发明的天然肽。本发明中，“天然肽”是指实际被抗原递呈至细胞表面的肽。此外，“天然抗原肽”是指天然肽中可确认抗原性的肽。通过从癌细胞分离该天然抗原肽并确定序列及其由来，可获得对使用CTL的癌症的靶向治疗有用的知识。
本发明中使用的天然肽的分离/鉴定方法中包括将递呈天然肽的癌症干细胞溶解并从该溶解物(裂解液)分离MHC与天然肽的复合物的工序、将分离的复合物分离为MHC分子和天然肽并分离天然肽的工序、对分离的天然肽进行鉴定的工序。
MHC与天然肽的复合物的分离采用基于使用针对MHC的特异抗体的免疫沉淀法的肽/MHC复合物的提取法。
作为适当的抗MHC抗体，使用抗HLA-A02抗体、抗HLA-A24抗体等针对HLA I类的抗体。
将复合物分离为MHC分子和天然肽的工序中，进行使用弱酸的肽分离。
然后，使用组合液相色谱法和串联质谱法的肽序列分析法分析上述分离天然肽的序列，对实际被抗原递呈至细胞表面的天然肽进行鉴定。
作为确认通过上述操作分离的天然肽的抗原性的方法，采用细胞毒性试验、ELISPOT测试、使用TCR样抗体的测试等。
本发明人通过上述方法对在人癌症干细胞中被抗原递呈的天然抗原肽进行了分析。其结果是，作为在人癌症干细胞中被抗原递呈的天然抗原肽，鉴定得到来源于ASB4蛋白质的肽(序列编号3)。基于所述认知进一步进行研究后，结果发现ASB4基因在癌症干细胞中特异性高表达，是针对癌症干细胞的分子靶向治疗的有用的候选基因。ASB4的肿瘤抗原、并且来源于ASB4的肽在肿瘤细胞表面与HLA I类抗原结合而形成复合物并被运送至细胞表面进行抗原递呈是以前完全不为人知的新发现。
＜1＞本发明的肽
本发明中，“人ASB4蛋白质”是指Mizuno Y等Biochem Biophys Res Commun.2002Feb 8；290(5):1499-505和Yang CS等Cell Rep.2014 Jul 24；8(2):327-37中所报道的公知的蛋白质，具体是指以序列编号2中记载的氨基酸序列(Genbank登录号:NP_057200；ASB4同源异构体a)表示的蛋白质、其同源异构体及其同源物。作为该同源异构体，可例举例如剪接变体、基于个体差异的SNP等的变体等。具体来说，可例举(1)由序列编号2中记载的氨基酸序列中具有90％以上、较好是95％以上、更好是98％以上的同源性的氨基酸序列形成的蛋白质，(2)由序列编号2中记载的氨基酸序列中1个或多个、较好是1个～数个、更好是1～10个、1～5个、1～3个、1或2个氨基酸置换、缺失、添加或插入了的氨基酸序列形成的蛋白质。作为这样的变体，可示例作为ASB4同源异构体a的剪接变体的以Genbank登录号:NP_665879登录的同源异构体(ASB4同源异构体b)、第17个氨基酸由缬氨酸(V)被置换为亮氨酸(L)的dbSNP RefSNP编号:rs35047380的SNP等。本说明书中单独提到“ASB4蛋白质”的情况下，只要没有另外的记载，均是指以序列编号2中记载的氨基酸序列表示的人ASB4蛋白质。
作为人ASB4蛋白质，较好是包含序列编号2中记载的氨基酸序列的蛋白质，或者由所述蛋白质中1～3个、较好是1或2个氨基酸被置换了的氨基酸序列形成的蛋白质。可更优选例举由序列编号2中记载的氨基酸序列形成的蛋白质。
本发明的肽在一种形态中为人ASB4蛋白质的部分肽，包括与MHC、特别是HLA结合的肽，较好是被MHC、特别是HLA抗原递呈的肽，更好是被MHC、特别是HLA抗原递呈的可诱导CTL的肽。HLA存在数种型，本发明的肽较好是可与HLA I类结合，更好是可与HLA-A02或HLA-A24结合，进一步更好是可与HLA-A02和HLA-A24两者结合(即双重结合性)。本发明的肽可在与MHC结合之前经过加工(processing)等处理，这些结果后生成表位肽等肽也包括在本发明的肽内。因此，本发明的肽只要是包含表位肽的氨基酸序列的序列即可，氨基酸长度无特别限定。然而，较好是本发明的肽本身为表位肽，因此氨基酸长度较好是约8～14个氨基酸左右，更好是约8～11个氨基酸左右，特别好是约9～约11个氨基酸左右。
已知与作为人的MHC I类的HLA I类结合的表位肽的长度为约8～14个氨基酸，较好是约9～11个氨基酸，其序列中具有结合的HLA特有的结合模体。例如与HLA-A02结合的肽具有自N末端起第2个的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的结合模体，与HLA-A24结合的肽具有自N末端起第2个的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的结合模体。
因此，本发明的肽在优选的一种形态中包含作为由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的ASB4蛋白质的部分肽的表位肽，更好是该表位肽本身。其中，特别好是由以序列编号4、6、7、10、14、15、17～19、21～23、26、28、31、33、36、39、41、42、45和46中的任一个表示的氨基酸序列形成的表位肽。
此外，在另一种优选形态中，包含作为所述部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽的表位肽，更好是该表位肽本身。其中，特别好是由以序列编号4、6、7、10、14、15、17～19、21～23、26、28、31、33、36、39、41、42、45和46中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的表位肽。
本发明的肽在另一种优选形态中包含作为由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的ASB4蛋白质的部分肽的表位肽，更好是该表位肽本身。其中，特别好是由以序列编号9、21、25、30、32、35和37中的任一个表示的氨基酸序列形成的表位肽。
此外，在另一种优选形态中，包含作为所述部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽的表位肽，更好是该表位肽本身。其中，特别好是由以序列编号9、21、25、30、32、35和37中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的表位肽。
本发明的肽在另一种优选形态中是上述的部分肽或经置换的部分肽中还在N末端和/或C末端添加有1个～数个氨基酸的肽。
其中，特别好是由以序列编号4、6、7、10、14、15、17～19、21～23、26、28、31、33、36、39、41、42、45和46中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽，该肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽，由以序列编号9、21、25、30、32、35和37中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽或者该肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽中，还在N末端和/或C末端添加有1个～数个氨基酸的肽。
因此，本发明的肽在一种形态中可表示为
Y0-X0-Z0。
在此，X0、Y0和Z0均为肽。
所述形态中，X0为从以下的(1)～(4)：
(1)由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸、较好是8～11个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，
(2)(1)的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽，
(3)由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸、较好是8～11个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，或者
(4)(3)的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽
中选择的肽。在此，(2)为(1)的置换同源物，(4)为(3)的置换同源物，因此将作为X0为(2)或(4)的肽的Y0-X0-Z0特别称为“X0同源物”。
此外，Y0和Z0相互独立为由0个～数个氨基酸形成的任意的肽。在此，“0个～数个氨基酸”具体是指0～5个氨基酸，可例举例如0个、1个、2个、3个、4个或5个氨基酸，可更优选例举0个、1个、2个或3个氨基酸，特别好是0个或1个。本发明中，Y0和/或Z0“不存在”的情况下，是指Y0和/或Z0为由0个氨基酸形成的肽。
在此，对构成Y0和/或Z0的氨基酸无特别限定，可例举构成蛋白质的20种天然氨基酸中任意的氨基酸，可优选例举能通过存在于生物体内的酶切断的氨基酸。此外，理想的是在ASB4蛋白质的氨基酸序列中与所述部分肽的N末端侧和/或C末端侧的氨基酸序列对应的氨基酸序列。
因此，其中进一步特别好是X0为由以序列编号4、6、7、10、14、15、17～19、21～23、26、28、31、33、36、39、41、42、45和46中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽，该肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽，由以序列编号9、21、25、30、32、35和37中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽或者该肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽中的任一个，并且Y0和/或Z0为1个氨基酸的情况，进一步更好是Y0或Z0中的任一方为1个氨基酸而另一方不存在的情况。
此外，另一种优选形态中，可例举X0为由8～11个氨基酸形成的上述(1)～(4)中的任一个，Y0和/或Z0相互独立为由0～3个氨基酸形成的肽，Y0-X0-Z0整体构成长度9～14个氨基酸的ASB4蛋白质的部分肽或者其X0同源物的情况。所述形态并不仅限于此，可例举例如X0为具有以序列编号3～7和9～19、21～28、30～46中的任一个表示的氨基酸序列的肽，在所述X0的N末端侧和/或C末端侧添加有由0～3个氨基酸形成的肽Y0和/或Z0，但所述Y0-X0-Z0也还是ASB4蛋白质的部分肽的情况。
本发明的肽在优选的一种形态中X0包括由与序列编号3～7、9～28和30中的任一个中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。该形态中，更好是本发明的肽(即Y0-X0-Z0)均为上述ASB4蛋白质的部分肽。所述更优选的形态中，例如本发明的肽为由与序列编号3～30中的任一个中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。
以序列编号3～30表示的肽分别是由上述ASB4的氨基酸的位置为与第319个～第327个对应的9个氨基酸(序列编号3)、与第80个～第88个对应的9个氨基酸(序列编号4)、第82～91个的10个氨基酸(序列编号5)、第124～133个的10个氨基酸(序列编号6)、第125～133个的9个氨基酸(序列编号7)、第184～195个的12个氨基酸(序列编号8)、第135～144个的10个氨基酸(序列编号9)、第83～92个的10个氨基酸(序列编号10)、第87～95个的9个氨基酸(序列编号11)、第307～316个的10个氨基酸(序列编号12)、第301～311个的11个氨基酸(序列编号13)和第405～413个的9个氨基酸(序列编号14)、第35～44个的10个氨基酸(序列编号15)、第92～101个的10个氨基酸(序列编号16)、第152～160个的9个氨基酸(序列编号17)、第186～195个的10个氨基酸(序列编号18)、第236～245个的10个氨基酸(序列编号19)、第265～274个的10个氨基酸(序列编号20)、第280～289个的10个氨基酸(序列编号21)、第383～392个的10个氨基酸(序列编号22)、第416～425个的10个氨基酸(序列编号23)、第76～85个的10个氨基酸(序列编号24)、第192～201个的10个氨基酸(序列编号25)、第211～220个的10个氨基酸(序列编号26)、第289～298个的10个氨基酸(序列编号27)、第318～327个的10个氨基酸(序列编号28)、第365～376个的12个氨基酸(序列编号29)、第365～373个的9个氨基酸(序列编号30)形成的肽，本发明人发现所有这些肽均可与HLA-A02和/或HLA-A24结合。其中，本发明人发现以序列编号3～23、25、26和28～30表示的肽还具有CTL诱导能力。
更优选的一种形态中，X0包括由与序列编号4～7、9～12和15～19和21～23中的任一个中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。该形态中，更好是本发明的肽(即Y0-X0-Z0)均为上述ASB4蛋白质的部分肽。所述更优选的形态中，例如本发明的肽为由与序列编号4～12和15～23中的任一个中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。
本发明人发现以序列编号4～12和15～23表示的肽均可与HLA-A02结合，且具有CTL诱导能力。
另一种更优选的形态中，X0包括由与序列编号3～7、9、13、14、18、24～28和30中的任一个中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。该形态中，更好是本发明的肽(即Y0-X0-Z0)均为上述ASB4蛋白质的部分肽。所述更优选的形态中，例如本发明的肽为由与序列编号3～9、13、14、25、26和28～30中的任一个中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。
本发明人发现以序列编号3～9、13、14、25、26和28～30表示的肽均可与HLA-A24结合，且具有CTL诱导能力。
此外，另一种优选形态中，X0包括由与序列编号4～7、9和18中的任一个中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。该形态中，更好是本发明的肽(即Y0-X0-Z0)均为上述ASB4蛋白质的部分肽。所述更优选的形态中，例如本发明的肽为由与序列编号4～9中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。
本发明人发现以序列编号4～9表示的肽均可与HLA-A02和HLA-A24这两者结合，且具有CTL诱导能力。其中，特别好是以序列编号4～6、8和9表示的肽，最好是以序列编号5和8表示的肽。
本发明的肽可以是其N末端和/或C末端被修饰的肽。作为该修饰，具体可例举N-烷酰基化(例如乙酰基化)、N-烷基化(例如甲基化)、C末端烷基酯(例如乙酯)和C末端酰胺(例如羧酰胺)等。
对于本发明的肽的合成，可按照通常的肽化学中所用的已知方法进行。作为所述已知的方法，可例举文献(Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；TheProteins，Vol 2，Academic Press Inc.，New York，1976；肽合成，丸善株式会社，1975；肽合成的基础和实验，丸善株式会社，1985；医药品的开发续第14卷；肽合成，广川书店，1991；这些文献通过引用而构成本申请的一部分)等中所记载的方法。
本发明的肽可通过后述的CTL诱导方法或供于采用人模型动物的测试(WO02/47474号公报、Int J.Cancer:100,565-570(2002))等来确认体内的活性。
