JPWO2015005479A1 - 腫瘍抗原ペプチド - Google Patents
腫瘍抗原ペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2015005479A1 JPWO2015005479A1 JP2015526447A JP2015526447A JPWO2015005479A1 JP WO2015005479 A1 JPWO2015005479 A1 JP WO2015005479A1 JP 2015526447 A JP2015526447 A JP 2015526447A JP 2015526447 A JP2015526447 A JP 2015526447A JP WO2015005479 A1 JPWO2015005479 A1 JP WO2015005479A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- seq
- hla
- present
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 459
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 206
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title abstract description 83
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title abstract description 82
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 80
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 115
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 76
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 146
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 85
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 82
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 45
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 39
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 23
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 23
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 10
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 10
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical group CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 40
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 46
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 46
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 34
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 24
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 24
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 23
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 23
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 22
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 22
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 20
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 18
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 8
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 8
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 8
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 8
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 7
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 6
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 5
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 4
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011878 Proof-of-mechanism Methods 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- -1 pcDNA3.1 Proteins 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 3
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 101150115702 OR7C1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012547 Olfactory receptors Human genes 0.000 description 2
- 108050002069 Olfactory receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 2
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- POVNCJSPYFCWJR-USZUGGBUSA-N (4s)-4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-[(2s)-2-[[2-[(2s)-2-[[(2s)-1-[[(2s,3r)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-methylpropyl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1- Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 POVNCJSPYFCWJR-USZUGGBUSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150080480 A27L gene Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010012253 E coli heat-labile enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036242 HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Human genes 0.000 description 1
- 102100040485 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain Human genes 0.000 description 1
- 108010036972 HLA-A11 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010039343 HLA-DRB1 Chains Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000986086 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000930801 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 2 chain Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001086395 Homo sapiens Olfactory receptor 7C1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 description 1
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 238000007126 N-alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102100032698 Olfactory receptor 7C1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100268532 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR150 gene Proteins 0.000 description 1
- UYRDHEJRPVSJFM-VSWVFQEASA-N [(1s,3r)-3-hydroxy-4-[(3e,5e,7e,9e,11z)-11-[4-[(e)-2-[(1r,3s,6s)-3-hydroxy-1,5,5-trimethyl-7-oxabicyclo[4.1.0]heptan-6-yl]ethenyl]-5-oxofuran-2-ylidene]-3,10-dimethylundeca-1,3,5,7,9-pentaenylidene]-3,5,5-trimethylcyclohexyl] acetate Chemical compound C[C@@]1(O)C[C@@H](OC(=O)C)CC(C)(C)C1=C=C\C(C)=C\C=C\C=C\C=C(/C)\C=C/1C=C(\C=C\[C@]23[C@@](O2)(C)C[C@@H](O)CC3(C)C)C(=O)O\1 UYRDHEJRPVSJFM-VSWVFQEASA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- UTIQDNPUHSAVDN-UHFFFAOYSA-N peridinin Natural products CC(=O)OC1CC(C)(C)C(=C=CC(=CC=CC=CC=C2/OC(=O)C(=C2)C=CC34OC3(C)CC(O)CC4(C)C)C)C(C)(O)C1 UTIQDNPUHSAVDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 229920000232 polyglycine polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 108010055094 transporter associated with antigen processing (TAP) Proteins 0.000 description 1
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010094106 vesicular stomatitis virus nucleoprotein (52-59) Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Abstract
がんの予防および/または治療剤として有用な、腫瘍抗原ペプチド等を提供する。配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、前記ペプチドの少なくとも一つをエピトープペプチドの一つとして含む、複数のエピトープペプチドを連結したポリエピトープペプチド、前記ペプチドもしくはポリエピトープペプチドの少なくともひとつをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを有効成分として含有する医薬組成物、CTLを誘導することを特徴とする、がんの予防および/または治療剤等。
Description
本発明は、がんの予防および/または治療剤として有用な、OR7C1由来の腫瘍抗原ペプチド等に関する。
生体による腫瘍細胞やウイルス感染細胞等の排除には細胞性免疫、とりわけ細胞傷害性T細胞(CTLと称する)が重要な働きをしている。腫瘍細胞の排除の場合、CTLは、腫瘍細胞上の抗原ペプチド(腫瘍抗原ペプチド)とMHC(Major Histocompatibility Complex)クラスI抗原(ヒトの場合はHLAクラスI抗原と称する)との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。すなわち、腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアーゼにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でMHCクラスI抗原(HLAクラスI抗原)と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示に係る複合体を腫瘍特異的なCTLが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆるがん免疫療法剤(がんワクチン)として利用することにより、がん患者の体内のがん特異的CTLを増強させる治療法が開発されつつある。
OR7C1(嗅覚受容体ファミリー7、サブファミリーC、メンバー1(Olfactory receptor, family 7, subfamily C, member 1))は、嗅覚受容体ファミリーに属するGタンパク質共役受容体(G-protein-coupled receptors;GPCR)である。OR7C1は、ヒト大腸癌細胞株であるSW480細胞、HCT15細胞およびHT29細胞、ヒト肺癌細胞株であるLHK2細胞のSP(Side Population)細胞に発現する遺伝子であることが明らかにされている(特許文献1)。SP細胞はがん幹細胞を多く含む画分であると考えられており、高い造腫瘍能を有することが報告されている。
がん幹細胞は、がんの再発や転移の主要な原因と考えられており、がん治療においてがん幹細胞を標的とし、その増殖、遊走を抑制することの重要性が近年指摘されている。実際に、SW480細胞にOR7C1に対するsiRNAをトランスフェクトすると、SP細胞分画の比率および造腫瘍能が著しく減少することから、OR7C1はがん幹細胞の機能に必須の役割を担っていると考えられている。
更に、OR7C1は、正常組織では精巣のみに発現することから、「がん精巣抗原」として分類される。がん精巣抗原はがんワクチンの有望な標的分子として広く認識されている。
がん幹細胞は、がんの再発や転移の主要な原因と考えられており、がん治療においてがん幹細胞を標的とし、その増殖、遊走を抑制することの重要性が近年指摘されている。実際に、SW480細胞にOR7C1に対するsiRNAをトランスフェクトすると、SP細胞分画の比率および造腫瘍能が著しく減少することから、OR7C1はがん幹細胞の機能に必須の役割を担っていると考えられている。
更に、OR7C1は、正常組織では精巣のみに発現することから、「がん精巣抗原」として分類される。がん精巣抗原はがんワクチンの有望な標的分子として広く認識されている。
また、OR7C1はがんワクチンの有望な標的分子であり、実際に、OR7C1由来の部分ペプチドが、HLA−A24結合性腫瘍抗原ペプチドとして報告されている(特許文献1)。
ところで、上述したように、腫瘍免疫に係るCTLは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原ペプチドとHLAクラスI抗原との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。一般に、腫瘍抗原ペプチドのHLA−A02拘束性またはHLA−A24拘束性はそれぞれ独立したものであり、欧米人および日本人に多いHLA−A02およびHLA−A24は異なる抗原特異性を示すことが知られている。OR7C1についても、HLA−A24に結合可能なOR7C1由来腫瘍抗原ペプチドは知られているものの(特許文献1)、HLA−A02に結合可能、またはHLA−A02およびHLA−A24の両方に結合可能なOR7C1由来腫瘍抗原ペプチドは、未だ見出されていない。
ところで、上述したように、腫瘍免疫に係るCTLは、腫瘍細胞上の腫瘍抗原ペプチドとHLAクラスI抗原との複合体を認識し、腫瘍細胞を攻撃・破壊する。一般に、腫瘍抗原ペプチドのHLA−A02拘束性またはHLA−A24拘束性はそれぞれ独立したものであり、欧米人および日本人に多いHLA−A02およびHLA−A24は異なる抗原特異性を示すことが知られている。OR7C1についても、HLA−A24に結合可能なOR7C1由来腫瘍抗原ペプチドは知られているものの(特許文献1)、HLA−A02に結合可能、またはHLA−A02およびHLA−A24の両方に結合可能なOR7C1由来腫瘍抗原ペプチドは、未だ見出されていない。
本発明の目的は、HLA−A02およびHLA−A24の両方と結合可能な、OR7C1由来の腫瘍抗原ペプチド、およびこれを有効成分として含有するがんの予防および/または治療に有用な医薬組成物等を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、Genbank Accession No. NP_945182として登録されているOR7C1(Olfactory receptor, family 7, subfamily C, member 1)(配列番号2)の部分ペプチドであって、HLA−A02およびHLA−A24の両方に結合可能な腫瘍抗原ペプチドを見出した。
