CN108699111A - Mphosph1衍生的肽和包含它们的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有诱导细胞毒性T细胞的能力的MPHOSPH1衍生的表位肽。本发明还提供编码所述肽的多核苷酸，呈递所述肽的抗原呈递细胞，和靶向所述肽的细胞毒性T细胞，以及诱导抗原呈递细胞或CTL的方法。本发明还提供了含有它们作为活性成分的组合物和药物组合物。此外，本发明提供了使用本发明的肽、多核苷酸、抗原呈递细胞、细胞毒性T细胞或药物组合物来治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法。还提供了诱导针对癌症的免疫应答的方法。

Description

MPHOSPH1衍生的肽和包含它们的疫苗
技术领域
发明涉及生物科学领域，更具体的说涉及癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗有效的新肽，使用所述肽治疗和/或预防肿瘤的方法，以及包含所述肽的药物组合物。
发明背景
已知CD8-阳性细胞毒性T细胞(CTL)识别呈递在细胞表面表达的主要组织相容性复合物(MHC)I类分子上的肿瘤相关抗原(TAA)所衍生的表位肽，并然后杀死肿瘤细胞。从发现黑素瘤抗原(MAGE)家族以来，已经通过免疫学方法发现了许多TAA(NPL1:Boon T,Int JCancer 1993,54(2):177-80；NPL2:Boon T&van der Bruggen P,J Exp Med 1996,183(3):725-9)。这些TAAs中的一部分目前正在作为免疫治疗靶标进行临床开发。
在众多TAA中的数个中，鉴定了可以被CTL识别的表位肽，并且预期它们在用于各种癌症类型的免疫疗法中的应用(NPL3:Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996,88(20):1442-55；NPL4:Butterfield LH et al.,Cancer Res 1999,59(13):3134-42；NPL5:Vissers JL et al.,Cancer Res 1999,59(21):5554-9；NPL6:van der Burg SH et al.,JImmunol 1996,156(9):3308-14；NPL7:Tanaka F et al.,Cancer Res 1997,57(20):4465-8；NPL8:Fujie T et al.,Int J Cancer 1999,80(2):169-72；NPL9:Kikuchi M et al.,Int J Cancer 1999,81(3):459-66；NPL10:Oiso M et al.,Int J Cancer 1999,81(3):387-94)。到目前为止，已经报道了使用这些TAA衍生的表位肽的几项临床试验。然而不幸的是，许多临床试验的响应率并不高(NPL11:Belli F et al.,J Clin Oncol 2002,20(20):4169-80；NPL12:Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002,188:33-42；NPL13:Rosenberg SAet al.,Nat Med 2004,10(9):909-15)。因此，仍然需要鉴定可应用于癌症免疫疗法的新的CTL表位肽。
MPHOSPH1(M期磷蛋白1)；参考序列：GenBank登录号NM_016195(SEQ ID NO:185)或NM_001284259(SEQ ID NO:187))已经鉴定为在G2/M转换期特异性磷酸化的蛋白并且表征为细胞周期促进性驱动蛋白相关蛋白。尤其是，据报道，MPHOSPH1是具有分裂促进作用的分子马达，其在细胞质分裂期间起重要作用(NPL14:Abaza A et al.,J Biol Chem 2003,278:27844-52)。另一方面，通过使用含有27,648个基因的全基因组cDNA微阵列中的基因表达谱，MPHOSPH1已经鉴定为在膀胱癌中上调的新的分子(NPL15:Kanehira M et al.,Cancer Res 2007,67(7):3276-85)。另外，在Northern印记分析中，MPHOSPH1基因产物在睾丸以外的正常重要器官中不表达。此外，通过siRNA的MPHOSPH1表达的下调导致膀胱癌细胞系的细胞增殖的抑制(PTL1:WO2006/085684；PTL2:WO2008/023842)。
最近，已经鉴定了MPHOSPH1衍生的HLA-A02-限制性CTL表位肽(PTL3:WO2013/024582；PTL4:WO2008/047473)和HLA-A24-限制性CTL表位肽(PTL4:WO2008/047473)。可以在患有HLA-A02型或HLA-A24型的癌症患者中预期这些肽的疗效，但不能预期在其它癌症患者中的疗效。
[引用列表]
[专利文献]
[PTL 1]WO2006/085684
[PTL 2]WO2008/023842
[PTL 3]WO2013/024582
[PTL 4]WO2008/047473
[非专利文献]
[NPL 1]Boon T,Int J Cancer 1993,54(2):177-80
[NPL 2]Boon T&van der Bruggen P,J Exp Med 1996,183(3):725-9
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[NPL 10]Oiso M et al.,Int J Cancer 1999,81(3):387-94
[NPL 11]Belli F et al.,J Clin Oncol 2002,20(20):4169-80
[NPL 12]Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002,188:33-42
[NPL 13]Rosenberg SA et al.,Nat Med 2004,10(9):909-15
[NPL 14]Abaza A et al.,J Biol Chem 2003,278:27844-52
[NPL 15]Kanehira M et al.,Cancer Res 2007,67(7):3276-85
发明概述
本发明涉及可以诱导与表达MPHOSPH1的细胞特异性反应的CTL的肽。当这些肽与人白细胞抗原(HLA)形成复合物并通过将所述复合物呈递至其表面的抗原呈递细胞(APC)呈递至CD8阳性T细胞时，诱导出显示肽特异性细胞毒性活性的CTL。迄今已鉴定的具有CTL诱导能力(CTL诱导力)的MPHOSPH1衍生肽是HLA-A02-限制性肽或HLA-A24-限制性肽，并且当抗原呈递细胞不表达这些HLA时不能诱导CTL。因此，常规肽不适合在不具有这些HLA的受试者中进行免疫治疗。HLA-A11和HLA-A33是亚洲人常见的等位基因(Cao K et al.,HumImmunol 2001；62(9):1009-30)，并且期望将HLA-A11-限制性肽施用至HLA-A11阳性受试者和将HLA-A33-限制性肽施用至HLA-A33阳性受试者。因此，本发明涉及MPHOSPH1衍生肽，其具有对HLA-A11或HLA-A33限制性的CTL诱导能力。基于本文公开的结果，已经证明本发明的肽是表位肽，其能够诱导针对表达MPHOSPH1和HLA-A11或HLA-A33的癌细胞的特异性和强力的免疫应答。
因此，本发明的目的之一是提供能够以HLA-A11或HLA-A33限制性方式诱导CTL的MPHOSPH1衍生肽。这些肽可以用于体外、离体或体内诱导CTL，或可用于施用至受试者用于诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫应答的目的。优选的肽是包含选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170；更优选的肽是九肽或十肽；和甚至更优选的肽是由选自以下的氨基酸序列组成的肽SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170。
本发明的肽包含以下肽，其中一个，两个或更多个氨基酸被取代，缺失，插入和/或添加，只要所得修饰肽保留了原始肽的CTL诱导能力。
本发明还提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的任一种肽。与本发明的肽类似，这些多核苷酸可用于诱导具有CTL诱导能力的APC，并可施用至受试者用于诱导针对MPHOSPH1表达的癌细胞的免疫应答。
本发明也提供了包含本发明的一种或多种类型的肽，编码本发明的一种或多种类型的肽的一种一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL。本发明的组合物优选是药物组合物。本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防癌症，以及防止其手术后复发。它们还可以用于诱导针对癌症的免疫应答。当施用于受试者时，本发明的肽呈递于APC的表面上，结果诱导了靶向肽的CTL。因此，本发明的另一个目的是提供用于诱导CTL的组合物，其中组合物包含一种或多种类型的本发明的肽，编码一种或多种类型的本发明的肽的一种或多种类型的多核苷酸，本发明的APC，和/或呈递本发明的肽的外来体。
本发明的另一个目的是提供诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其中所述方法包括将本发明的一种或多种类型的肽与APC接触的步骤，或将编码本发明的任何一种肽的多核苷酸引入APC的步骤。
本发明还提供了诱导CTL的方法，包括将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的APC共培养的步骤，将CD8-阳性T细胞与在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的外来体共培养的步骤，或将载体引入CD8-阳性T细胞的步骤，所述载体包含编码T细胞受体(TCR)的每个亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合由细胞表面上的HLA抗原所呈递的本发明的肽。本发明中优选的HLA抗原是HLA-A11或HLA-A33。
本发明的另一个目的是提供分离的APC，在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物。本发明还提供靶向本发明肽的分离的CTL。这些APC和CTL可以用于针对表达MPHOSPH1的癌症的免疫治疗。在本发明中，经受免疫治疗的癌症是例如存在于具有HLA-A11或HLA-A33的纯合子或杂合子患者中的癌症。因此，APC或CTL也是具有HLA-A11或HLA-A33的纯合子或杂合子的细胞。也就是说，本发明提供了用于表达MPHOSPH1和至少一种选自HLA-A11和HLA-A33的HLA抗原的癌症的免疫治疗。
本发明的另一个目的是提供在受试者中诱导针对癌症的免疫应答的方法，其中所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物包含本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。本发明的另一个目的是提供在受试者中治疗和/或预防癌症以及预防其手术后复发的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的肽，编码所述肽的多核苷酸，本发明的APC，呈递本发明肽的外来体，和/或本发明的CTL的步骤。
除了上述之外，当结合附图和实施例阅读以下详细描述时，本发明的其它目的和特征将变得更加显而易见。然而，应当理解，本发明的前述概述和以下详细描述都是示例性实施方案，而对本发明或本发明的其它替代实施方案不是限制性的。特别地，尽管本文参照多个具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，该描述是本发明的说明，而不构成对本发明的限制。在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以想到各种修改和应用。同样地，本发明的其它目的，特征，益处和优点将从该概述和下面描述的某些实施方案中变得明显，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。从上述结合所附实施例，数据，附图和从其中得出的所有合理推断，单独或与并入本文的参考文献一同考虑，此类目的，特征，益处和优点将是显而易见的。
附图简述
图1由照片(a)至(f)组成，其显示了使用衍生自MPHOSPH1的肽诱导的细胞进行的干扰素(IFN)-gamma酶联免疫点(ELISPOT)测定的结果。图中，“+”表示针对用感兴趣的肽冲击(pulsed)的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生(阴性对照)。通过与阴性对照相比较可以看出，可以在以下观察到肽特异性IFN-gamma
使用MPHOSPH1-A11-9-762(SEQ ID NO:5)的孔#3(a)，
使用MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ ID NO:12)的孔#2(b)，
使用MPHOSPH1-A11-9-96(SEQ ID NO:27)的孔#5(c)，
使用MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)的孔#6(d)，和
使用MPHOSPH1-A11-10-1675(SEQ ID NO:53)的孔#5(e)。增殖显示出反应的细胞(图片中的框)以建立CTL系。同时，MPHOSPH1-A11-9-739(SEQ ID NO:4)(f)显示为典型阴性数据的例子，其中未观察到肽特异性IFN-gamma产生。
图2由线形图(a)至(b)组成，其显示了使用IFN-gamma酶联免疫吸附测定(ELISA)，由用MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ ID NO:12)(a)或MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)(b)刺激的CTL系产生的IFN-gamma的测量结果。这些结果显示，用这些肽的各个诱导后，建立了以肽特异性方式产生IFN-gamma的CTL系。图中，“+”表示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与刺激它们的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图3由一系列线形图(a)至(b)组成，其显示了在MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ IDNO:12)(a)或MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)(b)诱导通过有限稀释法建立的CTL克隆中的IFN-gamma产生。这些结果显示了CTL克隆的肽特异性IFN-gamma产生。图中，“+”表示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与刺激它们的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图4的线形图显示了针对表达MPHOSPH1和HLA-A*11:01两者的靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生。引入HLA-A*11:01或全长MPHOSPH1基因的靶细胞用作阴性对照。使用MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)建立的CTL克隆表现出针引入MPHOSPH1和HLA-A*11:01基因两者的COS7细胞的IFN-gamma产生(黑色菱形)。另一方面，未显示出针对引入HLA-A*11:01(三角形)和MPHOSPH1(白色圆圈)之一的COS7细胞的显著IFN-gamma产生。
图5由照片(a)至(d)组成，其显示了使用用衍生自MPHOSPH1的肽诱导的细胞进行的IFN-gamma ELISPOT测定的结果。图中，“+”表示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生(阴性对照)。
通过与阴性对照相比较可以看出，可以在以下观察到肽特异性IFN-gamma生产：
使用MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)的孔#4(a)，
使用MPHOSPH1-A33-9-1474(SEQ ID NO:119)的孔#6(b)，和
使用MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO:170)的孔8(c)。增殖显示出反应的细胞(图片中的框)以建立CTL系。同时，MPHOSPH1-A33-9-1663(SEQ ID NO:48)(d)显示为典型阴性数据的例子，其中未观察到肽特异性IFN-gamma产生。
图6由线形图(a)至(b)组成，其通过ELISA显示了由用MPHOSPH1-A33-9-608(SEQID NO:118)(a)或MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO:170)(b)刺激的CTL系产生的IFN-gamma的测量结果。这些结果显示，用各个肽诱导后，建立了以肽特异性方式产生IFN-gamma的CTL系。图中，“+”表示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；和“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与刺激它们的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图7由一系列的图(a)至(b)组成，其显示了在MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)(a)或MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO:170)(b)诱导后通过有限稀释法建立的CTL克隆中的IFN-gamma产生。这些结果显示了CTL克隆的肽特异性IFN-gamma产生。图中，“+”表示针对用感兴趣的肽冲击的靶细胞的IFN-gamma产生；并且“-”表示针对尚未用任何肽冲击的靶细胞的CTL系的IFN-gamma产生。R/S比率表示CTL系(响应细胞)的细胞数与刺激他们的靶细胞(刺激细胞)的细胞数的比率。
图8的线形图显示了针对表达MPHOSPH1和HLA-A*33:03两者靶细胞的CTL克隆的IFN-gamma产生。引入有HLA-A*33:03或全长MPHOSPH1基因的靶细胞用作阴性对照。通过使用MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)诱导建立的CTL克隆显示出针对引入有MPHOSPH1和HLA-A*33:03基因两者(黑色菱形)的COS7细胞的IFN-gamma生产。另一方面，未显示出针对引入有HLA-A*33:03(白色三角形)或MPHOSPH1(白色圆圈)之一的COS7细胞的显著的IFN-gamma产生。
发明详述
具体实施方式的说明
尽管在实施或检验本发明的实施方案中可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的特定大小，形状，尺度，材料，方法学，方案等，因为这些可以根据常规实验和优化改变。还应当理解，本说明书中使用的术语仅用于描述特定版本或实施方案的目的，并且不旨在限定本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
I.定义
除非另有明确说明，如本文中使用的词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”。
术语“分离的”和“纯化的”与物质(例如肽、抗体、多核苷酸等)相关使用时，指该物质基本上不含至少一种可以包括在天然来源中的物质。因此，分离的或纯化的肽指基本上不含另一种细胞材料，例如来自所述肽的细胞或组织来源的碳水化合物、脂质，和其它污染性蛋白质。当化学合成肽时，分离或纯化的肽是指基本上不含有前体物质或另一种化学物质的肽。短语“基本上不含细胞物质”包括肽制备物，其中所述肽与分离出该肽的或重组产生该肽的细胞的细胞组分是分离的。如此，基本上不含细胞材料的肽包括肽制备物，其含有小于约30％,20％,10％,或5％,3％,2％或1％(以干重计)的其它细胞材料。
当肽以重组方式生成时，分离或纯化的肽基本上不含有培养基，其包含肽制备物，所述肽制备物含有小于肽制备物体积的约20％,10％,或5％,或3％,2％或1％(以干重计)的培养基。
或者，当化学合成肽时，分离或纯化的肽基本上不含有前体物质或其它化学物质，并且所述基本上不含前体物质或其它化学物质的肽含有肽制备物，所述肽制备物包含小于约30％,20％,10％,5％,3％,2％或1％(以干重计)肽制备物体积的前体物质或其它化学物质。可以通过例如在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色或此类凝胶之后出现单一条带来确认肽制备物是分离的或纯化的。在优选的实施方案中，本发明的肽和多核苷酸是分离的或纯化的。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，并指氨基酸残基的聚合物。除天然存在的氨基酸聚合物外，这些术语也适用于非天然存在的氨基酸聚合物，其包含一种或多种非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括氨基酸类似物，氨基酸模拟物，以及此类。
本文所用的术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在氨基酸是细胞中那些通过遗传密码编码的，以及那些翻译后修饰的(例如羟脯氨酸，gamma-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸等)。短语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(与氢结合的alpha碳，羧基，氨基和R基团)但具有修饰的R基团或修饰的骨架的化学化合物(如，高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍等)。术语“氨基酸模拟物”指指与一般氨基酸具有不同结构但具有与氨基酸类似功能的化合物。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸，并且本发明的肽优选是L-氨基酸聚合物。
术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且是指核苷酸的聚合物。
本说明书中使用的术语“组合物”旨在包括包含指定量的指定成分的产品，以及直接或间接由指定量的指定成分的组合产生的任何产品。当组合物是药物组合物时，术语“组合物”旨在包括活性成分和惰性成分的产品，以及从任何两种或多种成分的组合，络合或聚集，从一种或多种成分的离解，或从一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产品。因此，本发明的药物组合物包括通过将本发明的化合物或细胞与药学上或生理学上可接受的载体混合而制备的任何组合物。不限于此，本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂和包封材料；并且是指药学或生理学上可接受的材料，组合物，物质或介质。
除非另有说明，术语“癌症”是指过表达MPHOSPH1基因的癌症；且其实例包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肿瘤等，但不限于此。在示例性实施方案中，“癌症”是表达MPHOSPH1和HLA-A11和/或HLA-A33的癌症。
除非另有说明，术语“细胞毒性T淋巴细胞”和“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用。除非另有明确说明，它们是指可识别非自身细胞(例如肿瘤/癌细胞，病毒感染的细胞)并诱导此类细胞的死亡的T淋巴细胞亚群。
除非另有说明，术语“HLA-A11”是指包括诸如HLA-A*11:01,HLA-A*11:02,HLA-A*11:03,和HLA-A*11:04亚型的HLA-A11型。
除非另有说明，术语“HLA-A33”是指包括诸如HLA-A*33:03,HLA-A*33:01,和HLA-A*33:04亚型的HLA-A33型。
在受试者或患者的语境中，短语“受试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A11”是指受试者或患者具有纯合或杂合的HLA-A11抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分子,并且HLA-A11抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。类似地，本文所用的短语“受试者(或患者)的HLA抗原是HLA-A33”指受试者或患者具有纯合或杂合的HLA-A33抗原基因作为MHC(主要组织相容性复合物)I类分子，且HLA-A33抗原在受试者或患者的细胞中作为HLA抗原表达。
只要本发明的方法和组合物在癌症“治疗”的语境中是有用的，则当其实现临床优势时，该治疗被认为是“有效的”，例如，在受试者中减少癌症的尺寸，扩散或转移能力，延缓癌症进展，减轻癌症的临床症状，延长存活期，抑制术后复发。当预防性地施用治疗时，“有效”是指治疗延迟或防止癌症形成，或防止或减轻癌症的临床症状。有效性是相对于任何公知的用于诊断或治疗特定肿瘤类型的方法来确定的。
只要本发明的方法和组合物用于癌症“预防(防范)”的语境中，本文中术语“预防(防范)”包括减轻与疾病相关的死亡率或发病率的负担的任何工作。预防(防范)可以在“初级，二级和三级预防(防范)水平”进行。尽管一级预防(防范)避免疾病的发展，在二级和三级水平的预防(防范)包括预防(防范)疾病进展和症状的出现，以及旨在通过恢复功能和减少疾病相关并发症来降低现有疾病的不良影响。或者，预防(防范)可以包括减轻特定病症的严重性，例如旨在减少肿瘤生长和转移的广泛的预防性治疗。
在本发明的语境中，癌症的治疗和/或预防(防范)和/或其手术后复发预防(防范)包括任一事件，例如抑制癌细胞增殖，肿瘤退化或消退，诱导癌症发展的缓解和抑制，肿瘤消退，以及减少或抑制转移，抑制癌症的术后复发和延长存活期。癌症的有效治疗和/或预防(防范)降低死亡率，改善患有癌症的个体的预后，降低肿瘤标志物的血液水平，并减轻与癌症相关的可检测的症状。例如，症状的缓解或改善构成有效的治疗和/或预防(防范)，并包括其中症状稳定或减轻10％、20％、30％或更多的病患。
在本发明的语境中，术语“抗体”是指与指定的蛋白质或其肽特异性反应的免疫球蛋白及其片段。抗体可以包括人抗体，灵长类化抗体，嵌合抗体，双特异性抗体，人源化抗体，与其他蛋白或放射性标记融合的抗体，和抗体片段。此外，本文中的“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖完整单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体，由两个或多个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展示所需的生物学活性。“抗体”可以是所有类别的抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。
除非另有说明，本文使用的技术术语和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的术语相同的含义。
II.肽
HLA-A11和HLA-A33是亚洲人常见的等位基因(Cao et al.,Hum Immunol 2001；62(9):1009-30)。因此，对于亚洲人的大量群体，治疗表达MPHOSPH1的癌症的有效方法可以通过提供HLA-A11或HLA-A33限制的的MPHOSPH1衍生的CTL诱导肽来提供。因此本发明提供了MPHOSPH1衍生肽，其能够以HLA-A11-或HLA-A33限制性方式诱导CTL。
本发明的肽是MPHOSPH1衍生肽，其能够以HLA-A11-或HLA-A33限制性方式诱导CTL。能够以HLA-A11限制性方式诱导CTL的肽包括具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽。能够以HLA-A33限制性方式诱导CTL的肽包括具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽。
具有对这些肽特异的细胞毒性活性的CTLs可以通过用这些肽冲击(pulsed)的树突细胞(DC)对T细胞体外刺激来建立。建立的CTLs显示出针对用每种肽冲击的靶细胞的特异性细胞毒性活性。
MPHOSPH1基因在癌症细胞中过表达，例如在膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肿瘤等中的癌细胞中，但在大多数正常器官中不表达。因此它是免疫疗法的极好的靶标。因此，本发明的肽可以适合用于癌症免疫疗法。优选的肽是九肽(由9个氨基酸残基组成的肽)或十肽(由10个氨基酸残基组成的肽)，并且更为优选的是由选自以下氨基酸序列组成的组的肽：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170。例如具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的肽适于诱导显示针对表达HLA-A11和MPHOSPH1细胞的特异细胞毒性活性的CTL，并可以适合用于HLA-A11阳性患者的癌症免疫疗法。另外，例如，具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的肽适于诱导显示出针对表达HLA-A33和MPHOSPH1的细胞的特异性细胞毒性活性的CTL，并且可以适合用于针对HLA-A33阳性患者的癌症免疫疗法。在更优选的实施方案中，本发明的肽是由选自SEQ ID NO:52和118的氨基酸序列组成的肽。
对于本发明的肽，可以值得另外的氨基酸残基以附加(adjoin)本发明的肽的氨基酸序列，只要得到的肽保留原始肽的CTL诱导能力即可。另外的氨基酸残基可以由任何类型的氨基酸组成，只要它们不损害原始肽的CTL诱导能力即可。因此，本发明的肽包含具有CTL诱导能力的肽，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170。此类肽例如少于约40个氨基酸，在许多情况下少于约20个氨基酸，并通常少于约15个氨基酸。因此，如果原始肽是九肽，则本发明的肽包含10个氨基酸长或11-40个氨基酸长的肽，其通过将另外的氨基酸附加至所述肽产生。此外，如果原始肽是十肽，则本发明的肽包含11-40个氨基酸长的肽。此类肽可以是(例如)11-20个氨基酸长的肽或11-15个氨基酸长的肽。另外的氨基酸残基的优选实例为在MPHOSPH1的全长氨基酸序列中邻接本发明的肽的氨基酸序列的氨基酸残基(例如SEQ ID NO:186或188)。因此，本发明的肽包括含有选自以下氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170，并且其中所述肽是MPHOSPH1的肽片段并具有CTL诱导活性。
一般而言，某些肽中一个，两个或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能，或在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中一个、两个或数个氨基酸残基修饰(即取代、添加、缺失和/或插入)的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1984,81:5662-6；Zoller and Smith,Nucleic Acids Res 1982,10:6487-500；Dalbadie-McFarland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽可以是包含以下氨基酸序列的肽，其选自SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170的氨基酸序列的一个，两个或数个氨基酸残基被取代，缺失，插入和/或添加，并具有CTL诱导活性。
本领域技术人员可以认识到对氨基酸序列的个别取代(其改变了单个氨基酸或少数百分比的氨基酸)倾向于导致原始氨基酸侧链的特性的保留。其通常被称作“保守取代”或“保守修饰”；且通过“保守取代”或“保守修饰”对蛋白质的修饰可以导致修饰的蛋白具有与原蛋白相似的功能。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。功能上相似的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、和具有以下共同官能团或特征的侧链：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含羟基侧链(S、T、Y)；含硫原子侧链(C、M)；含羧酸和酰胺侧链(D、N、E、Q)；含碱侧链(R、K、H)；和含芳香侧链(H、F、Y、W)。另外，以下八组各自含有本领域认可互为保守替代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins 1984)。
此类保守修饰肽也被包含在本发明的肽中。然而，本发明的肽不限于此，并可包括非保守修饰，只要该肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不排除衍生自MPHOSPH1的多态性变体、种间同源物、和等位基因的可诱导CTL的肽。
只要肽保留原始肽的CTL诱导能力，可以修饰(即取代，缺失，插入和/或添加)少数(例如，1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。这里，术语“数个”意指5个以下的氨基酸，如4个或3个或更少。被修饰的氨基酸的百分比优选为20％或更少，更优选15％或更少，进一步更优选10％或更少，例如1至5％。
当在癌症免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应当呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。因此，优选的是本发明的肽拥有对HLA抗原的高结合亲和力。为此目的，可以对肽通过取代、缺失、插入和/或添加氨基酸残基来修饰以产生具有改善结合亲和力的修饰肽。由于通过结合HLA抗原而被展示的肽的序列规律是已知的(Falk,等人,Immunogenetics 1994 40 232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52:501-9；Takiguchi,等人,Tissue Antigens 2000:55:296-302.)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的肽。
例如，在具有对HLA I类分子具有结合亲和力的肽中，自N端起的第二个氨基酸和C末端氨基酸通常是参与结合至HLA I类的锚定残基(Rammensee HG,等人,Immunogenetics.1995；41(4):178-228.)。例如，对于HLA-A11，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸作为N末端的第二个氨基酸，赖氨酸和精氨酸作为C末端氨基酸被认为是对HLA-A11具有高结合亲和力的锚定残基(Falk,等人,Immunogenetics 1994,40:232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52:501-9)。
此外，在HLA-A11中，在N末端的3和7位有辅助锚定残基；并且已知亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸和丙氨酸优选作为从N末端开始的第三个氨基酸，且亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸和苯丙氨酸优选作为从N末端开始的第七个氨基酸(Falk,等人,Immunogenetics 1994,40:232-41；Chujoh,等人,Tissue Antigens 1998:52:501-9)。因此，为了增强HLA-A11结合亲和力，有可能期望用苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸取代自N端起的第二个氨基酸，和/或用赖氨酸或精氨酸取代C末端的氨基酸。此外，还可能期望用亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸取代自N端起的第三个氨基酸，和/或用亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸取代自N端起的第七个氨基酸。
因此，具有CTL诱导能力的肽包含氨基酸序列，其中在选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸；自N端起的第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸；自N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸；和/或用精氨酸取代C末端氨基酸包含于本发明的肽中。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸；自N端起的第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸；自N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸；和/或用精氨酸取代C末端氨基酸。
即，本发明的肽包含具有CTL诱导能力的肽，其中将选自以下(a)至(d)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，或酪氨酸；
(b)自N端起的第三个氨基酸被取代为亮氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，异亮氨酸或丙氨酸；
(c)自N端起的第七个氨基酸被取代为亮氨酸，异亮氨酸，酪氨酸，缬氨酸或苯丙氨酸；和
(d)C末端氨基酸被取代为精氨酸。
在优选的实施方式中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸组成的肽，其中将选自以上(a)至(d)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列中。在本发明中，优选的取代数目是选自以上(a)至(d)的1,2,3或4个取代。
本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中，在选自SEQ IDNOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中，在选自SEQ IDNOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸或酪氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为精氨酸。即，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列肽，其中将选自以下(a)和(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列之中：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，或酪氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为精氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中将选自以上(a)至(b)的一个或多个取代引入选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列中。在更优选的实施方案中，自N端起的第二个氨基酸被苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，或亮氨酸取代。