本发明的肽在另一种形态中包括与HLA-A02和/或HLA-A24结合的肽。具体来说，可例举例如由以序列编号3～30中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽，但并不仅限于此。这些肽并不一定具有HLA-A02或HLA-A24的结合模体，是由本发明人确认实际与HLA-A02和/或HLA-A24结合的肽。其中，确认由以序列编号3～23、25、26和28～30中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽还具有CTL诱导能力，所以优选。
本发明的肽中还包括将包含至少1条所述本发明的肽的多条表位肽连结而成的肽(多表位肽)。因此，具有CTL诱导活性的该多表位肽也可作为本发明的肽的具体例子示例。
本发明的多表位肽可定义为作为
(i)将本发明的肽(表位肽)和任意的除本发明的肽以外的1条或2条以上的CTL表位肽直接或适当介以间隔物连结而成的肽、
(ii)将本发明的肽和任意的1条或2条以上的辅助表位肽直接或适当介以间隔物连结而成的肽、或者
(iii)在上述(i)中记载的多表位肽上进一步直接或适当介以间隔物连结1条或2条以上的辅助表位肽而成的肽，
在抗原递呈细胞内接受加工，生成的表位肽被递呈至抗原递呈细胞，从而产生CTL诱导活性的肽。
在此，作为(i)中的除本发明的肽以外的CTL表位肽，无特别限定，具体可例举例如本发明不包括的其他来源于人ASB4的表位肽和来源于人OR7C1、人DNAJB8的表位肽(例如，国际公开第2010/050190号中所记载的肽)、来源于人FAM83B的表位肽(国际申请第PCT/JP2014/076625号)等。
作为间隔物，只要是不对抗原递呈细胞内的加工产生不良影响即可，无特别限定，较好是与各表位肽通过肽键连结的连接物，可例举例如若干个氨基酸连结而成的肽连接序列或两端具有氨基和羧基的连接物等。具体来说，可例举甘氨酸连接物和PEG(聚乙二醇)连接物等，甘氨酸连接物可例举聚甘氨酸(例如由6个甘氨酸形成的肽；Cancer Sci,103卷,150-153页)，PEG连接物可例举来源于PEG的两端具有氨基和羧基的化合物的连接物(例如H2N-(CH2)2-(OCH2CH2)3-COOH；Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,7551-7556)。
本发明的多表位肽所包含的本发明的表位肽可选择1种或2种以上。即，可以是多条同样的表位肽连结而成，也可以是多条不同的表位肽连结而成。选择2种以上的表位肽的情况下，当然也可以是所选择的表位肽中的1种或2种以上多条连结。对于除本发明的肽以外的表位肽，同样也可以是多种和/或多条表位肽连结。本发明的多表位肽可以是2～12条表位肽连结而成，较好是2条、3条、4条、5条、6条、7条、8条、9条、10条、11条、12条表位肽连结而成，最好是2条表位肽连结而成。
在此，与本发明的肽连结的表位肽为辅助表位肽的情况下，作为所用的辅助表位肽，可例举例如来源于乙型肝炎病毒的HBVc128-140和来源于破伤风毒素的TT947-967等。此外，作为该辅助表位肽的长度，可例举13～30个氨基酸左右、较好是13～17个氨基酸左右。
这样的使多条表位肽连结而成的肽(多表位肽)也可如前所述通过通常的肽合成法制造。此外，还可基于编码这些使多条表位肽连结而成的多表位肽的多聚核苷酸的序列信息，用通常的DNA合成和基因工程的方法制造。
即，可通过将该多聚核苷酸插入周知的表达载体，培养用所得的重组表达载体转化宿主细胞而制成的转化体，从培养物中回收作为目标的使多个表位连结而成的多表位肽来制造。这些方法可如前所述按照文献(Molecular Cloning,T.Maniatis等,CSHLaboratory(1983)、DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985))中记载的方法等进行。
如上制成的时多条表位肽连结而成的多表位肽可通过供于所述的体外测试或者国际公开第02/47474号和Int J.Cancer:100,565-570(2002)(这些文献通过引用而构成本申请的一部分)中记述的采用人模型动物的体内测试等来确认CTL诱导活性。
如本说明书中所记载，本发明的肽(包括多表位肽)对癌症的预防和/或治疗有用，可作为医药组合物的有效成分。此外，本发明的肽可用于癌症的预防和/或治疗。另外，本发明还涉及用于癌症的预防和/或治疗的医药品的制造中的本发明的肽的用途。
＜2＞本发明的多聚核苷酸
本发明的多聚核苷酸包括编码所述本发明的肽中的至少1个的多聚核苷酸。本发明的多聚核苷酸可以是cDNA或mRNA、cRNA或者合成DNA中的任一种。此外，可以是单链和双链中的任一种形态。具体来说，可例举例如由编码使用作为MHC与肽的结合预测程序的BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)和IEDB(MHC-I processing predictions，MHC-I加工预测；http://www.iedb.org/)等预测的氨基酸序列的核苷酸序列形成的多聚核苷酸等，更具体可例举由编码序列编号3～46中记载的氨基酸序列的核苷酸序列形成的多聚核苷酸以及由分别以可表达的方式编码选自序列编号3～46的任意2条以上的肽或使选自序列编号3～46的肽与辅助表位连结而成的多表位肽的核苷酸序列形成的多聚核苷酸等，但并不仅限于此。
本发明的多聚核苷酸可呈单链和双链中的任一种形态。本发明的多聚核苷酸为双链的情况下，可通过将所述本发明的多聚核苷酸插入表达载体来制备用于表达本发明的肽的重组表达载体。即，本发明的多聚核苷酸的范畴也包括将本发明的双链型多聚核苷酸插入表达载体而制成的重组表达载体。
如本说明书中所记载，本发明的多聚核苷酸对癌症的预防和/或治疗有用，可作为医药组合物的有效成分。此外，本发明的多聚核苷酸可用于癌症的预防和/或治疗。另外，本发明还涉及用于癌症的预防和/或治疗的医药品的制造中的本发明的多聚核苷酸的用途。
本发明中使用的表达载体可根据使用的宿主和目的等采用各种表达载体，只要是本领域技术人员，就可适当选择。作为本发明中可使用的表达载体，可例举例如质粒、噬菌体载体、病毒载体等。例如，宿主为大肠杆菌的情况下，作为载体，可例举pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等质粒载体，λZAPII、λgt11等噬菌体载体。宿主为酵母的情况下，作为载体，可例举pYES2、pYEUra3等。宿主为昆虫细胞的情况下，可例举pAcSGHisNT-A等。宿主为动物细胞的情况下，可例举pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMW等质粒载体，或者反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等病毒载体。
所述载体可适当具有可诱导表达的启动子、编码信号序列的基因、筛选用标记物基因、终止子等元件。此外，可添加作为与硫氧还蛋白、His标签或GST(谷胱甘肽转硫酶)等的融合蛋白表达的序列，使得分离纯化变得容易。该情况下，可使用具有在宿主细胞内发挥功能的合适的启动子(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子等)的GST融合蛋白载体(pGEX4T等)或具有Myc、His等的标签序列的载体(pcDNA3.1/Myc-His等)、又或表达与硫氧还蛋白和His标签的融合蛋白的载体(pET32a)等。
通过用如上所述制成的表达载体转化宿主，可制成含有该表达载体的转化细胞。因此，本发明中包括包含所述表达载体的基因导入用组合物。
作为用于转化的宿主，只要不破坏本发明的多肽所具有的功能，可使用任意的细胞，可例举例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。作为大肠杆菌，可例举E.coli K-12品系的HB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株等。此外，作为酵母，可例举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。作为动物细胞，可例举L929细胞、BALB/c3T3细胞、C127细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、HeLa细胞、293-EBNA细胞等。作为昆虫细胞，可例举sf9等。
作为向宿主细胞的表达载体的导入方法，使用适合于所述宿主细胞的通常的导入方法即可。具体来说，可例举磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、采用基因导入用脂质(Lipofectamine、Lipofectin；吉伯科BRL公司(Gibco-BRL社))的方法等。导入后，通过用含筛选标记物的通常的培养基进行培养，可筛选所述表达载体被导入宿主细胞中而得的转化细胞。
通过将如上所述得到的转化细胞在适当的条件下继续培养，可制造本发明的肽。所得的肽可通过通常的生物化学纯化手段进一步进行分离、纯化。在此，作为纯化手段，可例举盐析、离子交换色谱法、吸附色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱法等。此外，使本发明的肽作为所述的与硫氧还蛋白或His标签、GST等的融合蛋白表达的情况下，可通过利用这些融合蛋白或标签的性质的纯化方法进行分离、纯化。
编码本发明的肽的多聚核苷酸可以是DNA形态，也可以是RNA形态。这些本发明的多聚核苷酸可基于本发明的肽的氨基酸序列信息和由其编码的DNA的序列信息，使用该技术领域已知的常规方法容易地制造。具体来说，可通过通常的DNA合成或采用PCR的扩增等进行制造。
编码本发明的肽的多聚核苷酸包括编码所述表位肽的多聚核苷酸。
＜3＞以本发明的肽为有效成分的CTL诱导剂/医药组合物
本发明的肽具有CTL诱导活性，可作为肿瘤抗原肽制成CTL诱导剂。此外，如上所述，由本发明人首次发现ASB4蛋白质为肿瘤抗原、来源于ASB4蛋白质的肽在肿瘤细胞表面与HLA I类抗原结合而形成复合物并被运送至细胞表面进行抗原递呈。因此，ASB4蛋白质本身也可成为CTL诱导剂。
即，通过从HLA-A02抗原或HLA-A24抗原呈阳性的人分离外周血淋巴细胞，在体外添加本发明的肽和/或ASB4蛋白质进行刺激，可诱导特异性识别用该肽进行了脉冲(pulse)的HLA-A02抗原阳性细胞或HLA-A24抗原阳性细胞的CTL(J.Immunol.,154,p2257,1995)。在此，是否诱导了CTL例如可通过用例如ELISA法等测定CTL对抗原肽递呈细胞作出反应而产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量来确认。此外，也可通过测定CTL对51Cr标记的抗原肽递呈细胞的毒性的方法(51Cr释放试验，Int.J.Cancer,58:p317,1994)来确认。
此外，还可通过Int.J.Cancer,39,390-396,1987、N.Eng.J.Med,333,1038-1044,1995等中记载的方法来构建CTL克隆。
通过本发明的肽和/或ASB4蛋白质诱导的CTL具有对将本发明的肽和/或其他来源于ASB4蛋白质的表位肽作为抗原递呈的细胞的毒性作用和淋巴因子的产生能力。如上所述，本发明的肽是肿瘤抗原肽，而ASB4蛋白质在细胞内被分解而生成肿瘤抗原肽，因此可通过这些机能发挥抗肿瘤作用、较好是抗癌作用。因此，本发明的肽和/或ASB4蛋白质以及由其诱导的CTL可作为用于癌症的预防和/或治疗的医药品或医药组合物的有效成分。
如果将含有本发明的肽和/或ASB4蛋白质作为有效成分的CTL诱导剂给予癌症患者，则本发明的肽和/或来源于ASB4蛋白质的表位肽被递呈至抗原递呈细胞的HLA-A02抗原或HLA-A24抗原，HLA-A02抗原或HLA-A24抗原与递呈的肽的结合复合物特异性CTL增殖，可破坏癌细胞，因而能够预防和/或治疗癌症。因此，以本发明的肽和/或ASB4蛋白质为有效成分的CTL的诱导剂较好是对HLA-A02抗原或HLA-A24抗原阳性且罹患ASB4阳性的癌症的对象使用。作为ASB4阳性的癌症，可例举例如大肠癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、子宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、卵巢癌等癌症(肿瘤)，本发明的CTL诱导剂可用于这些癌症的预防和/或治疗。
自此，癌症的“预防”不仅是预防患者罹患癌症，还包括防止通过手术切除的原发病灶的肿瘤的患者的复发，防止通过手术、放射疗法或药物疗法等癌症治疗无法完全除去的肿瘤的转移等。此外，癌症的“治疗”不仅是使癌缩小的癌症的治愈、症状改善，还包括抑制癌细胞的增殖、肿瘤的扩大或癌细胞自原发病灶的转移等癌症发展的防止等。
以本发明的肽和/或ASB4蛋白质为有效成分的CTL诱导剂对于罹患例如序列编号2中记载的ASB4阳性的癌症且HLA-A02或HLA-A24阳性的癌症患者特别有效。具体来说，可用于例如大肠癌、肺癌、卵巢癌等癌症(肿瘤)的预防和/或治疗。因此，包含本发明的肽和/或ASB4蛋白质为有效成分的医药组合物也包括在本发明内。所述医药组合物较好是癌症的预防和/或治疗用的组合物，即癌症的预防和/或治疗剂。此外，本发明的医药组合物通过诱导对癌细胞(较好是癌症干细胞)特异性的CTL，即激活癌细胞特异性的细胞免疫来进行预防和/或治疗，因此较好是癌症的预防和/或治疗用疫苗。
以本发明的肽为有效成分的医药组合物可将单一的CTL表位(本发明的肽)作为有效成分，也可将与其他肽(CTL表位或辅助表位)连结而成的多表位肽作为有效成分。近年来，已发现将多个CTL表位(抗原肽)连结而成的多表位肽在体内具有高效的CTL诱导活性。例如Journal of Immunology 1998,161:3186-3194(本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载了将来源于癌抗原蛋白PSA的HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-B53限制性CTL表位(抗原肽)连结而成的多表位肽在体内诱导了对各CTL表位特异性的CTL。此外，也示出通过使CTL表位与辅助表位连结而成的多表位肽，可高效地诱导CTL。通过这样的多表位肽的形态给药的情况下，多表位肽被摄入抗原递呈细胞内后，经过细胞内分解而生成的各抗原肽与HLA抗原结合而形成复合物，该复合物被高密度地递呈至抗原递呈细胞表面，对该复合物特异性的CTL在体内高效地增殖，破坏癌细胞。癌症的治疗或预防由此得到促进。
以本发明的肽和/或ASB4蛋白质为有效成分的医药组合物可与作为医药品被允许的载体、例如适当的佐剂混合后给药或并用给药，从而有效地实现细胞免疫。
作为佐剂，可适用文献(例如Clin Infect Dis.:S266-70,2000)中记载的佐剂等该技术领域已知的佐剂，具体来说，例如作为凝胶类型，可例举氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙等；作为菌体类型，可例举CpG、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipid A，MPL)、霍乱毒素、大肠杆菌热敏感毒素、百日咳毒素和胞壁酰二肽(Muramyl dipeptide，MDP)等；作为油乳浊液类型(乳液制剂)，可例举弗氏不完全佐剂、MF59和SAF等；作为高分子纳米粒子类型，可例举免疫刺激复合物(Immunostimulatory complex，ISCOMs)、脂质体、生物降解性微球体(Biodegradable microsphere)和来源于皂苷的QS-21等；作为合成类型，可例举非离子性嵌段共聚物、胞壁肽类似物(Muramyl peptide analogue)、聚磷腈和合成多聚核苷酸等；作为细胞因子类型，可例举IFN-γ、IL-2和IL-12等。
此外，作为以本发明的肽和/或ASB4蛋白质为有效成分的CTL诱导剂/医药组合物的剂型，无特别限定，可例举油乳浊液(乳液制剂)、高分子纳米粒子、脂质体制剂、与直径数微米的珠粒结合而得的粒子状制剂、与脂质结合而得的制剂、微球体制剂、微胶囊制剂等。作为给药方法，可例举皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药等已知的任意的给药方法。制剂中的本发明的肽的给药量可根据要治疗的疾病、患者的年龄、体重等适当调整，通常为0.0001mg～1000mg，较好是0.001mg～1000mg，更好是0.1mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。
