CN105531368A - 肿瘤抗原肽 - Google Patents
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- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
Abstract
本发明提高可用作癌症的预防和/或治疗剂的肿瘤抗原肽等。由以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽，包含所述肽中的至少一种作为表位肽之一的将多条表位肽连结而成的多表位肽，编码所述肽或多表位肽中的至少一种的多聚核苷酸，以及含有这些作为有效成分的医药组合物，以诱导CTL为特征的癌症的预防和/或治疗剂等。
Description
技术领域
本发明涉及可用作癌症的预防和/或治疗剂的来源于OR7C1的肿瘤抗原肽等。
背景技术
生物体对肿瘤细胞和病毒感染细胞等的排斥中，细胞免疫、特别是细胞毒性T淋巴细胞(称为CTL)起到重要的作用。肿瘤细胞排斥的情况下，CTL识别肿瘤细胞上的抗原肽(肿瘤抗原肽)与MHC(主要组织相容性复合物，MajorHistocompatibilityComplex)的复合物，对肿瘤细胞进行攻击和破坏。即，肿瘤抗原肽是通过肿瘤特有的蛋白质、即肿瘤抗原蛋白质在细胞内合成后由蛋白酶在细胞内分解而生成。生成的肿瘤抗原肽在内质网内与MHCI类抗原(HLAI类抗原)结合而形成复合物，并被运送至细胞表面进行抗原递呈。肿瘤特异性CTL识别该涉及抗原递呈的复合物，通过细胞毒性作用和淋巴因子的产生而显示抗肿瘤效果。随着这一系列作用的揭示，不断地开发出通过将肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽用作所谓的癌症免疫疗法制剂(癌症疫苗)来使癌症患者体内的癌症特异性CTL增强的治疗法。
OR7C1(嗅觉受体家族7亚家族C成员1(Olfactoryreceptor,family7,subfamilyC,member1))是属于嗅觉受体家族的G蛋白质偶联受体(G-protein-coupledreceptors，GPCR)。OR7C1已知是在作为人结肠癌细胞株的SW480细胞、HCT15细胞和HT29细胞、作为人肺癌细胞株的LHK2细胞的SP(侧群，SidePopulation)细胞中表达的基因(专利文献1)。SP细胞被认为是含大量癌症干细胞的组分，被报道具有高致肿瘤性。
癌症干细胞被认为是癌症的复发和转移的主要原因，近年来指出了癌症治疗中以癌症干细胞为靶来抑制其增殖、迁移的重要性。实际对SW480细胞株转染针对OR7C1的siRNA后，SP细胞组分的比例和致肿瘤性显著减少，所以OR7C1被认为在癌症干细胞的机能中承担必不可少的角色。
另外，OR7C1在正常组织中仅于睾丸内表达，所以被分类为“癌睾丸抗原”。癌睾丸抗原被广泛认为是有希望用于癌症疫苗的靶分子。
此外，OR7C1是有希望用于癌症疫苗的靶分子，实际上来源于OR7C1的部分肽被报道是HLA-A24结合性肿瘤抗原肽(专利文献1)。
另外，如上所述，与肿瘤免疫相关的CTL识别肿瘤细胞上的肿瘤抗原肽与HLAI类抗原的复合物，对肿瘤细胞进行攻击和破坏。已知肿瘤抗原肽的HLA-A02限制性或HLA-A24限制性通常分别独立，欧美人和日本人中HLA-A02和HLA-A24显示不同的抗原特异性。对于OR7C1，也已知可与HLA-A24结合的来源于OR7C1的肿瘤抗原肽(专利文献1)，但是尚未发现可与HLA-A02结合或者可与HLA-A02和HLA-A24两者结合的来源于OR7C1的肿瘤抗原肽。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2010/050190号文本
发明的概要
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供可与HLA-A02结合或者可与HLA-A02和HLA-A24两者结合的来源于OR7C1的肿瘤抗原肽以及含有该肿瘤抗原肽作为有效成分的可用于癌症的预防和/或治疗的医药组合物等。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人反复进行认真研究后，发现了以Genbank登录号NP_945182登录的作为OR7C1(嗅觉受体家族7亚家族C成员1)(序列编号2)的部分肽的可与HLA-A02和HLA-A24两者结合的肿瘤抗原肽。
此外，本发明还发现该肿瘤抗原肽在体内或体外可用作癌症特异性CTL的诱导剂、即癌症疫苗。该肿瘤抗原肽可用作结肠癌、肺癌、卵巢癌等癌症(肿瘤)疾病的预防和/或治疗剂。此外，该肿瘤抗原肽可用作针对结肠癌、肺癌、卵巢癌等癌症(肿瘤)的肿瘤标记物。
即，本发明为以下所示的发明。
[1]由以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽。
[2]由以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列中，
(1)将C末端的氨基酸置换为疏水性氨基酸的氨基酸序列，或者
(2)在N末端和/或C末端添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列
形成的肽。
[3]如[2]的肽，其中，该肽由将以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列的C末端的氨基酸置换为亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸的氨基酸序列形成。
[4]如[2]的肽，其中，该肽由在以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列的N末端或C末端添加了1个氨基酸的氨基酸序列形成。
[5]将多条表位肽连结而成的多表位肽，其中，作为该表位肽，包含至少1条[1]～[4]的肽。
[6]含有[1]～[4]的肽或[5]的多表位肽作为有效成分的医药组合物。
[7]如[6]的医药组合物，其中，包含佐剂。
[8]含有[1]～[4]的肽或[5]的多表位肽作为有效成分的癌症的预防和/或治疗用疫苗。
[9]含有[1]～[4]的肽或[5]的多表位肽作为有效成分的癌症的预防和/或治疗剂。
[10]含有[1]～[4]的肽或[5]的多表位肽作为有效成分的细胞毒性T细胞(CTL)的诱导剂。
[11]编码[1]～[4]的肽或[5]的多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸。
[12]含有[11]的多聚核苷酸的表达载体。
[13]包含[12]的表达载体的基因导入用组合物。
[14]含有以下的(a)或(b)：
(a)[11]的多聚核苷酸、
(b)[12]的表达载体
中的任一个作为有效成分的用于癌症的治疗或预防的医药组合物。
[15]包括使以下的(a)或(b)：
(a)[1]～[4]的肽或[5]的多表位肽、
(b)编码上述(a)记载的肽中的至少1个的多聚核苷酸、
与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触的抗原递呈细胞的制造方法。
[16]包括使以下的(a)或(b)：
(a)[1]～[4]的肽或[5]的多表位肽、
(b)编码上述(a)记载的肽中的至少1个的多聚核苷酸
中的任一个与外周血淋巴细胞在体外接触的CTL的诱导方法。
[17]含有[1]～[4]的肽和HLA的HLA多聚体。
[18]含有[17]的HLA多聚体的诊断药物。
[19]识别[1]～[4]的肽与HLA的复合物的TCR样抗体。
[20]含有[19]的TCR样抗体的肿瘤检测剂。
[21]用于筛选可有效地适用[6]、[7]或[14]的医药组合物的患者的诊断药物，其中，包含[17]的HLA多聚体或[19]的TCR样抗体。
发明的效果
通过本发明，能提供可用作CTL的诱导剂的肿瘤抗原肽、和含有该肿瘤抗原肽作为有效成分的可用于癌症的预防和/或治疗的医药组合物等。
附图的简单说明
图1是表示以序列编号3表示的肽的采用干扰素γELISPOT测试的体外的CTL诱导能力的评价结果的图。纵轴表示每500000个接种细胞的斑点数。A表示利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的试验结果，B表示利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的试验结果。此外，黑柱(“w/Peptide”)和白柱(“w/oPeptide”)分别表示将来源于给肽小鼠的脾细胞在存在给予肽的条件下和不存在给予肽的条件下再次刺激培养的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过各肽的给予而在小鼠体内诱导的肽特异性CTL的数量。