また本発明者らは、当該腫瘍抗原ペプチドが、in vivoまたはin vitroにおいてがん特異的CTLの誘導剤、すなわちがんワクチンとして用いることができることも明らかにした。当該腫瘍抗原ペプチドは、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん(腫瘍)疾患の予防および/または治療剤として有用である。また、当該腫瘍抗原ペプチドは、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん(腫瘍)に対する腫瘍マーカーとしても有用である。
また本発明者らは、当該腫瘍抗原ペプチドが、in vivoまたはin vitroにおいてがん特異的CTLの誘導剤、すなわちがんワクチンとして用いることができることも明らかにした。当該腫瘍抗原ペプチドは、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん(腫瘍)疾患の予防および/または治療剤として有用である。また、当該腫瘍抗原ペプチドは、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん(腫瘍)に対する腫瘍マーカーとしても有用である。
すなわち本発明は下記に掲げるものである:
〔1〕配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド;
〔2〕配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列において、
(1)C末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列、または、
(2)N末端および/またはC末端に1個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列
からなるペプチド;
〔3〕配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列のC末端のアミノ酸をロイシン、バリンまたはイソロイシンに置換したアミノ酸配列からなる、〔2〕のペプチド;
〔4〕配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列のN末端またはC末端に1アミノ酸付加されたアミノ酸配列からなる、〔2〕のペプチド;
〔1〕配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド;
〔2〕配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列において、
(1)C末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列、または、
(2)N末端および/またはC末端に1個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列
からなるペプチド;
〔3〕配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列のC末端のアミノ酸をロイシン、バリンまたはイソロイシンに置換したアミノ酸配列からなる、〔2〕のペプチド;
〔4〕配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列のN末端またはC末端に1アミノ酸付加されたアミノ酸配列からなる、〔2〕のペプチド;
〔5〕複数のエピトープペプチドを連結したポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、〔1〕〜〔4〕のペプチドを少なくとも1つ含む、前記ポリエピトープペプチド;
〔6〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する医薬組成物;
〔7〕アジュバントを含んでなる、〔6〕の医薬組成物;
〔8〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および/または治療用ワクチン;
〔9〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および/または治療剤;
〔10〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導剤;
〔6〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する医薬組成物;
〔7〕アジュバントを含んでなる、〔6〕の医薬組成物;
〔8〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および/または治療用ワクチン;
〔9〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および/または治療剤;
〔10〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導剤;
〔11〕〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチドの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド;
〔12〕〔11〕のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター;
〔13〕〔12〕の発現ベクターを含んでなる、遺伝子導入用組成物;
〔14〕以下の(a)または(b):
(a)〔11〕のポリヌクレオチド、
(b)〔12〕の発現ベクター
のいずれかを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
〔15〕以下の(a)または(b):
(a)〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチド、
(b)上記(a)記載のペプチドの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド、
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法;
〔12〕〔11〕のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター;
〔13〕〔12〕の発現ベクターを含んでなる、遺伝子導入用組成物;
〔14〕以下の(a)または(b):
(a)〔11〕のポリヌクレオチド、
(b)〔12〕の発現ベクター
のいずれかを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。
〔15〕以下の(a)または(b):
(a)〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチド、
(b)上記(a)記載のペプチドの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド、
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法;
〔16〕以下の(a)または(b):
(a)〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチド、
(b)上記(a)記載のペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることを含む、CTLの誘導方法;
〔17〕〔1〕〜〔4〕のペプチドとHLAとを含有するHLAマルチマー;
〔18〕〔17〕のHLAマルチマーを含有する診断薬;および
〔19〕〔1〕〜〔4〕のペプチドとHLAとの複合体を認識するTCR様抗体。
〔20〕〔19〕のTCR様抗体を含有する腫瘍検出剤。
〔21〕〔6〕、〔7〕または〔14〕の医薬組成物を有効に適用できる患者を選択するための診断薬であって、〔17〕のHLAマルチマーまたは〔19〕のTCR様抗体を含む、前記診断薬。
(a)〔1〕〜〔4〕のペプチドまたは〔5〕のポリエピトープペプチド、
(b)上記(a)記載のペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることを含む、CTLの誘導方法;
〔17〕〔1〕〜〔4〕のペプチドとHLAとを含有するHLAマルチマー;
〔18〕〔17〕のHLAマルチマーを含有する診断薬;および
〔19〕〔1〕〜〔4〕のペプチドとHLAとの複合体を認識するTCR様抗体。
〔20〕〔19〕のTCR様抗体を含有する腫瘍検出剤。
〔21〕〔6〕、〔7〕または〔14〕の医薬組成物を有効に適用できる患者を選択するための診断薬であって、〔17〕のHLAマルチマーまたは〔19〕のTCR様抗体を含む、前記診断薬。
本発明により、CTLの誘導剤として有用な腫瘍抗原ペプチド、およびこれを有効成分として含有するがんの予防および/または治療に有用な医薬組成物等が提供される。
(1)本発明のペプチド
本発明において「エピトープペプチド」とは、MHC(ヒトにおいてはHLA)と結合して、細胞表面に抗原提示されるペプチドを意味する。エピトープペプチドには、MHCクラスIと結合して抗原提示され、CD8陽性T細胞に認識されるエピトープペプチドであるCTLエピトープペプチド、およびMHCクラスIIと結合して抗原提示され、CD4陽性T細胞に認識されるエピトープペプチドであるヘルパーエピトープペプチドが含まれる。
エピトープペプチドのうち、腫瘍細胞において特異的にあるいは過剰に発現しているタンパク質由来のペプチドを、特に腫瘍抗原ペプチドという。抗原提示とは、細胞内に存在するペプチドがMHCと結合し、このMHC/抗原ペプチド複合体が細胞表面に局在化する現象をいう。上述のとおり、細胞表面に提示された抗原はT細胞などにより認識された後、細胞性免疫や液性免疫を活性化することが知られており、MHCクラスIに提示された抗原は、細胞性免疫を活性化するとともに、ナイーブT細胞のT細胞受容体に認識され、ナイーブT細胞を、細胞傷害活性を有するCTLへと誘導するため、免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドとしては、MHCクラスIと結合し、抗原提示されるペプチドが好ましい。
本発明において「エピトープペプチド」とは、MHC(ヒトにおいてはHLA)と結合して、細胞表面に抗原提示されるペプチドを意味する。エピトープペプチドには、MHCクラスIと結合して抗原提示され、CD8陽性T細胞に認識されるエピトープペプチドであるCTLエピトープペプチド、およびMHCクラスIIと結合して抗原提示され、CD4陽性T細胞に認識されるエピトープペプチドであるヘルパーエピトープペプチドが含まれる。
エピトープペプチドのうち、腫瘍細胞において特異的にあるいは過剰に発現しているタンパク質由来のペプチドを、特に腫瘍抗原ペプチドという。抗原提示とは、細胞内に存在するペプチドがMHCと結合し、このMHC/抗原ペプチド複合体が細胞表面に局在化する現象をいう。上述のとおり、細胞表面に提示された抗原はT細胞などにより認識された後、細胞性免疫や液性免疫を活性化することが知られており、MHCクラスIに提示された抗原は、細胞性免疫を活性化するとともに、ナイーブT細胞のT細胞受容体に認識され、ナイーブT細胞を、細胞傷害活性を有するCTLへと誘導するため、免疫療法に用いられる腫瘍抗原ペプチドとしては、MHCクラスIと結合し、抗原提示されるペプチドが好ましい。
本発明において、「腫瘍(tumor)」は、良性腫瘍および悪性腫瘍(がん、悪性新生物)を含む。がん(cancer)は、造血器の腫瘍、上皮性の悪性腫瘍(癌、carcinoma)と非上皮性の悪性腫瘍(肉腫、sarcoma)とを含む。
本発明のペプチドは、一態様において、配列番号2に記載のヒトOR7C1の部分ペプチドであって、MHC、特にHLAと結合するペプチド、好ましくはMHC、特にHLAにより抗原提示されるペプチド、さらに好ましくはMHC、特にHLAにより抗原提示されてCTLを誘導可能なペプチドを含む。HLAにはいくつかの型が存在するが、本発明のペプチドは、好ましくはHLAクラスIに結合可能であり、より好ましくはHLA−A02に結合可能であり、さらに好ましくはHLA−A02およびHLA−A24の両方に結合可能である。本発明のペプチドは、MHCに結合する前にプロセシングなどの処理を経てもよく、それらの処理の結果エピトープペプチドを生成するようなペプチドも本発明のペプチドに含まれる。したがって、本発明のペプチドは、エピトープペプチドのアミノ酸配列を含む配列であれば、アミノ酸長は特に限定されない。しかしながら、本発明のペプチドそのものがエピトープペプチドであることが好ましく、したがってアミノ酸長は約9〜約11アミノ酸程度が好ましい。
本発明のペプチドは、一態様において、配列番号2に記載のヒトOR7C1の部分ペプチドであって、MHC、特にHLAと結合するペプチド、好ましくはMHC、特にHLAにより抗原提示されるペプチド、さらに好ましくはMHC、特にHLAにより抗原提示されてCTLを誘導可能なペプチドを含む。HLAにはいくつかの型が存在するが、本発明のペプチドは、好ましくはHLAクラスIに結合可能であり、より好ましくはHLA−A02に結合可能であり、さらに好ましくはHLA−A02およびHLA−A24の両方に結合可能である。本発明のペプチドは、MHCに結合する前にプロセシングなどの処理を経てもよく、それらの処理の結果エピトープペプチドを生成するようなペプチドも本発明のペプチドに含まれる。したがって、本発明のペプチドは、エピトープペプチドのアミノ酸配列を含む配列であれば、アミノ酸長は特に限定されない。しかしながら、本発明のペプチドそのものがエピトープペプチドであることが好ましく、したがってアミノ酸長は約9〜約11アミノ酸程度が好ましい。
本発明のペプチドは、好ましい一態様において、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドを含み、より好ましくはこれらのアミノ酸配列はいずれも上記OR7C1の部分ペプチドである。さらに好ましくは、配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるペプチドである。配列番号3〜6で表されるペプチドはそれぞれ、上記OR7C1のアミノ酸位置117〜126の10アミノ酸、276〜285の10アミノ酸、118〜126の9アミノ酸、34〜44の11アミノ酸からなるペプチドであり、いずれのペプチドも、HLA−A02およびHLA−A24の両方と結合可能であることが本発明者らにより見出されたものである。
本発明のペプチドは、そのN末端および/またはC末端が修飾されていてもよい。当該修飾として具体的には、N−アルカノイル化(例えば、アセチル化)、N−アルキル化(例えば、メチル化)、C末端アルキルエステル(例えば、エチルエステル)、およびC末端アミド(例えばカルボキサミド)等が挙げられる。
本発明の別の一態様において、本発明のペプチドには、MHC、特にHLAと結合するOR7C1の部分ペプチドであるアミノ酸配列において、N末端および/またはC末端に1から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。特に好ましい態様は、上記配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6で表されるアミノ酸配列において、N末端および/またはC末端に1から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。N末端および/またはC末端に付加される「1から数個のアミノ酸」は、具体的には1〜5個のアミノ酸を意味し、例えば1個、2個、3個、4個あるいは5個のアミノ酸が挙げられ、特に好ましいのは1個である。
本発明の別の一態様において、本発明のペプチドには、MHC、特にHLAと結合するOR7C1の部分ペプチドであるアミノ酸配列において、N末端および/またはC末端に1から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。特に好ましい態様は、上記配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6で表されるアミノ酸配列において、N末端および/またはC末端に1から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。N末端および/またはC末端に付加される「1から数個のアミノ酸」は、具体的には1〜5個のアミノ酸を意味し、例えば1個、2個、3個、4個あるいは5個のアミノ酸が挙げられ、特に好ましいのは1個である。
また、本発明の別の一態様において、本発明のペプチドには、MHC、特にHLAと結合するOR7C1の部分ペプチドであるアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸、N末端のアミノ酸、および/または第2番目のアミノ酸、好ましくはC末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなるペプチドも含まれる。特に好ましい態様は、上記配列番号3、配列番号4、配列番号5または配列番号6で表されるアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸および/または第2番目のアミノ酸、好ましくはC末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明において「疎水性アミノ酸」は、分子内極性を有さないアミノ酸を意味し、中でも好ましくは天然アミノ酸であるグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンを意味する。本発明においては、これらの疎水性アミノ酸の中でも特にロイシン、バリンおよびイソロイシンが好ましい。したがって当該態様における好ましいペプチドには、C末端のアミノ酸がロイシン、バリンまたはイソロイシンに置換されたもの、例えば配列番号3のペプチドにおいて、C末端のバリンをイソロイシンに置き換えたペプチド(配列番号11)などが含まれる。なお、配列番号11のアミノ酸配列は、ヒトOR7C1遺伝子(Genbank Accession No. NM_198944、配列番号1)の塩基配列において376番目のグアニン(G)がアデニン(A)に置換された一塩基多型変異体のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド(すなわち、配列番号2で表されるアミノ酸配列において126位のバリン(V)がイソロイシン(I)に置換された変異体)におけるアミノ酸位置117〜126の部分ペプチドのアミノ酸配列と一致する。