作为使本发明的肽实际作为医药品作用的方法，除了将该肽直接导入体内的直接体内法之外，还有从人采集某种细胞在体外使本发明的肽对其进行作用并将该细胞植回体内的间接体内法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)，只要是本领域的技术人员，可选择适合于所涉及方法的细胞、给药方法、给药形态和给药量。
＜4＞以本发明的多聚核苷酸为有效成分的CTL诱导剂/医药组合物
表达本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸的细胞成为将本发明的肽和/或其他来源于ASB4蛋白质的表位肽作为抗原递呈的细胞，因此具有通过T细胞受体被T细胞识别的特征。因此，本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸也可成为CTL的诱导剂。被诱导的CTL与由本发明的肽和/或ASB4蛋白质诱导的CTL同样，可通过细胞毒性作用或淋巴因子的产生而发挥抗肿瘤作用、较好是抗癌作用。因此，本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸可作为用于癌症的治疗和/或预防的医药品或医药组合物的有效成分。含有本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸作为有效成分的CTL的诱导剂例如通过将本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸给予癌症患者并使其表达，从而可治疗和/或预防癌症。
例如将整合至表达载体的本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸通过以下的方法给予癌症患者后，肿瘤抗原肽在抗原递呈细胞内高度表达。然后，生成的肿瘤抗原肽与HLA-A02抗原或HLA-A24抗原结合而形成复合物，该复合物被高密度地递呈至抗原递呈细胞表面，从而癌特异性的CTL在体内高效地增殖，破坏癌细胞。如上所述，实现癌症的治疗或预防。因此，包含本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸为有效成分的医药组合物也包括在本发明内。所述医药组合物较好是癌症的预防和/或治疗用的组合物，即癌症的预防和/或治疗剂。此外，本发明的医药组合物通过诱导对癌细胞(较好是癌症干细胞)特异性的CTL，即激活癌细胞特异性的细胞免疫来进行预防和/或治疗，因此较好是癌症的预防和/或治疗用疫苗。
以本发明的多聚核苷酸为有效成分的CTL诱导剂/医药组合物较好是对HLA-A02抗原或HLA-A24抗原阳性且罹患ASB4阳性的癌症的对象使用。作为ASB4阳性的癌症，可例举例如大肠癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、子宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、卵巢癌等癌症(肿瘤)，本发明的CTL诱导剂可用于这些癌症的预防或治疗。
作为给予本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸并导入细胞内的方法，可适用采用病毒载体的方法及其他的方法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)中的任一种方法。因此，本发明的医药组合物的一种形态中，含有包含本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸的载体为有效成分。
作为采用病毒载体的方法，可例举在反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒等DNA病毒或RNA病毒中整合本发明的DNA并导入的方法。其中，特别好是采用反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒等的方法。
作为其他方法，可例举将表达质粒直接肌肉内给药的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、脂质转染法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，特别好是DNA疫苗法、脂质体法。
为了使本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸实际作为医药发挥作用，有将该多聚核苷酸直接导入体内的直接体内法以及从人采集某种细胞在体外将本发明的多聚核苷酸导入该细胞并将该细胞植回体内的间接体内法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)。更好是直接体内法。
通过直接体内法给予本发明的多聚核苷酸和/或编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸的情况下，可适当选择与要治疗的疾病、症状等相适应的合适的给药路径和给药形态来给药。例如，可通过能够对静脉、动脉、皮下、皮内、肌肉内等进行注射的形态进行给药。通过直接体内法给药的情况下，例如可采用液剂等制剂形态，一般可制成含有作为有效成分的本发明的多聚核苷酸的注射剂等，根据需要加入医药上允许的载体。此外，对于含有本发明的多聚核苷酸的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)，可采用悬浮剂、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等脂质体制剂的形态。
制剂中的本发明的多聚核苷酸的含量可根据要治疗的疾病、患者的年龄、体重等适当调整，通常将以多聚核苷酸的含量计为0.0001mg～100mg、较好是0.001mg～10mg的本发明的多聚核苷酸数日～数月1次给药。
只要是本领域的技术人员，可适当选择合适的细胞、载体、给药方法、给药形态和给药量。
此外，近年来，已发现编码将多个CTL表位(肿瘤抗原肽)连结而成的多表位肽的多聚核苷酸或者编码将CTL表位与辅助表位连结而成的多表位肽的多聚核苷酸在体内具有高效的CTL诱导活性。例如Journal of Immunology1999,162:3915-3925(本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载了编码将来源于HBV的6种HLA-A2限制性抗原肽、3种HLA-A11限制性抗原肽和辅助表位连结而成的表位肽的DNA(小基因)在体内有效地诱导了针对各表位的CTL。因此，将通过使1种或2种以上编码本发明的肽的多聚核苷酸连结或者根据情况还连结编码其他肽的多聚核苷酸而制成的多聚核苷酸整合至合适的病毒载体，可作为CTL的诱导剂的有效成分。这样的CTL的诱导剂也可采用如前所述的给药方法和给药形态。
＜5＞本发明的抗原递呈细胞
所述的本发明的肽和多聚核苷酸例如可如下在体外利用。即，通过使本发明的肽和多聚核苷酸中的任一种与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触，可制备抗原递呈细胞。因此，本发明的一种形态中，提供使HLA-A02抗原或HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物递呈至细胞表面的抗原递呈细胞及其制造方法。如上所述，本发明的肽和多聚核苷酸可用于预防和/或治疗癌症。因此，本形态的抗原递呈细胞或其制造方法较好是利用来源于癌症患者的分离得到的细胞。具体来说，通过使从癌症患者分离的具有抗原递呈能力的细胞与本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种在体外接触，制造使HLA-A02抗原或HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物递呈至该细胞的细胞表面的抗原递呈细胞。
在此，“具有抗原递呈能力的细胞”只要是能够递呈本发明的肽的在细胞表面表达MHC、较好是HLA、更好是HLA-A02抗原或HLA-A24抗原的细胞即可，无特别限定，这些细胞中较好是专职性抗原递呈细胞，更好是被认为抗原递呈能力特别高的树突状细胞。
此外，作为为了由所述具有抗原递呈能力的细胞制备本发明的抗原递呈细胞而添加的物质，可以是本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种。
本发明的抗原递呈细胞例如可通过从癌症患者分离具有抗原递呈能力的细胞，在体外用本发明的肽对该细胞进行脉冲，使HLA-A02抗原或HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物递呈来获得(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999)。使用树突状细胞的情况下，例如通过从癌症患者的外周血用Ficoll法分离细胞细胞，然后除去非附着细胞，将附着细胞在GM-CSF和IL-4的存在下培养而诱导树突状细胞，将该树突状细胞与本发明的肽一起培养进行脉冲等，从而可制备本发明的抗原递呈细胞。
此外，通过将本发明的多聚核苷酸导入所述具有抗原递呈能力的细胞来制备本发明的抗原递呈细胞的情况下，该多聚核苷酸可以是DNA的形态，也可以是RNA的形态。具体来说，DNA的情况下，可将Cancer Res.,56:p5672,1996或J.Immunol.,161:p5607,1998(这些文献通过引用而构成本发明的一部分)等作为参考进行，而RAN的情况下，可将J.Exp.Med.,184:p465,1996(这些文献通过引用而构成本发明的一部分)等作为参考进行。
所述抗原递呈细胞可作为CTL的诱导剂的有效成分。由于可稳定地维持抗原递呈细胞，含有该抗原递呈细胞作为有效成分的CTL的诱导剂较好是包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。作为给药方法，可例举静脉内给药、皮下给药、皮内给药等。通过将这样的含有抗原递呈细胞作为有效成分的CTL的诱导剂送回至患者体内，在罹患ASB4阳性的癌症的患者体内，对抗原递呈本发明的肽的癌细胞特异性的CTL被高效地诱导，从而可治疗抗原递呈本发明的肽的ASB4阳性的癌症。
＜6＞本发明的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
本发明的肽和多聚核苷酸例如可如下在体外利用。即，通过使本发明的肽和多聚核苷酸中的任一种与外周血淋巴细胞在体外接触，可诱导CTL。因此，本发明的一种形态中，提供特异性地杀伤抗原递呈本发明的肽的细胞的CTL及其诱导方法。如上所述，本发明的肽和多聚核苷酸可用于预防和/或治疗癌症。因此，本形态的CTL及其诱导方法较好是利用来源于癌症患者的外周血淋巴细胞。具体来说，通过使来源于癌症患者的外周血淋巴细胞与本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种在体外接触，从而诱导特异性地杀伤抗原递呈本发明的肽的细胞的CTL。
例如，对于恶性黑色素瘤，将患者本人的肿瘤内浸润T细胞在体外大量培养并将其植回患者的过继性免疫治疗确认具有治疗效果(J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994)。此外，对于小鼠的恶性黑色素瘤，通过在体外通过肿瘤抗原肽TRP-2刺激脾细胞，使肿瘤抗原肽特异性的CTL增殖，将该CTL给予恶性黑色素瘤移植小鼠，确认到转移抑制(J.Exp.Med.,185:453,1997)。这是基于在体外使特异性识别抗原递呈细胞的MHC与肿瘤抗原肽的复合物的CTL的结果。因此，可认为使用本发明的肽或多聚核苷酸在体外刺激患者外周血淋巴细胞而使肿瘤特异性CTL增殖后将该CTL植回患者的治疗方法是有用的。
该CTL可作为癌症的治疗剂或预防剂的有效成分。由于可稳定地维持抗原递呈细胞，该治疗剂或预防剂较好是包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。作为给药方法，可例举静脉内给药、皮下给药、皮内给药等。通过将这样的含有CTL作为有效成分的癌症的治疗或预防剂送回至患者体内，在罹患ASB4阳性的癌症的患者体内，CTL产生的癌细胞的毒性作用得到促进，破坏癌细胞，从而可治疗癌症。
本发明的CTL能够以被肿瘤细胞抗原递呈的本发明的肽与HLA的复合物为靶发挥细胞毒性。即，本发明的CTL的T细胞受体(TCR)识别本发明的肽与HLA的复合物。近年来，设计出了克隆识别CTL中表达的特定的肽-HLA复合物的TCR基因，将该TCR基因导入从患者采集的CD8+T细胞而人工制作CTL，大量培养后，送回至患者体内的过继性免疫疗法(例如Ochi等,Blood.2011Aug 11；118(6):1495-503等)。本发明中，提到“人工CTL”的情况下，是指如前所述将编码识别肽与HLA的复合物的TCR的基因导入T细胞而制成的CTL，该CTL也可与上述的天然CTL同样用于癌症的治疗。因此，所述人工CTL也包括在本发明的CTL内。所述形态中，人工CTL所基因导入的识别本发明的肽与HLA的复合物的TCR可为了提高对于该复合物的结合亲和性或细胞毒性而适当改造。因此，“人工CTL”中还包括将编码识别本发明的肽与HLA的复合物的TCR的基因适当进行基因改造后导入来源于患者的T细胞而制成的CTL。人工CTL的制作可使用该技术领域已知的方法。
＜7＞使用本发明的肽的肿瘤特异性CTL检测剂
本发明的肽能够被肿瘤特异性CTL识别，因此可用作肿瘤特异性CTL检测剂的成分。因此，本发明还涉及包含本发明的肽的肿瘤特异性CTL检测剂。一种形态中，本发明的肿瘤特异性CTL检测剂包括含有本发明的肽与HLA-A02或HLA-A24的HLA多聚体(单体、二聚体、四聚体、五聚体和Dextramer)。
例如，HLA四聚体是指将使HLA的α链和β2微球蛋白与肽(表位肽)组装而成的复合物(HLA单体)生物素化，使其与亲和素结合而四聚体化而成的多聚体(Science 279:2103-2106(1998)，Science 274:94-96(1996))。现在，市场上有各种含有抗原肽的HLA四聚体销售(例如自株式会社医学生物学研究所)，可容易地制备含有本发明的肽和HLA-A02或HLA-A24的HLA四聚体。此外，HLA二聚体和HLA五聚体也基于同样的原理，对于这些多聚体，所述HLA单体分别二聚体化和五聚体化。因此，含有本发明的肽和HLA-A02或HLA-A24的HLA多聚体也是本发明的一种形态。
具体来说，可例举例如含有由序列编号3～14中的任一个中记载的氨基酸序列形成的肽和HLA-A02或HLA-A24的HLA四聚体。为了可通过流式细胞仪、荧光显微镜等已知的检测手段容易地筛选或检测结合的CTL，该HLA四聚体较好是经荧光标记。具体来说，可例举通过例如藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质(PerCP)等标记的HLA四聚体。
作为HLA四聚体的制法例子，可例举例如Science 279:2103-2106(1998)、Science274:94-96(1996)等文献中记载的方法，简单如下所述。
首先，向可表达蛋白质的大肠杆菌或哺乳动物细胞导入HLA-A24或HLA-A02的α链表达载体和β2微球蛋白表达载体并使其表达。在此，较好是使用大肠杆菌(例如BL21)。将所得的单体HLA-A24或HLA-A02复合物与本发明的肽混合，形成可溶性的HLA-肽复合物。接着，将HLA-肽复合物中的HLA-A24或HLA-A02的α链的C末端部位的序列通过BirA酶进行生物素化。将该经生物素化的HLA-肽复合物与经荧光标记的亲和素以4:1的摩尔比混合，从而可制备HLA四聚体。所述各步骤中，较好是进行采用凝胶过滤等的蛋白质纯化。
＜8＞癌症干细胞检测剂