在HLA-A33中，对于自N端起的第二个氨基酸的苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，和对于C末端氨基酸的赖氨酸和精氨酸已知是对HLA-A33具有高结合亲和力的锚定残基(Falk,et al.,Immunogenetics 1994,40:232-41；Takiguchi,et al.,Tissue Antigens 2000,55:296-302)。此外，在HLA-A33中，自N端起的第一个氨基酸残基也已知作为锚定残基，并且已知天冬氨酸和谷氨酸优选作为自N端起的第一个氨基酸(Falk,et al.,Immunogenetics 1994,40:232-41；Takiguchi,et al.,Tissue Antigens 2000:55:296-302)。
因此，为了维持或增强HLA-A33结合亲和力，有可能期望用天冬氨酸或谷氨酸取代自N端起的第一个氨基酸，用苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸取代自N端起的第二个氨基酸，和/或用赖氨酸取代C末端氨基酸。因此，具有CTL诱导能力的包含以下氨基酸序列的肽包括在本发明的肽中：其中在选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列中，自N端起的第一个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列中，自N端起的第一个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸。
即，本发明的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含引入选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列中的选自以下(a)至(c)的一个或多个取代：
(a)自N端起的第一个氨基酸被取代为天冬氨酸或谷氨酸；
(b)自N端起的第三个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；和
(c)C末端氨基酸被取代为赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列具有引入选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列中的以上(a)至(c)的一个或多个取代。在本发明中，优选的取代数目是选自以上(a)至(c)的1、2或3个取代。
此外，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，其中在选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸。优选地，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，其中在选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸，和/或C末端氨基酸被取代为赖氨酸。即，本发明的肽包括具有CTL诱导能力的包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列具有引入选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列中的选自以下(a)和(b)的一个或多个取代：
(a)自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸；和
(b)C末端氨基酸被取代为赖氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的肽可以是具有CTL诱导能力的由氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列具有引入选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列中的选自以上(a)和(b)的一个或多个取代。在更优选的实施方案中，自N端起的第二个氨基酸被取代为苯丙氨酸或酪氨酸。
不仅可以在锚定位点处引入氨基酸取代，而且可以在肽的潜在T细胞受体(TCR)识别位置处引入取代。数项研究已证明了具有氨基酸取代的肽可等同于或好于原来功能的功能，例如CAP1、p53(264-272)、Her-2/neu(369-377)或gp100(209-217)(Zaremba et al.CancerRes.1997,57,4570-7；T.K.Hoffmann et al.J Immunol.2002,168(3):1338-47.；S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.2003,52:199-206；and S.O.Dionne etal.Cancer Immunology,Immunotherapy 2004,53,307-14)。
本发明还考虑也可以向本发明的肽(例如,由选自以下氨基酸序列组成的肽：SEQID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170)。更具体地，本发明提供了由氨基酸组成的肽，其中在SEQ ID NO各自所示的氨基酸序列N末端和C末端的任一个或两者添加一个、两个或数个氨基酸。此类保留CTL诱导能力的修饰肽也包括在本发明中。例如，当肽与APC接触时(其中在由SEQ ID NO:52或118的氨基酸序列组成的肽的N末端和/或C末端添加一个，两个或数个氨基酸时)，其掺入APC中并加工成由SEQ ID NO:52或118的氨基酸序列组成的肽。然后其可以通过经由抗原呈递途径呈递在APC的细胞表面上诱导CTL。更具体地，本发明的肽可以是其中在N末端和C末端的任一个或两者上添加一个，两个或数个氨基酸的肽。
此外，在本发明的另一个实施方案中，提供了由氨基酸序列组成的肽，所述氨基酸序列在在SEQ ID NO各自所示的氨基酸序列中包含一个、两个或数个氨基酸取代，且其中将一个、两个或数个氨基酸添加到这些取代的氨基酸序列的N末端和C末端的任一个或两者。
当本发明的肽包含氨基酸取代时，期望的取代位置例如可以是包含在本发明的肽中的由SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53所示的的氨基酸序列中的选自以下的一个、两个、三个或四个位置：从N末端的第二个位置、从N末端的第三个位置，从N末端的第七个位置，以及C末端。或者，它们可以是由SEQ ID NOs:118、119，和170所示的的氨基酸序列中的选自以下的一个、两个或三个位置：从N末端的第一个位置、从N末端的第二个位置，以及C末端。
然而，当肽的氨基酸序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可以诱导针对特定物质的自身免疫性疾病和/或过敏性症状等副作用。因此，优选使用可用的数据库进行同源性搜索，以避免肽的氨基酸序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了不存在与目标肽相比仅有1个或2个氨基酸差异的肽时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有任何发生此类副作用的危险。
预测其中本发明的肽的一个，两个或数个氨基酸被修饰的肽能够保留原始肽的CTL诱导能力；然而优选验证修饰肽的CTL诱导能力。这里，“具有CTL诱导能力(CTL可诱导性(CTL inducibility))的肽”指肽，其通过用肽刺激的APC诱导CTLs。“CTL诱导”包括诱导分化成CTL，诱导CTL激活，诱导CTL增殖，诱导CTL的细胞毒活性，诱导CTL介导的靶细胞溶解，和诱导CTL的IFN-gamma产生增加。
CTL诱导能力的可通过如下来确认：用肽刺激表达感兴趣的HLA抗原的APC(例如B淋巴细胞，巨噬细胞或树突细胞)并将其与CD8阳性细胞混合；然后测量由CTL针对靶细胞所释放的IFN-gamma。对于APCs，可以优选使用人外周血单核细胞来源的树突细胞。作为反应系统，可使用已经制成以表达HLA抗原的转基因动物。或者，例如可以用51Cr或此类放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算肽-诱导的CTLs的细胞毒性活性。或者，在肽刺激的APCs的存在下，可能通过以下评估CTL诱导能力：测量由CTLs生成和释放的IFN-gamma，并使用抗IFN-gamma单克隆抗体显现培养基上的抑制区。
除上述的修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它肽，只要所得的连接肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当肽的例子包括衍生自其它TAA的CTL诱导肽。此外，本发明的肽也可以彼此连接。用于连接肽的合适的接头是本领域已知的，例如可以使用接头，如AAY(P.M.Daftarian et al.,J Trans Med 2007,5:26),AAA,NKRK(SEQ ID NO:189)(R.P.M.Sutmuller et al.,J Immunol.2000,165:7308-15)，或K(S.Ota et al.,CanRes.62,1471-6,K.S.Kawamura et al.,J Immunol.2002,168:5709-15)。肽可以以各种排列连接(例如，链状，重复等)，并且还可以连接三个或更多个肽。
本发明的肽还可连接至其它物质，只要所得的连接肽保留CTL诱导能力。与本发明的肽连接的适当物质的例子包括，例如，肽、脂质、糖或糖链、乙酰基，和天然的或合成的聚合物。本发明的肽可以进行如下修饰：糖基化、侧链氧化、或磷酸化等等，只要不破坏它们的CTL诱导能力。还可以实施此种类型的修饰以赋予额外的功能(例如，靶向功能和递送功能)或稳定所述肽。
例如，为了提高肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明的肽。肽的稳定性可以以多种方式测定。例如，可以通过使用肽酶以及各种生物介质例如人血浆和血清来测试稳定性(参见例如Verhoef等人,Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302)。
此外，如上文所述，在上述取代、缺失、插入和/或添加了1个、2个或数个氨基酸残基的修饰肽中，可以筛选或选择与原始肽相比活性相同或更高者。因此，本发明还提供由于筛选或选择与原始肽相比活性相同或更高的修饰肽的方法。具体地，本发明提供了筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)产生由对原始氨基酸序列通过取代、缺失、插入和/或添加一个、两个或数个氨基酸残基而修饰得到的氨基酸序列组成的候选序列，其中所述原始氨基酸序列由选自SEQID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170的氨基酸序列组成；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与MPHOSPH1之外的任何已知人基因产物的肽均无显著同源性(或序列同源性)的候选序列；
(c)使由(b)中选择的候选序列组成的肽与APCs接触；
(d)使(c)的APCs与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择具有与由原始氨基酸序列组成的肽相等或更高的CTL诱导能力的肽。
本文中，本发明的肽也被描述为“MPHOSPH1肽”。
III.本发明的肽的制备
本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，可以使用重组DNA技术或化学合成来制备本发明的肽。本发明的肽可独立地合成，或合成为包括两个或更多个肽的较长多肽。本发明的肽可以在使用重组DNA技术在宿主细胞中产生它们或者在化学合成它们之后从宿主细胞或合成反应产物分离。即，可以纯化或分离本发明的肽，以使其基本上不含其它宿主细胞蛋白质及其片段，或任何其它化学物质。
本发明的肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。其他示例性的修饰包括掺入一种或多种D-氨基酸或其他可用的氨基酸模拟物，以便例如增加肽的血清半寿期。
可以根据选定的氨基酸序列，通过化学合成来获得本发明的肽。可以适合于合成的常规肽合成方法的例子包括以下文献中描述的方法：
(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；
(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976；
(iii)“Peptide Synthesis”(in Japanese),Maruzen Co.,1975；
(iv)“Basics and Experiment of Peptide Synthesis”(in Japanese),MaruzenCo.,1985；
(v)“Development of Pharmaceuticals”(in Japanese),Continued Vol.14(peptide synthesis),Hirokawa,1991；
(vi)WO99/67288；and
(vii)Barany G.&Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,Solid Phase PeptideSynthesis,Academic Press,New York,1980,100-118.
或者，可适用任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如MorrisonJ,J Bacteriology 1977,132:349-51；Clark-Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology(eds.Wu等人)1983,101:347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转化入合适的宿主细胞。本发明还提供了此类载体和宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产本发明的肽。
IV.多核苷酸
本发明还提供编码任何本发明肽的多核苷酸。这些包括衍生自天然存在的MPHOSPH1基因(例如GenBank登录号NM_016195(SEQ ID NO:185)或NM_001284259(SEQ IDNO:187))以及具有它们的保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。本文中，短语“保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或实质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，大量的功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)都可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码肽的核酸的每一种沉默变异在每个公开的序列中隐含地描述。
本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由诸如A，T，C和G的碱基适当地组成，并且在RNA中T被U置换。
本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中有或无居间氨基酸序列(intervening amino acid sequence)。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。此外，多核苷酸可以包括编码本发明的肽的编码序列的任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(如质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。
重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成本发明的多核苷酸。或者，可使用PCR技术或在合适宿主中表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP,Tetrahedron 1992,48:2223-311；Matthes等人,EMBO J 1984,3:801-5中记载的。可根据需要来纯化能够以这种方式获得的几种肽的连接产物，并以该连接状态施用。在该情况下，连接的肽通过加工来产生可抗原呈递的肽并且引发每种肽的CTL诱导活性。因此，当连接肽时，优选组合具有相同HLA限制的肽。或者肽可以通过切割连接部分作为单个肽的混合物施用。
V.外来体(exosomes)
本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在JPH11-510507和WO99/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从作为治疗和/或预防(防范)对象的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行接种。
上述复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防(防范)的受试者的类型匹配。例如，HLA-A11(如HLA-A*11:01)和HLA-A33(如HLA-A*33:03)是在亚洲人群中广泛和普遍见到的等位基因，并且认为这些HLA抗原类型适合在亚洲患者中治疗。通常在临床实践中，通过预先研究需要治疗的患者的HLA抗原类型，可以选择合适的肽，其对特定HLA抗原具有高水平的结合亲和力，或者通过由特异性HLA抗原介导的抗原呈递的CTL诱导能力。
本发明的外来体在其表面上呈递本发明的肽与HLA-A11或HLA-A33的复合物。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A11时，本发明的肽优选为具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选为选自由SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽。此外，当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A33时，本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选地，由选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列组成的肽或其修饰的肽。
VI.抗原呈递细胞(APC)
本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的APC。或者本发明提供了在其表面上具有在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的APC。本发明的APC可以是分离的APC。当在细胞(APC，CTL等)的语境中使用时，术语“分离的”意指细胞与另一类型的细胞分离。本发明的APC可以是从衍生自待经受治疗和/或预防(防范)的患者的APC诱导的APC，并且可以作为疫苗自身或与其他药物(包括本发明的肽，外来体或CTL)组合施用。
本发明的APCs不限于特定种类的细胞，并且可以是已知在其细胞表面呈递蛋白质性质的抗原的细胞以通过淋巴细胞(例如树突细胞(DC)、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞)识别。由于DC是APCs中具有最强CTL诱导活性的代表性APC，可以优选使用DC作为本发明的APCs。本发明中，优选的DC是源自人的分离的DC。此外，本发明的APC可以是具有抗原呈递功能的多种类型的细胞的混合物，并且可以是APC的混合物，其中每种APC呈递不同类型的本发明的肽。
例如，可以通过从外周血单核细胞分离DC，然后在体外用本发明的肽刺激它们来获得本发明的APC。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。因此在将本发明的肽施用至受试者后，可以通过从受试者收集APC来获得本发明的APC。或者，可以通过使从受试者收集而来的APC与本发明的肽相接触来获得本发明的APC。
为了在受试者中诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫应答，本发明的APC可以单独或者与其他药物(包括本发明的肽、外来体或CTL)组合施用给受试者。例如，离体施用可包括下述步骤：
(a)自第一受试者收集APC；
(b)使步骤(a)的APC接触本发明的肽；和
(c)对第二受试者施用步骤(b)的APC。
第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。当第一受试者和第二受试者是不同个体时，优选第一受试者和第二受试者的HLA是相同类型。获得自上述步骤(b)中的APC可以是用于癌症治疗和/或预防(防范)的疫苗。
获得自如上描述方法的本发明的APCs具有CTL诱导能力。用于APC的语境中的术语“CTL诱导能力(CTL可诱导性)”指APC与CD8阳性细胞接触时诱导CTL的能力。此外，“CTL诱导能力(CTL可诱导性)”包括APC诱导CTL活化的能力，APC诱导CTL增殖的能力，APC促进CTL介导的溶解靶细胞的能力，和APC提高CTL介导的IFN-gamma生成的能力。由本发明的APC所诱导的CTL是对MPHOSPH1特异性的CTL，并表现出对表达MPHOSPH1的细胞的特异性细胞毒活性。
除了上述方法之外，可以通过在体外将编码本发明肽的多核苷酸导入至APC来制备本发明的APC。待导入的多核苷酸可以是DNA或RNA的形式。导入的方法并不特别限制，且其例子包括本领域中常规实施的各种方法，例如脂质体转染、电穿孔和磷酸钙法。更具体的说，可以使用描述于Cancer Res 1996,56:5672-7；J Immunol 1998,161:5607-13；J ExpMed 1996,184:465-72,和JP2000-509281中的方法。通过将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC，多核苷酸在细胞中转录并翻译，然后产生的肽被MHC I类加工并通过呈递途径以将本发明的肽呈递在APC的细胞表面上。
在优选的实施方案中，本发明的APC在其细胞表面上呈递本发明的肽和以下形成的复合物：HLA-A11(更优选地HLA-A*11:01)或HLA-A33(更优选地A*33:03)。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A11时，本发明的肽优选为具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选为选自由SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列组成的肽。当与本发明的肽形成复合物的HLA是HLA-A33时，本发明的肽优选为具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列组成的肽。
本发明的APC优选是通过包括下述(a)或(b)的步骤的方法诱导的APC：
(a)将APC与本发明的肽接触，所述APC表达至少一种选自HLA-A11(更优选地HLA-A*11:01)和HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)的HLA；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC，所述APC表达至少一种选自HLA-A11(更优选地HLA-A*11:01)和HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)的HLA。
与表达HLA-A11的APC接触的本发明的肽优选是具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选由选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列组成的肽。
与表达HLA-A33的APC接触的本发明的肽优选是选自具有SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽或其修饰的肽，并且更优选选自由SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列组成的肽。
本发明提供了本发明的肽用于制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的用途。另外，本发明提供了制备诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的方法或过程。进一步地，本发明提供了用于诱导具有CTL诱导能力的APC的本发明的肽。
VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
由本发明的肽诱导的CTL可以与本发明的肽相似的方式用作疫苗用于在体内增强靶向表达MPHOSPH1的细胞的免疫应答。因此本发明提供了CTLs，其通过本发明的肽诱导或活化。本发明的CTLs是靶向本发明肽的CTLs，并且能够结合至本发明的肽和HLA抗原的复合物。CTL与所述复合物的结合是经由存在于CTL的细胞表面的T细胞受体(TCR)介导的。本发明的CTL可以是分离的CTL。优选的CTL是分离的人源CTL。本发明的CTL可以是CTL的混合物，其各自靶向不同类型的本发明肽。
本发明的CTL可以获得自(1)向受试者施用本发明的肽，(2)体外用本发明的肽刺激衍生自受试者的APC和CD8阳性T细胞，或外周血单核细胞(PBMC)，(3)体外将CD8阳性T细胞或PBMC与APC或外来体接触，所述APC或外来体在它们的表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物，或(4)将包含编码每种T细胞受体(TCR)亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细胞，所述TCR能够结合由细胞表面上HLA抗原所呈递的本发明的肽。用于上文(2)或(3)方法的外来体和APCs可以分别通过“V.外来体”和“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中描述的方法制备，且上文(4)的方法的详情将在“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中描述。
本发明的CTLs可以单独施用至经受治疗和/或预防(防范)的患者，或与其他药物(包括本发明的肽、APC或外来体)组合施用以用于调节效果的目的。进一步地，本发明的CTLs可以是诱导自CD8阳性T细胞的CTLs，所述CD8阳性T细胞衍生自经受施用CTLs的患者。本发明的CTLs特异性作用于呈递本发明肽的靶细胞，例如，用于诱导本发明CTLs的相同的肽。靶细胞可以是内源表达MPHOSPH1的细胞，如癌细胞，或用MPHOSPH1基因转染的细胞。因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可成为本发明CTLs的攻击靶标。本发明的CTL靶向的细胞优选为对于HLA-A11(更优选地HLA-A*11:01)和HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)中的至少一种为阳性的细胞。
在优选的实施方案中，本发明的CTLs特异性靶向表达MPHOSPH1和选自HLA-A11(更优选地HLA-A*11:01)和HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)中至少一种的HLA的细胞。在本发明中，被CTLs靶向的细胞可以是纯合或杂合地具有HLA-A11和HLA-A33的等位基因的任一种的细胞。
本文中，CTL“靶向”细胞指CTL对在其细胞表面上呈递HLA和本发明肽的复合物的细胞的识别，和表现出对该细胞的细胞毒性活性。进一步地，“特异性靶向”指CTLs表现出对这些细胞的细胞毒性活性，但未显示对其他细胞的破坏活性。在CTL的语境中使用的表述“识别细胞”指经由其TCR结合至呈递在细胞表面的HLA和本发明的肽的复合物，并表现出对该细胞的特异性细胞毒性活性。因此，本发明的CTLs优选为能够经由TCR结合至呈递在细胞表面上的复合物的CTL，所述复合物在本发明的肽和HLA-A11(更优选地HLA-A*11:01)或HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)之间形成。
此外，本发明的CTLs优选是通过包括以下(a)或(b)中所述步骤的方法诱导的CTL：
(a)体外将CD8阳性T细胞与在其表面上呈递复合物的APCs或外来体接触，所述复合物为本发明的肽和HLA-A11(更优选地HLA-A*11:01)或HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)的复合物；或
(b)将包含编码每种TCR的亚基的多核苷酸导入CD8阳性T细胞，所述TCR能够结合通过HLA-A11(更优选地HLA-A*11:01)或HLA-A33(更优选地HLA-A*33:03)呈递在细胞表面的本发明的肽。通过该方法有道的CTL是具有特异性识别用于诱导的肽和HLA抗原的复合物的TCR的细胞。因此，它们是具有不同于其它CTL的结构差异的细胞，所述其它CTL由于TCR结构的差异具有不同的反应特异性。
VIII.T细胞受体(TCR)
本发明还提供组合物以及使用该组合物的方法，所述组合物包含编码每种TCR亚基的多核苷酸，所述TCR能够结合通过HLA抗原呈递在细胞表面的本发明的肽。所述多核苷酸通过在CD8阳性T细胞的表面表达TCR(其能够与通过HLA抗原呈递在靶细胞表面的本发明的肽相结合)来赋予CD8阳性T细胞针对表达MPHOSPH1的癌细胞的特异性。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出通过本发明的肽诱导的CTL中编码TCR亚基的alpha和beta链的多核苷酸(WO2007/032255和Morgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。例如，优选PCR方法用于TCR分析。不限于此，用于分析的PCR引物可以是(例如)通过组合以下5'侧引物和3'侧引物的用于扩增的引物组：
5’-R引物(5’-gtctaccaggcattcgcttcat-3’)(SEQ ID NO:181)
3’侧引物:
TCR-alpha-链-C-区-特异性
3-TRa-C引物(5’-tcagctggaccacagccgcagcgt-3’)(SEQ ID NO:182)
TCR-beta-链C1-区-特异性
3-TRb-C1引物(5’-tcagaaatcctttctcttgac-3’)(SEQ ID NO:183)或
TCR-beta-链C2-区-特异性
3-TR-beta-C2引物(5’-ctagcctctggaatcctttctctt-3’)(SEQ ID NO:184)
通过将鉴定的多核苷酸导入CD8阳性T细胞而形成的TCRs能够以高亲合力结合呈递本发明的肽的靶细胞，并在体内和体外介导针对呈递本发明的肽的靶细胞的高效杀伤。
可以将编码每种TCR亚基的多核苷酸掺入合适的载体，例如逆转录病毒载体中。这些载体是本领域公知的。可以将所述多核苷酸或者包含它们的载体导入CD8阳性T细胞，例如衍生自患者的CD8阳性T细胞。本发明提供一种即配即用型组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或衍生自其他受试者的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。
本文中，特异性TCR是当TCR呈递于CD8阳性T细胞的表面上时，能够通过特异性识别呈递在靶细胞表面上的本发明的肽和HLA抗原的复合物,赋予针对靶细胞特异性细胞毒活性的TCR。上述复合物的特异性识别可以通过任何已知方法来确认，并且其优选的例子包括使用HLA分子和本发明的肽的HLA多聚体染色分析，和ELISPOT测定方法。通过实施ELISPOT测定法，可以确认由导入有上述多核苷酸的T细胞和细胞内信号转导的靶细胞的特异的TCR介导的识别。当上述TCR呈递于CD8阳性T细胞表面上时，也可以通过已知方法确认TCR是否能够赋予针对CD8阳性T细胞的靶细胞特异性细胞毒性活性。优选的方法包括例如通过铬释放测定法等测定针对HLA阳性靶细胞的细胞毒性活性。
在HLA-A11的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基(其例如结合由具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽和HLA-A11抗原形成的复合物)的多核苷酸转化CD8阳性T细胞制备来CTL。
在HLA-A33的背景下，本发明提供了通过用编码每种TCR亚基(其例如结合由具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽和HLA-A33抗原形成的复合物)的多核苷酸转化CD8阳性T细胞制备来CTL。
经转化的CTL在体内能够归巢(homing)(从血液至淋巴组织的淋巴细胞移位(translocation))，并且可以利用公知的体外培养方法扩增(例如Kawakami等人,JImmunol.,1989,142:3452-3461)。可以利用本发明的CTLs来形成免疫原性组合物，所述组合物有用于在需要治疗和/或预防(防范)的患者中的疾病治疗或预防(防范)(对于参考文献WO2006/031221，其内容通过提述并入本文)。
IX.药物组合物
本发明还提供了组合物或药物组合物，包含选自以下的至少一种活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以根据需要包含载体，赋形剂或通常用于药物中的此类而没有特别限制。可用于本发明的药物组合物中的载体的例子包括无菌水，生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养液等。因此，本发明还提供了药物组合物，包含选自以下(a)至(e)的至少一种活性成分和药学上可接受的载体：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)本发明的APC；
(d)本发明的外来体；和
(e)本发明的CTL。
此外，本发明的药物组合物可以根据需要包含稳定剂、混悬剂、防腐剂、表面活性剂、增溶剂、pH调节剂、聚集抑制剂等。
与正常组织相比，癌细胞中MPHOSPH1表达显著上调。因此本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸可以用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发。因此本发明提供了用于治疗和/或预防癌症，和/或预防其术后复发的药物组合物，其包含作为活性成分的一种或多种类型的本发明的肽或多核苷酸。或者，可以制备本发明的肽以呈递在外来体或APC的表面上用作为药物组合物的用途。此外，靶向任一种本发明肽的本发明的CTL也可用作本发明药物组合物的活性成分。本发明的药物组合物可包含治疗有效量或药学有效量的上述活性成分。
本发明的药物组合物还可以用作疫苗。在本发明的语境中，术语“疫苗”(也称为“免疫原性组合物”)指当接种到动物时具有诱导导致抗肿瘤作用的免疫应答的功能的组合物。因此本发明的药物组合物可用于在受试者中诱导导致抗肿瘤作用的免疫应答。由本发明的肽、多核苷酸、APC、CTL和药物组合物诱导的免疫应答没有特别限制，只要其是导致抗肿瘤作用的免疫应答，并且例子包括诱导癌细胞特异的CTL和诱导癌细胞特异的细胞毒性活性。
本发明的药物组合物可用于在人类受试者或患者中治疗和/或预防的癌症，和/或预防其手术后复发。本发明的药物组合物可以优选用于对选自HLA-A11和HLA-A33中的至少一种HLA阳性的受试者。此外，本发明的药物组合物可优选用于治疗和/或预防表达MPHOSPH1和选自HLA-A11和HLA-A33的至少一种HLA的癌症和/或预防其术后复发。
在另一个实施方案中，本发明提供选自以下的活性成分在制备用于治疗或预防癌症的药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分，用于治疗或预防癌症：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供制备用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括用药学上或生理上可接受的载体配制至少一种选自以下活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明还提供了制备用于治疗或预防癌症的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体混合的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了用于治疗或预防癌症的方法，其包括向受试者施用至少一种选自以下的活性成分的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A11限制性表位肽。因此，包含至少一种具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽的本发明的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A11(例如,HLA-A*11:01)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)，呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A11的受试者(即HLA-A11阳性受试者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的肽的药物组合物。
类似地，在本发明中，具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽被鉴定为可以诱导强效和特异性免疫应答的HLA-A33限制性表位肽。因此，包含至少一种具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽的本发明的药物组合物特别适用于施用至具有HLA-A33(例如,HLA-A*33:03)作为HLA抗原的受试者。这同样适用于包含以下的药物组合物：编码这些肽中任一种的多核苷酸(即本发明的多核苷酸)，呈递这些肽的APC或外来体(即本发明的APC或外来体)，或靶向这些肽的CTL(即本发明的CTL)。也就是说，包含与具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽相关联的活性成分的药物组合物适合施用于具有HLA-A33的受试者(即HLA-A33阳性受试者)。在更优选的实施方案中，本发明的药物组合物是包含具有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的肽的药物组合物。
通过本发明的药物组合物治疗和/或预防的癌症没有特别限制，只要它们是表达MPHOSPH1的癌症，并包含各种癌症，例如膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肿瘤等。此外，本发明的药物组合物优选用于纯合地或杂合地具有选自HLA-A11和HLA-A33的HLA等位基因的受试者。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物可以包含具有诱导针对癌细胞的CTL的能力的其他肽(例如，其它TAA衍生肽CTL诱导肽)，编码其他肽的其他多核苷酸，呈递其他肽的其它细胞等。
本发明的药物组合物还可以任选地包含其它治疗物质作为活性成分，只要它们不抑制上述活性成分(例如本发明的肽)的抗肿瘤作用即可。例如，本发明的药物组合物可任选地包含抗炎组合物，镇痛药，化学治疗剂等。除了将其它治疗物质包括在本发明的药物组合物本身以外，还可以与一种或多种其它药物组合物顺序或同时施用本发明的药物组合物。本发明的药物组合物和其它药物组合物的剂量取决于例如所使用的药物组合物的类型和所治疗的疾病，以及施用时间安排(scheduling)和施用途径。
应当理解，考虑到制剂类型，除了本文明确提及的成分之外，本发明的药物组合物可以包含本领域常规的其它组分。
本发明还提供包含本发明的药物组合物的制品或试剂盒。本发明的制品或试剂盒可以包括容纳本发明的药物组合物的容器。适当的容器的例子包括瓶，小瓶或试管，但不限于此。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。标签可以附着于容器，并且可以在标签中描述本发明的药物组合物所应用的疾病或疾病状态。标签还可指明关于施用的指导等等。
除了容纳本发明的药物组合物的容器之外，优选地本发明的制品或试剂盒还可以任选包含容纳药学上可接受的稀释剂的第二容器。本发明的制品或试剂盒还可包括从商业立场和用户角度所需的其它材料，例如其它缓冲液，稀释剂，过滤器，注射针，注射器，和具有使用说明的包装插页。
