JP5230891B2 - 抗原特異的ｔ細胞の新規な誘導方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の新規な誘導方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、非特異的免疫賦活物質を含む組成物をあらかじめ投与した後に、抗原タンパク質または抗原ペプチドを含む組成物を投与することを特徴とする、抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法に関する。本発明はまた、癌抗原タンパク質ＷＴ１または当該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドと、菌体由来成分やＩＦＮ−αとを併用することを特徴とする、癌の治療剤および／または予防剤に関する。

発明の背景

生体による癌細胞やウイルス感染細胞の排除には細胞性免疫、とりわけ抗原特異的Ｔ細胞である細胞傷害性Ｔ細胞（キラーＴ細胞またはＣＴＬと呼ぶ場合もある）やヘルパーＴ細胞が中心的な働きをしている。抗原特異的Ｔ細胞は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞の細胞表面のＭＨＣ分子（ヒトの場合はＨＬＡ分子とも呼ばれる）と、癌やウイルスに由来する抗原タンパク質の断片ペプチドである抗原ペプチドとの結合複合体をＴ細胞受容体で認識して分化・増殖する。前記ＭＨＣ分子に提示される抗原ペプチドは、通常８から２０アミノ酸程度の長さであることが知られている。分化・増殖した抗原特異的Ｔ細胞は、前記の抗原ペプチド−ＭＨＣ分子結合複合体を提示している癌細胞やウイルス感染細胞を特異的に傷害したり、各種サイトカインを産生することにより、抗腫瘍効果や抗ウイルス効果を発揮する。
癌やウイルスの抗原タンパク質や抗原ペプチドを投与することにより抗原特異的Ｔ細胞を増強させる、いわゆるワクチン療法は、癌やウイルス感染症の治療や予防に有用と考えられている。これまでに種々の癌やウイルス感染症について、Ｔ細胞に認識される癌抗原やウイルス抗原の探索が行われ、現在までに数多くの癌抗原タンパク質、ウイルス由来抗原タンパク質、並びにこれらに由来する抗原ペプチドが同定されている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９５，４１：１７８、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００１，５０：３）。例えばその１つであるＷＴ１は、最初は小児の腎腫瘍であるＷｉｌｍｓ腫瘍の原因遺伝子として同定された遺伝子である（Ｎａｔｕｒｅ １９９０，３４３：７７４）。当該ＷＴ１遺伝子は、正常組織では腎臓、精巣、卵巣などの限定された組織でのみ低発現している一方、癌では白血病、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、胃癌、大腸癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌などの多様な癌において高発現が認められる（特開平９−１０４６２７号公報、特開平１１−３５４８４号公報）。近年、ＨＬＡ−Ａ２．１あるいはＨＬＡ−Ａ２４．２を持つヒトの末梢血単核球をＭＨＣクラスＩ結合モチーフを含む９ｍｅｒのＷＴ１ペプチドでｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激することにより、ＷＴ１特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が誘導されることが明らかとなった（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５１：９９−１０７，２０００，Ｂｌｏｏｄ ９５：２１９８−２０３，２０００，Ｂｌｏｏｄ ９５：２８６−９３，２０００）。またｉｎ ｖｉｖｏでマウスを９ｍｅｒのＷＴ１ペプチド（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１８７３−８０，２０００，Ｂｌｏｏｄ ９６：１４８０−９，２０００）やＷＴ１ ｃＤＮＡ（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：１９５−２０２，２０００）で免疫することにより、ＷＴ１特異的ＣＴＬが誘導され、さらに、その免疫マウスは移植されたＷＴ１高発現腫瘍細胞を拒絶することも明らかにされた（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１８７３−８０，２０００，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：１９５−２０２，２０００）。これらの知見により、ＷＴ１タンパクは癌抗原タンパク質の１つであり、液性癌や固形癌に対する癌ワクチンの指標となることが明らかとなった。
ワクチンにより効率良く特異免疫を誘導するためには、主体となる抗原タンパク質や抗原ペプチドと組み合わせて非特異的な免疫賦活物質を投与することが有効である。非特異的免疫賦活物質としては、菌体由来成分、サイトカインまたは植物由来成分などが知られている。また効率良く特異免疫を誘導するためには、ワクチンの剤形も重要なファクターである。ワクチンの剤形としては、アルミニウム製剤、脂質粒子、エマルジョン製剤、マイクロスフェアーなどが知られている。これらのワクチン効果を増強する作用をもつ物質や剤形は、総じてアジュバントと呼ばれている。（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９．１７：１０７５）。現在、ヒトへの適応が認められたアジュバントとして最も広く用いられているのはアルミニウム製剤であるが、抗原特異的Ｔ細胞の誘導能は弱く、またＩｇＥ産生などの副作用の問題が指摘されている。
最近は、抗原提示細胞である樹状細胞の抗原特異的Ｔ細胞誘導能の高さに着目し、患者から得られた樹状細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原タンパク質や抗原ペプチドをパルスして抗原提示させた後に患者に戻すという細胞ワクチンの研究も行われている（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１９９８，４：３２８）。しかしながら、治療に必要な大量の樹状細胞を得るのは技術的に難しいことや、コストが高くなるなど、細胞ワクチン療法を一般に普及させるには解決しなければならない問題点が多い。
以上のような状況から、簡便で効率良く抗原特異的Ｔ細胞を誘導することのできる新たなワクチンおよびその投与法の開発が求められている状況にあった。

