JP2011525108A - ミッドカインタンパク質に由来する抗ガンワクチンとしての免疫原性ペプチド - Google Patents

Abstract

抗ガンワクチン又はガンの間若しくは抗ガン治療の間のミッドカインに対する細胞性応答のモニタリング用試薬としての、白色人種において優勢なHLA分子により制限された少なくとも１つのCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープを含んでなる少なくとも１つのミッドカインタンパク質に由来するペプチド、又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、多くのタイプのガンにおける抗ガンワクチンとしての、白色人種の大多数の個体でミッドカインタンパク質を認識するCD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球を誘導し得る該ミッドカインタンパク質に由来するペプチドの使用に関する。

本発明はまた、多くのタイプのガンにおいて、白色人種の大多数の個体においてミッドカインタンパク質に特異的なCD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球により認識されるペプチドを、ガン又は抗ガン治療の間のミッドカインに対する細胞性応答の免疫モニタリング用試薬として使用することに関する。

腫瘍細胞は、健常細胞が発現しないか若しくは非常に少量にしか発現しないタンパク質又は少数の細胞タイプでのみ見出されるタンパク質の一団を発現する。腫瘍細胞において優先的に発現されるこれらタンパク質は、腫瘍抗原、すなわち腫瘍に存在し、且つ腫瘍を認識し(理想的には腫瘍を排除し)得る免疫応答を誘導するタンパク質を構成することがある。この応答は、抗体応答(抗原が膜抗原である場合)及びCD8⁺又はCD4⁺ Tリンパ球が関与する細胞性応答の両方であり得る。ほとんどの腫瘍抗原は細胞内にあり、細胞性応答を誘導する。これらは、ワクチン開発についての好適なターゲットを構成する。

Ｔリンパ球は腫瘍に対する細胞性免疫応答に貢献する。これらは、ガンを患っている患者で自然に誘導され、腫瘍に浸潤し、稀に自然退縮を生じることがある。Ｔリンパ球は、その動員が促進されるように設計されたワクチンにより誘導することができる。抗腫瘍免疫に関与する２タイプのＴリンパ球が存在する。CD8⁺ Tリンパ球は細胞傷害性(CD8⁺ CTL)であり、腫瘍細胞を溶解することができる。認識の間の細胞溶解には、パーフォリン及びグランザイムが関与する。CD8⁺ Tリンパ球は、腫瘍表面に存在するクラスI HLA分子(HLA-A、HLA-B及びHLA-C)により提示される(CD8⁺ Tエピトープと呼ばれる)ペプチド形態の腫瘍抗原を認識する。ヘルパーCD4⁺ Tリンパ球は、クラスII HLA分子により提示される(CD4⁺ Tエピトープと呼ばれる)ペプチド形態の腫瘍抗原を認識する。CD4⁺ Tリンパ球は、腫瘍を、腫瘍がクラスII分子を発現するときには直接認識することができ、又は樹状細胞(その表面に多数のクラスII HLA分子を有する細胞)による細胞片の取り込みを経て間接的に認識することができる。抗腫瘍免疫に関与するCD4⁺ Tリンパ球は、腫瘍抑制で多くの役割を果たし、特にCD8⁺ CTLの動員及び維持に関与する。CD4⁺ Tリンパ球は、CD40-依存性の機序を介して、樹状細胞(DC)の活性化の一翼を担っている。CD4⁺ Tリンパ球は、DCによるIL-12の分泌及び表面での同時刺激性分子又は接着分子(I-CAM-1、CD80、CD86)の発現を増加させる。この活性化によりCTLの動員が可能になる。加えて、クラスＩ分子を発現しないマウスで観察された結果から、ヘルパーＴリンパ球がCTL-非依存性機序を介して、おそらくはマクロファージの活性化を介して、腫瘍を抑制することも示唆される。最後に、CD4⁺ Tリンパ球は、それ自体が細胞傷害性であり得る。樹状細胞もまた、この応答を開始することで抗腫瘍免疫に関与する。実際、ナイーブな腫瘍-特異的Ｔリンパ球は、腫瘍細胞ではなく、樹状細胞によって動員され活性化される。

1990年代の最初の腫瘍抗原の発見は、腫瘍で発現するこれらタンパク質に関する多くの研究の起点となった。腫瘍抗原は、発現の態様により幾つかのカテゴリーに分類される。

＊腫瘍-特異抗原
これは、メラノーマで最初に発見されたが実際には多くの腫瘍で発現する最大の抗原群である。この抗原は、これを発現する唯一の健常組織である精巣で発現することから「精巣ガン」とも呼ばれる。この抗原の幾つかは、胎盤又は卵巣でも発現している。精巣及び胎盤は通常のHLA分子を欠いているので、この抗原はこの健常組織ではＴリンパ球には認識できない。主な抗原は、MAGE-A、MAGE-B、MAGE-C、GAGE、LAGE及びSSX抗原である。

＊分化抗原
分化抗原は、腫瘍及び腫瘍が生じた細胞組織により発現されるタンパク質である。最もよく知られた例は、メラノサイトでも発現されるメラノーマ抗原である。メラノーマ抗原は、チロシナーゼ(TYRO、TRP-1及びTRP-2)並びにGp100及びMELAN-A/MART-1抗原である。他の分化抗原も、前立腺腫瘍(カリクレイン-４及びPSA)又は消化管ガン(CEA)について知られている。

＊過剰発現抗原
過剰発現抗原は、正常細胞での発現レベルは然程高くないが多くの腫瘍細胞で高発現するタンパク質である。乳ガンや卵巣ガンの約30％で、大腸ガンや腎臓ガンでも幾分見出されるHER-2/neu抗原がこれに該当する。P53も腫瘍でしばしば過剰発現する。細胞増殖を阻害するこのタンパク質は、正常細胞では通常非常に迅速にリサイクルされる。テロメラーゼ(hTERT)は、組織起源に関わらず80％を超える腫瘍で見出される一方、正常細胞では存在しないか又は低ノイズレベルで発現する。テロメラーゼの作用は、細胞分割の間に起こるテロメアの減少を補償する働きをする。テロメラーゼがテロメラーゼ長を一定に維持することによって、細胞増殖、したがって腫瘍形成が促進される。サービビンタンパク質のようなアポトーシス阻害タンパク質(IAP)は、カスパーゼの阻害により細胞死を阻害するタンパク質ファミリーを構成する。

＊その他の抗原
その他の抗原カテゴリーは、遺伝子変異又は遺伝子配置(genetic arrangement)から生じる抗原(MUM-1、CDK4、ベータ-カテニン、HLA-A2、BCR-ALB、CASP-8)及びウイルス起源の腫瘍抗原(子宮頸ガンに関与するパピローマウイルスのE6及びE7タンパク質)である。