图2是表示以序列编号4表示的肽的采用干扰素γELISPOT测试的体外的CTL诱导能力的评价结果的图。纵轴表示每500000个接种细胞的斑点数。A表示利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的试验结果，B表示利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的试验结果。此外，黑柱(“w/Peptide”)和白柱(“w/oPeptide”)分别表示将来源于给肽小鼠的脾细胞在存在给予肽的条件下和不存在给予肽的条件下再次刺激培养的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过各肽的给予而在小鼠体内诱导的肽特异性CTL的数量。
图3是表示以序列编号5表示的肽的采用干扰素γELISPOT测试的体外的CTL诱导能力的评价结果的图。纵轴表示每500000个接种细胞的斑点数。A表示利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的试验结果，B表示利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的试验结果。此外，黑柱(“w/Peptide”)和白柱(“w/oPeptide”)分别表示将来源于给肽小鼠的脾细胞在存在给予肽的条件下和不存在给予肽的条件下再次刺激培养的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过各肽的给予而在小鼠体内诱导的肽特异性CTL的数量。
图4是表示以序列编号6表示的肽的采用干扰素γELISPOT测试的体外的CTL诱导能力的评价结果的图。纵轴表示每500000个接种细胞的斑点数。A表示利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的试验结果，B表示利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的试验结果。此外，黑柱(“w/Peptide”)和白柱(“w/oPeptide”)分别表示将来源于给肽小鼠的脾细胞在存在给予肽的条件下和不存在给予肽的条件下再次刺激培养的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过各肽的给予而在小鼠体内诱导的肽特异性CTL的数量。
图5是表示以序列编号3表示的肽的采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价结果的图。A表示利用来源于HLA-A*02:01阳性健康人的外周血单核细胞的试验结果，B表示利用来源于HLA-A*24:02阳性健康人的外周血单核细胞的试验结果。黑柱和白柱表示再刺激和非再刺激的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过肽的刺激培养而诱导的肽特异性CTL的数量。纵轴表示各孔中确认的斑点数，横轴表示阳性的各孔。此外，黑柱表示在肽刺激条件下检测到的斑点数，白柱表示在肽非刺激条件下检测到的斑点数(对照)。
图6是表示以序列编号5表示的肽的采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价结果的图。A表示利用来源于HLA-A*02:01阳性健康人的外周血单核细胞的试验结果，B表示利用来源于HLA-A*24:02阳性健康人的外周血单核细胞的试验结果。黑柱和白柱表示再刺激和非再刺激的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过肽的刺激培养而诱导的肽特异性CTL的数量。纵轴表示各孔中确认的斑点数，横轴表示阳性的各孔。此外，黑柱表示在肽刺激条件下检测到的斑点数，白柱表示在肽非刺激条件下检测到的斑点数(对照)。
图7是表示以序列编号6表示的肽的采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价结果的图。A表示利用来源于HLA-A*02:01阳性健康人的外周血单核细胞的试验结果，B表示利用来源于HLA-A*24:02阳性健康人的外周血单核细胞的试验结果。黑柱和白柱表示再刺激和非再刺激的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过肽的刺激培养而诱导的肽特异性CTL的数量。纵轴表示各孔中确认的斑点数，横轴表示阳性的各孔。此外，黑柱表示在肽刺激条件下检测到的斑点数，白柱表示在肽非刺激条件下检测到的斑点数(对照)。
图8是表示以序列编号11表示的肽的采用干扰素γELISPOT测试的体外的CTL诱导能力的评价结果的图。纵轴表示每500000个接种细胞的斑点数。A表示利用HLA-A*02:01基因导入小鼠的试验结果，B表示利用HLA-A*24:02基因导入小鼠的试验结果。此外，黑柱(“w/Peptide”)和白柱(“w/oPeptide”)分别表示将来源于给肽小鼠的脾细胞在存在给予肽的条件下和不存在给予肽的条件下再次刺激培养的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过各肽的给予而在小鼠体内诱导的肽特异性CTL的数量。
图9是表示以序列编号11表示的肽的采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价结果的图。A表示利用来源于HLA-A*02:01阳性健康人的外周血单核细胞的试验结果，B表示利用来源于HLA-A*24:02阳性健康人的外周血单核细胞的试验结果。黑柱和白柱表示再刺激和非再刺激的结果。即，黑柱和白柱的值的差表示通过肽的刺激培养而诱导的肽特异性CTL的数量。纵轴表示各孔中确认的斑点数，横轴表示阳性的各孔。此外，黑柱表示在肽刺激条件下检测到的斑点数，白柱表示在肽非刺激条件下检测到的斑点数(对照)。
实施发明的方式
(1)本发明的肽
本发明中，“表位肽”是指与MHC(人为HLA)结合而被抗原递呈至细胞表面的肽。表位肽中包括作为与MHCI类结合而抗原递呈并被CD8阳性T细胞识别的表位肽的CTL表位肽和作为与MHCII类结合而抗原递呈并被CD4阳性T细胞识别的表位肽的辅助表位肽。
表位肽中来源于肿瘤细胞中特异性或过度表达的蛋白质的肽特别成为肿瘤抗原肽。抗原递呈是指细胞内存在的肽与MHC结合，该MHC/抗原肽复合物集中分布于细胞表面的现象。如上所述，已知被递呈至细胞表面的抗原被T细胞等识别后，激活细胞免疫或体液免疫，被MCHI类递呈的抗原激活细胞免疫的同时，被初始T细胞的T细胞受体识别，将初始T细胞诱导为具有细胞毒性的CTL，因此作为用于免疫疗法的肿瘤抗原肽，较好是与MHCI类结合而抗原递呈的肽。
本发明中，“肿瘤(tumor)”包括良性肿瘤和恶性肿瘤(癌，恶性新生物)。癌(cancer)包括造血器官的肿瘤、上皮性的恶性肿瘤(癌，carcinoma)和非上皮性的恶性肿瘤(肉瘤，sarcoma)。
本发明的肽在一种形态中为序列编号2中记载的人OR7C1的部分肽，包括与MHC、特别是HLA结合的肽，较好是被MHC、特别是HLA抗原递呈的肽，更好是被MHC、特别是HLA抗原递呈的可诱导CTL的肽。HLA存在数种型，本发明的肽较好是可与HLAI类结合，更好是可与HLA-A02结合，进一步更好是可与HLA-A02和HLA-A24两者结合。本发明的肽可在与MHC结合之前经过加工(processing)等处理，这些结果后生成表位肽等肽也包括在本发明的肽内。因此，本发明的肽只要是包含表位肽的氨基酸序列的序列即可，氨基酸长度无特别限定。然而，较好是本发明的肽本身为表位肽，因此氨基酸长度较好是约9～约11个氨基酸左右。
本发明的肽在优选的一种形态中包括由与序列编号3、序列编号4、序列编号5或序列编号6中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽，较好是这些氨基酸序列均为上述OR7C1的部分肽。更好是由与序列编号3、序列编号4、序列编号5或序列编号6中记载的氨基酸序列相同的氨基酸序列形成的肽。以序列编号3～6表示的肽分别为由上述OR7C1的氨基酸位置117～126的10个氨基酸、276～285的10个氨基酸、118～126的9个氨基酸、34～34的11个氨基酸形成的肽，本发明人发现这些肽均可与HLA-A02和HLA-A24两者结合。
本发明的肽可以是其N末端和/或C末端被修饰的肽。作为该修饰，具体可例举N-烷酰基化(例如乙酰基化)、N-烷基化(例如甲基化)、C末端烷基酯(例如乙酯)和C末端酰胺(例如羧酰胺)等。
本发明的另一种形态中，本发明的肽中包括由作为与MHC、特别是HLA结合的OR7C1的部分肽的氨基酸序列中N末端和/或C末端添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列形成的肽。特别优选的形态是由在以上述序列编号3、序列编号3、序列编号4、序列编号5或序列编号6表示的氨基酸序列中N末端或C末端添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列形成的肽。N末端或C末端添加的“1个～数个氨基酸”具体是指1～5个氨基酸，例如可例举1个、2个、3个、4个或5个氨基酸，特别好是1个。
