WO2007066423A1 - Ａｍａｃｒ由来の腫瘍抗原ペプチド - Google Patents

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WO2007066423A1
WO2007066423A1 PCT/JP2006/312788 JP2006312788W WO2007066423A1 WO 2007066423 A1 WO2007066423 A1 WO 2007066423A1 JP 2006312788 W JP2006312788 W JP 2006312788W WO 2007066423 A1 WO2007066423 A1 WO 2007066423A1
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WO
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peptide
hla
antigen
amino acid
amacr
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/312788
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English (en)
French (fr)
Inventor
Noriyuki Sato
Toshihiko Torigoe
Ichiya Honma
Yoshihiko Hirohashi
Kenji Harada
Original Assignee
Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/99—Isomerases (5.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the treatment methods for 002 cancer can be divided into two types. There is a ray in the law.
  • drug therapy such as systemic drugs and phonons is mainly given by oral administration.
  • 40 after healing by the topical method healed by 7 to 0 in some way.
  • these 50 surgical methods and radiation therapy are used, but the remaining 50 degrees is the present condition, and it is thought that two major measures will be necessary for the treatment of these people in the future. It is received.
  • 000 3 is to increase the rate of treatment by early detection.
  • a molecular therapeutic agent having an incept has been frequently introduced in recent years as a therapeutic agent which does not have the action represented by the conventional myelopathies. For example, it is a tin for the He 2 child that appears, and a kinase for the emerging epithelial volume (EGR). That is why strong results have been reported.
  • C main-textile-adapted gene complex class 1
  • human progenitor main-textile-adapted gene complex class 1
  • vaccine which makes it possible to induce or enhance C in humans. It was As the 0007 tank, in 1991, T. Boon et al. Named the first G-tank quality (see). Its tank quality is mainly composed of cells.
  • AMACR apha meh ac CoA acease
  • apha meh ac CoA acease is an enzyme that contributes to branching and stroma, and is known to be a molecule whose expression is specifically elevated in the tissues of prostate cancer.
  • AMACR Increased AMACR titers have been observed in individuals with adenocarcinoma (see 2).
  • AMACR SRNA to reduce gene expression in prostate cancer that expresses AMACR, lower cells were observed, indicating that AMACR is also important for the control of prostate cancer. Is shown (see 3).
  • AMACR is a useful protein as a vaccine.
  • AMACR has been shown to be a method (tank) for prostatic adenocarcinoma, and it has been revealed that it will be useful for a vaccine method for prostate cancer patients.
  • AMACR is up-regulated not only in prostate cancer but also in tissues (AmJ gPaho 26926 931 (2002) H mPaho 4792 796 (2003) AmJ gPaho 9 (3) 381 389 (2005) App. mm nohs ochemMo Mo pho 3252 255 (2005)). Since it was revealed that AMACR is a protein, the expression level is increased similarly to prostate cancer (colorectal cancer, lung cancer, liver, gastric cancer, uterus). However, the Ming Tank AMACR and its are considered useful.
  • the amino acid at the 2-position of the amino sequence described in m 5 is substituted with nitrogen, alan, methionine, or toluene, or the C-terminal amino acid is substituted with alan, in, isoin,
  • the amino acid at the 2-position of the amino sequence described in (9) 24 to 33 which consists of an amino sequence substituted with a toppan or an on, and which is recognized by combining with the four sources. Containing an amino group substituted with in, methionine, benzene, isone, or guanine, or a C-terminal amino acid substituted with quinone or quinone,
  • C is a protein containing the amino acid sequence shown in Sequence 2, described in (14) above,
  • the clear AMACR and the native AMACR, or the nucleic acid containing them can be effectively used as a vaccine. Further, the above AMACR can also be effectively used as a component such as H A tetra for detecting CT.
  • the clear tank AMACR contains the sequence of amino acids shown in SEQ ID NO: 2 or a similar sequence.
  • Ming AMACR may or may not be a tank derived from a natural product (eg, prostate adenocarcinoma).
  • amino acid described in SEQ ID NO: 2 is AMACR (apha registered in the GenBank database as Acces ssonNo NM014324 AccessonNo NP055139. Meh ac CoA acemase).
  • the tank containing the ano sequence described in 2 above specifically means a tank composed of the ano sequence described in Sequence 2 or a tank containing the ano sequence described in Sequence 2. , And a tank consisting of an ano row with another ano row added to its side and / or C.
  • the other ano may be an ano sequence of genes outside AMACR.
  • the tank containing an anologous sequence similar to the anologous sequence described in 2 above specifically includes the following tank qualities (a) to (c) (a.
  • a plurality of ano acids are the tanks containing the ano series that have been replaced and / or added, and the tanks have the properties as a tank.
  • More preferable is a protein consisting of an amino acid sequence similar to the amino acid sequence shown in Sequence 2.
  • Examples of tanks that are similar to those described in 2 are the tank qualities listed in (a) to (c) below.
  • a plurality of ano acids are the tanks consisting of the ano series that have been replaced and / or added, and the tank quality is the property of the tank.
  • a tank containing an ano sequence in which a plurality of ano acids are substituted and / or added is an artificially prepared modified tan. , Which means a foreign substance existing in the living body.
  • an index for determining an anion that loses activity, and how it should be replaced and / or added should be found using a program well known to those skilled in the art, for example, DNA a So we.
  • the atypical number is typically within 0 of the anoic acid, and preferably within 5 of the anoic acid.
  • the anoic acid to be replaced is an anoic acid having similar properties to those before substitution, such as: sex, charge, solubility, sex, hydrophilicity and amphiphilicity in terms of the structure of the protein. I like that.
  • Va, eL, ne P, M, and P e Tp are amino acids that are mutually classified as anoic acids
  • G, T, and CT Asn Gn are anoic acids that are mutually classified as anoic acids.
  • Asp G is an anoic acid that is classified as an acidic anoic acid
  • s and 9 Hs are anoic acids that are classified as a basic anoic acid. Therefore, it is possible to select the anoic acid which belongs to, using these as indicators.
  • a tank containing an amino acid sequence exhibiting the homogeneity on the amino acid 70 described in 2 is, for example, the amino acid described in 2.
  • Examples include a protein containing an amino acid sequence exhibiting a homogeneity of 70, more preferably 80, even more preferably 90, and most preferably 95. Physically, it includes a protein that is composed of subsequences of the amino sequences shown in Sequence 2.
  • homogeneity refers to two tanks, sequence homology and homology.
  • Unisex is determined by comparing the two optimally aligned sequences over a range of comparative sequences.
  • the comparative tank quality may have additions (eg, etc.) in the proper alignment of the two columns.
  • sequence homogeneity can be calculated, for example, by using Vec o NT to create an alignment using the C saW asm (N cecAcdRes 22 (22) 4673 4680 (1994)). it can.
  • Sequence identity is determined using sequence software, specifically Veco NT, GENETYX MAC analysis software provided by public databases. Databases are generally available, for example, in the homepage ad hp wwwddb ngac p.
  • the ano string described in 2 in 002 (c) is the doc sequence of the ano sequence described in 2 above 40, preferably 60, more preferably 70, and more preferably 80.
  • more preferably above 90, and most preferably above 95 are groups containing a group of groups having a homogeneity.
  • the base sequence described in the sequence is 40, preferably 60, more preferably 70, more preferably 80, even more preferably 90, most preferably 95 or more.
  • a group containing a group sequence having properties More specifically, there may be mentioned a quat consisting of a subsequence of the base sequence described in the sequence.
  • the stringent conditions are Be ge and K e 1987 G de oMoec a C n ⁇ ngTechn ⁇ q esMeh ds ⁇ nEnz m g V ⁇
  • the complex can be determined based on the T of the nucleic acid binding the p.
  • C (20X C indicates 333mM od C ae 333mMNa), a condition containing 42 in a solution containing 0.5D and 50hom, or The conditions include 65C in a liquid containing C (not including 50H).
  • washing conditions after erasing can be C, 0.1 D 37C. It is preferable that the target disease state is maintained even under certain conditions. No particular restrictions, but as a more severe issue.
  • a splicing ant of human AMACR described in GenBan AccessonNoNM203382 Access onNo NP976316 is exemplified.
  • the clear tank AMACR has the character of a tank.
  • the term “tank” as used herein means to exhibit activity by the existing method for determining the activity of a tank. Physically, for example, cells expressing AMACR are recognized by CT, that is, they are responsive to CT, in other words, they are derived from a clear tank and a protein that activates CT. Indicates the quality that induces CT.
  • the cells in the paragraph 003 are preferably cells expressing H A.
  • the above-mentioned sex as a tank is more specifically expressed by expressing an apparent tank quality in cells expressing HA such as HA A24 and HA A2. It refers to the substance that is displayed on the cell surface when combined with the HA source, and is thus recognized by this CT, that is, that CT is activated (CT is induced).
  • an expression vector containing a DNA containing a protein and an expression vector containing a DNA containing a HA are transduced into a cell such as 293 EBNA (nvogen).
  • DNA to be used here include DNA to be H A A24 and DNA to be H A A2.
  • DNA to be carried by H A A24 include cDNA of H A A2402 (Cance Res. 55 4248 4252 1995) Genbank Accesson NoM64740).
  • H A A0201 cDNA (GenBankAccNoM84379) can be mentioned.
  • the 003 trans can be obtained, for example, by the Kuching method using kun (GBCOBR). It can be adjusted by adding a restricted CT to the used HA source and measuring the amount of cytokine (eg, N 2) produced by the reaction of CT (eg, S method).
  • a CT prepared by stimulating human cells with the tank AMACR of the present invention or a CT prepared by the method described in n Cance 39 390 396 987 N Eng Me 333 03 8 1044 995 etc. is used. You can
  • the tan tan quality can be adjusted for nVvo CT property by using, for example, the substance used (WO 02 47474 report, n J Cance 00565 570 2002).
  • the clear protein can be produced from a natural product (for example, a prostate cancer strain) by a method of purifying the protein itself.
  • the protein of the present invention described below can also be produced by transforming a nucleic acid containing a nucleic acid.
  • Ming Akira's original (hereinafter sometimes referred to as the present Akira) contains the aforementioned Akira's tank AMACR's original and is recognized by CT in combination with HA source. That is, it contains a part of the above-mentioned tank AMACR of the above-mentioned tank, It may contain as long as it exists in the anodic region of the clear tank, as long as its combination with the original can be recognized by CT.
  • composition of the pep can be carried out according to the method generally used in the science.
  • the law is based on the literature (Pep de y hes s) ne scence NewYok 966 ⁇ The Po ens Vo 2 AcademcPess nc ⁇ NewYok 976 Co., Ltd. 1975
  • HA A24 has a anoic acid at the 2-position of 8 to ano, which is alan, methionine, or toluene, and an amino acid at the C-terminal is alan, an amine. , Isone, toppan, or on (mm no ⁇ 52 3913 994 mm nogene cs4 p178 1995 mm no ⁇ 55p4307 1994).
  • the H A A2 tips the following tips are known (mm nogene cs4 p 81995 mm no ⁇ 55p47491995).
  • the expression plus that expresses is expressed against, for example, cells introduced into 293 EBNA (nvogen), and the restricted CT is reacted with a source of the type that is considered to present It can also be quantified by measuring the amount of cytokines (eg N) produced by humans (ExpMed 187 277 1998).
  • cytokines eg N
  • examples of the H A source include H A A24 and H A A2 sources.
  • H A A24 is selected, the cDN of H A A2402 (Cance Res 55 4248 4252 1995) Genbank Ac esson NoM64740) can be used as the HNA-added cDNA.
  • H A A2 the cDN of H A A2402 (Cance Res 55 4248 4252 1995) Genbank Ac esson NoM64740)
  • H.sub.AA201 cDNA (GenBankAccNoM84379) can be used as the H.sub.A cDNA.
  • CT it is possible to use the CT established by the method described in n Cance 39 390 396 987 N Eng Me 333 038 1044 when prepared by the stimulation of human spheres.
  • the sex at nVvo can be adjusted.
  • the array sequence 2 As an example of the above description, the array sequence 2
  • AMACR AMACR composed of rows, which is combined with HA source and is obtained by CT.
  • HA Have shown that they bind to HA A24 or HA A2 sources.
  • 8 to 4 amino acids are preferable, and 8 to 10 amino acids are more preferable.
  • sequences 3 to 33 contains an amino acid sequence described in the deviation of sequences 3 to 33, and is recognized by CT in combination with the A source.
  • the preferred examples are 9 to 4 amino acids, and more preferred are 9 to 10 amino acids. More specifically, for example, for A A24 compatibility, sequences 3 to
  • It is composed of the ano sequences described in 23 shifts and is recognized by CT by binding to the H A A24 source (2). More preferably, it comprises the amino acid sequence described in Sequence 3, Sequence 4 or Sequence 5.
  • H A A2 compatibility includes the sequence of amino acids described in sequence 24 to 33, which is recognized by CT by binding to H A A2 ((3)).
  • ano means the substitution, deletion, or addition (including the addition of an anoic acid at the C-terminal and the C-terminal) of the ano, preferably the ano conversion.
  • modification relating to the substitution of an ano it is optional as long as the properties of the substituted ano and and are maintained, but as described above, is usually 8 to 4 ano. I like a few boxes. For clarity, 8 to 4 ano is preferred, but HA DR DP D may be 14 ano long.
  • the anoic acid at the 2-position out of 8 to ano is hydrogen, alan, methionine, or toluene, which is presented by binding to HA A24.
  • the amino acid at the C-terminal is alan, in, inisone, toppan or on (mm no ⁇ 52p39131994 mm nogene cs4 p1781995 mm no 155p4307199 4).
  • the anoic acid at the 2nd position from 8 to ano is inn, methionine, nin, isoin or tan, and the C-terminal anoic acid is inn or inn.
  • OO49 which has an amino acid sequence which is substituted at any of the known amino acid positions, and which has a property.
  • Ie HA A24 compatibility as shown in 3-23 The 2-position anoic acid is substituted with nitrogen, alan, methionine, or toluene, or the C-terminal anoic acid is substituted with alan, amine, ethane, or toluene. Or contains an on-sequence replaced by
  • the anoic acid at position 2 of the amino sequence is substituted with in, methionine, benzene, isone or tan, or It is preferable that it contains an amino acid sequence in which the C-terminal anoic acid is substituted with an amine or an amino acid, and is recognized by C by binding to the HA A2 source.
  • Akira also includes toppe containing the above Akai.
  • top refers to having an action of activating C 4 cells (mm n ⁇ 751 994), and for example, T 947 967 due to 84 hepatitis caused by hepatitis and the like are known.
  • C 4 activated by the top, leading and holding of C activation, and qua It is considered to be important for the answer, because it can be used effectively. This is the Top CT
  • Toppe is connected with a number of CT tops (), or is connected with (2) CT topps, and is subjected to antigenic setting.
  • the resulting product is presented to the antigen cell and is defined as having the CT property.
  • the CT top to be used is HAA A0201 A0204 A0205 A0206 A0207 A A24 A A6801 B7 which is the original AMACR represented by Sequence 2.
  • B8 B2705 B37 B55 Cw0401 Cw0602, etc. include restricted C tops.
  • CT tops from other tumors are also available. It is possible to connect more than one of these CT tops, and the CT tops of these can be analyzed by analysis of the binding to various HA molecules (mm n. G. N. 4 1178 995). , 8 to 4 degrees can be mentioned.
  • top to be connected to Ming is a top
  • examples of the top to be used include c 28 4 due to hepatitis and T 947 967 due to gout. Also As a measure, it is possible to mention 13 to 30 degrees, and preferably 13 to 7 degrees.
  • the above-mentioned number of tops connected can be manufactured by the general production method as described above. It is also possible to manufacture a toppe that is a concatenation of these multiple topologies by using ordinary DNA and gene engineering techniques based on the reports of the doctor. In other words, we put the vector into the vector of knowledge and obtain
  • the vector can be produced by transforming a host cell with the vector, culturing the transformant, and recovering the toppe to which a desired number of topologies are ligated. As described above, these can be carried out according to the method described in the literature (Moec a Conng T. Mana se a C Habo a (1983, DNAConng DMGove R PRE (1985)).
  • CT is obtained by subjecting the toppe produced by connecting a number of tops manufactured as described above to nVvo using the items described in nV o, WO02 47474 and n J Cance 00565 570 2002) described above. Sex can be measured.
  • examples of the modification of the ano group of anoic acid include an achi having 3 to 6 carbon atoms, a quaki, and an azo group.