如上所述，本发明人首次发现ASB4在癌症干细胞中特异性高表达。即，本发明首先揭示了ASB4是在不包括癌症干细胞的癌细胞和通常的体细胞中无标点，但在癌症干细胞中高表达的基因。根据所述认知，发现ASB4可用作用于识别癌细胞、特别是癌症干细胞的标记物。因此，本发明在一方面涉及包含用于检测ASB4基因的表达产物的ASB4检测剂的癌症干细胞检测剂。
本发明中，单独提到ASB4的情况下，只要没有另外的记载，均是指ASB4基因。较好是人ASB4基因，但也可以是其同源物。
本发明中，“基因的表达”是指以该基因的转录为起点的影响力的生物体反应，“表达产物”是指例如mRNA和内源性多肽等通过这一系列的生物体反应而生成的分子。作为基因的表达产物的内源性多肽较好是通过该基因的表达最终产生的蛋白质。
本发明中，“ASB4检测剂”是指用于定性和/或定量地对ASB4基因或其表达产物进行检测的试剂。
本发明的癌症干细胞检测剂包含用于检测ASB4基因的表达产物的ASB4检测剂。在检测对象中检测出ASB4的表达产物的情况下，可确定检测对象具有癌症干细胞，即检测出癌症干细胞。本发明的癌症干细胞检测剂在体内和体外均可使用，但较好是对于来源于从生物个体(检查对象)采集的活体试样的细胞群(检测对象)在体外使用。该情况下，在作为检测对象的来源于活体试样的细胞群中检测出癌症干细胞意味着在作为检查对象的采集活体试样的生物个体中也检测出癌症干细胞，即该生物个体具有癌症干细胞。因此，如后所述，使用本发明的癌症干细胞检测剂在检查对象中检测癌症干细胞的方法也包括在本发明内。
作为检查对象的生物个体只要是可能具有肿瘤的生物个体即可，可以是任意的生物个体，但较好是人和非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类，黑猩猩等灵长类，牛、山羊、绵羊等偶蹄目，马等奇蹄目，兔子、狗、猫等)的个体，更好是人的个体。
关于检测对象的细胞群，可对来源于由上述检查对象得到的任意的活体试样的细胞群使用，但较好是来源于由人得到的活体试样的细胞群，更好是包含来源于确认在组织的细胞中ASB4几乎无表达的选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠和血液的1种或2种以上的活体试样的细胞的细胞群。
本发明的癌症干细胞检测剂所含的ASB4检测剂可根据检测的表达产物而变化，只要是本领域的技术人员就可适当选择最合适的检测剂。具体来说，例如表达产物为mRNA的情况下，可使用该技术领域中公知的任意的mRNA检测法，可例举例如RT-PCR法、原位杂交法、RNA印迹法、实时RT-PCR等，但并不仅限于此，其中，从检测灵敏度高、实验操作简便等角度来看，较好是RT-PCR法。例如表达产物为内源性多肽(较好是ASB4蛋白质)的情况下，可例举例如蛋白质印迹法、免疫组织染色法等，但并不仅限于此。使用的ASB4检测剂可根据检测的表达产物和采用的检测法而变化，本领域的技术人员可适当选择最合适的检测剂。具体来说，例如检测内源性多肽的情况下，可例举ASB4特异抗体(较好是单克隆抗体)等，检测mRNA的情况下，可例举具有与序列编号1中记载的碱基序列(Genbank登录号:NM_016116.2的第72～1352个)的一部分互补的碱基序列的探针和/或引物等，但并不仅限于此。此外，检测的表达产物可以是单一的表达产物，也可以将多种表达产物组合使用。
＜9＞识别本发明的肽的抗体
如上所述，本发明的肽被癌细胞、特别是癌症干细胞作为CTL表位肽递呈。这时，与MHC形成复合物被递呈至细胞表面。因此，通过使用特异性识别本发明的肽或所述复合物的抗体，可将本发明的肽作为肿瘤标记物或抗体医药的靶进行利用。作为这样的抗体，可例举例如与本发明的肽特异性结合的抗体(较好是单克隆抗体)，识别本发明的肽与HLA的复合物、较好是与HLA-A24或HLA-A02的复合物的TCR(T细胞抗原受体)样抗体。因此，本发明还涉及识别本发明的肽的抗体以及识别该肽与MHC的复合物的T细胞抗原受体样抗体。
本发明中，提到“抗体”的情况下，不仅是免疫球蛋白分子，还包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、dsFv、双价抗体(Diabody)和sc(Fc)2等抗体的功能性片段。此外，这些功能性片段的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、聚合物)也包括在本发明的抗体内。
本发明中，“TCR样抗体”是对片段化的来源于抗体的肽与主要组织相容性抗原复合物(MHC)分子的复合物(pMHC)具有TCR样的结合能力(抗原识别能力)的分子。例如，如EurJ Immunol.2004；34:2919-29等中所报道，识别来源于肿瘤抗原的肽与MHC的复合物的TCR样抗体可识别CTL可作为靶的递呈肿瘤抗原肽的癌细胞、吞噬癌细胞而在MHC I类上递呈肿瘤抗原肽的树突状细胞等。
此外，对于识别来源于病毒等的肽与MHC的复合物的所述TCR样抗体，可定量并实时地分析递呈的抗原在感染细胞上呈现怎样的递呈动作和CTL应答等。
所述TCR样抗体可通过Eur J Immunol.2004；34:2919-29等中所记载的方法制备。例如，可通过用MHC和肽的复合物对小鼠等动物进行免疫而获得复合物特异性抗体。此外，还可用噬菌体展示法获得复合物特异性抗体。
如上所述，通过识别本发明的肽或递呈该肽的MHC复合物，可检测将该MHC复合物提呈至细胞表面的肿瘤细胞。因此，本发明还涉及包含上述抗体或TCR样抗体的肿瘤检测剂。此外，除了肿瘤细胞之外，本发明的肽也同样被抗原递呈细胞、特别是树突状细胞等专职性抗原递呈细胞所递呈，因此上述抗体也可用于递呈本发明的肽的抗原递呈细胞等的检测。
此外，如上所述，本发明的肽被癌细胞、特别是癌症干细胞作为CTL表位肽递呈，因此识别本发明的肽或者该肽与HLA的复合物、较好是与HLA-A24或HLA-A02的复合物的抗体或TCR样抗体也可用作对象的癌症的预防和/或治疗剂。因此，本发明还涉及包含本发明的抗体和/或TCR样抗体的癌症的预防和/或治疗剂。
本发明的肽被肿瘤细胞作为CTL表位肽递呈，因此识别本发明的肽或者该肽与HLA的复合物、较好是与HLA-A24的复合物的抗体和/或TCR样抗体可与在对象中存在于细胞表面的所述肽和/或所述复合物结合。抗体结合于肿瘤细胞表面后，巨噬细胞或NK细胞等效应细胞的Fc受体与该抗体的Fc部位结合，该效应细胞产生攻击肿瘤细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性，从而可以处置肿瘤。因此，上述抗体和/或TCR样抗体可用作癌症的预防和/或治疗剂的有效成分。
此外，近年来，开发出了以具有2个不同的抗原结合部位，可分别与不同的抗原结合的方式进行了改造的双重特异性抗体。以一个抗原结合部位识别被抗原递呈的肽或MHC-抗原肽复合物等癌细胞表面抗原并以另一个抗原结合部位识别CD3等淋巴细胞表面抗原的双重特异性抗体可将CTL和效应细胞等具有淋巴细胞表面抗原的细胞约束、聚集在癌细胞附近。被约束在癌细胞附近的淋巴细胞发挥不仅自身显示ADCC活性等抗肿瘤活性，而且通过细胞因子等的分泌将癌细胞周围的初始免疫细胞激活为抗肿瘤性的旁侧效应，从而可以对癌细胞进行攻击。
因此，本发明还包括特异性识别本发明的肽和/或该肽与HLA的复合物以及淋巴细胞表面抗原的双重特异性抗体。被特异性识别的淋巴细胞表面抗原只要是在淋巴细胞的表面特异性表达的抗原即可，无特别限定，可优选例举CD3、CD16、CD64等。特别是CD3为参与CTL的细胞毒性的诱导的细胞表面抗原，若抗体与CD3结合，不识别HLA-癌抗原复合物就可不受HLA约束地激活CTL，可期待发挥强力的细胞毒性，因此优选。
另外，近年来，设计出了将对肿瘤抗原特异性的单克隆抗体的一部分施加基因操作进行改造而得的嵌合抗原受体(CAR)基因导入来源于患者的T细胞，将该基因改造T细胞在体外扩增培养后输注给患者的新的免疫细胞治疗法(Nat Rev Immunol.2012；12:269-81)。具体来说，通过将从患者采集的外周血单核细胞在抗CD3抗体和IL-2等的存在下进行培养而激活T细胞后，使用逆转录病毒载体或慢病毒载体等转化用载体将编码CAR的基因导入T细胞，从而制作基因改造T细胞。
本发明中，“嵌合抗原受体”是按照在N末端侧具有识别存在于癌细胞的细胞表面的分子的抗体的抗体可变区的轻链与重链串联结合而得的单链抗体(scFv)且在C末端侧具有构成T细胞受体(TCR)/CD3复合物的分子中的CD3ζ链的方式设计的嵌合蛋白分子。该嵌合抗原受体识别在scFv区域识别特定的抗原后，介以CD3ζ链发生T细胞的激活。为了增强T细胞的激活，可在scFv与ζ链之间整合1个或2个以上的共刺激分子(例如CD28、4-1BB、ICOS等)。本发明中，作为scFv，可使用本形态的TCR样抗体(包括可由TCR样抗体设计的抗体分子或其片段)制作CAR。识别来源于肿瘤抗原的肽与MHC的复合物的CAR可识别CTL可作为靶的递呈肿瘤抗原肽的癌细胞、吞噬癌细胞而在MHC I类上递呈肿瘤抗原肽的树突状细胞等，因此导入所述CAR的基因改造T细胞与人工CTL同样可用作所述肿瘤抗原特异性的癌症的预防和/或治疗剂。因此，本发明还涉及包含导入识别本发明的来源于肿瘤抗原的肽与MHC的复合物的CAR的基因改造T细胞或者人工CTL的癌症的预防和/或治疗剂。
＜10＞肿瘤的检测方法(检查方法、诊断方法)
本发明提供利用所述的本发明的CTL检测剂、或者癌症干细胞检测剂或肿瘤检测剂的肿瘤的检测方法(检查方法、诊断方法)。
作为典型的例子，使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测方法(诊断方法)是采集受检者的血液，或者通过活检等采集被怀疑是肿瘤的受检组织的一部分，通过本发明的CTL检测剂检测、测定其中所含的识别来源于ASB4的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的CTL的量，从而检测、检查或诊断是否罹患大肠癌、肺癌、肾脏癌、乳腺癌、口腔癌、子宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、卵巢癌等ASB4阳性的癌症(肿瘤)或者其程度。
作为典型的例子，使用本发明的癌症干细胞检测剂的本发明的检测方法(检查方法、诊断方法)是采集受检者的血液，或者通过活检等采集被怀疑是肿瘤的受检组织的一部分，通过本发明的癌症干细胞检测剂检测、测定其中所含的ASB4表达产物的量，从而检测、检查或诊断是否罹患大肠癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、子宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、卵巢癌等ASB4阳性的癌症(肿瘤)或者其程度。
作为典型的例子，使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的检测方法(检查方法、诊断方法)是采集受检者的血液，或者通过活检等采集被怀疑是肿瘤的受检组织的一部分，通过本发明的肿瘤检测剂检测、测定其中所含的递呈来源于ASB4的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的细胞的量，从而检测、检查或诊断是否罹患大肠癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌、子宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、卵巢癌等ASB4阳性的癌症(肿瘤)或者其程度。
本发明的检测(检查、诊断)方法例如也可以对于患有肿瘤的患者检测(检查、诊断)为了改善该肿瘤而给予治疗药物的情况下的该肿瘤是否改善或其程度。另外，本发明的检测(检查、诊断)方法还可用于可有效地适用以本发明的肽或多聚核苷酸为有效成分的医药品的治疗对象患者的筛选和该医药品产生的治疗效果的预测或判定等。此外，使用本发明的肿瘤检测剂的形态中，能够检测通过给予以本发明的肽为有效成分的癌症疫苗而在患者体内诱导的CTL可实际作为靶的递呈肿瘤抗原肽的癌细胞。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测(检查)方法的特定的形态包括以下的(a)和(b)以及任意采用的(c)的工序：
(a)使由受检者得到的活体试样与本发明的CTL检测剂接触的工序；
(b)以上述CTL检测剂结合的细胞的量为指标测定该活体试样中的识别来源于ASB4的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的CTL的量的工序；
(c)基于(b)的结果判断是否罹患癌症的工序。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的诊断方法的特定的形态包括上述(a)、(b)和(c)的工序。
使用本发明的癌症干细胞检测剂的本发明的检测(检查)方法的特定的形态包括以下的(d)和(e)以及任意采用的(f)的工序：
(d)使由受检者得到的活体试样与本发明的癌症干细胞检测剂接触的工序；
(e)测定该活体试样中的ASB4表达产物的量的工序；
(f)基于(e)的结果判断是否罹患癌症的工序。
使用本发明的癌症干细胞检测剂的本发明的诊断方法的特定的形态包括上述(d)、(e)和(f)的工序。
使用本发明的癌症干细胞检测剂的检测癌症干细胞的方法的形态包括上述(d)、(e)的工序且包括下述(f')的工序代替(f)：
(f')基于(e)的结果确定活体试样中是否存在癌症干细胞的工序。
作为在此所用的活体试样，可例举由受检者的活体组织(被怀疑存在癌细胞的组织及其周边组织或者血液等)制备的试样。具体来说，可例举由该组织采集的含组织细胞的试样等。
使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的检测(检查)方法的特定的形态包括以下的(g)和(h)以及任意采用的(i)的工序：
(g)使由受检者得到的活体试样与本发明的肿瘤检测剂接触的工序；
(h)以上述肿瘤检测剂结合的细胞的量为指标测定该活体试样中的递呈来源于ASB4的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的细胞的量的工序；
(i)基于(h)的结果判断是否罹患癌症的工序。
使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的诊断方法的特定的形态包括上述(g)、(h)和(i)的工序。
作为在此所用的活体试样，可例举由受检者的活体组织(被怀疑存在癌细胞的组织及其周边组织或者血液等)制备的试样。具体来说，可例举由该组织采集的含组织细胞的试样等。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测方法(检查方法、诊断方法)的一种形态通过检测活体试样中的本发明的肽特异性CTL并测定其量来实施。具体来说，可如下进行：按照文献(Science,274:p94,1996，本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载的方法制备荧光标记的HLA抗原与本发明的肽的复合物的四聚体(HLA四聚体)，使用该四聚体通过流式细胞仪对被怀疑的患者的外周血淋巴细胞中的抗原肽特异性CTL进行定量。
有无肿瘤的预测、判定、判断或诊断例如可通过测定受检者的血液或被怀疑是肿瘤的受检组织中的本发明的肽特异性CTL的量或者递呈本发明的肽的细胞的量来进行。这时，可根据情况将正常的对应组织中的ASB4基因表达水平、本发明的肽水平或CTL水平等作为基准值，将该基准值与由受检者得到的试样中的所述水平比较，判定两者的差异来进行。
在此，受检者的受检组织与正常的对应组织的所述水平的比较可通过平行地进行以受检者的活体试样和正常人的活体试样为对象的测定来实施。不平行进行的情况下，可将使用多份(至少2份，较好是3份以上，更好是5份以上)正常的组织以均一的测定条件测定的的本发明的肽特异性CTL的量或递呈本发明的肽的细胞的量的平均值或统计学中值作为正常人的值、即基准值，用于比较。
受检者是否罹患癌症的判断例如可将该受检者的组织中的本发明的肽特异性的CTL的量或者递呈本发明的肽的细胞与正常人的这些水平相比多例如多2倍以上、较好是3倍以上作为指标来进行。