多くの腫瘍抗原が既に見出されているが、ガンに対抗するワクチンは完成していない。ワクチン接種試験は依然として全く期待はずれであり、ワクチンで退縮が起こるケースは稀である。この失敗は、同定された抗原の弱い免疫原性の結果であるか、又は腫瘍が標的抗原をもはや発現しなくする逃避機序の結果である。しばしば、標的抗原は当該細胞にとって生命維持に不可欠ではないので、腫瘍の逃避が起こることがある。同定された抗原は大部分がメラノーマのものであり、その他の多くのガンには適切でない。広範な発現スペクトルを有し、多くのガンに適切なワクチンを可能にする抗原は少数しか知られていない。これらは主として、テロメラーゼやサービビン(PCT国際出願WO 2007/036638)のような過剰発現抗原である。

しかし、その起源に関わらず腫瘍細胞で優先的に発現され、したがって多くのガンに適切なワクチンを構成し得る多くのタンパク質が存在する。これらタンパク質がワクチンに関して興味深いものとなるためには、それらタンパク質が、該タンパク質を発現する腫瘍細胞を認識するＴリンパ球を誘導することができることを示す必要がある。実際には、これらタンパク質は、配列中にＴエピトープがないこと又は寛容機構のために弱い免疫原性しか示さない可能性がある。また、これらタンパク質は免疫応答を誘導し得るが、誘導された細胞は腫瘍を認識しない可能性もある。これらタンパク質に由来するＴエピトープは、実際には、不十分な発現レベル又は腫瘍細胞における該タンパク質の不正確なプロセシングに起因して腫瘍細胞の表面で提示されない可能性がある。

ミッドカイン(MDK)タンパク質は、NEGF2(神経突起生長促進因子２)としても知られるが、1988年に、レチノイン酸により誘導される胚性ガン腫細胞タンパク質と証明された(Kadomatsuら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988, 151, 1312-1318；概説についてはhttp://www.midkine.orgを参照)。ヒトでは、ミッドカイン遺伝子は第11染色体の11p11.2位に位置する。これは、４つのエキソンを含んでなり、3.5kbのサイズを有する。；コーディング配列はNCBIアクセッション番号M69148(添付の配列表の配列番号：１)に相当する。調節5'領域はレチノイン酸応答部位及び２つのWT1(ウィルムス腫瘍抑制因子１)腫瘍抑制因子応答部位を含有する。レチノイン酸応答部位は、レチノイン酸によるミッドカイン発現の誘導を担う一方、WT1応答部位は、WT1による発現の低減に関与する。INSP106として知られる、ヒトミッドカインタンパク質スプライス異形体も記載されている(PCT国際出願WO 2004/052928)。

ミッドカインは、５つのジスルフィドブリッジ[(37,61)；(45,70)；(52,74)；(84,116)；(94,126)]を有する、塩基性残基に富む143アミノ酸のタンパク質である。ヒト配列は、SwissProtアクセッション番号P21741に相当する(図１及び添付の配列表の配列番号２)。これは、22アミノ酸のシグナルペプチドを含んでなる前駆体の形態で発現される(図１)。これは、プレイオトロフィンタンパク質と約50％の相同性を示す。ミッドカインの構造は1997年にNMRによって解析された。このタンパク質は、各々がジスルフィドブリッジにより保持された３つの逆平行ベータシートからなる２つの異なるドメインを含んでなる；この２つのドメインは可撓性領域により接続されている。生物学的活性(神経突起成長、フィブリン溶解及び神経細胞遊走)にはＣ-末端ドメインのみ必要である。このドメインは保存されており、ショウジョウバエからヒトにまで見出される。このことにより、その機能的役割が確証される。ミッドカインは、２つのヘパリン結合部位も含んでなる。(多くの活性を示す)ミッドカインに結合し得るレセプターは少なくとも４つ知られている：ヘパリン硫酸を含んでなるプロテオグリカンである、シンデカンファミリーのメンバー；硫酸コンドロイチンを含んでなるプロテオグリカンである、PTPζ；ALK(未分化リンパ腫キナーゼ；Anaplastic Lymphoma Kinase)；LDLレセプターファミリーのメンバーである、LRP。

正常個体において、ミッドカインは主に胚形成の間に発現し、発現ピークは妊娠中期である。ミッドカインはニューロン発生に関与する。ミッドカインは神経突起成長及び神経細胞遊走を引き起こす。ミッドカインはまた、神経筋接合部の発生及びニューロンの保護に関与する。胚形成の間、ミッドカインは、歯、胚、腎臓及び骨の発生に関与する。ミッドカイン遺伝子を欠損するマウスは生存可能であり、神経系発生におけるミッドカインの役割に応じて、ニューロン機能に関してのみ影響を受ける。ミッドカイン遺伝子を欠損させたマウスは、対照マウスよりもネフライト(nephrite)誘導による影響が少ないことも観察されている。該動物は、再狭窄(損傷動脈組織の増殖に起因する動脈の狭窄)にも罹り難い。

ミッドカインは多くの腫瘍で過剰発現する一方、健常成体個体での発現は少なく、局所的である(小腸、脳)。ミッドカインは、健常組織と比較して腫瘍で最も多く発現する40遺伝子の１つである(Velculescuら, Nat. Genet., 1999, 23, 387-388)。ミッドカインは、多くのヒトガン、特にガン腫の約80％の場合で過剰発現する。ミッドカインの高発現は、特に食道ガン、胃ガン、結腸ガン、膵臓ガン、甲状腺ガン、肺ガン、乳ガン、膀胱ガン、子宮ガン、卵巣ガン及び前立腺ガン、肝細胞ガン腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫、星状芽細胞腫、白血病及びウィルムス腫瘍で観察されている(Moonら, Gynecologic Oncology, 2003, 88, 289-297；Hidakaら, Leukemia Res., 2007, 8, 1045-1051；Maedaら, Br. J. Cancer, 2007, 97, 405-411；Renら, World J. Gastroenterol., 2006, 12, 20062010)。高発現は、膀胱ガン、グリア芽細胞腫及び神経芽細胞腫における貧弱な予後と関連付けられている(O'Brien, Cancer Res., 1996, 56, 25152518)。加えて、ミッドカインの過剰発現は、ヒト胃ガン細胞株における化学療法に対する増大した抵抗性と関連付けられている。ミッドカインは組織でのみ発現するわけではない。高レベルのミッドカインは、ガン腫を患っている患者の60％超において、血清中で観察されている(Muramatsuら, J. Biochem., 2003, 132, 259-371)。このレベルは腫瘍が取り除かれると減少する。よって、血清中のミッドカインの存在は、診断上の価値を有し得る。ミッドカインは、腫瘍形成に関連する多くの活性を有しているようである。それは、実際には、トランスフォーミング活性、抗-アポトーシス活性、有糸分裂促進活性、血管形成活性、フィブリン溶解活性及び化学走性活性を有している。(Kadomatsuら, Cancer Letters, 2004, 127-143)。ミッドカイン遺伝子を標的とするアンチセンスストラテジーがマウスにおいてガン腫の腫瘍形成を抑制することが示されている(Takeiら, Cancer Research, 2001, 61, 8486-8491)。