此外，本发明的另一种形态中，本发明的肽中也包括由作为与MHC、特别是HLA结合的OR7C1的部分肽的氨基酸序列中将C末端的氨基酸、N末端的氨基酸和/或第2个氨基酸、较好是C末端的氨基酸置换为疏水性氨基酸的氨基酸序列形成的肽。特别优选的形态是由在以上述序列编号3、序列编号3、序列编号4、序列编号5或序列编号6表示的氨基酸序列中将C末端的氨基酸和/或第2个氨基酸、较好是C末端的氨基酸置换为疏水性氨基酸的氨基酸序列形成的肽。本发明中，“疏水性氨基酸”是指不具有分子内极性的氨基酸，其中较好是作为天然氨基酸的甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。本发明中，这些疏水性氨基酸中特别好是亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。因此，该形态中优选的肽包括C末端的氨基酸被置换为亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸的肽，例如序列编号3的肽中将C末端的缬氨酸置换为异亮氨酸的肽(序列编号11)等。序列编号11的氨基酸序列与由人OR7C1基因(Genbank登录号NM_198944，序列编号1)的碱基序列中第376位的鸟嘌呤(G)被置换为腺嘌呤(A)的单核苷酸多态性突变体的核苷酸序列所编码的多肽(即，以序列编号表示的氨基酸序列中126位的缬氨酸(V)被置换为异亮氨酸的突变体)中的氨基酸位置117～126的部分肽的氨基酸序列一致。
本领域技术人员应理解可将上述的N末端和/或C末端添加1个～数个氨基酸的改变和将C末端的氨基酸、N末端的氨基酸和/或第2个氨基酸置换为疏水性氨基酸的改变组合。因此，本发明的肽中也包括由作为与MHC、特别是HLA结合的OR7C1的部分肽的氨基酸序列中将C末端的氨基酸、N末端的氨基酸和/或第2个氨基酸、较好是C末端的氨基酸置换为疏水性氨基酸的氨基酸序列形成的肽的N末端和/或C末端添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列形成的肽。其中，较好是以序列编号11表示的肽的N末端和/或C末端添加有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸、特别好是1个氨基酸的肽。
对于本发明的肽的合成，可按照通常的肽化学中所用的已知方法进行。作为所述已知的方法，可例举文献(PeptideSynthesis，Interscience，NewYork，1966；TheProteins，Vol2，AcademicPressInc.，NewYork，1976；肽合成，丸善株式会社，1975；肽合成的基础和实验，丸善株式会社，1985；医药品的开发续第14卷；肽合成，广川书店，1991；这些文献通过引用而构成本申请的一部分)等中所记载的方法。
本发明的肽可通过后述的CTL诱导方法或供于采用人模型动物的测试(WO02/47474号公报、IntJ.Cancer:100,565-570(2002))等来确认体内的活性。
本发明的肽中还包括将包含至少1条所述本发明的肽的多条表位肽连结而成的肽(多表位肽)。因此，具有CTL诱导活性的该多表位肽也可作为本发明的肽的具体例子示例。
本发明的多表位肽可定义为作为
(i)将本发明的肽(表位肽)和任意的除本发明的肽以外的1条或2条以上的CTL表位肽直接或适当介以间隔物连结而成的肽、
(ii)将本发明的肽和任意的1条或2条以上的辅助表位肽直接或适当介以间隔物连结而成的肽、或者
(iii)在上述(i)中记载的多表位肽上进一步直接或适当介以间隔物连结1条或2条以上的辅助表位肽而成的肽，
在抗原递呈细胞内接受加工，生成的表位肽被递呈至抗原递呈细胞，从而产生CTL诱导活性的肽。
在此，作为(i)中的除本发明的肽以外的CTL表位肽，无特别限定，具体可例举来源于OR7C1的肽(例如，国际公开文本:WO2010/050190中所记载的肽)。
作为间隔物，只要是不对抗原递呈细胞内的加工产生不良影响即可，无特别限定，较好是与各表位肽通过肽键连结的连接物，可例举例如若干个氨基酸连结而成的肽连接序列或两端具有氨基和羧基的连接物等。具体来说，可例举甘氨酸连接物和PEG(聚乙二醇)连接物等，甘氨酸连接物可例举聚甘氨酸(例如由6个甘氨酸形成的肽；CancerSci,103卷,150-153页)，PEG连接物可例举来源于PEG的两端具有氨基和羧基的化合物的连接物(例如H2N-(CH2)2-(OCH2CH2)3-COOH；Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,7551-7556)。
本发明的多表位肽所包含的本发明的表位肽可选择1种或2种以上。即，可以是多条同样的表位肽连结而成，也可以是多条不同的表位肽连结而成。选择2种以上的表位肽的情况下，当然也可以是所选择的表位肽中的1种或2种以上多条连结。对于除本发明的肽以外的表位肽，同样也可以是多种和/或多条表位肽连结。本发明的多表位肽可以是2～12条表位肽连结而成，较好是2条、3条、4条、5条、6条、7条、8条、9条、10条、11条、12条表位肽连结而成，最好是2条表位肽连结而成。
在此，与本发明的肽连结的表位肽为辅助表位肽的情况下，作为所用的辅助表位肽，可例举例如来源于乙型肝炎病毒的HBVc128-140和来源于破伤风毒素的TT947-967等。此外，作为该辅助表位肽的长度，可例举13～30个氨基酸左右、较好是13～17个氨基酸左右。
这样的使多条表位肽连结而成的肽(多表位肽)也可如前所述通过通常的肽合成法制造。此外，还可基于编码这些使多条表位肽连结而成的多表位肽的多聚核苷酸的序列信息，用通常的DNA合成和基因工程的方法制造。
即，可通过将该多聚核苷酸插入周知的表达载体，培养用所得的重组表达载体转化宿主细胞而制成的转化体，从培养物中回收作为目标的使多个表位连结而成的多表位肽来制造。这些方法可如前所述按照文献(MolecularCloning,T.Maniatis等,CSHLaboratory(1983)、DNACloning,DM.Glover,IRLPRESS(1985))中记载的方法等进行。
如上制成的时多条表位肽连结而成的多表位肽可通过供于所述的体外测试或者WO02/47474号公报和IntJ.Cancer:100,565-570(2002)(这些文献通过引用而构成本申请的一部分)中记述的采用人模型动物的体内测试等来确认CTL诱导活性。
如本说明书中所记载，本发明的肽(包括多表位肽)对癌症的预防和/或治疗有用，可作为医药组合物的有效成分。此外，本发明的肽可用于癌症的预防和/或治疗。另外，本发明还涉及用于癌症的预防和/或治疗的医药品的制造中的本发明的肽的用途。
(2)本发明的多聚核苷酸
本发明的多聚核苷酸包括编码所述本发明的肽中的至少1个的多聚核苷酸。本发明的多聚核苷酸可以是cDNA或mRNA、cRNA或者合成DNA中的任一种。此外，可以是单链和双链中的任一种形态。具体来说，可例举例如由编码序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6或序列编号11中记载的氨基酸序列的核苷酸序列形成的多聚核苷酸以及由分别以可表达的方式编码选自序列编号3、4、5、6和11的任意2条以上的肽或使选自序列编号3、4、5、6和11的肽与辅助表位连结而成的多表位肽的核苷酸序列形成的多聚核苷酸等。
本发明的多聚核苷酸可呈单链和双链中的任一种形态。本发明的多聚核苷酸为双链的情况下，可通过将所述本发明的多聚核苷酸插入表达载体来制备用于表达本发明的肽的重组表达载体。即，本发明的多聚核苷酸的范畴也包括将本发明的双链型多聚核苷酸插入表达载体而制成的重组表达载体。
如本说明书中所记载，本发明的多聚核苷酸对癌症的预防和/或治疗有用，可作为医药组合物的有效成分。此外，本发明的多聚核苷酸可用于癌症的预防和/或治疗。另外，本发明还涉及用于癌症的预防和/或治疗的医药品的制造中的本发明的多聚核苷酸的用途。
本发明中使用的表达载体可根据使用的宿主和目的等采用各种表达载体，只要是本领域技术人员，就可适当选择。作为本发明中可使用的表达载体，可例举例如质粒、噬菌体载体、病毒载体等。例如，宿主为大肠杆菌的情况下，作为载体，可例举pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等质粒载体，λZAPII、λgt11等噬菌体载体。宿主为酵母的情况下，作为载体，可例举pYES2、pYEUra3等。宿主为昆虫细胞的情况下，可例举pAcSGHisNT-A等。宿主为动物细胞的情况下，可例举pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMW等质粒载体，或者反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等病毒载体。
所述载体可适当具有可诱导表达的启动子、编码信号序列的基因、筛选用标记物基因、终止子等元件。此外，可添加作为与硫氧还蛋白、His标签或GST(谷胱甘肽转硫酶)等的融合蛋白表达的序列，使得分离纯化变得容易。该情况下，可使用具有在宿主细胞内发挥功能的合适的启动子(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40早期启动子等)的GST融合蛋白载体(pGEX4T等)或具有Myc、His等的标签序列的载体(pcDNA3.1/Myc-His等)、又或表达与硫氧还蛋白和His标签的融合蛋白的载体(pET32a)等。