此外，对于给予本发明的肽或多聚核苷酸的受检者，也可通过测定本发明的肽特异性的CTL的量来判定实际上是否诱导了CTL。例如，可将该受检者的组织中的本发明的肽特异性的CTL的量与正常人的这些水平相比多例如2倍以上、较好是3倍以上作为指标，判定采用本发明的肽或多聚核苷酸的治疗有效。
＜11＞癌症的预防和/或治疗方法
本发明还涉及预防和/或治疗对象的癌症的方法，该方法包括将有效量的选自本发明的肽、多聚核苷酸、CTL、抗原递呈细胞、抗体和/或TCR样抗体、人工CTL、基因改造T细胞的有效成分给予需要其的对象的工序。
本发明中的“对象”只要是可能罹患癌症的生物个体即可，可以是任意的生物个体，但较好是人和非人哺乳动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等啮齿类，黑猩猩等灵长类，牛、山羊、绵羊等偶蹄目，马等奇蹄目，兔子、狗、猫等)的个体，更好是人的个体。本发明中，对象可以是健康的，也可以罹患某种疾病，但想要进行癌症的预防和/或治疗的情况下，典型的是指罹患癌症或有罹患癌症的风险的对象。本发明的一种形态中，对象为HLA-A02阳性或HLA-A24阳性。本发明的一种形态中，对象罹患ASB4阳性的癌症，或者有罹患的风险。本发明的一种形态中，对象为HLA-A02阳性或HLA-A24阳性且罹患ASB4阳性的癌症，或者有罹患的风险。
作为本发明的预防/治疗方法中使用的本发明的肽、多聚核苷酸、CTL、抗原递呈细胞、抗体和/或TCR样抗体、人工CTL以及基因改造T细胞，可例举本说明书中记载的任一种。本发明中的有效量例如为减轻癌症的症状或者延缓或停止其发展的量，较好是抑制或者治愈癌症的量。此外，较好是不产生超过给药产生的益处的不良影响的量。所述量可通过采用培养细胞等的体外试验或者小鼠、大鼠等模型动物的试验适当确定，这些试验的方法对本领域技术人员已知。有效成分的具体的使用量可考虑关于需要其的对象的各种条件，例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、给药的时期及频率、并用的医药品、对治疗的反应性、剂型及对治疗的顺应性等而确定。
作为具体的使用量，例如本发明的肽的情况下，通常为0.0001mg～1000mg，较好是0.001mg～1000mg，更好是0.1mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。此外，本发明的多聚核苷酸的情况下，通常为0.0001mg～100mg，较好是0.001mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。此外，本发明的抗体和/或TCR样抗体的情况下，通常为0.0001mg～2000mg，较好是0.001mg～2000mg，较好是将其1周～4周1次给药。本发明的基因改造T细胞或人工CTL的情况下，通常为1×104～1×108，较好是1×105～1×107，较好是将其1天～4周1次给药。此外，作为给药方法，可使用皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药等已知的任意的合适的给药方法。此外，除了将本发明的肽或核苷酸直接给药至体内的直接体内法之外，还可使用从人采集某种细胞在体外使用本发明的肽或多聚核苷酸诱导CTL或抗原递呈细胞后将这些细胞植回体内的间接体内法。
本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选HLA-A02阳性或HLA-A24阳性的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括确定对象的HLA型的工序。对象的HLA型的确定可通过已知的任意的方法进行。此外，本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选有ASB4阳性的癌症的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括检测对象的ASB4阳性的癌症的工序。对象的ASB4阳性的癌症的检测可使用上述＜9＞中记载的肿瘤的检测方法。本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选HLA-A02阳性或HLA-A24阳性且有ASB4阳性的癌症的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括确定对象的HLA型的工序和检测对象的ASB4阳性的癌症的工序。
＜12＞以癌症干细胞为靶的癌症治疗药的筛选方法
使用本发明的癌症干细胞检测剂的形态中，检测对象中的ASB4表达产物的表达量被认为与检测对象中的癌症干细胞的量相关。因此，通过比较对于检测对象给予癌症治疗药的候选化合物前后的ASB4表达产物的表达量，可判定给予的候选药物是否可用作以癌症干细胞为靶的癌症治疗药。
本发明的筛选方法包括以下的工序(I)、(II)和任意采用的(III)：
(I)在将癌症治疗药的候选化合物给予对象之前，测定该对象中的ASB4基因的表达产物的检测量A的工序；
(II)在将所述候选化合物给予所述对象的细胞群之后，测定该对象中的ASB4基因的表达产物的检测量B的工序；以及
(III)比较所述检测量A与B，该检测量A显著大于B的情况下，将所述候选化合物判定为具有以癌症干细胞为靶的特征的候选癌症治疗药的工序。
本发明的筛选方法的特定的形态包括上述工序(I)～(III)。在此，工序(I)和(II)的测定检测量的工序分别包括上述检测(检查、诊断)方法中的工序(d)和(e)。
本说明书中提及的全部的专利、申请及其他出版物通过参照将其整体引用至本说明书中。
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例
实验例1:人大肠癌细胞的SP分部分离的检测和亚克隆
a)试剂的制备
作为培养基，制备5％胎牛血清(FCS(HyClone Laboratories公司))补充DMEM(Sigma-Alldrich公司)培养基，预先加温至37℃。维拉帕米(Sigma-Alldrich公司)调整至50mM，用5％FCS补充DMEM培养基稀释至5mM。Hoechst 33342(Lonza公司)用5％FCS补充DMEM培养基调整至250μg/mL。DNase I(Qiagen公司)用DDW调整至1mg/mL，用0.2μm的滤器过滤灭菌。
b)流式细胞术(FACS)用的细胞的制备
将人大肠癌细胞株(SW480(ATCC))用4mL的5％FCS补充DMEM培养基悬浮，对细胞数进行计数。然后，加入5％FCS补充DMEM培养基将细胞浓度调整至10×106个/mL，获得检测标本。使用检测标本的一部分进行分注，主检测标本中未添加维拉帕米(维拉帕米(-)样品)，副检测标本中按最终浓度达到75μM的条件添加维拉帕米(维拉帕米(+)检测标本)。然后，向维拉帕米(+)检测标本和维拉帕米(-)检测标本中按照Hoechst 33342的最终浓度达到5.0μM的条件添加Hoechst 33342溶液。
将两种检测标本在37℃振荡培养90分钟后，在冰上冷却。以1500rpm在4℃离心分离5分钟，除去上清。用5％FCS补充1×PBS悬浮，移入预先冰冷的FACS管。再以1500rpm在4℃离心分离5分钟，除去上清，用5％FCS补充1×PBS悬浮。重复1次同样的清洗后，用加入2mM的EDTA的2％FCS补充1×PBS2mL悬浮。加入2μL的DNase I液，混合后用FACS用滤器(碧迪公司)除去细胞凝集块。添加2μL的1mg/mL的碘化丙啶(PI)(Sigma-Aldrich公司)后，作为流式细胞仪使用BD FACS Aria II special edition(注册商标)(碧迪公司)，以1000～2000个/秒的流动速度进行了分析。
c)流式细胞术(FACS)
FACS的操作按照使用说明书进行。
首先，分析维拉帕米(-)检测标本的细胞，与作为主体的细胞群(主群mainpopulation(MP))比较，检测发光强度低的细胞群(侧群，side population(SP))细胞(图1)。为了确认SP细胞是ABC转运器特异性且Hoechst 33342染料低染色性，用同样的条件分析维拉帕米(+)检测标本，确认SP细胞消失(图1)。
分离SP细胞，将细胞以4℃、1500rpm离心分离15分钟，除去上清后，用100～200μL的1×PBS悬浮。
d)单一细胞水平下的亚克隆
来源于SW480的SP细胞通过上述c)检测，将其SP和MP细胞部分分别以1个细胞/孔加入96孔板进行单细胞分类(图2-1)。向各孔中预先加入有1％青霉素/链霉素添加10％FCS补充DMEM培养基。
培养2～3周后，将各孔中增殖的细胞株分别记作SW480-SP克隆细胞株、SW480-MP克隆细胞株。“SW480-SP-X”或“SW480-MP-Y”的X和Y分别为克隆编号。
通过共聚焦显微镜对其形态进行了观察，结果MP克隆细胞株主要以单层增值，各细胞呈纺锤形。另一方面，SP克隆细胞株显示叠层化倾向，各细胞呈圆形～近似圆形。所得的代表性的SP克隆和MP克隆的显微镜图像示于图2-2。
实验例2:肿瘤形成能力实验
为了确认实施例1中得到的SW480-SP和SW480-MP克隆细胞株各自的体内的肿瘤形成能力，使用SP克隆和MP克隆各自的代表性的3个克隆，移植至NOD/SCID免疫缺陷小鼠(东方酵母工业株式会社)。
具体来说，将同样数量的SP和MP克隆细胞分布在冰上悬浮于100μL的1×PBS，与100μL的基质胶(碧迪公司)混合。将100μL的细胞基质胶混合液接种于NOD/SCID小鼠(东方酵母工业株式会社)的背部皮下，SP和MP克隆细胞分别接种100个、1000个、10000个，各组接种5只，观察肿瘤形成。测量肿瘤的长径、短径的长度，用(体积＝长径×短径2/2)的算式算出肿瘤体积。移植10000个的小鼠的肿瘤增大曲线示于图3。
其结果是，10000个细胞移植组中，细胞接种后8周时SW480-MP克隆移植组完全未观察到肿瘤形成。另一方面，SW480-SP克隆移植组中所有的小鼠均观察到肿瘤形成，制成的肿瘤的体积显著比SW480-MP克隆组高(图3)。这与癌症干细胞是肿瘤形成的巨大要因，SP克隆细胞中浓缩了癌症干细胞这一见解(Kondo T,Setoguchi T,Taga T.Persistence of asmall subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line.ProcNatl Acad Sci U S A.20:781-786,2004)一致。
实验例3:人大肠癌SP细胞的HLA-A24结合天然肽的鉴定
按照以下的步骤进行了仅被人大肠癌细胞株SW480的SP部分细胞特异性递呈的HLA-A24结合天然肽的溶出和序列分析。
a)细胞株
作为所述来源于大肠癌细胞株的克隆的SW480-MP和SW480-SP系统用添加了10％FCS和1％青霉素/链霉素(Gibco公司)的DMEM培养基进行培养基，细胞数分别设定为1.5×109～1.8×109的范围内。b)抗体
产生抗HLA-A24抗体(C7709A2)的杂交瘤由P.G.Coulie博士(de Duve Institute,Brussel)提供。杂交瘤用添加10％FCS、1％青霉素/链霉素、55μM的2-巯基乙醇(Gibco公司)、1mM的丙酮酸钠(Gibco公司)、2mM的L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich公司)和20mM的HEPES(Gibco公司)的RPMI-1640(Sigma-Aldrich公司)培养基进行培养，从培养上清通过使用纤维素管和聚乙二醇(PEG-20000)的反渗透法获得浓缩抗体。浓缩抗体添加0.03％叠氮化钠和蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断产品公司)，在4℃保存。
c)抗体与珠粒的结合
将30～40mL的浓缩抗体与3mL的蛋白质A琼脂糖珠(GE Healthcare公司)在4℃搅拌一晚使其结合，然后用0.1M的硼酸和0.2M的三乙醇胺缓冲液(pH8.2)清洗。抗体和珠粒用含20mM的庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐的三乙醇胺缓冲液(pH8.3)在室温下搅拌60～90分钟使其共价结合。
d)HLA-A24结合肽的免疫沉淀
使用含0.5％NP-40、50mM Tris盐酸(pH8)、150mM氯化钠和蛋白质酶抑制剂的缓冲液，分别溶解实验例3a)的细胞(SW480-SP和SW480-MP)。细胞溶解液分阶段进行离心分离(2000g、10分钟，38000g、30分钟，100000g、90分钟)，回收上清。回收的上清过0.5mL的蛋白质A琼脂糖悬浮液柱，除去与蛋白质A琼脂糖非特异性结合的成分后，与实验例3)中制成的抗体结合蛋白质A琼脂糖珠混合，在4℃慢慢搅拌一晚，同时使天然肽与HLA-A24分子的复合物结合于抗体珠。然后，抗体珠使用4种缓冲液([1]0.005％的NP-40、50mM的Tris盐酸(pH8.0)、150mM的氯化钠、5mM的EDTA和蛋白质酶抑制剂；[2]50mM的Tris盐酸(pH8.0)和150mM的氯化钠；[3]50mM的Tris盐酸(pH8.0)和450mM的氯化钠；以及[4]50mM的Tris盐酸(pH8.0))分阶段清洗后，通过10％乙酸处理使与抗体结合的肽和HLA-A24分子溶出。接着，通过3kDa截止过滤器(Millipore公司)仅提取作为目标的肽。将该含肽的提取液浓缩干燥，以0.1％甲酸为溶剂再溶解，作为样品。
e)溶出肽的序列分析
将实验例3d)中得到的样品通过Nanoflow HPLC(Kya TechnologiesCorporation)进行分部分离，点样至MALDI基质后，通过质谱仪(Applied Biosystems公司，MDS SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF)进行了分析。质谱分析和肽序列分析使用AppliedBiosystems 4000Series Explorer software(版本3.5.3)、ProteinPilot 3.0软件(Applied Biosystems公司)和ipi.HUMAN FASTA蛋白质数据库(版本3.71)。所得的肽序列中SW480-SP特异性的序列中实验例4之后记述的来源于ASB4基因的肽的序列和分析图谱示于图4。
f)考察
通过组合采用抗HLA-A24抗体的免疫沉淀和质谱分析的方法，可进行HLA-A24结合肽的鉴定。这些被认为是递呈至大肠癌细胞的表面的天然肽。此外，对于MP部分细胞也使用同样的方法进行分析，将两者进行了比较，作为被SP部分细胞特异性抗原递呈的天然肽，鉴定了具有以序列编号3表示的氨基酸序列的天然肽等。
实验例4：编码HLA-A24结合天然肽的基因的表达
a)SP特异性的基因表达
实验例3e)中鉴定出多种SP部分细胞特异性的HLA-A24结合天然肽。这些肽不认为大致分类成2组。即，编码肽的基因对SP部分细胞特异性表达的组，以及编码肽的基因在SP部分细胞、MP部分细胞均表达，但因为蛋白质表达水平或肽加工的差，MP中未作为天然肽被HLA-A24抗原递呈的组。
为了将上述中鉴定的天然肽以该分类目的进行分类，提取SW480-SP和SW480-MP各自的mRNA进行了采用RT-PCR的基因表达的探讨，作为SP部分细胞特异性表达的基因之一，确认了ASB4基因。基因表达分析的结果示于图5。mRNA提取和逆转录分别按照产品附带说明书使用TRIzol(Invitrogen公司)和SuperScript(注册商标)III逆转录酶(Invitrogen公司)。RT-PCR使用的引物和热循环仪的条件示于下表。RT-PCR产物使用1.5％琼脂糖凝胶以100V进行25分钟的电泳
[表1]
表1：RT-PCR中使用的引物
引物信息
G3PDH fw：5′-accacagtccatgccatcac-3′(序列编号53)
rv：5′-tccaccaccctgttgctgta-3′(序列编号54)
(预测的扩增产物的大小：450bp)
Asb4 fw：5′-ctgtcttgtttggccatgtg-3′(序列编号55)