多くの生物学的活性に起因して、ミッドカイン又はそのモジュレータ(インヒビター)は、血管形成及び造血の刺激、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄の予防、及びアポトーシスの抑制、炎症性の心臓の病的状態(心筋梗塞)、大脳の病的状態、肝臓の病的状態、神経の病的状態、腎臓の病的状態、眼の病的状態(網膜症)、神経線維腫、呼吸の病的状態(喘息及び肺肥大)及び術後の病的状態の予防及び治療に有用である(米国出願US 2003/0072739、US 2003/0185794、US 2004/0077579、US 2005/0079151、US 2006/0148738及びUS 2005/0130928；欧州特許出願EP 1832296、PCT国際出願WO 2007/055397及びWO 2000/031541；並びに特許US 5,629,284；US 6,383,480及びUS 6,572,851)。

加えて、血中及び尿中でのミッドカインタンパク質の存在及びガンのリスクに関連するミッドカイン多形性の存在と組み合わさった、腫瘍におけるミッドカインの頻繁な発現に起因して、ミッドカインはガンのリスクの評価並びにガンの診断及び予後ためのマーカーである(特許US 7,090,983並びに出願US 2003/0149534及びUS 2004/0219614)。ミッドカインは、特に、ミッドカイン前駆体の23〜25位及び82〜143位に相当する短縮化ミッドカインに特異的なモノクローナル抗体を用いて検出される(米国出願US 2004/0219614)。ミッドカインプロモーターも自殺遺伝子ストラテジーにおいて使用される。

他方で、ミッドカインタンパク質の免疫原性は調べられていない。

本発明者らは、腫瘍で優先的に発現するミッドカインタンパク質が、白色人種の大多数の個体において、多くのガンタイプで腫瘍細胞により発現される該ミッドカインタンパク質を認識する特異的CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球を誘導し得るペプチドを含有することを示した。これらペプチドは、(i)これらが多くの腫瘍により発現される抗原に由来し、(ii)腫瘍により発現される抗原を認識する特異的CD4⁺ T及びCD8⁺ Tリンパ球を誘導し得、(iii)HLA分子の多形性を考慮し、白色人種において優勢なHLA分子により制限されるという事実のために、白色人種の大多数の個体において、CD4⁺ T及びCD8⁺ Tリンパ球により認識されるので、ワクチン接種した患者の大多数で、腫瘍を指向するCD4⁺ T及びCD8⁺ T応答を引き起こし得ることから判断すると、ガンに対する予防的又は治療的ワクチン接種の可能性ある候補を示す。

加えて、大多数の腫瘍により発現される腫瘍抗原に特異的なCD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球により認識されるこれらペプチドは、ガンの進行の間、特に抗ガン治療(外科的療法、化学療法、放射線療法、免疫療法)後のミッドカインに対する細胞性応答の免疫モニタリングに有用である.

結果として、本発明の主題は、白色人種において優勢なHLA分子により制限された少なくとも１つのCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープを含んでなるミッドカインタンパク質に由来するペプチド又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドの、ミッドカインタンパク質の腫瘍過剰発現に関連するガンの治療用抗ガンワクチンの製造についての使用である。

定義
− 用語「ミッドカインに由来するペプチド」は、ミッドカインタンパク質(143アミノ酸の前駆体又は成熟タンパク質(該前駆体の23〜143位))及び該タンパク質の少なくとも８つの連続するアミノ酸からなるペプチドフラグメントの両方を意味するものとする。用語「ミッドカイン」は、任意の哺乳動物に由来するミッドカインタンパク質を意味するものとし；好ましくはヒトタンパク質である。ミッドカインに由来するペプチドの位置は、ヒト配列(SwissProt P21741、図１及び配列番号２)を参照して示す。

− 用語「白色人種において優勢なHLA分子」又は「優勢なHLA分子」は、優勢なHLA I(HLA-A、HLA-B又はHLA-C)又はHLA II分子を意味するものとする。この用語には、下記表Ｉに示されるように、白色人種で５％より多い頻度の対立遺伝子によりコードされるα鎖を含んでなるHLA-A、HLA-B及びHLC-C分子が含まれる。

この用語には、下記表IIに示されるように、白色人種で５％より多い頻度の対立遺伝子によりコードされるβ鎖を含んでなるHLA II分子が含まれる。

白色人種において優勢なHLA分子の幾つか(特に、HLA-DP401及びHLA-DP402分子)は、他の人種においても優勢である(南米、インド、日本、アフリカ；表II)。結果として、本発明に従うペプチドは白色人種に対する使用に制限されず、表IIに示されるような、北米及び欧州諸国以外の当該HLA分子が優勢である国の個体をワクチン接種するためにも使用することができる。

− 本発明の目的のためには、用語「広く行きわたっている」及び「優勢」は同義とみなされ、区別なく使用する。

− 表現「白色人種に優勢なHLA II分子により制限されたミッドカインのCD4⁺ Tエピトープ」は、白色人種に優勢な少なくとも１つのHLA II分子に結合し、且つこの人種の個体においてCD4⁺ Tリンパ球により認識される、11〜15アミノ酸からなるペプチドを意味するものとする；このペプチドは、少なくとも２アミノ酸(好ましくは３アミノ酸)が端部の一方(好ましくは両端)で隣接するHLA II分子への固定のための残基を含む、９アミノ酸からなる配列を含んでなる。

− 表現「白色人種に優勢なHLA I分子により制限されたミッドカインのCD8⁺ Tエピトープ」は、白色人種に優勢な少なくとも１つのHLA I分子に結合し、且つこの人種の個体においてCD8⁺ Tリンパ球により認識される、８〜13アミノ酸からなるペプチドを意味するものとする；このペプチドは、HLA I分子への固定のための残基を含む、８又は９アミノ酸からなる配列を含んでなる。

− 用語「ガン」は、腫瘍細胞によるミッドカインタンパク質の過剰発現に関連するガン、例えば、非制限的な様式で、食道ガン、胃ガン、結腸ガン、膵臓ガン、甲状腺ガン、肺ガン、乳ガン、膀胱ガン、子宮ガン、卵巣ガン及び前立腺ガン、肝細胞ガン腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫、星状芽細胞腫、白血病及びウィルムス腫瘍を意味するものとする。

− 用語「天然又は合成アミノ酸」は、タンパク質中に通常見出される20の天然αアミノ酸(Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶ)、タンパク質中で稀に遭遇する幾つかのアミノ酸(ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、メチルリジン、ジメチルリジン、など)、タンパク質中に存在しないアミノ酸(例えばβ-アラニン、γ-アミノ酪酸、ホモシステイン、オルニチン、シトルリン、カナバニン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニンなど)、Ｌアミノ酸から誘導されたＤアミノ酸及び上記アミノ酸のアナログを意味するものとする。

− 用語「疎水性アミノ酸」は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｆ及びＭ(一文字表記)から選択されるアミノ酸を意味するものとする。
− 用語「芳香族アミノ酸」は、Ｆ、Ｗ及びＹ(一文字表記)から選択されるアミノ酸を意味するものとする。