  • Cai a C6 to C6 group substituted with a group, a C5 to C7 quasi group with a C5 to C6 group, a C6 to C6 ax, a C2 to C6 group
  • cabs cabs that have been converted with fluorine groups
  • Modification of the C anoic acid group includes, for example, Examples of adducts include adducts having a carbon number of 6 to 6, a carbon group having a carbon number of 6 to 6 substituted with a group, and a quasi ester having a carbon number of 5 to 7. Specific examples other than the addition include an ad, an adduct having a carbon number of 6 or an acyl group substituted with 2 and an ad group having a carbon number of 6 substituted with a group of 2 or 2. The substituted ad, the nitrogen atom of the ad group 005 8 3)
  • Akira is, specifically,
  • the AMACR doc may be any of the following: cDNA, RNA CRNA, genomic DNA, or synthetic DNA of cells or tissues derived from, for example, prostate cancer. It may be in the state of 1 or 2. Physically, a quan containing the base sequence described in (a),
  • the base sequence described here corresponds to the opening of the AMACR gene registered as Access on No NM014324 in GenBank database.
  • sequence shown in Sequence 2 is the sequence of AMACR registered as AccessonNo NM014324 AccessonNo NP055139 in the GenBank database.
  • the quant containing the base sequence for the amino acid sequence described in 2 means a quat or sequence consisting of the base sequence described in the sequence.
  • An example is a quat consisting of a base sequence that adds the amino acid sequence described in 2.
  • a quat consisting of the base sequence described or a base sequence in which another base sequence is added to the 5 side and / or 3 of the base sequence containing the amino acid sequence described in Sequence 2 is exemplified.
  • the other base sequence may be, for example, a base sequence that carries a gene other than AMACR.
  • Any AMACR doc may be used as long as the quality of the tactics given by the quo has properties as a tactic.
  • Quo containing the base sequence described in 006 is the base sequence disclosed in GenBankAccesson No NM014324, or the corresponding part of the base sequence disclosed in the present specification is an id version.
  • a person skilled in the art can easily carry out the process according to a basic document such as p ngHabo abo ao Pess 1989).
  • the quan of (a) or (b) is quantized under a stringent condition, and the quality of the tank carried by the quanto has the property of being a tank.
  • (D) (d) (a) or (b) is a quan containing a base sequence exhibiting homogeneity on the cu 7, and the tank quality of the cu Have a quo,
  • Quo having a base sequence similar to that of (a) or (b) include the following () to (e): (c) (a) or (b) The qualities that are tanks under stringent conditions and that the tank quality of the tanks possesses the characteristics of tanks (d) (a) or (b). ), Which is a group consisting of a base sequence showing the uniformity on the quo 7, and the quanity of the quanties possessed by the quanta has the property as a tan.
  • the quantified amino acid sequence is substituted and / or added.
  • the quanties that are carried by the poqu have quanity.
  • the equos under the stringent condition for the qua of (a) or (b) means, for example, on the base sequence 40 of the qua of (a) or (b) above, Preference is given to quo which contains a base sequence having a homogeneity of above 60, more preferably above 70, more preferably above 80, even more preferably above 90 and most preferably above 95. Physically, it may be, for example, a quan consisting of a subsequence of the quan of (a) or (b).
  • the idea can be prepared according to the method described in the basic text such as Mo ec a Conng2ndEd Cod p ngHabo abo a o Pess 1989) or a method according to it. When a commercially available liar is used, it can be done according to the method described in the document.
  • the stringent conditions are Be ge and K e 1987 G de oMoec a ConngTechnq esMehods nEnz oog Vo 52 AcademcPess anDego CA) EMoec a Conng2ndEd Cod p ngHabo abo ao Pess 1989), the complex can be determined based on the (Tm) of the nucleic acid binding the p.
  • the washing conditions after erasing can be C, 0.1 D 37C. It is preferable that the target disease state is maintained even under certain conditions.
  • the more severe cases are 0 ⁇ C and 0.1D 42C degrees, and the more severe cases are 0 ⁇ C and 0.1D 65C degrees.
  • a quo containing a base sequence showing homogeneity on the quo 7 of (a) or (b) is, for example, a base sequence 70 of the qua of (a) or (b) above. And more preferably 80, even more preferably 90, and most preferably 95. Physically, it may be, for example, a qua consisting of a subsequence of the qua in (a) or (b).
  • homology means the homology and homology of sequences between two quanta.
  • Unisex is determined by comparing the two optimally aligned sequences over a range of comparative sequences.
  • the comparative quanta may have additions (eg, etc.) in the proper alignment of the two columns.
  • the homogeneity of the sequence can be calculated, for example, by using Vec o NT to make an alignment using the C saW asm (N cecAcdRes 22 (22) 4673 4680 (1994)).
  • Sequence homogeneity is determined using sequence code, specifically the analysis code provided by Veco NT GENETYX MAC public database.
  • the database is, for example, It is generally available in page address hpw and ddb ngac p.
  • a quat having such sequence homogeneity can be prepared by the above-mentioned conventional ordinary PC reaction, or by the following quat (, addition, substitution) reaction.
  • an index for determining an anion that loses activity, and how it should be replaced and / or added should be found using a program well known to those skilled in the art, for example, DNA a So we.
  • the atypical number is typically within 0 of the anoic acid, and preferably within 5 of the anoic acid.
  • the anoic acid to be replaced is an anoic acid having similar properties to those before substitution, such as: sex, charge, solubility, sex, hydrophilicity and amphiphilicity in terms of the structure of the protein. I like that.
  • Va, ne P Me, and Phe Tp are amino acids that are classified as anoic acids
  • G, e, TCT Asn Gn are anoic acids that are classified as anoic acids
  • Asp G is an anoic acid that is classified as an acidic anoic acid
  • s and 9 Hs are anoic acids that are classified as basic anoic acids. Therefore, it is possible to select the anoic acid which belongs to, using these as indicators.
  • This tank is, for example, Moec a Conng2nd Ed ⁇ C. d p ngHabo "b.” P. (1989) and other basic methods, for example, mutagenesis and PCR. It can also be produced by a method such as the Gappedd pex K nke method using a commercially available kit.
  • tank means that it is more active than the existing method for determining the activity of a tank.
  • CT cells expressing AMACR doco are recognized by CT, that is, they are responsive to CT, in other words, the clear tank AMACR is derived from it.
  • Nucleic acids containing clear quanta can be in the 1 and 2 deviated states. In addition, it is possible to take the form of deviation of DNA NA.
  • a vector for expressing the light protein can be prepared by inserting the light quanta into the expression vector.
  • Ming is also a vector created by inserting 2 quantities of Ming into an expression vector.
  • the expression vector used here can be selected according to the purpose of the host to be used, and examples thereof include plus, vector, and vector.
  • examples of the vector when the host is the large intestine, examples of the vector include pUC 18 pUC 9 pBR322 pC R3 and other vectors, and ZAP and 11 and other vectors.
  • examples of vectors include pYE 2 pYEUa3. In the case of the main cell, pAc GHsNT A etc. can be mentioned.
  • examples include pCEP4 pKCR pCDM8 pG 2 pcDNA3 pRc R V pRc CMV and other vectors, and twisvectors, adwisvectors, adwisvectors, and other vector vectors.
  • the vector may be a gene that expresses a gene, a gene that encodes a gna sequence, a selection gene, a gene, or the like. Further, a sequence which is expressed as a quinque, Hs, or a GT (Glutathione translase) may be added to facilitate isolation.
  • the host computer ac
  • GT tank PGEX4T with p, CMV V40, etc. , Etc., Hs, etc. (eg pcDNA3M c Hs), and further, a kectan and a Ks that expresses a protein with Hs (pET32a), etc. can be used.
  • a cell containing the vector By transforming a host with the prepared expression vector, a cell containing the vector can be prepared.
  • Examples of the host used here include large intestine, mother, animal cell and the like. As a rule, E. . Examples include K 2 strain HB 01, C600, M09, DH, and AD494 (DE3) strains. Examples of mothers include succession and sevice. Examples include 929, BA B c3T3, C127, CHO, O 2, Ve o, Hea, and 293 EBNA cells. Examples include sfg.
  • a normal method suitable for the cell may be used. Physically, it is a DEAE kisstran.
  • Examples include the method of using Coptons, genes, and (poec a ne poc n Gbco B). After the introduction, the cells introduced with the vector can be selected by culturing in a normal place containing the selection vector.
  • AMACR clear tank
  • the obtained protein can be further isolated / isolated by a general method.
  • the stage include salting-out, ion chromatography, adsorption chromatography, activity chromatography, and chromatography.
  • the clear protein when expressed as a tank with the above-mentioned Kin Hs, GT, etc., it can be purified by a purification method using the quality of these tanks.
  • the light source may be in the DNA or RNA state. It may be in the state of 1 or 2.
  • Doc's can be easily constructed based on the reports of Ming's and the DNA it carries. Physically, it is possible to produce it by ordinary DNA synthesis or amplification by PCR and the like, and specifically, the above-mentioned dope.
  • Nucleic acids containing light and dark quanta can be in the 1 and 2 deviated states. It can also be a form of DNA NA shift.
  • the vector for expressing the light (tope) can be prepared by inserting the light quo into the expression vector.
  • the expression vector host used here and the method for changing the host cell are the same as those described above.
  • an antigen cell can be prepared by in-contacting with the cells having the above-mentioned light tank, pep, and the difference. Physically, a cell method characterized by in-cells having a conventional separation, a light tank, a pep and a gap between
  • the cell having is not particularly limited as long as it is a cell which is expressed on the cell surface capable of presenting the light, and is particularly preferably high in antigen.
  • the substance added to prepare the cells of the above-mentioned cells from the cells of the above may be the tank of light, the pep and the difference thereof.
  • the cell of the present invention When the cell of the present invention is prepared by introducing the acid of the present invention into cells having the above, it may be in the form of DNA or RNA. Physically, it is possible to refer to Cance Res ⁇ 56p56721996 and ⁇ mm no ⁇ 161 p56071998 of DNA, and ⁇ Exped ⁇ 184 p4651996 of RNA.
  • cells with an antigen were isolated from prostate cancer patients whose HA type is HA A24, and cells containing the sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or HA It is obtained by presenting the combination of Hara and the above.
  • CT CT-guided method characterized by in-coming and clear tanks, peppers, and deviations of CT, and CT-guided by the law.
  • Metastasis was observed by stimulating with TRP 2, proliferating specific CT, and administering CT to the mouse (ExpMed 1854531997). This is based on the result of in-proliferation of CT that specifically recognizes the combination with H A source on the antigen.
  • a light tank, pep, or nucleic acid to stimulate the cells in situ to increase the CT and then return the CT to the patient.
  • the CT used in the method 00887 is prepared by isolating the patient's bulb and stimulating it in vitro with light tank, pep, or nucleic acid (Jo na O Expe mena Medcne 999 9061669).
  • 008 Ming CT is the difference between Ming tank, Pep and
  • CT kun can be either a single CT kun or a CT compound () consisting of different types of kn. Physically, there can be mentioned, for example, a CT that specifically recognizes the combination with the H A A24 source consisting of an amino acid sequence described in 3, 4, or 5.
  • the clear tank, pep, nucleic acid, antigen, and CT described above can be used as active ingredients of medicines by making them into appropriate forms according to their respective qualities. It can be used as an active ingredient of Ming, CT, that is, vaccine. Explain physically. Of CT containing 990 ⁇ ⁇
  • the light tank AMACR Since the light tank AMACR has CT use, it can be used as an active ingredient of (vaccine) for the prevention or prevention of ulcer. That is, it is possible to treat or prevent CT, which has a clear protein as an active ingredient.
  • CT which has a clear protein as an active ingredient.
  • the protein When the protein is administered to a tumor, it is taken up by the antigen, and it is produced by cell lysis, but it binds to the HA source to form a complex, and the complex is presented on the antigen surface. CT proliferates and destroys cells efficiently. As above, prevention of ulcers is achieved.
  • CT which contains the clear protein as an active ingredient. Physically, it can be used for () or treatment of, for example, prostate cancer, colon cancer ,, lung cancer, lung cancer, liver cancer, gastric cancer, uterine cancer, or the like.
  • CT containing a clear protein as an active ingredient should be administered as a pharmaceutical-acceptable carrier, for example, as a mixture of such agents, or in combination.
  • cytokine means, for example, N 2 GM C 2
  • cytokines may be naturally occurring or gene components. These cytokines can be obtained and used if they are already on the market.
  • a gene composition for example, based on the nucleotide sequence registered in the database such as GenBank EMB or DDB, the desired gene is cloned by an ordinary method and ligated to an appropriate expression vector. Expression can be achieved by transforming a host cell with the vector prepared as described above.
  • examples of the conductor include QA (Acc a eChe ca cen 66CCo p) Q 2 (Aq aBopha ace ca s nc), which is a component, or tin (GMA A DRCH, etc.).
  • the conductor is, for example, the original quality of ctocera.
  • the product manufactured by Won
  • the product includes, for example, a (wo) drug formulation, an in-water (ow) drug product, and an in-water (wow) drug product.
  • the posome formulation is a fine particle in which the active ingredient is encapsulated in or in a porosity.
  • Phosphine, inn, etc. are mentioned as important qualities for making a posum, and to this, by adding stos, phosphidine, phosphine, etc., electricity is applied to the pom and stable.
  • Monkey Examples of the method for producing the posome include ultrasonic method, tan, te, reverse, and chip structuring.
  • the active ingredient is dispersed in the tox, which is composed of high quality polymer stock.
  • the stock for the stock includes biodegradable molecules such as ann, gelatin, chitin, sun, starch, po, and poachiaact.
  • As a method for producing an ixa agent according to (E Pha Bopha 50129 146 2,000 Dev Bo and 9263 78 998 Ph m ⁇ Bo echno 0 43 997), etc., there is no particular limitation.
  • the active ingredient as the quality and the film quality
  • Membrane molecules such as methesses, cesium acetate, thymoses, gelatin, gelatin and arabicum, thoses, pores, and hydrapicose are used as quality-imparting materials.
  • Examples of the method for producing Ikucapse preparations include acetone and legal methods. Examples of the method include administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, and intravenous administration. However, it is usually 0.009-9, preferably 0.009-9, and more preferably 0.009-9, but more preferably 0.009-9, more preferably 0.009-9, more preferably 0.009-9, but more preferably 0.009-9, more preferably 0.009-9. Is 0.9 to 9 and it is preferable to give this within a few days.
  • Akino has CT properties. Guided CT can be useful for cells and for the production of kine. It can be used as an active ingredient of vaccines for preventing or preventing ulcers.
  • the substance of the present invention is presented to the HA source of the antigen cell, and the combined CT with the presented HA source can proliferate and destroy the cell. Therefore, the treatment of the patient can be prevented.
  • CT which has Akimino as the active ingredient. Physically, it can be used for () or treatment of, for example, prostate cancer, colon cancer ,, lung cancer, lung cancer, liver cancer, gastric cancer, uterine cancer, or the like.
  • CT can be efficiently induced by Peupé.
  • it is taken up by the antigen and ,
  • the aggregates are presented at high density on the antigen surface, and the CT specific to the aggregates proliferates efficiently and destroys the cells. In this way ulcer or prophylaxis is achieved.
  • CT having 0103 Akira of the active ingredient for example,
  • CT of which is an active ingredient is mentioned. More preferred is a CT containing as an active ingredient an array of sequences described in Sequence 3, Sequence 4 or Sequence 5.
  • CT containing the active ingredient of 0104 as an active ingredient can be administered as a drug, for example, as a mixture with a suitable agent, or in combination.
  • Examples of the 105 method include administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, and intravenous administration. However, it is usually 0.009 to 09, preferably 0.000 to 10 mg, and more preferably 0.9 to 0.9, depending on the patient's age, and body weight. It is 9 and it is preferable to give this in a few days.
  • a CT having clear acid as an active ingredient can be treated or prevented by, for example, administering and expressing clear acid to a person.
  • the antigenic protein quality is enhanced.
  • the cells produced by cell lysis are bound to the source to form a complex, and the complex is highly densely presented on the antigen surface, whereby C efficiently proliferates and destroys the cell. As above, ulcer or prevention is achieved.
  • Examples of a method using a whistle vector include incorporating the obvious material into a whistle or a whistle such as a twis, an adices, an adices, a swiss, a wax awis, a poxwisse, a poowis or an nbiswis. How to enter. Among them, the method using towice, adice, adweiss, wax awis, etc. is particularly preferable.
  • nVvo method is preferred.
  • the 0110 nVvo method When administered by the 0110 nVvo method, it can be administered by an appropriate administration route depending on the therapeutic disease. For example, it can be administered to veins, arteries, subcutaneously, skin and muscle.
  • the form is as follows: Generally, it is an injection containing the active ingredient, clear acid, and, if necessary, a pharmaceutically acceptable drug (). You can add it.