当業者は、上記のN末端および/またはC末端に1から数個のアミノ酸を付加する改変と、C末端のアミノ酸、N末端のアミノ酸および/または第2番目のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換する改変とを組み合わせることができることを理解する。したがって、本発明のペプチドには、MHC、特にHLAと結合するOR7C1の部分ペプチドであるアミノ酸配列において、C末端のアミノ酸、N末端のアミノ酸、および/または第2番目のアミノ酸、好ましくはC末端のアミノ酸を、疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列からなるペプチドのN末端および/またはC末端に1から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。中でも好ましいのは、配列番号11で表されるペプチドのN末端および/またはC末端に1個、2個、3個、4個あるいは5個のアミノ酸、特に好ましくは1個のアミノ酸が付加されたペプチドである。
本発明のペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる既知の方法に準じて行うことができる。かかる既知の方法としては文献(Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966; The Proteins,Vol 2,Academic Press Inc.,New York,1976;ペプチド合成,丸善(株),1975;ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株),1985;医薬品の開発 続 第14巻・ペプチド合成,広川書店,1991、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)などに記載されている方法が挙げられる。
本発明のペプチドは、後述するCTL誘導方法や、ヒトモデル動物を用いたアッセイ(WO02/47474号公報、Int J. Cancer:100,565-570 (2002))等に供することにより、in vivoでの活性を確認することができる。
本発明のペプチドには、さらに、前記本発明のペプチドを少なくとも1つ含む複数のエピトープペプチドを連結したペプチド(ポリエピトープペプチド)も含まれる。したがって、該ポリエピトープペプチドであって、CTL誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
本発明のポリエピトープペプチドは、具体的には、
(i)本発明のペプチド(エピトープペプチド)および任意の本発明のペプチド以外の1または2以上のCTLエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、
(ii)本発明のペプチドおよび任意の1または2以上のヘルパーエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、若しくは、
(iii)上記(i)に記載のポリエピトープペプチドに、さらに1または2以上ヘルパーエピトープペプチドを、直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド
であって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じたエピトープペプチドが抗原提示細胞に提示され、CTL誘導活性を導くペプチドとして定義され得る。
本発明のポリエピトープペプチドは、具体的には、
(i)本発明のペプチド(エピトープペプチド)および任意の本発明のペプチド以外の1または2以上のCTLエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、
(ii)本発明のペプチドおよび任意の1または2以上のヘルパーエピトープペプチドを直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド、若しくは、
(iii)上記(i)に記載のポリエピトープペプチドに、さらに1または2以上ヘルパーエピトープペプチドを、直接、または適宜スペーサーを介して連結したペプチド
であって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じたエピトープペプチドが抗原提示細胞に提示され、CTL誘導活性を導くペプチドとして定義され得る。
ここで、(i)における本発明のペプチド以外のCTLエピトープペプチドとしては特に限定はないが、具体的には、OR7C1由来のペプチド(例えば、国際公開パンフレット:WO2010/050190に記載されたペプチド)が挙げられる。
スペーサーとしては、抗原提示細胞内におけるプロセッシングに悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、好ましくはそれぞれのエピトープペプチドとペプチド結合で連結されるリンカーであり、例えばいくつかのアミノ酸が連結したペプチドリンカーや、両端にアミノ基およびカルボキシル基を有するリンカーなどが挙げられる。具体的にはグリシンリンカーやPEG(ポリエチレングリコール)リンカーなどが挙げられ、グリシンリンカーとしてはポリグリシン(例えばグリシン6個からなるペプチド;Cancer Sci, vol.103, p150-153)が挙げられ、PEGリンカーとしては、PEGの両端にアミノ基およびカルボキシ基を有する化合物由来のリンカーが挙げられる(例えば、H2N−(CH2)2−(OCH2CH2)3−COOH;Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7551-7556)。
スペーサーとしては、抗原提示細胞内におけるプロセッシングに悪影響を及ぼさないものであれば特に限定されず、好ましくはそれぞれのエピトープペプチドとペプチド結合で連結されるリンカーであり、例えばいくつかのアミノ酸が連結したペプチドリンカーや、両端にアミノ基およびカルボキシル基を有するリンカーなどが挙げられる。具体的にはグリシンリンカーやPEG(ポリエチレングリコール)リンカーなどが挙げられ、グリシンリンカーとしてはポリグリシン(例えばグリシン6個からなるペプチド;Cancer Sci, vol.103, p150-153)が挙げられ、PEGリンカーとしては、PEGの両端にアミノ基およびカルボキシ基を有する化合物由来のリンカーが挙げられる(例えば、H2N−(CH2)2−(OCH2CH2)3−COOH;Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 7551-7556)。
本発明のポリエピトープペプチドに含まれる本発明のエピトープペプチドは、1種または2種以上が選択されてよい。すなわち、同一のエピトープペプチドが複数個連結されていてもよいし、複数の異なるエピトープペプチドが連結されたものであってもよい。当然ながら、2種以上のエピトープペプチドが選択される場合であっても、選択されたエピトープペプチドのうちの1種または2種以上が複数個連結されてもよい。本発明のペプチド以外のエピトープペプチドについても、同様に複数種および/または複数個のエピトープペプチドが連結されてよい。本発明のポリエピトープペプチドは、2〜12個のエピトープペプチドが連結されたものであってよく、好ましくは2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個のエピトープペプチドが連結されており、最も好ましくは2個のエピトープペプチドが連結されている。
ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープペプチドがヘルパーエピトープペプチドの場合、用いられるヘルパーエピトープペプチドとしては、例えばB型肝炎ウイルス由来のHBVc128−140や破傷風毒素由来のTT947−967などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープペプチドの長さとしては、13〜30アミノ酸程度、好ましくは13〜17アミノ酸程度を挙げることができる。
ここで、本発明のペプチドに連結させるエピトープペプチドがヘルパーエピトープペプチドの場合、用いられるヘルパーエピトープペプチドとしては、例えばB型肝炎ウイルス由来のHBVc128−140や破傷風毒素由来のTT947−967などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープペプチドの長さとしては、13〜30アミノ酸程度、好ましくは13〜17アミノ酸程度を挙げることができる。
このような複数のエピトープペプチドを連結させたペプチド(ポリエピトープペプチド)もまた、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープペプチドを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のDNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。
すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献(Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985))に記載の方法などに準じて行うことができる。
すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献(Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory(1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985))に記載の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のエピトープペプチドを連結させたポリエピトープペプチドを、前述のin vitroアッセイや、WO02/47474号公報およびInt J. Cancer:100,565-570 (2002)(これらの文献は引用により本願の一部を構成する)に記述のヒトモデル動物を用いたin vivoアッセイに供すること等によりCTL誘導活性を確認することができる。
本発明のペプチド(ポリエピトープペプチドを含む)は、本明細書に記載のとおり、がんの予防および/または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のペプチドは、がんの予防および/または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および/または治療のための医薬の製造への本発明のペプチドの使用にも関する。
本発明のペプチド(ポリエピトープペプチドを含む)は、本明細書に記載のとおり、がんの予防および/または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のペプチドは、がんの予防および/または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および/または治療のための医薬の製造への本発明のペプチドの使用にも関する。
(2)本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のペプチドを少なくとも1つコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、cDNAやmRNA、cRNA、または合成DNAのいずれであってもよい。また1本鎖、2本鎖のいずれの形態であってもよい。具体的には、例えば配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号11に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号3、4、5、6および11から選択される任意の2以上のペプチド、または配列番号3、4、5、6および11から選択されるペプチドおよびヘルパーエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを、それぞれ発現可能なようにコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、前記本発明のペプチドを少なくとも1つコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドは、cDNAやmRNA、cRNA、または合成DNAのいずれであってもよい。また1本鎖、2本鎖のいずれの形態であってもよい。具体的には、例えば配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号11に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号3、4、5、6および11から選択される任意の2以上のペプチド、または配列番号3、4、5、6および11から選択されるペプチドおよびヘルパーエピトープを連結させたポリエピトープペプチドを、それぞれ発現可能なようにコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、1本鎖および2本鎖のいずれの形態もとることができる。本発明のポリヌクレオチドが2本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。すなわち本発明のポリヌクレオチドの範疇には、本発明の2本鎖型ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおり、がんの予防および/または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、がんの予防および/または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および/または治療のための医薬の製造への本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおり、がんの予防および/または治療などに有用であり、医薬組成物の有効成分とすることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、がんの予防および/または治療のためのものであってもよい。さらに、本発明は、がんの予防および/または治療のための医薬の製造への本発明のポリヌクレオチドの使用にも関する。
本発明で用いる発現ベクターは、用いる宿主や目的等に応じて様々なものを用いることができ、当業者であれば適宜選択することができる。本発明で用い得る発現ベクターとしては、例えばプラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、pUC118、pUC119、pBR322、pCR3等のプラスミドベクター、λZAPII、λgt11などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、pYES2、pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、pAcSGHisNT−Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していてもよい。また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Hisタグ、あるいはGST(グルタチオンS−トランスフェラーゼ)等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていてもよい。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター(lac、tac、trc、trp、CMV、SV40初期プロモーターなど)を有するGST融合タンパク質ベクター(pGEX4Tなど)や、Myc、Hisなどのタグ配列を有するベクター(pcDNA3.1/Myc−Hisなど)、さらにはチオレドキシンおよびHisタグとの融合タンパク質を発現するベクター(pET32a)などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。ここで用いられる宿主としては、本発明のポリペプチドが有する機能を損なわない限りいかなる細胞を用いてもよく、例えば大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K−12系統のHB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、Saccharomyces cerevisiaeなどが挙げられる。動物細胞としては、L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、Hela細胞、293−EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはsf9などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いればよい。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド(Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社)を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いればよい。具体的にはリン酸カルシウム法、DEAE−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド(Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社)を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のペプチドを、前述のチオレドキシンやHisタグ、GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもRNAの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるDNAの配列情報に基づき、当該技術分野において知られた通常の方法を用いて容易に製造することができる。具体的には、通常のDNA合成やPCRによる増幅などによって、製造することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNAの形態であってもRNAの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるDNAの配列情報に基づき、当該技術分野において知られた通常の方法を用いて容易に製造することができる。具体的には、通常のDNA合成やPCRによる増幅などによって、製造することができる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記エピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。