本発明に従うペプチドは、大多数の個体において、CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球により認識される。なぜなら、それらペプチドは白色人種に優勢なHLA I及びHLA II分子により提示されるからである。これらは免疫原性であり、すなわちナイーブな個体の大多数に存在する前駆体からミッドカイン-特異的CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球を誘導し得るか、又はミッドカインの過剰発現に関連するガンを有する個体の大多数で該Ｔリンパ球を刺激し得る。加えて、大多数の個体において誘導されるCD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球は、これら個体の腫瘍により発現されるミッドカインを認識する。このペプチドの免疫原性は、特に末梢血単核細胞(PBMC)を用いて、当業者に公知の任意の適切なアッセイ、例えば細胞増殖試験、細胞傷害性試験、Elispot試験(サイトカイン産生細胞のアッセイ)又はサイトカイン(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-5、TNF-α及びTGF-β)をアッセイする試験により決定することができる。

本発明は、後記配列が優勢なHLA分子に関する良好な親和性を保存し、免疫原性であるという条件で、ミッドカイン配列中の１又はそれより多いアミノ酸の変異(挿入、欠失、置換)により得られる天然又は合成の異形ペプチドを包含する。天然異形体は、特に、ミッドカインの多形性から生じる。加えて、他の異形体は、HLA-DR及びHLA-DP4分子への結合に関与するアミノ酸残基(固定用残基)及びこれら残基の改変のHLA-DR及びHLA-DP4分子への結合に対する効果が当業者に公知であることを考えれば、容易に構築することができる；PCT国際出願WO 03/040299は、特に、HLA-DP4に結合するためには、P6の残基が芳香族若しくは疎水性であるか又はシステイン残基(Ｃ)からなるべきであり、残基P1及びP9の少なくとも一方は次のとおりである：P1が芳香族若しくは疎水性であり、及び/又はP9が芳香族若しくは疎水性であるか、又はＣ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｔ若しくはＥ残基からなる一方で、P4の残基は任意のアミノ酸残基であることができることを教示している。米国特許US 6,649,166は、HLA-DR分子への固定用残基(P1、P4、P6、P7及びP9)を決定する一般的な方法及びHLA-DR分子に関する親和性を改変することができるこれら残基の変異の性質を記載している。HLA-DR分子-結合モチーフは、特に、Sturnolioら, Nat. Biotech., 1999, 17, 533-534及びRammenseeら, Immunogenetics, 1995, 41, 178-228に記載されている。

HLA-I分子への結合に関与するアミノ酸残基(固定用残基)及びこれら残基の改変のHLA-I分子への結合に対する効果は当業者に公知である。ペプチドをクラスI HLA分子に結合するためのモチーフは、Rammenseeら, Immunogenetics, 1995, 41, 178-228及び下記表IIIに記載されている。

或る置換が、その抗原性を乱すことなく、HLA I分子に関するペプチドの親和性を改善することもまた公知である；HLA-A2-結合ペプチドに１位でチロシンを導入することがこれに該当する(Tourdotら, Eur. J. Immunol., 2000, 30, 3411-3421)。

本発明はまた、後記改変ペプチドが優勢なHLA分子に関する良好な親和性を保存し、免疫原性であるという条件で、アミノ酸残基、ペプチド結合性又はペプチド両端の任意の改変の導入により上記ペプチドから誘導される改変ペプチドを包含する。当業者に公知の従来法によりペプチド中に導入されるこれら改変には、非限定的様式で、以下のものが挙げられる：非タンパク質生成アミノ酸(Ｄアミノ酸又はアミノ酸アナログ)でのアミノ酸の置換；反応性官能基(特に側鎖Ｒ)における化学基(脂質、オリゴ糖又は多糖)の付加；特に逆型若しくは逆-反転型の結合(-NH-CO-)又はペプチド結合以外の結合でのペプチド結合(-CO-NH)の改変；環化；ペプチドの融合(ワクチン接種のための目的のエピトープ；特にプロテアーゼにより切断可能な形態の、ペプチド精製に使用するタグ)；前記ペプチドの配列と或るタンパク質(特に、HLA I若しくはHLA II分子のα-鎖、HLA II分子のβ-鎖又は前記鎖の細胞外ドメイン)の配列又はエンドソームを標的するための、特に不変鎖Ii若しくはLAMP-1タンパク質から誘導された配列との融合；適切な分子、特に標識、例えば蛍光色素又はビオチンへのカップリング。これら改変は、特に、安定性、より具体的にはタンパク質分解に対する抵抗性及び溶解性若しくは免疫原性の増大、又は本発明に従うペプチド若しくは前記ペプチドに特異的なCD4⁺及び/若しくはCD8⁺細胞の精製若しくは検出の容易化を意図する。

前記使用の１つの有利な実施形態によれば、ペプチドはミッドカインタンパク質からなる。好ましくは、ペプチドは配列番号２の配列のヒトタンパク質である。
本発明は、当業者に公知の任意の適切な手段により変性されたミッドカインタンパク質、特に還元されたミッドカインタンパク質の使用を包含する。
本発明はまた、ジスルフィドブリッジに関与するシステイン残基の少なくとも１つが別のアミノ酸、例えばセリンで置換されている異形体のミッドカインタンパク質の使用を包含する。

本発明はまた、上記の少なくとも１つのCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープを含んでなる、ミッドカインタンパク質に由来する少なくとも８アミノ酸のペプチドの使用を包含する。本発明は、白色人種で最も頻度の高いHLA I分子の１つ及び/又はHLA II分子の１つ(特に、HLA-A2分子(表Ｉ)及び/又はHLA-DR7、HLA-DRB4、HLA-DP401又はHLA-DP402分子(表II))に結合するペプチドの使用を包含する。本発明はまた、ワクチンの射程を白色人種の大多数に拡げるための、幾つかの異なる優勢なHLA I及び/又はHLA II分子に結合するペプチドの使用を包含する。

本発明はまた、上記の少なくとも１つのCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープを含んでなる、ミッドカインのＮ-末端ドメイン(ミッドカイン前駆体配列を参照して１〜84位)の少なくとも８アミノ酸のペプチドの使用を包含する。
本発明によれば、前記フラグメントは８〜100アミノ酸長、好ましくは８〜50アミノ酸長、好ましくは10〜25アミノ酸長(10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25アミノ酸長)を有する。

前記使用の別の有利な実施形態によれば、ペプチドは、少なくとも１つのHLA-A2分子-制限CD8⁺ Tエピトープを含んでなるミッドカインタンパク質の少なくとも８アミノ酸のフラグメントであり、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも14〜21位又は114〜122位を含んでなる。

好ましくは、ペプチドは、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の12〜21位、13〜21位、13〜22位、14〜22位又は113〜122位を含んでなる。
好ましくは、ペプチドは、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の12〜21位(MDK 12-21)、13〜21位(MDK 13-21)、13〜22位(MDK 13-22)、14〜22位(MDK 14-22)、113〜122位(MDK 113-122)又は114〜122位(MDK 114-122)からなる；これらペプチドは、それぞれ、添付の配列表の配列番号３〜８の配列に相当する。