  • posomes or posomes containing clear acid Sendaiwis (HV) posomes, etc.
  • they can be in the form of suspensions, freezes, and centrifugal posome formulations.
  • nucleic acid quantification is from 0.00 g to 09, preferably from 0.009 to 9 It is preferable to give the acid in a few days.
  • a high-performance computer or a high-performance computer that is connected to a CT computer has an efficient CT property at nVvo.
  • nVvo o na O mm noog 999 62 391 5 3925, HBV HLA A2 6 type, H A A
  • CT Since it has the use of light CT, it can be used as an active ingredient of a vaccine for the prevention or prevention of ulcer. It is possible to treat or prevent CT by administering to a person the function of CT, which has bright cells as an active ingredient.
  • CT cardiovascular disease
  • It can also be used for persons with AMACR properties of CT, which has bright cells as the active ingredient. Physically, it can be used for () or treatment of, for example, prostate cancer, or large intestine cancer, ..., lung cancer, cancer, liver, gastric cancer, uterine cancer, and the like.
  • CT having vesicles as an active ingredient preferably contains physiological saline or saline (PB) in order to stably retain antigen vesicles.
  • PB physiological saline or saline
  • the method include intravenous administration, subcutaneous administration, and administration.
  • the above-mentioned administration is exemplified.
  • Ming CT Since Ming CT has utility, it can be used as an active ingredient of a vaccine for preventing or preventing ulcer.
  • AMACR AMACR
  • it can be used for the treatment of () such as prostate cancer, colon cancer, lung cancer, lung cancer, liver cancer, gastric cancer, uterine cancer or the like.
  • physiological saline, saline (PB) physiological saline, saline
  • the method include intravenous administration, subcutaneous administration, and administration.
  • a body that specifically binds to Ming There is no particular limitation on the state of Akira, and it may be a kunno immunogenic body or a nokuna body.
  • the clear for example, the Ano sequences described in every 3 to 33
  • the clear for example, the Ano sequences described in every 3 to 33
  • the clear for example, the Ano sequences described in every 3 to 33
  • the obtained bone marrow is combined with the cells.
  • the prepared cells can be used (C en po ocos nMoec a Boog ed As s ea 1987) P b sh JohnW e and ons ec on 4 ⁇ o
  • agents include int agint, sodium hydroxide, as well as tin, poppo, pour-on, pep, oil emulsion, chimpet.
  • Tono and agents such as CG (Tran) actinium.
  • CG Tran actinium.
  • a body that recognizes pep and a body that neutralizes the sex can be easily prepared.
  • the body include attack toggler and immunological. It can be selected from epidemiological, immunological, radiometric (RA), conventional (EA), fluorescent or luminescent.
  • RA radiometric
  • EA conventional
  • fluorescent or luminescent the clear AMACR gene is expressed, and it is effective, for example, in the prevention of prostate cancer.
  • H A no, H A die, H A tetra, or H A penta containing a light H A source Also provides H A no, H A die, H A tetra, or H A penta containing a light H A source.
  • predicting the degree and amount of CT cells to () before treatment and adjusting the degree and amount of CT in () are as follows.
  • H A tetra is the 2 H
  • HA-no refers to a compound (monomer) obtained by synthesizing a combination of HA, 2-clon, and an antigen in the production of HA tetra.
  • 0121 HA dye refers to a fusion product of HA 9 (gun, eg, gG), and 2 kg of this fusion with an antigen (PocNa Acad c U Ag06671 6675 (1993)).
  • Such CT can be detected by, for example, binding a gG body to gG.
  • HA penta is a technology that has been developed in recent years, and it refers to the 5 pentamers that are polymerized with the HA precursor through the Co ed Co domain.
  • HA Since it is possible to recognize the union of the HA, it can be analyzed with a cytometer, etc. as with the HA tetra (hp ⁇ p Omm n C k) 0122. It can be synthesized, for example, by outsourcing to Pommne BD Boscences. At present, H A Tetra, etc., containing is also sold (Biology Research Institute, Inc., etc.).
  • HA no, Dye, Tetra, and Ta of Akira include HA No, Dye, Tetra, and Ta containing the HA A24 source consisting of the Ano sequence described in 3, Sequence 4 or Sequence 5.
  • H A tetra or H A penta in this CT output.
  • the bound CT can be easily selected or detected by the steps of H 124 H A tetra, H A tetra and H A penta, cytometh, and fluorescence microscope.
  • H H
  • HA tetra H
  • H HA tetra
  • H H
  • H H
  • H tetra H
  • H tetra H
  • H tetra H
  • H tetra H
  • H tetra penta which are recognized by, for example, sodium (PE), ossein net (TC), peg quinte pein (Pe CP), ian (APC), etc.
  • PE sodium
  • TC ossein net
  • Pe CP peg quinte pein
  • API ian
  • H A A24 (of H A A24 source), which is the component of H A no, Die, Tetra and Ta of Ming, is G. nbankA. . . . nN. ⁇ Based on the base sequence of H A A2402 disclosed in M64 740, it can be easily cleaved by the PCR method. In addition, H A A2 (original H A A2) can be easily cloned by the PCR method based on the basic sequence of the H A A0201 gene disclosed in GenBankAccNoM84379.
  • the H A A24 vector and the 2 vector are introduced into a colonic cell capable of expressing a protein and expressed.
  • a colonic cell capable of expressing a protein and expressed.
  • H A tetra can be prepared by mixing the combined H A combination with the known Avid in a 4 ratio.
  • the tank is manufactured by the above step.
  • a CT-containing living body PBMC
  • Ming HA tetra Ming HA tetra
  • degree of CT not bound to HA tetra etc.
  • measure the amount with a cytometer measure the amount with a cytometer.
  • RMA A 2402 cells into which the C gene was stably introduced were cultured at 26C for 18 times.
  • the cells were suspended in a nutrient solution OPT MEM (nvogen) containing 100 cc and cultivated at 26 C for 3 hours and at 37 C for 3 times.
  • OPT MEM nvogen
  • the cells were treated with PB, anti-HA A24 and anti-HA A2 at 4C for 30 minutes.
  • PB the cells further
  • E-viruses E-viruses
  • E-viruses E-viruses
  • E-viruses E-viruses
  • Ovab mn Ovab mn (8), which was reported to bind to H 2 Kb in the reference literature (EJ mm no 2 2891 991), showed low activity.
  • AMACR used for discussion AMACR 25 133
  • AMACR 83 191 (4) and AMACR 240 248 (5) were shown to bind very well to H A A 2402.
  • AMACR240 248 (5) in which H A A 2402 binding was observed in 2), CT guidance from peripheral neutrophils was performed by a method similar to that in the document U ⁇ mm no 691611 20002). Blood samples were collected from individuals with H A A 2402 adenocarcinoma, and the lymphocytes were separated by specific gravity and cultured using AMV nutrient solution (nvogen). After 24 hours, non-adherent cells were harvested and cultured with 10 U of AMV containing 2. For demonstration purposes, it was cultivated for 5 minutes with the adhesive, 0 UmL of AMV nutrient solution containing 4 and 10 Um of GMC, followed by addition of 0 M of VN and ng of TN. The culture was performed by adding 0 U of N 2.
  • CD8 cells were separated from the adherent cells by a CD8-conjugated Gnetic beads, and the cells were incubated with the above cells.
  • the remaining adherent cells from which CD8 cells had been isolated were cultivated in AMV territory containing PHA and U2, then cultivated in the cultivated PHA-excluded territory, and stocked as second and third cells. .
  • stock cells were added with the above cells for 2 seconds and cells irradiated with X at 5000 ad, and the second and third cells were performed. It was Third eye
  • cytotoxic activity of the cells after the acute period was determined by C-swat.
  • T138 cells with T2 cells lacking TAP and stably introducing HAA242 gene into T2A24 cells, with or without addition of pepAMACR24048 (5) or HV binding to HAA24 , Again NK Cell lineage myeloid leukemia K562
  • Cytotoxic activity was measured by adding 30 times as much Kuta (excited T) to 5 target cells and feeding them 4 times.
  • Figure 2 shows the results for 7 cases of adenocarcinoma.
  • T stimulated with AMACR240 248 (5) and the peptide-treated H A A 2402-type T2A24 cells were injured, but the cells added with Pep and HV and H A A 2402 K562 were not injured.
  • CT induced by AMACR 242 248 from AMACR specifically impaired cells from H A A 2402 AMACR, indicating that AMACR 242 248 is.
  • AMACR tank which is the future of the ship, is a tank.
  • 0142 provides use in the field of AMACR and AMACR, or nucleic acids that carry them.
  • Akira Tank A MACR and its derivatives can treat individuals such as prostate cancer.
  • T (C) derived from prostate cancer using 2AMACR240248 Shows cytotoxicity by longitudinal CT. Cases 7 of 7 cases of prostate cancer are shown. In addition, in order to show isomerism, four target cells were used, T2A24 () was only T2A24 cells, T2A24AMACR was T2A24 cells plus AMACR240248, T2A24HV was T2A24 cells added with HV, and K562 was only K562 cells.
  • T (C) derived from Shows cytotoxicity by longitudinal CT. Cases 8 to 4 represent 7 cases of prostate cancer.
  • T2A2 4 () T2A24 cells only T2A24AMACR T2A24 cells with AMACR 25 133 and AMACR 183 191 added, T2A24HV added TVA24 cells with HV, K562 only K 562 cells Indicates.

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Abstract

　ＡＭＡＣＲ由来の部分ペプチドを含有し、かつＨＬＡ抗原と結合してＣＴＬにより認識されるペプチド、当該ペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物等に関する。

Description

明 細 書
AMACR由来の腫瘍抗原ペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、 alpha-methylacyl-CoA racemase (以下、 AMACR)および当該 AMACR 由来ペプチドの、癌免疫分野における利用に関する。
背景技術
[0002] 癌の治療法は、大きく「局所療法」と「全身療法」に分けることができる。局所療法に は「手術療法」と「放射線療法」がある。また全身療法は抗癌剤、ホルモン剤などの薬 剤を、内服や静脈内注射などで投与する薬物療法が主体になる。現状では、局所療 法による治療で患者の 40%前後が治癒し、 7〜10%が何らかの形で抗癌剤の寄与に より治癒している。すなわち、これら約 50%の患者は手術療法、放射線療法あるいは 化学療法により治癒されるが、残りの 50%程度の患者は治らないというのが現状であ り、今後これらの癌患者の治療を目的として、大きく 2種の対策が必要であると考えら れている。
[0003] 一つは早期発見により局所治療で治療できる割合を増加させることであり、もう一方 は、新しい治療法を開発し、全身療法で治療できる割合を増カロさせることである。
[0004] 新しい治療法としては、従来の抗癌剤で認められた骨髄抑制に代表される重篤な 副作用を持たない治療薬として、新しいコンセプトを有した分子標的治療薬が、近年 多く開発、上市されている。例えば乳癌で高発現する Her2分子に対する抗体薬であ るハーセプチン、また肺癌で高発現する上皮成長因子受容体 (EGF-R)のチロシンキ ナーゼ阻害剤であるィレッサ等がある。その効果は顕著であり、強い抗腫瘍効果が 報告されている。
[0005] し力しながら、従来の抗癌剤で報告されていた骨髄抑制等の副作用は認められな いものの、間質性肺炎など重篤な副作用が報告されていることから、分子標的治療 薬とはいえ、未だ満足できる薬剤が無いのが現状であり、新たな癌特異的な分子を 標的とした薬剤、ある!、は新たな治療法の研究開発が望まれて！/、る。
[0006] 他方、新たな治療法として、近年生体の免疫力を利用した癌免疫療法の研究'開 発が活発に進められている。生体による腫瘍の排除には、免疫系、特に自己の腫瘍 細胞を認識する細胞傷害性 T細胞 (CTL)が重要な役割を果たしている。 CTLは、 T 細胞受容体 (TCR)を用いて、腫瘍抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適 合遺伝子複合体クラス I抗原 (MHCクラス I抗原、ヒトの場合は HLA抗原と呼ばれる） との複合体を認識することにより、自己の腫瘍細胞を攻撃していることが知られている この腫瘍抗原ペプチドあるいは当該ペプチドの由来である腫瘍抗原タンパク質、若 しくはこれらをコードする核酸を、いわゆる癌ワクチンとして利用することにより、腫瘍 患者の体内の腫瘍特異的 CTLを誘導'増強させる治療法が可能となった。
[0007] 腫瘍抗原タンパク質としては、 1991年に T.Boonらが初めて MAGEと名付けたタン ノ ク質をヒトメラノーマ細胞力も同定した (非特許文献 1を参照)。その後、いくつかの 腫瘍抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞カゝら同定されている。
[0008] 腫瘍抗原タンパク質や腫瘍抗原ペプチドを腫瘍の治療や診断に応用するために、 メラノーマに比べて発生頻度が圧倒的に高い腺癌などに幅広く適応可能な、新たな 腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドの同定が望まれている。
[0009] AMACR(alpha-methylacyl-CoA racemase)は、分岐鎖脂肪酸、胆汁酸中間体の j8 酸化に寄与する酵素であり、前立腺癌の上皮組織で特異的に発現上昇する分子と して知られている。
前立腺癌患者の血中での AMACR特異的抗体価の上昇が観察されている (非特許 文献 2を参照)。また、 AMACRを高発現する前立腺癌細胞株において AMACR特異 的 siRNAを用いて遺伝子発現を減弱させた結果、細胞増殖能の低下が観察されたこ とから、 AMACRが前立腺癌細胞株の増殖制御にも重要な働きをして ヽることが示さ れている（非特許文献 3を参照）。さらに AMACR遺伝子の変異が adult-onset sensory motor neuropathyの原因であることが報告されている（非特許文献 4を参照）。しかし ながら、 AMACRが癌ワクチンとして有用な腫瘍抗原タンパク質であることは知られて いない。
[0010] 非特許文献 1 : Science, 254, 1643-1647(1991)
非特許文献 2 : J. Natl. Cancer Inst., 96(11), 834-843(2004) 非特許文献 3 : Cancer Res., 63(21), 7365-7376(2003)
非特許文献 4: Nat. Genet., 24(2), 188-191(2000)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本発明の目的は、 AMACRおよび当該 AMACR由来ペプチドの、癌免疫分野にお ける用途などを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明者らは、ヒト AMACRのアミノ酸配列より HLA-A24に結合する可能性を有する ペプチドを合成し、結合親和性の高いペプチドを同定した。この AMACRペプチドを 用いて HLA-A24陽性前立腺患者の末梢血リンパ球を刺激し、 CTLの誘導を試みた 結果、ペプチド特異的 CTLを誘導することができた。以上の結果より、 AMACRは前 立腺癌において癌免疫療法の標的抗原 (腫瘍抗原タンパク質)となることが示され、 そのペプチドは前立腺癌患者のワクチン療法に有用な腫瘍抗原ペプチドとなること が明らかとなった。