(3)本発明のペプチドを有効成分とする、CTL誘導剤
本発明のペプチドはCTL誘導活性を有し、腫瘍抗原ペプチドとして、CTL誘導剤となり得る。
すなわち、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで本発明のペプチドを添加して刺激することにより、該ペプチドをパルスしたHLA−A02抗原陽性細胞、またはHLA−A24抗原陽性細胞を特異的に認識するCTLを誘導することができる(J.Immunol.,154,p2257,1995)。ここでCTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してCTLが産生する種々のサイトカイン(例えばIFN−γ)の量を、例えばELISA法などによって測定することにより、確認することができる。また51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法(51Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994)によっても確認することができる。
また、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987、 N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により、CTLクローンを樹立することもできる。
本発明のペプチドはCTL誘導活性を有し、腫瘍抗原ペプチドとして、CTL誘導剤となり得る。
すなわち、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、in vitroで本発明のペプチドを添加して刺激することにより、該ペプチドをパルスしたHLA−A02抗原陽性細胞、またはHLA−A24抗原陽性細胞を特異的に認識するCTLを誘導することができる(J.Immunol.,154,p2257,1995)。ここでCTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してCTLが産生する種々のサイトカイン(例えばIFN−γ)の量を、例えばELISA法などによって測定することにより、確認することができる。また51Crで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するCTLの傷害性を測定する方法(51Crリリースアッセイ、Int.J.Cancer,58:p317,1994)によっても確認することができる。
また、Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987、 N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等に記載の方法により、CTLクローンを樹立することもできる。
本発明のペプチドによって誘導されたCTLは、本発明のペプチドを抗原として提示する細胞に対する傷害作用やリンフォカインの産生能を有する。本発明のペプチドは上述のとおり腫瘍抗原ペプチドであるため、それら機能を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のペプチドおよびそれにより誘導されたCTLは、がんの予防および/または治療のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。
本発明のペプチドを有効成分として含有するCTL誘導剤をがん患者に投与すると、抗原提示細胞のHLA−A02抗原またはHLA−A24抗原に本発明のペプチドが提示され、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原と提示されたペプチドとの結合複合体特異的CTLが増殖してがん細胞を破壊することができ、その結果、がんを予防および/または治療することができる。したがって、本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、好ましくは、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原陽性の対象であって、OR7C1陽性のがんに罹患している対象に対して使用することができる。OR7C1陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん(腫瘍)などが挙げられ、本発明のCTL誘導剤は、これらのがんの予防および/または治療のために使用することができる。
本発明のペプチドを有効成分として含有するCTL誘導剤をがん患者に投与すると、抗原提示細胞のHLA−A02抗原またはHLA−A24抗原に本発明のペプチドが提示され、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原と提示されたペプチドとの結合複合体特異的CTLが増殖してがん細胞を破壊することができ、その結果、がんを予防および/または治療することができる。したがって、本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、好ましくは、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原陽性の対象であって、OR7C1陽性のがんに罹患している対象に対して使用することができる。OR7C1陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん(腫瘍)などが挙げられ、本発明のCTL誘導剤は、これらのがんの予防および/または治療のために使用することができる。
ここでがんの「予防」には、患者のがんへの罹患の予防だけでなく、手術により原発巣の腫瘍を切除した患者における再発予防、手術、放射線療法もしくは薬物療法等のがん治療により完全に除去できなかった腫瘍の転移防止等が含まれる。また、がんの「治療」には、がんを縮小させるがんの治癒・症状改善のみでなく、がん細胞の増殖、腫瘍の拡大もしくは原発巣からのがん細胞の転移を抑制する進行防止等が含まれる。
本発明のペプチドを有効成分とするCTL誘導剤は、配列番号2に記載のOR7C1陽性のがんに罹患している、HLA−A02またはHLA−A24陽性のがん患者に対して特に有効である。具体的には、例えば、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん(腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
本発明のペプチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、単一のCTLエピトープ(本発明のペプチド)を有効成分とするものであっても、また他のペプチド(CTLエピトープやヘルパーエピトープ)と連結したポリエピトープペプチドを有効成分とするものであってもよい。近年、複数のCTLエピトープ(抗原ペプチド)を連結したポリエピトープペプチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1998, 161: 3186-3194(本文献は引用により本願の一部を構成する)には、がん抗原タンパク質PSA由来のHLA−A2、−A3、−A11、−B53拘束性CTLエピトープ(抗原ペプチド)を連結した約30merのポリエピトープペプチドが、in vivoでそれぞれのCTLエピトープに特異的なCTLを誘導したことが記載されている。またCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドにより、効率的にCTLが誘導されることも示されている。このようなポリエピトープペプチドの形態で投与した場合、ポリエピトープペプチドが抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがHLA抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なCTLが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。このようにしてがんの治療または予防が促進される。
本発明のペプチドを有効成分とするCTL誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して投与、または併用して投与することができる。
アジュバントとしては、文献(例えば、Clin Infect Dis.:S266-70, 2000)に記載のものなど、当該技術分野において既知のアジュバントが適用可能であり、具体的には、例えば、ゲルタイプとして水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムなど、菌体タイプとしてCpG、モノホスホリルリピドA(monophosphoryl lipid A;MPL)、コレラ毒素、大腸菌易熱性毒素、百日咳毒素およびムラミルジペプチド(Muramyl dipeptide;MDP)など、油乳濁液タイプ(エマルション製剤)としてフロイント不完全アジュバント、MF59およびSAFなど、高分子ナノ粒子タイプとして免疫刺激複合体(Immunostimulatory complex;ISCOMs)、リポソーム、生分解性マイクロスフェア(Biodegradable microsphere)およびサポニン由来のQS−21など、合成タイプとして非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログ(Muramyl peptide analogue)、ポリホスファゼンおよび合成ポリヌクレオチドなど、サイトカインタイプとしてIFN−γ、IL−2およびIL−12などを挙げることができる。
また、本発明のペプチドを有効成分とするCTL誘導剤の剤形としては、特に限定はないが、油乳濁液(エマルション製剤)、高分子ナノ粒子、リポソーム製剤、直径数μmのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェア製剤、マイクロカプセル製剤などが挙げられる。
また、本発明のペプチドを有効成分とするCTL誘導剤の剤形としては、特に限定はないが、油乳濁液(エマルション製剤)、高分子ナノ粒子、リポソーム製剤、直径数μmのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤、マイクロスフェア製剤、マイクロカプセル製剤などが挙げられる。
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の投与方法が挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に1回投与するのが好ましい。
本発明のペプチドを実際に医薬として作用させる手法としては、当該ペプチドを直接体内に導入するin vivo法の他に、ヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のペプチドを作用させ、その細胞を体内に戻すex vivo法があり(日経サイエンス,1994年4月号,20−45頁、月刊薬事,36(1),23−48(1994)、実験医学増刊,12(15),(1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)、当業者であれば、かかる手法に適切な細胞、投与方法、投与形態および投与量を選択することができる。
本発明のペプチドを実際に医薬として作用させる手法としては、当該ペプチドを直接体内に導入するin vivo法の他に、ヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のペプチドを作用させ、その細胞を体内に戻すex vivo法があり(日経サイエンス,1994年4月号,20−45頁、月刊薬事,36(1),23−48(1994)、実験医学増刊,12(15),(1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)、当業者であれば、かかる手法に適切な細胞、投与方法、投与形態および投与量を選択することができる。
(4)本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするCTL誘導剤
本発明のポリヌクレオチドを発現させた細胞は、本発明のペプチドを抗原として提示する細胞となるため、T細胞受容体を介してT細胞に認識されるという特徴を有する。したがって、本発明のポリヌクレオチドもまたCTLの誘導剤となり得る。誘導されたCTLは、本発明のペプチドによって誘導されたCTLと同様に、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のポリヌクレオチドは、がんの治療または予防のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明のポリヌクレオチドを有効成分として含有するCTLの誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドをがん患者に投与し発現させることで、がんを治療および/または予防し得るものである。
本発明のポリヌクレオチドを発現させた細胞は、本発明のペプチドを抗原として提示する細胞となるため、T細胞受容体を介してT細胞に認識されるという特徴を有する。したがって、本発明のポリヌクレオチドもまたCTLの誘導剤となり得る。誘導されたCTLは、本発明のペプチドによって誘導されたCTLと同様に、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用、好ましくは抗がん作用を発揮することができる。したがって本発明のポリヌクレオチドは、がんの治療または予防のための医薬や医薬組成物の有効成分とすることができる。本発明のポリヌクレオチドを有効成分として含有するCTLの誘導剤は、例えば、本発明のポリヌクレオチドをがん患者に投与し発現させることで、がんを治療および/または予防し得るものである。
例えば発現ベクターに組み込まれた本発明のポリヌクレオチドを以下の方法によりがん患者に投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原ペプチドが高発現する。その後、生じた腫瘍抗原ペプチドがHLA−A02抗原またはHLA−A24抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、がん特異的CTLが体内で効率的に増殖し、がん細胞を破壊する。以上のようにして、がんの治療または予防が達成される。
本発明のポリヌクレオチドを有効成分とするCTLの誘導剤は、好ましくは、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原陽性の対象であって、OR7C1陽性のがんに罹患した対象に対して使用することができる。OR7C1陽性のがんとしては、例えば大腸癌、肺癌、卵巣癌等のがん(腫瘍)などが挙げられ、本発明のCTL誘導剤は、これらのがんの予防または治療のために使用することができる。
本発明のポリヌクレオチドを投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法(日経サイエンス,1994年4月号,20−45頁、月刊薬事,36(1),23−48(1994)、実験医学増刊,12(15),(1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)のいずれの方法も適用することができる。
本発明のポリヌクレオチドを投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法(日経サイエンス,1994年4月号,20−45頁、月刊薬事,36(1),23−48(1994)、実験医学増刊,12(15),(1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)のいずれの方法も適用することができる。
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルスまたはRNAウイルスに本発明のDNAを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNAワクチン法、リポソーム法が好ましい。
本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するin vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で本発明のポリヌクレオチドを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo法がある(日経サイエンス,1994年4月号,20−45頁、月刊薬事,36(1),23−48(1994)、実験医学増刊,12(15),(1994)、およびこれらの引用文献等、これらの文献は引用により本願の一部を構成する)。in vivo法がより好ましい。
本発明のポリヌクレオチドをin vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路および投与形態を適宜選択して投与し得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射可能な形態で投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー(担体)を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルス(HVJ)−リポソーム等)においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