根据需要，本发明的药物组合物可包装在药包或分配装置中提供，该药包或分配装置可装有一个或多个含有活性成分的单位剂型。例如，药包可包括例如金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配装置可附有施用说明书。
(1)包含肽作为活性成分的药物组合物
包含本发明的肽的药物组合物可以根据需要通过常规制剂方法配制。除了本发明的肽之外，本发明的药物组合物可以包含通常用于药物中的载体，赋形剂等，而没有特别限制。可用于本发明的药物组合物中的载体的例子包括灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，Tris缓冲盐水，0.3％甘氨酸，培养液，等等。此外，本发明的药物组合物可根据需要含有稳定剂、悬浮剂、防腐剂、表面活性剂、增溶剂、pH调节剂、聚集抑制剂，等等。本发明的药物组合物可以诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的特异性免疫，因此可以用于癌症治疗或预防(防范)的目的。
例如，可以通过以下制备本发明的药物组合物：在药学上或生理上可接受的水溶性载体中溶解，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水，并根据需要加入稳定剂，悬浮剂，防腐剂，表面活性剂，增溶剂，pH调节剂，聚集抑制剂等，然后灭菌肽溶液。对肽溶液进行灭菌的方法没有特别限定，优选通过过滤灭菌进行。过滤灭菌可以使用(例如)孔径为0.22μm或以下的过滤灭菌过滤器进行。过滤灭菌的肽溶液可以例如作为注射剂施用至受试者，但不限于此。
本发明的药物组合物可以通过冷冻干燥上述肽溶液制备为冷冻干燥制剂。冷冻干燥制剂可以通过以下制备：将如上所述制备的肽溶液装入适当的容器，如安瓿、小瓶或塑料容器中，随后冷冻干燥并用洗涤灭菌的橡胶塞等在压力回收之后包封入容器中。冷冻干燥制剂可以在其再溶解于药学上或生理学上可接受的水溶性载体后施用至受试者，所述水溶性载体例如灭菌水(例如注射用水)，生理盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水，和Tris缓冲盐水等。本发明的药物组合物的优选实例包括此类过滤灭菌的肽溶液的注射物和由冻干该肽溶液所产生的冷冻干燥制剂。本发明还包括含有此类冷冻干燥制剂和再溶解溶液的试剂盒。本发明还包括容纳冷冻干燥制剂(其是本发明的药物组合物)的容器和容纳再溶解溶液的容器的试剂盒。
本发明的药物组合物可以包含两种或更多种类型的本发明肽的组合。肽的组合可以采取混合的肽的鸡尾酒形式，或可以使用标准技术彼此缀合。例如，可以将肽化学连接或表达成为单一融合多肽。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以从受试者分离APC(例如DC)，然后用本发明的肽刺激它们，来获得在其细胞表面上展示任何所述本发明肽的APC。将这些APC重新施用给受试者以在受试者中诱导CTL，结果，可提高针对表达MPHOSPH1的癌细胞的攻击性。
本发明的药物组合物还可以包含已知用于有效建立细胞免疫的佐剂。佐剂是指当与抗原一起(或连续)施用时增强针对具有免疫学活性的抗原的免疫应答的化合物。可以使用描述于文献中的已知佐剂，例如Clin Microbiol Rev 1994,7:277-89。合适佐剂的例子包括铝盐(磷酸铝，氢氧化铝，羟基氧化铝等),明矾,霍乱毒素,沙门氏菌毒素,IFA(不完全弗氏佐剂),CFA(完全弗氏佐剂),ISCOMatrix,GM-CSF和其他免疫刺激细胞因子，含有CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG7909等)，水包油乳液，皂苷或其衍生物(QS21等)，脂多糖例如脂质A或其衍生物(MPL,RC529,GLA,E6020等)，脂肽，乳铁蛋白，鞭毛蛋白，双链RNA或其衍生物(poli IC等)，细菌DNA，咪唑并喹啉(Imiquimod,R848等)，C型凝集素配体(海藻糖-6,6’-二山嵛酸/酯(TDB)等)，CD1d配体(alpha-半乳糖神经酰胺等)，角鲨烯乳液(MF59,AS03,AF03等),PLGA等，但不限于此。在包含本发明的药物组合物的试剂盒中，佐剂可以包含在与包含本发明的肽的药物组合物分开的另一容器中。在这种情况下，佐剂和药物组合物可以连续地施用于受试者，或者在施用给受试者之前立即混合在一起。本发明还提供了包含含有本发明的肽药物组合物和佐剂的此类试剂盒。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒还可以包含再溶解溶液。此外，本发明提供试剂盒，其包括容纳本发明的药物组合物的容器和存储佐剂的容器。试剂盒可以根据需要进一步包含储存再溶解溶液的容器。
当油佐剂用作佐剂时，本发明的药物组合物可以制备为乳液。例如，可以通过混合并搅拌如上所述制备的肽溶液和油佐剂来制备乳液。肽溶液可以是在冷冻干燥后再溶解的溶液。乳液可以是W/O型乳液和O/W型乳液，且W/O型乳液优选用于获得高免疫应答增强效果。IFA可优选用作油佐剂，但不限于此。乳剂的制备可以在施用受试者之前立即进行，且在这种情况下，本发明的药物组合物可以作为包含本发明的肽溶液和油性佐剂的试剂盒提供。当本发明的药物组合物是冷冻干燥制剂时，试剂盒可以进一步包含再溶解溶液。
此外，本发明的药物组合物可以是其中包封了本发明肽的脂质体制剂、其中肽结合至具有几微米直径的珠子的颗粒配制剂，或其中脂质结合至肽的配制剂。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的肽还可以以药学上可接受的盐的形式施用。优选的盐的实例包括与碱金属(锂，钾，钠等)的盐，与碱土金属(钙，镁等)的盐，与其他金属(铜，铁，锌，锰等)的盐,与有机碱的盐,与胺的盐,与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸等等)的盐,和与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、硝酸等等)的盐。本文中所用的短语“药学上可接受的盐”是指保留所述化合物的药理学和药学上的有效性和性质的盐。因此，包含本发明的肽的药学上可接受的盐的药物组合物也包括在本发明内。此外，除了游离肽之外，“本发明的肽”还包括其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可以进一步包括引发(prime)CTL的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的组分。例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL响应的其他例子，大肠杆菌脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与适宜的肽共价连接时，可用来引发CTL(参见例如Deres et al.,Nature 1989,342:561-4)。
用于施用本发明的肽或药物组合物的合适方法的实例包括口服、皮内、皮下、肌肉内、骨内、腹膜内和静脉内注射，以及全身施用或局部施用至靶位点附近，但不限于此。优选的施用方法包括皮下注射到诸如腋窝或腹股沟的淋巴结附近。更具体地(例如)，当本发明的药物组合物包含作为活性成分的肽或外来体时，优选皮下施用。或者，可通过静脉注射等方式施用具有作为活性成分的APC或CTL的组合物。
本发明的肽可以以治疗或药学有效量施用于受试者以治疗癌症，或以治疗或药学有效量以诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫(更具体地为CTL)。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整。对于本发明的每种肽，剂量通常是0.001mg-1000mg,例如0.01mg-100mg，例如0.1mg-30mg，例如0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg。给药间隔可以是每几天至几个月一次，且例如，可以每周一次的间隔进行给药。本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量(dose)(剂量(dosage))。
在优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽和药学上或生理学上可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽，药学或生理学上可接受的载体和佐剂。本发明的药物组合物可以包含0.001mg-1000mg,优选0.01mg-100mg,更优选0.1mg-30mg，甚至更优选0.1mg-10mg，例如0.5mg-5mg的本发明的肽。当本发明的药物组合物是注射剂时，其可以包含以下浓度的本发明的肽：0.001mg/ml-1000mg/ml,优选0.01mg/ml-100mg/ml,更优选0.1mg/ml-30mg/ml,甚至更优选0.1mg/ml-10mg/ml,例如0.5mg/ml-5mg/ml。在这种情况下，例如，可以通过注射向受试者施用0.1至5ml,优选0.5ml至2ml的本发明的药物组合物。
此外，本发明提供了治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的肽或本发明的药物组合物。如上所述，本发明的肽可以以通常为以下量的单一剂量施用于受试者：0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如,0.5mg-5mg。在优选的实施方案中，本发明的肽与佐剂一起施用于受试者。此外，给药间隔可以是每几天至几个月一次，优选每几天至每月一次，例如每周一次或每两周一次。
(2)含有多核苷酸作为活性成分的药物组合物
本发明的药物组合物也可含有以可表达的形式编码本发明公开的肽的多核苷酸。在本文中，短语“以可表达的形式”意味着多核苷酸在导入细胞时会表达作为本发明的肽。在示例性的实施方案中，本发明的多核苷酸的序列包括用于本发明的肽的表达所必需的调节元件。本发明的多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的序列(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR&Capecchi MR,Cell 1987,51:503-12)。参见例如Wolff等人,Science 1990,247:1465-8；美国专利号5,580,859,5,589,466,5,804,566,5,739,118,5,736,524,5,679,647；和WO98/04720。基于DNA的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利号5,922,687)。
本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主，诸如牛痘或禽痘。例如，可以使用牛痘病毒作为表达本发明的肽的载体。在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利号4,722,848。另一种载体是BCG(Bacille Calmette Guerin)。BCG载体描述于Stover等人,Nature 1991,351:456-60。各种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体等等。参见例如Shata et al.,Mol MedToday 2000,6:66-71；Shedlock et al.,J Leukoc Biol 2000,68:793-806；Hipp et al.,In Vivo 2000,14:571-85。
本发明的多核苷酸投递至患者中可以是直接的，在这种情况下患者可以直接暴露于携带本发明多核苷酸的载体，或者是间接的，在这种情况下首先在体外用携带本发明多核苷酸的载体转化细胞，然后将细胞移植入患者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。
关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel等人,Clinical Pharmacy 1993,12:488-505；Wu和Wu,Biotherapy 1991,3:87-95；Tolstoshev,Ann Rev PharmacolToxicol 1993,33:573-96；Mulligan,Science 1993,260:926-32；Morgan&Anderson,AnnRev Biochem 1993,62:191-217；Trends in Biotechnology 1993,11(5):155-215。在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY,1993；及Krieger,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY,1990中描述了可应用于本发明的重组DNA技术领域的公知方法。
与肽的施用类似，多核苷酸的施用可以通过口服、皮内、皮下、静脉内、肌肉内、骨内、和/或腹膜内注射等进行。多核苷酸的施用可以是系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明的多核苷酸可以以治疗或药学有效量施用于受试者，用于诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫(更具体地，CTL)，或以治疗或药学有效量用于治疗癌症。合适载体中的多核苷酸的剂量或使用编码本发明的肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等适当地调整，且通常是0.001mg-1000mg,例如,0.01mg-100mg,例如,0.1mg-30mg,例如,0.1mg-10mg,或例如0.5mg-5mg。给药间隔可以是每几天至几个月一次，例如，给药可以每周一次的间隔进行。本领域技术人员可以适当地选择合适的剂量(dose)(剂量(dosage))。
X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法
本发明的肽和多核苷酸可用于诱导APCs和CTL。也可以使用本发明的的外来体和APC来诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要其CTL诱导能力不被抑制。因此，可以使用包含本发明的任何肽，多核苷酸，APC和外来体的药物组合物来诱导本发明的CTL。此外，可以使用包含本发明的肽或多核苷酸的药物组合物来诱导本发明的APC。
(1)诱导APC的方法
本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸诱导具有CTL诱导能力的APCs的方法。
本发明的方法包括在体外、离体或体内使APC与本发明的肽接触的步骤。例如，使APC与肽离体接触的方法可以包括以下步骤：
(a)从受试者收集APC；和
(b)使步骤(a)的APC与本发明的肽接触。
上述APC不限于特定种类的细胞，并且可以使用已知在其表面呈递由淋巴细胞识别的蛋白质抗原的DC，Langerhans细胞，巨噬细胞，B细胞，和活化的T细胞。DC在APC中具有最强的CTL诱导能力，并因此优选使用DC。本发明的任何肽均可以单独或与本发明的其它肽组合使用。此外，本发明的肽可以与其它CTL诱导肽(例如，其它TAA衍生的CTL诱导肽)组合使用。
同时，当将本发明的肽施用给受试者时，APC在体内接触到所述肽，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明的方法可包向受试者施用本发明的肽的步骤。类似地，当将可表达形式的本发明的多核苷酸施用于受试者时，本发明的肽在体内表达，表达的肽在体内与APCs接触，结果，在受试者的身体中诱导出具有高CTL诱导能力的APC。因此，本发明还可以包括向受试者施用本发明的多核苷酸的步骤。
为了诱导具有CTL诱导能力的APC，本发明还包括将本发明的多核苷酸导入APC的步骤。例如，所述方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APC；并
(b)将编码本发明肽的多核苷酸导入步骤(a)的APC。
步骤(b)可如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APC与本发明的肽接触；并
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC中。
此外，本发明提供了制备具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含以下步骤(a)或(b)：
(a)使APC与本发明的肽接触；或
(b)将编码本发明的肽的多核苷酸导入APC中。
上述方法可以在体外、离体或体内实施，并优选在体外或离体实施它们。在上述方法中使用的APC可以衍生自计划施用诱导的APC的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC时，施用受试者和供体必须具有相同的HLA类型。
在本发明的方法中，当具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA类型优选为HLA-A11(更优选HLA-A*11:01)。或者，在上述方法中使用的APC优选是表达HLA-A11(更优选HLA-A*11:01)的APC。
类似地，当包含选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作本发明的肽时，在施用受试者和供体中HLA优选为HLA-A33(更优选HLA-A*33:03)。或者，在上述方法中使用的APCs优选是表达HLA-A33(更优选HLA-A*33:03)的APC。在通过特定重力离心法等从供体收集的血液中分离PBMC之后，可以使用已知方法从PBMC制备APC。
在另一个实施方案中，本发明还提供了包含本发明的肽或编码该肽的多核苷酸用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物。
或者，本发明还提供了本发明的肽或编码该肽的多核苷酸在制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物中的用途。
或者，本发明还提供本发明的肽或编码所述肽的多核苷酸，用于诱导具有CTL诱导能力的APC。
或者，本发明进一步提供制备用于诱导APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体进行配制的步骤。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导具有CTL诱导能力的APC的药物组合物的方法或过程，其中所述方法或过程包括将本发明的肽或本发明的多核苷酸与药学上或生理上可接受的载体相混合的步骤。
通过本发明的方法诱导的APC可诱导对MPHOSPH1特异性的CTL(即本发明的CTL)。
(2)诱导CTL的方法
本发明还提供了使用本发明的肽，多核苷酸，外来体或APC来诱导CTL的方法。本发明还提供了使用一种或多种编码能够形成T细胞受体(TCR)的多肽(即TCR亚基)的多核苷酸来诱导CTL的方法，所述TCR能够识别本发明的肽和HLA抗原的复合物。优选地，诱导CTL的方法包含选自以下至少一个步骤：
(a)使CD8阳性T细胞与抗原呈递细胞接触，所述抗原呈递细胞在其表面上呈递有HLA抗原与本发明的肽的复合物；
(b)使CD8阳性T细胞与外来体接触，所述外来体在其表面上呈递有HLA抗原与本发明的肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入一种或多种编码能够形成TCR的多肽的多核苷酸，所述TCR能够识别本发明的肽和HLA抗原的复合物。
当本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用至受试者后，在受试者的身体中诱导CTL，而且靶向表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫应答的强度增强。因此，本发明的方法可包括将本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体施用于受试者的步骤。
或者，也可在体外或离体使用它们来诱导CTL。例如，本发明的方法可以包括以下步骤：
(a)自受试者收集APC；
(b)将步骤(a)的APC与本发明的肽接触；和
(c)将步骤(b)的APC与CD8阳性T细胞共培养。
诱导的CTL可以随后返回到受试者。
上文步骤(c)中要与CD8阳性T细胞共培养的APC也可通过将编码本发明的肽的多核苷酸引入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞(APC)”部分所述。然而，用于本发明的方法中的APC不限于此，并且可以使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明的肽的复合物的任何APC。
在本发明的方法中，除了此类APCs，也可以使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽形成的复合物的外来体。即，本发明的方法可以包括与在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的外来体共培养的步骤。此类外来体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。
此外，可通过将包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体导入CD8阳性T细胞来诱导CTL，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。此类转化可如上文“VIII.T细胞受体(TCR)”部分中所述来实施。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了诱导CTLs的方法，包括选自以下的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APCs共培养，所述APCs在其表面呈递HLA抗原和本发明肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面呈递HLA抗原和本发明肽的复合物；和
(c)向CD8阳性T细胞导入包含编码TCR的每种亚基的多核苷酸的载体，所述TCR能够结合通过细胞表面上的HLA抗原呈递的本发明的肽。
上述方法可以在体外，离体或体内实施，并且优选在体外或离体实施它们。在上述方法中使用的APCs或外来体和CD8阳性T细胞可以衍生自计划施用诱导的CTL的受试者，或者它们可以衍生自不同的受试者。当使用来自与计划施用的受试者不同的受试者(供体)的APC或外来体和CD8阳性T细胞时，施用对象和供体必须具有相同的HLA类型。例如，当具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽或其修饰肽用作为本发明的肽时，在施用对象和供体中HLA类型优选为HLA-A11(更优选HLA-A*11:01)。或者，上述方法中使用的APC或外来体优选是在其表面上呈递HLA-A11(更优选HLA-A*11:01)和本发明的肽(具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽或其修饰肽)的复合物的APC或外来体。在这种情况下，诱导的CTL显示出针对呈递HLA-A11和本发明的肽的复合物的细胞(例如，表达MPHOSPH1的HLA-A11阳性细胞)的细胞毒活性。
或者，例如，当具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列或其修饰的肽用作本发明的肽时，施用的受试者和供体两者中的HLA优选为HLA-A33(更优选为HLA-A*33:03)。或者，上述方法中使用的APC或外来体优选为在其表面呈递HLA-A33(更优选为HLA-A*33:03)和本发明的肽(具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽或其修饰的肽)的复合物的APC和外来体。在这种情况下，诱导的CTL显示出针对呈递HLA-A33和本发明的肽的复合物的细胞(例如，表达MPHOSPH1的HLA-A33阳性细胞)的细胞毒活性。
在另一个实施方案中，本发明还提供了用于诱导CTL的组合物或药物组合物，其包含至少一种选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导CTL的组合物或药物组合物中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分用于诱导CTL：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
或者，本发明进一步提供了制备用于诱导CTLs的组合物或药物组合物的方法或过程，其是包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体进行配制的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了制备用于诱导CTLs的组合物或药物组合物的方法或过程，其实包括将选自以下的活性成分与药学上或生理上可接受的载体混合的步骤的方法或过程：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；和
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体。
XI.诱导免疫应答的方法
本发明还提供了诱导针对表达MPHOSPH1的癌症的免疫应答的方法。适用的癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肿瘤等。优选的是癌症表达选自HLA-A11和HLA-A33中至少一种HLA。
本发明还提供了诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫应答的方法。MPHOSPH1被认为在上述各种类型的癌症中过表达。因此，当诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫应答时，结果抑制了癌细胞的增殖。因此，本发明还提供了抑制表达MPHOSPH1的癌细胞增殖的方法。本发明的方法特别适用于抑制表达MPHOSPH1和选自HLA-A11和HLA-A33中至少一种HLA的癌细胞的增殖。
本发明的方法可以包括施用包含本发明的任何肽或编码所述肽的多核苷酸的组合物的步骤。本发明的方法还涵盖施用呈递任何本发明的肽的APC或外来体。关于详情参见“IX.药物组合物”部分，特别是描述本发明的药物组合物作为疫苗的用途的部分。另外，可用于本发明的诱导免疫应答的方法的外来体和APC详细描述于上文“V.外来体”、“VI.抗原呈递细胞(APC)”、和“X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法”的项(1)和(2)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于诱导针对表达MPHOSPH1的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供了用于抑制表达MPHOSPH1的癌细胞增殖的药物组合物或疫苗，其中所述药物组合物或疫苗包含选自以下的活性成分：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在另一个实施方案中，本发明提供了选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达MPHOSPH1的癌症的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明还提供选自以下的活性成分在制备用于诱导针对表达MPHOSPH1的癌细胞的免疫应答的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
或者，本发明进一步提供选自以下的活性成分在制备用于抑制表达MPHOSPH1的癌细胞的增殖的药物组合物或疫苗中的用途：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
本发明还提供了用于制备诱导针对表达MPHOSPH1的癌症的免疫应答的药物组合物的方法或过程，其中所述方法可以包括将本发明的肽与药学上可接受的载体进行混合或配制的步骤。
或者，本发明提供了抑制表达MPHOSPH1的癌细胞增殖的方法或诱导针对癌症的免疫应答的方法，其包括向受试者施用包含选自以下的活性成分的疫苗或药物组合物的步骤：
(a)本发明的肽；
(b)以可表达的形式编码本发明的肽的多核苷酸；
(c)在其表面上呈递本发明的肽的APC；
(d)在其表面上呈递本发明的肽的外来体；和
(e)本发明的CTL。
在本发明的语境中，可以通过施用本发明的肽，多核苷酸，APC，外来体和/或CTL来治疗表达MPHOSPH1的癌症。或者通过施用本发明的肽，多肽，APC，外来体和/或CTL可以诱导针对表达MPHOSPH1的癌症的免疫应答。此类癌症的例子包括但不限于：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肿瘤等。此外，通过施用本发明的肽，多核苷酸，APC，外来体和/或CTL可以诱导针对表达MPHOSPH1的癌症的免疫应答。因此，在施用包含上述活性成分的疫苗或药物组合物之前，优选确认待治疗的受试者中患病部位的MPHOSPH1表达水平是否增加。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要癌症治疗的患者中治疗表达MPHOSPH1的癌症的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的受试者的患病部位收集的生物样品中MPHOSPH1表达的水平；
(ii)基于(i)中测量的MPHOSPH1表达水平鉴定具有表达MPHOSPH1的癌症的受试者；和
(iii)与正常对照相比，向患有过表达MPHOSPH1的癌症的受试者施用选自上组(a)至(e)的至少一种成分。
或者，本发明进一步提供了疫苗和药物组合物，其包含至少一种选自由以上(a)至(e)组成的组的活性成分，用于向具有表达MPHOSPH1的癌症患者施用。本发明还提供鉴定或选择要用至少一种选自上述(a)至(e)的活性成分治疗的受试者的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)测量从患有癌症的受试者的患病部位收集的生物样品中MPHOSPH1表达的水平；
(ii)基于(i)中测量的MPHOSPH1表达水平鉴定具有表达MPHOSPH1的癌症的受试者；和
(iii)鉴定或选择(ii)中鉴定的受试者作为可以用至少一种选自由(a)至(e)组成的组的活性成分治疗的受试者。
在上述方法中从受试者收集的用于测量MPHOSPH1表达水平的生物样品没有特别限制，并且例如，可以优选使用通过活组织检查等收集的含有癌细胞的组织样品。生物样品中的MPHOSPH1表达水平可以通过已知方法测量，例如，可以使用通过探针或PCR方法检测MPHOSPH1基因的转录产物的方法(例如cDNA微阵列法，Northern印迹法，RT-PCR法等)、通过抗体等检测MPHOSPH1基因的翻译产物的方法(例如，Western印迹法，免疫染色法等)，等等。此外，生物样品可以是血液样品，在这种情况下，测量针对MPHOSPH1的抗体的血液水平，并且可以基于血液水平来评估患病部位的MPHOSPH1表达水平。可以使用已知方法测量针对MPHOSPH1的抗体的血液水平，例如，可以使用使用MPHOSPH1蛋白或本发明的肽作为抗原的酶免疫测定(EIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)等。
通常，在不表达MPHOSPH1的组织和细胞中，几乎没有检测到MPHOSPH1转录产物和翻译产物。因此，当在从受试者收集的癌细胞或含有癌细胞的组织样品中检测到MPHOSPH1的转录产物或翻译产物时，可以确定受试者的癌症表达MPHOSPH1。在没有表达MPHOSPH1的癌症的受试者的血液样品中，几乎没有检测到针对MPHOSPH1或其片段的抗体。因此，当在从受试者收集的血液样品中检测到针对MPHOSPH1或其片段的抗体时，可以确定受试者的癌症表达MPHOSPH1。
受试者的癌症是否表达MPHOSPH1也可以通过与收集自受试者的非癌症部位的相同类型的生物材料的测量结果相比较或与收集自未患有癌症的受试者的相同类型的生物材料(正常对照样品)相比较。即，在与正常对照样品中的测量的靶水平(正常对照水平)进行比较中，当测试受试者的生物样品中的水平升高时，受试者的癌症被评估为表达MPHOSPH1。例如，当检测到的测量对象的量与正常对照水平相比增加至少10％或更高时，可以评估受试者的癌症表达MPHOSPH1。期望的是，检测到的测量目标的量优选地比正常对照水平高25％或更高，更优选50％或更高。此外，检测到的MPHOSPH1的转录产物或翻译产物的量可以通过相对于检测到的已知持家基因(例如β-肌动蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶或核糖体蛋白P1)的量标准化来评价。
在优选的实施方案中，优选在施用至少一种选自由上述(a)至(e)组成的组的活性成分之前确认受试者的HLA类型。例如，对于要施用与具有选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择HLA-A11阳性受试者。对于要施用与具有选自SEQ ID NOs:118、119，和170的氨基酸序列的肽相关的活性成分的受试者，优选选择HLA-A33阳性受试者。
本发明还提供了本发明的肽与HLA的复合物。上述本发明的复合物可以是单体或多聚体。当本发明的复合物为多聚体时，聚合的数目没有特别限制，且可以是任何聚合数目的多聚体。例子包括但不限于四聚体，五聚体，六聚体等。本发明的多聚体还包括dextramers(WO2002/072631)和streptamers(Knabel M等人,Nat Med.2002 Jun；8(6):631-7.)。本发明的肽和HLA的复合物可以根据已知方法制备(例如,Altman JD等人,Science.1996,274(5284):94-6；WO2002/072631；WO2009/003492；Knabel M,Nat Med.2002Jun；8(6):631-7等)。
例如，本发明的复合物可用于定量对本发明的肽特异的CTLs。例如，从施用本发明的药物组合物的受试者收集血液样品，并且在分离PBMC之后制备CD4阴性细胞并与本发明的荧光染料-缀合的复合物接触。然后，可以通过流式细胞术分析测量对本发明的肽特异性的CTLs的百分比。例如，可以通过在施用本发明的药物组合物之前，期间和/或之后测量针对本发明的肽的特异性CTLs来监测本发明的药物组合物的免疫应答诱导作用。
XII.抗体
本发明进一步提供了与本发明的肽结合的抗体。优选的抗体特异性结合本发明的肽且不会结合(或会微弱结合)不是本发明的肽。在另一个实施方案中，此类抗体可以包括在HLA分子的背景下识别肽的抗体，即结合肽-MHC复合物的抗体。抗体的结合特异性可以通过抑制测定来确认。也就是说，如果在本发明的肽的存在下，待分析的抗体与全长MPHOSPH1多肽之间的结合被抑制，则该抗体显示出特异性结合本发明的肽。针对本发明的肽的抗体可用于疾病诊断和预后的测定，以及用于选择施用本发明的药物组合物的受试者选择和监测本发明的药物组合物。
本发明还提供了用于检测和/或定量本发明的肽或其片段的各种免疫测定。此类免疫测定包括但不限于放射免疫测定，免疫色谱，酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶联免疫荧光测定(ELIFA)等，并且在本领域熟知的各种免疫测定形式的范围内进行。
本发明的抗体可以用于可以检测表达MPHOSPH1疾病的免疫学成像方法，且其实例包括但不限于使用本发明的标记抗体的放射性闪烁照相成像。此类测定方法在临床上用于检测，监测和预后表达MPHOSPH1的癌症；且此类癌症的例子包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肿瘤等。
本发明的抗体可以以任何任意形式使用，例如单克隆或多克隆抗体，而且还可包括通过用本发明的肽免疫动物(诸如家兔)而获得的抗血清，所有种类的多克隆和单克隆抗体，人抗体，及通过遗传重组生成的嵌合抗体和人源化抗体。
用作获得抗体的抗原的本发明的肽或其片段可以通过基于本文公开的氨基酸序列通过化学合成或基因工程技术获得。
用作免疫抗原的肽可以是本发明的肽或本发明的肽的片段。此外，该肽可以与载体结合或与载体缀合以增加免疫原性。匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体是公知的。用于将KLH结合至肽的方法也是本领域公知的。
可以用上述抗原免疫任何哺乳动物，且当产生单克隆抗体时优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常，可使用啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如家兔。灵长目动物包括例如狭鼻猿(旧大陆猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴、狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射和皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。然后，优选的是使用每4至21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，可通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。
可以如下制备针对本发明肽的多克隆抗体：从哺乳动物中收集血液(其已经在免疫后确认了所需抗体血清水平的增)，并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体可以是包括含有多克隆抗体的血清，或可以从所述血清中分离的，含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有本发明肽的亲和柱从仅识别本发明肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。
为了制备单克隆抗体，在确认免疫后所需抗体的血清水平增加时，从哺乳动物收集免疫细胞并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞可优选获自脾。对于其他与上述免疫细胞融合的亲本细胞，例如，可以使用哺乳动物骨髓瘤细胞，并且更优选为已获得融合细胞的药物选择性质的骨髓瘤细胞。
可根据已知的方法，例如Milstein等人(Galfre and Milstein,MethodsEnzymol,1981,73:3-46)的方法，将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
对于由细胞融合得到的杂交瘤，可在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基)中培养以进行选择。通常在HAT培养基中继续细胞培养足够的时间(例如，数天至数周)，以允许除了所需的杂交瘤之外的所有其他细胞(非融合细胞)死亡。然后，通过标准有限稀释(standard limiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。
除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用肽、表达肽的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了EB病毒的人淋巴细胞。然后，可以使经过免疫的淋巴细胞与永生化的衍生自人的骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生期望的生成能够与所述肽结合的人抗体的杂交瘤(JPS63-17688)。
然后将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。所得的单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联有本发明肽的亲和柱进行纯化。
或者，可以通过癌基因永生化抗体产生免疫细胞(如免疫的淋巴细胞)，并用于制备单克隆抗体。
如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick,Therapeutic Monoclonal Antibodies,由MacMillanPublishers LTD在英国出版(1990))。例如，可以从免疫细胞诸如杂交瘤或经免疫淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供如上所述制备的重组抗体。