通过用如上所述制成的表达载体转化宿主，可制成含有该表达载体的转化细胞。作为在此所用的宿主，只要不破坏本发明的多肽所具有的功能，可使用任意的细胞，可例举例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。作为大肠杆菌，可例举E.coliK-12品系的HB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株等。此外，作为酵母，可例举酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等。作为动物细胞，可例举L929细胞、BALB/c3T3细胞、C127细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、Hela细胞、293-EBNA细胞等。作为昆虫细胞，可例举sf9等。
作为向宿主细胞的表达载体的导入方法，使用适合于所述宿主细胞的通常的导入方法即可。具体来说，可例举磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、采用基因导入用脂质(Lipofectamine、Lipofectin；吉伯科BRL公司(Gibco-BRL社))的方法等。导入后，通过用含筛选标记物的通常的培养基进行培养，可筛选所述表达载体被导入宿主细胞中而得的转化细胞。
通过将如上所述得到的转化细胞在适当的条件下继续培养，可制造本发明的肽。所得的肽可通过通常的生物化学纯化手段进一步进行分离、纯化。在此，作为纯化手段，可例举盐析、离子交换色谱法、吸附色谱法、亲和色谱法、凝胶过滤色谱法等。此外，使本发明的肽作为所述的与硫氧还蛋白或His标签、GST等的融合蛋白表达的情况下，可通过利用这些融合蛋白或标签的性质的纯化方法进行分离、纯化。
编码本发明的肽的多聚核苷酸可以是DNA形态，也可以是RNA形态。这些本发明的多聚核苷酸可基于本发明的肽的氨基酸序列信息和由其编码的DNA的序列信息，使用该技术领域已知的常规方法容易地制造。具体来说，可通过通常的DNA合成或采用PCR的扩增等进行制造。
编码本发明的肽的多聚核苷酸包括编码所述表位肽的多聚核苷酸。
(3)以本发明的肽为有效成分的CTL诱导剂
本发明的肽具有CTL诱导活性，可作为肿瘤抗原肽制成CTL诱导剂。
即，通过从HLA-A02抗原或HLA-A24抗原呈阳性的人分离外周血淋巴细胞，在体外添加本发明的肽进行刺激，可诱导特异性识别用该肽进行了脉冲(pulse)的HLA-A02抗原阳性细胞或HLA-A24抗原阳性细胞的CTL(J.Immunol.,154,p2257,1995)。在此，是否诱导了CTL例如可通过用例如ELISA法等测定CTL对抗原肽递呈细胞作出反应而产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量来确认。此外，也可通过测定CTL对51Cr标记的抗原肽递呈细胞的毒性的方法(51Cr释放试验，Int.J.Cancer,58:p317,1994)来确认。
此外，还可通过Int.J.Cancer,39,390-396,1987、N.Eng.J.Med,333,1038-1044,1995等中记载的方法来构建CTL克隆。
通过本发明的肽诱导的CTL具有对将本发明的肽作为抗原递呈的细胞的毒性作用和淋巴因子的产生能力。如上所述，本发明的肽是肿瘤抗原肽，因此可通过这些机能发挥抗肿瘤作用、较好是抗癌作用。因此，本发明的肽和由其诱导的CTL可作为用于癌症的预防和/或治疗的医药品或医药组合物的有效成分。
如果将含有本发明的肽作为有效成分的CTL诱导剂给予癌症患者，则本发明的肽被递呈至抗原递呈细胞的HLA-A02抗原或HLA-A24抗原，HLA-A02抗原或HLA-A24抗原与递呈的肽的结合复合物特异性CTL增殖，可破坏癌细胞，因而能够预防和/或治疗癌症。因此，以本发明的肽为有效成分的CTL的诱导剂较好是对HLA-A02抗原或HLA-A24抗原阳性且罹患OR7C1阳性的癌症的对象使用。作为OR7C1阳性的癌症，可例举例如结肠癌、肺癌、卵巢癌等癌症(肿瘤)，本发明的CTL诱导剂可用于这些癌症的预防和/或治疗。
自此，癌症的“预防”不仅是预防患者罹患癌症，还包括防止通过手术切除的原发病灶的肿瘤的患者的复发，防止通过手术、放射疗法或药物疗法等癌症治疗无法完全除去的肿瘤的转移等。此外，癌症的“治疗”不仅是使癌缩小的癌症的治愈、症状改善，还包括抑制癌细胞的增殖、肿瘤的扩大或癌细胞自原发病灶的转移等癌症发展的防止等。
以本发明的肽为有效成分的CTL诱导剂对于罹患序列编号2中记载的OR7C1阳性的癌症且HLA-A02或HLA-A24阳性的癌症患者特别有效。具体来说，可用于例如结肠癌、肺癌、卵巢癌等癌症(肿瘤)的预防和/或治疗。
以本发明的肽为有效成分的CTL的诱导剂可将单一的CTL表位(本发明的肽)作为有效成分，也可将与其他肽(CTL表位或辅助表位)连结而成的多表位肽作为有效成分。近年来，已发现将多个CTL表位(抗原肽)连结而成的多表位肽在体内具有高效的CTL诱导活性。例如JournalofImmunology1998,161:3186-3194(本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载了将来源于癌抗原蛋白PSA的HLA-A2、HLA-A3、HLA-A11、HLA-B53限制性CTL表位(抗原肽)连结而成的多表位肽在体内诱导了对各CTL表位特异性的CTL。此外，也示出通过使CTL表位与辅助表位连结而成的多表位肽，可高效地诱导CTL。通过这样的多表位肽的形态给药的情况下，多表位肽被摄入抗原递呈细胞内后，经过细胞内分解而生成的各抗原肽与HLA抗原结合而形成复合物，该复合物被高密度地递呈至抗原递呈细胞表面，对该复合物特异性的CTL在体内高效地增殖，破坏癌细胞。癌症的治疗或预防由此得到促进。
以本发明的肽为有效成分的CTL诱导剂可与作为医药品被允许的载体、例如适当的佐剂混合后给药或并用给药，从而有效地实现细胞免疫。
作为佐剂，可适用文献(例如ClinInfectDis.:S266-70,2000)中记载的佐剂等该技术领域已知的佐剂，具体来说，例如作为凝胶类型，可例举氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙等；作为菌体类型，可例举CpG、单磷酰脂质A(monophosphoryllipidA，MPL)、霍乱毒素、大肠杆菌热敏感毒素、百日咳毒素和胞壁酰二肽(Muramyldipeptide，MDP)等；作为油乳浊液类型(乳液制剂)，可例举弗氏不完全佐剂、MF59和SAF等；作为高分子纳米粒子类型，可例举免疫刺激复合物(Immunostimulatorycomplex，ISCOMs)、脂质体、生物降解性微球体(Biodegradablemicrosphere)和来源于皂苷的QS-21等；作为合成类型，可例举非离子性嵌段共聚物、胞壁肽类似物(Muramylpeptideanalogue)、聚磷腈和合成多聚核苷酸等；作为细胞因子类型，可例举IFN-γ、IL-2和IL-12等。
此外，作为以本发明的肽为有效成分的CTL诱导剂的剂型，无特别限定，可例举油乳浊液(乳液制剂)、高分子纳米粒子、脂质体制剂、与直径数微米的珠粒结合而得的粒子状制剂、与脂质结合而得的制剂、微球体制剂、微胶囊制剂等。
作为给药方法，可例举皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药等已知的任意的给药方法。制剂中的本发明的肽的给药量可根据要治疗的疾病、患者的年龄、体重等适当调整，通常为0.0001mg～1000mg，较好是0.001mg～1000mg，更好是0.1mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。
作为使本发明的肽实际作为医药品作用的方法，除了将该肽直接导入体内的直接体内法之外，还有从人采集某种细胞在体外使本发明的肽对其进行作用并将该细胞植回体内的间接体内法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)，只要是本领域的技术人员，可选择适合于所涉及方法的细胞、给药方法、给药形态和给药量。
(4)以本发明的多聚核苷酸为有效成分的CTL诱导剂
表达本发明的多聚核苷酸的细胞成为将本发明的肽作为抗原递呈的细胞，因此具有通过T细胞受体被T细胞识别的特征。因此，本发明的多聚核苷酸也可成为CTL的诱导剂。被诱导的CTL与由本发明的肽诱导的CTL同样，可通过细胞毒性作用或淋巴因子的产生而发挥抗肿瘤作用、较好是抗癌作用。因此，本发明的多聚核苷酸可作为用于癌症的治疗和/或预防的医药品或医药组合物的有效成分。含有本发明的多聚核苷酸作为有效成分的CTL的诱导剂例如通过将本发明的多聚核苷酸给予癌症患者并使其表达，从而可治疗和/或预防癌症。
例如将整合至表达载体的本发明的多聚核苷酸通过以下的方法给予癌症患者后，肿瘤抗原肽在抗原递呈细胞内高度表达。然后，生成的肿瘤抗原肽与HLA-A02抗原或HLA-A24抗原结合而形成复合物，该复合物被高密度地递呈至抗原递呈细胞表面，从而癌特异性的CTL在体内高效地增殖，破坏癌细胞。如上所述，实现癌症的治疗或预防。