rv：5′-gcgtctcctcatcttggttg-3′(序列编号56)
(预测的扩增产物的大小：288bp)
[表2]
表2：RT-PCR的条件
[表3]
表3：热循环仪的条件
b)正常细胞中的ASB4基因表达
对于实验例4a)中确认的ASB4，在人成人正常细胞中调查了表达。从Clontech公司获得来源于人成人正常组织的mRNA，使用其进行了RT-PCR。mRNA面板包括来源于心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠、外周血单核细胞的各成人正常细胞和组成的mRNA。
首先，使用SuperScript(注册商标)III逆转录酶(Invitrogen公司)按照试剂盒的实验方法由mRNA合成了cDNA。对于合成的cDNA，使用正向(Fw)引物和反向(Rv)引物(表1)，通过RT-PCR扩增了ASB4的cDNA。此外，作为对照，通过同样的方法扩增了GAPDH的cDNA。PCR条件示于表2、3。对于扩增得到的扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶以100V进行25分钟的电泳结果示于图6。
c)癌细胞株中的ASB4基因表达
通过与实验例4b)同样的方法对大肠癌细胞株3种(SW480、SW620、HTC116)、肺癌细胞株4种(A549、LHK2、LK79、86-9)、肾脏癌细胞株2种(Caki1、ACHN)、乳腺癌细胞株2种(MDAMB468、MCF7)、卵巣癌2种(ES2、Tov21G)、子宫颈癌细胞株1种(HeLa)、膀胱癌细胞株1种(UMUC3)、骨肉瘤1种(U205)、口腔癌细胞株2种(OSC70、HSC2)中的ASB4基因表达进行了确认。结果示于图7。
d)考察
确认到作为大肠癌细胞的干细胞的SW480SP特异性递呈HLA-A24肽的ASB4的基因表达(图5)。该基因在死亡人数在国内和世界上都多的大肠癌和肺癌等上皮性恶性肿瘤细胞中确认表达，而在各种脏器的正常细胞中未见表达(图6和图7)。即，ASB4基因及作为其产物的肽被认为作为癌症治疗的靶具有理想的资质。
实验例5:肽结合试验
对质谱分析中得到的来源于ASB4蛋白质的肽(IV9:序列编号3)的HLA-A24结合能力进行了验证。首先，将T2-A24细胞在24℃培养一晚，第二天以图8所示的浓度范围(0.3μM、1μM、3.3μM和10μM)用肽进行脉冲，保持同样的温度孵育3小时，接着在37℃孵育2.5小时。作为阳性对照，使用HIV584-594肽(氨基酸序列:RYLRDQQLLGI；序列编号51)，作为阴性对照，使用GK12肽(氨基酸序列:GYISPYFINTSK；序列编号52)。离心分离(15000rpm，5分钟)除去上清，将分离的细胞成分用HLA-A24抗体(C7709A2.6)进行处理(4℃，1小时孵育)。然后，用PSB清洗，离心分离除去上清后，用二次抗体(山羊抗小鼠IgG，FITC)进行处理(4℃，30分钟孵育)。然后，将细胞用PBS清洗，加入1％多聚甲醛磷酸缓冲液，固定细胞。使用流式细胞仪(FACScan)测量FITC荧光强度，对在细胞表面表达的合成肽与HLA-A24的复合物的量进行定量。结果示于图8。如图所示，可知来源于ASB4蛋白质的肽IV9具有对HLA-A24的结合活性。
实验例6:细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的诱导
a)人外周血单核细胞(PBMC)的分离
将获得知情同意的HLA-A24阳性大肠癌患者或HLA-A24阳性健康人的外周血采集至添加肝素的50mL针筒。将全血在添加了13mL的Lymphoprep(Nycomed公司)的50mL管(FALCON公司)中叠层，2000rpm离心分离30分钟。通过移液管回收Lymphoprep层上沉淀的PBMc层，用PBS清洗3次，作为人PBMC。
b)CD8阳性细胞(CD8+)和CD8阴性细胞(CD8-)的分离
将如上所述分离的PBMC悬浮于10mL的AIM-V培养液(Life Technologies公司)，在10cm塑料培养皿中于37℃培养约2小时。将10cm培养液缓缓振荡，将浮游细胞与AIM-V培养液一起回收，用15mL管以1500rpm离心分离5分钟。对于所得的细胞团，悬浮于160μL的添加2mM的EDTA的0.1％BSA补充PBS，添加、混合40μL的CD8微珠(Miltenyi Biotec公司)后，在4℃培养15分钟，用5mL添加2mM的EDTA的0.1％BSA补充PBS清洗，以1500rpm离心分离5分钟。向细胞团中添加、混合1mL添加2mM的EDTA的0.1％BSA补充PBS，添加至装有磁铁的柱，通过添加2mM的EDTA的0.1％BSA补充PBS清洗5次后，将柱从磁铁上取下，回收CD8+细胞。未附着于柱的细胞为CD8-细胞。
c)采用合成肽的CD8+细胞刺激
将CD8-细胞和CD8+细胞用添加10％人AB血清(HS)的AIM-V培养液进行培养。向一部分CD8-细胞添加1mg/mL的植物血凝素(PHA)(和光纯药工业株式会社)和100U/mL的白细胞介素-2(IL-2)(武田药品工业株式会社)，培养7天，制成PHA-blast细胞。向PHA-blast细胞添加20μg/mL实验例3e)中鉴定的具有来源于ASB4的氨基酸序列的合成肽IV9(序列编号3)，在室温下培养1小时。将肽脉冲PHA-blast细胞用放射线照射机(Softex公司)照射100Gy，添加10mL的PBS后，以1500rpm离心分离5分钟。将细胞团悬浮于1mL的10％HS添加AMI-V，计算细胞浓度。将4×105个PHA-blast细胞添加至2×106个CD8+细胞，用1mL的10％HS添加AMI-V于37℃培养1周。在第7天用100Gy的放射线照射同样地进行了肽脉冲的PHA-blast细胞，添加至CD8+细胞。第8天向CD8+细胞添加20U/mL的IL-2。在第14天峻县同样的采用PHA-blast细胞的刺激。
实验例7:干扰素(IFN)γELISPOT测试
a)ELISPOT板的制作
实验使用人IFNγELISPOT套装(碧迪公司)进行。将稀释200倍的抗IFNγ抗体于4℃在ELISPOT板上静置一晚进行涂敷。用10％FCS补充RPMI(Sigma-Aldrich公司)将板在室温下培养2小时，进行封闭，制成ELISPOT板。
b)细胞培养
以20μg/mL的浓度将各肽在室温下对作为向人淋巴样干细胞T2细胞导入HLA-A2402基因使其表达的细胞株的T2-A24细胞(由爱知县癌症中心葛岛医生提供)进行1小时的脉冲。肽脉冲组采用[1]无肽脉冲、[2]HIV肽脉冲、[3]ASB4肽脉冲这3组。肽脉冲后添加PBS，以1500rpm离心分离5分钟。细胞团以5×105个/mL悬浮，在ELISPOT板上各孔分别接种5×104个。将CTL向各孔分别接种5×104个，在37℃培养一晚。
c)斑点的检测
从培养一晚的ELISPOT板除去培养液和细胞后，用Milli Q水清洗2次，用清洗缓冲液清洗3次。向各孔添加稀释250倍的生物素化检测抗体，在室温下培养2小时。用清洗缓冲液清洗3次后，向各孔添加稀释100倍的HRP标记链霉亲和素，在室温下培养1小时。用清洗缓冲液清洗3次并用PBS清洗2次后，向各孔添加显色试剂，在室温下进行15～30分钟的显色反应。确认形成足够的可见斑点后，用Milli Q水清洗，结束反应。干燥硝基纤维素膜后，用KSELISPOT(ZEISS社公司)检测，摄影。如图9可见，在ASB4肽脉冲组检测出IFNγ斑点。
实验例8:细胞毒性试验
将T2-A24细胞、SW480-SP、SW480-MP和HLA-I类缺失的白血病细胞K562(由ATCC获得)以1×106个/mL的细胞浓度悬浮于10％FBS补充RPMI。用10mL的10％FBS补充RPMI清洗3次。
对于T2-A24细胞，以20μg/mL的浓度用IV9肽和作为T2-A24细胞结合阳性对照的HIV584-594肽在室温下进行1小时的脉冲。作为阴性对照，无肽脉冲的组。T2-A24细胞的实验组采用[1]无肽脉冲、[2]HIV584-594肽脉冲、[3]IV9肽脉冲这3组。此外，对于K562也以同样的条件用IV9肽进行了脉冲。SW480-SP和SW480-MP这两组以无肽脉冲的状态使用。肽脉冲后，用PBS清洗2次。将各组细胞以1×105个/100μL接种于各孔。
将效应细胞(CTL)按照效应细胞/靶细胞比(E/T比)为1、3、9的条件以各个数的CTL接种于各孔。作为自然游离孔，接种效应细胞(CTL)。最大游离孔中，向靶细胞按照最终浓度2％的条件添加4％的NP-40添加PBS。在37℃培养6小时后，离心并将100μl上清移至新的板，向各孔中加入100μl的LDH细胞毒性检测试剂盒反应液(宝生物株式会社)。10分钟后，用Terra Scan测定各孔的荧光强度。用下述算式计算细胞毒性。
细胞毒性＝(实验组的游离量-实验组的自然游离量)/(实验组的最大游离量-实验组的自然游离量)×100
如图10所示，与[1]无肽脉冲组、[2]HIV肽脉冲组、IV9肽脉冲K562组相比，CTL对于[3]IV9肽脉冲组显示出高细胞毒性。这提示CTL对于ASB4肽显示特异性的细胞毒性。此外，SW480-SP组在无肽脉冲中也显示与[3]IV9肽脉冲组同等的细胞毒性，而SW480-MP组仅显示与[1]无肽脉冲组和[2]HIV肽脉冲组同等程度的细胞毒性。这提示SW480细胞株仅在SP部分细胞中将IV9肽抗原提呈至细胞表面。
实验例9:具有HLA-A*02:01和HLA-A*24:02结合模体的来源于ASB4的肽
使用作为MHC与肽的结合预测程序的BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)和IEDB(MHC-I processingpredictions；http://www.iedb.org/)等，提取预测与HLA-A*02:01和/或HLA-A*24:02结合的来源于ASB4的肽(以序列编号4～46表示的肽)。通过Fmoc法化学合成这些肽。合成的肽示于以下的表4。Start表示合成的肽的N末端氨基酸的ASB4(序列编号2)中的氨基酸位置，End表示合成的肽的C末端氨基酸的ASB4(序列编号2)中的氨基酸位置。Length表示合成的肽的氨基酸数。
[表4]
表4：合成的肽
实验例10:来源于ASB4的肽的HLA-A*02:01或HLA-A*24:02结合性评价
来源于ASB4的肽的对各HLA分子的结合性评价通过MHCI类稳定表达试验来实施。该试验中利用了作为人淋巴样干细胞株的T2-A24细胞。T2细胞缺失参与从细胞质向内质网的肽的运输的抗原加工相关转运子(TAP，transporter associated with antigenprocessing)。MHCI类分子(HLA-A*02:01和HLA-A*24:02)已知在不结合肽的状态(空MHCI类，empty MHC class I)下结构不稳定。通常，T2细胞仅能在细胞表面表达低水平的空MHCI类分子。但是，如果添加可与MHC I类分子结合的肽，空MHC I类分子可与该肽结合而在细胞表面稳定存在。因此，细胞表面MHC I类表达水平依赖于肽的MHC I类结合亲和性。
T2-A24细胞在37℃、5％CO2下进行继代培养。对于肽，分别以100μg/mL的浓度使用来源于ASB4的肽(表4中记载的肽)、作为HLA-A02阳性对照的Melan A A27L肽(氨基酸序列:ELAGIGILTV；序列编号47)、作为HLA-A24阳性对照的HIV584-592肽(氨基酸序列:RYLRDQQLL；序列编号48)、作为HLA-A02阴性对照的MAGE-1161-169肽(氨基酸序列:EADPTGHSY；序列编号49)、作为HLA-A24阴性对照的VSV52-59肽(氨基酸序列:RGYVYQGL；序列编号50)对结合性进行了评价。这些肽被溶解于DMSO，再用RPMI160培养基稀释至200倍。将细胞悬浮液与肽溶液混合，在5％CO2、26℃的条件下培养了16～18小时。将温度设为37℃，再共培养3小时后，离心分离除去上清，分离细胞。将分离的细胞用含3％FBS的PBS清洗，加入用FITC进行了荧光标记的抗HLA-A02抗体(clone:BB7.2；医学生物学研究所)或抗HLA-A24抗体(clone:17A10；医学生物学研究所)，在室温下静置30分钟。然后，将细胞用含3％FBS的PBS清洗，加入4％多聚甲醛磷酸缓冲液，在室温下静置10分钟而固定细胞。固定后的细胞通过流式细胞仪(FACScan)测定FITC荧光强度。算出平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)的溶剂比。
HLA结合试验的结果示于表5。如表5所示，以序列编号4～23表示的肽对于HLA-A*02:01的MFI显示1.5以上，以序列编号3～14和24～30表示的肽对于HLA-A*24:02的MFI显示1.5以上，以序列编号4～14表示的肽对于HLA-A*02:01和HLA-A*24:02两者的MFI显示1.5以上。
[表5]
表5：HLA结合试验的结果
实验例11:使用HLA-A*02:01基因导入小鼠和HLA-A*24:02基因导入小鼠的体内的 CTL诱导能力的评价
对实验例10中对于HLA-A*02:01和/或HLA-A*24:02的MFI在1.5以上的来源于ASB4的肽，通过使用HLA-A*02:01基因导入小鼠和/或HLA-A*24:02基因导入小鼠的体内的CTL诱导试验对其CTL诱导能力进行了评价。
HLA-A*02:01基因导入小鼠(C57BL/6CrHLA-A2.1DR1)是缺失小鼠的MHC并表达作为人的MHC的HLA-A*02:01和HLA-DRB1*01:01的小鼠，通过使用该小鼠，可筛选能够在人体中诱导CTL的肽。此外，HLA-A*24:02基因导入小鼠是表达作为人的MHC的HLA-A*24:02的小鼠，通过使用该小鼠，可筛选能够在人体中诱导CTL的肽。于是，各肽是否具有CTL诱导活性根据通过向上述小鼠给予肽是否诱导可与给予肽反应的T细胞进行判断。
具体来说，如下进行。首先，将肽用二甲亚砜溶解至80mg/mL后，用注射用水稀释，与等量的弗氏不完全佐剂(ISA51VG)混合，乳液化。经乳液化的肽以250μg/处的使用量向小鼠的尾根部皮内的2处给药。1周后，通过CO2气体使小鼠安乐死后，取出脾脏，制备脾细胞。IFNγ产生的测定使用IFNγELISPOT测试试剂盒(碧迪公司(ベクトン·ディッキンソン社)制)。脾细胞制备的前一天，将ELISPOT板用抗IFNγ抗体处理，当天用含10％FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的脾细胞以0.25～1.0×106个/孔接种至经封闭的ELISPOT板。将给予的来源于ASB4的肽用DMSO溶解至40mg/mL，再用10％RPMI1640培养基稀释至20μg/mL。将经稀释的肽以50μL/孔添加至来源于给予了该肽的动物的脾细胞。将添加了肽的脾细胞在37℃、5％CO2下培养16～18小时，从而施加体外的肽再刺激。培养后除去上清，按照所附的实验方法使ELISPOT板显色。显色的斑点数通过KS-ELISPOT测定。
IFNγELISPOT测试的结果示于图1～38。
本试验的结果是，来源于HLA-A*02:01基因导入小鼠的脾细胞中，确认产生肽特异性的IFNγ，从而可知以序列编号4～12和15～23表示的来源于ASB4的各肽具有CTL诱导能力。此外，来源于HLA-A*24:02基因导入小鼠的脾细胞中，确认产生肽特异性的IFNγ，从而可知以序列编号4～9、13、14、25、26和28～30表示的来源于ASB4的肽具有CTL诱导能力。因此，显示以序列编号4～9表示的来源于ASB4的各肽在HLA-A02型和HLA-A24型这两种对象中具有CTL诱导能力。
实验例12:采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价
实验例13中，对于确认在HLA-A02型和HLA-A24型这两种对象中具有CTL诱导能力的以序列编号4～9表示的6种肽，对通过该肽的刺激是否可由来源于健康人的外周血单核细胞诱导肽特异性T细胞进行了评价。