此外，本发明的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它结合本发明的肽。例如，期望抗体片段含有抗体的抗原结合位点。具体来说，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Huston et al.,Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:5879-83)。更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如Co et al.,J Immunol,1994,152:2968-76；Better and Horwitz,Methods Enzymol,1989,178:476-96；Pluckthun and Skerra,Methods Enzymol,1989,178:497-515；Lamoyi,Methods Enzymol,1986,121:652-63；Rousseaux et al.,Methods Enzymol,1986,121:663-9；Bird and Walker,TrendsBiotechnol,1991,9:132-7)。
抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。本发明提供了经过此类修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。这些修饰方法是本领域常规的。
或者，可以以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人抗体的恒定区之间的嵌合抗体或者包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人抗体的框架区(FR)及恒定区的人源化抗体的形式来获得本发明的抗体。此类抗体可依照已知技术来制备。人源化可通过用非人抗体CDR序列取代人抗体的相应序列来进行(参见例如Verhoeyen et al.,Science,1998,239:1534-6)。因而，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中人可变域的一小部分已被来自非人物种的相应序列所取代。
也可以使用完全的人抗体，这样的抗体除了人框架区和恒定区外还包含人可变区。此类抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。例如，体外方法包括使用展示在噬菌体上的人抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom&Winter,J.Mol.Biol.,1991,227:381)。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠，来生成人抗体。该方法记载于例如美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016。
可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦来分离和纯化抗体(Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow和David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D、POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。
除了亲和色谱，示例性的色谱包括，例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification和Characterization:ALaboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak等人,Cold Spring HarborLaboratory Press(1996))。可以通过液相层析来进行层析程序，诸如HPLC和FPLC。
例如，可通过使用吸光度测量、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光(IF)来测量本发明抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明的抗体固定化在板上，将本发明的肽施加到该板上，然后施加含有所需抗体的样品，诸如生成抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后施加用酶(诸如碱性磷酸酶)标记的、识别第一抗体的第二抗体，并将板温育。接着，在洗涤后，向板中加入酶底物，诸如磷酸对硝基苯酯，并通过测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。为了评估抗体的结合活性，可以使用肽片段如C-末端或N-末端片段作为抗原。可以使用BIAcore(Pharmacia)来评估本发明抗体的活性。
通过将本发明的抗体暴露于假定含有本发明的肽的样品，并检测或测量在抗体和肽之间形成的免疫复合物，可以检测或测量使用以上方法的本发明的肽。
例如，本发明的抗体可用于检测受试者的血液样品(例如，血清样品)中存在的本发明的肽。或者，也可以使用本发明的肽来检测受试者血液样品(例如，血清样品)中存在的本发明的抗体。在受试者的血液样品中测量本发明的肽或本发明的抗体的结果可以用于受试者选择用于施用本发明的药物组合物或监测药物组合物的功效。此外，已报道具有抗体(其针对作为疫苗施用的肽)的患者可能对疫苗具有高的应答性。因此，当使用针对肽的抗体作为指标时，还可以利用本发明的肽作为免疫测定抗原用于在癌症患者中选择对包含所述肽的疫苗显示高应答性的患者。
XII.载体和宿主细胞
本发明提供包含编码本发明的肽的多核苷酸的载体和导入有所述载体的宿主细胞。本发明的载体可以用于将本发明的多核苷酸保持在宿主细胞中，以在宿主细胞中表达本发明的肽，或者以施用本发明的多核苷酸用于基因疗法。
当大肠杆菌为宿主细胞且在大肠杆菌(例如JM109、DH5-alpha、HB101或XL1-Blue)中大量扩增和生成载体时，载体需要具有用于在大肠杆菌中扩增的“复制起点”和用于选择经过转化的大肠杆菌的标志基因(例如通过药物诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等进行选择的药物抗性基因)。例如，可以使用M13系列载体、pUC系列载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，pGEM-T，pDIRECT和pT7可用于克隆以及以上载体。当载体用于生产本发明的肽时，可以使用表达载体。例如，要在大肠杆菌中表达的表达载体应具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌诸如JM109、DH5-alpha、HB101或XL1-Blue作为宿主细胞时，载体应具有能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子((Ward et al.,Nature,1989,341:544-6；FASEB J,1989,6:2422-7)、araB启动子(Better et al.,Science,1988,240:1041-3)、T7启动子等。在这方面，可以使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress系统”(Qiagen)、pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)来取代上述载体。另外，载体还可以包含用于肽分泌的信号序列。指导肽分泌至大肠杆菌周质的例示性信号序列有pelB信号序列(Lei et al.,J Bacteriol,1987,169:4379)。用于将载体导入靶宿主细胞的手段包括例如氯化钙法和电穿孔法。
除了大肠杆菌外，还可以使用例如衍生自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS((Nucleic Acids Res,1990,18(17):5322)、pEF、pCDM8)、衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)、pBacPAK8)、衍生自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、衍生自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、衍生自逆转录病毒的表达载体(例如pZIpneo)、衍生自酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)及衍生自枯草芽孢杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)来生成本发明的多肽。
为了在动物细胞诸如CHO、COS或NIH3T3细胞中表达载体，载体应具有在所述细胞中进行表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan et al.,Nature,1979,277:108)、MMLV-LTR启动子、EF1-alpha启动子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res,1990,18:5322)、CMV启动子、等等，及优选用于选择转化子的标志基因(例如通过药物(例如新霉素、G418)进行选择的药物抗性基因)。具有这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV和pOP13。
下面基于上述说明例示本发明的实施方案；然而本发明不限于这些实施方案。
[1]具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1、2或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170。
[2][1]的肽其选自下组(i)至(ii)：
(i)包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含引入选自SEQ ID NOs:5、12、27、52，和53的氨基酸序列的选自以下(a)至(d)的一个或多个取代；
(a)用选自由苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；和
(c)用选自由亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第七个氨基酸；和
(d)用精氨酸取代C末端的氨基酸；和
(ii)包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包含引入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:118、119，和170的选自以下(a)至(c)的一个或多个取代：
(a)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第一个氨基酸；
(b)用选自由苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(c)用赖氨酸取代C末端的氨基酸。
[3][1]的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170。
[4]多核苷酸，其编码[1]至[3]中任一项的肽。
[5]组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[6][5]的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
[7][5]的组合物，其是药物组合物。
[8][7]的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途的药物组合物：(i)癌症治疗,(ii)癌症预防(防范(prophylaxis))和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
[9][7]的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
10][8]或[9]的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌和软组织肿瘤。
[11][5]至[10]中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的HLA阳性的受试者施用：HLA-A11和HLA-A33。
[12]诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)体外，离体或体内将APC与[1]至[3]中任一项的肽接触；和
(b)将编码[1]至[3]中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
[13]诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物；
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的[1]至[3]中任一项的肽。
[14]APC，其在其表面呈递HLA抗原与[1]至[3]中任一项的肽的复合物。
[15][14]的APC，其通过[12]的方法诱导。
[16]CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[17][16]的CTL，其通过[13]的方法诱导。
[18]诱导针对癌症的免疫应答方法，其包含向受试者施用包含选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[19]治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，所述方法包括向受试者施用组合物，所述组合物选自下组(a)至(e)的至少一种活性成分：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[20]抗体，其结合[1]至[3]中任一项的肽。
[21]筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加一个，两个或数个氨基酸残基：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119，和170；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与除MPHOSPH1外的任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
[22]选自下组(a)至(e)中的至少一种活性成分在制备用于诱导针对癌症的免疫应答的组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[23]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在制备用于治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发的药物组合物中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[24]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分在诱导针对癌症的免疫应答中的用途：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[25]选自下组(a)至(e)中的至少一种成分，其用于治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[26]诱导针对表达MPHOSPH1的细胞的细胞毒性活性的方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)中的至少一种成分的步骤：
(a)一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码[1]至[3]中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在细胞表面上呈递[1]至[3]中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向[1]至[3]中任一项的肽。
[27]冷冻干燥制剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽。
[28]药物组合物，其通过包含如下的方法制备：将一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽溶解在水溶性载体中，并进行过滤灭菌。
[29]过滤灭菌水溶液，其是包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽和水溶性载体的水溶液。
[30]乳剂，其包含一种或多种类型的[1]至[3]中任一项的肽，水溶性载体和油佐剂。
[31]试剂盒，其包含容纳[5]至[11]中任一项的药物组合物的容器和容纳佐剂的容器。
[32]试剂盒，其包含储存包含[1]至[3]中任一项的肽的冷冻干燥制剂的容器，储存佐剂的容器，和储存溶解液冷冻干燥制剂的容器。
本文参考其具体实施方案在此详细解释本发明。然而，应当理解，上述解释实际上是说明性和解释性解释，并且旨在解释本发明及其优选实施方式。通过常规实验，本领域技术人员将容易地认识到，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种改变和修改。因此，本发明不限于上述说明，而是旨在由所附权利要求及其等同物限定。
在下文中，参照实施例更为详细地描述本发明。然而，虽然下述材料、方法和实施例可以用来帮助普通技术人员进行和使用本发明的某些实施方案，但是这些仅意图例示本发明的各方面，如此绝不限制本发明的范围。如本领域普通技术人员会容易认可与本文中描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实施或测试。
本文引用的所有现有技术文献通过引用并入本说明书。
实施例
[实施例1]
材料和方法
细胞系
C1R细胞，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系，和COS7细胞，非洲绿猴肾细胞系购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*11:01表达的靶细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*11:01的C1R细胞(C1R-A11)作为刺激CTL的细胞。通过PCR扩增编码HLA-A*11:01基因的cDNA，并整合入表达载体。在药物选择条件下，在含有G418(Invitrogen)的培养基中培养引入了HLA-A*11:01基因表达载体的C1R细胞2周。稀释G418抗性C1R细胞悬液，接种到96孔板中，并进一步在含有G418的培养基中选择培养30天。通过流式细胞术分析来验证C1R细胞中HLA-A*11:01表达。
MPHOSPH1衍生肽的选择
使用结合预测服务器“NetMHC 3.2”(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.2/)(Buus et al.,Tissue Antigens.2003,62(5):378-84；Nielsen et al.,ProteinSci.2003,12(5):1007-17；Bioinformatics.2004,20(9):1388-97)确定了预期结合HLA-A*11:01分子的MPHOSPH1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过American Peptide Company(Sunnyvale,CA)根据标准固相合成法合成所述肽，并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。通过HPLC和质谱确保肽的质量(90％纯度或更高)。将肽溶解在二甲基亚砜(终浓度：20mg/ml)中并保存于-80℃。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递在人白细胞抗原(HLA)上的肽的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如文献报道体外生成DC(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具体地，将用Ficoll-Paqueplus溶液(Pharmacia)从健康志愿者(HLA-A*11:01阳性)收集的外周血单核细胞接种至塑料组织培养皿(Corning)以使PBMC中的单核细胞粘附至所述皿。在1000IU/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白细胞介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养7天。将含有5％灭活的AB型血清(ABS)的AIM-V培养基(Invitrogen)用作培养基。对使用细胞因子诱导从单核细胞分化的DC用20μg/ml的各种合成的肽进行冲击(37摄氏度,3小时)。在含有3μg/ml beta 2-微球蛋白的AIM-V培养基中进行肽冲击。将这些经肽冲激的DC用X射线放射(20Gy)灭活，并以1:20比例与使用CD8阳性分离试剂盒(Invitrogen)通过阳性选择获得的自体CD8+ T细胞混合(1.5x 104DC和3x 105CD8阳性T细胞)，并在48孔板(Corning)中培养。向每个含有0.5ml 5％ABS/AIM-V培养基的孔加入IL-7(R&D System)(终浓度：10ng/ml)。培养开始两天后，加入IL-2(Novartis)(终浓度：20IU/ml)。在培养的第7天和第14天，使用用肽冲击的DC进一步刺激CD8阳性T细胞。DC在使用时通过与上述相同的方法制备。21天后(三次DC刺激后)，使用人干扰素(IFN)-gamma酶联免疫点(ELISPOT)测定(Tanaka H etal.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)来确认针对肽冲击的C1R-A11的IFN-gamma产生。
CTL扩增程序
使用类似于Riddell等人(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995,333(16):1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996,2(2):216-23)报道的方法来扩增CTL。将CTL与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B类淋巴母细胞细胞系(各自为5x 106细胞/25ml培养基)和抗CD3抗体(终浓度：40ng/ml)在25ml 5％ABS/AIM-V培养基中共培养。开始培养后一天，向培养物添加IL-2(终浓度：120IU/ml)。在第5天、第8天和第11天，将培养基更换为含有IL-2(终浓度：30IU/ml)的5％ABS/AIM-V培养基(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,ClinCancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
体外诱导CTL后，将CTL以1个细胞/孔或10个细胞/孔接种到96圆底微量滴定板上(Nalge Nunc International)。在具有抗CD3抗体(终浓度：30ng/ml)和IL-2(终浓度：125IU/ml)的总共150微升/孔的5％AIM-V/AS培养基中，将CTL与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B类淋巴母细胞细胞系(各自为1x 104细胞/孔)共培养。10天后，向培养物添加50微升含有500IU/ml IL-2的5％ABS/AIM-V培养基。在第14天或之后，使用与如上描述相同的方法(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,CancerSci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)扩增在ELISPOT测定中显示出肽特异性IFN-gamma产生的CTL。
IFN-gamma产生的确认
为了确认用肽诱导的CTL的肽特异性IFN-gamma产生，进行了IFN-gamma ELISPOT测定和IFN-gamma ELISA。制备了作为靶细胞的肽冲击的C1R-A11(1x 104细胞/孔)。根据测定试剂盒制造商手册进行IFN-gamma ELISPOT测定和IFN-gamma ELISA。
强制表达MPHOSPH1和HLA-A*11:01的靶细胞的制备
通过PCR来扩增编码MPHOSPH1或HLA-A*11:01基因的cDNA。将PCR扩增的产物各自整合到表达载体中。依照制造商推荐的程序使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将MPHOSPH1基因表达载体和HLA-A*11:01基因表达载体之一或两者引入COS7(其为HLA阴性的细胞系)。在基因引入后的第一天，用versene(Invitrogen)分离并收获COS7细胞，并用作确认IFN-gamma产生的靶细胞(5x 104细胞/孔)。
结果
MPHOSPH1衍生的HLA-A*11:01结合肽的预测
表1a和1b以结合亲和力的降序显示了通过“NetMHC 3.2”预测的结合HLA-A*11:01的MPHOSPH1衍生的9聚体肽和10聚体肽。潜在具有HLA-A*11:01结合能力的总共117个肽被用作表位肽候选物。
[表1a-1]
衍生自MPHOSPH1的HLA-A*11:01结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
109 MAQKFSFSK 8 1
1112 LTQGVTCYK 9 2
1426 KMMLITQAK 11 3
739 TINEFQNLK 12 4
762 TSSLIINNK 13 5
186 RLYTKMNLK 15 6
1547 TSFEISRNK 15 7
350 RSHSIFTVK 18 8
104 KSSGQMAQK 18 9
940 SQIKLMHTK 18 10
903 AIAELHVQK 19 11
1227 SSARTQNLK 19 12
747 KSHMENTFK 24 13
182 SLQERLYTK 24 14
1495 ALISSNVQK 25 15
640 AIFKDLVGK 26 16
935 ITNNVSQIK 30 17
404 NTSLLTLGK 32 18
1702 SILQSKAKK 39 19
565 KAFISHEEK 40 20
1657 KVAIRPSSK 43 21
1192 LTNNLQDMK 58 22
1678 GVNLATKKK 63 23
1719 KLSNVEASK 65 24
814 SSAITEDQK 71 25
1134 KVECSHSAK 76 26
96 CILGRLSEK 86 27
1658 VAIRPSSKK 86 28
216 KSALLRQIK 87 29
290 VSSKFQKRK 132 30
1522 TQIMDIKPK 136 31
1711 IIETMSSSK 138 32
441 QSFFNGKGK 148 33
[表1a-2]
1277 RIKINELEK 179 34
503 SLDSNSNSK 197 35
1486 VAALEIQLK 200 36
1531 RISSADPDK 201 37
1048 LQAEVKGYK 266 38
1753 GQVILMDQK 273 39
1463 ILTAQLTEK 275 40
1279 KINELEKKK 297 41
1098 QIQHVVEGK 300 42
1607 TVKIPKARK 336 43
1116 VTCYKAKIK 390 44
776 TVEVPKDSK 398 45
213 IASKSALLR 404 46
784 KSKICSERK 427 47
1663 SSKKTYSLR 428 48
1676 IIGVNLATK 449 49
439 YFQSFFNGK 480 50
1322 RACKDLNVK 483 51
起始位置指示从MPHOSPH1的N端起的氨基酸残基的数目。解离常数[Kd(nM)]来源于“NetMHC3.2”。
[表1b-1]
衍生自MPHOSPH1的HLA-A*11：01结合10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
1546 STSFEISRNK 8 52
1675 SIIGVNLATK 13 53
1226 ASSARTQNLK 14 54
1603 TTPVTVKIPK 15 55
934 SITNNVSQIK 18 56
149 FTYGLTNSGK 19 57
1710 KIIETMSSSK 23 58
117 KVFGPATTQK 35 59
108 QMAQKFSFSK 35 60
502 VSLDSNSNSK 43 61
1725 ASKENVSQPK 44 62
1494 KALISSNVQK 52 63
1657 KVAIRPSSKK 59 64
813 VSSAITEDQK 61 65
133 IMQPVKDLLK 64 66
761 DTSSLIINNK 64 67
181 DSLQERLYTK 72 68
814 SSAITEDQKK 72 69
1485 LVAALEIQLK 73 70
287 FVPVSSKFQK 79 71
939 VSQIKLMHTK 86 72
639 LAIFKDLVGK 97 73
902 IAIAELHVQK 100 74
64 RIRPFTQSEK 111 75
47 NTEANSFESK 114 76
738 DTINEFQNLK 117 77
1754 QVILMDQKMK 119 78
507 NSNSKILNVK 140 79
83 ILDSQTVVLK 141 80
1768 QIIKRRLRTK 147 81
1111 ELTQGVTCYK 150 82
1462 EILTAQLTEK 157 83
1644 ISDDRNSSVK 184 84
[表1b-2]
1585 IQFTPLQPNK 185 85
1447 YAEDRERFFK 192 86
850 FLLTIENELK 195 87
988 LLGNDYLVSK 196 88
409 TLGKCINVLK 201 89
245 NISEFEESIK 207 90
1097 VQIQHVVEGK 210 91
575 KLLDLIEDLK 217 92
1468 LTEKDSDLQK 217 93
708 LIQELETSNK 231 94
1153 IILKLERNLK 234 95
1277 RIKINELEKK 236 96
413 CINVLKNSEK 244 97
15 YVFSADPIAR 249 98
1366 ATELEKWKEK 265 99
1316 AIQQYERACK 279 100
440 FQSFFNGKGK 282 101
686 KTKGELIKTK 284 102
1115 GVTCYKAKIK 289 103
377 SLCDLAGSER 303 104
576 LLDLIEDLKK 325 105
718 KIITQNQRIK 337 106
177 NVLFDSLQER 339 107
1606 VTVKIPKARK 351 108
273 VSFFEIYNEY 358 109
298 KMLRLSQDVK 371 110
322 DSKEAYRLLK 376 111
1047 KLQAEVKGYK 389 112
875 FQQELSLSEK 396 113
1251 KLTDAKKQIK 441 114
1676 IIGVNLATKK 449 115
1191 QLTNNLQDMK 465 116
469 VLKFSAIAQK 466 117
起始位置指示从MPHOSPH1的N端起的氨基酸残基的数目。解离常数[Kd(nM)]来源于“NetMHC3.2”。
通过预测的MPHOSPH1衍生的HLA-A*11：01限制性肽来诱导CTL
根据“材料和方法”中描述的方案来诱导MPHOSPH1衍生的肽特异性CTL。通过ELISPOT测定来确认肽特异性IFN-gamma产生(图1)。在以下孔中的CTL观察到肽特异性IFN-gamma产生：
使用MPHOSPH1-A11-9-762(SEQ ID NO:5)的孔#3(a)，
使用MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ ID NO:12)的孔#2(b)，
使用MPHOSPH1-A11-9-96(SEQ ID NO:27)的孔#5(c)，
使用MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)的孔#6(d)，和
使用MPHOSPH1-A11-10-1675(SEQ ID NO:53)的孔#5(e)。同时，未观察到针对表1a和1b中所示的其它的肽的特异性IFN-gamma产生。例如，未观察到针对MPHOSPH1-A11-9-739(SEQ ID NO:4)的特异性IFN-gamma产生(f)。结果，尽管所有肽均具有结合HLA-A*11:01的潜力，选择五个肽作为具有CTL诱导能力的肽。
对HLA-A*11:01限制性MPHOSPH1衍生的肽特异的CTL系和克隆的建立
通过增殖IFN-gamma ELISPOT测定中使用MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ ID NO:12)(a)的孔#2中的细胞和使用MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)(b)的孔#6中的细胞来建立CTL系。作为通过ELISA测量IFN-gamma的结果，观察到针对用MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ ID NO:12)(a)或MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)冲击的靶细胞(C1R-A11)的CTL系的IFN-gamma产生(图2)。此外，通过从如以上“材料和方法”部分中描述的有限稀释方法来建立CTL克隆。作为通过ELISA测量IFN-gamma的结果，用MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ IDNO:12)(a)或MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)(b)刺激的CTL克隆各自显示出肽特异性IFN-gamma产生(图3)。
针对表达MPHOSPH1和HLA-A*11:01的靶细胞的IFN-gamma产生
研究了针对表达MPHOSPH1和HLA-A*11:01的靶细胞的MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQID NO:52)特异性CTL克隆的IFN-gamma产生。制备表达MPHOSPH1和HLA-A*11:01两者的COS7细胞作为靶细胞。制备表达MPHOSPH1和HLA-A*11:01之一的COS7细胞作为阴性对照细胞。MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)-特异性CTL克隆显示出针对表达MPHOSPH1和HLA-A*11:01两者的COS7细胞的IFN-gamma产生(图4)。另一方面，未观察到针对阴性对照细胞的显著的IFN-gamma产生。这明确证明了MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)是由抗原加工产生的，并与HLA-A*11:01分子呈递在细胞上的并由CTL识别的肽。这一结果显示，MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)可以作为其中癌细胞中MPHOSPH1表达增加的患者的癌症疫苗。
抗原肽的同源分析
已经确认，MPHOSPH1-A11-9-762(SEQ ID NO:5)、MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ IDNO:12)、MPHOSPH1-A11-9-96(SEQ ID NO:27)、MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)，和MPHOSPH1-A11-10-1675(SEQ ID NO:53)可诱导显示出肽特异性IFN-gamma产生的CTL。因此，为了确认MPHOSPH1-A11-9-762(SEQ ID NO:5)、MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ ID NO:12)、MPHOSPH1-A11-9-96(SEQ ID NO:27)、MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)，和MPHOSPH1-A11-10-1675(SEQ ID NO:53)序列仅源自MPHOSPH1，使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行了肽序列的同源性分析。结果，仅在MPHOSPH1中发现MPHOSPH1-A11-9-762(SEQ ID NO:5)、MPHOSPH1-A11-9-1227(SEQ ID NO:12)、MPHOSPH1-A11-9-96(SEQ ID NO:27)、MPHOSPH1-A11-10-1546(SEQ ID NO:52)，和MPHOSPH1-A11-10-1675(SEQ ID NO:53)序列。因此，根据本发明人的知识，这些肽对MPHOSPH1是特异性的，因此这些肽几乎不可能引起针对MPHOSPH1以外的已知可以使人体免疫系统敏感的分子的非预期的免疫反应。总之，鉴定了新的MPHOSPH1衍生的HLA-A11:01限制性表位肽。证明了MPHOSPH1衍生的表位肽适用于癌症免疫治疗。
[实施例2]
材料和方法
细胞系
C1R细胞，HLA-A阴性和HLA-B阴性人类B淋巴母细胞系，和COS7细胞，非洲绿猴肾细胞系购自ATCC。
具有稳定的HLA-A*33:03表达的靶细胞的生成
使用稳定表达HLA-A*33:03的C1R细胞(C1R-A11)作为刺激CTL的细胞。通过PCR扩增编码HLA-A*33:03基因的cDNA，并整合入表达载体。在药物选择条件下，在含有G418(Invitrogen)的培养基中培养引入了HLA-A*33:03基因表达载体的C1R细胞2周。稀释G418抗性C1R细胞悬液，接种到96孔板中，并进一步在含有G418的培养基中选择培养30天。通过流式细胞术分析来验证C1R细胞中HLA-A*33:03表达。
MPHOSPH1衍生肽的选择
使用结合预测服务器“NetMHC pan2.4”(www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-2.4/)(Nielsen et al.,PLoS One.2007；29；2(8):e796；Hoof et al.,Immunogenetics.2009；61(1):1-13)确定了预期结合HLA-A*33:03分子的MPHOSPH1衍生的9聚体和10聚体肽。
肽合成
通过American Peptide Company(Sunnyvale,CA)根据标准固相合成法合成所述肽，并通过反相高效液相色谱(HPLC)纯化。通过HPLC和质谱确保肽的质量(90％纯度或更高)。将肽溶解在二甲基亚砜(终浓度：20mg/ml)中并保存于-80℃。
体外CTL诱导