[0013] AMACRは前立腺癌のみならず、種々の癌組織で発現上昇して!/ヽることが知られて いる（Am J Surg Pathol.,26,926- 931(2002), Hum Pathol, 34,792-796(2003), Am J Su rg Pathol, 29(3),381-389(2005), Appl Immunohistochem Mol Morphol 13,252-255(2 005))。前述のように本発明により AMACRが腫瘍抗原タンパク質であることが明ら力と なったため、前立腺癌と同様に発現上昇の認められる種々の癌 (大腸癌、卵巣癌、 膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、子宮癌）に ぉ 、ても、本発明の腫瘍抗原タンパク質 AMACRおよびその腫瘍抗原ペプチドは有 用であると考えられる。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
[0014] すなわち本発明は、
(1) AMACR由来の部分ペプチドを含有し、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認 識されるペプチド、
(2) HLA抗原が HLA— A24抗原または HLA— A2抗原である、前記 (1)記載のぺ プチド、 (3) 配列番号： 3〜配列番号： 33のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、前記 (2)記載のペプチド、
(4) 配列番号： 3〜配列番号： 5のいずれかに記載のアミノ酸配列力もなる、前記 (3) 記載のペプチド、
(5) 配列番号： 5に記載のアミノ酸配列力 なる、前記 (4)記載のペプチド、
(6) 配列番号： 3〜配列番号： 23のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位のアミノ 酸がチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンに置換され、及び/ 又は C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたは メチォニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ HLA— A24抗原と結合して CT Lにより認識されるペプチド、
(7) 配列番号： 3〜配列番号： 5の 、ずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸 がチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンに置換され、及び/又 は C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメ チォニンに置換されたアミノ酸配列からなり、かつ HLA— A24抗原と結合して CTL により認識されるペプチド、
(8) 配列番号： 5に記載のアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸がチロシン、フエニルァラ- ン、メチォニンまたはトリプトファンに置換され、及び/又は C末端のアミノ酸がフエ- ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチォニンに置換されたァミノ 酸配列からなり、かつ HLA—A24抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド、
(9) 配列番号： 24〜配列番号： 33のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位のアミノ 酸がロイシン、メチォニン、パリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、及び/ 又は C末端のアミノ酸力パリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列を含有し、か つ HLA— A2抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド、
(10) 前記 (1)〜(9)の 、ずれかに記載のペプチドを含有するェピトープペプチド、
(11) 前記 (1)〜(10)のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容される担体とを含 有する医薬組成物、
(12) 前記 (1)〜(10)のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有 する核酸、 (13) 前記 (12)記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(14) AMACRと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
(15) AMACRが配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、前 記 (14)記載の医薬組成物、
(16) AMACRをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸と薬学的に許容される担 体とを含有する医薬組成物、
(17) AMACRをコードするポリヌクレオチドが配列番号： 1に記載の塩基配列を含有 するポリヌクレオチド、または配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレ ォチドである、前記 (16)記載の医薬組成物、
(18) 以下の (a)〜(d) :
(a)前記 (1)〜(10)のいずれかに記載のペプチド、
(b)前記 (12)記載の核酸、
(c) AMACR、および
(d) AMACRをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン'ビトロで接触させることを特徴とす る、抗原提示細胞の製造方法、
(19) 前記 (18)記載の製造方法により製造される抗原提示細胞、
(20) 前記 (19)記載の抗原提示細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組 成物、
(21) 以下の (a)〜(d) :
(a)前記 (1)〜(10)のいずれかに記載のペプチド、
(b)前記 (12)記載の核酸、
(c) AMACR、および
(d) AMACRをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン'ビトロで接触させることを特徴とする、 CTLの 誘導方法、
(22) 前記 (21)記載の誘導方法により誘導される CTL、
(23) 前記 (22)記載の CTLと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、 [0017] (24) CTLの誘導剤として使用される、前記 (11)、（13)、（14)、（15)、（16)、（17)または (20 )に記載の医薬組成物、
(25) 癌ワクチンとして使用される、前記 (11)、（13)、（14)、（15)、（16)、（17)、（20)または（ 23)に記載の医薬組成物、
(26) 前記 (1)〜(9)のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
(27) 前記 (1)〜(9)の!、ずれかに記載のペプチドと HLA抗原とを含有する HLAモノ マー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一、ならびに
(28) 前記 (27)記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAぺ ンタマーを成分として含有する、 AMACR由来の腫瘍抗原ペプチド特異的な CTLの 検出用試薬、に関する。
発明の効果
[0018] 本発明の AMACRおよび AMACR由来の腫瘍抗原ペプチド、またはこれらをコード する核酸等は、癌ワクチンとして有効に用いることができる。また前記 AMACR由来の 腫瘍抗原ペプチドは、 CTLを検出するための HLAテトラマー等の成分としても有効に 用!/、ることができる。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本明細書にぉ 、て、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号 による表示は、 IUPAC- IUBの規定〔IUPAC- IUB Communication on Biological Nome nclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細 書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣 用記号に従う。
[0020] 1)本発明のタンパク質 AMACR
本発明の腫瘍抗原タンパク質 AMACRは、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列または それに類似するアミノ酸配列を含有する。本発明の AMACRは、天然物 (例えば前立 腺癌細胞株）に由来するタンパク質であってもよぐまた組換えタンパク質であっても 良い。
ここで配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータベースにおいて Acce ssion No. NM— 014324、 Accession No. NP— 055139として登録されたヒト AMACR(alpha -methylacyl-CoA racemase)のアミノ酸配列である。
前記において「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、具 体的には、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含有し、その N末端側及び/又は C末端側に他のアミノ酸 配列の付加されたアミノ酸配列力もなるタンパク質が挙げられる。ここで「他のアミノ酸 配列」とは AMACR以外の構造遺伝子のアミノ酸配列であっても良 、。
[0021] また前記において「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含 有するタンパク質」とは、具体的には以下の (a)〜(c)に挙げるタンパク質が挙げられる
(a)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置 換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質であって、かつ当該タン ノ ク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(b)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列 を含有するタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての 活性を有するタンパク質、
(c)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対して ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるタン ノ ク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタ ンパク質。
[0022] 好ましくは、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列力 なるタン パク質が挙げられる。配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列から なるタンパク質としては、以下の (a')〜(c')に挙げるタンパク質が挙げられる：
(a')配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置 換及び Z又は付加されたアミノ酸配列力もなるタンパク質であって、かつ当該タンパ ク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するタンパク質、
(b')配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列 力もなるタンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活 性を有するタンパク質、 (c')配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補鎖に対し てストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチドによりコードされるタ ンパク質であって、かつ当該タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有する タンパク質。
[0023] 前記 (a)における「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミ ノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、 人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異体等の タンパク質を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明タンパク質の活 性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、 どのように、何個欠失、置換及び Z又は付加されればよいかを決定する指標は、当 業者に周知のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すこと ができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全 アミノ酸の 5%以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点 から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前の アミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala, Val、 Leu、 lie 、 Pro、 Met, Phe及び Trpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 S er、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn及び Ginは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であ り、 Asp及び Gluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Arg及び Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として 同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
[0024] 前記 (b)における「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列と 70%以上の配列同一性を示 すアミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、例えば配列番号： 2に記載のアミノ酸配 列と約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上、最も好ま しくは約 95%以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げら れる。具体的には、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列の部分配列力 なるタンパク 質などが挙げられる。
ここで「配列同一性」とは、 2つのタンパク質間の、配列の同一性及び相同性をいう 。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にァライン メントされた 2つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のタンパク 質は、 2つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失 (例えばギャップ等 )を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、 Vector NTIを用い て、 ClustalWアルゴリズム (Nucleic Acid Res. ,22(22):4673- 4680(1994))を利用してァラ インメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソ フト、具体的には Vector NTI、 GENETYX- MACや公共のデータベースで提供される 解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページ アドレス http：〃 www. ddbj.nig.ac.jpにお!/、て、一般的に利用可能である。
[0025] 前記 (c)における「配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの 相補鎖に対してストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、 例えば配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約 40%以上 、好ましくは約 60%以上、より好ましくは約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、さら に好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の配列同一性を有する塩基配 列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、配列番号： 1に記載の塩基 配列と、約 40%以上、好ましくは約 60%以上、より好ましくは約 70%以上、より好ましく は約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の配列同一 性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、配列 番号： 1に記載の塩基配列の部分配列力 なるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
[0026] ハイブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば Mol ecularし loning 2nd Edt. し old Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の ¾本 【こ 記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付 の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、 Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego C A)や目 ij 己 Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度 (Tm)に基づ いて決定することができる。 [0027] ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、 6 X SSC(20 X SSCは、 333mM Sodiu m citrate, 333mM NaClを示す)、 0.5%SDSおよび 50%ホルムアミドを含む溶液中で 42 °Cにてハイブリダィズさせる条件、または 6 X SSCを含む (50%ホルムアミドは含まな!/、） 溶液中で 65°Cにてハイブリダィズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダィゼーシヨン後の洗浄の条件としては、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程 度の条件を挙げることができる。相補鎖は力かる条件で洗浄しても対象とする正鎖と ノ、イブリダィズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より 厳しいハイブリダィズ条件として「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」程度、さらに厳しいハイ ブリダィズ条件として「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」程度の洗浄条件を挙げることがで きる。
[0028] 以上に示したような配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列から なるタンパク質の具体例としては、例えば GenBank Accession No.NM203382, Access ion No. NP976316に記載の、ヒト AMACRのスプライシングバリアントが例示される。
[0029] 前記のように本発明のタンパク質 AMACRは、腫瘍抗原タンパク質としての活性を有 する。ここで「腫瘍抗原タンパク質としての活性」とは、既存の腫瘍抗原タンパク質の 活性測定法により活性を示すことを意味する。具体的には、例えば、 AMACRを発現 させた細胞が CTLにより認識される、すなわち当該細胞が CTLに反応性を示す、換 言すれば本発明のタンパク質若しくは該タンパク質に由来する抗原ペプチドが CTL を活性化する若しくは CTLを誘導すると ヽぅ性質を示す。
[0030] 前記にお!、て細胞とは、 HLA抗原を発現する細胞であることが好ま 、。従って前 記腫瘍抗原タンパク質としての活性とは、より具体的には、例えば HLA-A24や HLA- A2等の HLA抗原を発現する細胞において本発明のタンパク質を発現させることによ り、本発明タンパク質由来の抗原ペプチドと HLA抗原との複合体が細胞表面に提示 され、その結果、当該細胞が CTLに認識される、すなわち CTLが活性ィ匕される（CTL が誘導される)と ヽぅ性質を指す。
[0031] このような本発明タンパク質の性質は、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法
(例えば51 Crリリースアツセィ (J.Immunol., 159:4753, 1997)、 LDHリリースアツセィ（LDH Cytotoxicity Detection Kit (タカラバイオ）、サイト力イン量の測定等）により容易に測 定することができる。以下に具体的なアツセィ法を例示する。
[0032] まず、 293-EBNA細胞（Invitrogen社）等の宿主細胞に対し、本発明タンパク質をコ ードする DNAを含有する発現ベクターと、 HLA抗原をコードする DNAを含有する発現 ベクターとをトランスフエタトする。ここで用いる HLA抗原をコードする DNAとしては、例 えば HLA-A24抗原をコードする DNA若しくは HLA-A2抗原をコードする DNAが挙げ られる。 HLA- A24抗原をコードする DNAとしては HLA- A2402の cDNA(Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)、 Genbank Accession No.M64740)が挙げられる。また HLA- A2 抗原をコードする DNAとしては HLA- A0201の cDNA(GenBank Acc.No.M84379)が挙 げられる。
[0033] 前記トランスフエタトは、例えばリポフエクトァミン試薬 (GIBCO BRL社製)を用いたリ ポフエクチン法などにより行うことができる。その後、用いた HLA抗原に拘束性の CTL を加えて作用させ、該 CTLが反応 (活性化）して産生する種々のサイト力イン、例えば IFN- γの量を、例えば ELISA法などで測定することにより調べることができる。ここで CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球を本発明のタンパク質 AMACRで刺激することに より調製された CTLや、 Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 103 8-1044, 1995等に記載の方法により樹立した CTLを用いることができる。
[0034] また本発明のタンパク質は、例えばヒトモデル動物を用いたアツセィ (WO 02/47474 号公報、 Int J. Cancer: 100,565-570 (2002))に供することにより、 in vivoでの CTL誘 導活性を調べることができる。
本発明のタンパク質は、天然物 (例えば前立腺癌細胞株など)力も自体公知のタン ノ^質の精製方法によって製造することができる。また後述する本発明のタンパク質 をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸を含有する形質転換体を培養すること によっても製造することができる。
[0035] 2)本発明の AMACR由来のペプチド
本発明の AMACR由来のペプチド (以下、本発明のペプチドと称する場合がある）と は、前記本発明のタンパク質 AMACR由来の部分ペプチドを含有し、かつ HLA抗原と 結合して CTLにより認識される腫瘍抗原ペプチドである。すなわち、前記した本発明 のタンパク質 AMACRのアミノ酸配列の一部を含有するペプチドであって、かつ、該ぺ プチドと HLA抗原との結合複合体が CTLにより認識されるようなペプチドであれば、 本発明のタンパク質のアミノ酸配列中の如何なる位置に存する如何なる長さのぺプ チドを含有するものであっても良い。
[0036] このような本発明のペプチドは、例えば、 AMACRの一部よりなる候補ペプチドを合 成し、該候補ペプチドと HLA抗原との複合体が CTLにより認識されるか否か、すなわ ち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有する力否力をアツセィすること により、同定することができる。