前記使用の別の有利な実施形態によれば、ペプチドは、白色人種に優勢な少なくとも１つのHLA II分子により制限された少なくとも１つのCD4⁺ Tエピトープを含んでなるミッドカインタンパク質の少なくとも８アミノ酸のフラグメントであり、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも９〜15位、14〜28位、52〜64位、64〜78位、70〜84位、74〜88位、78〜92位、84〜98位、99〜113位、105〜119位、110〜124又は119〜133位を含んでなる。これらペプチドの例は、配列番号９、10、13〜15、21〜26、28、29及び30の配列のペプチドである(表VII)。

好ましくは、白色人種に優勢なHLA II分子は、HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DP40及びHLA-DP402分子から選択される。前記HLA II分子は、有利には、それぞれ、HLA DRB1^*0101、DRB1^*0301、DRB1^*0401、DRB1^*0701、DRB1^*1101、DRB1^*1301、DRB1^*1501、DRB3^*0101、DRB4^*0104、DRB5^*0101、DP^*0401及びDP^*0402対立遺伝子によりコードされる。

好ましくは、ペプチドは、白色人種において優勢な少なくとも４つの異なるHLA II分子に結合し、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも９〜15位、14〜28位又は110〜124位を含んでなる。ペプチドは、有利には、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の１〜15位、４〜18位、９〜21位、９〜22位、９〜23位又は14〜28位を含んでなる。

好ましくは、ペプチドは、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の１〜15位(MDK 1-15)、４〜18位(MDK 4-18)、９〜21位(MDK 9-21)、９〜22位(MDK 9-22)、９〜23位(MDK 9-23)、14〜28位(MDK 14-28)又は110〜124位(MDK 110-124)からなる；これらペプチドは、それぞれ、添付の配列表の配列番号９〜15の配列に相当する。

本発明によれば、ペプチドは、有利には、ミッドカインタンパク質の幾つかのCD4⁺及び/又はCD8⁺ Tエピトープを、任意に他のCD4⁺ T、CD8⁺ T又はＢエピトープとの組合せで含んでなる。エピトープは、有利には、サイトhttp:www/cancerimmunity.org/peptidedatabase/tumorspecific.htmに記載されているような腫瘍抗原に由来するCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープ、特にMAGE、NY-ESO-1又はサービビンに由来するCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープである。

上記実施形態の１つの有利な取合せによれば、ペプチドは、HLA-A2分子により制限された少なくとも１つのCD8⁺ Tエピトープ及び白色人種において優勢な少なくとも４つの異なるHLA II分子により制限された少なくとも１つのCD4⁺ Tエピトープを含んでなる、ミッドカインタンパク質のフラグメントであり、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の９〜21位、９〜22位、９〜23位又は110〜124位を含んでなる。好ましくは、ペプチドは、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の９〜21位(MDK 9-21)、９〜22位(MDK 9-22)、９〜23位(MDK 9-23)又は110〜124位(MDK 110-124)からなる。

このようなペプチドは、有利には、多くの腫瘍に特異的なCD4⁺ Tリンパ球及びCD8⁺ Tリンパ球の両方を、これら腫瘍を有する白色人種の個体の大多数で誘導することを可能にする。

種々のエピトープを、単離ペプチドの混合物の形態、複数エピトープペプチドの形態、融合タンパク質の形態又は該ペプチド/タンパク質をコードするポリヌクレオチドの形態でワクチン組成物に含ませることができる。ペプチド/タンパク質は、リポソーム又は脂質で改変し、又はこれらと結合させることができる(特にリポペプチドの形態で)。好ましくは、ポリヌクレオチドはベクター、特に発現ベクターに含ませる。

本発明のワクチン組成物中に組み込むことができるエピトープとして、特に以下のものが挙げられる：
− 特許US 6,063,900及びPCT出願WO 2004/052917に記載されるような、MAGEのCD8⁺ Tエピトープ、
− MAGEのCD4⁺ Tエピトープ、例えばDR1-制限MAGE-A3 267-282(PCT国際出願WO 02/095051)；DR4-及びDR7-制限MAGE-A3 149-160(Kobayashiら, Cancer Research, 2001, 61, 47734788)；DR11-制限MAGE-A3 191-205及び281-295(Consognoら, Blood, 2003, 101, 1038-1044；Maniciら, J. Exp. Med., 1999, 189, 871-876)及びDR13-制限MAGE-A3 121-134(特許US 6,716,809)；DR15-制限MAGE-A1 281-292(PCT国際出願WO 00/78806)；DR4-制限MAGE-A6 102-116、121-144、140-170、145-160、150-165及び246-263(Tatsumiら, Clinical Cancer Research, 2003, 9, 947-954)；DR15-制限MAGE-A1 281-292(PCT国際出願WO 00/78806)；DR4-制限MAGE-A6 102-116、121-144、140-170、145-160、150-165及び246-263(Tatsumiら, Clinical Cancer Research, 2003, 9, 947-954)並びにPCT国際出願WO 2007/026078に記載のようなHLA-DP4-制限MAGEエピトープ、

− 以下から選択されるサービビンのCD8⁺ Tエピトープ：サービビン96-104(LTLGEFLKL、配列番号：39)又は95-104(ELTLGEFLKL、配列番号：40)、サービビン-2B 80-88(AYACNTSTL、配列番号：41)及びBachinskyら, Cancer Immun., 2005, 5, 6-の表Ｉに記載のようなペプチド、
− PCT国際出願WO 2007/036638に記載されるようなサービビンのCD4⁺ Tエピトープ、特にペプチド19-33、90-104又は93-107、
− 天然又は合成の普遍(universal)CD4⁺ Tエピトープ、例えば破傷風毒素ペプチドTT 830-846(O'Sullivanら, J. Immunol., 1991, 147, 2663-2669)、インフルエンザウイルスヘマグルチニンペプチドHA 307-319(O'Sullivanら，前出)、PADREペプチド(KXVAAWTLKAA、配列番号：16；Alexanderら, Immunity, 1994, 1, 751-761)並びに熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)の抗原に由来するペプチド、例えばCS.T3ペプチド(Sinigagliaら, Nature, 1988, 336, 778-780)、及びCSP、SSP2、LSA-1及びEXP-1ペプチド(Doolanら, J. Immunol., 2000, 165, 1123-1137)、

− 糖から作られたＢエピトープ(Alexanderら，前出)。このＢエピトープは、好ましくは、糖ペプチドの形態である、及び
− 前記腫瘍抗原に対する抗体により特異的に認識されるミッドカインのＢエピトープ。

ミッドカインCD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tエピトープと上記のようなエピトープの少なくとも１つとの組合せは、有利には、抗腫瘍免疫応答の改善、特に長期免疫記憶の樹立を可能にする。

前記使用の別の有利な実施形態によれば、ミッドカインに由来するペプチドは、少なくとも２つの同一の又は異なるエピトープの連結を含んでなる複数エピトープペプチドであり、エピトープの少なくとも１つがミッドカインCD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tエピトープである。複数エピトープペプチドは、有利には、上記のような他のエピトープ(別の腫瘍抗原のCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープ)を含んでなる。本発明によれば、種々のエピトープの配列は、ペプチド結合により互いに連結されているか、又は異種配列(すなわち、ミッドカインのアミノ酸配列中でその位置に天然に存在する配列以外の配列)により分離されている。好ましくは、複数エピトープペプチドは、20〜1000アミノ酸長、好ましくは20〜100アミノ酸長を有する。