本発明のポリヌクレオチドをin vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路および投与形態を適宜選択して投与し得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射可能な形態で投与することができる。in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、医薬上許容されるキャリアー(担体)を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム(センダイウイルス(HVJ)−リポソーム等)においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明のポリヌクレオチドの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、ポリヌクレオチドの含量として、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgの本発明のポリヌクレオチドを、数日ないし数月に1回投与するのが好ましい。
当業者であれば、好適な細胞、ベクター、投与方法、投与形態および投与量を適宜選択することが可能である。
当業者であれば、好適な細胞、ベクター、投与方法、投与形態および投与量を適宜選択することが可能である。
また近年、複数のCTLエピトープ(腫瘍抗原ペプチド)を連結したポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはCTLエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたポリエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、in vivoで効率的にCTL誘導活性を有することが示されている。例えばJournal of Immunology 1999, 162: 3915-3925(本文献は引用により本願の一部を構成する)には、HBV由来HLA−A2拘束性抗原ペプチド6種類、HLA−A11拘束性抗原ペプチド3種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするDNA(ミニジーン)が、in vivoでそれぞれのエピトープに対するCTLを効果的に誘導したことが記載されている。
したがって、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを1種または2種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなCTLの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。
したがって、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを1種または2種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。このようなCTLの誘導剤も、前記と同様の投与方法および投与形態をとることができる。
(5)本発明の抗原提示細胞
前記した本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、がん患者の治療において、例えば、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかと抗原提示能を有する細胞とをin vitroで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。具体的には本発明は、がん患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより、当該細胞の細胞表面にHLA−A02抗原またはHLA−A24抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞、およびその製造方法を提供するものである。
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なMHC、好ましくはHLA−A02抗原またはHLA−A24抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、これらのうち、プロフェッショナル抗原提示細胞が好ましく、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞がより好ましい。
前記した本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、がん患者の治療において、例えば、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかと抗原提示能を有する細胞とをin vitroで接触させることにより、抗原提示細胞を作製することができる。具体的には本発明は、がん患者由来の単離された抗原提示能を有する細胞と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより、当該細胞の細胞表面にHLA−A02抗原またはHLA−A24抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させた抗原提示細胞、およびその製造方法を提供するものである。
ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能なMHC、好ましくはHLA−A02抗原またはHLA−A24抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されないが、これらのうち、プロフェッショナル抗原提示細胞が好ましく、特に抗原提示能が高いとされる樹状細胞がより好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために添加される物質としては、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれであってもよい。
本発明の抗原提示細胞は、例えば、がん患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチドをin vitroでパルスして、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999)。樹状細胞を用いる場合は、例えば、がん患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM−CSFおよびIL−4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
本発明の抗原提示細胞は、例えば、がん患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチドをin vitroでパルスして、HLA−A02抗原またはHLA−A24抗原と本発明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998、J.Immunol.,158,p1796,1997、Cancer Res.,59,p1184,1999)。樹状細胞を用いる場合は、例えば、がん患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をGM−CSFおよびIL−4存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のポリヌクレオチドを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドは、DNAの形態であっても、RNAの形態であってもよい。具体的には、DNAの場合はCancer Res.,56:p5672,1996やJ.Immunol.,161: p5607,1998(これらの文献は引用により本願の一部を構成する)などを参考にして行うことができ、またRNAの場合はJ.Exp.Med., 184: p465,1996(本文献は引用により本願の一部を構成する)などを参考にして行うことができる。
前記抗原提示細胞はCTLの誘導剤の有効成分とすることができる。当該抗原提示細胞を有効成分として含有するCTLの誘導剤は、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このような抗原提示細胞を有効成分として含有してなるCTLの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、OR7C1陽性のがんに罹患している患者の体内で、本発明のペプチドを抗原提示するがん細胞に特異的なCTLが効率良く誘導され、結果として本発明のペプチドを抗原提示するOR7C1陽性のがんを治療することができる。
(6)本発明の細胞傷害性T細胞(CTL)
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、がん患者の治療において、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかと末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることにより、CTLを誘導することができる。具体的には本発明は、がん患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより誘導されたCTL、およびその誘導方法を提供するものである。
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、がん患者の治療において、以下のようにin vitroで利用することができる。すなわち本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドのいずれかと末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることにより、CTLを誘導することができる。具体的には本発明は、がん患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをin vitroで接触させることにより誘導されたCTL、およびその誘導方法を提供するものである。
例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤T細胞を体外で大量に培養して、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている(J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994)。またマウスのメラノーマにおいては、脾細胞を、in vitroで腫瘍抗原ペプチドTRP−2により刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なCTLを増殖させ、該CTLをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている(J.Exp.Med.,185:453,1997)。これは、抗原提示細胞のMHCと腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するCTLをin vitroで増殖させた結果に基づくものである。したがって、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを用いて、in vitroで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的CTLを増やした後、このCTLを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。
当該CTLはがんの治療剤または予防剤の有効成分とすることができる。該治療剤または予防剤は、CTLを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与などが挙げられる。このようなCTLを有効成分として含有してなるがんの治療または予防剤を患者の体内に戻すことにより、本発明のOR7C1陽性のがんに罹患した患者の体内でCTLによるがん細胞の傷害作用が促進され、がん細胞を破壊することにより、がんを治療することができる。
(7)本発明のペプチドを用いた腫瘍特異的CTL検出剤
本発明のペプチド、特に配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、腫瘍特異的CTLに認識されるため、腫瘍特異的CTL検出剤の成分として有用である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドを含む、腫瘍特異的CTL検出剤に関する。一態様において、本発明の腫瘍検出剤および腫瘍特異的CTL検出剤は、本発明のペプチドとHLA−A02またはHLA−A24とを含有するHLAマルチマー(モノマー、ダイマー、テトラマー、ペンタマーおよびデキストラマー)を含む。
本発明のペプチド、特に配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、腫瘍特異的CTLに認識されるため、腫瘍特異的CTL検出剤の成分として有用である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドを含む、腫瘍特異的CTL検出剤に関する。一態様において、本発明の腫瘍検出剤および腫瘍特異的CTL検出剤は、本発明のペプチドとHLA−A02またはHLA−A24とを含有するHLAマルチマー(モノマー、ダイマー、テトラマー、ペンタマーおよびデキストラマー)を含む。
例えば、HLAテトラマーとは、HLAのα鎖とβ2ミクログロブリンをペプチド(抗原ペプチド)と会合させた複合体(HLAモノマー)をビオチン化し、アビジンに結合させることにより4量体化したものを指す(Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996))。現在では種々の抗原ペプチドを含有するHLAテトラマーが市販されており(例えば(株)医学生物学研究所より)、本発明のペプチドとHLA−A02またはHLA−A24とを含有するHLAテトラマーを容易に作製することができる。また、HLAダイマーおよびHLAペンタマーも同様な原理に基づいており、これらにおいては、それぞれ、前記HLAモノマーが2量体化および5量体化されている。したがって、本発明のペプチドとHLA−A02またはHLA−A24とを含有するHLAマルチマーもまた、本発明の一態様である。
具体的には、例えば配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6または配列番号11に記載のアミノ酸配列からなるペプチドとHLA−A02またはHLA−A24とを含有するHLAテトラマーが挙げられる。当該HLAテトラマーは、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の既知の検出手段により結合したCTLを容易に選別または検出することができるように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン(PE)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ペリジニンクロロフィルプロテイン(PerCP)などにより標識されたHLAテトラマーが挙げられる。
HLAテトラマーの製法例としては、例えば、Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)などの文献に記載のものが挙げられ、簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、HLA−A24あるいはHLA−A02のα鎖発現ベクターおよびβ2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌(例えばBL21)を用いることが好ましい。得られた単量体HLA−A24あるいはHLA−A02複合体と本発明のペプチドとを混合し、可溶性のHLA−ペプチド複合体を形成させる。次にHLA−ペプチド複合体におけるHLA−A02あるいはHLA−A24のα鎖のC末端部位の配列をBirA酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたHLA−ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを4:1のモル比で混合することにより、HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、HLA−A24あるいはHLA−A02のα鎖発現ベクターおよびβ2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌(例えばBL21)を用いることが好ましい。得られた単量体HLA−A24あるいはHLA−A02複合体と本発明のペプチドとを混合し、可溶性のHLA−ペプチド複合体を形成させる。次にHLA−ペプチド複合体におけるHLA−A02あるいはHLA−A24のα鎖のC末端部位の配列をBirA酵素によりビオチン化する。このビオチン化されたHLA−ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを4:1のモル比で混合することにより、HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステップにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
(8)本発明のペプチドを標的とする腫瘍検出剤
本発明のペプチドは、がん細胞によりCTLエピトープペプチドとして提示されるため、腫瘍マーカーとして利用できる。このため、本発明のペプチドを腫瘍マーカーとして検出可能な物質、例えば、本発明のペプチドとHLA−A24もしくはHLA−A02との複合体を認識するTCR(T細胞抗原受容体)様抗体は、腫瘍検出剤として有用である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドを検出可能な物質を含む、腫瘍検出剤にも関する。本発明のペプチドは、抗原提示細胞、特に樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞にも提示されるため、上記検出剤は、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞の検出にも有用である。