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法 に準じて行うことができる。該公知方法としては文献 (ぺプタイド'シンセシス (Peptide Synthesis) , Interscience, New York, 1966 ;ザ'プロテインズ（The Proteins) , Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976 ;ペプチド合成，丸善（株）， 1975 ;ペプチド合 成の基礎と実験、丸善 (株)， 1985 ;医薬品の開発 続 第 14卷 'ペプチド合成，広川 書店， 1991)などに記載されている方法が挙げられる。
[0037] 次に、本発明の腫瘍抗原ペプチドの同定方法につき、以下に記述する。
HLA-A1, -A0201, -A0204, - A0205, - A0206, -A0207, -All, -A24, - A31, - A680 1, -B7, -B8, -B2705, - B37, - Cw0401, - Cw0602などの HLAの型については、該 H LAに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性 (モチーフ）が判明して 、る ( 例えば Immunogenetics,41:pl78,1995などを参照のこと）。例えば HLA-A24のモチー フとしては、 8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸がチロシン、フエ 二ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンであり、 C末端のアミノ酸がフエ-ルァラ ニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチォニンとなることが知られている（ J.Immunol.,152,p3913,1994、 Immunogenetics,41:pl78,1995、 J.Immunol.,155:p4307, 1994)。また HLA-A2のモチーフについては、以下の表 1に示したモチーフが知られ ている（Immunogenetics,41,pl78,1995、 J.Immunol.,155:p4749,1995)。
[0038] [表 1] HLA-A2のタイプ _N末端から 2番目のアミノ酸 C末端のアミノ酸
HLA-A0201 L， M V , L
HLA-A0204 L L
HLA-A0205 V , L , I , M L
HLA-A0206 V , Q V , L
HLA-A0207 L L
(ぺプチドの長さは 8〜 11アミノ酸)
[0039] さらに近年、 HLA抗原に結合可能と予想されるペプチド配列を、インターネット上、 NIHの BIMASのソフトを使用することにより検索することができる（http：〃 bimas.dcrt.ni h.gov/ molbio/hla_bind/ )。
ペプチドの長さとしては、各種 HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（ Immunogenetics, 41:178, 1995)、通常 8から 14アミノ酸程度であることが明らかにされ ている（ただし HLA-DR、 -DP、 -DQについては、 14アミノ酸以上の長さの抗原べプチ ドも認められる)。
[0040] これらのモチーフに関わるペプチド部分を本発明の AMACRのアミノ酸配列中から 選び出すのは容易である。例えば、前記 BIMASソフトでの検索により、 HLA抗原に 結合可能と予想される配列を容易に選び出すことができる。選び出された候補ぺプ チドを前述の方法にて合成し、該候補ペプチドが HLA抗原と結合して CTLにより認 識されるか否か、すなわち候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチドとしての活性を有するか 否かを測定することにより、本発明のペプチドを同定することができる。
本発明の腫瘍抗原ペプチドの具体的な同定法としては、例えば J.Immunol.,154,p2 257,1995に記載の方法が挙げられる。すなわち、候補ペプチドを提示すると考えられ るタイプの HLA抗原が陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、 in vitroで該候補べ プチドを添加して刺激した場合に、該候補ペプチドをパルスした HLA抗原陽性細胞 を特異的に認識する CTLが誘導された場合は、該候補ペプチドが腫瘍抗原ペプチド に成り得ることが示される。ここで CTLの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示 細胞に反応して CTLが産生する種々のサイト力イン (例えば IFN- γ )の量を、例えば ELISA法などによって測定することにより、調べることができる。また51 Crで標識した抗 原ペプチド提示細胞に対する CTLの傷害性を測定する方法 (51Crリリースアツセィ、 In t.J.Cancer,58:p317,1994)によっても調べることができる。
[0041] さらに、候補ペプチドを提示すると考えられるタイプの HLA抗原をコードする cDN Aを発現する発現プラスミドを、例えば 293-EBNA細胞（Invitrogen社）に導入した細 胞に対して候補ペプチドをパルスし、この細胞に対して、前記候補ペプチドを提示す ると考えられるタイプの HLA抗原に拘束性の CTLを反応させ、該 CTLが産生する種 々のサイト力イン (例えば IFN- γ )の量を測定することによつても、調べることができる（ J.Exp.Med.,187: 277,1998)。
ここで HLA抗原としては、 HLA-A24抗原若しくは HLA-A2抗原が挙げられる。 HLA- A24拘束性の腫瘍抗原ペプチドを選択する場合には、前記 HLA抗原をコードする cD NAとしては HLA- A2402の cDNA(Cancer Res., 55: 4248-4252 (1995)、 Genbank Acc ession No.M64740)を用いることができる。また HLA-A2拘束性の腫瘍抗原ペプチド を選択する場合は、前記 HLA抗原をコードする cDNAとしては HLA-A0201の cDNA( GenBank Acc.No.M84379)を用いることができる。
[0042] また前記 CTLとしては、ヒトの末梢血リンパ球のペプチド刺激により調製される場合 の他、 Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987, N. Eng. J. Med, 333, 1038-1044, 1995等 に記載の方法により樹立した CTLを用いることができる。
また本発明のペプチドは、例えばヒトモデル動物を用いたアツセィ（WO 02/47474 号公報、 Int J. Cancer: 100,565-570 (2002))に供することにより、 in vivoでの活性を調 ベることができる。
[0043] 前記のように腫瘍抗原ペプチドの配列の規則性 (モチーフ）が判明して 、る場合と 異なり、例えば HLA-B55や HLA-A26のようにそのペプチドのモチーフが明らかでな V、場合は、これらの HLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を認識する CTL株が存 在する場合には、例えば W097/46676等に記載の方法に準じて本発明の腫瘍抗原 ペプチドを同定することができる。
[0044] 以上のような本発明のペプチドの具体例としては、配列番号： 2に記載のアミノ酸配 列からなる AMACRの部分ペプチドであって、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認 識されるペプチドが挙げられる。また、本発明のペプチドが結合する HLA抗原の観点 力もは、 HLA-A24抗原または HLA-A2抗原に結合する本発明のペプチドを挙げるこ とができる。ペプチドの長さとして、好ましくは 8〜14アミノ酸力 より好ましくは 8〜11ァ ミノ酸が挙げられる。
具体的には、配列番号: 3〜33のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有し、かつ HL A抗原と結合して CTLにより認識されるペプチドが挙げられる。ペプチドの長さとして 、好ましくは 9〜14アミノ酸力 より好ましくは 9〜11アミノ酸が挙げられる。より具体的 には、例えば HLA-A24結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、配列番号: 3〜配列番 号： 23のいずれかに記載のアミノ酸配列力 なるペプチドであって、 HLA-A24抗原に 結合して CTLに認識されるペプチドが挙げられる（後述の表 2)。好ましくは、配列番 号: 3、配列番号： 4または配列番号： 5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げ られる。
また、 HLA-A2結合性の腫瘍抗原ペプチドとしては、配列番号: 24〜配列番号: 33 の!、ずれかに記載のアミノ酸配列力 なるペプチドであって、 HLA-A2抗原に結合し て CTLに認識されるペプチドが挙げられる（後述の表 3)。
[0045] 本発明においては、前記の如き配列番号： 2に記載のアミノ酸配列の一部を含有す るペプチドのみならず、当該ペプチドの一部を改変した改変ペプチドであっても、 HL A抗原と結合して CTLにより認識されるという性質を有する限り、本発明のペプチドの 範疇に含まれる。具体的には、本発明の AMACRのアミノ酸配列、より具体的には配 列番号： 2に記載のアミノ酸配列の一部力 なる本発明のペプチドのアミノ酸配列に 対して、 1又はそれ以上のアミノ酸残基の改変を施したアミノ酸配列を含有する改変 ペプチドであって、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識されるという腫瘍抗原べ プチドとしての活性を有するものは、本発明のペプチドの範疇に含まれる。
[0046] ここで、アミノ酸残基の「改変」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、及び Z又は付加 ( ペプチドの N末端、 C末端へのアミノ酸の付加も含む）を意味し、好ましくはアミノ酸残 基の置換が挙げられる。アミノ酸残基の置換に係る改変の場合、置換されるアミノ酸 残基の数および位置は、腫瘍抗原ペプチドとしての活性が維持される限り、任意であ るが、前記したように通常、腫瘍抗原ペプチドの長さが 8〜14アミノ酸程度であること から、 1個力 数個の範囲が好ましい。 [0047] 本発明の改変ペプチドの長さとしては、 8〜 14アミノ酸程度が好ましい（ただし HLA - DR、 -DP, - DQについては、 14アミノ酸以上の長さの場合もある。 )
先に記載したように、 HLA-A1, -A0201, -A0204, -A0205, -A0206, -A0207, -All, -A24, -A31, -A6801, -B7, - B8, -B2705, -B37, - Cw0401, - Cw0602などの HLAの 型につ 、ては、該 HLAに結合して提示される抗原ペプチドの配列の規則性 (モチ一 フ）が判明している。また前記したように、 HLA抗原に結合可能と予想されるペプチド 配列をインターネット上検索することができる（http：〃 bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_ bind/ ) 0従って、該モチーフ等に基づき、前記改変ペプチドを作製することが可能で ある。
[0048] 例えば HLA-A24に結合して提示される抗原ペプチドのモチーフとしては、前記した ように、 8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸がチロシン、フエ-ル ァラニン、メチォニンまたはトリプトファンであり、 C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン、 ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメチォニンであることが知られている（J.Im munol, 152:p3913,1994、 Immunogenetics,41:pl78,1995、 J.Immunol.,155:p4307,199 4)。また HLA-A2の場合は、 8〜11アミノ酸よりなるペプチドのうちの第 2位のアミノ酸 力 イシン、メチォニン、パリン、イソロイシンまたはグルタミンであり、 C末端のアミノ酸 力 Sパリンまたはロイシンであることが知られている（Immunogenetics,41,pl78,1995、 J.I mmunol.,155:p4749,1995)。またインターネット上で HLA抗原に結合可能と予想され るペプチド配列が示されており（http：〃 bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)、例え ば前記モチーフ上とり得るアミノ酸に類似の性質を持つアミノ酸が許容される。従って 、これらモチーフ上アミノ酸の置換が可能な位置（HLA-A24、 HLA-A2においてはぺ プチドの第 2位と C末端）にあるアミノ酸を他のアミノ酸 (好ましくは前記インターネット 等で結合可能と予想されて 、るアミノ酸）に置換したアミノ酸配列を含むものであって 、かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識されると ヽぅ活性を持つ改変ペプチドを 挙げることができる。
[0049] より好ましくは、該位置において、前記モチーフ上知られたアミノ酸残基のいずれか に置換したアミノ酸配列を含有するペプチドであって、かつ前記活性を有する改変べ プチドが挙げられる。すなわち配列番号: 3〜23に示されるような HLA-A24結合性の ペプチドの場合、その第 2位のアミノ酸をチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまた はトリブトファンに置換し、及び/又は C末端のアミノ酸をフエ-ルァラニン、ロイシン、 イソロイシン、トリブトファンまたはメチォニンに置換したアミノ酸配列を含有するぺプ チドであって、かつ HLA-A24抗原と結合して CTLにより認識される改変ペプチドが 挙げられる。このうち第 2位のアミノ酸をチロシンに置換したペプチドがより好ましい。
[0050] さらに好ましくは、配列番号: 3〜配列番号: 5のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸をチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンに置換し、 及び/又は C末端のアミノ酸をフエ二ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファ ンまたはメチォニンに置換したアミノ酸配列力もなり、かつ HLA-A24抗原と結合して C TLにより認識されるペプチドが挙げられる。
[0051] また配列番号： 24〜33に示されるような HLA-A2結合性のペプチドの場合、そのアミ ノ酸配列の第 2位のアミノ酸をロイシン、メチォニン、パリン、イソロイシンまたはグルタ ミンに置換し、及び Z又は C末端のアミノ酸をパリンまたはロイシンに置換したアミノ酸 配列を含有し、かつ HLA-A2抗原と結合して CTLにより認識されるペプチドが好まし い。
[0052] 本発明のペプチドには、さらに、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドを含有するェピト ープペプチドも含まれる。
近年、複数の CTLェピトープ (抗原ペプチド）を連結したペプチド (ェピトープぺプ チド）力 効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of lmm unology 1998, 161: 3186-3194には、腫瘍抗原タンパク質 PSA由来の HLA-A2, -A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープを連結した約 30merのペプチド力 イン'ビボでそれ ぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導したことが記載されている。
[0053] また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたペプチド（ェピトープぺプ チド）により、効率的に CTLが誘導されることも示されている。ここでヘルパーェピトー プとは CD4陽性 T細胞を活性ィ匕させる作用を有するペプチドを指すものであり（Immu nity., 1:751, 1994)、例えば B型肝炎ウィルス由来の HBVcl28— 140や破傷風毒 素由来の TT947— 967などが知られている。当該ヘルパーェピトープにより活性化 された CD4陽性 T細胞は、 CTLの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどの エフェクター活性ィ匕などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考 えられて!/、る。このようなヘルパーェピトープと CTLェピトープとを連列したペプチド の具体例として、例えば Journal of Immunology 1999, 162: 3915- 3925には、 HBV由 来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA-A11拘束性抗原ペプチド 3種類、およ びヘルパーェピトープより構成されるペプチドをコードする DNA (ミニジーン）力 イン 'ビボでそれぞれのェピトープに対する CTLを効果的に誘導したことが記載されてい る。また実際に、 CTLェピトープ (メラノーマ抗原 gplOOの第 280位〜 288位力もなる腫 瘍抗原ペプチド）とヘルパーェピトープ (破傷風毒素由来 Tヘルパーェピトープ）とを 連結したペプチドが臨床試験に供されている（Clinical Cancer Res., 2001,7:3012-30 24)。
従って、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドを含む複数のェピトープを連結したぺプ チド (ェピトープペプチド)であって、 CTL誘導活性を有するペプチドも、本発明のぺ プチドの具体例として例示することができる。
[0054] ここに、ェピトープペプチドとは、（1)複数の CTLェピトープ (腫瘍抗原ペプチド）を連 結したペプチド、若しくは (2)CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結したぺプチ ドであって、抗原提示細胞内にてプロセッシングを受け、生じた腫瘍抗原ペプチドが 抗原提示細胞に提示され、 CTL誘導活性を導くペプチドとして定義される。
[0055] ここで、本発明のペプチドに連結させるェピトープが CTLェピトープの場合、用いる CTLェピトープとしては、配列番号： 2に代表される AMACRのアミノ酸配列由来の HL A-Al, -A0201, -A0204, - A0205, - A0206, -A0207, -All, -A24, - A31, - A6801, - B7, -B8, -B2705, - B37,- B55, - Cw0401, - Cw0602などに拘束性の CTLェピトープが 挙げられる。また、他の腫瘍抗原タンパク質由来の CTLェピトープも挙げられる。これ ら CTLェピトープは複数個連結することが可能であり、 1つの CTLェピトープの長さと しては、各種 HLA分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Immunogenetics, 4 1:178, 1995)、 8〜14アミノ酸程度を挙げることができる。
また本発明のペプチドに連結させるェピトープがヘルパーェピトープの場合、用い るヘルパーェピトープとしては、前述のような B型肝炎ウィルス由来の HBVcl28— 1 40や破傷風毒素由来の TT947— 967などが挙げられる。また当該ヘルパーェピト ープの長さとしては、 13〜30アミノ酸程度、好ましくは 13〜17アミノ酸程度を挙げるこ とがでさる。
[0056] このような複数のェピトープを連結させたペプチド（ェピトープペプチド）は、前述の ように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のェピ トープを連結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基 づ 、て、通常の DNA合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。 すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発 現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より 目的の複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを回収することにより製造 することができる。これらの手法は、前述のように文献 (Molecular Cloning, T.Maniatis et al.'CSH Laboratory(1983)、 DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS(1985》に記載 の方法などに準じて行うことができる。
以上のようにして製造された複数のェピトープを連結させたェピトープペプチドを、 前述の in vitroアツセィや、 WO 02/47474号公報および Int J. Cancer: 100,565- 570 ( 2002)に記述のヒトモデル動物を用いた in vivoアツセィに供すること等により CTL誘導 活性を測定することができる。
[0057] さらに、前記本発明の腫瘍抗原ペプチドの N末端アミノ酸のアミノ基、または C末端 アミノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能であり、このような修飾に係るぺプチ ドも本発明のペプチドの範疇に含まれる。
ここで N末端アミノ酸のァミノ基の修飾基としては、例えば 1〜3個の炭素数 1から 6 のアルキル基、フ -ル基、シクロアルキル基、ァシル基が挙げられ、ァシル基の具 体例としては炭素数 1から 6のアルカノィル基、フ -ル基で置換された炭素数 1から 6のアルカノィル基、炭素数 5から 7のシクロアルキル基で置換されたカルボ-ル基、 炭素数 1から 6のアルキルスルホ-ル基、フエ-ルスルホ-ル基、炭素数 2から 6のァ ルコキシカルボ-ル基、フエ-ル基で置換されたアルコキシカルボ-ル基、炭素数 5 力 7のシクロアルコキシで置換されたカルボ-ル基、フエノキシカルボ-ル基等が挙 げられる。
C末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体お よびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数 1から 6のアルキルェ ステル、フエ-ル基で置換された炭素数 0から 6のアルキルエステル、炭素数 5から 7 のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数 1 力 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、フエ-ル基で置換された炭 素数 0から 6のアルキル基の 1つまたは 2つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子 を含んで 5から 7員環のァザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
[0058] 3)本発明の核酸
本発明の核酸とは、具体的には、
(1) AMACRをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
(2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
を指す。
[0059] (l)AMACRをコードするポリヌクレオチド及びそれを含有する核酸
AMACRをコードするポリヌクレオチドは、種々の細胞や組織、例えば前立腺癌等に 由来する細胞や組織の cDNAや mRNA、 cRNA、ゲノム DNA、または合成 DNAのいず れであっても良い。また 1本鎖、 2本鎖のいずれの形態であっても良い。具体的には、
(a)配列番号： 1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオ チド、
また前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列を含有するポリヌクレオチ ド、が例示される。
[0060] ここで配列番号： 1に記載の塩基配列は、 GenBankデータベースにおいて Accessi on No. NM_014324として登録されているヒト AMACR遺伝子のオープンリーディングフ レームに該当する。また配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は、 GenBankデータべ一 スにおいて Accession No. NM_014324、 Accession No. NP_055139として登録された ヒト AMACRのアミノ酸配列である。
[0061] 前記にお!、て（a)配列番号： 1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、 (b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド とは、より具体的には、配列番号： 1に記載の塩基配列力 なるポリヌクレオチド、配列 番号: 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列力 なるポリヌクレオチドが例示さ れる。さらに、当該配列番号： 1に記載の塩基配列、または配列番号: 2に記載のアミ ノ酸配列をコードする塩基配列の 5'末端側及び/又は 3'末端側に他の塩基配列の付 カロされた塩基配列力もなるポリヌクレオチドが例示される。ここで「他の塩基配列」とは 、例えば AMACR以外の構造遺伝子をコードする塩基配列であっても良 ヽ。
これら AMACRをコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質が、腫瘍抗原タンパク質としての活性を有すものであれば良い。当該 活性およびその測定法については、前記「1)本発明のタンパク質」において記載し たとおりである。