本発明の目的は、効率良く抗原特異的Ｔ細胞を誘導することができる新規な誘導方法を提供することにある。すなわち、非特異的免疫賦活物質を含む組成物をあらかじめ投与した後に、抗原タンパク質または抗原ペプチドを含む組成物を投与することを特徴とする、抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、癌抗原タンパク質ＷＴ１または当該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドと、菌体由来成分やＩＦＮ−αとを併用することを特徴とする、癌の治療剤および／または予防剤を提供することにある。
ワクチンによる免疫応答においては、抗原を適切な態様にてタイミングよく投与することが重要である。しかしながら前述のように、抗原特異的Ｔ細胞を効率良く誘導して抗腫瘍効果や抗ウイルス効果をもたらすワクチン投与法は、未だ見出されていない状況にあった。
そこで本発明者らは、癌抗原タンパク質ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドを例として用い、ｉｎ ｖｉｖｏ癌モデルにおける治療効果等につき鋭意検討を行った。その結果、免疫賦活物質をあらかじめ投与し、一定時間の後に抗原ペプチドを投与するという投与方法をとることにより、ｉｎ ｖｉｖｏで効率良く抗原特異的Ｔ細胞が誘導されること、例えば抗腫瘍効果の得られることを初めて見出した。さらに前記免疫賦活物質として、由来・性状の異なる５種類の物質のいずれを用いた場合においても、これら免疫賦活物質を抗原投与の前にあらかじめ投与することにより、普遍的に顕著な抗腫瘍効果が示されることも見出した。
また癌抗原タンパク質ＷＴ１に関して、本発明において初めて、動物への腫瘍細胞移植の後にＷＴ１由来の癌抗原ペプチドを投与するという、言わば「治療の系」を反映する癌モデルを用いてその効果を検討した。その結果、当該ＷＴ１が治療上有効であることを初めて確認するに到った。さらに、当該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドは、アジュバントとして菌体由来成分若しくはＩＦＮ−αと併用することにより、顕著な抗腫瘍効果をもたらすことも見出した。
本発明は、以上のような知見に基づいて完成するに至ったものである。
即ち本発明は、
（１−１） （ａ）活性成分として抗原タンパク質または抗原ペプチドを含む組成物、および
（ｂ）活性成分として非特異的免疫賦活物質を含む組成物、
をそれを必要としている患者に投与する、該患者における抗原特異的Ｔ細胞を誘導するための方法であって、該組成物（ｂ）をあらかじめ投与した後、例えば投与後約２４時間後に該組成物（ａ）を投与すること、例えば組成物（ａ）および（ｂ）をいずれも皮内の同一部位に投与することを特徴とする方法（組成物（ａ）および（ｂ）による投与サイクルは複数回繰り返すことができる）； 好ましくは組成物（ａ）の活性成分として癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドを含む方法； より好ましくは癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドが、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドである方法； さらに好ましくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドが、Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ（配列番号：２）、Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：３）、およびＣｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：４）より選択される方法；
組成物（ｂ）の活性成分である非特異的免疫賦活物質が、（ｉ）菌体由来成分またはその誘導体、（ｉｉ）サイトカイン、（ｉｉｉ）植物由来成分またはその誘導体、および（ｉｖ）海洋生物由来成分またはその誘導体より選択される； 好ましくは菌体由来成分が、ヒト型結核菌由来多糖類成分（例えばアンサー）、溶連菌粉末（例えばピシバニール）、担子菌由来多糖類（例えばレンチナン、クレスチン）、死菌浮遊物カクテル（例えばブロンカスマ・ベルナ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）関連化合物、リポ多糖（ＬＰＳ）、リピドＡ関連化合物（例えばＭＰＬ）、糖脂質トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、および前記菌体由来のＤＮＡ（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）より選択される方法； 好ましくはサイトカインが、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５より選択される方法；好ましくは、海洋生物由来成分がα−ガラクトシルセラミドである方法；
具体的には、前記いずれかの誘導方法を含む、患者における癌の治療方法および／または予防方法；
他の態様として、
（１−２） 抗原タンパク質または抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するための医薬組成物であって、活性成分として非特異的免疫賦活物質を含有する、該抗原タンパク質または抗原ペプチドの投与前に投与される該組成物； または非特異的免疫賦活物質における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための医薬組成物であって、活性成分として抗原タンパク質または抗原ペプチドを含有する、該非特異的免疫賦活物質の投与後に投与される該組成物；
好ましくは、抗原タンパク質または抗原ペプチドが癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドである医薬組成物； より好ましくは癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドが、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドである医薬組成物； さらに好ましくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドが、Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ（配列番号：２）、Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：３）、およびＣｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：４）より選択される医薬組成物；
好ましくは、非特異的免疫賦活物質が、（ｉ）菌体由来成分またはその誘導体、（ｉｉ）サイトカイン、（ｉｉｉ）植物由来成分またはその誘導体、および（ｉｖ）海洋生物由来成分またはその誘導体より選択される医薬組成物； 具体的には、菌体由来成分が、ヒト型結核菌由来多糖類成分（例えばアンサー）、溶連菌粉末（例えばピシバニール）、担子菌由来多糖類（例えばレンチナン、クレスチン）、死菌浮遊物カクテル（例えばブロンカスマ・ベルナ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）関連化合物、リポ多糖（ＬＰＳ）、リピドＡ関連化合物（例えばＭＰＬ）、糖脂質トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、および前記菌体由来のＤＮＡ（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）より選択される医薬組成物； 具体的にはサイトカインが、ＩＦＮ一α、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８およびＩＬ−１５より選択される医薬組成物；具体的には、海洋生物由来成分がα−ガラクトシルセラミドである医薬組成物；
具体的には、癌を治療および／または予防するための上記医薬組成物；および
他の態様として、
（１−３） 抗原タンパク質または抗原ペプチドの投与前に投与される、該抗原タンパク質または抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強する医薬を調製するための、非特異的免疫賦活物質の使用；または非特異的免疫賦活物質の投与後に投与される、該非特異的免疫賦活物質における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強する医薬を調製するための、抗原タンパク質または抗原ペプチドの使用、および上記（１−２）にて説明している好ましい態様および具体的な態様に相当する態様；ならびに
さらに別の態様として、
（２−１）配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するための医薬組成物であって、活性成分として菌体由来成分またはその誘導体を含有する該組成物； または菌体由来成分またはその誘導体における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための医薬組成物であって、活性成分として配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドを含有する該組成物； 好ましくは菌体由来成分がヒト型結核菌由来多糖類成分（例えばアンサー）、溶連菌粉末（例えばピシバニール）、担子菌由来多糖類（例えばクレスチン）または死菌浮遊物カクテル（例えばブロンカスマ・ベルナ）である医薬組成物； および
配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するための医薬組成物であって、活性成分としてＩＦＮ−αを含有する該組成物； またはＩＦＮ−αにおける免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための医薬組成物であって、活性成分として配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴｌ由来の癌抗原ペプチドを含有する該組成物；
好ましくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドが、Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ（配列番号：２）、Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：３）、およびＣｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：４）より選択される医薬組成物； 具体的には癌を治療および／または予防するための前記医薬組成物；
他の態様して
（２−２）患者において配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するため方法であって、抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するに有効な量の菌体由来成分またはその誘導体を該患者に投与することを特徴とする方法；
患者において菌体由来成分またはその誘導体における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための方法であって、免疫賦活作用に基づく抗癌活性を増強するに有効な量の配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドを該患者に投与することを特徴とする方法；
患者において配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するための方法であって、抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するに有効な量のＩＦＮ−αを該患者に投与することを特徴とする方法；
患者においてＩＦＮ−αにおける免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための方法であって、免疫賦活作用に基づく抗癌活性を増強するに有効な量の配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドを該患者に投与することを特徴とする方法；および
癌患者に投与し、癌を治療および／または予防するための前記方法；および上記（２−１）にて説明している好ましい態様および具体的な態様に相当する態様；および
他の態様として
（２−３）配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強する医薬を調製するための、菌体由来成分またはその誘導体の使用；
菌体由来成分またはその誘導体における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強する医薬を調製するための、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドの使用；
配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強する医薬を調製するための、ＩＦＮ−αの使用；および
ＩＦＮ−αにおける免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強する医薬を調製するための、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドの使用；および上記（２−１）にて説明している好ましい態様および具体的な態様に相当する態様；
に関する。

上記のように、本発明は第１の態様として、（ａ）活性成分として抗原タンパク質または抗原ペプチドの治療学的有効量を含む組成物、および（ｂ）活性成分として非特異的免疫賦活物質の治療学的有効量を含む組成物を、それを必要としている患者に投与する、該患者における抗原特異的Ｔ細胞を誘導するための方法であって、該組成物（ｂ）をあらかじめ投与した後に該組成物（ａ）を投与することを特徴とする該方法を提供する。この方法は、アジュバントである非特異的免疫賦活物質をあらかじめ投与し、一定時間の後に抗原（抗原タンパク質または該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチド）を投与するという投与方法をとるところに特徴を有している。本発明の投与方法によれば、抗原単独または非特異的免疫賦活物質単独の場合と比して良好な抗原特異的Ｔ細胞の誘導効果、そして結果として抗腫瘍効果や抗ウイルス効果をもたらすことが可能である。
前記組成物（ａ）の活性成分として含まれる「抗原タンパク質または抗原ペプチド」とは、抗原タンパク質および当該抗原タンパク質に由来する抗原ペプチドを意味するものであり、抗原ペプチド特異的なＴ細胞を誘導できるものであれば特に限定されない。また前記「抗原タンパク質または抗原ペプチド」の範疇には、抗原提示細胞の細胞表面のＭＨＣ分子（ＨＬＡ分子）との複合体を直接形成することにより抗原特異的Ｔ細胞を誘導可能なものと、間接的に、すなわち細胞内に取り込まれ、その後細胞内分解されて生じたペプチド断片がＭＨＣ分子と結合して複合体を形成し、該結合複合体が細胞表面に提示されることにより抗原特異的Ｔ細胞を誘導可能なものとの両方が含まれる。
抗原タンパク質には、ウイルス由来の抗原タンパク質、細菌由来の抗原タンパク質または癌抗原タンパク質（腫瘍抗原タンパク質とも呼ばれる）等が含まれる。以下、既に抗原タンパク質として公知である幾つかの抗原タンパク質につき列挙する。ウイルス由来の抗原タンパク質としては、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ＨＰＶ、ＨＴＬＶ、ＥＢＶ等のウイルス由来の抗原タンパク質が挙げられる。細菌由来の抗原タンパク質としては、結核菌等の細菌由来の抗原タンパク質が挙げられる。癌抗原タンパク質としては、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｖｏｌ．１０：２８１，１９９９のＴａｂｌｅ１、あるいはＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．５０，３−１５，２００１のＴａｂｌｅ１〜Ｔａｂｌｅ６に記載のものが代表例として挙げられる。具体的には、例えば、メラノーマ抗原タンパク質として、ＭＡＧＥ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３，１９９１）、ｇｐ１００（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５，１９９４）、ＭＡＲＴ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５，１９９４）、チロシナーゼ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９，１９９３）；メラノーマ以外の癌抗原タンパク質として、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９，１９９５）、ＣＥＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８７：９８２，１９９５）、ＰＳＡ（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７）等の腫瘍マーカー、または扁平上皮癌由来のＳＡＲＴ−１（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１８７，ｐ２７７−２８８，１９９８、国際公開第９７／４６６７６号パンフレット）、サイクロフィリンＢ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１９０３，１９９１）、ＳＡＲＴ−３（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５９，４０５６（１９９９）、あるいはＷＴ１（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．５１，９９，２０００，Ｂｌｏｏｄ ９５：２１９８−２０３，２０００，Ｂｌｏｏｄ ９５：２８６−９３，２０００、また本願配列表の配列番号：１に記載されたヒト型ＷＴ１）等が挙げられる。以上の抗原タンパク質は、全長のみならず、その部分ポリペプチドや改変体であっても、抗原ペプチド特異的なＴ細胞を誘導可能なものであればよい。
このような抗原タンパク質は、前記に記載の各文献やＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従って、所望の抗原タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング工程、当該ｃＤＮＡの発現ベクターへの連結工程、当該組換え発現ベクターの宿主細胞への導入工程、および抗原タンパク質の発現工程を経ることにより得ることができる。具体的には、例えば所望の抗原タンパク質をコードするｃＤＮＡをハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりクローニングする。次にクローニングされたｃＤＮＡを適当な発現ベクター（例えばｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１など）に組み込みこんで作製された組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得、この形質転換体を適当な培地で培養することにより、所望の抗原タンパク質を発現・生産することができる。ここで宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
前記抗原タンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を有することは、例えば癌抗原タンパク質の場合、以下のような試験により調べることができる。すなわちまず、アフリカミドリザル腎臓由来のＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）や繊維芽細胞ＶＡ−１３（理化学研究所細胞開発銀行）といった癌抗原タンパク質を発現していない細胞に対し、所望の癌抗原タンパク質をコードするｃＤＮＡを有する組換え発現ベクターと、ＨＬＡ抗原をコードするＤＮＡを有する組換え発現ベクターとをダブルトランスフェクトする。該トランスフェクトは、例えばリポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いたリポフェクチン法などにより行うことができる。その後、用いたＨＬＡ抗原に拘束性の腫瘍反応性のＣＴＬを加えて作用させ、該ＣＴＬが反応して産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法などで測定することによって、所望の癌抗原タンパク質の抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を調べることができる。
抗原タンパク質に由来する抗原ペプチド（以下、単に抗原ペプチドと略す）には、前記抗原タンパク質の一部であって８〜２０アミノ酸残基程度からなるペプチド、もしくはその機能的に同等の特性を有する改変ペプチド、または該ペプチドもしくはその改変ペプチドを２以上連結したポリトープ等が含まれる。ここで「８〜２０」との定義は、ＭＨＣ分子に提示される抗原ペプチドは、通常８〜２０アミノ酸程度の長さであるという当業者の常識に基くものである。また「機能的に同等の特性を有する改変ペプチド」とは、抗原ペプチドのアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／または付加（ペプチドのＮ末端、Ｃ末端へのアミノ酸の付加も含む）した改変体であって、かつ抗原ペプチド特異的なＴ細胞を誘導可能なものをいう。
癌抗原ペプチドやウイルス由来抗原ペプチドのうち、ＨＬＡ−Ａ１，−Ａ０２０１，−Ａ０２０４，−Ａ０２０５，−Ａ０２０６，−Ａ０２０７，−Ａ１１，−Ａ２４，−Ａ３１，−Ａ６８０１，−Ｂ７，−Ｂ８，−Ｂ２７０５，−Ｂ３７，−Ｃｗ０４０１，−Ｃｗ０６０２などのＨＬＡの型については、該ＨＬＡに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明している（例えばＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：ｐ１７８，１９９５などを参照のこと）。例えばＨＬＡ−Ａ２４のモチーフとしては、８〜１１アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンとなることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，ｐ３９１３，１９９４、ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉＣｓ，４１：ｐ１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：ｐ４３０７，１９９４）。またＨＬＡ−Ａ２のモチーフについては、以下の表１に示したモチーフが知られている（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１，ｐ１７８，１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：ｐ４７４９，１９９５）。
表１