具体来说，将来源于HLA-A*02:01阳性或HLA-A*24:02阳性的健康人的外周血单核细胞(细胞技术有限公司(Cellular Technology Limited社)制)用含10％来源于人的血清的AIM-V培养基悬浮后，接种约1×105个至U型底96孔板的各孔，在37℃、5％CO2下培养。这时，添加100U/mL人IL-2和20μg/mL肽。每3天或4天更换1次培养基，约2周后实施IFNγELISPOT测试。测试的前一天，将ELISPOT板用抗IFNγ抗体处理，当天用含10％来源于胎牛的血清的RPMI1640培养基在室温下封闭约2小时。将培养中的人外周血单核细胞用含10％来源于人的血清的AIM-V培养基清洗，将3分之1的量接种至经封闭的ELISPOT板的各孔。在37℃、5％CO2下培养，16～18小时后除去上清，按照所附的实验方法使ELISPOT板显色。显色的斑点数通过细胞技术有限公司制ELISPOT分析仪测定。
利用HLA-A*02:01阳性PBMC对序列编号4、5、6、8和9进行评价的结果示于图39、40、41、42和43，利用HLA-A*24:02阳性PBMC对序列编号5和8进行评价的结果示于图44和45。纵轴表示各孔中确认的斑点数，横轴表示阳性的孔编号。此外，黑柱表示在肽刺激条件下检测到的斑点数，白柱表示在肽非刺激条件下检测到的斑点数(对照)。即，黑柱和白柱的差表示肽特异性的斑点。
本试验的结果是发现以序列编号4、5、6、8和9表示的肽通过HLA-A*02:01阳性或HLA-A*24:02阳性的来源于健康人的外周血单核细胞诱导对这些肽特异性的CTL。
此外，显示以序列编号5和8表示的来源于ASB4的各肽在HLA-A02型和HLA-A24型这两种对象中具有CTL诱导能力。
工业上利用的可能性
本发明对被癌症干细胞实际抗原递呈的来源于ASB4的天然肽进行鉴定，从而通过肽疫苗诱导的CTL可靠地杀伤癌细胞，有助于效果好的癌症疫苗的开发。此外，根据所鉴定的癌症干细胞特异性天然肽，可特别限定癌症干细胞中特异性表达ASB4，所以可将ASB4作为标记物特别限定癌症干细胞。另外，来源于该基因的天然抗原肽可用作即使少量也具有良好效果的癌症的预防和/或治疗剂。此外，通过本发明，可提供具有CTL的诱导活性的来源于ASB4的肿瘤抗原肽等。本发明的肽可用作癌症的预防和/或治疗剂。
序列表
<110> 北海道公立大学法人札幌医科大学
大日本住友制药株式会社
<120> 肿瘤抗原肽
<130> PCT2751DN
<150> JP 2014-249169
<151> 2014-12-09
<160> 56
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1281
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
atggacggca ccactgcccc tgtcactaaa tctggagctg ccaagttagt taagagaaat 60
ttccttgagg cgctaaagtc caatgacttc ggaaaattga aggctatttt gatccaaagg 120
caaatagatg tggacactgt ttttgaagtc gaagatgaga atatggtttt ggcatcttat 180
aaacaaggtt actggttgcc tagctataaa ttgaagtctt cctgggccac aggcctccat 240
ctctctgtct tgtttggcca tgtggaatgt cttctggtgc tactggacca caatgctaca 300
atcaactgta gacccaatgg gaaaacccct cttcacgtgg cttgtgaaat ggccaatgtg 360
gattgtgtta agatcctctg tgatcgtggg gcaaagctca attgctactc cttaagtgga 420
cacacagctt tgcacttttg tacaactcca agttccattc tctgtgccaa gcaattggtt 480
tggagagggg cgaatgtgaa catgaagacc aacaaccaag atgaggagac gcccttgcac 540
acggctgccc acttcggcct ttcggagctg gtggccttct acgtggaaca cggggccata 600
gtggacagcg tgaatgccca catggagacc cccctggcca tcgccgccta ctgggccctc 660
cgctttaagg agcaggagta cagcacggag caccacctgg tctgccgcat gctgcttgac 720
tacaaagccg aagtcaatgc ccgagatgac gactttaaat ctcccctcca caaggcagcc 780
tggaactgtg accacgtgct catgcacatg atgctggaag ctggcgccga agccaatctc 840
atggatatca acggctgtgc tgccatccag tacgtgctga aggtcacctc cgtgcgccct 900
gctgcccagc ctgagatctg ctaccagctc ctgttgaacc atggggctgc ccgaatatac 960
cctccacagt tccataaggt gatacaggcc tgccattctt gtcctaaagc aattgaagtt 1020
gtagtcaatg cctatgaaca catcagatgg aacacaaagt ggagaagagc tatccccgat 1080
gatgacttgg agaaatactg ggatttttac cactctctct ttactgtgtg ctgtaactct 1140
ccaaggactc tcatgcactt atcgagatgt gccattagaa gaacattaca caacagatgc 1200
catagagcaa ttcctttgct ttccctccca ttgtcattga aaaagtactt gcttttagag 1260
ccagagggaa ttatttatta a 1281
<210> 2
<211> 426
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Asp Gly Thr Thr Ala Pro Val Thr Lys Ser Gly Ala Ala Lys Leu
1 5 10 15
Val Lys Arg Asn Phe Leu Glu Ala Leu Lys Ser Asn Asp Phe Gly Lys
20 25 30
Leu Lys Ala Ile Leu Ile Gln Arg Gln Ile Asp Val Asp Thr Val Phe
35 40 45
Glu Val Glu Asp Glu Asn Met Val Leu Ala Ser Tyr Lys Gln Gly Tyr
50 55 60
Trp Leu Pro Ser Tyr Lys Leu Lys Ser Ser Trp Ala Thr Gly Leu His
65 70 75 80
Leu Ser Val Leu Phe Gly His Val Glu Cys Leu Leu Val Leu Leu Asp
85 90 95
His Asn Ala Thr Ile Asn Cys Arg Pro Asn Gly Lys Thr Pro Leu His
100 105 110
Val Ala Cys Glu Met Ala Asn Val Asp Cys Val Lys Ile Leu Cys Asp
115 120 125
Arg Gly Ala Lys Leu Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Gly His Thr Ala Leu
130 135 140
His Phe Cys Thr Thr Pro Ser Ser Ile Leu Cys Ala Lys Gln Leu Val
145 150 155 160
Trp Arg Gly Ala Asn Val Asn Met Lys Thr Asn Asn Gln Asp Glu Glu
165 170 175
Thr Pro Leu His Thr Ala Ala His Phe Gly Leu Ser Glu Leu Val Ala
180 185 190
Phe Tyr Val Glu His Gly Ala Ile Val Asp Ser Val Asn Ala His Met
195 200 205
Glu Thr Pro Leu Ala Ile Ala Ala Tyr Trp Ala Leu Arg Phe Lys Glu
210 215 220
Gln Glu Tyr Ser Thr Glu His His Leu Val Cys Arg Met Leu Leu Asp
225 230 235 240
Tyr Lys Ala Glu Val Asn Ala Arg Asp Asp Asp Phe Lys Ser Pro Leu
245 250 255
His Lys Ala Ala Trp Asn Cys Asp His Val Leu Met His Met Met Leu
260 265 270
Glu Ala Gly Ala Glu Ala Asn Leu Met Asp Ile Asn Gly Cys Ala Ala
275 280 285
Ile Gln Tyr Val Leu Lys Val Thr Ser Val Arg Pro Ala Ala Gln Pro
290 295 300
Glu Ile Cys Tyr Gln Leu Leu Leu Asn His Gly Ala Ala Arg Ile Tyr
305 310 315 320
Pro Pro Gln Phe His Lys Val Ile Gln Ala Cys His Ser Cys Pro Lys
325 330 335
Ala Ile Glu Val Val Val Asn Ala Tyr Glu His Ile Arg Trp Asn Thr
340 345 350
Lys Trp Arg Arg Ala Ile Pro Asp Asp Asp Leu Glu Lys Tyr Trp Asp
355 360 365
Phe Tyr His Ser Leu Phe Thr Val Cys Cys Asn Ser Pro Arg Thr Leu
370 375 380
Met His Leu Ser Arg Cys Ala Ile Arg Arg Thr Leu His Asn Arg Cys
385 390 395 400
His Arg Ala Ile Pro Leu Leu Ser Leu Pro Leu Ser Leu Lys Lys Tyr
405 410 415
Leu Leu Leu Glu Pro Glu Gly Ile Ile Tyr
420 425
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Ile Tyr Pro Pro Gln Phe His Lys Val
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
His Leu Ser Val Leu Phe Gly His Val
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Ser Val Leu Phe Gly His Val Glu Cys Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Lys Ile Leu Cys Asp Arg Gly Ala Lys Leu
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 7
Ile Leu Cys Asp Arg Gly Ala Lys Leu
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 8
His Phe Gly Leu Ser Glu Leu Val Ala Phe Tyr Val
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 9
Cys Tyr Ser Leu Ser Gly His Thr Ala Leu
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 10
Val Leu Phe Gly His Val Glu Cys Leu Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 11
His Val Glu Cys Leu Leu Val Leu Leu
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 12
Cys Tyr Gln Leu Leu Leu Asn His Gly Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 13
Ala Ala Gln Pro Glu Ile Cys Tyr Gln Leu Leu
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
Pro Leu Leu Ser Leu Pro Leu Ser Leu
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 15
Ala Ile Leu Ile Gln Arg Gln Ile Asp Val
1 5 10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Leu Val Leu Leu Asp His Asn Ala Thr Ile
1 5 10
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Ser Ile Leu Cys Ala Lys Gln Leu Val
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Gly Leu Ser Glu Leu Val Ala Phe Tyr Val
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Arg Met Leu Leu Asp Tyr Lys Ala Glu Val
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
His Val Leu Met His Met Met Leu Glu Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Leu Met Asp Ile Asn Gly Cys Ala Ala Ile
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 22
Thr Leu Met His Leu Ser Arg Cys Ala Ile
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 23
Tyr Leu Leu Leu Glu Pro Glu Gly Ile Ile
1 5 10
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 24
Ala Thr Gly Leu His Leu Ser Val Leu Phe
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 25
Ala Phe Tyr Val Glu His Gly Ala Ile Phe
1 5 10
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 26
Pro Leu Ala Ile Ala Ala Tyr Trp Ala Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 27