[0062] 配列番号： 1に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、 GenBank Accession No. NM_014324において開示されている塩基配列、あるいは本明細書の配列表の配 列番号： 1に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーシヨンのプロ ーブあるいは PCRのプライマーに用いて、例えば前立腺癌細胞株（例えば DU 145 ( ATCC Number: HTB-81》由来の cDNAライブラリーをスクリーニングすることなどによ りクロー-ングすることができる。該クロー-ングは、例えば Molecular Cloning 2nd Ed t. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容 易に行うことができる。
[0063] また、前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列を含有するポリヌクレ ォチドとは、具体的には、
(c)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(d)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の配列同一性を示す塩基配列を 含有するポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタン ノ ク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(e)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において 1若しく は複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパ ク質をコードするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされ るタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、 が挙げられる。
[0064] 好ましくは、前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列力 なるポリヌク レオチドが挙げられる。前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドに類似の塩基配列力 な るポリヌクレオチドとしては、以下の (c')〜(e')に挙げるポリヌクレオチドが挙げられる： (c')前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードさ れるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、 (d')前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の配列同一性を示す塩基配列か らなるポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク 質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド、
(e')前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質において 1若しく は複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク 質をコードするポリヌクレオチドであって、かつ当該ポリヌクレオチドによりコードされる タンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有するポリヌクレオチド。
[0065] 前記にお!、て「前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェント な条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、例えば前記 (a)または (b)のポリヌ クレオチドの塩基配列と約 40%以上、好ましくは約 60%以上、より好ましくは約 70% 以上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95 %以上の配列同一性を有する塩基配列を含有するポリヌクレオチドが挙げられる。具 体的には、前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドな どが挙げられる。
[0066] ハイブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば Mol ecularし loning 2nd Edt. し old Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の ¾本 【こ 記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付 の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、 Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego C A)や目 ij 己 Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度 (Tm)に基づ いて決定することができる。
[0067] ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、 6 X SSC(20 X SSCは、 333mM Sodiu m citrate, 333mM NaClを示す)、 0.5%SDSおよび 50%ホルムアミドを含む溶液中で 42 °Cにてハイブリダィズさせる条件、または 6 X SSCを含む (50%ホルムアミドは含まな!/、） 溶液中で 65°Cにてハイブリダィズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダィゼーシヨン後の洗浄の条件としては、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程 度の条件を挙げることができる。相補鎖は力かる条件で洗浄しても対象とする正鎖と ノ、イブリダィズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より 厳しいハイブリダィズ条件として「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」程度、さらに厳しいハイ ブリダィズ条件として「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」程度の洗浄条件を挙げることがで きる。
[0068] 前記にお!、て「前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の配列同一性を示 す塩基配列を含有するポリヌクレオチド」とは、例えば前記 (a)または (b)のポリヌクレオ チドの塩基配列と約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、さらに好ましくは約 90% 以上、最も好ましくは約 95%以上の配列同一性を示す塩基配列を含有するポリヌク レオチドが挙げられる。具体的には、前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドの部分配列 力 なるポリヌクレオチドなどが挙げられる。
[0069] ここで「配列同一性」とは、 2つのポリヌクレオチド間の、配列の同一性及び相同性を いう。当該「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にァラ インメントされた 2つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のポリ ヌクレオチドは、 2つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失 (例えば ギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、 Vector NTIを用いて、 ClustalWアルゴリズム (Nucleic Acid Res., 22(22):4673- 4680(1994》を利 用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、 配列解析ソフト、具体的には Vector NTI、 GENETYX- MACや公共のデータベースで 提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホー ムページアドレス http：〃 www.ddbj.nig.a jpにお!/、て、一般的に利用可能である。
[0070] このような配列同一性を有するポリヌクレオチドは、前述のハイブリダィゼーシヨン反 応ゃ通常の PCR反応により、または後述するポリヌクレオチドの改変 (欠失、付加、置 換)反応により作製することができる。
[0071] 前記において「前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に お!、て 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたアミノ酸配列を 含有するタンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に 存在するアレル変異体等のタンパク質をコードする核酸を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明タンパク質の活 性が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、 どのように、何個欠失、置換及び Z又は付加されればよいかを決定する指標は、当 業者に周知のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すこと ができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全 アミノ酸の 5%以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点 から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前の アミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala, Val、 Leu、 lie 、 Pro、 Met, Phe及び Trpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 S er、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn及び Ginは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であ り、 Asp及び Gluは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Arg及び Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として 同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
[0072] この改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、 Molecular Cloning 2nd
Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の種々の方法 、例えば部位特異的変異誘発や PCR法等によって製造することができる。また市販 のキットを用いて、 Gapped duplex法や Kunkel法などの公知の方法に従って製造する ことちでさる。
[0073] 以上のような本発明の AMACRをコードするポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチ ドによりコードされるタンパク質が腫瘍抗原タンパク質としての活性を有する。ここで「 腫瘍抗原タンパク質としての活性」とは、既存の腫瘍抗原タンパク質の活性測定法に より活性を示すことを意味する。具体的には、例えば、 AMACRをコードするポリヌクレ ォチドを発現させた細胞が CTLにより認識される、すなわち当該細胞が CTLに反応 性を示す、換言すれば本発明のタンパク質 AMACR若しくはそれに由来する抗原べ プチドが CTLを活性ィ匕する若しくは CTLを誘導するという性質を示す。当該活性およ びその測定法については、前記「1)本発明のタンパク質 AMACR」において記載した とおりである。
[0074] 前記本発明のポリヌクレオチドを含有する核酸は、 1本鎖および 2本鎖のいずれの 形態もとることができる。また DNA、 RNAのいずれの形態もとることができる。本発明の ポリヌクレオチドが 2本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに挿 入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製 することができる。すなわち本発明の核酸の範疇には、本発明の 2本鎖型ポリヌクレ ォチドを発現ベクターに挿入して作製された組換え発現ベクターも含まれる。
[0075] ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択するこ とができ、プラスミド、ファージベクター、ウィルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、 pUC118、 pUC119、 pBR322、 pC R3等のプラスミドベクター、 λ ΖΑΡΠ、 gtllなどのファージベクターが挙げられる。宿 主が酵母の場合、ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆 虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には 、 pCEP4、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3.1、 pRc/RSV、 pRc/CMVなどのプラスミド ベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウィルスべク ターなどのウィルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子 、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を適宜有していても良い。
[0076] また、単離精製が容易になるように、チォレドキシン、 Hisタグ、あるいは GST (ダルタ チオン S-トランスフェラーゼ)等との融合タンパク質として発現する配列が付加されて いても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、 tac、 trc、 tr p、 CMV、 SV40初期プロモーターなど）を有する GST融合タンパクベクター（pGEX4T など）や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さら にはチォレドキシンおよび Hisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a) などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現べクタ 一を含有する形質転換細胞を作製することができる。
[0077] ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げら れる。大腸菌としては、 E.coli K- 12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5 α株、 AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス'セルビジェなど が挙げられる。動物細胞としては、 L929細胞、 BALB/c3T3細胞、 C127細胞、 CHO細 胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞、 293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞と しては sl9などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の 導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、 Lipofectin; Gibco- B RL社)を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地に て培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞 を選択することができる。
[0078] 以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより 、本発明のタンパク質 (AMACR)を製造することができる。得られたタンパク質は、一般 的な生化学的精製手段により、さらに単離'精製することができる。ここで精製手段と しては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ァフィ-ティーク 口マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク 質を、前述のチォレドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパク質として発現させた 場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離'精製する ことができる。
[0079] (2)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド及びそれを含有する核酸
前述のように本発明の核酸の範疇には、本発明のペプチドをコードするポリヌクレ ォチドを含有する核酸も含まれる。 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 DNAの形態であっても RNAの形 態であっても良い。また 1本鎖、 2本鎖のいずれの形態であっても良い。これら本発明 のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報お よびそれによりコードされる DNAの配列情報に基づき容易に製造することができる。 具体的には、通常の DNA合成や PCRによる増幅などによって、製造することができる
[0080] 本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、具体的には、前記ェピトープぺ プチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸は、 1本鎖および 2 本鎖のいずれの形態もとることができる。また DNA、 RNAのいずれの形態もとることが できる。本発明のポリヌクレオチドが 2本鎖の場合、前記本発明のポリヌクレオチドを 発現ベクターに挿入することにより、本発明のペプチド (ェピトープペプチド)を発現 するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターや宿主細胞、宿主細胞の形質転換方法等については、 前述の (1)と同様である。
[0081] 4)本発明の抗原提示細胞
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により CTLの誘導が認められたが 、これは、本発明のペプチドと HLA抗原との複合体の提示された抗原提示細胞 (榭 状細胞）を用いることで、この抗原提示細胞を特異的に認識する CTLが誘導されたこ とを示すものである。従って、前記した本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のい ずれカゝと抗原提示能を有する細胞とをイン'ビトロで接触させることにより、抗原提示 細胞を作製することができる。具体的には本発明は、腫瘍患者由来の単離された抗 原提示能を有する細胞と、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかとを イン'ビトロで接触させることを特徴とする抗原提示細胞の製造方法、および当該製 造方法により製造される抗原提示細胞を提供するものである。
[0082] ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示することの可能な HLA抗原を細胞表面に発現する細胞であれば特に限定されな ヽが、特に抗原提示 能が高!、とされる榭状細胞が好ま 、。 また、前記抗原提示能を有する細胞から本発明の抗原提示細胞を調製するために 添加される物質としては、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれであつ ても良い。
[0083] 本発明の抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細 胞に本発明のタンパク質またはペプチドをイン'ビトロでパルスして、 HLA抗原と本発 明のペプチドとの複合体を提示させることにより得られる (Cancer Immunol. Immunothe r.,46:82,1998、 J.Immunol.,158,pl796,1997、 Cancer Res.,59,pll84,1999)。榭状細胞 を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血カもフイコール法によりリンパ球を分離 し、その後非付着細胞を除き、付着細胞を GM-CSFおよび IL-4存在下で培養して榭 状細胞を誘導し、当該榭状細胞を本発明のタンパク質またはペプチドと共に培養し てノルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明の核酸を導入することにより本発明 の抗原提示細胞を調製する場合は、当該核酸は、 DNAの形態であっても、 RNAの形 態であっても良い。具体的には、 DNAの場合は Cancer Res.,56:p5672,1996や J.Imm unol.,161: p5607, 1998などを参考にして行うことができ、また RNAの場合は J.Exp.Me d.， 184: p465,1996などを参考にして行うことができる。
[0084] 本発明の抗原提示細胞は、本発明のペプチドと HLA抗原との複合体の提示された 抗原提示細胞であれば良ぐ具体的には、例えば配列番号: 3、配列番号: 4または配 列番号： 5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと HLA-A24抗原との複合体が榭状 細胞の細胞表面に提示された抗原提示細胞を挙げることができる。当該抗原提示細 胞は、例えば HLAの型が HLA-A24である前立腺癌患者力 抗原提示能を有する細 胞を単離し、該細胞に、配列番号: 3、配列番号: 4または配列番号: 5に記載のァミノ 酸配列からなるペプチドをイン ·ビトロでパルスし、 HLA-A24抗原と前記ペプチドとの 複合体を提示させることにより得られる。
[0085] 5)本発明の CTL
後述の実施例において、本発明のペプチド刺激により CTL誘導活性が認められた 。これは、本発明のペプチドと HLA抗原との複合体の提示された抗原提示細胞 (榭 状細胞）を用いることで、この抗原提示細胞を特異的に認識する CTLが誘導されたこ とを示すものである。従って、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと 末梢血リンパ球とをイン'ビトロで接触させることにより、 CTLを誘導することができる。 具体的には本発明は、腫瘍患者由来の末梢血リンパ球と、本発明のタンパク質、ぺ プチドおよび核酸のいずれかとをイン'ビトロで接触させることを特徴とする CTLの誘 導方法、および当該方法により誘導される CTLを提供するものである。
[0086] 例えばメラノーマにおいては、患者本人の腫瘍内浸潤 T細胞を体外で大量に培養 し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている (J.Natl.Cancer.Ins t.,86:1159 、 1994) oまたマウスのメラノーマにおいては、脾細胞をイン'ビトロで腫瘍 抗原ペプチド TRP-2で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的な CTLを増殖させ、該 CT Lをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（J.Exp.Me d., 185:453,1997 ) 0これは、抗原提示細胞上の HLA抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複 合体を特異的に認識する CTLを、イン'ビトロで増殖させた結果に基づくものである。 従って、本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸を用いて、イン'ビトロで患者末梢 血リンパ球を刺激して腫瘍特異的 CTLを増やした後、この CTLを患者に戻す治療法 は有用であると考えられる。
[0087] 養子免疫療法において用いられる CTLは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを 本発明のタンパク質、ペプチド、あるいは核酸でイン'ビトロで刺激することにより作製 される (Journal of Experimental Medicine 1999, 190:1669)。
[0088] 本発明の CTLは、本発明のタンパク質、ペプチドおよび核酸のいずれかと末梢血リ ンパ球とをイン'ビトロで接触させることにより誘導されたものであれば良ぐ単一の CT Lクローンであっても、様々な種類のクローン力もなる CTL混合物 (集団)であっても良 い。具体的には、例えば配列番号: 3、 4または 5に記載のアミノ酸配列からなるぺプチ ドと HLA-A24抗原との複合体を特異的に認識する CTLを挙げることができる。
[0089] 6)本発明の医薬組成物