以本发明的多聚核苷酸为有效成分的CTL的诱导剂较好是对HLA-A02抗原或HLA-A24抗原阳性且罹患OR7C1阳性的癌症的对象使用。作为OR7C1阳性的癌症，可例举例如结肠癌、肺癌、卵巢癌等癌症(肿瘤)，本发明的CTL诱导剂可用于这些癌症的预防或治疗。
作为给予本发明的多聚核苷酸并导入细胞内的方法，可适用采用病毒载体的方法及其他的方法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)中的任一种方法。
作为采用病毒载体的方法，可例举在反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒等DNA病毒或RNA病毒中整合本发明的DNA并导入的方法。其中，特别好是采用反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒等的方法。
作为其他方法，可例举将表达质粒直接肌肉内给药的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、脂质转染法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，特别好是DNA疫苗法、脂质体法。
为了使本发明的多聚核苷酸实际作为医药品作用，有将该多聚核苷酸直接导入体内的直接体内法以及从人采集某种细胞在体外将本发明的多聚核苷酸导入该细胞并将该细胞植回体内的间接体内法(日经科学,1994年4月号,20-45页、月刊药事,36(1),23-48(1994)、实验医学增刊,12(15),(1994)及它们的引用文献等，这些文献通过引用而构成本申请的一部分)。更好是直接体内法。
通过直接体内法给予本发明的多聚核苷酸的情况下，可适当选择与要治疗的疾病、症状等相适应的合适的给药路径和给药形态来给药。例如，可通过能够对静脉、动脉、皮下、皮内、肌肉内等进行注射的形态进行给药。通过直接体内法给药的情况下，例如可采用液剂等制剂形态，一般可制成含有作为有效成分的本发明的多聚核苷酸的注射剂等，根据需要加入医药上允许的载体。此外，对于含有本发明的多聚核苷酸的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)，可采用悬浮剂、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等脂质体制剂的形态。
制剂中的本发明的多聚核苷酸的含量可根据要治疗的疾病、患者的年龄、体重等适当调整，通常将以多聚核苷酸的含量计为0.0001mg～100mg、较好是0.001mg～10mg的本发明的多聚核苷酸数日～数月1次给药。
只要是本领域的技术人员，可适当选择合适的细胞、载体、给药方法、给药形态和给药量。
此外，近年来，已发现编码将多个CTL表位(肿瘤抗原肽)连结而成的多表位肽的多聚核苷酸或者编码将CTL表位与辅助表位连结而成的多表位肽的多聚核苷酸在体内具有高效的CTL诱导活性。例如JournalofImmunology1999,162:3915-3925(本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载了编码将来源于HBV的6种HLA-A2限制性抗原肽、3种HLA-A11限制性抗原肽和辅助表位连结而成的表位肽的DNA(小基因)在体内有效地诱导了针对各表位的CTL。
因此，将通过使1种或2种以上编码本发明的肽的多聚核苷酸连结或者根据情况还连结编码其他肽的多聚核苷酸而制成的多聚核苷酸整合至合适的病毒载体，可作为CTL的诱导剂的有效成分。这样的CTL的诱导剂也可采用如前所述的给药方法和给药形态。
(5)本发明的抗原递呈细胞
所述的本发明的肽或多聚核苷酸在癌症患者的治疗中可如下在体外利用。即，通过使本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触，可制备抗原递呈细胞。具体来说，本发明提供通过使从癌症患者分离的具有抗原递呈能力的细胞与本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种在体外接触，使HLA-A02抗原或HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物递呈至该细胞的细胞表面的抗原递呈细胞及其制造方法。
在此，“具有抗原递呈能力的细胞”只要是能够递呈本发明的肽的在细胞表面表达MHC、较好是HLA-A02抗原或HLA-A24抗原的细胞即可，无特别限定，这些细胞中较好是专职性抗原递呈细胞，更好是被认为抗原递呈能力特别高的树突状细胞。
此外，作为为了由所述具有抗原递呈能力的细胞制备本发明的抗原递呈细胞而添加的物质，可以是本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种。
本发明的抗原递呈细胞例如可通过从癌症患者分离具有抗原递呈能力的细胞，在体外用本发明的肽对该细胞进行脉冲，使HLA-A02抗原或HLA-A24抗原与本发明的肽的复合物递呈来获得(CancerImmunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158,p1796,1997、CancerRes.,59,p1184,1999)。使用树突状细胞的情况下，例如通过从癌症患者的外周血用Ficoll法分离细胞细胞，然后除去非附着细胞，将附着细胞在GM-CSF和IL-4的存在下培养而诱导树突状细胞，将该树突状细胞与本发明的肽一起培养进行脉冲等，从而可制备本发明的抗原递呈细胞。
此外，通过将本发明的多聚核苷酸导入所述具有抗原递呈能力的细胞来制备本发明的抗原递呈细胞的情况下，该多聚核苷酸可以是DNA的形态，也可以是RNA的形态。具体来说，DNA的情况下，可将CancerRes.,56:p5672,1996或J.Immunol.,161:p5607,1998(这些文献通过引用而构成本发明的一部分)等作为参考进行，而RAN的情况下，可将J.Exp.Med.,184:p465,1996(这些文献通过引用而构成本发明的一部分)等作为参考进行。
所述抗原递呈细胞可作为CTL的诱导剂的有效成分。由于可稳定地维持抗原递呈细胞，含有该抗原递呈细胞作为有效成分的CTL的诱导剂较好是包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。作为给药方法，可例举静脉内给药、皮下给药、皮内给药等。通过将这样的含有抗原递呈细胞作为有效成分的CTL的诱导剂送回至患者体内，在罹患OR7C1阳性的癌症的患者体内，对抗原递呈本发明的肽的癌细胞特异性的CTL被高效地诱导，从而可治疗抗原递呈本发明的肽的OR7C1阳性的癌症。
(6)本发明的细胞毒性T细胞(CTL)
本发明的肽和多聚核苷酸在癌症患者的治疗中可如下在体外利用。即，通过使本发明的肽和多聚核苷酸中的任一种与外周血淋巴细胞在体外接触，可诱导CTL。具体来说，本发明提供通过使来源于癌症患者的外周血淋巴细胞与本发明的肽或多聚核苷酸中的任一种在体外接触而诱导的CTL及其诱导方法。
例如，对于恶性黑色素瘤，将患者本人的肿瘤内浸润T细胞在体外大量培养并将其植回患者的过继性免疫治疗确认具有治疗效果(J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994)。此外，对于小鼠的恶性黑色素瘤，通过在体外通过肿瘤抗原肽TRP-2刺激脾细胞，使肿瘤抗原肽特异性的CTL增殖，将该CTL给予恶性黑色素瘤移植小鼠，确认到转移抑制(J.Exp.Med.,185:453,1997)。这是基于在体外使特异性识别抗原递呈细胞的MHC与肿瘤抗原肽的复合物的CTL的结果。因此，可认为使用本发明的肽或多聚核苷酸在体外刺激患者外周血淋巴细胞而使肿瘤特异性CTL增殖后将该CTL植回患者的治疗方法是有用的。
该CTL可作为癌症的治疗剂或预防剂的有效成分。由于可稳定地维持抗原递呈细胞，该治疗剂或预防剂较好是包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。作为给药方法，可例举静脉内给药、皮下给药、皮内给药等。通过将这样的含有CTL作为有效成分的癌症的治疗或预防剂送回至患者体内，在罹患OR7C1阳性的癌症的患者体内，CTL产生的癌细胞的毒性作用得到促进，破坏癌细胞，从而可治疗癌症。
(7)使用本发明的肽的肿瘤特异性CTL检测剂
本发明的肽，特别是由序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6或序列编号11中记载的氨基酸序列形成的肽被肿瘤特异性CTL识别，因此可用作肿瘤特异性CTL检测剂的成分。因此，本发明还涉及包含本发明的肽的肿瘤特异性CTL检测剂。一种形态中，本发明的肿瘤检测剂和肿瘤特异性CTL检测剂包括含有本发明的肽与HLA-A02或HLA-A24的HLA多聚体(单体、二聚体、四聚体、五聚体和Dextramer)。