さらに近年、ＨＬＡ抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、インターネット上、ＮＩＨのＢＩＭＡＳのソフトを使用することにより検索することができる（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）。またＢＩＭＡＳ ＨＬＡ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，１６３，１９９４）を用いて検索することも可能である。
従って、前述の癌抗原タンパク質やウイルス由来抗原タンパク質のアミノ酸配列から、これらのモチーフに関わる抗原ペプチド部分を選び出すのは容易である。このようにして選択された抗原ペプチドの具体例としては、例えば癌抗原ペプチドの場合、以下のものが挙げられる。すなわちＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとしては、国際公開第２０００／１８７９５号パンフレットのＴａｂｌｅＩＩ−ＴａｂｌｅＸＬＶＩに列挙されたペプチドが挙げられ、特に、本願配列表の配列番号：２および配列番号：３に記載のＨＬＡ−Ａ２４およびＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを有するペプチドが挙げられる。またＳＡＲＴ−１由来の癌抗原ペプチドとしては、国際公開第９７／４６６７６号パンフレット、国際公開第２０００／０２９０７号パンフレット、および国際公開第２０００／０６５９５号パンフレットの配列表に列挙されたペプチドが挙げられる。また、サイクロフィリンＢ由来の癌抗原ペプチドとしては、国際公開第９９／６７２８８号パンフレットの配列表に列挙されたペプチドが挙げられる。また、ＳＡＲＴ−３由来の癌抗原ペプチドとしては、国際公開第２０００／１２７０１号パンフレットの配列表に列挙されたペプチドが挙げられる。以上のペプチドを後述の活性測定に供することにより、抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を有する抗原ペプチドを選択することができる。
さらに、前記抗原ペプチドと機能的に同等の特性を有する改変ペプチドとしては、前記のようにＨＬＡ抗原に結合して提示される抗原ペプチド配列の規則性（モチーフ）が判明しているものについては、当該モチーフに基いてアミノ酸を置換した改変ペプチドを例示することができる。すなわちＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフを例にとり説明すると、当該ＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフは、前述のように、８〜１１アミノ酸よりなるペプチドのうちの第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニンまたはトリプトファンであり、Ｃ末端がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチオニンとなることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，ｐ３９１３，１９９４，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：ｐ１７８，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５５：ｐ４３０７，１９９４）。従ってＨＬＡ−Ａ２４抗原に結合して提示される改変ペプチドとしては、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性の天然型ペプチドの第２位および／またはＣ末端のアミノ酸において、前記に列挙したアミノ酸の範囲内での置換を施した改変ペプチドを例示することができる。当該改変ペプチドの具体例としては、例えば癌抗原の改変ペプチドの場合、以下のものが挙げられる。すなわちＷＴ１由来の改変ペプチドとしては、国際公開第２０００／１８７９５号パンフレットのＴａｂｌｅＩＩ〜ＴａｂｌｅＸＬＶＩに列挙されたペプチドを前記のモチーフに基き改変した改変ペプチドが挙げられ、特に本願配列表の配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。またＳＡＲＴ−１、サイクロフィリンＢ、ＳＡＲＴ−３等に由来する改変ペプチドについても、前記の文献に挙げられた各抗原ペプチドをモチーフに基き改変した改変ペプチドが挙げられる。このような改変ペプチドも本発明における抗原ペプチドに包含される。
以上のような抗原ペプチド（改変ペプチドを含む）は、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。また、前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに従って、抗原ペプチドをコードするＤＮＡを発現させた組換えペプチドを常法により精製する方法で調製しても良い。
前記抗原ペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を有することは、癌抗原ペプチドの場合、例えばＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，ｐ２２５７，１９９５に記載の測定方法により調べることができる。具体的には、ＨＬＡ抗原陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、イン・ビトロで所望のペプチドを添加して刺激した場合に、該ペプチドをパルスしたＨＬＡ陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されることにより、そのペプチドが抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を有することを確認することができる。ここでＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生したＩＦＮ−γの量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定することによって調べることができる。また、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生したＴＮＦ−αの量を、ＴＮＦ−α感受性細胞株（例えばＷＥＨＩ１６４Ｓ細胞；ＡＴＣＣ Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−１７５１）の生存率で測定することによっても、調べることができる。
さらに、^５１Ｃｒで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（^５１Ｃｒリリースアッセイ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：ｐ３１７，１９９４）によっても調べることができる。またＨＬＡのｃＤＮＡを発現する発現プラスミドを、例えばＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）やＶＡ−１３細胞（理化学研究所細胞銀行）に導入した細胞に対して所望のペプチドをパルスし、この細胞に対して、前記で調製したＣＴＬなどを反応させ、該ＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γやＴＮＦ−α）の量を測定することによっても、調べることができる。
ポリトープとは、複数の抗原ペプチドを連結させた組換えペプチドをいい（例えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６０，ｐ１７１７，１９９８等を参照のこと）、本発明においては前記抗原ペプチドの１種または２種以上を適宜組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドのことである。ポリトープは、前記抗原ペプチドをコードするＤＮＡを１種または２種以上連結させることにより作製された組換えＤＮＡを、適当な発現ベクターに挿入し、得られた組換えベクターを宿主細胞内で発現させることにより得られる。当該ポリトープが抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を有することは、前記の抗原タンパク質のアッセイに供することにより、確認することができる。このポリトープも本発明において抗原ペプチドとして使用することができる。
以上述べたような抗原タンパク質または抗原ペプチドから少なくとも１種を選択し、前記組成物（ａ）の活性成分とする。目的に応じて、抗原タンパク質を２種以上、または抗原ペプチドを２種以上有していても良い。当該抗原タンパク質または抗原ペプチドの治療学的有効量は、生体において抗原特異的Ｔ細胞を誘導可能であれば特に限定されないが、１回の投与当たり、好ましくは通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇである。
前記組成物（ａ）は、所望の薬理効果を奏するような投与剤形にすることが好ましい。この目的に適する投与剤形としては、油中水型（ｗ／ｏ）エマルション製剤、水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルション製剤、リポソーム製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤、固形注射剤または液剤等が挙げられる。
油中水型（ｗ／ｏ）エマルション製剤は、有効成分を水の分散相に分散させた形態をとる。水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤は、有効成分を水の分散媒に分散させた形態をとる。また水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルション製剤は、有効成分を最内相の水の分散相に分散させた形態をとる。このようなエマルション製剤の調製は、例えば、特開平８−９８５号公報、特開平９−１２２４７６号公報等を参考にして行うことができる。
リポソーム製剤は、有効成分を脂質二重膜構造のリポソームで水相内または膜内に包み込んだ形の微粒子である。リポソームを作るための主要な脂質としては、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられ、これにジセチルホスフェート、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン等を加えてリポソームに荷電を与えて安定化させる。リポソームの調製方法としては、超音波法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、フレンチプレスエクストラクション法等が挙げられる。
マイクロスフェアー製剤は、均質な高分子マトリックスから構成され、該マトリックス中に有効成分が分散された形の微粒子である。マトリックスの材料としては、アルブミン、ゼラチン、キチン、キトサン、デンプン、ポリ乳酸、ポリアルキルシアノアクリレート等の生分解性高分子が挙げられる。マイクロスフェアー製剤の調製方法としては公知の方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０：１２９−１４６，２０００、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：６３−７８，１９９８、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１−４３，１９９７）等に従えばよく特に限定されない。
マイクロカプセル製剤は、有効成分を芯物質として被膜物質で覆った形の微粒子である。被膜物質に用いられるコーティング材料としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース等の膜形成性高分子が挙げられる。マイクロカプセル製剤の調製方法は、コアセルベーション法、界面重合法等が挙げられる。
固形注射剤は有効成分をコラーゲンやシリコン等の基材に封入して固形化させた剤形である。固形注射剤の調製方法としては文献（Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈ．Ｊａｐａｎ，７（１９９１），ｐ４０２−４０９）記載の方法等が挙げられる。
液剤は、有効成分を医薬上許容されうる溶媒、担体等と混合した剤形である。医薬上許容されうる溶媒としては、水、ブドウ糖液、生理食塩水等が挙げられる。さらに、医薬として許容される補助剤、例えば、ｐＨ調節剤または緩衝剤、張度調節剤、浸潤剤等を含有することができる。
さらに組成物（ａ）は、前記の投与剤形に応じて凍結乾燥製剤の形とすることも可能である。また必要に応じて安定化剤（例えば多糖類、アミノ酸、タンパク質、ウレア、塩化ナトリウム等）や賦形剤（例えば糖類、アミノ酸、ウレア、塩化ナトリウム等）、酸化防止剤、防腐剤、等張化剤、あるいは緩衝剤等を添加することも可能である。
以上のような組成物（ａ）は、あらかじめ製剤化したものを使用することもできれば、患者への投与時に用時調製することも可能である。すなわち、当該組成物（ａ）の活性成分である抗原タンパク質または抗原ペプチド、および投与剤形であるエマルション等は、あらかじめ混合して製剤化したものを使用することもできれば、患者への投与時に用時調製することも可能である。
次に前記組成物（ｂ）、すなわち活性成分として非特異的免疫賦活物質を含む組成物につき説明する。
組成物（ｂ）の活性成分として含まれる「非特異的免疫賦活物質」とは、抗原タンパク質や抗原ペプチドの有する抗原特異的Ｔ細胞の誘導活性を増強する作用を有する物質であれば、特に限定されない。具体的には、（ｉ）菌体由来成分またはその誘導体、（ｉｉ）サイトカイン、（ｉｉｉ）植物由来成分またはその誘導体、または（ｉｖ）海洋生物由来成分またはその誘導体などが挙げられる。
抗原特異的Ｔ細胞の誘導活性を増強する作用を有する「菌体由来成分またはその誘導体」とは、例えば▲１▼細菌の死菌、▲２▼細菌由来の細胞壁骨格（Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ，ＣＷＳと略する）、▲３▼菌体由来の特定の成分またはその誘導体等に分類される。
ここで▲１▼細菌の死菌としては、例えば溶連菌粉末（例えばピシバニール；中外製薬株式会社）、死菌浮遊物カクテル（例えばブロンカスマ・ベルナ；三和化学研究所）、あるいはヒト型結核菌の死菌等が挙げられる。
▲２▼細菌由来のＣＷＳとしては、マイクバクテリア属由来のＣＷＳ（例えばマイコバクテリア属ウシ型結核菌であるＢＣＧ株のＣＷＳ）、ノカルディア属由来のＣＷＳ（例えばノカルディア・ノブラのＣＷＳ）、あるいはコリネバクテリア属由来のＣＷＳ等が挙げられる。
▲３▼菌体由来の特定の成分またはその誘導体としては、例えば菌体由来多糖類であるヒト型結核菌由来多糖類成分（例えばアンサー；ゼリア新薬工業株式会社）や担子菌由来多糖類（例えばレンチナン；味の素、クレスチン；三共株式会社、担子菌カワラタケ）、またムラミルジペプチド（ＭＤＰ）関連化合物、リポ多糖（ＬＰＳ）、リピドＡ関連化合物（ＭＰＬ）、糖脂質トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、細菌由来のＤＮＡ（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）、あるいはこれらの誘導体などが挙げられる。
これら菌体由来成分およびその誘導体は、既に市販されているものであればそれを入手するか、または公知文献（例えばＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，３３，２１８７−２１９５（１９７３）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，４８，８３１−８３５（１９７２）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９４，１７３６−１７４５（１９６７）、Ｇａｎｎ，６９，６１９−６２６（１９７８）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９２，８６９−８７９（１９６６）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，５２，９５−１０１（１９７４））等に基き単離または製造することが可能である。
抗原特異的Ｔ細胞の誘導活性を増強する作用を有する「サイトカイン」としては、例えばＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８、あるいはＩＬ−１５などが挙げられる。これらのサイトカインは、天然品であっても遺伝子組換え品であっても良い。これらのサイトカインは、既に市販されていればそれを入手して使用することができる。また遺伝子組換え品であれば、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、あるいはＤＤＢＪ等のデータベースにおいて登録されている各塩基配列に基き、常法により所望の遺伝子をクローニングし、適当な発現ベクターに連結して作製された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、発現・生産することができる。
抗原特異的Ｔ細胞の誘導活性を増強する作用を有する「植物由来成分またはその誘導体」としては、例えばサポニン由来成分であるＱｕｉｌ Ａ（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ）、ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｉｎｃ．）、あるいはグリチルリチン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨなど）などが挙げられる。
抗原特異的Ｔ細胞の誘導活性を増強する作用を有する「海洋生物由来成分またはその誘導体」としては海綿由来の糖脂質が挙げられ、具体的にはα−ガラクトシルセラミドなどが挙げられる（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，１９９５，Ｊｕｎ ９，３８（１２）ｐ２１７６−２７８７）。
以上述べたような非特異的免疫賦活物質から少なくとも１種を選択し、前記組成物（ｂ）の活性成分とする。目的に応じて、当該非特異的免疫賦活物質を２種以上有していても良い。当該非特異的免疫賦活物質の治療学的有効量は、生体において抗原特異的Ｔ細胞の誘導増強活性を有すれば特に限定されないが、１回の投与当たり、好ましくは通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、さらに好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇである。また前記サイトカインの場合は、力価として、１回当たり１０Ｕ〜１ｘ１０^８Ｕ程度が挙げられる。
前記組成物（ｂ）は、前記組成物（ａ）と同様に、所望の薬理効果を奏するような投与剤形にすることが好ましい。この目的に適する投与剤形としては、油中水型（ｗ／ｏ）エマルション製剤、水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルション製剤、リポソーム製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤、固形注射剤または液剤等が挙げられる。
油中水型（ｗ／ｏ）エマルション製剤は、有効成分を水の分散相に分散させた形態をとる。水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤は、有効成分を水の分散媒に分散させた形態をとる。また水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルション製剤は、有効成分を最内相の水の分散相に分散させた形態をとる。このようなエマルション製剤の調製は、例えば、特開平８−９８５号公報、特開平９−１２２４７６号公報等を参考にして行うことができる。
リポソーム製剤は、有効成分を脂質二重膜構造のリポソームで水相内または膜内に包み込んだ形の微粒子である。リポソームを作るための主要な脂質としては、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられ、これにジセチルホスフェート、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン等を加えてリポソームに荷電を与えて安定化させる。リポソームの調製方法としては、超音波法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、フレンチプレスエクストラクション法等が挙げられる。
マイクロスフェアー製剤は、均質な高分子マトリックスから構成され、該マトリックス中に有効成分が分散された形の微粒子である。マトリックスの材料としては、アルブミン、ゼラチン、キチン、キトサン、デンプン、ポリ乳酸、ポリアルキルシアノアクリレート等の生分解性高分子が挙げられる。マイクロスフェアー製剤の調製方法としては公知の方法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０：１２９−１４６，２０００、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：６３−７８，１９９８、Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１−４３，１９９７）等に従えばよく特に限定されない。
マイクロカプセル製剤は、有効成分を芯物質として被膜物質で覆った形の微粒子である。被膜物質に用いられるコーティング材料としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース等の膜形成性高分子が挙げられる。マイクロカプセル製剤の調製方法は、コアセルベーション法、界面重合法等が挙げられる。
固形注射剤は有効成分をコラーゲンやシリコン等の基材に封入して固形化させた剤形である。固形注射剤の調製方法としては文献（Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈ．Ｊａｐａｎ，７（１９９１），ｐ４０２−４０９）記載の方法等が挙げられる。
液剤は、有効成分を医薬上許容されうる溶媒、担体等と混合した剤形である。医薬上許容されうる溶媒としては、水、ブドウ糖液、生理食塩水等が挙げられる。さらに、医薬として許容される補助剤、例えば、ｐＨ調節剤または緩衝剤、張度調節剤、浸潤剤等を含有することができる。
これらの投与剤形のうち、好ましいのは油中水型（ｗ／ｏ）エマルション製剤、水中油型（ｏ／ｗ）エマルション製剤、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルション製剤、あるいはマイクロスフェアー製剤である。特に、非特異的免疫賦活物質が菌体由来成分、植物由来成分、あるいはこれらの誘導体の場合はこれらの剤型をとることが好ましい。
さらに前記組成物（ｂ）は、前記の投与剤形に応じて凍結乾燥製剤の形とすることも可能である。また必要に応じて安定化剤（例えば多糖類、アミノ酸、タンパク質、ウレア、塩化ナトリウム等）や賦形剤（例えば糖類、アミノ酸、ウレア、塩化ナトリウム等）、酸化防止剤、防腐剤、等張化剤、あるいは緩衝剤等を添加することも可能である。
以上のような組成物（ｂ）は、あらかじめ製剤化したものを使用することもできれば、患者への投与時に用時調製することも可能である。すなわち、当該組成物（ｂ）の活性成分で非特異的免疫賦活物質、および投与剤形であるエマルション等は、あらかじめ混合して製剤化したものを使用することもできれば、患者への投与時に用時調製することも可能である。
以上のような組成物（ａ）および（ｂ）を投与する本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法は、組成物（ｂ）をあらかじめ投与した後に、組成物（ａ）を投与することを特徴とするものである。具体的には、前記組成物（ｂ）を投与後６時間以上おいた後に前記組成物（ａ）を投与することが好ましく、また前記組成物（ｂ）を投与後１２時間以上おいた後に前記組成物（ａ）を投与することがより好ましい。さらに、前記組成物（ｂ）を投与後、約１２時間〜４８時間おいた後に前記組成物（ａ）を投与することがより好ましく、前記組成物（ｂ）を投与後、約２４時間〜４８時間おいた後に前記組成物（ａ）を投与することがさらに好ましい。最も好ましいのは、前記組成物（ｂ）を投与後、約２４時間（ｃａ １ｄａｙ；２０〜２８時間）おいた後に前記組成物（ａ）を投与するという投与タイミングである。
なお、前記のように組成物（ｂ）をあらかじめ投与した後に組成物（ａ）を投与するという投与タイミングでさえあれば、如何なる投与を行っても良く、例えば以下のような投与法が例示される。
１）組成物（ｂ）を１回〜複数回投与し、前記の如き一定時間おいた後に組成物（ａ）を投与する。
２）組成物（ｂ）を１回〜複数回投与し、前記の如き一定時間おいた後に、組成物（ｂ）と組成物（ａ）とを同時に投与する。
ここで組成物（ｂ）の複数回投与の投与回数は、具体的には２回〜１０回が挙げられ、好ましくは２回〜５回が挙げられる。
以上の（ａ）および（ｂ）による投与を１投与サイクルとした場合、Ｔ細胞誘導効果をさらに上げるために、当該１投与サイクルを複数回繰り返して行っても良い。すなわち前記１投与サイクルを１回以上、対象とする疾患、患者の症状、年齢および体重等に応じて、適宜繰り返すことができる。当該繰り返し投与の投与間隔も、患者の症状等に応じて、１週間〜１年程度の範囲から適宜選択することができる。
本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法に使用する前記組成物（ａ）および（ｂ）の投与ルートとしては、皮内投与、皮下投与、持続皮下投与、静脈注射、動脈注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与等が挙げられる。浸透圧ポンプなどを用いて連続的に徐々に投与することや、徐放性製剤（例えばミニペレット製剤）を調製し、埋め込むことも可能である。好ましくは皮内投与あるいは皮下投与を挙げることができる。特に前記組成物（ａ）および（ｂ）を、いずれも皮内投与することが好ましい。その際、前記組成物（ａ）および（ｂ）を、いすれも皮内の同一部位に投与することが好ましい。
本発明の抗原特異的Ｔ細胞誘導方法における前記組成物（ａ）および（ｂ）の活性成分の組み合わせば、抗原タンパク質と菌体由来成分またはその誘導体との組み合わせ、抗原タンパク質とサイトカインとの組み合わせ、抗原タンパク質と植物由来成分またはその誘導体との組み合わせ、または抗原タンパク質と海洋生物由来成分またはその誘導体との組み合わせ、あるいは抗原ペプチドと菌体由来成分またはその誘導体との組み合わせ、抗原ペプチドとサイトカインとの組み合わせ、抗原ペプチドと植物由来成分またはその誘導体との組み合わせ、または抗原ペプチドと海洋生物由来成分またはその誘導体との組み合わせ等が例示される。このうち抗原が癌抗原の場合、より効果的に抗原特異的Ｔ細胞の誘導が行い得るという観点から、癌抗原タンパク質と菌体由来成分またはその誘導体との組み合わせ、若しくは癌抗原ペプチドと菌体由来成分またはその誘導体との組み合わせが好ましい。ここで菌体由来成分としては、アンサー、ブロンカスマ・ベルナ、クレスチン若しくはピシバニールが好ましい。また前記（ｂ）の活性成分がサイトカインの場合は、癌抗原タンパク質とＩＦＮ−αとの組み合わせ、若しくは癌抗原ペプチドとＩＦＮ−αとの組み合わせが好ましい。前記（ｂ）の活性成分が海洋生物由来成分の場合は、癌抗原タンパク質または癌抗原ペプチドとα−ガラクトシルセラミドとの組み合わせが好ましい。
前記組成物（ａ）の有効成分が癌抗原タンパク質の場合、具体的にはＷＴ１（配列番号：１）と菌体由来成分またはその誘導体との組み合わせ、ＷＴ１とサイトカインとの組み合わせ、若しくはＷＴ１と植物由来成分またはその誘導体との組み合わせ、若しくはＷＴ１と海洋生物由来成分またはその誘導体との組み合わせが例示される。好ましくはＷＴ１と菌体由来成分またはその誘導体との組み合わせが挙げられ、より好ましくはＷＴ１とアンサー、ＷＴ１とブロンカスマ・ベルナ、クレスチン若しくはＷＴ１とピシバニールの組み合わせが挙げられる。また、ＷＴ１とＩＦＮ−αとの組み合わせおよびＷＴ１とα−ガラクトシルセラミドとの組み合わせも好ましい態様として挙げられる。
また前記組成物（ａ）の有効成分が癌抗原ペプチドの場合、具体的にはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドと菌体由来成分またはその誘導体との組み合わせ、ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとサイトカインとの組み合わせ、若しくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドと植物由来成分またはその誘導体との組み合わせ、若しくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドと海洋生物由来成分またはその誘導体との組み合わせが例示される。好ましくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドと菌体由来成分またはその誘導体との組み合わせが挙げられ、より好ましくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとアンサー、ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとブロンカスマ・ベルナ、ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとクレスチン、若しくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとピシバニールとの組み合わせが挙げられる。また、ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとＩＦＮ−αとの組み合わせ、およびＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとα−ガラクトシルセラミドとの組み合わせも好ましい態様として挙げられる。
ここでＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとしては、配列番号：１に記載のヒトＷＴ１のアミノ酸配列中、前述したようなＨＬＡ抗原に結合して提示されるモチーフ構造を有するペプチド、およびその改変ペプチドが挙げられる。具体的には、国際公開第２０００／１８７９５号パンフレットのＴａｂｌｅＩＩ−ＴａｂｌｅＸＬＶＩに列挙されたペプチドおよびそのモチーフに基く改変ペプチドが挙げられ、より好ましくはＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフを有するＡｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ（配列番号：２）、Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：３）、若しくはそのＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに基く改変ペプチドが挙げられる。当該改変ペプチドの具体例としては、配列番号：３に記載のペプチドの第２位のＭｅｔをモチーフ上とり得るアミノ酸Ｔｙｒに置換したＣｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：４）などが挙げられる。
以上のような本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法は、以下のようにしてその抗原特異的Ｔ細胞の誘導能を調べることができる。
実験動物に本発明にかかる組成物（ｂ）を皮内注射し、２４時間後に組成物（ａ）を皮内注射する。これを１クールとし、１回、または１〜２週間おきに数回免疫する。最後の投与から１週間後に脾臓を摘出し、脾臓のリンパ球を調製する。未感作のマウスの脾細胞も同時に調製し、抗原ペプチドを数時間パルスした後、２０００〜５０００ｒａｄ程度のＸ線を照射し、これを抗原提示細胞とする。免疫したマウスのリンパ球に抗原提示細胞を加えることにより培養系で抗原ペプチドによる再刺激を行う。必要に応じて同様の刺激を１週間に１回の割合で複数回行う。最後の刺激から１週間後にリンパ球を回収し、抗原ペプチドをパルスした細胞、抗原陽性の細胞などを標的細胞として、リンパ球内に誘導された抗原ペプチド特異的Ｔ細胞が反応して産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の量を定量したり、^５１Ｃｒでラベルした標的細胞に対する抗原ペプチド特異的Ｔ細胞の傷害活性を^５１Ｃｒ遊離測定法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：２８８８，１９８７）で測定することなどにより抗原特異的Ｔ細胞の誘導能を調べることができる。ヒトの場合は、実験動物の脾臓リンパ球の代わりに、末梢血からフィコール法などで分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて同様な方法で抗原ペプチド特異的Ｔ細胞の誘導能を調べることができる。
また、実施例に記載した以下の手法を用いることにより、癌抗原特異的Ｔ細胞の誘導能を調べることもできる。簡単に述べると、まず、所望の癌抗原タンパク質をコードするｃＤＮＡを腫瘍細胞に導入することにより、所望の癌抗原タンパク質を高発現する腫瘍細胞を調製する。当該腫瘍細胞を実験動物の腹腔内に投与し、翌日より免疫を開始する。免疫は、まず前記組成物（ｂ）を皮内注射し、２４時間後に組成物（ａ）を皮内注射するという１投与クールを１週間おきに計４回繰り返すことにより行う。その後、腫瘍形成率や生存率、さらには無病生存率を常法により測定することにより、抗原特異的Ｔ細胞の誘導能に基く抗腫瘍効果を調べることができる。また実験動物の代わりに腫瘍患者に対して前記と同様の投与を行うことにより、抗原ペプチド特異的Ｔ細胞の誘導能を調べることができる。
本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法によれば、抗原陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原に抗原ペプチドが高密度に提示され、提示されたＨＬＡ抗原−ペプチド複合体特異的なＴ細胞が増殖してターゲット細胞（抗原ペプチド陽性の細胞）を破壊したり、各種のサイトカインを産生して免疫を活性化することができる。本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法は、抗原が癌抗原の場合は癌の治療または予防に用いられる。具体的には、例えば肺癌、卵巣癌、前立腺癌、および白血病などの治療または予防に用いられる。また抗原がウイルス由来抗原の場合はウイルス感染症の治療または予防に用いられる。
癌の治療または予防の場合、本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法により、癌細胞に対する特異的細胞性免疫が誘導・増強され、癌を治療し、または癌の増殖・転移を予防することができる。さらに、本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法を、従来の化学療法や放射線療法と併用することにより、治療効果を上げることも可能である。またウイルス感染症を治療または予防する場合、本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法により、ウイルス感染細胞に対する特異的細胞性免疫が誘導・増強され、ウイルス感染症を治療または予防することができる。
本発明の抗原特異的Ｔ細胞誘導方法の開始時期は、特に制限されるものではないが、癌患者への処置の場合、例えば白血病が完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：ＣＲ）に到達した後や、固形癌の手術後の腫瘍細胞が少ない、つまりＭＲＤ（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）の状態の時に行うことが好ましい。
上記態様に関連し、本発明は、患者における抗原特異的Ｔ細胞を誘導するための本発明の方法を含む、患者における癌の治療方法および／または予防方法を提供する。
本発明は別の態様として、抗原タンパク質または抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するための医薬組成物であって、活性成分として非特異的免疫賦活物質を含有する、該抗原タンパク質または抗原ペプチドの投与前に投与される該組成物、および；
非特異的免疫賦活物質における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための医薬組成物であって、活性成分として抗原タンパク質または抗原ペプチドを含有する、該非特異的免疫賦活物質の投与後に投与される該組成物に関する。前記非特異的免疫賦活物質を含有する組成物は上記の組成物（ｂ）に関する説明に基づいて調製、使用することができ、他方前記抗原タンパク質または抗原ペプチドを含有する組成物は上記組成物（ａ）に関する説明に基づいて調製、使用することができる。
上記態様に関連し、本発明は、抗原タンパク質または抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するための本発明医薬組成物、または非特異的免疫賦活物質における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための本発明医薬組成物であって、癌を治療および／または予防するための医薬組成物を提供する。
また、本発明は上記態様に関連し、抗原タンパク質または抗原ペプチドの投与前に投与される、該抗原タンパク質または抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強する医薬を調製するための、非特異的免疫賦活物質の使用、および非特異的免疫賦活物質の投与後に投与される、該非特異的免疫賦活物質における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強する医薬を調製するための、抗原タンパク質または抗原ペプチドの使用を提供する。さらに、本発明は、抗原タンパク質または抗原ペプチドの投与前に投与される、該抗原タンパク質または抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強し、それにより癌を治療および／または予防する医薬を調製するための、非特異的免疫賦活物質の使用、ならびに非特異的免疫賦活物質の投与後に投与される、該非特異的免疫賦活物質における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強し、それにより癌を治療および／または予防する医薬を調製するための、抗原タンパク質または抗原ペプチドの使用を提供する。この態様において、抗原タンパク質または抗原ペプチド、および非特異的免疫賦活物質は上記の組成物（ａ）および（ｂ）に関する説明に基づいて調製、使用することができる。
さらに本発明は特定の態様として、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するための医薬組成物であって活性成分として菌体由来成分またはその誘導体を含有する該組成物、および菌体由来成分またはその誘導体における免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための医薬組成物であって、活性成分として配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドを含有する該組成物を提供する。また本発明は、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するための医薬組成物であって活性成分としてＩＦＮ−αを含有する該組成物、およびＩＦＮ−αにおける免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための医薬組成物であって活性成分として配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドを含有する該組成物をも提供する。この態様には、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチド、および菌体由来成分またはその誘導体をともに含有する、抗原特異的Ｔ細胞誘導のための医薬組成物が含まれる。さらに、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチド、およびＩＦＮ−αをともに含有する、抗原特異的Ｔ細胞誘導のための医薬組成物も含まれる。
後述の実施例に示したように、ＷＴ１を、種々の菌体由来成分やＩＦＮ−αと併用することにより、いずれの場合においても良好なＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）の誘導効果、すなわち抗腫瘍効果が得られた。従ってＷＴ１と菌体由来成分とを併用に供することによる癌の治療剤および／または予防剤、あるいはＷＴ１とＩＦＮ−αとを併用に供することによる癌の治療剤および／または予防剤は、優れた抗腫瘍特異的免疫療法剤として臨床効果を発揮するものと考えられる。ＷＴ１を種々の菌体由来成分またはＩＦＮ−αと併用する際にはその順序は、ＷＴ１および菌体由来成分やＩＦＮ−αのいずれを先に投与してもよし、あるいは両者を混合して投与してもよい。
ＷＴ１タンパク質との組み合わせにおいて使用される菌体由来成分またはその誘導体は特に制限されないが、好ましくはＷＴ１とアンサー、ＷＴ１とブロンカスマ・ベルナ、ＷＴ１とクレスチン、若しくはＷＴ１とピシバニールとの組み合わせが挙げられる。
またＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとの組み合わせにおいて使用される菌体由来成分またはその誘導体も特に制限されないが、好ましくはＷＴＩ由来の癌抗原ペプチドとアンサー、ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとブロンカスマ・ベルナ、ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとクレスチン、若しくはＷＴ１由来の癌抗原ペプチドとピシバニールとの組み合わせが挙げられる。ここでＷＴ由来の癌抗原ペプチドとしては、配列番号：１に記載のヒトＷＴ１のアミノ酸配列中、前述したようなＨＬＡ抗原に結合して提示されるモチーフ構造を有するペプチド、およびその改変ペプチドが挙げられる。具体的には、国際公開第２０００／１８７９５号パンフレットのＴａｂｌｅＩＩ〜ＴａｂｌｅＸＬＶＩに列挙されたペプチドおよびそのモチーフに基く改変ペプチドが挙げられ、より好ましくはＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４の結合モチーフを有するＡｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ（配列番号：２）、Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：３）、若しくはそのＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２結合モチーフに基く改変ペプチドが挙げられる。当該改変ペプチドの具体例としては、配列番号：３に記載のペプチドの第２位のＭｅｔをモチーフ上とり得るアミノ酸Ｔｙｒに置換したＣｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ（配列番号：４）などが挙げられる。
以上のようなＷＴ１と菌体由来成分との組み合わせに係る癌の治療剤および／または予防剤の投与法、投与量、投与形態等は、前述の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法におけるものと同様である。
この態様に関連し、本発明は、患者において配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するため方法であって、抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強するに有効な量の菌体由来成分またはその誘導体、あるいはＩＦＮ−αを該患者に投与することを特徴とする方法；
患者において菌体由来成分またはその誘導体、あるいはＩＦＮ−αにおける免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強するための方法であって、免疫賦活作用に基づく抗癌活性を増強するに有効な量の配列番号：１に記載のＷＴＩタンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドを該患者に投与することを特徴とする方法；
癌患者に投与し、癌を治療および／または予防するための上記方法；および
配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチド、および菌体由来成分またはその誘導体、あるいはＩＦＮ−αを同時に投与する上記方法；ならびに
配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドにおける抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を増強する医薬を調製するための、菌体由来成分またはその誘導体、あるいはＩＦＮ−αの使用；
菌体由来成分またはその誘導体、あるいはＩＦＮ−αにおける免疫賦活作用に基づく抗癌活性を抗原特異的Ｔ細胞誘導活性を介して増強する医薬を調製するための、配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドの使用；
癌患者に投与し、癌を治療および／または予防するため医薬を調製するための、上記方法；
配列番号：１に記載のＷＴ１タンパク質または該ＷＴ１由来の癌抗原ペプチド、および菌体由来成分またはその誘導体、あるいはＩＦＮ−αをともに含有する医薬を調製するための、上記使用に関する。
以上のようなＷＴ１と菌体由来成分またはＩＦＮ−αとの組み合わせに係る方法または使用の態様等は、前述の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法におけるものと同様である。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