以上に記載した本発明のタンパク質、ペプチド、核酸、抗原提示細胞および CTLは 、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、医薬組成物の有効成分とす ることができる。本発明の医薬組成物は、 CTLの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効 成分として使用することができる。以下具体的に説明する。 [0090] (1)本発明のタンパク質を有効成分とする CTLの誘導剤
本発明のタンパク質 AMACRは CTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または 予防のための医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすることができる。すなわち本発明のタ ンパク質を有効成分として含有する CTLの誘導剤は、腫瘍を治療または予防し得る ものである。当該タンパク質を腫瘍患者に投与すると、抗原提示細胞内に取り込まれ 、その後、細胞内分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合 体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に提示され、この複合体に特異的な CT Lが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療又 は予防が達成される。
[0091] 本発明のタンパク質を有効成分とする CTLの誘導剤は、 AMACR陽性の如何なる腫 瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大腸癌 、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、 子宮癌などの癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
本発明のタンパク質を有効成分として含有する CTLの誘導剤は、細胞性免疫が効 果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバント と混合して投与、又は併用して投与することができる。
[0092] アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものな どが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイト力イン、植 物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミ二 ゥムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プル口ニックポリオールの如き界面活性剤、ポリア 二オン、ペプチド、または油乳濁液 (エマルシヨン製剤）などを挙げることができる。ま た、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結 合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。
[0093] 前記において菌体由来成分又はその誘導体とは、具体的には、例えば (1)細菌の 死菌、（2)細菌由来の細胞壁骨格 (Cell Wall Skeleton, CWSと略する）、（3)菌体由来 の特定の成分又はその誘導体等に分類される。ここで (1)細菌の死菌としては、例え ば溶連菌粉末 (例えばピシバニール；中外製薬株式会社)、死菌浮遊物カクテル (例 えばブロンカスマ ·ベルナ；三和化学研究所）、あるいはヒト型結核菌の死菌等が挙げ られる。
(2)細菌由来の CWSとしては、マイクバクテリア属由来の CWS (例えばマイコバクテリ ァ属ゥシ型結核菌である BCG株の CWS)、ノカルディア属由来の CWS (例えばノカル ディア'ノブラの CWS)、あるいはコリネバクテリア属由来の CWS等が挙げられる。
[0094] (3)菌体由来の特定の成分又はその誘導体としては、例えば菌体由来多糖類であ るヒト型結核菌由来多糖類成分 (例えばアンサー；ゼリア新薬工業株式会社)や担子 菌由来多糖類 (例えばレンチナン;味の素、クレスチン;三共株式会社、担子菌カワラ タケ）、またムラミルジペプチド (MDP)関連化合物、リポ多糖 (LPS)、リピド A関連化合 物（MPL)、糖脂質トレハロースジマイコレート（TDM)、細菌由来の DNA (例えば CpG オリゴヌクレオチド）、あるいはこれらの誘導体などが挙げられる。
これら菌体由来成分及びその誘導体は、既に市販されているものであればそれを 入手するか、又は公知文献（例えば Cancer Res.,33,2187- 2195(1973)、 J.Natl.Cancer Inst.,48,831- 835(1972)、 J.Bacteriol.,94,1736- 1745(1967)、 Gann,69,619- 626(1978) 、 J.Bacteriol.,92, 869- 879(1966)、 J.Natl.Cancer Inst.,52,95- 101(1974))等に基き単 離又は製造することが可能である。
[0095] 前記において「サイト力イン」とは、例えば IFN- α、 IL- 12、 GM- CSF、 IL- 2、 IFN- γ 、 IL-18、あるいは IL-15などが挙げられる。これらのサイト力インは、天然品であっても 遺伝子組換え品であっても良い。これらのサイト力インは、既に市販されていればそ れを入手して使用することができる。また遺伝子組換え品であれば、例えば GenBank 、 EMBL、あるいは DDBJ等のデータベースにおいて登録されている各塩基配列に基 き、常法により所望の遺伝子をクローニングし、適当な発現ベクターに連結して作製 された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、発現 '生産すること ができる。
[0096] 前記において「植物由来成分又はその誘導体」とは、例えばサポニン由来成分で aooQuil A (Accurate Chemical&Scientificし orp)、 Q¾-21 (Aquila Biopharmaceutical s inc.)、あるいはグリチルリチン（SIGMA-ALDRICHなど）などが挙げられる。
前記において「海洋生物由来成分又はその誘導体」とは、例えば海綿由来の糖脂 質である a -ガラタトシルセラミドなどが挙げられる。 前記にぉ 、て油乳濁液 (エマルシヨン製剤）とは、例えば油中水型 (w/o)エマルショ ン製剤、水中油型 (o/w)エマルシヨン製剤、水中油中水型 (w/o/w)エマルシヨン製剤 などが挙げられる。
[0097] ここで油中水型 (w/o)エマルシヨン製剤は、有効成分を水の分散相に分散させた 形態をとる。水中油型 (o/w)エマルシヨン製剤は、有効成分を水の分散媒に分散さ せた形態をとる。また水中油中水型 (w/o/w)エマルシヨン製剤は、有効成分を最内 相の水の分散相に分散させた形態をとる。このようなエマルシヨン製剤の調製は、例 えば、特開平 8— 985号公報、特開平 9— 122476号公報等を参考にして行うことが できる。
[0098] 前記においてリボソーム製剤とは、有効成分を脂質二重膜構造のリボソームで水相 内または膜内に包み込んだ形の微粒子である。リボソームを作るための主要な脂質 としては、ホスファチジルコリン、スフインゴミエリン等が挙げられ、これにジセチルホス フェート、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン等をカ卩えてリボソームに荷電を与え て安定ィ匕させる。リボソームの調製方法としては、超音波法、エタノール注入法、エー テル注入法、逆相蒸発法、フレンチプレスェクストラクシヨン法等が挙げられる。
[0099] 前記においてマイクロスフェアー製剤は、均質な高分子マトリックス力も構成され、 該マトリックス中に有効成分が分散された形の微粒子である。マトリックスの材料として は、アルブミン、ゼラチン、キチン、キトサン、デンプン、ポリ乳酸、ポリアルキルシアノ アタリレート等の生分解性高分子が挙げられる。マイクロスフェアー製剤の調製方法 としては公知の方法（Eur. J. Pharm. Biopharm. 50:129-146, 2000、 Dev. Biol. Stand. 92:63-78, 1998、 Pharm. Biotechnol. 10:1-43, 1997)等に従えばよく特に限定されな い。
[0100] 前記においてマイクロカプセル製剤は、有効成分を芯物質として被膜物質で覆つ た形の微粒子である。被膜物質に用いられるコーティング材料としては、カルボキシメ チノレセノレロース、セノレロースアセテートフタレート、ェチノレセノレロース、ゼラチン、ゼラ チン'アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビュルアルコール、ヒドロキシプロピルセル ロース等の膜形成性高分子が挙げられる。マイクロカプセル製剤の調製方法は、コア セルべーシヨン法、界面重合法等が挙げられる。 投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げら れる。製剤中の本発明のタンパク質の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体 重等により適宜調整することができる力 通常 0.0001mg〜1000mg、好ましくは 0.001 mg〜100mg、より好ましくは 0.01mg〜10mgであり、これを数日ないし数月に 1回投与 するのが好ましい。
[0101] (2)本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤
本発明のペプチドは CTL誘導活性を有する。誘導された CTLは、細胞傷害作用や リンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明の ペプチドは、腫瘍の治療または予防のための医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすること ができる。本発明のペプチドを有効成分として含有する CTLの誘導剤を腫瘍患者に 投与すると、抗原提示細胞の HLA抗原に本発明のペプチドが提示され、提示された HLA抗原とペプチドとの結合複合体特異的 CTLが増殖して腫瘍細胞を破壊すること ができ、従って、患者の腫瘍を治療又は予防することができる。
本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、 AMACR陽性の如何なる腫 瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大腸癌 、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、 子宮癌などの癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
[0102] 本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、単一の CTLェピトープ (本発 明のペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（CTLェピトープ やヘルパーェピトープ）と連結したェピトープペプチドを有効成分とするものであって も良い。近年、複数の CTLェピトープ (抗原ペプチド)を連結したェピトープペプチド 力 イン'ビボで効率的に CTL誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1998, 161: 3186- 3194には、腫瘍抗原タンパク質 PSA由来の HLA- A2 , -A3, -All, B53拘束性 CTLェピトープ（抗原ペプチド）を連結した約 30merのェピト ープペプチド力 S、イン.ビボでそれぞれの CTLェピトープに特異的な CTLを誘導した ことが記載されて 、る。また CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連結させたェピ トープペプチドにより、効率的に CTLが誘導されることも示されている。このようなェピ トープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細 胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合体を形成し 、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的な CTL が体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。このようにして腫瘍の治療または 予防が達成される。
[0103] 本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤として、より具体的には、例えば 配列番号： 3〜配列番号： 33の 、ずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ぺプ チドを有効成分とする CTLの誘導剤が挙げられる。好ましくは配列番号: 3、配列番号 ： 4または配列番号： 5に記載のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分とする CTL の誘導剤が挙げられる。
[0104] 本発明のペプチドを有効成分とする CTLの誘導剤は、細胞性免疫が効果的に成 立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントと混合して 投与、又は併用して投与することができる。
アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev., 7:277-289, 1994)に記載のものな どが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分又はその誘導体、サイト力イン、植 物由来成分又はその誘導体、海洋生物由来成分又はその誘導体、水酸化アルミ二 ゥムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プル口ニックポリオールの如き界面活性剤、ポリア 二オン、ペプチド、または油乳濁液 (エマルシヨン製剤）などを挙げることができる。ま た、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結 合させた製剤、マイクロスフェアー製剤、マイクロカプセル製剤なども考えられる。これ らアジュバントの具体例については、前記「6)-(1)本発明のタンパク質を有効成分とす る CTLの誘導剤」の項を参照された!、。
[0105] 投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げら れる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重 等により適宜調整することができる力 通常 0.0001mg〜1000mg、好ましくは O.OOlmg 〜1000mg、より好ましくは O.lmg〜10mgであり、これを数日ないし数月に 1回投与す るのが好ましい。
[0106] (3)本発明の核酸を有効成分とする CTLの誘導剤
本発明の核酸は CTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防のための 医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明の核酸を有効成分として含 有する CTLの誘導剤は、例えば、本発明の核酸を腫瘍患者に投与し発現させること で、腫瘍を治療または予防し得るものである。
[0107] 例えば発現ベクターに組み込まれた本発明の核酸を以下の方法により腫瘍患者に 投与すると、抗原提示細胞内で腫瘍抗原タンパク質が高発現する。その後、細胞内 分解を受けて生じた腫瘍抗原ペプチドが HLA抗原と結合して複合体を形成し、該複 合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示されることにより、腫瘍特異的 CTLが体 内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療または予 防が達成される。
本発明の核酸を有効成分とする CTLの誘導剤は、 AMACR陽性の如何なる腫瘍患 者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大腸癌、卵 巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、脾臓癌、子宮 癌などの癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
[0108] 本発明の核酸を投与し細胞内に導入する方法としては、ウィルスベクターによる方 法およびその他の方法（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、月刊薬事， 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊， 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献等）のいずれ の方法も適用することができる。
ウィルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ 関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウィル ス、シンビスウィルス等の DNAウィルス又は RNAウィルスに本発明の DNAを組み 込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ 関連ウィルス、ワクシニアウィルス等を用いた方法が特に好ま 、。
[0109] その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法 (DNAヮクチ ン法）、リボソーム法、リポフエクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム 法、エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられ、特に DNAワクチン法、リボソーム法が好 ましい。
本発明の核酸を実際に医薬として作用させるには、当該核酸を直接体内に導入す る in vivo法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外で核酸を該細胞に導入しその 細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20-45頁、月刊 薬事， 36(1), 23-48(1994)、実験医学増刊， 12(15), (1994)、およびこれらの引用文献 等)。 in vivo法がより好ましい。
[0110] in vivo法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経 路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することが できる。 in vivo法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一 般的には有効成分である本発明の核酸を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、 医薬上許容されるキャリアー (担体)を加えてもよい。また、本発明の核酸を含有する リボソームまたは膜融合リボソーム（センダイウィルス（HJV)-リボソーム等）にお ヽては 、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤の形態とすることができ る。
製剤中の本発明の核酸の含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適 宜調整することができる力 通常、核酸中のポリヌクレオチドの含量として、 O.OOOlmg 〜100mg、好ましくは 0.001mg〜10mgの本発明の核酸を、数日ないし数月に 1回投与 するのが好ましい。
[0111] また近年、複数の CTLェピトープ (腫瘍抗原ペプチド)を連結したェピトープぺプチ ドをコードするポリヌクレオチド、ある 、は CTLェピトープとヘルパーェピトープとを連 結させたェピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド力 in vivoで効率的に CTL 誘導活性を有することが示されている。例えば Journal of Immunology 1999, 162: 391 5-3925には、 HBV由来 HLA-A2拘束性抗原ペプチド 6種類、 HLA-A11拘束性抗原 ペプチド 3種類、およびヘルパーェピトープを連結したェピトープペプチドをコードす る DNA (ミニジーン）力 イン'ビボでそれぞれのェピトープに対する CTLを効果的に 誘導したことが記載されて 、る。
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを 1種または 2種以上連結さ せることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結 させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことに より、 CTLの誘導剤の有効成分とすることができる。このような CTLの誘導剤も、前記 と同様の投与方法および投与形態をとることができる。 [0112] (4)本発明の抗原提示細胞を有効成分とする CTLの誘導剤
本発明の抗原提示細胞は CTLの誘導作用を有するため、腫瘍の治療または予防 のための医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすることができる。本発明の抗原提示細胞を 有効成分として含有する CTLの誘導剤は、本発明の抗原提示細胞を腫瘍患者に投 与することで、腫瘍を治療または予防し得るものである。
本発明の抗原提示細胞を有効成分とする CTLの誘導剤は、 AMACR陽性の如何な る腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は大 腸癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、脾臓 癌、子宮癌などの癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
[0113] 抗原提示細胞を有効成分として含有する CTLの誘導剤は、抗原提示細胞を安定 に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、培地等を含むことが 好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また 投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。このような抗原提示細胞を有効成 分として含有してなる CTLの誘導剤を患者の体内に戻すことにより、 AMACR陽性の 患者の体内で効率良く特異的な CTLが誘導され、腫瘍を治療することができる。
[0114] (5)本発明の CTLを有効成分とする癌ワクチン
本発明の CTLは腫瘍細胞傷害作用を有するため、腫瘍の治療または予防のため の医薬 (癌ワクチン)の有効成分とすることができる。
本発明の CTLを有効成分とする腫瘍の治療または予防薬は、 AMACR陽性の如何 なる腫瘍患者に対しても使用することができる。具体的には、例えば前立腺癌、又は 大腸癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、腎細胞癌、リンパ腫、メラノーマ、肝臓癌、胃癌、脾 臓癌、子宮癌などの癌 (腫瘍)の予防または治療のために使用することができる。
CTLを有効成分として含有する腫瘍の治療または予防薬は、 CTLを安定に維持す るために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、培地等を含むことが好ましい 。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。このような CT Lを有効成分として含有してなる腫瘍の治療または予防剤を患者の体内に戻すこと により、 AMACR陽性の患者の体内で CTLによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、 腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。 [0115] 7)本発明のペプチドに対する抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体 は、その形態に特に制限はなぐ本発明のペプチドを免疫抗原とするポリクローナル 抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良!、。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば 特に制限されないが、具体的には、配列番号: 3〜33のいずれかに記載のアミノ酸配 列からなる腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。好ましくは、配 列番号: 3、 4または 5に記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドに特異的に結 合する抗体が挙げられる。
[0116] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従 つて製造すること; 0できる (し urrent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et a 1. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜丄丄 .13、 Antibodies; A Labora tory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press出版 New York 1989)。
具体的には、本発明のペプチド (例えば配列番号： 3〜33の 、ずれかに記載のアミ ノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド)を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免 疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクロ一 ナル抗体の場合には、本発明のペプチド (例えば配列番号： 3〜33の 、ずれかに記 載のアミノ酸配列力 なる腫瘍抗原ペプチド)をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得ら れた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイプリドーマ細胞の中か ら得 こと力できる (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et ai. (1987 ) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11J。