例如，HLA四聚体是指将使HLA的α链和β2微球蛋白与肽(抗原肽)组装而成的复合物(HLA单体)生物素化，使其与亲和素结合而四聚体化而成的多聚体(Science279:2103-2106(1998)，Science274:94-96(1996))。现在，市场上有各种含有抗原肽的HLA四聚体销售(例如自株式会社医学生物学研究所)，可容易地制备含有本发明的肽和HLA-A02或HLA-A24的HLA四聚体。此外，HLA二聚体和HLA五聚体也基于同样的原理，对于这些多聚体，所述HLA单体分别二聚体化和五聚体化。因此，含有本发明的肽和HLA-A02或HLA-A24的HLA多聚体也是本发明的一种形态。
具体来说，可例举例如含有由序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6或序列编号11中记载的氨基酸序列形成的肽和HLA-A02或HLA-A24的HLA四聚体。为了可通过流式细胞仪、荧光显微镜等已知的检测手段容易地筛选或检测结合的CTL，该HLA四聚体较好是经荧光标记。具体来说，可例举通过例如藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质(PerCP)等标记的HLA四聚体。
作为HLA四聚体的制法例子，可例举例如Science279:2103-2106(1998)、Science274:94-96(1996)等文献中记载的方法，简单如下所述。
首先，向可表达蛋白质的大肠杆菌或哺乳动物细胞导入HLA-A24或HLA-A02的α链表达载体和β2微球蛋白表达载体并使其表达。在此，较好是使用大肠杆菌(例如BL21)。将所得的单体HLA-A24或HLA-A02复合物与本发明的肽混合，形成可溶性的HLA-肽复合物。接着，将HLA-肽复合物中的HLA-A24或HLA-A02的α链的C末端部位的序列通过BirA酶进行生物素化。将该经生物素化的HLA-肽复合物与经荧光标记的亲和素以4:1的摩尔比混合，从而可制备HLA四聚体。所述各步骤中，较好是进行采用凝胶过滤等的蛋白质纯化。
(8)以本发明的肽为靶的肿瘤检测剂
本发明的肽通过癌细胞作为CTL表位肽被递呈，因此可用作肿瘤标记物。因此，将本发明的肽作为肿瘤标记物可检测的物质，例如识别本发明的肽与HLA-A24或HLA-A02的复合物TCR(T细胞抗原受体)样抗体可用作肿瘤检测剂。因此，本发明还涉及包含可检测本发明的肽的物质的肿瘤检测剂。本发明的肽也被抗原递呈细胞、特别是树突状细胞等专职性抗原递呈细胞所递呈，因此上述检测剂也可用于递呈本发明的肽的抗原递呈细胞的检测。
本发明中，“TCR样抗体”是对片段化的来源于抗体的肽与主要组织相容性抗原复合物(MHC)分子的复合物(pMHC)具有TCR样的结合能力(抗原识别能力)的分子。例如，如EurJImmunol.2004；34:2919-29等中所报道，识别来源于肿瘤抗原的肽与MHC的复合物的TCR样抗体可识别CTL可作为靶的递呈肿瘤抗原肽的癌细胞、吞噬癌细胞而在MHCI类上递呈肿瘤抗原肽的树突状细胞等。
此外，对于识别来源于病毒等的肽与MHC的复合物的所述TCR样抗体，可定量并实时地分析递呈的抗原在感染细胞上呈现怎样的递呈动作和CTL应答等。
所述TCR样抗体可通过EurJImmunol.2004；34:2919-29等中所记载的方法制备。例如，可通过用MHC和肽的复合物对小鼠等动物进行免疫而获得复合物特异性抗体。此外，还可用噬菌体展示法获得复合物特异性抗体。
(9)肿瘤的检测方法(检查方法、诊断方法)
本发明提供利用所述的本发明的CTL检测剂或肿瘤检测剂的肿瘤的检测方法(检查方法、诊断方法)。
作为典型的例子，使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测方法(诊断方法)是采集受检者的血液，或者通过活检等采集被怀疑是肿瘤的受检组织的一部分，通过本发明的CTL检测剂检测、测定其中所含的识别来源于OR7C1的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的CTL的量，从而检测、检查或诊断是否罹患结肠癌、肺癌、卵巢癌等OR7C1阳性的癌症(肿瘤)或者其程度。
作为典型的例子，使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的检测方法(检查方法、诊断方法)是采集受检者的血液，或者通过活检等采集被怀疑是肿瘤的受检组织的一部分，通过本发明的肿瘤检测剂检测、测定其中所含的递呈来源于OR7C1的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的细胞的量，从而检测、检查或诊断是否罹患结肠癌、肺癌、卵巢癌等OR7C1阳性的癌症(肿瘤)或者其程度。
本发明的检测(检查、诊断)方法例如也可以对于患有肿瘤的患者检测(检查、诊断)为了改善该肿瘤而给予治疗药物的情况下的该肿瘤是否改善或其程度。另外，本发明的检测(检查、诊断)方法还可用于可有效地适用以本发明的肽或多聚核苷酸为有效成分的医药品的癌症患者的筛选和该医药品产生的治疗效果的预测或判定等。此外，使用本发明的肿瘤检测剂的形态中，能够检测通过给予以本发明的肽为有效成分的癌症疫苗而在患者体内诱导的CTL可实际作为靶的递呈肿瘤抗原肽的癌细胞。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测(检查)方法的特定的形态包括以下的(a)和(b)以及任意采用的(c)的工序：
(a)使由受检者得到的活体试样与本发明的CTL检测剂接触的工序；
(b)以上述CTL检测剂结合的细胞的量为指标测定该活体试样中的识别来源于OR7C1的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的CTL的量的工序；
(c)基于(b)的结果判断是否罹患癌症的工序。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的诊断方法的特定的形态包括上述(a)、(b)和(c)的工序。
使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的检测(检查)方法的特定的形态包括以下的(d)和(e)以及任意采用的(f)的工序：
(d)使由受检者得到的活体试样与本发明的肿瘤检测剂接触的工序；
(e)以上述肿瘤检测剂结合的细胞的量为指标测定该活体试样中的递呈来源于OR7C1的肿瘤抗原肽与HLA抗原的复合物的细胞的量的工序；
(f)基于(e)的结果判断是否罹患癌症的工序。
使用本发明的肿瘤检测剂的本发明的诊断方法的特定的形态包括上述(d)、(e)和(f)的工序。
作为在此所用的活体试样，可例举由受检者的活体组织(被怀疑存在癌细胞的组织及其周边组织或者血液等)制备的试样。具体来说，可例举由该组织制备的含外周血淋巴细胞的试样。
使用本发明的CTL检测剂的本发明的检测方法(检查方法、诊断方法)的一种形态通过检测活体试样中的本发明的肽特异性CTL并测定其量来实施。具体来说，可如下进行：按照文献(Science,274:p94,1996，本文献通过引用而构成本申请的一部分)中记载的方法制备荧光标记的HLA抗原与本发明的肽的复合物的四聚体(HLA四聚体)，使用该四聚体通过流式细胞仪对被怀疑的患者的外周血淋巴细胞中的抗原肽特异性CTL进行定量。
有无肿瘤的预测、判定、判断或诊断例如可通过测定受检者的血液或被怀疑是肿瘤的受检组织中的本发明的肽特异性CTL的量或者递呈本发明的肽的细胞的量来进行。这时，可根据情况将正常的对应组织中的OR7C1基因表达水平、本发明的肽水平或CTL水平等作为基准值，将该基准值与由受检者得到的试样中的所述水平比较，判定两者的差异来进行。
在此，受检者的受检组织与正常的对应组织的所述水平的比较可通过平行地进行以受检者的活体试样和正常人的活体试样为对象的测定来实施。不平行进行的情况下，可将使用多份(至少2份，较好是3份以上，更好是5份以上)正常的组织以均一的测定条件测定的的本发明的肽特异性CTL的量的平均值或统计学中值作为正常人的值、即基准值，用于比较。
受检者是否罹患癌症的判断例如可将该受检者的组织中的本发明的肽特异性的CTL的量或者递呈本发明的肽的细胞与正常人的这些水平相比多例如多2倍以上、较好是3倍以上作为指标来进行。
此外，对于给予本发明的肽或多聚核苷酸的受检者，也可通过测定本发明的肽特异性的CTL的量来判定实际上是否诱导了CTL。例如，可将该受检者的组织中的本发明的肽特异性的CTL的量与正常人的这些水平相比多例如2倍以上、较好是3倍以上作为指标，判定采用本发明的肽或多聚核苷酸的治疗有效。本发明的肽或多聚核苷酸被认为主要起到疫苗的作用，通过诱导CTL而发挥抗肿瘤作用，因此CTL的诱导可用作用于确认给予的本发明的肽或多聚核苷酸是否起到疫苗的作用的所谓的POM(机制证明，ProofofMechanism)标记物。因此，本发明的CTL检测剂可用作用于通过检测作为POM标记物的CTL来确认给药对象中给予的肽或多聚核苷酸是否起到疫苗的作用的诊断药物。
(10)癌症的预防和/或治疗方法
本发明还涉及预防和/或治疗对象的癌症的方法，该方法包括将有效量的选自本发明的肽、多聚核苷酸、CTL、抗原递呈细胞、TCR样抗体的有效成分给予需要其的对象的工序。