複数エピトープペプチドは、有利には、フラグメントの精製又は検出用に、末端の一方に融合したタグを含んでなる。タグ、特にポリヒスチジン配列又は或る抗原のＢエピトープは、好ましくは、融合体から複数エピトープ配列を単離するために、該複数エピトープ配列とは、プロテアーゼの切断部位によって分離されている。

前記使用の別の有利な実施形態によれば、ミッドカインに由来するペプチドは、上記の複数エピトープフラグメント又はペプチドを含んでなるリポペプチドである。
リポペプチドは、特に、複数エピトープフラグメント又はペプチドのアミノ酸の側鎖のα-アミノ官能基又は反応性官能基への脂質の付加より得られる；これは、任意に分枝状又は不飽和であってもよいC_4-20脂肪酸(パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、2-アミノヘキサデカン酸、ピメラウチド、トリメキサウチド)から誘導された１若しくはそれより多い鎖又はステロイド誘導体を含んでなってもよい。好ましい脂質部分は、特に、Nα-アセチルリシンNε(パルミトイル)基(Ac-K(Pam)とも呼ばれる)に代表される。

前記使用の別の有利な実施形態によれば、ミッドカインに由来するペプチドは、異種タンパク質又はタンパク質フラグメントと融合される(融合タンパク質)。

複数エピトープフラグメント又はペプチドは、前記タンパク質のNH₂又はCOOH末端と融合するか、又は該タンパク質の配列中に挿入することができる。融合タンパク質の１つの有利な実施形態によれば、これは、エンドソームに標的付けるための配列、好ましくはヒト不変鎖Ii又はLAMP-1タンパク質から誘導された配列と融合した上記ペプチドからなる。エンドソームに標的付けるための配列及びエンドソームに抗原を標的付けるためのその使用は、特に、Sandersonら(Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1995, 92, 7217-7222)、Wuら(Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1995, 92, 11671-11675)及びThompsonら(J. Virol., 1998, 72, 2246-2252)に記載されている。

前記融合タンパク質の有利な取合せによれば、これは、HLA分子の鎖の１つと、好ましくはHLA II分子のβ-鎖又はHLA I分子のα-鎖と、或いは可溶性HLA分子に対応するそのフラグメント、特に同種シグナルペプチド又は異種シグナルペプチドが先行する細胞外ドメインに対応するフラグメントと融合した、上記ペプチドからなる。ペプチドは、有利には、HLA-DR分子について記載されるように(Kolzinら, PNAS, 2000, 97, 291-296)、シグナルペプチドとα又はβ鎖の細胞外ドメインのNH₂末端との間に挿入される。

或いは、複数エピトープフラグメント又はペプチドは、特にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)及び蛍光タンパク質(GFP及びその誘導体)のような当業者に公知の精製又は検出を容易にするタンパク質と融合される。この場合、目的の複数エピトープフラグメント又はペプチドの配列は、好ましくは、複数エピトープフラグメント又はペプチドの精製を容易にするために、タンパク質の残りの部分とは、プロテアーゼの切断部位により分離される。

前記使用の別の有利な実施形態によれば、前記ポリヌクレオチドは、上記のペプチド、複数エピトープフラグメント又は融合タンパク質をコードする。
本発明によれば、ポリヌクレオチドの配列は、複数エピトープフラグメント又はペプチド又は融合タンパク質をコードするcDNAの配列である。配列は、有利には、コドン使用頻度が該配列を発現させる宿主において最適であるように改変することができる。加えて、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの異種配列に連結することができる。

本発明の目的のためには、表現「ミッドカインをコードする核酸配列に対して異種配列」は、天然においてミッドカインペプチドをコードする核酸配列に直接隣接している配列以外の任意の核酸配列を意味するものとする。
好ましくは、ポリヌクレオチドはベクター中に挿入される。

本発明の目的のためには、用語「ベクター」は、組み合わされた別の核酸を輸送し得る核酸分子を意味するものとする。本発明で使用することができるベクターの１つのタイプには、非制限様式で、特にウイルスベクター、プラスミドベクター又はRNベクターのような、染色体、非染色体、合成又は半合成の核酸からなる線状又は環状のDNA又はRNA分子が挙げられる。

真核生物又は原核生物宿主細胞中に導入しその中で維持するために目的の核酸分子を挿入することができる多くのベクターはそれ自体公知である：適切なベクターの選択は、このベクターに関して想定する使用(例えば、目的の配列の複製、この配列の発現、染色体外形態でのこの配列の維持、或いは宿主の染色体材料への統合)及び宿主細胞の性質に依存する。例えば、裸の核酸(DNA又はRNA)又はウイルスベクター(例えば、目的の配列が事前に挿入されているアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びAAV)を使用することができる；(単離されているか又はプラスミドベクター中に挿入されている)前記配列を、トランスポーター(例えばナノトランスポーター)のような宿主細胞の膜を横断することを可能にする物質又はリポソーム若しくはカチオン性ポリマーの製造を可能にする物質或いは物理的方法(例えば、エレクトロポレーション又はマイクロイジェクション)を用いて宿主細胞中に該配列を導入することを可能にする物質と組み合せることもできる。加えて、これら方法は、有利には、例えばエレクトロポレーションを使用して、リポソームと組み合せることができる。

好ましくは、ベクターは、上記ペプチド又はタンパク質の発現に必要なエレメントの全てを含んでなる。例えば、ベクターは、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを転写及び任意に翻訳を調節するに適切な配列(プロモーター、エンハンサー、イントロン、開始コドン(ATG)、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、スプライス部位)の制御下に含む発現カセットを含んでなる。

本発明に従うワクチン組成物は、有利には、医薬的に許容され得るビヒクル、担体物質及び/又はアジュバントを含んでなる。
医薬的に許容され得るビヒクル、担体物質及びアジュバントは、従来使用されているものである。

アジュバントは、有利には、油性エマルジョン、鉱物、細菌抽出物、CpGを含有するオリゴヌクレオチド、サポニン、アルミナ水酸化物、モノホスホリルリピドＡ及びスクアレンからなる群より選択される。
担体物質は、有利には、単層又は多層のリポソーム、ISCOM、ビロゾーム、ウイルス様粒子、サポニンミセル、糖類(ポリ(ラクチド-コ-グリコリド))であるか又は天然に金を含有する固相マイクロスフェア及びナノ粒子からなる群より選択される。

ワクチン組成物は、上記のように、ミッドカインの腫瘍過剰発現に関連するガンに対する予防/治療効果を得ることができる有効用量のペプチド/タンパク質/リポペプチド/ベクターを含んでなる。この用量は、個体の年齢、性別及び体重のような因子に従って決定され、調整される。ワクチン組成物は、一般に、通常のワクチン接種プロトコルに従って、ミッドカインタンパク質に対する細胞性応答を誘導するに十分な用量及び期間で投与される。投与は、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、経口、舌下、直腸、膣、鼻内、吸入又は経皮による適用であり得る。