ＷＴ１ペプチドとアンサーとの併用による抗腫瘍効果
１．材料と方法
１）細胞
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＷＴ１を発現していない白血病細胞細胞株であるＣ１４９８は、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より購入した。マウスＷＴ１を発現しているＣ１４９８（ＷＴ１−Ｃ１４９８）は、マウスＷＴ１のｃＤＮＡ（ＷＯ００／０６６０２）を常法によりＣ１４９８細胞に遺伝子導入することにより作製した。
２）ペプチド
ＷＴ１由来の癌抗原ペプチドである９ｍｅｒのペプチド（配列：Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ；配列番号：２）はＦｍｏｃ法を使用し、ＡＢＩ４３０Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ，Ｆｏｓｔｅｒ）により合成後、Ｃ１８ Ｍｉｃｒｏｂｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）カラムを用いた逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。合成したペプチドは、ＡＰＩ ＩＩＩＥ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｓｃｉｅｘ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）で確認し、ペプチド濃度はＢＳＡをスタンダードとし、ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ）により決定した。
３）非特異的免疫賦活物質
非特異的免疫賦活物質として、ヒト結核菌の熱水抽出物を精製して得られた多糖類を主成分とする放射線療法による白血球減少抑制剤のアンサー２０注（ゼリア新薬工業株式会社）を購入して用いた。
４）マウス
６−８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは日本クレアより購入した。
５）腫瘍細胞の移植と免疫（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）スケジュール
ＷＴ１−Ｃ１４９８細胞１×１０^６個をマウスの腹腔内に投与し、翌日より免疫を開始した。アンサー２０注０．２ｍｌをマウスの側腹部へ皮内注射し、２４時間後に同一部位に２ｍｇ／ｍｌのＷＴ１ペプチド（配列番号：２）溶液を０．１ｍｌ皮内注射した。これを１クールとし、１週間おきに計４回免疫した（図１）。１群当たり５匹のマウスを用いた。
２．結果
図１に示したスケジュールに従い、腫瘍細胞の移植とワクチン投与を行い、その後の腫瘍塊形成を観察した。図２は非特異的免疫賦活剤としてアンサーを用いた場合のマウスの腫瘍径を表したものである。非免疫群は５匹中３匹で急速な腫瘍塊の形成が認められた。アンサーのみを投与した群では、５匹中２匹で腫瘍塊の形成が認められたが、非免疫群の腫瘍塊の形成が認められた個体に比べて腫瘍塊形成の速度は遅く、腫瘍径は小さかった。ＷＴ１ペプチドとアンサーを投与した群では、５匹全例で腫瘍塊の形成が認められなかった。
これらの結果より、非特異的免疫賦活剤のみの投与でも弱い腫瘍増殖抑制作用がみとめられるが、非特異的免疫賦活剤とＷＴ１ペプチドを組み合わせることにより、より強い抗腫瘍効果の得られることが示された。