本発明において「TCR様抗体」は、断片化された抗原由来のペプチドと主要組織適合性抗原複合体(MHC)分子との複合体(pMHC)に対してTCR様の結合力(抗原認識能)を有する分子である。例えば、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で報告されているように、腫瘍抗原由来のペプチドとMHCとの複合体を認識するTCR様抗体は、CTLが標的とし得る腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞、がん細胞を貪食してMHCクラスI上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができる。
本発明のペプチドは、がん細胞によりCTLエピトープペプチドとして提示されるため、腫瘍マーカーとして利用できる。このため、本発明のペプチドを腫瘍マーカーとして検出可能な物質、例えば、本発明のペプチドとHLA−A24もしくはHLA−A02との複合体を認識するTCR(T細胞抗原受容体)様抗体は、腫瘍検出剤として有用である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドを検出可能な物質を含む、腫瘍検出剤にも関する。本発明のペプチドは、抗原提示細胞、特に樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞にも提示されるため、上記検出剤は、本発明のペプチドを提示する抗原提示細胞の検出にも有用である。
本発明において「TCR様抗体」は、断片化された抗原由来のペプチドと主要組織適合性抗原複合体(MHC)分子との複合体(pMHC)に対してTCR様の結合力(抗原認識能)を有する分子である。例えば、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で報告されているように、腫瘍抗原由来のペプチドとMHCとの複合体を認識するTCR様抗体は、CTLが標的とし得る腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞、がん細胞を貪食してMHCクラスI上に腫瘍抗原ペプチドを提示している樹状細胞などを認識することができる。
また、ウイルス等由来のペプチドとMHCとの複合体を認識する前記TCR様抗体は、提示した抗原が感染細胞上でどの様な提示動態およびCTL応答等を示すのかを、定量的・経時的に解析できる。
前記TCR様抗体は、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で記載されている方法で作製することができる。例えば、MHCとペプチド複合体をマウス等の動物に免疫することにより複合体特異的な抗体を取得できる。また、ファージディスプレイ法を利用して複合体特異的抗体を取得することも可能である。
前記TCR様抗体は、Eur J Immunol. 2004;34:2919-29等で記載されている方法で作製することができる。例えば、MHCとペプチド複合体をマウス等の動物に免疫することにより複合体特異的な抗体を取得できる。また、ファージディスプレイ法を利用して複合体特異的抗体を取得することも可能である。
(9)腫瘍の検出方法(検査方法、診断方法)
本発明は、前述した本発明のCTL検出剤または腫瘍検出剤を利用した腫瘍の検出方法(検査方法、診断方法)を提供するものである。
本発明のCTL検出剤を用いる本発明の検出方法(診断方法)は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部を生検等で採取し、そこに含まれるOR7C1由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を認識するCTLの量を、本発明のCTL検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のOR7C1陽性のがん(腫瘍)の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
本発明は、前述した本発明のCTL検出剤または腫瘍検出剤を利用した腫瘍の検出方法(検査方法、診断方法)を提供するものである。
本発明のCTL検出剤を用いる本発明の検出方法(診断方法)は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部を生検等で採取し、そこに含まれるOR7C1由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を認識するCTLの量を、本発明のCTL検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のOR7C1陽性のがん(腫瘍)の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出方法(検査方法、診断方法)は、典型的には、被験者の血液を採取するか、若しくは腫瘍が疑われる被験組織の一部を生検等で採取し、そこに含まれるOR7C1由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を提示する細胞の量を、本発明の腫瘍検出剤によって検出・測定することにより、大腸癌、肺癌、卵巣癌等のOR7C1陽性のがん(腫瘍)の罹患の有無またはその程度を検出、検査または診断するものである。
本発明の検出(検査、診断)方法は、例えば腫瘍を有する患者において、該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、該腫瘍の改善の有無またはその程度を検出(検査、診断)することもできる。さらに本発明の検出(検査、診断)方法は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを有効成分とする医薬を有効に適用できるがん患者の選択や、当該医薬による治療効果の予測や判定などにも利用できる。また、本発明の腫瘍検出剤を用いる態様においては、本発明のペプチドを有効成分とするがんワクチンを投与することにより患者生体内で誘導されるCTLが実際に標的とし得る、腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞を検出することが可能である
本発明の検出(検査、診断)方法は、例えば腫瘍を有する患者において、該腫瘍の改善のために治療薬を投与した場合における、該腫瘍の改善の有無またはその程度を検出(検査、診断)することもできる。さらに本発明の検出(検査、診断)方法は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを有効成分とする医薬を有効に適用できるがん患者の選択や、当該医薬による治療効果の予測や判定などにも利用できる。また、本発明の腫瘍検出剤を用いる態様においては、本発明のペプチドを有効成分とするがんワクチンを投与することにより患者生体内で誘導されるCTLが実際に標的とし得る、腫瘍抗原ペプチドを提示しているがん細胞を検出することが可能である
本発明のCTL検出剤を用いる本発明の検出(検査)方法の特定の態様は、次の(a)および(b)、および任意に(c)の工程を含むものである:
(a)被験者から得られた生体試料と本発明のCTL検出剤とを接触させる工程、
(b)該生体試料中のOR7C1由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を認識するCTLの量を、上記CTL検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
(c)(b)の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明のCTL検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記(a)、(b)および(c)の工程を含む。
(a)被験者から得られた生体試料と本発明のCTL検出剤とを接触させる工程、
(b)該生体試料中のOR7C1由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を認識するCTLの量を、上記CTL検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
(c)(b)の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明のCTL検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記(a)、(b)および(c)の工程を含む。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の検出(検査)方法の特定の態様は、次の(d)および(e)、および任意に(f)の工程を含むものである:
(d)被験者から得られた生体試料と本発明の腫瘍検出剤とを接触させる工程、
(e)該生体試料中のOR7C1由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を提示する細胞の量を、上記腫瘍検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
(f)(e)の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記(d)、(e)および(f)の工程を含む。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織(がん細胞の存在が疑われる組織およびその周辺組織、または血液など)から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製される末梢血リンパ球を含む試料を挙げることができる。
(d)被験者から得られた生体試料と本発明の腫瘍検出剤とを接触させる工程、
(e)該生体試料中のOR7C1由来の腫瘍抗原ペプチドとHLA抗原との複合体を提示する細胞の量を、上記腫瘍検出剤が結合した細胞の量を指標として測定する工程、
(f)(e)の結果をもとに、がんの罹患を判断する工程。
本発明の腫瘍検出剤を用いる本発明の診断方法の特定の態様は、上記(d)、(e)および(f)の工程を含む。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織(がん細胞の存在が疑われる組織およびその周辺組織、または血液など)から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製される末梢血リンパ球を含む試料を挙げることができる。
本発明のCTL検出剤を用いる本発明の検出方法(検査方法、診断方法)の一態様は、生体試料中の本発明のペプチド特異的CTLを検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には、文献(Science,274:p94,1996、本文献は引用により本願の一部を構成する)に記載の方法に従って蛍光標識したHLA抗原と本発明のペプチドとの複合体の4量体(HLAテトラマー)を作製し、これを用いてがんが疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的CTLをフローサイトメーターにより定量することにより行うことができる。
腫瘍の有無の予測、判定、判断または診断は、例えば、被験者の血液や腫瘍が疑われる被験組織における本発明のペプチド特異的CTLの量、または、本発明のペプチドを提示する細胞の量を測定することにより行うことができる。その際、場合によっては正常な対応組織におけるOR7C1遺伝子発現レベル、本発明のペプチドレベルまたはCTLレベル等を基準値として、該基準値と被験者から得られた試料における前記レベルとを比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との前記レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数(少なくとも2つ、好ましくは3以上、より好ましくは5以上)の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本発明のペプチド特異的CTLの量の平均値または統計的中間値を、正常者の値すなわち基準値として、比較に用いることができる。
ここで被験者の被験組織と正常な対応組織との前記レベルの比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数(少なくとも2つ、好ましくは3以上、より好ましくは5以上)の正常な組織を用いて均一な測定条件で測定して得られた本発明のペプチド特異的CTLの量の平均値または統計的中間値を、正常者の値すなわち基準値として、比較に用いることができる。
被験者が、がんに罹患しているかどうかの判断は、例えば該被験者の組織における本発明のペプチド特異的CTLの量、または、本発明のペプチドを提示する細胞が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば2倍以上、好ましくは3倍以上多いことを指標として行うことができる。
また、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを投与されている被験者において、本発明のペプチド特異的CTLの量を測定することにより、実際にCTLが誘導されているか否かを判定することも可能である。例えば、該被験者の組織における本発明のペプチド特異的CTLの量が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば2倍以上、好ましくは3倍以上多いことを指標として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドによる治療が有効であると判定することができる。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、主にワクチンとして作用し、CTLを誘導することにより抗腫瘍作用を発揮すると考えられることから、CTLの誘導は、投与した本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドがワクチンとして作用しているか否かを確認するためのいわゆるPOM(Proof of Mechanism)マーカーとして用いることができる。したがって本発明のCTL検出剤は、POMマーカーとしてのCTLを検出することにより、投与対象において投与したペプチドまたはポリヌクレオチドがワクチンとして作用しているか否かを確認するための診断薬として用いることができる。
また、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを投与されている被験者において、本発明のペプチド特異的CTLの量を測定することにより、実際にCTLが誘導されているか否かを判定することも可能である。例えば、該被験者の組織における本発明のペプチド特異的CTLの量が、正常者のそれらのレベルと比較して例えば2倍以上、好ましくは3倍以上多いことを指標として、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドによる治療が有効であると判定することができる。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドは、主にワクチンとして作用し、CTLを誘導することにより抗腫瘍作用を発揮すると考えられることから、CTLの誘導は、投与した本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドがワクチンとして作用しているか否かを確認するためのいわゆるPOM(Proof of Mechanism)マーカーとして用いることができる。したがって本発明のCTL検出剤は、POMマーカーとしてのCTLを検出することにより、投与対象において投与したペプチドまたはポリヌクレオチドがワクチンとして作用しているか否かを確認するための診断薬として用いることができる。
(10)がんの予防および/または治療方法
本発明はまた、対象におけるがんを予防および/または治療する方法であって、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、CTL、抗原提示細胞、TCR様抗体からなる群から選択される有効成分の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法にも関する。
本発明における「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、がんの予防および/または治療が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。本発明の一態様において、対象はHLA−A02陽性またはHLA−A24陽性である。本発明の一態様において、対象はOR7C1陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。本発明の一態様において、対象はHLA−A02陽性またはHLA−A24陽性であり、かつ、OR7C1陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。
本発明はまた、対象におけるがんを予防および/または治療する方法であって、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、CTL、抗原提示細胞、TCR様抗体からなる群から選択される有効成分の有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法にも関する。
本発明における「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、がんの予防および/または治療が企図される場合には、典型的にはがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。本発明の一態様において、対象はHLA−A02陽性またはHLA−A24陽性である。本発明の一態様において、対象はOR7C1陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。本発明の一態様において、対象はHLA−A02陽性またはHLA−A24陽性であり、かつ、OR7C1陽性のがんに罹患しているか、罹患するリスクを有する。
本発明の予防/治療方法に用いる本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、CTL、抗原提示細胞および、TCR様抗体としては、本明細書に記載の任意のものが挙げられる。本発明における有効量とは、例えば、がんの症状を低減し、またはその進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、がんを抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラットなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。有効成分の具体的な用量は、それを必要とする対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