使用单核细胞衍生的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞来诱导针对呈递在人白细胞抗原(HLA)上的肽的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如文献报道体外生成DC(Nakahara S et al.,Cancer Res 2003,63(14):4112-8)。具体地，将用Ficoll-Paqueplus溶液(Pharmacia)从健康志愿者(HLA-A*33:03阳性)收集的外周血单核细胞接种至塑料组织培养皿(Corning)以使PBMC中的单核细胞粘附至所述皿。在1000IU/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(R&D System)和1000IU/ml白细胞介素(IL)-4(R&D System)的存在下培养7天。将含有5％灭活的AB型血清(ABS)的AIM-V培养基(Invitrogen)用作培养基。对使用细胞因子诱导从单核细胞分化的DC用20μg/ml的各种合成的肽进行冲击(37摄氏度,3小时)。在含有3μg/ml beta 2-微球蛋白的AIM-V培养基中进行肽冲击。将这些经肽冲激的DC用X射线放射(20Gy)灭活，并以1:20比例与使用CD8阳性分离试剂盒(Invitrogen)通过阳性选择获得的自体CD8+T细胞混合(1.5x 104DC和3x 105CD8阳性T细胞)，并在48孔板(Corning)中培养。向每个含有0.5ml 5％ABS/AIM-V培养基的孔加入IL-7(R&D System)(终浓度：10ng/ml)。培养开始两天后，加入IL-2(Novartis)(终浓度：20IU/ml)。在培养的第7天和第14天，使用用肽冲击的DC进一步刺激CD8阳性T细胞。DC在使用时通过与上述相同的方法制备。21天后(三次DC刺激后)，使用人干扰素(IFN)-gamma酶联免疫点(ELISPOT)测定(Tanaka H etal.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)来确认针对肽冲击的C1R-A33的IFN-gamma产生。
CTL扩增程序
使用类似于Riddell等人(Walter EA et al.,N Engl J Med 1995,333(16):1038-44；Riddell SR et al.,Nat Med 1996,2(2):216-23)报道的方法来扩增CTL。将CTL与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B类淋巴母细胞细胞系(各自为5x 106细胞/25ml培养基)和抗CD3抗体(终浓度：40ng/ml)在25ml 5％ABS/AIM-V培养基中共培养。开始培养后一天，向培养物添加IL-2(终浓度：120IU/ml)。在第5天、第8天和第11天，将培养基更换为含有IL-2(终浓度：30IU/ml)的5％ABS/AIM-V培养基(Tanaka H et al.,Br J Cancer 2001,84(1):94-9；Umano Y et al.,Br J Cancer 2001,84(8):1052-7；Uchida N et al.,ClinCancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,Cancer Sci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)。
CTL克隆的建立
体外诱导CTL后，将CTL以1个细胞/孔或10个细胞/孔接种到96圆底微量滴定板上(Nalge Nunc International)。在具有抗CD3抗体(终浓度：30ng/ml)和IL-2(终浓度：125IU/ml)的总共150微升/孔的5％AIM-V/AS培养基中，将CTL与两种类型的经丝裂霉素C处理的人B类淋巴母细胞细胞系(各自为1x104细胞/孔)共培养。10天后，向培养物添加含有500IU/ml IL-2的50微升，5％ABS/AIM-V培养基。在第14天或之后，使用与如上描述相同的方法(Uchida N et al.,Clin Cancer Res 2004,10(24):8577-86；Suda T et al.,CancerSci 2006,97(5):411-9；Watanabe T et al.,Cancer Sci 2005,96(8):498-506)扩增在ELISPOT测定中显示出肽特异性IFN-gamma产生的CTL。
IFN-gamma产生的确认
为了确认用肽诱导的CTL的肽特异性IFN-gamma产生，进行了IFN-gamma ELISPOT测定和IFN-gamma ELISA。制备了作为靶细胞的肽冲击的C1R-A33(1x 104细胞/孔)。根据测定试剂盒制造商手册进行IFN-gamma ELISPOT测定和IFN-gamma ELISA。
强制表达MPHOSPH1和HLA-A*33:03的靶细胞的制备
通过PCR来扩增编码MPHOSPH1或HLA-A*33:03基因的cDNA。将PCR扩增的产物各自整合到表达载体中。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，将MPHOSPH1基因表达载体和HLA-A*33:03基因表达载体之一或两者引入COS7(其为HLA阴性的细胞系)。在基因引入后的第一天，用versene(Invitrogen)分离并收获COS7细胞，并用作确认IFN-gamma产生的靶细胞(5x104细胞/孔)。
结果
MPHOSPH1衍生的HLA-A*33:03结合肽的预测
表2a和2b以结合亲和力的降序显示了通过“NetMHC pan2.4”，预测的结合HLA-A*33:03的MPHOSPH1衍生的9聚体肽和10聚体肽。潜在具有HLA-A*33:03结合能力的总共78个肽被用作表位肽候选物。
[表2a-1]
衍生自MPHOSPH1的HLA-A*33:03结合9聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
608 EFTQYWAQR 17.06 118
1474 DLQKWREER 25.07 119
1523 QIMDIKPKR 35.56 120
1663 SSKKTYSLR 41.91 48
509 NSKILNVKR 71.91 121
1767 HQIIKRRLR 82.02 122
629 EILEENAER 85.51 123
1606 VTVKIPKAR 101.85 124
293 KFQKRKMLR 108.81 125
1151 ESIILKLER 113.20 126
424 KFQQHVPFR 119.23 127
4 NFNQEGVPR 119.92 128
305 DVKGYSFIK 145.68 129
1112 LTQGVTCYK 163.64 2
1198 DMKHLLQLK 165.44 130
962 SNIDLLNLR 190.24 131
16 VFSADPIAR 191.67 132
109 MAQKFSFSK 194.66 1
739 TINEFQNLK 206.27 4
1443 EMKKYAEDR 208.73 133
439 YFQSFFNGK 228.11 50
1730 VSQPKRAKR 229.27 134
1001 EYRIQEPNR 239.25 135
995 VSKQVKEYR 251.90 136
178 VLFDSLQER 270.86 137
830 NIAEIEDIR 320.33 138
1545 LSTSFEISR 331.38 139
191 MNLKPHRSR 337.04 140
1262 VQKEVSVMR 434.39 141
285 DLFVPVSSK 456.68 142
1356 EAKLEEVER 509.15 143
282 YIYDLFVPV 545.45 144
1378 DLETKNNQR 597.27 145
[表2a-2]
566 AFISHEEKR 647.83 146
274 SFFEIYNEY 699.38 147
289 PVSSKFQKR 723.20 148
1633 NATPRTNLK 726.27 149
644 DLVGKCDTR 831.89 150
1629 ENKKNATPR 874.58 151
182 SLQERLYTK 888.77 14
364 DSEMSRVIR 927.06 152
起始位置指示从MPHOSPH1的N端起的氨基酸残基的数目。解离常数[Kd(nM)]来源于“NetMHCpan 2.4”。
[表2b-1]
衍生自MPHOSPH1的HLA-A*33：03结合10聚体肽
起始位置 氨基酸序列 Kd(nM) SEQ ID NO
15 YVFSADPIAR 28.76 98
619 DFKETLLQER 29.78 153
341 FTKLNNASSR 35.36 154
782 DSKSKICSER 39.22 155
188 YTKMNLKPHR 47.68 156
212 EIASKSALLR 58.27 157
438 HYFQSFFNGK 75.94 158
319 QVSDSKEAYR 87.99 159
1729 NVSQPKRAKR 88.94 160
944 LMHTKIDELR 102.01 161
1607 TVKIPKARKR 121.80 162
177 NVLFDSLQER 123.79 107
738 DTINEFQNLK 137.06 77
994 LVSKQVKEYR 144.15 163
387 TMKTQNEGER 154.63 164
761 DTSSLIINNK 169.23 67
924 LSNEIETATR 191.09 165
1639 NLKFPISDDR 216.60 166
149 FTYGLTNSGK 268.53 57
377 SLCDLAGSER 319.11 104
629 EILEENAERR 327.56 167
190 KMNLKPHRSR 335.96 168
1261 QVQKEVSVMR 360.40 169
57 DYLQVCLRIR 517.46 170
1098 QIQHVVEGKR 527.36 171
582 DLKKKLINEK 542.54 172
108 QMAQKFSFSK 543.93 60
961 ISNIDLLNLR 584.25 173
508 SNSKILNVKR 611.66 174
181 DSLQERLYTK 633.51 68
3 SNFNQEGVPR 636.03 175
194 KPHRSREYLR 678.04 176
1268 VMRDEDKLLR 736.18 177
[表2b-2]
1522 TQIMDIKPKR 810.10 178
322 DSKEAYRLLK 833.84 111
607 QEFTQYWAQR 939.95 179
565 KAFISHEEKR 943.45 180
起始位置指示从MPHOSPH1的N端起的氨基酸残基的数目。解离常数[Kd(nM)]来源于“NetMHCpan 2.4”。
通过预测的MPHOSPH1衍生的HLA-A*33：03限制性肽来诱导CTL
根据“材料和方法”中描述的方案来诱导MPHOSPH1衍生的肽特异性CTL。通过ELISPOT测定来确认肽特异性IFN-gamma产生(图5)。在以下孔中的CTL观察到肽特异性IFN-gamma生产：
使用MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO：118)的孔#4(a)，
使用MPHOSPH1-A33-9-1474(SEQ ID NO：119)的孔#6(b)，和
使用MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO：170)的孔#8(c)。同时，未观察到针对表2a和2b中所示的其它的肽的特异性IFN-gamma产生。例如，未观察到针对MPHOSPH1-A33-9-1663(SEQ ID NO：48)的特异性IFN-gamma产生(d)。结果，尽管所有肽均具有结合HLA-A*33：03的潜力，选择三个肽作为具有CTL诱导能力的肽。
对HLA-A*33：03限制性MPHOSPH1衍生的肽特异的CTL系和克隆的建立
通过增殖IFN-gamma ELISPOT测定中使用MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO：118)(a)的孔#4中的细胞和使用MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO：170)(b)的孔#8中的细胞来建立CTL系。作为通过ELISA测量IFN-gamma的结果，观察到通过针对用MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO：118)(a)或MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO：170)(b)冲击的靶细胞(C1R-A33)的CTL系的IFN-gamma产生(图6)。此外，通过从如以上“材料和方法”部分中描述的有限稀释方法来建立CTL克隆。作为通过ELISA测量IFN-gamma的结果，用MPHOSPH1-A33-9-608(SEQID NO：118)(a)或MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO：170)(b)刺激的CTL克隆各自显示出肽特异性IFN-gamma产生(图7)。
针对表达MPHOSPH1和HLA-A*33：03的靶细胞的IFN-gamma产生
研究了针对表达MPHOSPH1和HLA-A*33:03的靶细胞的MPHOSPH1-A33-9-608(SEQID NO:118)特异性CTL克隆的IFN-gamma产生。制备表达MPHOSPH1和HLA-A*33:03两者的COS7细胞作为靶细胞。制备表达MPHOSPH1和HLA-A*33:03之一的COS7细胞作为阴性对照细胞。MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)-特异性CTL克隆显示出针对表达MPHOSPH1和HLA-A*33:03两者的COS7细胞的IFN-gamma产生(图8)。另一方面，未观察到针对阴性对照细胞的显著的IFN-gamma产生。这清晰地证明了MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)是由抗原加工产生的，并用HLA-A*33:03分子呈递在细胞上的并由CTL识别的肽。这一结果显示，MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)可以作为其中癌细胞中MPHOSPH1表达增加的患者的癌症疫苗。
抗原肽的同源分析
已经确认，MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)、MPHOSPH1-A33-9-1474(SEQ IDNO:119)，和MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO:170)可诱导显示出肽特异性IFN-gamma产生的CTL。因此，为了确认MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)、MPHOSPH1-A33-9-1474(SEQID NO:119)，和MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO:170)序列仅源自MPHOSPH1，使用BLAST算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行了肽序列的同源性分析。结果，仅在MPHOSPH1中发现MPHOSPH1-A33-9-608(SEQ ID NO:118)、MPHOSPH1-A33-9-1474(SEQ IDNO:119)，和MPHOSPH1-A33-10-57(SEQ ID NO:170)序列。因此，根据本发明人的知识，这些肽对MPHOSPH1是特异性的，因此这些肽几乎不可能引起针对MPHOSPH1以外的已知可以使人体免疫系统敏感的分子的非预期的免疫反应。总之，鉴定了新的MPHOSPH1衍生的HLA-A33:03限制性表位肽。证明了MPHOSPH1衍生的表位肽适用于癌症免疫治疗。
[实施例3]
乳液制剂的制备
将肽溶解在注射用溶剂或无菌生理盐水中，使其为1.0mg/ml至10.0mg/ml，并收集到注射器中。这经由连接器连接至装有与注射溶剂或无菌生理盐水等量的IFA的注射器，然后通过交替地推动两个连接的注射器的注射器柱塞来混合。混合几分钟后，通过滴落试验法(drop test method)评价乳液的完成。滴落试验法可以通过将一滴混合样品滴在水上进行。当滴在水上的样品不立即在水中扩散时，评估乳液完成；并且当滴在水上的样品立即在水中扩散时，该乳液被评估为未完成。当乳液被评估为不完全时，进行进一步混合以完成乳液。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肿瘤等。
冷冻干燥制剂的制备
将肽溶解在注射用溶剂中，使其为1.0mg/ml至10.0mg/ml，并过滤灭菌。将其装入灭菌的小瓶中，并用无菌橡胶塞半封闭。将该小瓶冷冻干燥后，将其完全封闭并用铝盖缝合以产生冷冻干燥的制剂。当使用时，将注射溶剂或无菌生理盐水注入小瓶中以重新溶解冷冻干燥的粉末。使用注射器收集小瓶中的再溶解溶液，并且通过连接器将注射器与填充有与收集的再溶解溶液的量相同量的IFA的注射器连接。通过交替地推动两个连接的注射器的注射器柱塞来混合重新溶解的溶液和IFA。混合几分钟后，通过滴落试验法(drop testmethod)评价乳液的完成。可以通过皮下注射将完成的乳剂施用于癌症患者。经受施用的癌症患者可以选自受以下癌症影响的患者：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肿瘤等。
工业应用性
本发明提供了MPHOSPH1衍生的新型HLA-A11限制性，HLA-A33限制性，HLA-A03限制性和HLA-A33限制性表位肽，其诱导强而特异性的抗肿瘤免疫应答，并且因此具有广泛的癌症类型的可用性。本发明的肽，组合物，APCs和CTLs可用作针对表达MPHOSPH1癌症的肽疫苗，例如：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、和软组织肿瘤。
尽管本文详细地并且关于其具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，前述描述本质上是示例性和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。经由常规实验，本领域技术人员会容易地认识到，可以对本发明进行各种变化和修饰，而不偏离本发明的精神和范围，本发明的边界和范围由所附权利要求来限定。
序列表
<110> 肿瘤疗法科学股份有限公司
<120> MPHOSPH1衍生的肽和包含它们的疫苗
<130> ONC-A1603P
<150> JP 2015-200220
<151> 2015-10-08
<160> 189
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 1
Met Ala Gln Lys Phe Ser Phe Ser Lys
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 2
Leu Thr Gln Gly Val Thr Cys Tyr Lys
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 3
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1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 4
Thr Ile Asn Glu Phe Gln Asn Leu Lys
1 5
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<212> PRT
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<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 13
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<213> 人工序列
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<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 14
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<213> 人工序列
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<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 15
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<213> 人工序列
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<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 19
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 20
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 21
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 22
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<212> PRT
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<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<211> 9
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<220>
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 26
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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Cys Ile Leu Gly Arg Leu Ser Glu Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 28
Val Ala Ile Arg Pro Ser Ser Lys Lys
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 29
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<212> PRT
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<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 30
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<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
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Ile Ile Glu Thr Met Ser Ser Ser Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 33
Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys Gly Lys
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 34
Arg Ile Lys Ile Asn Glu Leu Glu Lys
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 35
Ser Leu Asp Ser Asn Ser Asn Ser Lys
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 36
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<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 37
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 38
Leu Gln Ala Glu Val Lys Gly Tyr Lys
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 39
Gly Gln Val Ile Leu Met Asp Gln Lys
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 40
Ile Leu Thr Ala Gln Leu Thr Glu Lys
1 5
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 41
Lys Ile Asn Glu Leu Glu Lys Lys Lys
1 5
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 42
Gln Ile Gln His Val Val Glu Gly Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 43
Thr Val Lys Ile Pro Lys Ala Arg Lys
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 44
Val Thr Cys Tyr Lys Ala Lys Ile Lys
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 45
Thr Val Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 46
Ile Ala Ser Lys Ser Ala Leu Leu Arg
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 47
Lys Ser Lys Ile Cys Ser Glu Arg Lys
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 48
Ser Ser Lys Lys Thr Tyr Ser Leu Arg
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 49
Ile Ile Gly Val Asn Leu Ala Thr Lys
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 50
Tyr Phe Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 51
Arg Ala Cys Lys Asp Leu Asn Val Lys
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 52
Ser Thr Ser Phe Glu Ile Ser Arg Asn Lys
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 53
Ser Ile Ile Gly Val Asn Leu Ala Thr Lys
1 5 10
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 54
Ala Ser Ser Ala Arg Thr Gln Asn Leu Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 55
Thr Thr Pro Val Thr Val Lys Ile Pro Lys
1 5 10
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 56
Ser Ile Thr Asn Asn Val Ser Gln Ile Lys
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 57
Phe Thr Tyr Gly Leu Thr Asn Ser Gly Lys
1 5 10
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 58
Lys Ile Ile Glu Thr Met Ser Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 59
Lys Val Phe Gly Pro Ala Thr Thr Gln Lys
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 60
Gln Met Ala Gln Lys Phe Ser Phe Ser Lys
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 61
Val Ser Leu Asp Ser Asn Ser Asn Ser Lys
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 62
Ala Ser Lys Glu Asn Val Ser Gln Pro Lys
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 63
Lys Ala Leu Ile Ser Ser Asn Val Gln Lys
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 64
Lys Val Ala Ile Arg Pro Ser Ser Lys Lys
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 65
Val Ser Ser Ala Ile Thr Glu Asp Gln Lys
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 66
Ile Met Gln Pro Val Lys Asp Leu Leu Lys
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 67
Asp Thr Ser Ser Leu Ile Ile Asn Asn Lys
1 5 10
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 68
Asp Ser Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Thr Lys
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 69
Ser Ser Ala Ile Thr Glu Asp Gln Lys Lys
1 5 10
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 70
Leu Val Ala Ala Leu Glu Ile Gln Leu Lys
1 5 10
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 71
Phe Val Pro Val Ser Ser Lys Phe Gln Lys
1 5 10
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 72
Val Ser Gln Ile Lys Leu Met His Thr Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 73
Leu Ala Ile Phe Lys Asp Leu Val Gly Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 74
Ile Ala Ile Ala Glu Leu His Val Gln Lys
1 5 10
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 75
Arg Ile Arg Pro Phe Thr Gln Ser Glu Lys
1 5 10
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 76
Asn Thr Glu Ala Asn Ser Phe Glu Ser Lys
1 5 10
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 77
Asp Thr Ile Asn Glu Phe Gln Asn Leu Lys
1 5 10
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 78
Gln Val Ile Leu Met Asp Gln Lys Met Lys
1 5 10
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 79
Asn Ser Asn Ser Lys Ile Leu Asn Val Lys
1 5 10
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 80
Ile Leu Asp Ser Gln Thr Val Val Leu Lys
1 5 10
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 81
Gln Ile Ile Lys Arg Arg Leu Arg Thr Lys
1 5 10
<210> 82
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 82
Glu Leu Thr Gln Gly Val Thr Cys Tyr Lys
1 5 10
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 83
Glu Ile Leu Thr Ala Gln Leu Thr Glu Lys
1 5 10
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 84
Ile Ser Asp Asp Arg Asn Ser Ser Val Lys
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 85
Ile Gln Phe Thr Pro Leu Gln Pro Asn Lys
1 5 10
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 86
Tyr Ala Glu Asp Arg Glu Arg Phe Phe Lys
1 5 10
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 87
Phe Leu Leu Thr Ile Glu Asn Glu Leu Lys
1 5 10
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 88
Leu Leu Gly Asn Asp Tyr Leu Val Ser Lys
1 5 10
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 89
Thr Leu Gly Lys Cys Ile Asn Val Leu Lys
1 5 10
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 90
Asn Ile Ser Glu Phe Glu Glu Ser Ile Lys
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 91
Val Gln Ile Gln His Val Val Glu Gly Lys
1 5 10
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 92
Lys Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu Lys
1 5 10
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 93
Leu Thr Glu Lys Asp Ser Asp Leu Gln Lys
1 5 10
<210> 94
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 94
Leu Ile Gln Glu Leu Glu Thr Ser Asn Lys
1 5 10
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 95
Ile Ile Leu Lys Leu Glu Arg Asn Leu Lys
1 5 10
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 96
Arg Ile Lys Ile Asn Glu Leu Glu Lys Lys
1 5 10
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 97
Cys Ile Asn Val Leu Lys Asn Ser Glu Lys
1 5 10
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 98
Tyr Val Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala Arg
1 5 10
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 99
Ala Thr Glu Leu Glu Lys Trp Lys Glu Lys
1 5 10
<210> 100
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 100
Ala Ile Gln Gln Tyr Glu Arg Ala Cys Lys
1 5 10
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 101
Phe Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys Gly Lys
1 5 10
<210> 102
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 102
Lys Thr Lys Gly Glu Leu Ile Lys Thr Lys
1 5 10
<210> 103
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 103
Gly Val Thr Cys Tyr Lys Ala Lys Ile Lys
1 5 10
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 104
Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser Glu Arg
1 5 10
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 105
Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu Lys Lys
1 5 10
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 106
Lys Ile Ile Thr Gln Asn Gln Arg Ile Lys
1 5 10
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 107
Asn Val Leu Phe Asp Ser Leu Gln Glu Arg
1 5 10
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 108
Val Thr Val Lys Ile Pro Lys Ala Arg Lys
1 5 10
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 109
Val Ser Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu Tyr
1 5 10
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 110