本发明中的“对象”是指任意的生物个体，较好是动物的个体，更好是哺乳动物的个体，进一步更好是人的个体。本发明中，对象可以是健康的，也可以罹患某种疾病，但想要进行癌症的预防和/或治疗的情况下，典型的是指罹患癌症或有罹患癌症的风险的对象。本发明的一种形态中，对象为HLA-A02阳性或HLA-A24阳性。本发明的一种形态中，对象罹患OR7C1阳性的癌症，或者有罹患的风险。本发明的一种形态中，对象为HLA-A02阳性或HLA-A24阳性且罹患OR7C1阳性的癌症，或者有罹患的风险。
作为本发明的预防/治疗方法中使用的本发明的肽、多聚核苷酸、CTL、抗原递呈细胞和TCR样抗体，可例举本说明书中记载的任一种。本发明中的有效量例如为减轻癌症的症状或者延缓或停止其发展的量，较好是抑制或者治愈癌症的量。此外，较好是不产生超过给药产生的益处的不良影响的量。所述量可通过采用培养细胞等的体外试验或者小鼠、大鼠等模型动物的试验适当确定，这些试验的方法对本领域技术人员已知。有效成分的具体的使用量可考虑关于需要其的对象的各种条件，例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、给药的时期及频率、并用的医药品、对治疗的反应性、剂型及对治疗的顺应性等而确定。
作为具体的使用量，例如本发明的肽的情况下，通常为0.0001mg～1000mg，较好是0.001mg～1000mg，更好是0.1mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。此外，本发明的多聚核苷酸的情况下，通常为0.0001mg～100mg，较好是0.001mg～10mg，较好是将其数日～数月1次给药。此外，本发明的TCR样抗体的情况下，通常为0.0001mg～2000mg，较好是0.001mg～2000mg，较好是将其1周～4周1次给药。此外，作为给药方法，可使用皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药等已知的任意的合适的给药方法。此外，除了将本发明的肽或核苷酸直接给药至体内的直接体内法之外，还可使用从人采集某种细胞在体外使用本发明的肽或多聚核苷酸诱导CTL或抗原递呈细胞后将这些细胞植回体内的间接体内法。
本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选HLA-A02阳性或HLA-A24阳性的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括确定对象的HLA型的工序。对象的HLA型的确定可通过已知的任意的方法进行。此外，本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选有OR7C1阳性的癌症的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括检测对象的OR7C1阳性的癌症的工序。对象的OR7C1阳性的癌症的检测可使用上述(9)中记载的肿瘤的检测方法。
本发明的预防/治疗方法的一种形态在给药的工序之前还包括筛选HLA-A02阳性或HLA-A24阳性且有OR7C1阳性的癌症的对象作为预防/治疗的对象的工序。本发明的该形态在上述进行筛选的工序之前还包括确定对象的HLA型的工序和检测对象的OR7C1阳性的癌症的工序。HLA-A02阳性或HLA-A24阳性且有OR7C1阳性的癌症的对象是可有效地适用含有本发明的肽和/或多聚核苷酸作为有效成分的医药组合物的对象。因此，上述(9)中记载的肿瘤的检测方法中可使用的肿瘤特异性CTL检测剂或肿瘤检测剂可用作筛选使用本发明的医药组合物的癌症的处置方法有效的治疗对象的所谓的伴随诊断用诊断药物。
此外，本发明的预防/治疗方法的一种形态还可包括对给予本发明的医药组合物的患者，判定采用本发明的医药组合物的治疗是否有效，筛选采用本发明的医药组合物的治疗有效的治疗对象的工序。如上述(9)中所记载，给予本发明的医药组合物时诱导本发明的肽特异性CTL的对象为采用含有本发明的肽和/或多聚核苷酸作为有效成分的医药组合物的治疗有效的对象，即可有效地适用本申请医药组合物的对象，本发明的肽特异性CTL的诱导可用作用于预测或判定本发明的医药组合物的治疗效果的替代标记。因此，上述(9)中记载的肿瘤的检测方法中可使用的肿瘤特异性CTL检测剂可用作用于筛选给予本发明的医药组合物的患者中有效的治疗对象的诊断药物，或者用于通过检测上述作为替代标记的CTL来预测或判定给予本发明的医药组合物的患者中的该医药组合物的治疗效果的诊断药物。
本说明书中提及的全部的专利、申请及其他出版物通过参照将其整体引用至本说明书中。
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例
实施例1:具有HLA-A*02:01结合模体的来源于OR7C1的肽
通过MHC与肽的结合预测程序BIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)和IEDB(MHC-Iprocessingpredictions；http://www.iedb.org/)，提取预测与HLA-A*02:01结合的来源于OR7C1的肽(以序列编号3、4、5和6表示的肽)。通过Fmoc法化学合成这些肽，供于HLA结合试验和体内的CTL诱导试验。
实施例2:来源于OR7C1的肽的HLA-A02和HLA-A24结合性评价
来源于OR7C1的肽的HLA-A02和HLA-A24结合性评价通过MHCI类稳定表达试验来实施。该试验中，利用了作为人淋巴样干细胞株的T2细胞和人为地强制表达HLA-A*24:02的T2-A24细胞。T2细胞缺失参与从细胞质向内质网的肽的运输的抗原加工相关转运子(transporterassociatedwithantigenprocessing，TAP)。MHCI类分子(包括HLA-A*02:01和HLA-A*24:02)已知在不结合肽的状态(空MHCI类，emptyMHCclassI)下结构不稳定。通常，T2细胞仅能在细胞表面表达低水平的空MHCI类分子。但是，如果添加可与MHCI类分子结合的肽，空MHCI类分子可与该肽结合而在细胞表面稳定存在。因此，细胞表面MHCI类表达水平依赖于肽的MHCI类结合亲和性。
T2细胞和T2-A24细胞在37℃、5％CO2下进行继代培养。对于肽，分别以100μg/mL的浓度对来源于OR7C1的肽(表1中记载的肽)、作为HLA-A02阳性对照的MelanAA27L肽(氨基酸序列:ELAGIGILTV；序列编号7)、作为HLA-A24阳性对照的HIV584-592肽(氨基酸序列:RYLRDQQLL；序列编号8)、作为HLA-A02阴性对照的MAGE-1161-169肽(氨基酸序列:EADPTGHSY；序列编号9)、作为HLA-A24阴性对照的VSV52-59肽(氨基酸序列:RGYVYQGL；序列编号10)进行了评价。这些肽被溶解于DMSO，再用RPMI160培养基稀释至200倍。将细胞悬浮液与肽溶液混合，在5％CO2、26℃的条件下培养了16～18小时。将温度设为37℃，再共培养3小时后，离心分离除去上清，分离细胞。将分离的细胞用含3％FBS的PBS清洗，加入用FITC进行了荧光标记的抗HLA-A02抗体(clone:BB7.2；医学生物学研究所)或抗HLA-A24抗体(clone:17A10；医学生物学研究所)，在室温下静置30分钟。然后，将细胞用含3％FBS的PBS清洗，加入4％多聚甲醛磷酸缓冲液，在室温下静置10分钟而固定细胞。固定后的细胞通过流式细胞仪(FACScan)测定FITC荧光强度。算出平均荧光强度(meanfluorescenceintensity，MFI)的溶剂比，将1.5以上判断为阳性。
结果示于表1。由该结果可知，以序列编号3、4、5和6表示的肽均呈现HLA-A*02:01结合性和HLA-A24结合性。
[表1]
实施例3:使用HLA-A*02:01基因导入小鼠和HLA-A*24:02基因导入小鼠的体内的CTL诱导能力的评价
被判断为存在与HLA-A*02:01和HLA-A*24:02的结合的来源于OR7C1的肽(序列编号3、4、5和6)的CTL诱导能力通过使用HLA-A*02:01基因导入小鼠和HLA-A*24:02基因导入小鼠的体内的CTL诱导试验进行了评价。
HLA-A*02:01基因导入小鼠(C57BL/6CrHLA-A2.1DR1)是缺失小鼠的MHC并表达作为人的MHC的HLA-A*02:01和HLA-DRB1*01:01的小鼠，通过使用本小鼠，可筛选能够在人体中诱导CTL的肽。另一方面，HLA-A*24:02基因导入小鼠表达作为人的MHC的HLA-A*24:02和作为小鼠的MHC的H-2Kb的嵌合体HLA的小鼠，通过使用本小鼠，可筛选HLA-A24阳性的能够在人体中诱导CTL的肽(IntJCancer.2002；100:565-70)。通过给予肽是否诱导CTL通过测定用给予肽对来源于给予了肽的上述小鼠的脾细胞进行再刺激的情况下产生的IFNγ来判断。