Ile Gln Tyr Val Leu Lys Val Thr Ser Val
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 28
Arg Ile Tyr Pro Pro Gln Phe His Lys Val
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 29
Lys Tyr Trp Asp Phe Tyr His Ser Leu Phe Thr Val
1 5 10
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 30
Lys Tyr Trp Asp Phe Tyr His Ser Leu
1 5
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 31
Lys Leu Val Lys Arg Asn Phe Leu Glu Ala Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 32
Asp Phe Gly Lys Leu Lys Ala Ile Leu
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Gln Ile Asp Val Asp Thr Val Phe Glu Val
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 34
Phe Glu Val Glu Asp Glu Asn Met Val Leu
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 35
Gly Tyr Trp Leu Pro Ser Tyr Lys Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 36
Lys Leu Lys Ser Ser Trp Ala Thr Gly Leu
1 5 10
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
His Phe Cys Thr Thr Pro Ser Ser Ile Leu
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 38
Lys Gln Leu Val Trp Arg Gly Ala Asn Val
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 39
Met Leu Glu Ala Gly Ala Glu Ala Asn Leu
1 5 10
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 40
Gln Tyr Val Leu Lys Val Thr Ser Val
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Leu Leu Leu Asn His Gly Ala Ala Arg Ile
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Leu Leu Asn His Gly Ala Ala Arg Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Val Val Val Asn Ala Tyr Glu His Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Asp Phe Tyr His Ser Leu Phe Thr Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Ala Ile Pro Leu Leu Ser Leu Pro Leu
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
Ser Leu Pro Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Leu
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<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu
1 5
<210> 51
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
Gly Tyr Ile Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Thr Ser Lys
1 5 10
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
accacagtcc atgccatcac 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
tccaccaccc tgttgctgta 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
ctgtcttgtt tggccatgtg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 56
gcgtctcctc atcttggttg 20

Claims (42)

1.一种以
Y0-X0-Z0
表示的癌症干细胞特异性抗原肽，其中，
X为以下的(1)～(4)：
(1)由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，
(2)(1)的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽，
(3)由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～14个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，或者
(4)(3)的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽
中的任一个；
Y0和Z0相互独立为由0个～数个氨基酸形成的肽。
2.如权利要求1所述的抗原肽，其特征在于，
X为以下的(1')～(4')：
(1')由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～11个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，
(2')(1')的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的肽，
(3')由ASB4蛋白质的氨基酸序列中的连续的8～11个氨基酸形成的自N末端起第2个的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的ASB4蛋白质的部分肽，或者
(4')(3')的部分肽中自N末端起第2个的氨基酸被置换为酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的肽
中的任一个；
Y0和Z0相互独立为0个或1个氨基酸，或者由0～3个氨基酸形成的肽为由0～3个氨基酸形成的肽；在此，Y0-X0-Z0整体为长度9～14个氨基酸的ASB4蛋白质的部分肽或者其X0同源物。
3.如权利要求1或2所述的抗原肽，其中，X0由以序列编号3～7、9～19、21～28、30～46中的任一个表示的氨基酸序列形成。
4.如权利要求1或2所述的抗原肽，其中，X0由以序列编号3～7、9～19、21～28、30～46中的任一个表示的氨基酸序列形成，Y0和Z0不存在。
5.如权利要求1或2所述的抗原肽，其中，X0由以序列编号3～7、9～11、13～19、21～23和26～28、30～46中的任一个表示的氨基酸序列中自N末端起第2个的氨基酸被置换为甲硫氨酸、亮氨酸或异亮氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸的氨基酸序列形成，Y0和Z0不存在。
6.如权利要求1或2所述的抗原肽，其中，X0由以序列编号3、5～7、9～14、16、19、21～26、28、30～32、34～37和39～46中的任一个表示的氨基酸序列中自N末端起第2个的氨基酸被置换为甲硫氨酸或酪氨酸且/或C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸的氨基酸序列形成，Y0和Z0不存在。
7.如权利要求1或2所述的抗原肽，其中，X0为权利要求4～6中的任一项所述的X0，Y0或Z0中的任一方为1个氨基酸，另一方不存在。
8.如权利要求1～3中的任一项所述的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号4、6、7、10、14、15、17～19、21～23、26、28、31、33、36、39、41、42、45和46中的任一个表示的氨基酸序列形成。
9.如权利要求1～3中的任一项所述的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号9、21、25、30、32、35和37中的任一个表示的氨基酸序列形成。
10.如权利要求1～3中的任一项所述的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号4～12和15～23中的任一个表示的氨基酸序列形成。
11.如权利要求1～3中的任一项所述的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号3～9、13、14、25、26和28～30中的任一个表示的氨基酸序列形成。
12.如权利要求1～3中的任一项所述的抗原肽，其中，以Y0-X0-Z0表示的肽由以序列编号4～9中的任一个表示的氨基酸序列形成。
13.一种多条表位肽连结而成的多表位肽，其中，作为该表位肽，包含至少1条权利要求1～12中的任一项所述的肽。
14.一种癌症干细胞检测剂，其中，包含用于检测ASB4基因的表达产物的ASB4检测剂。
15.如权利要求14所述的癌症干细胞检测剂，其中，该检测剂用于在包含来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、大肠和血液的1种或2种以上的活体试样的细胞的细胞群中检测癌症干细胞。
16.如权利要求14或15所述的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4基因的表达产物为mRNA和/或内源性多肽。
17.如权利要求14～16中的任一项所述的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4基因的表达产物为mRNA，包括通过RT-PCR法进行检测。
18.如权利要求14～16中的任一项所述的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4基因的表达产物为内源性多肽，包括通过与该内源性多肽特异性反应的ASB4检测剂进行检测。
19.如权利要求18所述的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4检测剂为抗体。
20.如权利要求14～17中的任一项所述的癌症干细胞检测剂，其中，ASB4检测剂是用于检测作为ASB4基因的表达产物的mRNA的具有与所述基因互补的碱基序列的探针和/或引物。
21.一种在检查对象中检测癌症干细胞的方法，其中，使用权利要求14～20中的任一项所述的癌症干细胞检测剂。
22.一种癌症治疗药的筛选方法，其中，包括：
(i)在将癌症治疗药的候选化合物给予对象之前，测定该对象中的ASB4基因的表达产物的检测量A的工序；
(ii)在将所述候选化合物给予所述对象的细胞群之后，测定该对象中的ASB4基因的表达产物的检测量B的工序；以及
(iii)比较所述检测量A与B，该检测量A显著大于B的情况下，将所述候选化合物判定为具有以癌症干细胞为靶的特征的候选癌症治疗药的工序。
23.一种多聚核苷酸，其中，该多聚核苷酸编码权利要求1～12中的任一项所述的抗原肽或权利要求12所述的多表位肽中的至少1个。
24.一种表达载体，其中，包含权利要求23所述的多聚核苷酸。
25.一种基因导入用组合物，其中，包含权利要求24所述的表达载体。
26.一种医药组合物，其中，
包含以下的(a)～(d)中的任一个作为有效成分：
(a)权利要求1～12中的任一项所述的抗原肽或权利要求12所述的多表位肽，
(b)权利要求23所述的多聚核苷酸，
(c)权利要求24所述的表达载体，
(d)ASB4蛋白质、编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸或包含该多聚核苷酸的表达载体。
27.一种医药组合物，其中，包含权利要求1～12中的任一项所述的抗原肽和/或权利要求13所述的多表位肽作为有效成分。
28.如权利要求26或27所述的医药组合物，其中，还包含佐剂。
29.如权利要求26～28中的任一项所述的医药组合物，其中，所述组合物是癌症的预防和/或治疗剂。
30.如权利要求26～29中的任一项所述的医药组合物，其中，所述组合物是癌症的预防和/或治疗用疫苗。
31.一种细胞毒性T淋巴细胞的诱导剂，其中，
含有以下的(a)～(d)中的任一个作为有效成分：
(a)权利要求1～12中的任一项所述的抗原肽或权利要求12所述的多表位肽，
(b)权利要求23所述的多聚核苷酸，
(c)权利要求24所述的表达载体，
(d)ASB4蛋白质、编码ASB4蛋白质的多聚核苷酸或包含该多聚核苷酸的表达载体。
32.一种抗原递呈细胞的制造方法，其中，包括使
(A)权利要求1～12中的任一项所述的抗原肽或权利要求12所述的多表位肽、或者
(B)编码所述(A)的肽和/或多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸
与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触。
33.一种细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法，其中，包括使
(A)权利要求1～12中的任一项所述的抗原肽或权利要求12所述的多表位肽、或者
(B)编码所述(A)的抗原肽和/或多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸
与外周血淋巴细胞在体外接触。
34.一种HLA多聚体，其中，该多聚体包含权利要求1～12中的任一项所述的抗原肽和HLA。
35.一种诊断药物，其中，包含权利要求34所述的HLA多聚体。
36.一种抗体，其中，该抗体识别权利要求1～12所述的抗原肽。
37.一种T细胞受体样抗体，其中，该抗体识别权利要求1～12所述的抗原肽与HLA的复合物。
38.一种肿瘤检测剂，其中，含有权利要求36所述的抗体和/或权利要求37所述的T细胞受体样抗体。
39.一种嵌合抗原受体，其中，该受体识别权利要求1～12所述的抗原肽与HLA的复合物。
40.一种人工CTL，其中，包含识别权利要求1～12所述的抗原肽与HLA的复合物的T细胞受体。
41.一种用于筛选使用权利要求26～30中的任一项所述的医药组合物的癌症处置方法有效的治疗对象患者的诊断药物，其中，包含权利要求14～20中的任一项所述的癌症干细胞检测剂、权利要求34所述的HLA多聚体、权利要求36所述的抗体和/或权利要求37所述的T细胞受体样抗体。
42.一种癌症干细胞特异性的抗原肽，其中，该抗原肽由以序列编号3～30中的任一个表示的氨基酸序列形成。
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