Lys Met Leu Arg Leu Ser Gln Asp Val Lys
1 5 10
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 111
Asp Ser Lys Glu Ala Tyr Arg Leu Leu Lys
1 5 10
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 112
Lys Leu Gln Ala Glu Val Lys Gly Tyr Lys
1 5 10
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 113
Phe Gln Gln Glu Leu Ser Leu Ser Glu Lys
1 5 10
<210> 114
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 114
Lys Leu Thr Asp Ala Lys Lys Gln Ile Lys
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 115
Ile Ile Gly Val Asn Leu Ala Thr Lys Lys
1 5 10
<210> 116
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 116
Gln Leu Thr Asn Asn Leu Gln Asp Met Lys
1 5 10
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 117
Val Leu Lys Phe Ser Ala Ile Ala Gln Lys
1 5 10
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 118
Glu Phe Thr Gln Tyr Trp Ala Gln Arg
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 119
Asp Leu Gln Lys Trp Arg Glu Glu Arg
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 120
Gln Ile Met Asp Ile Lys Pro Lys Arg
1 5
<210> 121
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 121
Asn Ser Lys Ile Leu Asn Val Lys Arg
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 122
His Gln Ile Ile Lys Arg Arg Leu Arg
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 123
Glu Ile Leu Glu Glu Asn Ala Glu Arg
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 124
Val Thr Val Lys Ile Pro Lys Ala Arg
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 125
Lys Phe Gln Lys Arg Lys Met Leu Arg
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 126
Glu Ser Ile Ile Leu Lys Leu Glu Arg
1 5
<210> 127
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 127
Lys Phe Gln Gln His Val Pro Phe Arg
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 128
Asn Phe Asn Gln Glu Gly Val Pro Arg
1 5
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 129
Asp Val Lys Gly Tyr Ser Phe Ile Lys
1 5
<210> 130
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 130
Asp Met Lys His Leu Leu Gln Leu Lys
1 5
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 131
Ser Asn Ile Asp Leu Leu Asn Leu Arg
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 132
Val Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala Arg
1 5
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 133
Glu Met Lys Lys Tyr Ala Glu Asp Arg
1 5
<210> 134
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 134
Val Ser Gln Pro Lys Arg Ala Lys Arg
1 5
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 135
Glu Tyr Arg Ile Gln Glu Pro Asn Arg
1 5
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 136
Val Ser Lys Gln Val Lys Glu Tyr Arg
1 5
<210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 137
Val Leu Phe Asp Ser Leu Gln Glu Arg
1 5
<210> 138
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 138
Asn Ile Ala Glu Ile Glu Asp Ile Arg
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 139
Leu Ser Thr Ser Phe Glu Ile Ser Arg
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 140
Met Asn Leu Lys Pro His Arg Ser Arg
1 5
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 141
Val Gln Lys Glu Val Ser Val Met Arg
1 5
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 142
Asp Leu Phe Val Pro Val Ser Ser Lys
1 5
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 143
Glu Ala Lys Leu Glu Glu Val Glu Arg
1 5
<210> 144
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 144
Tyr Ile Tyr Asp Leu Phe Val Pro Val
1 5
<210> 145
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 145
Asp Leu Glu Thr Lys Asn Asn Gln Arg
1 5
<210> 146
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 146
Ala Phe Ile Ser His Glu Glu Lys Arg
1 5
<210> 147
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 147
Ser Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu Tyr
1 5
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 148
Pro Val Ser Ser Lys Phe Gln Lys Arg
1 5
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 149
Asn Ala Thr Pro Arg Thr Asn Leu Lys
1 5
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 150
Asp Leu Val Gly Lys Cys Asp Thr Arg
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 151
Glu Asn Lys Lys Asn Ala Thr Pro Arg
1 5
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 152
Asp Ser Glu Met Ser Arg Val Ile Arg
1 5
<210> 153
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 153
Asp Phe Lys Glu Thr Leu Leu Gln Glu Arg
1 5 10
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 154
Phe Thr Lys Leu Asn Asn Ala Ser Ser Arg
1 5 10
<210> 155
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 155
Asp Ser Lys Ser Lys Ile Cys Ser Glu Arg
1 5 10
<210> 156
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 156
Tyr Thr Lys Met Asn Leu Lys Pro His Arg
1 5 10
<210> 157
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 157
Glu Ile Ala Ser Lys Ser Ala Leu Leu Arg
1 5 10
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 158
His Tyr Phe Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys
1 5 10
<210> 159
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 159
Gln Val Ser Asp Ser Lys Glu Ala Tyr Arg
1 5 10
<210> 160
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 160
Asn Val Ser Gln Pro Lys Arg Ala Lys Arg
1 5 10
<210> 161
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 161
Leu Met His Thr Lys Ile Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 162
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 162
Thr Val Lys Ile Pro Lys Ala Arg Lys Arg
1 5 10
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 163
Leu Val Ser Lys Gln Val Lys Glu Tyr Arg
1 5 10
<210> 164
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 164
Thr Met Lys Thr Gln Asn Glu Gly Glu Arg
1 5 10
<210> 165
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 165
Leu Ser Asn Glu Ile Glu Thr Ala Thr Arg
1 5 10
<210> 166
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 166
Asn Leu Lys Phe Pro Ile Ser Asp Asp Arg
1 5 10
<210> 167
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 167
Glu Ile Leu Glu Glu Asn Ala Glu Arg Arg
1 5 10
<210> 168
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 168
Lys Met Asn Leu Lys Pro His Arg Ser Arg
1 5 10
<210> 169
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 169
Gln Val Gln Lys Glu Val Ser Val Met Arg
1 5 10
<210> 170
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 170
Asp Tyr Leu Gln Val Cys Leu Arg Ile Arg
1 5 10
<210> 171
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 171
Gln Ile Gln His Val Val Glu Gly Lys Arg
1 5 10
<210> 172
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 172
Asp Leu Lys Lys Lys Leu Ile Asn Glu Lys
1 5 10
<210> 173
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 173
Ile Ser Asn Ile Asp Leu Leu Asn Leu Arg
1 5 10
<210> 174
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 174
Ser Asn Ser Lys Ile Leu Asn Val Lys Arg
1 5 10
<210> 175
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 175
Ser Asn Phe Asn Gln Glu Gly Val Pro Arg
1 5 10
<210> 176
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 176
Lys Pro His Arg Ser Arg Glu Tyr Leu Arg
1 5 10
<210> 177
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 177
Val Met Arg Asp Glu Asp Lys Leu Leu Arg
1 5 10
<210> 178
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 178
Thr Gln Ile Met Asp Ile Lys Pro Lys Arg
1 5 10
<210> 179
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 179
Gln Glu Phe Thr Gln Tyr Trp Ala Gln Arg
1 5 10
<210> 180
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自MPHOSPH1的肽
<400> 180
Lys Ala Phe Ile Ser His Glu Glu Lys Arg
1 5 10
<210> 181
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 181
gtctaccagg cattcgcttc at 22
<210> 182
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 182
tcagctggac cacagccgca gcgt 24
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 183
tcagaaatcc tttctcttga c 21
<210> 184
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于TCR分析的PCR引物
<400> 184
ctagcctctg gaatcctttc tctt 24
<210> 185
<211> 6339
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (93)..(5435)
<400> 185
agtgcggtgc cctggccgcc attgtttgaa tttgaaaacg gtaacatcgc agtgctgctc 60
gcgggtctgg ctagtcaggc gaagtttgca ga atg gaa tct aat ttt aat caa 113
Met Glu Ser Asn Phe Asn Gln
1 5
gag gga gta cct cga cca tct tat gtt ttt agt gct gac cca att gca 161
Glu Gly Val Pro Arg Pro Ser Tyr Val Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala
10 15 20
agg cct tca gaa ata aat ttc gat ggc att aag ctt gat ctg tct cat 209
Arg Pro Ser Glu Ile Asn Phe Asp Gly Ile Lys Leu Asp Leu Ser His
25 30 35
gaa ttt tcc tta gtt gct cca aat act gag gca aac agt ttc gaa tct 257
Glu Phe Ser Leu Val Ala Pro Asn Thr Glu Ala Asn Ser Phe Glu Ser
40 45 50 55
aaa gat tat ctc cag gtt tgt ctt cga ata aga cca ttt aca cag tca 305
Lys Asp Tyr Leu Gln Val Cys Leu Arg Ile Arg Pro Phe Thr Gln Ser
60 65 70
gaa aaa gaa ctt gag tct gag ggc tgt gtg cat att ctg gat tca cag 353
Glu Lys Glu Leu Glu Ser Glu Gly Cys Val His Ile Leu Asp Ser Gln
75 80 85
act gtt gtg ctg aaa gag cct caa tgc atc ctt ggt cgg tta agt gaa 401
Thr Val Val Leu Lys Glu Pro Gln Cys Ile Leu Gly Arg Leu Ser Glu
90 95 100
aaa agc tca ggg cag atg gca cag aaa ttc agt ttt tcc aag gtt ttt 449
Lys Ser Ser Gly Gln Met Ala Gln Lys Phe Ser Phe Ser Lys Val Phe
105 110 115
ggc cca gca act aca cag aag gaa ttc ttt cag ggt tgc att atg caa 497
Gly Pro Ala Thr Thr Gln Lys Glu Phe Phe Gln Gly Cys Ile Met Gln
120 125 130 135
cca gta aaa gac ctc ttg aaa gga cag agt cgt ctg att ttt act tac 545
Pro Val Lys Asp Leu Leu Lys Gly Gln Ser Arg Leu Ile Phe Thr Tyr
140 145 150
ggg cta acc aat tca gga aaa aca tat aca ttt caa ggg aca gaa gaa 593
Gly Leu Thr Asn Ser Gly Lys Thr Tyr Thr Phe Gln Gly Thr Glu Glu
155 160 165
aat att ggc att ctg cct cga act ttg aat gta tta ttt gat agt ctt 641
Asn Ile Gly Ile Leu Pro Arg Thr Leu Asn Val Leu Phe Asp Ser Leu
170 175 180
caa gaa aga ctg tat aca aag atg aac ctt aaa cca cat aga tcc aga 689
Gln Glu Arg Leu Tyr Thr Lys Met Asn Leu Lys Pro His Arg Ser Arg
185 190 195
gaa tac tta agg tta tca tca gaa caa gag aaa gaa gaa att gct agc 737
Glu Tyr Leu Arg Leu Ser Ser Glu Gln Glu Lys Glu Glu Ile Ala Ser
200 205 210 215
aaa agt gca ttg ctt cgg caa att aaa gag gtt act gtg cat aat gat 785
Lys Ser Ala Leu Leu Arg Gln Ile Lys Glu Val Thr Val His Asn Asp
220 225 230
agt gat gat act ctt tat gga agt tta act aac tct ttg aat atc tca 833
Ser Asp Asp Thr Leu Tyr Gly Ser Leu Thr Asn Ser Leu Asn Ile Ser
235 240 245
gag ttt gaa gaa tcc ata aaa gat tat gaa caa gcc aac ttg aat atg 881
Glu Phe Glu Glu Ser Ile Lys Asp Tyr Glu Gln Ala Asn Leu Asn Met
250 255 260
gct aat agt ata aaa ttt tct gtg tgg gtt tct ttc ttt gaa att tac 929
Ala Asn Ser Ile Lys Phe Ser Val Trp Val Ser Phe Phe Glu Ile Tyr
265 270 275
aat gaa tat att tat gac tta ttt gtt cct gta tca tct aaa ttc caa 977
Asn Glu Tyr Ile Tyr Asp Leu Phe Val Pro Val Ser Ser Lys Phe Gln
280 285 290 295
aag aga aag atg ctg cgc ctt tcc caa gac gta aag ggc tat tct ttt 1025
Lys Arg Lys Met Leu Arg Leu Ser Gln Asp Val Lys Gly Tyr Ser Phe
300 305 310
ata aaa gat cta caa tgg att caa gta tct gat tcc aaa gaa gcc tat 1073
Ile Lys Asp Leu Gln Trp Ile Gln Val Ser Asp Ser Lys Glu Ala Tyr
315 320 325
aga ctt tta aaa cta gga ata aag cac cag agt gtt gcc ttc aca aaa 1121
Arg Leu Leu Lys Leu Gly Ile Lys His Gln Ser Val Ala Phe Thr Lys
330 335 340
ttg aat aat gct tcc agt aga agt cac agc ata ttc act gtt aaa ata 1169
Leu Asn Asn Ala Ser Ser Arg Ser His Ser Ile Phe Thr Val Lys Ile
345 350 355
tta cag att gaa gat tct gaa atg tct cgt gta att cga gtc agt gaa 1217
Leu Gln Ile Glu Asp Ser Glu Met Ser Arg Val Ile Arg Val Ser Glu
360 365 370 375
tta tct tta tgt gat ctt gct ggt tca gaa cga act atg aag aca cag 1265
Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser Glu Arg Thr Met Lys Thr Gln
380 385 390
aat gaa ggt gaa agg tta aga gag act ggg aat atc aac act tct tta 1313
Asn Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Thr Gly Asn Ile Asn Thr Ser Leu
395 400 405
ttg act ctg gga aag tgt att aac gtc ttg aag aat agt gaa aag tca 1361
Leu Thr Leu Gly Lys Cys Ile Asn Val Leu Lys Asn Ser Glu Lys Ser
410 415 420
aag ttt caa cag cat gtg cct ttc cgg gaa agt aaa ctg act cac tat 1409
Lys Phe Gln Gln His Val Pro Phe Arg Glu Ser Lys Leu Thr His Tyr
425 430 435
ttt caa agt ttt ttt aat ggt aaa ggg aaa att tgt atg att gtc aat 1457
Phe Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys Gly Lys Ile Cys Met Ile Val Asn
440 445 450 455
atc agc caa tgt tat tta gcc tat gat gaa aca ctc aat gta ttg aag 1505
Ile Ser Gln Cys Tyr Leu Ala Tyr Asp Glu Thr Leu Asn Val Leu Lys
460 465 470
ttc tcc gcc att gca caa aaa gtt tgt gtc cca gac act tta aat tcc 1553
Phe Ser Ala Ile Ala Gln Lys Val Cys Val Pro Asp Thr Leu Asn Ser
475 480 485
tct caa gag aaa tta ttt gga cct gtc aaa tct tct caa gat gta tca 1601
Ser Gln Glu Lys Leu Phe Gly Pro Val Lys Ser Ser Gln Asp Val Ser
490 495 500
cta gac agt aat tca aac agt aaa ata tta aat gta aaa aga gcc acc 1649
Leu Asp Ser Asn Ser Asn Ser Lys Ile Leu Asn Val Lys Arg Ala Thr
505 510 515
att tca tgg gaa aat agt cta gaa gat ttg atg gaa gac gag gat ttg 1697
Ile Ser Trp Glu Asn Ser Leu Glu Asp Leu Met Glu Asp Glu Asp Leu
520 525 530 535
gtt gag gag cta gaa aac gct gaa gaa act caa aat gtg gaa act aaa 1745
Val Glu Glu Leu Glu Asn Ala Glu Glu Thr Gln Asn Val Glu Thr Lys
540 545 550
ctt ctt gat gaa gat cta gat aaa aca tta gag gaa aat aag gct ttc 1793
Leu Leu Asp Glu Asp Leu Asp Lys Thr Leu Glu Glu Asn Lys Ala Phe
555 560 565
att agc cac gag gag aaa aga aaa ctg ttg gac tta ata gaa gac ttg 1841
Ile Ser His Glu Glu Lys Arg Lys Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu
570 575 580
aaa aaa aaa ctg ata aat gaa aaa aag gaa aaa tta acc ttg gaa ttt 1889
Lys Lys Lys Leu Ile Asn Glu Lys Lys Glu Lys Leu Thr Leu Glu Phe
585 590 595
aaa att cga gaa gaa gtt aca cag gag ttt act cag tat tgg gct caa 1937
Lys Ile Arg Glu Glu Val Thr Gln Glu Phe Thr Gln Tyr Trp Ala Gln
600 605 610 615
cgg gaa gct gac ttt aag gag act ctg ctt caa gaa cga gag ata tta 1985
Arg Glu Ala Asp Phe Lys Glu Thr Leu Leu Gln Glu Arg Glu Ile Leu
620 625 630
gaa gaa aat gct gaa cgt cgt ttg gct atc ttc aag gat ttg gtt ggt 2033
Glu Glu Asn Ala Glu Arg Arg Leu Ala Ile Phe Lys Asp Leu Val Gly
635 640 645
aaa tgt gac act cga gaa gaa gca gcg aaa gac att tgt gcc aca aaa 2081
Lys Cys Asp Thr Arg Glu Glu Ala Ala Lys Asp Ile Cys Ala Thr Lys
650 655 660
gtt gaa act gaa gaa gct act gct tgt tta gaa cta aag ttt aat caa 2129
Val Glu Thr Glu Glu Ala Thr Ala Cys Leu Glu Leu Lys Phe Asn Gln
665 670 675
att aaa gct gaa tta gct aaa acc aaa gga gaa tta atc aaa acc aaa 2177
Ile Lys Ala Glu Leu Ala Lys Thr Lys Gly Glu Leu Ile Lys Thr Lys
680 685 690 695
gaa gag tta aaa aag aga gaa aat gaa tca gat tca ttg att caa gag 2225
Glu Glu Leu Lys Lys Arg Glu Asn Glu Ser Asp Ser Leu Ile Gln Glu
700 705 710
ctt gag aca tct aat aag aaa ata att aca cag aat caa aga att aaa 2273
Leu Glu Thr Ser Asn Lys Lys Ile Ile Thr Gln Asn Gln Arg Ile Lys
715 720 725
gaa ttg ata aat ata att gat caa aaa gaa gat act atc aac gaa ttt 2321
Glu Leu Ile Asn Ile Ile Asp Gln Lys Glu Asp Thr Ile Asn Glu Phe
730 735 740
cag aac cta aag tct cat atg gaa aac aca ttt aaa tgc aat gac aag 2369
Gln Asn Leu Lys Ser His Met Glu Asn Thr Phe Lys Cys Asn Asp Lys
745 750 755
gct gat aca tct tct tta ata ata aac aat aaa ttg att tgt aat gaa 2417
Ala Asp Thr Ser Ser Leu Ile Ile Asn Asn Lys Leu Ile Cys Asn Glu
760 765 770 775
aca gtt gaa gta cct aag gac agc aaa tct aaa atc tgt tca gaa aga 2465
Thr Val Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Ser Lys Ile Cys Ser Glu Arg
780 785 790
aaa aga gta aat gaa aat gaa ctt cag caa gat gaa cca cca gca aag 2513
Lys Arg Val Asn Glu Asn Glu Leu Gln Gln Asp Glu Pro Pro Ala Lys
795 800 805
aaa ggg tct atc cat gtt agt tca gct atc act gaa gac caa aag aaa 2561
Lys Gly Ser Ile His Val Ser Ser Ala Ile Thr Glu Asp Gln Lys Lys
810 815 820
agt gaa gaa gtg cga ccg aac att gca gaa att gaa gac atc aga gtt 2609
Ser Glu Glu Val Arg Pro Asn Ile Ala Glu Ile Glu Asp Ile Arg Val
825 830 835
tta caa gaa aat aat gaa gga ctg aga gca ttt tta ctc act att gag 2657
Leu Gln Glu Asn Asn Glu Gly Leu Arg Ala Phe Leu Leu Thr Ile Glu
840 845 850 855
aat gaa ctt aaa aat gaa aag gaa gaa aaa gca gaa tta aat aaa cag 2705
Asn Glu Leu Lys Asn Glu Lys Glu Glu Lys Ala Glu Leu Asn Lys Gln
860 865 870
att gtt cat ttt cag cag gaa ctt tct ctt tct gaa aaa aag aat tta 2753
Ile Val His Phe Gln Gln Glu Leu Ser Leu Ser Glu Lys Lys Asn Leu
875 880 885
act tta agt aaa gag gtc caa caa att cag tca aat tat gat att gca 2801
Thr Leu Ser Lys Glu Val Gln Gln Ile Gln Ser Asn Tyr Asp Ile Ala
890 895 900
att gct gaa tta cat gtg cag aaa agt aaa aat caa gaa cag gag gaa 2849
Ile Ala Glu Leu His Val Gln Lys Ser Lys Asn Gln Glu Gln Glu Glu
905 910 915
aag atc atg aaa ttg tca aat gag ata gaa act gct aca aga agc att 2897
Lys Ile Met Lys Leu Ser Asn Glu Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ser Ile
920 925 930 935
aca aat aat gtt tca caa ata aaa tta atg cac acg aaa ata gac gaa 2945
Thr Asn Asn Val Ser Gln Ile Lys Leu Met His Thr Lys Ile Asp Glu
940 945 950
cta cgt act ctt gat tca gtt tct cag att tca aac ata gat ttg ctc 2993
Leu Arg Thr Leu Asp Ser Val Ser Gln Ile Ser Asn Ile Asp Leu Leu
955 960 965
aat ctc agg gat ctg tca aat ggt tct gag gag gat aat ttg cca aat 3041
Asn Leu Arg Asp Leu Ser Asn Gly Ser Glu Glu Asp Asn Leu Pro Asn
970 975 980
aca cag tta gac ctt tta ggt aat gat tat ttg gta agt aag caa gtt 3089
Thr Gln Leu Asp Leu Leu Gly Asn Asp Tyr Leu Val Ser Lys Gln Val
985 990 995
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Lys Glu Tyr Arg Ile Gln Glu Pro Asn Arg Glu Asn Ser Phe His
1000 1005 1010
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Ser Ser Ile Glu Ala Ile Trp Glu Glu Cys Lys Glu Ile Val Lys
1015 1020 1025
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Ala Ser Ser Lys Lys Ser His Gln Ile Glu Glu Leu Glu Gln Gln
1030 1035 1040
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Ile Glu Lys Leu Gln Ala Glu Val Lys Gly Tyr Lys Asp Glu Asn
1045 1050 1055
aat aga cta aag gag aag gag cat aaa aac caa gat gac cta cta 3314
Asn Arg Leu Lys Glu Lys Glu His Lys Asn Gln Asp Asp Leu Leu
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aaa gaa aaa gaa act ctt ata cag cag ctg aaa gaa gaa ttg caa 3359
Lys Glu Lys Glu Thr Leu Ile Gln Gln Leu Lys Glu Glu Leu Gln