ＷＴ１ペプチドとブロンカスマ・ベルナとの併用による抗腫瘍効果
１．材料と方法
１）細胞、ペプチドおよびマウス
実施例１と同様に調製した。
２）非特異的免疫賦活物質
非特異的免疫賦活物質として、各種菌体死菌浮遊液で上気道アレルギーの免疫療法剤であるブロンカスマ・ベルナ（三和化学研究所）を購入して用いた。
３）腫瘍細胞の移植と免疫（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）スケジュール
ＷＴ１−Ｃ１４９８細胞１×１０^６個をマウスの腹腔内に投与し、翌日より免疫を開始した。ブロンカスマ・ベルナ０．５ｍｌをマウスの側腹部へ皮内注射し、２４時間後に同一部位に２ｍｇ／ｍｌのＷＴ１ペプチド（配列番号：２）溶液を０．１ｍｌ皮内注射した。これを１クールとし、１週間おきに計４回免疫した（図１）。１群当たり５匹のマウスを用いた。
２．結果
図１に示したスケジュールに従い、腫瘍細胞の移植とワクチン投与を行い、その後の腫瘍塊形成を観察した。図３は非特異的免疫賦活剤としてブロンカスマ・ベルナを用いた場合のマウスの腫瘍径を表したものである。非免疫群は５匹中３匹で急速な腫瘍塊の形成が認められた。ブロンカスマ・ベルナのみを投与した群では、５匹中２匹で急速な腫瘍塊の形成が認められ、腫瘍移植３５日後の腫瘍径はともに２５ｍｍ以上に増大していた。ＷＴ１ペプチドとブロンカスマ・ベルナを投与した群では、５匹中１匹で腫瘍塊の形成が認められたものの、残りの４匹のうち３匹では腫瘍の形成が全く認められず、また１匹では腫瘍形成は明らかに抑制されており腫瘍径は５ｍｍ以下であった。
これらの結果より、非特異的免疫賦活剤のみの投与でも弱い腫瘍増殖抑制作用が認められるが、非特異的免疫賦活剤とＷＴ１ペプチドを組み合わせることにより、より強い抗腫瘍効果の得られることが示された。