組成物は、選択した投与に適切な製薬形態(galenical form)である：標準的なプロトコルに従って製造される、注射可能な滅菌溶液、粉剤、錠剤、ゲルカプセル、懸濁液、シロップ、坐剤。
前記組成物の１つの有利な実施形態によれば、それは、ミッドカイン少なくとも１つのCD4⁺ Tエピトープ及び少なくとも１つのCD8⁺ Tエピトープを、ペプチドの混合物の形態、複数エピトープフラグメントの形態及び/又は該ペプチド若しくはフラグメントをコードする発現ベクターの形態で含んでなる。

前記組成物のこの実施形態の１つの有利な取合せによれば、それは、少なくともMDK 9-21、MDK 9-22、MDK 9-23又はMDK 110-124ペプチドを含んでなる。
好ましくは、MDK 9-21、MDK 9-22又はMDK 9-23ペプチドは、MDK 74-88又は78-92ペプチドと、MDK 14-28又は99-113ペプチドと、及びMDK 4-18ペプチドと組み合わされる。
HLA-A2分子並びにHLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DP401及びHLA-DP402(表VII)分子の全てに結合するペプチドの組合せは、有利には、ワクチン接種された実質的に全ての個体においてCD4⁺ T及びCD8⁺ Tリンパ球を誘導することを可能にする。

前記組成物の更に別の有利な実施形態によれば、それは、普遍CD4⁺ Tエピトープ並びに/又は上記のような別の腫瘍抗原のCD4⁺ T及び/若しくはCD8⁺ Tエピトープ含むペプチドを含んでなる。
本発明に従うペプチド及びその誘導産物(複数エピトープペプチド、融合タンパク質、リポペプチド、組換えベクター)は、ミッドカインを過剰発現している腫瘍の処置における免疫療法で使用することができる。ペプチド又は誘導産物は、ワクチンとして、又は細胞療法において、或いはこれら２つのアプローチの組合せで使用される。

細胞療法は、治療すべき患者からの末梢血単核細胞(PBMC)の単離及びペプチドの存在下での樹状細胞の培養を含む従来のプロトコルによる抗原-提示細胞(樹状細胞)の製造を含んでなる。第２工程で、ペプチドをロードした抗原-提示細胞が患者に再注射される。

本発明の主題はまた、上記のミッドカインに由来する少なくとも１つのペプチドフラグメント、上記の複数エピトープペプチド、融合タンパク質、リポペプチド又はベクターと、医薬的に許容され得るビヒクル、担体物質又はアジュバントとを含んでなることを特徴とするワクチン組成物である。

本発明の主題はまた、上記の任意の適切な手段による上記ワクチン組成物の個体への投与を含んでなることを特徴とする予防用又は治療用の抗腫瘍ワクチン接種法である。

本発明の主題はまた、ガンの予後の評価用又はガン治療(手術、放射線療法、化学療法、免疫療法)のモニタリング用のミッドカインに対する細胞性応答の免疫モニタリング試薬の製造についての、上記少なくとも１つのペプチドの使用である。好ましくは、試薬は、例えば標識され及び/又はHLA分子と複合体化されている、多量体のHLA/ペプチド複合体(例えば、標識されたHLA/ペプチド複合体四量体)の形態の上記のペプチド又は融合タンパク質を含んでなる。

本発明の主題はまた、ガンを有する個体におけるミッドカインに対する細胞性応答の免疫モニタリングのためのインビトロ方法であり、該方法は、以下:
− 個体からの生物学的サンプルを上記ペプチドと接触させ、
− 任意の適切な手段によりミッドカイン-特異的CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球を検出する
ことを含んでなることを特徴とする。

本発明に従う方法により、ガンの間、或いは抗腫瘍治療、特に抗腫瘍免疫療法の間に、ミッドカインに対するCD4⁺ T及び/又はCD8⁺ T応答の変化をモニターすることが可能になる；ミッドカイン-特異的CD4⁺ Tリンパ球は、TH1タイプ(IFN-γの分泌)、TH2タイプ(IL-4の分泌)又は調節Ｔタイプ(IL-10又はTGF-βの分泌)であり得る；TH1-タイプのＴ応答は、ガンの好ましい経過の徴候である一方、調節Ｔ応答はガンの好ましくない経過の徴候であると予想される。検出は、CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ T細胞を含有する生物学的サンプル、特に末梢血サンプルから単離した単核細胞(PBMC)のサンプルを用いて実施される。

ミッドカイン-特異的CD4⁺ T及び/又はCD8⁺リンパ球は、それ自体公知の任意の手段により検出される。例えば、使用は、上記の多量体複合体の存在下でのフローサイトメトリのような直接手段、或いはリンパ球増殖アッセイ、細胞細胞傷害性試験及びサイトカイン(例えば、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及びIFN-γ)についての、特に免疫酵素技術(ELISA、RIA、ELISPOT)又はフローサイトメトリ(細胞内サイトカインのアッセイ)によるアッセイのような間接手段からなり得る。

より具体的には:
細胞(PBMC、CD4⁺又はCD8⁺細胞を欠くPBMC、上記のペプチドとのインビトロ培養工程により予め富化されたＴリンパ球又はクローン化Ｔリンパ球)の懸濁液を、前記ペプチド及び必要であれば適切な提示細胞、例えば、樹状細胞、自家若しくは異種のPBMC、リンパ芽腫細胞(例えば、EBVウイルスによる感染後に得られるもの)又は遺伝子改変細胞との接触状態に置く。最初の懸濁液中のミッドカイン-特異的CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ T細胞の存在を、以下の方法の１つに従って、ペプチドを用いて検出する:

＊増殖アッセイ：
ミッドカイン-特異的CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ T細胞の増殖を、細胞DNAへの滴定チミジンの組込みにより測定する。

＊Elispotアッセイ：
Elispotアッセイにより、上記ペプチドに特異的なサイトカイン(IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α及びTGF-β)を分泌するＴ細胞の存在を明らかにすることができる。このアッセイの原理は、Czerkinskyら, J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109-121及びSchmittelら, J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167-174に記載されており、その実施は、国際出願WO 99/51630又はGahery-Segardら, J. Virol., 2000, 74, 1694-1703に説明されている。

＊サイトカインの検出：
サイトカイン(IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α及びTGF-β)を分泌するミッドカイン-特異的Ｔ細胞の存在を、酵素イムノアッセイ、特に市販キットを用いて、培養上清中に存在するサイトカインをアッセイすることにより、又はフローサイトメトリによって細胞内サイトカインを検出することにより検出する。細胞内サイトカインの検出原理は、Goulderら, J. Exp. Med., 2000, 192, 1819-1832及びMaeckerら, J. Immunol. Methods, 2001, 255, 27-40に記載されており、その実施は、Draenertら, J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19-29に説明されている。