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gaa aaa aat gtt act ctt gat gtt caa ata cag cat gta gtt gaa 3404
Glu Lys Asn Val Thr Leu Asp Val Gln Ile Gln His Val Val Glu
1090 1095 1100
gga aag aga gcg ctt tca gaa ctt aca caa ggt gtt act tgc tat 3449
Gly Lys Arg Ala Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gly Val Thr Cys Tyr
1105 1110 1115
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Lys Ala Lys Ile Lys Glu Leu Glu Thr Ile Leu Glu Thr Gln Lys
1120 1125 1130
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Val Glu Cys Ser His Ser Ala Lys Leu Glu Gln Asp Ile Leu Glu
1135 1140 1145
aag gaa tct atc atc tta aag cta gaa aga aat ttg aag gaa ttt 3584
Lys Glu Ser Ile Ile Leu Lys Leu Glu Arg Asn Leu Lys Glu Phe
1150 1155 1160
caa gaa cat ctt cag gat tct gtc aaa aac acc aaa gat tta aat 3629
Gln Glu His Leu Gln Asp Ser Val Lys Asn Thr Lys Asp Leu Asn
1165 1170 1175
gta aag gaa ctc aag ctg aaa gaa gaa atc aca cag tta aca aat 3674
Val Lys Glu Leu Lys Leu Lys Glu Glu Ile Thr Gln Leu Thr Asn
1180 1185 1190
aat ttg caa gat atg aaa cat tta ctt caa tta aaa gaa gaa gaa 3719
Asn Leu Gln Asp Met Lys His Leu Leu Gln Leu Lys Glu Glu Glu
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gaa gaa acc aac agg caa gaa aca gaa aaa ttg aaa gag gaa ctc 3764
Glu Glu Thr Asn Arg Gln Glu Thr Glu Lys Leu Lys Glu Glu Leu
1210 1215 1220
tct gca agc tct gct cgt acc cag aat ctg aaa gca gat ctt cag 3809
Ser Ala Ser Ser Ala Arg Thr Gln Asn Leu Lys Ala Asp Leu Gln
1225 1230 1235
agg aag gaa gaa gat tat gct gac ctg aaa gag aaa ctg act gat 3854
Arg Lys Glu Glu Asp Tyr Ala Asp Leu Lys Glu Lys Leu Thr Asp
1240 1245 1250
gcc aaa aag cag att aag caa gta cag aaa gag gta tct gta atg 3899
Ala Lys Lys Gln Ile Lys Gln Val Gln Lys Glu Val Ser Val Met
1255 1260 1265
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Arg Asp Glu Asp Lys Leu Leu Arg Ile Lys Ile Asn Glu Leu Glu
1270 1275 1280
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Lys Lys Lys Asn Gln Cys Ser Gln Glu Leu Asp Met Lys Gln Arg
1285 1290 1295
acc att cag caa ctc aag gag cag tta aat aat cag aaa gtg gaa 4034
Thr Ile Gln Gln Leu Lys Glu Gln Leu Asn Asn Gln Lys Val Glu
1300 1305 1310
gaa gct ata caa cag tat gag aga gca tgc aaa gat cta aat gtt 4079
Glu Ala Ile Gln Gln Tyr Glu Arg Ala Cys Lys Asp Leu Asn Val
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aaa gag aaa ata att gaa gac atg cga atg aca cta gaa gaa cag 4124
Lys Glu Lys Ile Ile Glu Asp Met Arg Met Thr Leu Glu Glu Gln
1330 1335 1340
gaa caa act cag gta gaa cag gat caa gtg ctt gag gct aaa tta 4169
Glu Gln Thr Gln Val Glu Gln Asp Gln Val Leu Glu Ala Lys Leu
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Glu Glu Val Glu Arg Leu Ala Thr Glu Leu Glu Lys Trp Lys Glu
1360 1365 1370
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Lys Cys Asn Asp Leu Glu Thr Lys Asn Asn Gln Arg Ser Asn Lys
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Glu His Glu Asn Asn Thr Asp Val Leu Gly Lys Leu Thr Asn Leu
1390 1395 1400
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Gln Asp Glu Leu Gln Glu Ser Glu Gln Lys Tyr Asn Ala Asp Arg
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Lys Lys Trp Leu Glu Glu Lys Met Met Leu Ile Thr Gln Ala Lys
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Glu Ala Glu Asn Ile Arg Asn Lys Glu Met Lys Lys Tyr Ala Glu
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Asp Arg Glu Arg Phe Phe Lys Gln Gln Asn Glu Met Glu Ile Leu
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Thr Ala Gln Leu Thr Glu Lys Asp Ser Asp Leu Gln Lys Trp Arg
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Glu Glu Arg Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Glu Ile Gln Leu Lys
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Ala Leu Ile Ser Ser Asn Val Gln Lys Asp Asn Glu Ile Glu Gln
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Leu Lys Arg Ile Ile Ser Glu Thr Ser Lys Ile Glu Thr Gln Ile
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Leu Gln Thr Glu Pro Leu Ser Thr Ser Phe Glu Ile Ser Arg Asn
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Lys Ile Glu Asp Gly Ser Val Val Leu Asp Ser Cys Glu Val Ser
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Ile Gln Phe Thr Pro Leu Gln Pro Asn Lys Met Ala Val Lys His
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Asn Lys Lys Asn Ala Thr Pro Arg Thr Asn Leu Lys Phe Pro Ile
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Ser Asp Asp Arg Asn Ser Ser Val Lys Lys Glu Gln Lys Val Ala
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Ile Arg Pro Ser Ser Lys Lys Thr Tyr Ser Leu Arg Ser Gln Ala
1660 1665 1670
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Ser Ile Ile Gly Val Asn Leu Ala Thr Lys Lys Lys Glu Gly Thr
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Leu Gln Lys Phe Gly Asp Phe Leu Gln His Ser Pro Ser Ile Leu
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Arg Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Thr Ser Glu Ile Ser Ser Pro Ile
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Asp Ile Ser Gly Gln Val Ile Leu Met Asp Gln Lys Met Lys Glu
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Ser Asp His Gln Ile Ile Lys Arg Arg Leu Arg Thr Lys Thr Ala
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Lys
1780
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acggggtatg tgagatgttt tgacacaggc atgcaatgtg aaatacgtgt atcatggaga 6025
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ctccccctgc aaccgtcagt acccttacca gccactggta accattcttc tactctgtat 6265
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ttgtcaaaaa aaaa 6339
<210> 186
<211> 1780
<212> PRT
<213> 智人
<400> 186
Met Glu Ser Asn Phe Asn Gln Glu Gly Val Pro Arg Pro Ser Tyr Val
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Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala Arg Pro Ser Glu Ile Asn Phe Asp Gly
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Val His Ile Leu Asp Ser Gln Thr Val Val Leu Lys Glu Pro Gln Cys
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Ile Leu Gly Arg Leu Ser Glu Lys Ser Ser Gly Gln Met Ala Gln Lys
100 105 110
Phe Ser Phe Ser Lys Val Phe Gly Pro Ala Thr Thr Gln Lys Glu Phe
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1 5
gag gga gta cct cga cca tct tat gtt ttt agt gct gac cca att gca 161
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10 15 20
agg cct tca gaa ata aat ttc gat ggc att aag ctt gat ctg tct cat 209
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gaa ttt tcc tta gtt gct cca aat act gag gca aac agt ttc gaa tct 257
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aaa gat tat ctc cag gtt tgt ctt cga ata aga cca ttt aca cag tca 305
Lys Asp Tyr Leu Gln Val Cys Leu Arg Ile Arg Pro Phe Thr Gln Ser
60 65 70
gaa aaa gaa ctt gag tct gag ggc tgt gtg cat att ctg gat tca cag 353
Glu Lys Glu Leu Glu Ser Glu Gly Cys Val His Ile Leu Asp Ser Gln
75 80 85
act gtt gtg ctg aaa gag cct caa tgc atc ctt ggt cgg tta agt gaa 401
Thr Val Val Leu Lys Glu Pro Gln Cys Ile Leu Gly Arg Leu Ser Glu
90 95 100
aaa agc tca ggg cag atg gca cag aaa ttc agt ttt tcc aag gtt ttt 449
Lys Ser Ser Gly Gln Met Ala Gln Lys Phe Ser Phe Ser Lys Val Phe
105 110 115
ggc cca gca act aca cag aag gaa ttc ttt cag ggt tgc att atg caa 497
Gly Pro Ala Thr Thr Gln Lys Glu Phe Phe Gln Gly Cys Ile Met Gln
120 125 130 135
cca gta aaa gac ctc ttg aaa gga cag agt cgt ctg att ttt act tac 545
Pro Val Lys Asp Leu Leu Lys Gly Gln Ser Arg Leu Ile Phe Thr Tyr
140 145 150
ggg cta acc aat tca gga aaa aca tat aca ttt caa ggg aca gaa gaa 593
Gly Leu Thr Asn Ser Gly Lys Thr Tyr Thr Phe Gln Gly Thr Glu Glu
155 160 165
aat att ggc att ctg cct cga act ttg aat gta tta ttt gat agt ctt 641
Asn Ile Gly Ile Leu Pro Arg Thr Leu Asn Val Leu Phe Asp Ser Leu
170 175 180
caa gaa aga ctg tat aca aag atg aac ctt aaa cca cat aga tcc aga 689
Gln Glu Arg Leu Tyr Thr Lys Met Asn Leu Lys Pro His Arg Ser Arg
185 190 195
gaa tac tta agg tta tca tca gaa caa gag aaa gaa gaa att gct agc 737
Glu Tyr Leu Arg Leu Ser Ser Glu Gln Glu Lys Glu Glu Ile Ala Ser
200 205 210 215
aaa agt gca ttg ctt cgg caa att aaa gag gtt act gtg cat aat gat 785
Lys Ser Ala Leu Leu Arg Gln Ile Lys Glu Val Thr Val His Asn Asp
220 225 230
agt gat gat act ctt tat gga agt tta act aac tct ttg aat atc tca 833
Ser Asp Asp Thr Leu Tyr Gly Ser Leu Thr Asn Ser Leu Asn Ile Ser
235 240 245
gag ttt gaa gaa tcc ata aaa gat tat gaa caa gcc aac ttg aat atg 881
Glu Phe Glu Glu Ser Ile Lys Asp Tyr Glu Gln Ala Asn Leu Asn Met
250 255 260
gct aat agt ata aaa ttt tct gtg tgg gtt tct ttc ttt gaa att tac 929
Ala Asn Ser Ile Lys Phe Ser Val Trp Val Ser Phe Phe Glu Ile Tyr
265 270 275
aat gaa tat att tat gac tta ttt gtt cct gta tca tct aaa ttc caa 977
Asn Glu Tyr Ile Tyr Asp Leu Phe Val Pro Val Ser Ser Lys Phe Gln
280 285 290 295
aag aga aag atg ctg cgc ctt tcc caa gac gta aag ggc tat tct ttt 1025
Lys Arg Lys Met Leu Arg Leu Ser Gln Asp Val Lys Gly Tyr Ser Phe
300 305 310
ata aaa gat cta caa tgg att caa gta tct gat tcc aaa gaa gcc tat 1073
Ile Lys Asp Leu Gln Trp Ile Gln Val Ser Asp Ser Lys Glu Ala Tyr
315 320 325
aga ctt tta aaa cta gga ata aag cac cag agt gtt gcc ttc aca aaa 1121
Arg Leu Leu Lys Leu Gly Ile Lys His Gln Ser Val Ala Phe Thr Lys
330 335 340
ttg aat aat gct tcc agt aga agt cac agc ata ttc act gtt aaa ata 1169
Leu Asn Asn Ala Ser Ser Arg Ser His Ser Ile Phe Thr Val Lys Ile
345 350 355
tta cag att gaa gat tct gaa atg tct cgt gta att cga gtc agt gaa 1217
Leu Gln Ile Glu Asp Ser Glu Met Ser Arg Val Ile Arg Val Ser Glu
360 365 370 375
tta tct tta tgt gat ctt gct ggt tca gaa cga act atg aag aca cag 1265
Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser Glu Arg Thr Met Lys Thr Gln
380 385 390
aat gaa ggt gaa agg tta aga gag act ggg aat atc aac act tct tta 1313
Asn Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Thr Gly Asn Ile Asn Thr Ser Leu
395 400 405
ttg act ctg gga aag tgt att aac gtc ttg aag aat agt gaa aag tca 1361
Leu Thr Leu Gly Lys Cys Ile Asn Val Leu Lys Asn Ser Glu Lys Ser
410 415 420
aag ttt caa cag cat gtg cct ttc cgg gaa agt aaa ctg act cac tat 1409
Lys Phe Gln Gln His Val Pro Phe Arg Glu Ser Lys Leu Thr His Tyr
425 430 435
ttt caa agt ttt ttt aat ggt aaa ggg aaa att tgt atg att gtc aat 1457
Phe Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys Gly Lys Ile Cys Met Ile Val Asn
440 445 450 455
atc agc caa tgt tat tta gcc tat gat gaa aca ctc aat gta ttg aag 1505
Ile Ser Gln Cys Tyr Leu Ala Tyr Asp Glu Thr Leu Asn Val Leu Lys
460 465 470
ttc tcc gcc att gca caa aaa gtt tgt gtc cca gac act tta aat tcc 1553
Phe Ser Ala Ile Ala Gln Lys Val Cys Val Pro Asp Thr Leu Asn Ser
475 480 485
tct caa gag aaa tta ttt gga cct gtc aaa tct tct caa gat gta tca 1601
Ser Gln Glu Lys Leu Phe Gly Pro Val Lys Ser Ser Gln Asp Val Ser
490 495 500
cta gac agt aat tca aac agt aaa ata tta aat gta aaa aga gcc acc 1649
Leu Asp Ser Asn Ser Asn Ser Lys Ile Leu Asn Val Lys Arg Ala Thr
505 510 515
att tca tgg gaa aat agt cta gaa gat ttg atg gaa gac gag gat ttg 1697
Ile Ser Trp Glu Asn Ser Leu Glu Asp Leu Met Glu Asp Glu Asp Leu
520 525 530 535
gtt gag gag cta gaa aac gct gaa gaa act caa aat gtg gaa act aaa 1745
Val Glu Glu Leu Glu Asn Ala Glu Glu Thr Gln Asn Val Glu Thr Lys
540 545 550
ctt ctt gat gaa gat cta gat aaa aca tta gag gaa aat aag gct ttc 1793
Leu Leu Asp Glu Asp Leu Asp Lys Thr Leu Glu Glu Asn Lys Ala Phe
555 560 565
att agc cac gag gag aaa aga aaa ctg ttg gac tta ata gaa gac ttg 1841
Ile Ser His Glu Glu Lys Arg Lys Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu
570 575 580
aaa aaa aaa ctg ata aat gaa aaa aag gaa aaa tta acc ttg gaa ttt 1889
Lys Lys Lys Leu Ile Asn Glu Lys Lys Glu Lys Leu Thr Leu Glu Phe
585 590 595
aaa att cga gaa gaa gtt aca cag gag ttt act cag tat tgg gct caa 1937
Lys Ile Arg Glu Glu Val Thr Gln Glu Phe Thr Gln Tyr Trp Ala Gln
600 605 610 615
cgg gaa gct gac ttt aag gag act ctg ctt caa gaa cga gag ata tta 1985
Arg Glu Ala Asp Phe Lys Glu Thr Leu Leu Gln Glu Arg Glu Ile Leu
620 625 630
gaa gaa aat gct gaa cgt cgt ttg gct atc ttc aag gat ttg gtt ggt 2033
Glu Glu Asn Ala Glu Arg Arg Leu Ala Ile Phe Lys Asp Leu Val Gly
635 640 645
aaa tgt gac act cga gaa gaa gca gcg aaa gac att tgt gcc aca aaa 2081
Lys Cys Asp Thr Arg Glu Glu Ala Ala Lys Asp Ile Cys Ala Thr Lys
650 655 660
gtt gaa act gaa gaa aca cat aat tat gta gga ttt gaa gat att att 2129
Val Glu Thr Glu Glu Thr His Asn Tyr Val Gly Phe Glu Asp Ile Ile
665 670 675
gat tct ctt caa gat aat gtt gct gat att aag aaa cag gct gaa att 2177
Asp Ser Leu Gln Asp Asn Val Ala Asp Ile Lys Lys Gln Ala Glu Ile
680 685 690 695
gct cac tta tat att gca tct ctt cct gac ccc cag gaa gct act gct 2225
Ala His Leu Tyr Ile Ala Ser Leu Pro Asp Pro Gln Glu Ala Thr Ala
700 705 710
tgt tta gaa cta aag ttt aat caa att aaa gct gaa tta gct aaa acc 2273
Cys Leu Glu Leu Lys Phe Asn Gln Ile Lys Ala Glu Leu Ala Lys Thr
715 720 725
aaa gga gaa tta atc aaa acc aaa gaa gag tta aaa aag aga gaa aat 2321
Lys Gly Glu Leu Ile Lys Thr Lys Glu Glu Leu Lys Lys Arg Glu Asn
730 735 740
gaa tca gat tca ttg att caa gag ctt gag aca tct aat aag aaa ata 2369
Glu Ser Asp Ser Leu Ile Gln Glu Leu Glu Thr Ser Asn Lys Lys Ile
745 750 755
att aca cag aat caa aga att aaa gaa ttg ata aat ata att gat caa 2417
Ile Thr Gln Asn Gln Arg Ile Lys Glu Leu Ile Asn Ile Ile Asp Gln
760 765 770 775
aaa gaa gat act atc aac gaa ttt cag aac cta aag tct cat atg gaa 2465
Lys Glu Asp Thr Ile Asn Glu Phe Gln Asn Leu Lys Ser His Met Glu
780 785 790
aac aca ttt aaa tgc aat gac aag gct gat aca tct tct tta ata ata 2513
Asn Thr Phe Lys Cys Asn Asp Lys Ala Asp Thr Ser Ser Leu Ile Ile
795 800 805
aac aat aaa ttg att tgt aat gaa aca gtt gaa gta cct aag gac agc 2561
Asn Asn Lys Leu Ile Cys Asn Glu Thr Val Glu Val Pro Lys Asp Ser
810 815 820
aaa tct aaa atc tgt tca gaa aga aaa aga gta aat gaa aat gaa ctt 2609
Lys Ser Lys Ile Cys Ser Glu Arg Lys Arg Val Asn Glu Asn Glu Leu
825 830 835
cag caa gat gaa cca cca gca aag aaa ggg tct atc cat gtt agt tca 2657
Gln Gln Asp Glu Pro Pro Ala Lys Lys Gly Ser Ile His Val Ser Ser
840 845 850 855
gct atc act gaa gac caa aag aaa agt gaa gaa gtg cga ccg aac att 2705
Ala Ile Thr Glu Asp Gln Lys Lys Ser Glu Glu Val Arg Pro Asn Ile
860 865 870
gca gaa att gaa gac atc aga gtt tta caa gaa aat aat gaa gga ctg 2753
Ala Glu Ile Glu Asp Ile Arg Val Leu Gln Glu Asn Asn Glu Gly Leu
875 880 885
aga gca ttt tta ctc act att gag aat gaa ctt aaa aat gaa aag gaa 2801
Arg Ala Phe Leu Leu Thr Ile Glu Asn Glu Leu Lys Asn Glu Lys Glu
890 895 900
gaa aaa gca gaa tta aat aaa cag att gtt cat ttt cag cag gaa ctt 2849
Glu Lys Ala Glu Leu Asn Lys Gln Ile Val His Phe Gln Gln Glu Leu
905 910 915
tct ctt tct gaa aaa aag aat tta act tta agt aaa gag gtc caa caa 2897
Ser Leu Ser Glu Lys Lys Asn Leu Thr Leu Ser Lys Glu Val Gln Gln
920 925 930 935
att cag tca aat tat gat att gca att gct gaa tta cat gtg cag aaa 2945
Ile Gln Ser Asn Tyr Asp Ile Ala Ile Ala Glu Leu His Val Gln Lys
940 945 950
agt aaa aat caa gaa cag gag gaa aag atc atg aaa ttg tca aat gag 2993
Ser Lys Asn Gln Glu Gln Glu Glu Lys Ile Met Lys Leu Ser Asn Glu
955 960 965
ata gaa act gct aca aga agc att aca aat aat gtt tca caa ata aaa 3041
Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ser Ile Thr Asn Asn Val Ser Gln Ile Lys
970 975 980
tta atg cac acg aaa ata gac gaa cta cgt act ctt gat tca gtt tct 3089
Leu Met His Thr Lys Ile Asp Glu Leu Arg Thr Leu Asp Ser Val Ser
985 990 995
cag att tca aac ata gat ttg ctc aat ctc agg gat ctg tca aat 3134
Gln Ile Ser Asn Ile Asp Leu Leu Asn Leu Arg Asp Leu Ser Asn
1000 1005 1010
ggt tct gag gag gat aat ttg cca aat aca cag tta gac ctt tta 3179
Gly Ser Glu Glu Asp Asn Leu Pro Asn Thr Gln Leu Asp Leu Leu
1015 1020 1025
ggt aat gat tat ttg gta agt aag caa gtt aaa gaa tat cga att 3224
Gly Asn Asp Tyr Leu Val Ser Lys Gln Val Lys Glu Tyr Arg Ile
1030 1035 1040
caa gaa ccc aat agg gaa aat tct ttc cac tct agt att gaa gct 3269
Gln Glu Pro Asn Arg Glu Asn Ser Phe His Ser Ser Ile Glu Ala
1045 1050 1055
att tgg gaa gaa tgt aaa gag att gtg aag gcc tct tcc aaa aaa 3314
Ile Trp Glu Glu Cys Lys Glu Ile Val Lys Ala Ser Ser Lys Lys
1060 1065 1070
agt cat cag att gag gaa ctg gaa caa caa att gaa aaa ttg cag 3359
Ser His Gln Ile Glu Glu Leu Glu Gln Gln Ile Glu Lys Leu Gln
1075 1080 1085
gca gaa gta aaa ggc tat aag gat gaa aac aat aga cta aag gag 3404
Ala Glu Val Lys Gly Tyr Lys Asp Glu Asn Asn Arg Leu Lys Glu
1090 1095 1100
aag gag cat aaa aac caa gat gac cta cta aaa gaa aaa gaa act 3449
Lys Glu His Lys Asn Gln Asp Asp Leu Leu Lys Glu Lys Glu Thr
1105 1110 1115
ctt ata cag cag ctg aaa gaa gaa ttg caa gaa aaa aat gtt act 3494
Leu Ile Gln Gln Leu Lys Glu Glu Leu Gln Glu Lys Asn Val Thr
1120 1125 1130
ctt gat gtt caa ata cag cat gta gtt gaa gga aag aga gcg ctt 3539
Leu Asp Val Gln Ile Gln His Val Val Glu Gly Lys Arg Ala Leu
1135 1140 1145
tca gaa ctt aca caa ggt gtt act tgc tat aag gca aaa ata aag 3584
Ser Glu Leu Thr Gln Gly Val Thr Cys Tyr Lys Ala Lys Ile Lys
1150 1155 1160
gaa ctt gaa aca att tta gag act cag aaa gtt gaa tgt agt cat 3629
Glu Leu Glu Thr Ile Leu Glu Thr Gln Lys Val Glu Cys Ser His
1165 1170 1175
tca gcc aag tta gaa caa gac att ttg gaa aag gaa tct atc atc 3674
Ser Ala Lys Leu Glu Gln Asp Ile Leu Glu Lys Glu Ser Ile Ile
1180 1185 1190
tta aag cta gaa aga aat ttg aag gaa ttt caa gaa cat ctt cag 3719
Leu Lys Leu Glu Arg Asn Leu Lys Glu Phe Gln Glu His Leu Gln
1195 1200 1205
gat tct gtc aaa aac acc aaa gat tta aat gta aag gaa ctc aag 3764
Asp Ser Val Lys Asn Thr Lys Asp Leu Asn Val Lys Glu Leu Lys
1210 1215 1220
ctg aaa gaa gaa atc aca cag tta aca aat aat ttg caa gat atg 3809
Leu Lys Glu Glu Ile Thr Gln Leu Thr Asn Asn Leu Gln Asp Met
1225 1230 1235
aaa cat tta ctt caa tta aaa gaa gaa gaa gaa gaa acc aac agg 3854
Lys His Leu Leu Gln Leu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Thr Asn Arg
1240 1245 1250
caa gaa aca gaa aaa ttg aaa gag gaa ctc tct gca agc tct gct 3899
Gln Glu Thr Glu Lys Leu Lys Glu Glu Leu Ser Ala Ser Ser Ala
1255 1260 1265
cgt acc cag aat ctg aaa gca gat ctt cag agg aag gaa gaa gat 3944
Arg Thr Gln Asn Leu Lys Ala Asp Leu Gln Arg Lys Glu Glu Asp
1270 1275 1280
tat gct gac ctg aaa gag aaa ctg act gat gcc aaa aag cag att 3989
Tyr Ala Asp Leu Lys Glu Lys Leu Thr Asp Ala Lys Lys Gln Ile
1285 1290 1295
aag caa gta cag aaa gag gta tct gta atg cgt gat gag gat aaa 4034