ＷＴ１ペプチドとピシバニールとの併用による抗原ペプチド特異的ＣＴＬ誘導効果
１．材料と方法
１）ペプチド
ヒトＷＴ１由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性の抗原ペプチド誘導体である９ｍｅｒのペプチド（配列：Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ；配列番号：４）はＦｍｏｃ法により合成した。
２）非特異的免疫賦活物質
非特異的免疫賦活物質として、溶連菌由来の抗腫瘍剤ピシバニール（中外製薬株式会社）を購入して用いた。投与当日に５ＫＥ／バイアルのピシバニールを０．５ｍｌの生理的食塩水で懸濁して１０ＫＥ／ｍｌの溶液を調製した。
３）マウス
α１、α２ドメインがヒトのＨＬＡ−Ａ２４０２由来であり、残りの領域がマウスのＫ^ｂ由来のキメラ遺伝子（ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋ^ｂと表記する場合もある）を導入したトランスジェニックマウスを作出して実験に用いた。トランスジェニックマウスの作出方法は下記の通りである。ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡ断片はヒト腫瘍細胞株ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ（理研細胞バンクＲＣＢ０４４４）のゲノムＤＮＡよりＰＣＲ法で増幅した。プライマーはＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトを持った上流プライマー ５’−ＣＧＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＴＣ−３’とＢｇｌ ＩＩの制限酵素サイトを持った下流プライマー ５’−ＣＧＧ ＧＡＧ ＡＴＣ ＴＡＣ ＡＧＧ ＣＧＡ ＴＣＡ ＧＧＴ ＡＧＧ ＣＧＣ−３’を用いた。ＨＬＡ−Ａ２４０２のプロモーター、α１およびα２の領域の遺伝子を含む増幅断片をファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩ切断部位に連結して、キメラ遺伝子の構築に必要なＨＬＡ−Ａ２４０２遺伝子領域をコードするプラスミドを得た。Ｈ−２ＫｂのゲノムＤＮＡ断片はマウス腫瘍細胞株ＥＬ−４（ＡＴＣＣ Ｔ１Ｂ−３９）のゲノムＤＮＡよりＰＣＲ法で増幅した。プライマーは上流プライマー ５’−ＣＧＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＴＡＴ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＡＴ ＣＴＣ−３’と制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ部位を付加した下流プライマー ５’−ＣＧＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＴＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣ−３’を用いた。増幅断片をファージミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの制限酵素Ｋｐｎ ＩおよびＥｃｏ ＲＩ切断部位に挿入し、キメラ遺伝子の構築に必要なＨ−２Ｋ^ｂ遺伝子のα３、膜貫通領域および細胞質領域をコードするプラスミドを得た。上記ＨＬＡ−Ａ２４０２ゲノムＤＮＡをコードするプラスミドを制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ部位で切断し、一方、上記Ｈ−２Ｋ^ｂ遺伝子を制限酵素Ｂａｍ ＨＩ部位で切断し、これら部位を連結してＨＬＡ−Ａ２４０２とＨ−２Ｋ^ｂのキメラ遺伝子ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋ^ｂを作製した。ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋ^ｂをＣ５７ＢＬ／６マウスの受精卵に導入してＨＬＡ−Ａ２４０２を発現するトランスジェニックマウスを作出した。
４）免疫（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）スケジュールとＣＴＬ活性の測定
Ｄａｙ０にマウス腹側皮内に２ＫＥのピシバニールを投与し、翌日に同一部位に２ｍｇ／ｍｌのＷＴ１ペプチド（配列番号：４）溶液を０．１ｍｌ皮内注射した。マウスは３匹を使用した。Ｄａｙ８に脾臓を摘出し、スライドガラスのフロスト部分で擦り合わせて破壊し、ＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ_３，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２−７．４）にて溶血処理して脾細胞を回収・調製した。脾細胞の一部をＸ線照射（２，０００ｒａｄ）した後、前記ペプチドを１００ｕｇ／ｍｌで１時間パルスして０．７×１０^６個／ｗｅｌｌで２４穴プレートに播種した。このとき、非照射・非ペプチドパルスの７×１０^６個／ｗｅｌｌの脾細胞を同時に加えて３７℃下でペプチド再刺激を施行した（ペプチド終濃度１μｇ／ｍｌ）。脾細胞の培養は個体ごとに行った。培養には、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ＦＣＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ＭＥＭビタミン、５５μＭ ２−メルカプトエタノールを含む培養液（ＣＴＭ培養液）を１０ｍｌ用い、５日間イン・ビトロ刺激した。他方、ヒト腫瘍細胞株Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ Ｔ１Ｂ−１５２）に前記ＨＬＡ−Ａ２４０２／Ｋ^ｂ遺伝子を安定的に導入した細胞であるＪｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋ^ｂ細胞を３．７ＭＢｑ／１０^６個で^５１Ｃｒラベル後、前記ペプチドを１００μｇ／ｍｌで１時間パルスした。（ラベル時間２時間、ラベル開始１時間後にペプチドを終濃度１００μｇ／ｍｌ添加）。また、ペプチド非パルスの細胞をコントロール標的細胞として調製した。当該Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２４０２／Ｋ^ｂを標的細胞とし、ペプチド再刺激を行ったトランスジェニックマウス脾細胞を添加して、ＣＴＬ活性を^５１Ｃｒリリースアッセイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：４７５３，１９９７）により測定した。脾細胞と標的細胞の細胞数の比は６０：１であった。
２．結果
図４に免疫した３匹のマウスのＣＴＬ活性を示した。３匹のマウスの脾細胞は、抗原ペプチドをパルスしていない標的細胞に対してよりも抗原ペプチドをパルスした標的細胞に対して強い細胞傷害活性を示した。この結果よりピシバニールを皮内投与した翌日にＷＴ１ペプチド溶液を同一部位に皮内投与する免疫方法で効率的にペプチド特異的ＣＴＬが誘導されることが示された。