具体的な用量としては、例えば、本発明のペプチドの場合、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に1回投与するのが好ましい。また、本発明のポリヌクレオチドの場合、通常、0.0001mg〜100mg、好ましくは0.001mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に1回投与するのが好ましい。また、本発明のTCR様抗体の場合、通常、0.0001mg〜2000mg、好ましくは0.001mg〜2000mgであり、これを1週間〜4週間に1回投与するのが好ましい。また、投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などの既知の任意の適切な投与方法を用いることができる。また、本発明のペプチドやヌクレオチドを直接体内に投与するin vivo法の他、ヒトからある種の細胞を採集し、体外で本発明のペプチドやポリヌクレオチドを用いてCTLや抗原提示細胞を誘導した後、これらの細胞を体内に戻すex vivo法を用いることもできる。
本発明の予防/治療方法の一態様は、投与する工程の前に、HLA−A02陽性またはHLA−A24陽性の対象を予防/治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のHLA型を決定する工程をさらに含んでもよい。対象のHLA型の決定は、既知の任意の手法により行うことができる。また、本発明の予防/治療方法の一態様は、投与する工程の前に、OR7C1陽性のがんを有する対象を予防/治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象におけるOR7C1陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。対象におけるOR7C1陽性のがんの検出は、上記(9)に記載の腫瘍の検出方法を用いることができる。
本発明の予防/治療方法の一態様は、投与する工程の前に、HLA−A02陽性またはHLA−A24陽性であり、かつ、OR7C1陽性のがんを有する対象を予防/治療の対象として選択する工程をさらに含む。本発明のこの態様は、上記選択する工程の前に、対象のHLA型を決定する工程および対象におけるOR7C1陽性のがんを検出する工程をさらに含んでもよい。HLA−A02陽性またはHLA−A24陽性であり、かつ、OR7C1陽性のがんを有する対象は、本発明のペプチドおよび/またはポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物を有効に適用できる対象である。したがって上記(9)に記載の腫瘍の検出方法に用いることができる腫瘍特異的CTL検出剤または腫瘍検出剤は、本発明の医薬組成物を用いたがんの処置方法が有効な治療対象を選択する、いわゆるコンパニオン診断用の診断薬として使用可能である。
また、本発明の予防/治療方法の一態様は、本発明の医薬組成物を投与した患者において、本発明の医薬組成物による治療が有効であるか否かを判定し、本発明の医薬組成物による治療が有効な治療対象を選択する工程をさらに含んでもよい。上記(9)に記載されるとおり、本発明の医薬組成物を投与した場合に本発明のペプチド特異的CTLが誘導される対象は、本発明のペプチドおよび/またはポリヌクレオチドを有効成分として含有する医薬組成物による治療が有効である対象、すなわち本願医薬組成物を有効に適用できる対象であり、本発明のペプチド特異的CTLの誘導は、本発明の医薬組成物の治療効果を予測または判定するためのサロゲートマーカーとして用いることができる。したがって、上記(9)に記載の腫瘍の検出方法に用いることができる腫瘍特異的CTL検出剤は、本発明の医薬組成物を投与した患者における有効な治療対象を選択するための診断薬、または、上記サロゲートマーカーとしてのCTLを検出することにより、本発明の医薬組成物を投与した患者における当該医薬組成物の治療効果を予測または判定するための診断薬として使用可能である。
本明細書中で言及する全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
本明細書中で言及する全ての特許、出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例1:HLA−A*02:01結合モチーフを有するOR7C1由来ペプチド
MHCとペプチドの結合予測プログラムであるBIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)およびIEDB(MHC-I processing predictions;http://www.iedb.org/)によって、HLA−A*02:01への結合が予測されるOR7C1由来のペプチド(配列番号3、4、5および6で表されるペプチド)を抽出した。これらペプチドをFmoc法で化学合成し、HLA結合試験およびin vivoのCTL誘導試験に供した。
MHCとペプチドの結合予測プログラムであるBIMAS(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)およびIEDB(MHC-I processing predictions;http://www.iedb.org/)によって、HLA−A*02:01への結合が予測されるOR7C1由来のペプチド(配列番号3、4、5および6で表されるペプチド)を抽出した。これらペプチドをFmoc法で化学合成し、HLA結合試験およびin vivoのCTL誘導試験に供した。
実施例2:OR7C1由来ペプチドのHLA−A02およびHLA−A24結合性評価
OR7C1由来ペプチドのHLA−A02およびHLA−A24の結合性評価はMHCクラスI発現安定化試験によって実施した。当試験ではヒトリンパ芽球様細胞株であるT2細胞およびHLA−A*24:02を人為的に強制発現させたT2−A24細胞を利用した。T2細胞は細胞質から小胞体へのペプチドの輸送に関与するtransporter associated with antigen processing(TAP)を欠損している。MHCクラスI分子(HLA−A*02:01およびHLA−A*24:02を含む)は、ペプチドが結合していない状態(empty MHC class I)では、構造が不安定であることが知られる。通常、T2細胞は細胞表面に低レベルのempty MHC class I分子しか発現できない。しかし、MHCクラスI分子に結合可能なペプチドを添加すると、empty MHC class I分子は該ペプチドと結合して細胞表面で安定化して存在できる。したがって、細胞表面MHCクラスI発現レベルはペプチドのMHCクラスI結合親和性に依存することとなる。
OR7C1由来ペプチドのHLA−A02およびHLA−A24の結合性評価はMHCクラスI発現安定化試験によって実施した。当試験ではヒトリンパ芽球様細胞株であるT2細胞およびHLA−A*24:02を人為的に強制発現させたT2−A24細胞を利用した。T2細胞は細胞質から小胞体へのペプチドの輸送に関与するtransporter associated with antigen processing(TAP)を欠損している。MHCクラスI分子(HLA−A*02:01およびHLA−A*24:02を含む)は、ペプチドが結合していない状態(empty MHC class I)では、構造が不安定であることが知られる。通常、T2細胞は細胞表面に低レベルのempty MHC class I分子しか発現できない。しかし、MHCクラスI分子に結合可能なペプチドを添加すると、empty MHC class I分子は該ペプチドと結合して細胞表面で安定化して存在できる。したがって、細胞表面MHCクラスI発現レベルはペプチドのMHCクラスI結合親和性に依存することとなる。
T2細胞およびT2−A24細胞は、37℃、5%CO2下で継代培養された。ペプチドは、OR7C1由来ペプチド(表1に記載のペプチド)、HLA−A02ポジティブコントロールとしてMelan A A27Lペプチド(アミノ酸配列:ELAGIGILTV;配列番号7)、HLA−A24ポジティブコントロールとしてHIV584−592ペプチド(アミノ酸配列:RYLRDQQLL;配列番号8)、HLA−A02ネガティブコントロールとしてMAGE−1161−169ペプチド(アミノ酸配列:EADPTGHSY;配列番号9)、HLA−A24ネガティブコントロールとしてVSV52−59ペプチド(アミノ酸配列:RGYVYQGL;配列番号10)をそれぞれ100μg/mLの濃度で評価した。これらペプチドはDMSOに溶解され、さらに、RPMI160培地で200倍に希釈された。細胞懸濁液とペプチド溶液とを混合し、5%CO2、26℃の条件で16〜18時間培養した。温度を37℃にして、さらに3時間共培養した後、遠心分離して上清を除き、細胞を単離した。単離した細胞を、3%FBSを含むPBSで洗浄し、FITCで蛍光標識した抗HLA−A02抗体(clone:BB7.2;医学生物学研究所)あるいは抗HLA−A24抗体(clone:17A10;医学生物学研究所)を加え、室温で30分静置した。その後、細胞を、3%FBSを含むPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液を加え、室温で10分間静置することで細胞を固定した。固定した細胞は、フローサイトメーター(FACScan)にて、FITC蛍光強度を計測した。平均蛍光強度(mean fluorescence intensity;MFI)の溶媒比を算出し、1.5以上をポジティブと判断した。
結果を表1に示す。この結果から、配列番号3、4、5および6で表されるペプチドがいずれも、HLA−A*02:01結合性およびHLA−A24結合性を示すことがわかった。
実施例3:HLA−A*02:01遺伝子導入マウスおよびHLA−A*24:02遺伝子導入マウスを用いた、in vivoでのCTL誘導能の評価
HLA−A*02:01およびHLA−A*24:02への結合があると判断されたOR7C1由来ペプチド(配列番号3、4、5および6)のCTL誘導能は、HLA−A*02:01遺伝子導入マウスおよびHLA−A*24:02遺伝子導入マウスを用いたin vivoのCTL誘導試験によって評価した。
HLA−A*02:01遺伝子導入マウス(C57BL/6CrHLA−A2.1DR1)は、マウスのMHCを欠損し、ヒトのMHCであるHLA−A*02:01およびHLA−DRB1*01:01を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ヒトでCTLを誘導し得るペプチドの選択が可能である。一方、HLA−A*24:02遺伝子導入マウスは、ヒトのMHCであるHLA−A*24:02とマウスMHCであるH−2KbのキメラHLAを発現するマウスであり、本マウスを用いることで、HLA−A24陽性のヒトでCTLを誘導し得るペプチドの選択が可能である(Int J Cancer. 2002;100:565-70)。ペプチド投与によりCTLが誘導されるか否かは、ペプチドを投与した上記マウス由来の脾細胞を投与ペプチドで再刺激を行った場合に産生されるIFNγを測定することで判断した。
HLA−A*02:01およびHLA−A*24:02への結合があると判断されたOR7C1由来ペプチド(配列番号3、4、5および6)のCTL誘導能は、HLA−A*02:01遺伝子導入マウスおよびHLA−A*24:02遺伝子導入マウスを用いたin vivoのCTL誘導試験によって評価した。
HLA−A*02:01遺伝子導入マウス(C57BL/6CrHLA−A2.1DR1)は、マウスのMHCを欠損し、ヒトのMHCであるHLA−A*02:01およびHLA−DRB1*01:01を発現するマウスであり、本マウスを用いることで、ヒトでCTLを誘導し得るペプチドの選択が可能である。一方、HLA−A*24:02遺伝子導入マウスは、ヒトのMHCであるHLA−A*24:02とマウスMHCであるH−2KbのキメラHLAを発現するマウスであり、本マウスを用いることで、HLA−A24陽性のヒトでCTLを誘導し得るペプチドの選択が可能である(Int J Cancer. 2002;100:565-70)。ペプチド投与によりCTLが誘導されるか否かは、ペプチドを投与した上記マウス由来の脾細胞を投与ペプチドで再刺激を行った場合に産生されるIFNγを測定することで判断した。
具体的には、ペプチドをPBS(−)で10mg/mLに溶解し、等量の不完全フロイントアジュバント(IFA)と混合し、エマルション化させた。エマルション化させたペプチドは、マウスの尾根部皮内に50μg/箇所の用量で2箇所投与した。1週間後に、マウスをCO2ガスにより安楽死させたのち脾臓を摘出し、脾細胞を調製した。IFNγ産生の測定には、IFNγ ELISPOTアッセイキット(ベクトン・ディッキンソン社製)を用いた。脾細胞調製の前日に、ELISPOTプレートを抗IFNγ抗体で処理し、当日に10%FBSを含むRPMI1640培地でブロッキングした。調製した脾細胞を0.5×106個/ウェルで、ブロッキングしたELISPOTプレートに播種した。OR7C1由来ペプチドを、DMSOで40mg/mLに溶解し、さらに10%RPMI1640培地で20μg/mLに希釈した。希釈したペプチドを、50μL/ウェルでそのペプチドを投与した動物に由来する脾細胞に添加した。ペプチドを添加した脾細胞を、16〜18時間、37℃、5%CO2下で培養することでin vitroにおけるペプチド再刺激を加えた。培養後に上清を除き、ELISPOTプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、KS−ELISPOTによって測定した。
IFNγ ELISPOTアッセイの結果は図1、2、3および4に示す。
本試験の結果、HLA−A*02:01遺伝子導入マウス由来およびHLA−A*24:02遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、各ペプチド特異的なIFNγ産生が確認されたことより、配列番号3、4、5および6で表されるOR7C1由来の各ペプチドがCTL誘導能を持つことがわかった。
本試験の結果、HLA−A*02:01遺伝子導入マウス由来およびHLA−A*24:02遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、各ペプチド特異的なIFNγ産生が確認されたことより、配列番号3、4、5および6で表されるOR7C1由来の各ペプチドがCTL誘導能を持つことがわかった。
実施例4:ヒト末梢血単核細胞を用いたCTL誘導能の評価
配列番号3、5および6で表される3種類のペプチドを添加した場合に、健常人由来末梢血単核細胞よりCTLが誘導されるか評価した。
具体的には、HLA−A*02:01陽性あるいはHLA−A*24:02陽性の健常人由来の末梢血単核細胞(Cellular Technology Limited社製)を10%ヒト由来血清を含有するAIM−V培地でサスペンドしたのち、96穴U底プレートの各ウェルに1×105個を播種し、37℃、5%CO2下で培養した。このとき、ヒトIL−2を100U/mLおよび上記ペプチドを20μg/mLで添加した。3日あるいは4日毎に培地を交換し、約2週間後にIFNγ ELISPOTアッセイを実施した。アッセイの前日に、ELISPOTプレートを抗IFNγ抗体で処理し、当日に10%ヒト由来血清を含むAIM−V培地で約2時間室温にてブロッキングした。培養中のヒト末梢血単核細胞をAIM−V培地で洗浄し、ブロッキングしたELISPOTプレートの各ウェルに3分の1量を播種した。このとき、配列番号3、5および6で表されるペプチドで培養したヒト末梢血単核細胞は、任意の2ウェルを混合して1ウェルとした後、各ウェルを再度2ウェルに分けて播種し、一方のウェルにペプチド溶液を添加し、もう一方のウェルはペプチドのみを含まない対照溶液を添加し、非再刺激コントロールとし、それぞれ60ウェルずつとした。ここで、配列番号3、5および6で表される3種類のペプチドは、DMSOで40mg/mLに溶解し、さらに10%ヒト由来血清を含むAIM−V培地で希釈した。最終濃度20μg/mLとなるよう添加し、ヒト末梢血単核細胞を再刺激した。37℃、5%CO2下で培養して16〜18時間後に上清を除き、ELISPOTプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、Cellular Technology Limited社製ELISPOTアナライザーで測定した。配列番号3、5および6のIFNγ ELISPOTアッセイの結果を図5、6および7にそれぞれに示す。縦軸は各ウェルで認められたスポット数を、横軸は陽性のウェルを示す。また、黒棒はペプチド刺激条件下で検出されたスポットの数を、白棒はペプチド非パルス条件下で検出されたスポット(コントロール)の数を示す。ペプチド刺激時のスポット数が50個以上あるとともに黒棒と白棒の差が2倍以上ある場合に限って陽性ウェルと判断した。
配列番号3、5および6で表される3種類のペプチドを添加した場合に、健常人由来末梢血単核細胞よりCTLが誘導されるか評価した。
具体的には、HLA−A*02:01陽性あるいはHLA−A*24:02陽性の健常人由来の末梢血単核細胞(Cellular Technology Limited社製)を10%ヒト由来血清を含有するAIM−V培地でサスペンドしたのち、96穴U底プレートの各ウェルに1×105個を播種し、37℃、5%CO2下で培養した。このとき、ヒトIL−2を100U/mLおよび上記ペプチドを20μg/mLで添加した。3日あるいは4日毎に培地を交換し、約2週間後にIFNγ ELISPOTアッセイを実施した。アッセイの前日に、ELISPOTプレートを抗IFNγ抗体で処理し、当日に10%ヒト由来血清を含むAIM−V培地で約2時間室温にてブロッキングした。培養中のヒト末梢血単核細胞をAIM−V培地で洗浄し、ブロッキングしたELISPOTプレートの各ウェルに3分の1量を播種した。このとき、配列番号3、5および6で表されるペプチドで培養したヒト末梢血単核細胞は、任意の2ウェルを混合して1ウェルとした後、各ウェルを再度2ウェルに分けて播種し、一方のウェルにペプチド溶液を添加し、もう一方のウェルはペプチドのみを含まない対照溶液を添加し、非再刺激コントロールとし、それぞれ60ウェルずつとした。ここで、配列番号3、5および6で表される3種類のペプチドは、DMSOで40mg/mLに溶解し、さらに10%ヒト由来血清を含むAIM−V培地で希釈した。最終濃度20μg/mLとなるよう添加し、ヒト末梢血単核細胞を再刺激した。37℃、5%CO2下で培養して16〜18時間後に上清を除き、ELISPOTプレートを、添付のプロトコールに従って発色させた。発色したスポット数は、Cellular Technology Limited社製ELISPOTアナライザーで測定した。配列番号3、5および6のIFNγ ELISPOTアッセイの結果を図5、6および7にそれぞれに示す。縦軸は各ウェルで認められたスポット数を、横軸は陽性のウェルを示す。また、黒棒はペプチド刺激条件下で検出されたスポットの数を、白棒はペプチド非パルス条件下で検出されたスポット(コントロール)の数を示す。ペプチド刺激時のスポット数が50個以上あるとともに黒棒と白棒の差が2倍以上ある場合に限って陽性ウェルと判断した。