Lys Gln Val Gln Lys Glu Val Ser Val Met Arg Asp Glu Asp Lys
1300 1305 1310
tta ctg agg att aaa att aat gaa ctg gag aaa aag aaa aac cag 4079
Leu Leu Arg Ile Lys Ile Asn Glu Leu Glu Lys Lys Lys Asn Gln
1315 1320 1325
tgt tct cag gaa tta gat atg aaa cag cga acc att cag caa ctc 4124
Cys Ser Gln Glu Leu Asp Met Lys Gln Arg Thr Ile Gln Gln Leu
1330 1335 1340
aag gag cag tta aat aat cag aaa gtg gaa gaa gct ata caa cag 4169
Lys Glu Gln Leu Asn Asn Gln Lys Val Glu Glu Ala Ile Gln Gln
1345 1350 1355
tat gag aga gca tgc aaa gat cta aat gtt aaa gag aaa ata att 4214
Tyr Glu Arg Ala Cys Lys Asp Leu Asn Val Lys Glu Lys Ile Ile
1360 1365 1370
gaa gac atg cga atg aca cta gaa gaa cag gaa caa act cag gta 4259
Glu Asp Met Arg Met Thr Leu Glu Glu Gln Glu Gln Thr Gln Val
1375 1380 1385
gaa cag gat caa gtg ctt gag gct aaa tta gag gaa gtt gaa agg 4304
Glu Gln Asp Gln Val Leu Glu Ala Lys Leu Glu Glu Val Glu Arg
1390 1395 1400
ctg gcc aca gaa ttg gaa aaa tgg aag gaa aaa tgc aat gat ttg 4349
Leu Ala Thr Glu Leu Glu Lys Trp Lys Glu Lys Cys Asn Asp Leu
1405 1410 1415
gaa acc aaa aac aat caa agg tca aat aaa gaa cat gag aac aac 4394
Glu Thr Lys Asn Asn Gln Arg Ser Asn Lys Glu His Glu Asn Asn
1420 1425 1430
aca gat gtg ctt gga aag ctc act aat ctt caa gat gag tta cag 4439
Thr Asp Val Leu Gly Lys Leu Thr Asn Leu Gln Asp Glu Leu Gln
1435 1440 1445
gag tct gaa cag aaa tat aat gct gat aga aag aaa tgg tta gaa 4484
Glu Ser Glu Gln Lys Tyr Asn Ala Asp Arg Lys Lys Trp Leu Glu
1450 1455 1460
gaa aaa atg atg ctt atc act caa gcg aaa gaa gca gag aat ata 4529
Glu Lys Met Met Leu Ile Thr Gln Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile
1465 1470 1475
cga aat aaa gag atg aaa aaa tat gct gag gac agg gag cgt ttt 4574
Arg Asn Lys Glu Met Lys Lys Tyr Ala Glu Asp Arg Glu Arg Phe
1480 1485 1490
ttt aag caa cag aat gaa atg gaa ata ctg aca gcc cag ctg aca 4619
Phe Lys Gln Gln Asn Glu Met Glu Ile Leu Thr Ala Gln Leu Thr
1495 1500 1505
gag aaa gat agt gac ctt caa aag tgg cga gaa gaa cga gat caa 4664
Glu Lys Asp Ser Asp Leu Gln Lys Trp Arg Glu Glu Arg Asp Gln
1510 1515 1520
ctg gtt gca gct tta gaa ata cag cta aaa gca ctg ata tcc agt 4709
Leu Val Ala Ala Leu Glu Ile Gln Leu Lys Ala Leu Ile Ser Ser
1525 1530 1535
aat gta cag aaa gat aat gaa att gaa caa cta aaa agg atc ata 4754
Asn Val Gln Lys Asp Asn Glu Ile Glu Gln Leu Lys Arg Ile Ile
1540 1545 1550
tca gag act tct aaa ata gaa aca caa atc atg gat atc aag ccc 4799
Ser Glu Thr Ser Lys Ile Glu Thr Gln Ile Met Asp Ile Lys Pro
1555 1560 1565
aaa cgt att agt tca gca gat cct gac aaa ctt caa act gaa cct 4844
Lys Arg Ile Ser Ser Ala Asp Pro Asp Lys Leu Gln Thr Glu Pro
1570 1575 1580
cta tcg aca agt ttt gaa att tcc aga aat aaa ata gag gat gga 4889
Leu Ser Thr Ser Phe Glu Ile Ser Arg Asn Lys Ile Glu Asp Gly
1585 1590 1595
tct gta gtc ctt gac tct tgt gaa gtg tca aca gaa aat gat caa 4934
Ser Val Val Leu Asp Ser Cys Glu Val Ser Thr Glu Asn Asp Gln
1600 1605 1610
agc act cga ttt cca aaa cct gag tta gag att caa ttt aca cct 4979
Ser Thr Arg Phe Pro Lys Pro Glu Leu Glu Ile Gln Phe Thr Pro
1615 1620 1625
tta cag cca aac aaa atg gca gtg aaa cac cct ggt tgt acc aca 5024
Leu Gln Pro Asn Lys Met Ala Val Lys His Pro Gly Cys Thr Thr
1630 1635 1640
cca gtg aca gtt aag att ccc aag gct cgg aag agg aag agt aat 5069
Pro Val Thr Val Lys Ile Pro Lys Ala Arg Lys Arg Lys Ser Asn
1645 1650 1655
gaa atg gag gag gac ttg gtg aaa tgt gaa aat aag aag aat gct 5114
Glu Met Glu Glu Asp Leu Val Lys Cys Glu Asn Lys Lys Asn Ala
1660 1665 1670
aca ccc aga act aat ttg aaa ttt cct att tca gat gat aga aat 5159
Thr Pro Arg Thr Asn Leu Lys Phe Pro Ile Ser Asp Asp Arg Asn
1675 1680 1685
tct tct gtc aaa aag gaa caa aag gtt gcc ata cgt cca tca tct 5204
Ser Ser Val Lys Lys Glu Gln Lys Val Ala Ile Arg Pro Ser Ser
1690 1695 1700
aag aaa aca tat tct tta cgg agt cag gca tcc ata att ggt gta 5249
Lys Lys Thr Tyr Ser Leu Arg Ser Gln Ala Ser Ile Ile Gly Val
1705 1710 1715
aac ctg gcc act aag aaa aaa gaa gga aca cta cag aaa ttt gga 5294
Asn Leu Ala Thr Lys Lys Lys Glu Gly Thr Leu Gln Lys Phe Gly
1720 1725 1730
gac ttc tta caa cat tct ccc tca att ctt caa tca aaa gca aag 5339
Asp Phe Leu Gln His Ser Pro Ser Ile Leu Gln Ser Lys Ala Lys
1735 1740 1745
aag ata att gaa aca atg agc tct tca aag ctc tca aat gta gaa 5384
Lys Ile Ile Glu Thr Met Ser Ser Ser Lys Leu Ser Asn Val Glu
1750 1755 1760
gca agt aaa gaa aat gtg tct caa cca aaa cga gcc aaa cgg aaa 5429
Ala Ser Lys Glu Asn Val Ser Gln Pro Lys Arg Ala Lys Arg Lys
1765 1770 1775
tta tac aca agt gaa att tca tct cct att gat ata tca ggc caa 5474
Leu Tyr Thr Ser Glu Ile Ser Ser Pro Ile Asp Ile Ser Gly Gln
1780 1785 1790
gtg att tta atg gac cag aaa atg aag gag agt gat cac cag att 5519
Val Ile Leu Met Asp Gln Lys Met Lys Glu Ser Asp His Gln Ile
1795 1800 1805
atc aaa cga cga ctt cga aca aaa aca gcc aaa taa atcacttatg 5565
Ile Lys Arg Arg Leu Arg Thr Lys Thr Ala Lys
1810 1815 1820
gaaatgttta atataaattt tatagtcata gtcattggaa cttgcatcct gtattgtaaa 5625
tataaatgta tatattatgc attaaatcac tctgcatata gattgctgtt ttatacatag 5685
tataatttta attcaataaa tgagtcaaaa tttgtatatt tttataaggc ttttttataa 5745
tagcttcttt caaactgtat ttccctatta tctcagacat tggatcagtg aagatcctag 5805
gaaagaggct gttattctca tttattttgc tatacaggat gtaataggtc aggtatttgg 5865
tttacttata tttaacaatg tcttatgaat tttttttact ttatctgtta tacaactgat 5925
tttacatatc tgtttggatt atagctagga tttggagaat aagtgtgtac agatcacaaa 5985
acatgtatat acattattta gaaaagatct caagtcttta attagaatgt ctcacttatt 6045
ttgtaaacat tttgtgggta catagtacat gtatatattt acggggtatg tgagatgttt 6105
tgacacaggc atgcaatgtg aaatacgtgt atcatggaga atgaggtatc catcccctca 6165
agcatttttc ctttgaatta cagataatcc aattacattc tttagatcat ttaaaaatat 6225
acaagtaagt tattattgat tatagtcact ctattgtgct atcagatagt agatcattct 6285
ttttatctta tttgtttttg tacccattaa ccatccccac ctccccctgc aaccgtcagt 6345
acccttacca gccactggta accattcttc tactctgtat gcccatgagg tcaattgatt 6405
ttatttttag atcccataaa taaatgagaa catgcagtct ttgtcaaaaa aaaa 6459
<210> 188
<211> 1820
<212> PRT
<213> 智人
<400> 188
Met Glu Ser Asn Phe Asn Gln Glu Gly Val Pro Arg Pro Ser Tyr Val
1 5 10 15
Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala Arg Pro Ser Glu Ile Asn Phe Asp Gly
20 25 30
Ile Lys Leu Asp Leu Ser His Glu Phe Ser Leu Val Ala Pro Asn Thr
35 40 45
Glu Ala Asn Ser Phe Glu Ser Lys Asp Tyr Leu Gln Val Cys Leu Arg
50 55 60
Ile Arg Pro Phe Thr Gln Ser Glu Lys Glu Leu Glu Ser Glu Gly Cys
65 70 75 80
Val His Ile Leu Asp Ser Gln Thr Val Val Leu Lys Glu Pro Gln Cys
85 90 95
Ile Leu Gly Arg Leu Ser Glu Lys Ser Ser Gly Gln Met Ala Gln Lys
100 105 110
Phe Ser Phe Ser Lys Val Phe Gly Pro Ala Thr Thr Gln Lys Glu Phe
115 120 125
Phe Gln Gly Cys Ile Met Gln Pro Val Lys Asp Leu Leu Lys Gly Gln
130 135 140
Ser Arg Leu Ile Phe Thr Tyr Gly Leu Thr Asn Ser Gly Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Phe Gln Gly Thr Glu Glu Asn Ile Gly Ile Leu Pro Arg Thr Leu
165 170 175
Asn Val Leu Phe Asp Ser Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Thr Lys Met Asn
180 185 190
Leu Lys Pro His Arg Ser Arg Glu Tyr Leu Arg Leu Ser Ser Glu Gln
195 200 205
Glu Lys Glu Glu Ile Ala Ser Lys Ser Ala Leu Leu Arg Gln Ile Lys
210 215 220
Glu Val Thr Val His Asn Asp Ser Asp Asp Thr Leu Tyr Gly Ser Leu
225 230 235 240
Thr Asn Ser Leu Asn Ile Ser Glu Phe Glu Glu Ser Ile Lys Asp Tyr
245 250 255
Glu Gln Ala Asn Leu Asn Met Ala Asn Ser Ile Lys Phe Ser Val Trp
260 265 270
Val Ser Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu Tyr Ile Tyr Asp Leu Phe Val
275 280 285
Pro Val Ser Ser Lys Phe Gln Lys Arg Lys Met Leu Arg Leu Ser Gln
290 295 300
Asp Val Lys Gly Tyr Ser Phe Ile Lys Asp Leu Gln Trp Ile Gln Val
305 310 315 320
Ser Asp Ser Lys Glu Ala Tyr Arg Leu Leu Lys Leu Gly Ile Lys His
325 330 335
Gln Ser Val Ala Phe Thr Lys Leu Asn Asn Ala Ser Ser Arg Ser His
340 345 350
Ser Ile Phe Thr Val Lys Ile Leu Gln Ile Glu Asp Ser Glu Met Ser
355 360 365
Arg Val Ile Arg Val Ser Glu Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser
370 375 380
Glu Arg Thr Met Lys Thr Gln Asn Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Thr
385 390 395 400
Gly Asn Ile Asn Thr Ser Leu Leu Thr Leu Gly Lys Cys Ile Asn Val
405 410 415
Leu Lys Asn Ser Glu Lys Ser Lys Phe Gln Gln His Val Pro Phe Arg
420 425 430
Glu Ser Lys Leu Thr His Tyr Phe Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys Gly
435 440 445
Lys Ile Cys Met Ile Val Asn Ile Ser Gln Cys Tyr Leu Ala Tyr Asp
450 455 460
Glu Thr Leu Asn Val Leu Lys Phe Ser Ala Ile Ala Gln Lys Val Cys
465 470 475 480
Val Pro Asp Thr Leu Asn Ser Ser Gln Glu Lys Leu Phe Gly Pro Val
485 490 495
Lys Ser Ser Gln Asp Val Ser Leu Asp Ser Asn Ser Asn Ser Lys Ile
500 505 510
Leu Asn Val Lys Arg Ala Thr Ile Ser Trp Glu Asn Ser Leu Glu Asp
515 520 525
Leu Met Glu Asp Glu Asp Leu Val Glu Glu Leu Glu Asn Ala Glu Glu
530 535 540
Thr Gln Asn Val Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Asp Leu Asp Lys Thr
545 550 555 560
Leu Glu Glu Asn Lys Ala Phe Ile Ser His Glu Glu Lys Arg Lys Leu
565 570 575
Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu Lys Lys Lys Leu Ile Asn Glu Lys Lys
580 585 590
Glu Lys Leu Thr Leu Glu Phe Lys Ile Arg Glu Glu Val Thr Gln Glu
595 600 605
Phe Thr Gln Tyr Trp Ala Gln Arg Glu Ala Asp Phe Lys Glu Thr Leu
610 615 620
Leu Gln Glu Arg Glu Ile Leu Glu Glu Asn Ala Glu Arg Arg Leu Ala
625 630 635 640
Ile Phe Lys Asp Leu Val Gly Lys Cys Asp Thr Arg Glu Glu Ala Ala
645 650 655
Lys Asp Ile Cys Ala Thr Lys Val Glu Thr Glu Glu Thr His Asn Tyr
660 665 670
Val Gly Phe Glu Asp Ile Ile Asp Ser Leu Gln Asp Asn Val Ala Asp
675 680 685
Ile Lys Lys Gln Ala Glu Ile Ala His Leu Tyr Ile Ala Ser Leu Pro
690 695 700
Asp Pro Gln Glu Ala Thr Ala Cys Leu Glu Leu Lys Phe Asn Gln Ile
705 710 715 720
Lys Ala Glu Leu Ala Lys Thr Lys Gly Glu Leu Ile Lys Thr Lys Glu
725 730 735
Glu Leu Lys Lys Arg Glu Asn Glu Ser Asp Ser Leu Ile Gln Glu Leu
740 745 750
Glu Thr Ser Asn Lys Lys Ile Ile Thr Gln Asn Gln Arg Ile Lys Glu
755 760 765
Leu Ile Asn Ile Ile Asp Gln Lys Glu Asp Thr Ile Asn Glu Phe Gln
770 775 780
Asn Leu Lys Ser His Met Glu Asn Thr Phe Lys Cys Asn Asp Lys Ala
785 790 795 800
Asp Thr Ser Ser Leu Ile Ile Asn Asn Lys Leu Ile Cys Asn Glu Thr
805 810 815
Val Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Ser Lys Ile Cys Ser Glu Arg Lys
820 825 830
Arg Val Asn Glu Asn Glu Leu Gln Gln Asp Glu Pro Pro Ala Lys Lys
835 840 845
Gly Ser Ile His Val Ser Ser Ala Ile Thr Glu Asp Gln Lys Lys Ser
850 855 860
Glu Glu Val Arg Pro Asn Ile Ala Glu Ile Glu Asp Ile Arg Val Leu
865 870 875 880
Gln Glu Asn Asn Glu Gly Leu Arg Ala Phe Leu Leu Thr Ile Glu Asn
885 890 895
Glu Leu Lys Asn Glu Lys Glu Glu Lys Ala Glu Leu Asn Lys Gln Ile
900 905 910
Val His Phe Gln Gln Glu Leu Ser Leu Ser Glu Lys Lys Asn Leu Thr
915 920 925
Leu Ser Lys Glu Val Gln Gln Ile Gln Ser Asn Tyr Asp Ile Ala Ile
930 935 940
Ala Glu Leu His Val Gln Lys Ser Lys Asn Gln Glu Gln Glu Glu Lys
945 950 955 960
Ile Met Lys Leu Ser Asn Glu Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ser Ile Thr
965 970 975
Asn Asn Val Ser Gln Ile Lys Leu Met His Thr Lys Ile Asp Glu Leu
980 985 990
Arg Thr Leu Asp Ser Val Ser Gln Ile Ser Asn Ile Asp Leu Leu Asn
995 1000 1005
Leu Arg Asp Leu Ser Asn Gly Ser Glu Glu Asp Asn Leu Pro Asn
1010 1015 1020
Thr Gln Leu Asp Leu Leu Gly Asn Asp Tyr Leu Val Ser Lys Gln
1025 1030 1035
Val Lys Glu Tyr Arg Ile Gln Glu Pro Asn Arg Glu Asn Ser Phe
1040 1045 1050
His Ser Ser Ile Glu Ala Ile Trp Glu Glu Cys Lys Glu Ile Val
1055 1060 1065
Lys Ala Ser Ser Lys Lys Ser His Gln Ile Glu Glu Leu Glu Gln
1070 1075 1080
Gln Ile Glu Lys Leu Gln Ala Glu Val Lys Gly Tyr Lys Asp Glu
1085 1090 1095
Asn Asn Arg Leu Lys Glu Lys Glu His Lys Asn Gln Asp Asp Leu
1100 1105 1110
Leu Lys Glu Lys Glu Thr Leu Ile Gln Gln Leu Lys Glu Glu Leu
1115 1120 1125
Gln Glu Lys Asn Val Thr Leu Asp Val Gln Ile Gln His Val Val
1130 1135 1140
Glu Gly Lys Arg Ala Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gly Val Thr Cys
1145 1150 1155
Tyr Lys Ala Lys Ile Lys Glu Leu Glu Thr Ile Leu Glu Thr Gln
1160 1165 1170
Lys Val Glu Cys Ser His Ser Ala Lys Leu Glu Gln Asp Ile Leu
1175 1180 1185
Glu Lys Glu Ser Ile Ile Leu Lys Leu Glu Arg Asn Leu Lys Glu
1190 1195 1200
Phe Gln Glu His Leu Gln Asp Ser Val Lys Asn Thr Lys Asp Leu
1205 1210 1215
Asn Val Lys Glu Leu Lys Leu Lys Glu Glu Ile Thr Gln Leu Thr
1220 1225 1230
Asn Asn Leu Gln Asp Met Lys His Leu Leu Gln Leu Lys Glu Glu
1235 1240 1245
Glu Glu Glu Thr Asn Arg Gln Glu Thr Glu Lys Leu Lys Glu Glu
1250 1255 1260
Leu Ser Ala Ser Ser Ala Arg Thr Gln Asn Leu Lys Ala Asp Leu
1265 1270 1275
Gln Arg Lys Glu Glu Asp Tyr Ala Asp Leu Lys Glu Lys Leu Thr
1280 1285 1290
Asp Ala Lys Lys Gln Ile Lys Gln Val Gln Lys Glu Val Ser Val
1295 1300 1305
Met Arg Asp Glu Asp Lys Leu Leu Arg Ile Lys Ile Asn Glu Leu
1310 1315 1320
Glu Lys Lys Lys Asn Gln Cys Ser Gln Glu Leu Asp Met Lys Gln
1325 1330 1335
Arg Thr Ile Gln Gln Leu Lys Glu Gln Leu Asn Asn Gln Lys Val
1340 1345 1350
Glu Glu Ala Ile Gln Gln Tyr Glu Arg Ala Cys Lys Asp Leu Asn
1355 1360 1365
Val Lys Glu Lys Ile Ile Glu Asp Met Arg Met Thr Leu Glu Glu
1370 1375 1380
Gln Glu Gln Thr Gln Val Glu Gln Asp Gln Val Leu Glu Ala Lys
1385 1390 1395
Leu Glu Glu Val Glu Arg Leu Ala Thr Glu Leu Glu Lys Trp Lys
1400 1405 1410
Glu Lys Cys Asn Asp Leu Glu Thr Lys Asn Asn Gln Arg Ser Asn
1415 1420 1425
Lys Glu His Glu Asn Asn Thr Asp Val Leu Gly Lys Leu Thr Asn
1430 1435 1440
Leu Gln Asp Glu Leu Gln Glu Ser Glu Gln Lys Tyr Asn Ala Asp
1445 1450 1455
Arg Lys Lys Trp Leu Glu Glu Lys Met Met Leu Ile Thr Gln Ala
1460 1465 1470
Lys Glu Ala Glu Asn Ile Arg Asn Lys Glu Met Lys Lys Tyr Ala
1475 1480 1485
Glu Asp Arg Glu Arg Phe Phe Lys Gln Gln Asn Glu Met Glu Ile
1490 1495 1500
Leu Thr Ala Gln Leu Thr Glu Lys Asp Ser Asp Leu Gln Lys Trp
1505 1510 1515
Arg Glu Glu Arg Asp Gln Leu Val Ala Ala Leu Glu Ile Gln Leu
1520 1525 1530
Lys Ala Leu Ile Ser Ser Asn Val Gln Lys Asp Asn Glu Ile Glu
1535 1540 1545
Gln Leu Lys Arg Ile Ile Ser Glu Thr Ser Lys Ile Glu Thr Gln
1550 1555 1560
Ile Met Asp Ile Lys Pro Lys Arg Ile Ser Ser Ala Asp Pro Asp
1565 1570 1575
Lys Leu Gln Thr Glu Pro Leu Ser Thr Ser Phe Glu Ile Ser Arg
1580 1585 1590
Asn Lys Ile Glu Asp Gly Ser Val Val Leu Asp Ser Cys Glu Val
1595 1600 1605
Ser Thr Glu Asn Asp Gln Ser Thr Arg Phe Pro Lys Pro Glu Leu
1610 1615 1620
Glu Ile Gln Phe Thr Pro Leu Gln Pro Asn Lys Met Ala Val Lys
1625 1630 1635
His Pro Gly Cys Thr Thr Pro Val Thr Val Lys Ile Pro Lys Ala
1640 1645 1650
Arg Lys Arg Lys Ser Asn Glu Met Glu Glu Asp Leu Val Lys Cys
1655 1660 1665
Glu Asn Lys Lys Asn Ala Thr Pro Arg Thr Asn Leu Lys Phe Pro
1670 1675 1680
Ile Ser Asp Asp Arg Asn Ser Ser Val Lys Lys Glu Gln Lys Val
1685 1690 1695
Ala Ile Arg Pro Ser Ser Lys Lys Thr Tyr Ser Leu Arg Ser Gln
1700 1705 1710
Ala Ser Ile Ile Gly Val Asn Leu Ala Thr Lys Lys Lys Glu Gly
1715 1720 1725
Thr Leu Gln Lys Phe Gly Asp Phe Leu Gln His Ser Pro Ser Ile
1730 1735 1740
Leu Gln Ser Lys Ala Lys Lys Ile Ile Glu Thr Met Ser Ser Ser
1745 1750 1755
Lys Leu Ser Asn Val Glu Ala Ser Lys Glu Asn Val Ser Gln Pro
1760 1765 1770
Lys Arg Ala Lys Arg Lys Leu Tyr Thr Ser Glu Ile Ser Ser Pro
1775 1780 1785
Ile Asp Ile Ser Gly Gln Val Ile Leu Met Asp Gln Lys Met Lys
1790 1795 1800
Glu Ser Asp His Gln Ile Ile Lys Arg Arg Leu Arg Thr Lys Thr
1805 1810 1815
Ala Lys
1820
<210> 189
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头肽
<400> 189
Asn Lys Arg Lys
1

Claims (23)

1.具有细胞毒性T细胞(CTL)诱导能力的少于15个氨基酸的肽，其包含选自以下组的氨基酸序列：
(a)选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119和170；以及
(b)选自下组的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1、2或数个氨基酸的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119和170。
2.权利要求1的肽，其选自下组(i)至(ii)：
(i)包含氨基酸序列的肽，其中将选自以下(a)至(d)的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:5、12、27、52和53：
(a)用选自由苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(b)用选自由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第三个氨基酸；
(c)用选自由亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第七个氨基酸；和
(d)用选自由赖氨酸和精氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸；和
(ii)包含氨基酸序列的肽，其中将选自以下(a)至(c)的一个或多个取代引入选自下组的氨基酸序列中：SEQ ID NOs:118、119和170：
(a)用选自由天冬氨酸和谷氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第一个氨基酸；
(b)用选自由苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸组成的组的氨基酸取代自N端起的第二个氨基酸；
(c)用选自由精氨酸和赖氨酸组成的组的氨基酸取代C末端的氨基酸。
3.权利要求1的肽，其由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119和170。
4.多核苷酸，其编码权利要求1至3中任一项的肽。
5.组合物，其包含药学上可接受的载体和选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
6.权利要求5的组合物，其是用于诱导CTL的组合物，其中所述成分是选自下组(a)至(d)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)抗原呈递细胞(APC)，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物。
7.权利要求5的组合物，其是药物组合物。
8.权利要求7的组合物，其用于选自下组的一种或多种用途：(i)癌症治疗,(ii)癌症预防(防范)和(iii)手术后癌症复发的预防(防范)。
9.权利要求7的组合物，其用于诱导针对癌症的免疫应答。
10.权利要求8或9的组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性粒细胞白血病(CML)、大肠癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌和软组织肿瘤。
11.权利要求5至10中任一项的组合物，其配制为用于对至少一种选自下组的HLA呈阳性的受试者施用：HLA-A11和HLA-A33。
12.诱导具有CTL诱导能力的APC的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)在体外，离体或体内将APC与权利要求1至3中任一项的肽接触；和
(b)将编码权利要求1至3中任一项的肽的多核苷酸导入APC。
13.诱导CTL的方法，其包含选自下组的步骤：
(a)将CD8阳性T细胞与APC共培养，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；
(b)将CD8阳性T细胞与外来体共培养，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物；和
(c)将多核苷酸引入CD8阳性T细胞，所述多核苷酸编码T细胞受体(TCR)的每个亚基，所述T细胞受体能够结合细胞表面上由HLA抗原呈递的权利要求1至3中任一项的肽。
14.APC，其在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至3中任一项的肽的复合物。
15.权利要求14的APC，其通过权利要求12的方法诱导。
16.CTL，其靶向权利要求1-3中任一项的肽。
17.权利要求16的CTL，其通过权利要求13的方法诱导。
18.诱导针对癌症的免疫应答的方法，其包含向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
19.治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发的方法，所述方法包括向受试者施用选自下组(a)至(e)的至少一种成分：
(a)一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽；
(b)一种或多种类型的多核苷酸，其以可表达的形式编码权利要求1至3中任一项的肽；
(c)APC，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；
(d)外来体，其在其细胞表面上呈递权利要求1至3中任一项的肽与HLA抗原的复合物；和
(e)CTL，其靶向权利要求1至3中任一项的肽。
20.抗体，其结合权利要求1至3中任一项的肽。
21.筛选具有CTL诱导能力的肽的方法，其包含以下步骤：
(a)产生由氨基酸序列组成的候选序列，其中对由选自下组的氨基酸序列组成的原始氨基酸序列取代、缺失、插入和/或添加一个，两个或数个氨基酸残基：SEQ ID NOs:5、12、27、52、53、118、119和170；
(b)从在(a)中产生的候选序列中选择与除MPHOSPH1外的任何已知的人基因产物不具有显著同源性(序列同一性)的候选序列；
(c)将APC与由在(b)中选择出的候选序列组成的肽接触；
(d)将(c)的APC与CD8阳性T细胞接触；和
(e)选择与由原始氨基酸序列组成的肽相比，具有相等或更高的CTL诱导能力的肽。
22.乳剂，其包含一种或多种类型的权利要求1至3中任一项的肽，水溶性载体和油佐剂。
23.试剂盒，其包含容纳权利要求5至11中任一项的组合物的容器和容纳佐剂的容器。
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