ＷＴ１ペプチドとＩＦＮ−αとの併用による抗原ペプチド特異的ＣＴＬ誘導効果
１．材料と方法
１）ペプチドおよびマウス
実施例３と同様に調製した。
２）非特異的免疫賦活物質
非特異的免疫賦活物質としてマウスＩＦＮ−αを用いた。ＩＦＮ−αは、酪酸ナトリウムで前処理したマウス細胞株ＥＡＴ細胞（エールリッヒ腹水癌由来、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７７）にニューキャッスル病ウイルスを感染させ、テオフィリン処理することにより産生させた後にＣＰＧカラムと坑ＩＦＮ−α抗体カラムで精製した。
３）免疫（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）スケジュールとＣＴＬ活性の測定
Ｄａｙ０にマウス腹側皮内に２００μｌのＩＦＮ−α（５×１０^４Ｕ相当）を投与し、翌日に同一部位に２ｍｇ／ｍｌのＷＴ１ペプチド（配列番号：４）溶液を０．１ｍｌ皮内注射した。マウスは３匹用いた。Ｄａｙ８以降、実施例と同様にペプチド再刺激を行い抗原ペプチド特異的ＣＴＬの活性を測定した。ただし再刺激用の脾細胞は３匹のマウスの脾細胞を合一して調製した。
２．結果
図５に結果を示した。脾細胞は抗原ペプチドをパルスしていない標的細胞に対してよりも抗原ペプチドをパルスした標的細胞に対して強い細胞傷害活性を示した。この結果よりＩＦＮ−αを皮内投与した翌日にＷＴ１ペプチド溶液を同一部位に皮内投与する免疫方法で効率的にペプチド特異的ＣＴＬが誘導されることが示された。