本試験の結果、配列番号3、5および6で表される3種類のペプチドは、HLA−A*02:01陽性およびHLA−A*24:02陽性の健常人由来の末梢血単核細胞より、それらペプチド特異的CTLを誘導することが判明した。これより、これら3種類のペプチドは、マウスのみならずヒトにおいてCTL誘導能を持つことがわかった。
実施例5:OR7C1由来ペプチドのC末端アミノ酸置換体ペプチドの評価
(1)ペプチドの合成
配列番号3で表されるペプチドのC末端アミノ酸がバリンからイソロイシンに置換されたペプチド(配列番号11)を、実施例1と同様にFmoc法で化学合成し、HLA結合試験およびin vivoのCTL誘導試験に供した。
(1)ペプチドの合成
配列番号3で表されるペプチドのC末端アミノ酸がバリンからイソロイシンに置換されたペプチド(配列番号11)を、実施例1と同様にFmoc法で化学合成し、HLA結合試験およびin vivoのCTL誘導試験に供した。
(2)HLA−A02およびHLA−A24結合性評価
実施例2と同様の方法で、上記(1)にて合成した配列番号11で表されるペプチドについて、HLA−A02およびHLA−A24の結合性評価を行った。結果を表2に示す。この結果から、配列番号11で表されるペプチドも、HLA−A*02:01結合性およびHLA−A24結合性を示すことがわかった。
実施例2と同様の方法で、上記(1)にて合成した配列番号11で表されるペプチドについて、HLA−A02およびHLA−A24の結合性評価を行った。結果を表2に示す。この結果から、配列番号11で表されるペプチドも、HLA−A*02:01結合性およびHLA−A24結合性を示すことがわかった。
(3)in vivoでのCTL誘導能の評価
CTL誘導能は、実施例3に倣って、HLA−A*02:01遺伝子導入マウスおよびHLA−A*24:02遺伝子導入マウスを用いたin vivoのCTL誘導試験によって評価した。具体的には、配列番号11で表されるペプチドを注射用水で40mg/mLに溶解し、等量のIFAと混合し、エマルション化させ、エマルション化させたペプチドをマウスの尾根部皮内に150μg/箇所の用量で2箇所投与したこと以外は、実施例3と同様に行った。結果を図8に示す。
HLA−A*02:01遺伝子導入マウス由来およびHLA−A*24:02遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、該ペプチドに特異的なIFNγ産生が確認されたことより、配列番号11で表されるペプチドがCTL誘導能を持つことがわかった。
CTL誘導能は、実施例3に倣って、HLA−A*02:01遺伝子導入マウスおよびHLA−A*24:02遺伝子導入マウスを用いたin vivoのCTL誘導試験によって評価した。具体的には、配列番号11で表されるペプチドを注射用水で40mg/mLに溶解し、等量のIFAと混合し、エマルション化させ、エマルション化させたペプチドをマウスの尾根部皮内に150μg/箇所の用量で2箇所投与したこと以外は、実施例3と同様に行った。結果を図8に示す。
HLA−A*02:01遺伝子導入マウス由来およびHLA−A*24:02遺伝子導入マウス由来の脾細胞において、該ペプチドに特異的なIFNγ産生が確認されたことより、配列番号11で表されるペプチドがCTL誘導能を持つことがわかった。
(4)ヒト末梢血単核細胞を用いたCTL誘導能の評価
配列番号11で表されるペプチドを添加した場合に、健常人由来末梢血単核細胞よりCTLが誘導されるかについて、実施例4に倣って評価した。具体的には、配列番号11で表されるペプチドで培養したヒト末梢血単核細胞をIFNγ ELISPOTアッセイに供する際に、任意の2ウェルを混合して1ウェルとすることなく、各ウェルを2ウェルに分けて播種して評価した以外は実施例4と同様に行った。結果を図9に示す。配列番号11で表されるペプチドは、HLA−A*02:01陽性およびHLA−A*24:02陽性の健常人由来の末梢血単核細胞より、該ペプチドに特異的なCTLを誘導することが判明し、マウスのみならずヒトにおいてCTL誘導能を持つことがわかった。
配列番号11で表されるペプチドを添加した場合に、健常人由来末梢血単核細胞よりCTLが誘導されるかについて、実施例4に倣って評価した。具体的には、配列番号11で表されるペプチドで培養したヒト末梢血単核細胞をIFNγ ELISPOTアッセイに供する際に、任意の2ウェルを混合して1ウェルとすることなく、各ウェルを2ウェルに分けて播種して評価した以外は実施例4と同様に行った。結果を図9に示す。配列番号11で表されるペプチドは、HLA−A*02:01陽性およびHLA−A*24:02陽性の健常人由来の末梢血単核細胞より、該ペプチドに特異的なCTLを誘導することが判明し、マウスのみならずヒトにおいてCTL誘導能を持つことがわかった。
本発明により、CTLの誘導活性を有するOR7C1由来の腫瘍抗原ペプチド等が提供される。本発明のペプチドは、がんの予防および/または治療剤として有用である。
配列番号3:合成ペプチド
配列番号4:合成ペプチド
配列番号5:合成ペプチド
配列番号6:合成ペプチド
配列番号7:合成ペプチド
配列番号8:合成ペプチド
配列番号9:合成ペプチド
配列番号10:合成ペプチド
配列番号11:合成ペプチド
配列番号4:合成ペプチド
配列番号5:合成ペプチド
配列番号6:合成ペプチド
配列番号7:合成ペプチド
配列番号8:合成ペプチド
配列番号9:合成ペプチド
配列番号10:合成ペプチド
配列番号11:合成ペプチド
Claims (21)
- 配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
- 配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列において、
(1)C末端のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換したアミノ酸配列、および/または、
(2)N末端および/またはC末端に1個から数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列
からなるペプチド。 - 配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列のC末端のアミノ酸をロイシン、バリンまたはイソロイシンに置換したアミノ酸配列からなる、請求項2に記載のペプチド。
- 配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6および配列番号11のいずれかで表されるアミノ酸配列のN末端またはC末端に1アミノ酸付加されたアミノ酸配列からなる、請求項2に記載のペプチド。
- 複数のエピトープペプチドを連結したポリエピトープペプチドであって、該エピトープペプチドとして、請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドを少なくとも1つ含む、前記ポリエピトープペプチド。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項5に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
- アジュバントを含んでなる、請求項6に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項5に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および/または治療用ワクチン。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項5に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含有するがんの予防および/または治療剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項5に記載のポリエピトープペプチドを有効成分として含有する、細胞傷害性T細胞(CTL)の誘導剤。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項5に記載のポリエピトープペプチドの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項11に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
- 請求項12に記載の発現ベクターを含んでなる、遺伝子導入用組成物。
- 以下の(a)または(b):
(a)請求項11に記載のポリヌクレオチド、
(b)請求項12に記載の発現ベクター
のいずれかを有効成分として含有する、がんの治療または予防のための医薬組成物。 - 以下の(a)または(b):
(a)請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項5に記載のポリエピトープペプチド、
(b)上記(a)記載のペプチドの少なくとも1つをコードするポリヌクレオチド、
と、抗原提示能を有する細胞とを、in vitroで接触させることを含む、抗原提示細胞の製造方法。 - 以下の(a)または(b):
(a)請求項1〜4のいずれかに記載のペプチドまたは請求項5に記載のポリエピトープペプチド、
(b)上記(a)記載のペプチドの少なくとも一つをコードするポリヌクレオチド、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをin vitroで接触させることを含む、CTLの誘導方法。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドとHLAとを含有するHLAマルチマー。
- 請求項17に記載のHLAマルチマーを含有する診断薬。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチドとHLAとの複合体を認識するTCR様抗体。
- 請求項19に記載のTCR様抗体を含有する腫瘍検出剤。
- 請求項6、7または14に記載の医薬組成物を有効に適用できる患者を選択するための診断薬であって、請求項17に記載のHLAマルチマーまたは請求項19に記載のTCR様抗体を含む、前記診断薬。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013146849 | 2013-07-12 | ||
JP2013146849 | 2013-07-12 | ||
PCT/JP2014/068595 WO2015005479A1 (ja) | 2013-07-12 | 2014-07-11 | 腫瘍抗原ペプチド |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2015005479A1 true JPWO2015005479A1 (ja) | 2017-03-02 |
Family
ID=52280156
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015526447A Pending JPWO2015005479A1 (ja) | 2013-07-12 | 2014-07-11 | 腫瘍抗原ペプチド |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160166666A1 (ja) |
EP (1) | EP3020806A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2015005479A1 (ja) |
KR (1) | KR20160029127A (ja) |
CN (1) | CN105531368A (ja) |
AU (1) | AU2014288127A1 (ja) |
CA (1) | CA2917785A1 (ja) |
HK (1) | HK1223971A1 (ja) |
WO (1) | WO2015005479A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20190117751A1 (en) * | 2015-12-28 | 2019-04-25 | Sapporo Medical University | Tumor antigen peptide |
CN109485721A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-19 | 杜学明 | 一种获得肿瘤特异性t细胞受体的方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2002047474A1 (ja) | 2000-12-13 | 2004-04-15 | 住友製薬株式会社 | Hla−a24発現トランスジェニック動物及びその利用 |
CN1376713A (zh) * | 2001-03-22 | 2002-10-30 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种多肽——嗅觉受体蛋白-9.25和编码这种多肽的多核苷酸 |
US20100015101A1 (en) * | 2006-03-28 | 2010-01-21 | Noriyuki Sato | Novel tumor antigen peptides |
TWI615403B (zh) * | 2007-02-21 | 2018-02-21 | 腫瘤療法 科學股份有限公司 | 表現腫瘤相關抗原之癌症的胜肽疫苗 |
WO2010050190A1 (ja) | 2008-10-27 | 2010-05-06 | 北海道公立大学法人札幌医科大学 | がん幹細胞分子マーカー |
-
2014
- 2014-07-11 WO PCT/JP2014/068595 patent/WO2015005479A1/ja active Application Filing
- 2014-07-11 AU AU2014288127A patent/AU2014288127A1/en not_active Abandoned
- 2014-07-11 KR KR1020167003563A patent/KR20160029127A/ko not_active Application Discontinuation
- 2014-07-11 CN CN201480039862.3A patent/CN105531368A/zh active Pending
- 2014-07-11 US US14/904,525 patent/US20160166666A1/en not_active Abandoned
- 2014-07-11 CA CA2917785A patent/CA2917785A1/en not_active Abandoned
- 2014-07-11 EP EP14823622.7A patent/EP3020806A4/en not_active Withdrawn
- 2014-07-11 JP JP2015526447A patent/JPWO2015005479A1/ja active Pending
-
2016
- 2016-10-20 HK HK16112144.2A patent/HK1223971A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2917785A1 (en) | 2015-01-15 |
HK1223971A1 (zh) | 2017-08-11 |
KR20160029127A (ko) | 2016-03-14 |
US20160166666A1 (en) | 2016-06-16 |
AU2014288127A1 (en) | 2016-02-18 |
WO2015005479A1 (ja) | 2015-01-15 |
CN105531368A (zh) | 2016-04-27 |
EP3020806A1 (en) | 2016-05-18 |
EP3020806A4 (en) | 2017-05-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2721574C2 (ru) | Вакцинная композиция против злокачественной опухоли | |
ES2341785T3 (es) | Peptidos antigenicos del cancer derivados de wt1. | |
JP5230891B2 (ja) | 抗原特異的t細胞の新規な誘導方法 | |
JP2003530083A (ja) | ペプチドおよび核酸組成物を使用する、HER2/neuに対する細胞性免疫応答の誘導 | |
JP2007277251A (ja) | Kdrペプチド及びこれを含むワクチン | |
JP2003521245A (ja) | ペプチドおよび核酸組成物を使用する、前立腺癌抗原に対する細胞性免疫応答の誘導 | |
JPWO2016047715A1 (ja) | 腫瘍抗原ペプチド | |
JP6959597B2 (ja) | 腫瘍抗原ペプチド | |
JP6960179B2 (ja) | 腫瘍抗原ペプチド | |
JP4516916B2 (ja) | リビン由来のhla−a24結合性癌抗原ペプチド | |
JP7266834B2 (ja) | 腫瘍抗原ペプチド | |
JP5606322B2 (ja) | 腫瘍抗原ペプチド及びその利用 | |
WO2015005479A1 (ja) | 腫瘍抗原ペプチド | |
JP2003517310A (ja) | ペプチドおよび核酸組成物を使用する、mage2/3に対する細胞性免疫応答の誘導 | |
WO2022210863A1 (ja) | ヒト膀胱がん幹細胞に発現する抗原ペプチド | |
JP4705697B2 (ja) | Mn/ca9由来のhla−a24拘束性腫瘍抗原ペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20170310 |