[0117] 本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用い て免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、 フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン 、プル口-ックポリオル、ポリア-オン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットへモ シァニンおよびジニトロフエノールのような表面活性物質、 BCG (カルメット ゲラン 桿菌）やコリネバタテリゥム-パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。 [0118] 以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、 ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。 抗体の用途としては、ァフィユティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられ る。免疫学的診断は、ィムノブロット法、放射免疫測定法 (RIA)、酵素免疫測定法 (E LISA)、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は 、本発明の AMACR遺伝子が発現している癌、例えば前立腺癌等の診断において有 効である。
[0119] 8)本発明の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一
本発明はまた、本発明の腫瘍抗原ペプチドと HLA抗原とを含有する HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一を提供する。
癌免疫療法において、治療前に腫瘍抗原 (腫瘍抗原ペプチド）に対する CTL前駆 細胞の頻度や量を予め調べることや、腫瘍抗原 (腫瘍抗原ペプチド）による治療実施 中の患者における CTLの頻度や量を調べることは、当該腫瘍抗原 (腫瘍抗原べプチ ド）に対する応答性が高い患者の選択や、治療効果のモニタリング、治療の適合性 の判定などにお!ヽて重要な指標となる。腫瘍抗原ペプチドと HLA抗原とを含有する H LAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一は、抗原（抗原べ プチド)特異的 CTLの検出、すなわち当該 CTLの頻度や量を測定するための試薬と して有用である。
[0120] ここで HLAテトラマーとは、 HLA抗原の α鎖と j8 2ミクログロブリンをペプチド（抗原べ プチド）と会合させた複合体 (HLAモノマー）をピオチン化し、アビジンに結合させるこ とにより 4量体化したものを指す（Science 279: 2103-2106(1998)、 Science 274: 94-96 (1996》。
HLAモノマーとは前記 HLAテトラマーの製造において用いられる、 HLA抗原 α鎖、 β 2ミクログロブリン、抗原ペプチドの会合体をピオチンィ匕したもの（単量体)を指す。
[0121] HLAダイマーとは HLA抗原 α鎖と Ig (ィムノグロブリン、例えば IgGl)とを融合させ、こ れに 13 2ミクログロブリン、抗原ペプチドを結合させたものを指す (Pro Natl.Acad.Sci. USA 90:6671-6675(1993))。 HLAダイマーに結合した抗原ペプチド特異的 CTLは、例 えば標識抗 IgGl抗体を IgGlに結合させることなどにより、検出することができる。 HLAペンタマ一とは近年開発された技術であり、 HLA抗原と抗原ペプチドとの複合 体 5分子が Coiled-Coilドメインを介して重合した 5量体を指す。 HLA抗原 抗原ぺプ チドの複合体を蛍光色素等で標識することができるため、 HLAテトラマー法と同様に フローサイトメーター等で解析することができる（http：〃 www.proimmune.co.uk/参照）
[0122] 以上に述べた HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一はいずれも受 託合成可能であり、例えば Prolmmune社や BD Biosciences社などに委託することによ り合成することができる。また現在では種々の抗原ペプチドを含有する HLAテトラマ 一なども市販されて ヽる ((株)医学生物学研究所等)。
[0123] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一として具体的には、 例えば配列番号： 3、配列番号： 4または配列番号： 5に記載のアミノ酸配列からなるぺ プチドと HLA-A24抗原とを含有する HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタ マーが挙げられる。このうち CTLの検出においては HLAテトラマーまたは HLAペンタ マーを用いることが好まし 、。
[0124] HLAモノマー、 HLAテトラマーおよび HLAペンタマ一は、フローサイトメトリー、蛍光 顕微鏡等の公知の検出手段により結合した CTLを容易に選別または検出することが 出来るように蛍光標識されていることが好ましい。具体的には、例えばフィコエリスリン (PE)、フルォレセインイソチオシァネート（FITC)、ベリジ-ンクロロフィルプロテイン（ PerCP)、ァロフィコシァニン (APC)などにより標識された HLAモノマー、 HLAテトラマ 一および HLAペンタマ一が挙げられる。
[0125] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一の成分である HLA 抗原のうち、 HLA- A24抗原（HLA- A24抗原の α鎖）は、 Genbank Accession No.M64 740に開示されている HLA-A2402の公知の塩基配列の情報等に基づき、 PCR法等 の常法により容易にクローユングすることができる。また HLA-A2抗原（HLA-A2抗原 の α鎖）は、 GenBank (^^0.\184379に開示されてぃる1"[1^- 0201遺伝子の公知 の塩基配列の情報等に基づき、 PCR法等の常法により容易にクローユングすることが できる。
[0126] 本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一の成分である β 2ミ クログロブリンは、ヒト由来の β 2ミクログロブリンが好ましい。当該ヒト 13 2ミクログロブリ ンは GenBank Acc.No.AB021288に開示されているヒト j8 2ミクログロブリンの公知の 塩基配列情報に基づき、 PCR法等の常法により容易にクローユングすることができる
[0127] HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一作製法にっ 、ては、前記各 文献により周知である力 具体的に HLA-A24を用いた HLAテトラマーの作製法につ き簡単に述べると以下のようになる。
まずタンパク質を発現可能な大腸菌や哺乳動物細胞に、 HLA-A24 a鎖発現べクタ 一および j8 2ミクログロブリン発現ベクターを導入し発現させる。ここでは大腸菌（例え ば BL21)を用いることが好ま ヽ。得られた単量体 HLA-A24複合体と本発明べプチ ドとを混合し、可溶性の HLA-ペプチド複合体を形成させる。次に HLA-ペプチド複合 体における HLA-A24 a鎖の C末端部位の配列を BirA酵素によりピオチンィ匕する。こ のピオチンィ匕された HLA-ペプチド複合体と蛍光標識されたアビジンとを 4： 1のモル 比で混合することにより、 HLAテトラマーを調製することができる。なお、前記各ステツ プにおいて、ゲルろ過等によるタンパク精製を行うことが好ましい。
[0128] 前記で本発明の HLAモノマー、ダイマー、テトラマーおよびペンタマ一は、 AMACR 由来の腫瘍抗原ペプチド特異的な CTLの検出用試薬として有効に用いられる。 本発明の CTL検出用試薬は、例えば以下の目的に使用することができる：
1)本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸による治療開始前に、本発明の腫瘍抗 原ペプチドに対する CTL前駆細胞の頻度や量を調べる。これにより、当該腫瘍抗原 ペプチドに対する患者の応答性を判断することができる。
2)本発明のタンパク質、ペプチドまたは核酸による治療実施中の患者における CTL の頻度や量を調べる。これにより治療効果のモニタリング、治療の適合性の判定、治 療が順調に進んでいることの確認などを行うことができる。
[0129] CTLの検出法としては、具体的には、被験患者より CTLを含む生体試料 (例えば PB MC)を単離し、本発明の HLAテトラマー等と前記生体試料とを接触させ、 HLAテトラ マー等に結合した本発明ペプチド特異的な CTLの存在頻度または量を、フローサイ トメータ一等で測定する。 [0130] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する力 本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではな 、。
実施例 1
[0131] 候補ペプチドの撰択および合成
(1)候補ペプチドの選択
ヒト AMACRのアミノ酸配列 (配列番号： 2)中、 HLA-A24分子に結合する可能性のあ るペプチドとして配列番号： 3〜23に記載のアミノ酸配列力 なるペプチドを選択した 。また、 HLA-A2分子に結合する可能性のあるペプチドとして配列番号: 24〜33に記 載のアミノ酸配列力 なるペプチドを選択した。各ペプチドの配列と AMACR上の位 置を以下の表に示す。
[0132] [表 2]
AMACR A24 peptides
Figure imgf000043_0001
[0133] [表 3] AMAGR A2 peptides
Figure imgf000044_0001
[0134] (2)ペプチド合成
前記のペプチドのうち、 AMACR 125-133 (配列番号： 3)、 AMACR 183-191 (配列 番号： 4)、 AMACR 240- 248 (配列番号： 5)および AMACR 364-373 (配列番号： 6)の ペプチドを Fmoc法にて合成し、以下の実験に用いた。
実施例 2
[0135] AMACR杭原由来ペプチドの HLA-A*2402への結合親和件の枪討
実施例 1で合成したペプチドの HLA-*A2402への結合親和性の測定は、文献 (J. I mmunol. 164:2565, 2000)に記載の方法と同様に実施した。 MHCクラス I分子を発現 して 、な 、マウスリンパ腫由来の細胞株 RMA-Sに HLA-*A2402と H-2Kbのキメラ MH Cの遺伝子を安定的に導入した細胞株 RMA-S-A*2402細胞を、 26°Cで 18時間培養 した。 RMA- S- A*2402細胞を PBS溶液で洗浄後、 3 μ L/mLのヒト β -ミクログロブリン
2
と 100 L/mLの各種ペプチドを含有する培養液 OPTI-MEM(Invitrogen社)に懸濁し て 26°Cで 3時間、 37°Cで 3時間培養した。この細胞を PBS溶液で洗浄後、抗 HLA-A24 抗体、抗 HLA-A2抗体により 4°Cで 30分間処理した。さらに細胞を PBS溶液で洗浄後 、 PE標識した抗マウス IgG抗体により 4°Cで 30分間処理した。細胞を洗浄後、 1%ホル マリンを含む PBS溶液 lmLに懸濁して固定した。細胞はフローサイトメーター装置 FA CScan (BDバイオサイエンス社)で測定し、平均蛍光強度によりペプチドの結合親和 性を求めた。検討した 4種類のペプチドの結合親和性を測定した結果を図 1に示した
[0136] 陽性対照として用いた、文献 0. Immunol. 158:3325, 1997)で HLA-A*2402に結合 することが報告されている EBウィルス由来のペプチド (EBV)、及び文献 (J. Immunol. 1 64:2565, 2000)で報告されている HIVウィルス由来のペプチド (HIV)は、強い結合能を 示した。陰性対照として用いた文献 (Eur J Immunol. 21 :2891 , 1991)で H2-Kbに結合 することが報告されている Ovalbumin由来のペプチド (SL8)は、低い活性を示した。検 討に用いたペプチドのうち AMACR抗原由来の 3種類のペプチド AMACR 125-133 ( 配列番号： 3)、 AMACR 183-191 (配列番号： 4)および AMACR 240-248 (配列番号： 5 )は、 HLA-A*2402に非常に良好に結合することが示された。
実施例 3
[0137] AMACR杭原由 ペプチドによるヒト末梢血単核球力ゝらの CTL誘導 (1)
実施例 2で HLA-A*2402への強!、結合能が認められたペプチド AMACR 240-248( 配列番号： 5)について、文献 (J. Immunol. 169: 1611 , 2002)と同様の方法により、末梢 血単核球からの CTL誘導を行った。 HLA-A*2402陽性の前立腺癌患者からインフォ ームドコンセントを得て末梢血を採血し、比重遠心法により単核球を分離し、 AIM-V 培養液 Onvitrogen社)を用いて培養した。 24時間後、非接着性の細胞を回収して、 10 OU/mLの IL-2を含んだ AIM-Vを用いて培養した。抗原提示用細胞調製のため、接 着性の細胞は、 lOOOU/mLの IL-4と lOOOU/mLの GM- CSFを含む AIM-V培養液で 5 日間培養した後、 10 μ Μの各種ペプチドを添カ卩して 1日間培養し、さらに lOng/mLの TNFと lOOOU/mLの IFN- aを加えて培養した。非接着性の細胞から CD8陽性 T細胞 を抗 CD8抗体結合マグネチックビーズで分離し、上記のペプチドをパルスした抗原 提示用細胞ととも培養した。 CD8陽性 T細胞を分離した残りの非接着性細胞は、 1 μ g/mLの ΡΗΑと lOOU/mLの IL- 2を含む AIM- V培地で 3日間培養した後、 PHAを除い た培地で 4日間培養し、 2回目、 3回目のペプチド刺激用の抗原提示細胞としてストッ クした。ペプチド刺激をした CD8陽性 T細胞に対しては、 1回目のペプチド刺激から 7 日後と 14日後に、ストックの抗原提示細胞に上記のペプチドを 2時間パルスし、 5000r adで X線照射した細胞を添加して 2回目、 3回目のペプチド刺激を行った。 3回目の 刺激から 1週間後の T細胞の細胞傷害活性を51 Crリリースアツセィにより測定した。
[0138] 標的細胞として、 TAP分子を欠失した T2細胞に HLA-A*2402遺伝子を安定的に導 入した T2A24細胞に対し、ペプチド AMACR 240-248(配列番号： 5)を添カ卩あるいは 非添加の細胞、 HLA-A24に結合する HIV由来ペプチドを添カ卩した細胞、また NK細 胞に対して感受性を示す HLA-A*2402陰性の慢性骨髄性白血病由来細胞株 K562 ( ATCC株番号 CCL-243)を用いた。標的細胞は、 100 /z Ciの51 Crで 1時間ラベルした。 5 X 103個の標的細胞に対して、 30倍のエフェクター細胞 (ペプチド刺激した T細胞）を 添加し、 4時間培養して細胞傷害活性を測定した。前立腺癌患者検体 7例の結果を 図 2に示す。検体 l(Case 1)において、 AMACR 240-248(配列番号： 5)で刺激した T細 胞は、ペプチドパルスした HLA-A*2402陽性の T2A24細胞を傷害した力 ペプチド非 添加、 HIV由来ペプチドを添カ卩した細胞および HLA-A*2402陰性の K562は傷害しな かった。このように AMACR由来のペプチド AMACR 240-248により誘導された CTLは 、 HLA-A*2402拘束性に AMACR由来のペプチド提示細胞を特異的に傷害したこと から、 AMACR 240-248は腫瘍抗原ペプチドであることが示された。また、当該腫瘍抗 原ペプチドの由来である AMACRタンパクは腫瘍抗原タンパクであることが明らかとな つた o
実施例 4
[0139] AMACR抗原由来ペプチドによるヒト末梢血単核球からの CTL誘導 (2)
実施例 2で HLA-A*2402への強!、結合能が認められたペプチド AMACR 125-133( 配列番号： 3)および AMACR 183-19K配列番号: 4)について、実施例 3と同様の方 法により、 HLA-A*2402陽性の前立腺癌患者由来末梢血単核球力ゝらの CTL誘導を 行った。前立腺癌患者検体 7例の結果を図 3に示す。 2検体 (Case8,Case9)において 、 AMACR 125-133、 AMACR 183-191で刺激した T細胞は、ペプチドパルスした HLA -Α*2402陽性の Τ2Α24細胞を強く傷害したが、ペプチド非添加その他標的細胞に対 してはペプチドパルスしたものに比較して弱い傷害性が検出された。
[0140] 更にペプチド AMACR 125-133(配列番号： 3)、 AMACR 183-191(配列番号： 4)を用 Vヽて、 Case9で得られた CTLを用いて E/T (Effector (CTL)と target (標的細胞） )の比 率を変化させた時の細胞傷害性を検討した結果を図 4に示す。 AMACR 125-133、 A MACR 183-191で誘導された CTLは、低い E/T比 (1,3)ではペプチド非添加等陰性対 照の標的細胞には傷害性を示さず、ペプチドパルスした HLA-A*2402陽性の T2A24 細胞のみを強く傷害した。また高い E/T比 (10,30)では、図 3の結果と同様、ペプチド 非添加その他陰性対照の標的細胞に対して弱 、傷害性を示したが、ペプチドパルス した HLA-A*2402陽性の T2A24細胞にはより強 、傷害性を示した。
[0141] 以上の結果から、 AMACR 240-248 (配列番号： 5)と同様に、 AMACR 125-133(配列 番号: 3)および AMACR 183-19 配列番号: 4)も腫瘍抗原ペプチドであることが示さ れた。
産業上の利用可能性
[0142] 本発明により AMACRおよび当該 AMACR由来ペプチド、またはこれらをコードする 核酸等の、癌免疫分野における利用が提供される。本発明の腫瘍抗原タンパク質 A MACRおよびそれに由来する腫瘍抗原ペプチドは、前立腺癌などの癌患者を処置 することができる。
図面の簡単な説明
[0143] [図 1]AMACR由来の 4種類のペプチドおよび陽性コントロールである EBウィルス由来 ペプチド (図中 EBV)、 HIVウィルス由来ペプチド (図中 HIV)、陰性コントロールである 0 valbumin由来のペプチド (SL8)の HLA-A*2402への結合親和性を示したグラフである 。図中、縦軸は平均蛍光強度 (結合親和性)を示す。横軸はペプチド名を示す。
[図 2]AMACR 240-248ペプチドを用いて前立腺癌患者末梢血リンパ球より誘導した ペプチド特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)誘導能を示した結果である。図中、縦軸 は CTLによる細胞傷害活性を示す。横軸は前立腺癌 7例の症例を CaSel〜7で示す。 またペプチド特異性を示すため、 4種の標的細胞を用い、 T2A24 -)は T2A24細胞の み、 T2A24 AMACRは T2A24細胞に AMACR 240- 248ペプチドを添加、 T2A24 HIV は T2A24細胞に HIVペプチドを添加、 K562は K562細胞のみを示す。
[0144] [図 3]AMACR 125-133と AMACR 183-191ペプチドを用いて前立腺癌患者末梢血リ ンパ球より誘導したペプチド特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)誘導能を示した結果 である。図中、縦軸は CTLによる細胞傷害活性を示す。横軸は前立腺癌 7例の症例 を Case8〜14で示す。またペプチド特異性を示すため、 4種の標的細胞を用い、 T2A2 4(- )は T2A24細胞のみ、 T2A24 AMACRは T2A24細胞に AMACR 125- 133と AMACR 183-191ペプチドを添加、 T2A24 HIVは T2A24細胞に HIVペプチドを添加、 K562は K 562細胞のみを示す。
[図 4]AMACR 125- 133と AMACR 183- 191ペプチドを用いて前立腺癌患者（Case9) 末梢血リンパ球より誘導したペプチド特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)誘導能を Ε/ T (Effector (CTL)と target (標的細胞） )の比率を変化させた時の結果である。図中、 縦軸は CTLによる細胞傷害活性を示す。横軸は E/T比を 1,3,10,30に設定し、示す。 またペプチド特異性を示すため、 4種の標的細胞を用い、 T2A24 -)は T2A24細胞の み、 T2A24 AMACRは T2A24細胞に AMACR 125- 133と AMACR 183- 191ペプチドを 添加、 T2A24 HIVは T2A24細胞に HIVペプチドを添加、 K562は K562細胞のみを示 す。
配列表フリーテキスト
配列番号： 3〜33に記載のアミノ酸配列は合成ペプチドである。

Claims

請求の範囲
[I] alpha-methylacyl-CoA racemase (以下、 AMACR)由来の部分ペプチドを含有し、 かつ HLA抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド。
[2] HLA抗原が HLA— A24抗原または HLA— A2抗原である、請求項 1記載のぺプ チド。
[3] 配列番号： 3〜配列番号： 33のいずれかに記載のアミノ酸配列を含有する、請求項 2記載のペプチド。
[4] 配列番号： 3〜配列番号： 23のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位のアミノ酸 がチロシン、フエ-ルァラニン、メチォニンまたはトリプトファンに置換され、及び/又 は C末端のアミノ酸がフエ-ルァラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファンまたはメ チォニンに置換されたアミノ酸配列を含有し、かつ HLA— A24抗原と結合して CTL により認識されるペプチド。
[5] 配列番号： 24〜配列番号： 33のいずれかに記載のアミノ酸配列の第 2位のアミノ 酸がロイシン、メチォニン、パリン、イソロイシンまたはグルタミンに置換され、及び/ 又は C末端のアミノ酸力パリンまたはロイシンに置換されたアミノ酸配列を含有し、か つ HLA— A2抗原と結合して CTLにより認識されるペプチド。
[6] 請求項 1〜5の 、ずれかに記載のペプチドを含有するェピトープペプチド。
[7] 請求項 1〜6のいずれかに記載のペプチドと薬学的に許容される担体とを含有する 医薬組成物。
[8] 請求項 1〜6のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する 核酸。
[9] 請求項 8記載の核酸と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[10] AMACRと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[II] AMACRが配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質である、請求 項 10記載の医薬組成物。
[12] AMACRをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸と薬学的に許容される担体と を含有する医薬組成物。
[13] AMACRをコードするポリヌクレオチドが配列番号： 1に記載の塩基配列を含有す るポリヌクレオチド、または配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ チドである、請求項 12記載の医薬組成物。
[14] 以下の（a)〜（d) :
(a)請求項 1〜6のいずれかに記載のペプチド、
(b)請求項 8記載の核酸、
(c) AMACRゝおよび
(d) AMACRをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、抗原提示能を有する細胞とをイン'ビトロで接触させることを特徴とす る、抗原提示細胞の製造方法。
[15] 請求項 14記載の製造方法により製造される抗原提示細胞。
[16] 請求項 15記載の抗原提示細胞と薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成 物。
[17] 以下の (a)〜(d) :
(a)請求項 1〜6のいずれかに記載のペプチド、
(b)請求項 8記載の核酸、
(c) AMACRゝおよび
(d) AMACRをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
のいずれかと、末梢血リンパ球とをイン'ビトロで接触させることを特徴とする、 CTLの 誘導方法。
[18] 請求項 17記載の誘導方法により誘導される CTL。
[19] 請求項 18記載の CTLと薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
[20] CTLの誘導剤として使用される、請求項 7、 9、 10、 11、 12、 13または 16に記載の 医薬組成物。
[21] 癌ワクチンとして使用される、請求項 7、 9、 10、 11、 12、 13、 16または 19に記載の 医薬組成物。
[22] 請求項 1〜5のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
[23] 請求項 1〜5の!、ずれかに記載のペプチドと HLA抗原とを含有する HLAモノマー 、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペンタマ一。 請求項 23記載の HLAモノマー、 HLAダイマー、 HLAテトラマーまたは HLAペン タマ一を成分として含有する、 AMACR由来の腫瘍抗原ペプチド特異的な CTLの 検出用試薬。
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