ＷＴ１ペプチドとクレスチンとの併用による抗腫瘍効果
１．材料と方法
１）細胞
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の肺癌細胞株である３ＬＬにマウスＷＴ１のｃＤＮＡを定法により遺伝子導入して作製した細胞ＷＴ１−３ＬＬを用いた。
２）ペプチド
実施例１と同様に調製した。
３）非特異的免疫賦活物質
非特異的免疫賦活物質として、担子菌由来多糖類の抗腫瘍剤クレスチン（三共株式会社）を購入して用いた。
４）腫瘍細胞の移植と免疫（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）スケジュール
ＷＴ１−３ＬＬ細胞５×１０^４個をマウスの皮下に移植し、翌日より免疫を開始した。クレスチン１００μｇをマウスの側腹部へ皮内注射し、２４時間後に同一部位に２ｍｇ／ｍｌのＷＴ１ペプチド（配列番号：２）溶液を０．１ｍｌ皮内注射した。これを１クールとし、１週間おきに計３回免疫した。
２．結果
腫瘍細胞移植日を０日として、ワクチン投与を３回行った後の１８日目の腫瘍径を測定した結果を図６に示した。クレスチンとＷＴ１ペプチドを投与した群では、５匹中３匹で腫瘍の生着が認められなかった。一方、非免疫群（５匹）、ペプチドのみを投与した群（５匹）、クレスチンのみを投与した群（４匹）では、全例で腫瘍の生着が観察され、平均値はクレスチンとＷＴ１ペプチドを投与した群より大きかった。非免疫群と他の群の腫瘍径についてＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行ったところ、クレスチンとＷＴ１ペプチドを投与した群のみ有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。
これらの結果より、非特異的免疫療法剤とＷＴ１ペプチドを組み合わせることにより強い抗腫瘍効果の得られることが示された。

産業上の利用の可能性

本発明方法により、効率良く抗原特異的Ｔ細胞を誘導することができる。本発明の抗原特異的Ｔ細胞の誘導方法および関連する医薬組成物は、効率よくかつ簡便に抗原特異的Ｔ細胞を誘導することができるため、抗癌剤または抗ウイルス剤として有用である。

図１は、腫瘍細胞の移植、およびＷＴ１ペプチドと各免疫賦活物質による免疫（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）のスケジュールを示す。
図２は、腫瘍細胞移植後３５日目までのＷＴ１ペプチドおよびアンサー投与における腫瘍長径（ｍｍ）を示したグラフである。図中、●はＷＴ１ペプチド＋アンサー投与の結果を、◆はアンサー投与の結果を、そして■は非免疫の結果を、それぞれ示す。
図３は、腫瘍細胞移植後３２日目までのＷＴ１ペプチドおよびブロンカスマ・ベルナ投与における腫瘍長径（ｍｍ）を示したグラフである。図中、●はＷＴ１ペプチド＋ブロンカスマ・ベルナ投与の結果を、◆はブロンカスマ・ベルナ投与の結果を、そして■は非免疫の結果を、それぞれ示す。
図４は、ＷＴ１ペプチドおよびピシバニール投与による抗原ペプチド特異的ＣＴＬ誘導効果を示したグラフである。
図５は、ＷＴ１ペプチドおよびＩＦＮ−α投与による抗原ペプチド特異的ＣＴＬ誘導効果を示したグラフである。
図６は、腫瘍細胞移植後１８日目の腫瘍径（ｍｍ）の平均値を示したグラフである。１群は非免疫群、２群はＷＴ１ペプチドのみを投与した群、３群はクレスチンのみを投与した群、４群はクレスチンとＷＴ１ペプチドを投与した群を示す。図のカラムに付随したバーは各群の標準偏差を示す。

配列表

Claims (2)

1. 活性成分としてArg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu（配列番号：２）およびCys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu（配列番号：４）より選択されるWT1由来の癌抗原ペプチドの治療学的有効量を含む医薬組成物（ａ）であって、
   活性成分としてＩＦＮ−αである非特異的免疫賦活物質を含む医薬組成物（ｂ）を癌患者にあらかじめ皮内投与し、その１２−４８時間後に、医薬組成物（ｂ）の投与部位と同一部位に皮内投与される物であることを特徴とする、癌患者を治療するための医薬組成物。
   
2. 医薬組成物（ａ）および（ｂ）による投与サイクルが複数回繰り返されることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
   
   
   

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