具体来说，将肽用PBS(-)溶解至10mg/mL，与等量的弗氏不完全佐剂(IFA)混合，乳液化。经乳液化的肽以50μg/处的使用量向小鼠的尾根部皮内的2处给药。1周后，通过CO2气体使小鼠安乐死后，取出脾脏，制备脾细胞。IFNγ产生的测定使用IFNγELISPOT测试试剂盒(碧迪公司(ベクトン·ディッキンソン社)制)。脾细胞制备的前一天，将ELISPOT板用抗IFNγ抗体处理，当天用含10％FBS的RPMI1640培养基封闭。将制备的脾细胞以0.5×106个/孔接种至经封闭的ELISPOT板。将来源于OR7C1的肽用DMSO溶解至40mg/mL，再用10％RPMI1640培养基稀释至20μg/mL。将经稀释的肽以50μL/孔添加至来源于给予了该肽的动物的脾细胞。将添加了肽的脾细胞在37℃、5％CO2下培养16～18小时，从而施加体外的肽再刺激。培养后除去上清，按照所附的实验方法使ELISPOT板显色。显色的斑点数通过KS-ELISPOT测定。
IFNγELISPOT测试的结果示于图1、2、3和4。
本试验的结果是，来源于HLA-A*02:01基因导入小鼠的脾细胞和来源于HLA-A*24:02基因导入小鼠的脾细胞中，确认产生各肽特异性的IFNγ，从而可知以序列编号3、4、5和6表示的来源于OR7C1的各肽具有CTL诱导能力。
实施例4:采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价
对于添加以序列编号3、5和6表示的3种肽的情况下来源于健康人的外周血单核细胞是否诱导CTL进行了评价。
具体来说，将来源于HLA-A*02:01阳性或HLA-A*24:02阳性的健康人的外周血单核细胞(细胞技术有限公司(CellularTechnologyLimited社)制)用含10％来源于人的血清的AIM-V培养基悬浮后，接种1×105个至U型底96孔板的各孔，在37℃、5％CO2下培养。这时，添加100U/mL人IL-2和20μg/mL上述肽。每3天或4天更换1次培养基，约2周后实施IFNγELISPOT测试。测试的前一天，将ELISPOT板用抗IFNγ抗体处理，当天用含10％来源于人的血清的AIM-V培养基在室温下封闭约2小时。将培养中的人外周血单核细胞用AIM-V培养基清洗，将3分之1的量接种至经封闭的ELISPOT板的各孔。这时，对于用以序列编号3、5和6表示的肽培养了的人外周血单核细胞，将任意的2孔混合而并成1孔后，将各孔再次分成2孔接种，一个孔添加肽溶液，另一个孔添加仅不含肽的对照溶液，作为非再刺激对照，各60孔。在此，以序列编号3、5和6表示的3种肽用DMSO溶解至40mg/mL，再用含10％来源于人的血清的AIM-V培养基稀释。以最终浓度达到20μg/mL的条件添加，对人外周血单核细胞进行再刺激。在37℃、5％CO2下培养，16～18小时后除去上清，按照所附的实验方法使ELISPOT板显色。显色的斑点数通过细胞技术有限公司制ELISPOT分析仪测定。序列编号3、5和6的IFNγELISPOT测试的结果分别示于图5、6和7。纵轴表示各孔中确认的斑点数，横轴表示阳性的孔。此外，黑柱表示在肽刺激条件下检测到的斑点数，白柱表示在肽非刺激条件下检测到的斑点数(对照)。仅限肽刺激时的斑点数在50个以上且黑柱与白柱的差在2倍以上的情况判断为阳性孔。
本试验的结果是发现以序列编号3、5和6表示的3种肽通过HLA-A*02:01阳性和HLA-A*24:02阳性的来源于健康人的外周血单核细胞诱导对这些肽特异性的CTL。由此可知，这3种肽不仅在小鼠中，在人体中也具有CTL诱导能力。
实施例5:来源于OR7C1的肽的C末端氨基酸置换体肽的评价
(1)肽的合成
与实施例1同样地通过Fmoc法化学合成以序列编号3表示的肽的C末端氨基酸由缬氨酸被置换为异亮氨酸的肽(序列编号11)，供于HLA结合试验和体内的CTL诱导试验。
(2)HLA-A02和HLA-A24结合性评价
通过与实施例2同样的方法,对于上述(1)中合成的以序列编号11表示的肽,进行)HLA-A02和HLA-A24的结合性评价。结果示于表2。由该结果可知，以序列编号11表示的肽也呈现HLA-A*02:01结合性和HLA-A24结合性。
[表2]
(3)体内的CTL诱导能力的评价
CTL诱导能力仿照实施例3通过使用HLA-A*02:01基因导入小鼠和HLA-A*24:02基因导入小鼠的体内的CTL诱导试验进行了评价。具体来说，除了将以序列编号11表示的肽用注射用水溶解至40mg/mL，与等量的IFA混合，乳液化，将经乳液化的肽以150μg/处的使用量向小鼠的尾根部皮内的2处给药以外，与实施例3同样地进行。结果示于图8。
来源于HLA-A*02:01基因导入小鼠的脾细胞和来源于HLA-A*24:02基因导入小鼠的脾细胞中，确认产生该肽特异性的IFNγ，从而可知以序列编号11表示的肽具有CTL诱导能力。
(4)采用人外周血单核细胞的CTL诱导能力的评价
对于添加以序列编号11表示的肽的情况下来源于健康人的外周血单核细胞是否诱导CTL仿照实施例4进行了评价。具体来说，除了将用以序列编号11表示的肽培养了的人外周血单核细胞供于IFNγELISPOT测试时，不将任意的2孔混合而并成1孔，并将各孔分成2孔接种进行评价以外，与实施例4同样地进行。结果示于图9。发现以序列编号11表示的肽通过HLA-A*02:01阳性和HLA-A*24:02阳性的来源于健康人的外周血单核细胞诱导对该肽特异性的CTL，可知不仅是小鼠，在人体中也具有CTL诱导能力。
工业上利用的可能性
通过本发明，可提供具有CTL的诱导活性的来源于OR7C1的肿瘤抗原肽等。本发明的肽可用作癌症的预防和/或治疗剂。
序列表的自由文字部分
序列编号3:合成肽
序列编号4:合成肽
序列编号5:合成肽
序列编号6:合成肽
序列编号7:合成肽
序列编号8:合成肽
序列编号9:合成肽
序列编号10:合成肽
序列编号11:合成肽
Claims (21)
1.由以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列形成的肽。
2.由以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列中，
(1)将C末端的氨基酸置换为疏水性氨基酸的氨基酸序列，和/或
(2)在N末端和/或C末端添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列
形成的肽。
3.如权利要求2所述的肽，其中，该肽由将以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列的C末端的氨基酸置换为亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸的氨基酸序列形成。
4.如权利要求2所述的肽，其中，该肽由在以序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6和序列编号11中的任一个表示的氨基酸序列的N末端或C末端添加了1个氨基酸的氨基酸序列形成。
5.将多条表位肽连结而成的多表位肽，其中，作为该表位肽，包含至少1条权利要求1～4中的任一项所述的肽。
6.含有权利要求1～4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽作为有效成分的医药组合物。
7.如权利要求6所述的医药组合物，其中，包含佐剂。
8.含有权利要求1～4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽作为有效成分的癌症的预防和/或治疗用疫苗。
9.含有权利要求1～4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽作为有效成分的癌症的预防和/或治疗用剂。
10.含有权利要求1～4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽作为有效成分的细胞毒性T细胞(CTL)的诱导剂。
11.编码权利要求1～4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽中的至少1个的多聚核苷酸。
12.含有权利要求11所述的多聚核苷酸的表达载体。
13.包含权利要求12所述的表达载体的基因导入用组合物。
14.含有以下的(a)或(b):
(a)权利要求11所述的多聚核苷酸、
(b)权利要求12所述的表达载体
中的任一种作为有效成分的用于癌症的治疗或预防的医药组合物。
15.包括使以下的(a)或(b):
(a)权利要求1～4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽、
(b)编码上述(a)记载的肽中的至少1个的多聚核苷酸、
与具有抗原递呈能力的细胞在体外接触的抗原递呈细胞的制造方法。
16.包括使以下的(a)或(b):
(a)权利要求1～4中的任一项所述的肽或权利要求5所述的多表位肽、
(b)编码上述(a)记载的肽中的至少1个的多聚核苷酸
中的任一个与外周血淋巴细胞在体外接触的CTL的诱导方法。
17.含有权利要求1～4中的任一项所述的肽和HLA的HLA多聚体。
18.含有权利要求17所述的HLA多聚体的诊断药物。
19.识别权利要求1～4所述的肽与HLA的复合物的TCR样抗体。
20.含有权利要求19所述的TCR样抗体的肿瘤检测剂。
21.用于筛选可有效地适用权利要求6、7或14所述的医药组合物的患者的诊断药物，其中，包含权利要求17所述的HLA多聚体或权利要求19所述的TCR样抗体。
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