＊多量体複合体：
− 生物学的サンプル、好ましくは末梢血単核細胞(PBMC)を、(可溶性HLA分子と上記ペプチドとの結合により形成された)標識多量体複合体、特に蛍光色素で標識したものと接触させ、
− 前記多量体複合体で標識される細胞を、特にフローサイトメトリにより分析する。

有利には、複合体と接触させる前に、生物学的サンプルを、抗-CD4又は抗-CD8抗体と接触させることにより、CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ T細胞について富化する。
HLA-ペプチド多量体複合体は、HLA I及び/又はHLA II分子を発現する細胞から抽出した天然分子から、又は例えばNovakら(J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67)若しくはKurodaら(J. Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756)において示されるような適切な宿主細胞で産生される組換え分子から製造することができる。これらHLA分子は、特に、短縮化されてもよく(膜貫通ドメインの欠失)、その配列は、可溶性にするため或いはα-及びβ-鎖の対合を容易にするために改変されていてもよい(Novakら、前出)。

HLA分子のペプチドローディングは、上記HLA分子の調製物をペプチドと接触させることにより行い得る。例えば、ビオチン化可溶性HLA分子を、72時間、37℃にて、10-倍過剰のペプチドと、0.15mM NaClを含有する10mMリン酸-クエン酸緩衝液(pH4.5〜７)中でインキュベートする。
或いは、融合タンパク質を発現する適切な宿主細胞からのHLA/ペプチド多量体複合体の製造を可能にする融合タンパク質の形態で、ペプチドの配列をHLA分子の鎖の１つに導入し得る。複合体は、その後、特にビオチンで標識することができる。

四量体タイプの多量体複合体は、特に、ロードされたHLA分子に、HLA分子に関して４倍少ない量(モル対モル)の蛍光色素で標識したストレプトアビジンを加えた後、混合物全体を十分な時間、一晩周囲温度にてインキュベートすることによって得られる。
多量体複合体は、HLA-I分子に関して記載されているように(Bodinierら, Nature, 2000, 6, 707-710)、ストレプトアビジンにカップリングした磁性ビーズとのHLA-ペプチド単量体のインキュベーションにより、又はマウスMHCクラスII分子に関して記載されているように(Prakken, Nature Medicine, 2000, 6, 1406-1410)、脂質ベシクル中へのHLA-ペプチド単量体の挿入により形成してもよい。

この多量体HLA-ペプチド複合体、特に四量体タイプのものを使用するために、細胞(PBMC、CD4⁺及び/又はCD8⁺細胞を欠くPBMC、上記ペプチドとのインビトロ培養工程により予め富化されたＴリンパ球又はクローン化Ｔリンパ球)の懸濁液を、適切な濃度(例えば、10〜20μg/mlのオーダー)のHLA-ペプチド多量体複合体と、該複合体とミッドカイン-特異的CD4⁺及び/又はCD8⁺ Tリンパ球との結合を可能にするに十分な時間(例えば、１〜３時間のオーダー)接触させる。洗浄後、懸濁液をフローサイトメトリにより分析する：細胞の標識化を蛍光性の多量体複合体により可視化する。このフローサイトメトリにより、HLA-ペプチド多量体複合体で標識された細胞を非標識細胞からの分離、したがって細胞選別の実施が可能になる。

本発明の主題はまた、上記ペプチドを少なくとも１つ含んでなる免疫モニタリング試薬である。好ましくは、試薬はキットに含まれる。免疫モニタリング試薬は、有利には、任意に標識又は複合体化されていてもよい(特に、標識した(例えばビオチン化)HLA分子と複合体化した)ペプチド又は融合タンパク質を、HLA-ペプチド多量体複合体の形態(例えば、標識された四量体のHLA-ペプチド複合体)で含んでなる。

本発明の主題はまた、以下の工程を少なくとも含んでなることを特徴とするミッドカイン-特異的CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球を分析する方法である：
− 細胞サンプルを標識HLA-ペプチド多量体複合体(該複合体は可溶性HLA分子と上記少なくとも１つのペプチドとの結合により形成される)、特に蛍光色素で標識されたものとインビトロで接触させる工程、及び
− HLA-ペプチド複合体に結合した細胞を、特にフローサイトメトリによって、分析する工程。

前記方法の１つの有利な実施形態によれば、細胞(CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球)の分析は細胞の選別を含んでなる。
本発明の主題はまた、ミッドカインに由来するペプチドフラグメント、複数エピトープペプチド、融合タンパク質又はリポペプチドである。
本発明の主題はまた、上記のペプチド/タンパク質から誘導される、ポリヌクレオチド、発現カセット、組換えベクター、改変された原核生物又は真核生物宿主細胞である。

本発明は、特に、以下のものを包含する：
ａ)転写及び任意に翻訳に適切な調節配列(プロモーター、エンハンサー、イントロン、開始コドン(ATG)、終止コドン、ポリアデニル化シグナル)の制御下に上記ポリヌクレオチドを少なくとも１つ含んでなる発現カセット、及び
ｂ)本発明に従うポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。有利には、これらベクターは、上記発現カセットを少なくとも１つ含んでなる発現ベクターである。
上記のポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換細胞は、特に、本発明に従うペプチド、複数エピトープフラグメント及び融合タンパク質の製造に有用である。

本発明に従うポリヌクレオチドは、標準的なプロトコル、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. Ausubel, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA)に記載のプロトコルに従ってそれ自体公知の従来方法により得られる。例えば、本発明に従うポリヌクレオチドは、PCR又はRT-PCRによる核酸配列の増幅によってか、相同プローブとのハイブリダイゼーションによるゲノムDNAライブラリのスクリーニングによってか或いは完全又は部分的な化学合成によって得ることができる。組換えベクターは、それ自体公知の従来の組換えDNA及び遺伝子工学の方法により、構築されて宿主細胞中に導入される。

上記のペプチド及びその誘導体(異形体、改変ペプチド、リポペプチド、複数エピトープフラグメント、融合タンパク質)は、当業者に公知の従来技術により、特に固相若しくは液相合成又は適切な細胞系(真核生物又は原核生物系)における組換えDNAの発現により、製造される。

より具体的には：
− ペプチド及びその誘導体(異形体、複数エピトープペプチド)は、Merrifieldら(J. Am. Chem. Soc., 1965, 85：2149-)により最初に記載されたFmoc技術に従って固相合成し、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製することができ、
− リポペプチドは、特に、国際出願WO 99/40113又はWO 99/51630に記載される方法に従って製造することができ、
− ペプチド及び誘導体(例えば、異形体、複数エピトープフラグメント及び融合タンパク質)はまた、当業者に公知の任意の手段により得られる対応するcDNAから製造することもできる；cDNAを、真核生物又は原核生物発現ベクター中にクローニングし、組換えベクターで改変された細胞中で産生されるタンパク質又はフラグメントを任意の適切な手段、特にアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。

上記取合せに加えて、本発明はまた、添付図面を参照しながら本発明の主題の実施例に言及する下記の記載から明らかになる他の取合せを包含する。添付図面において：
− 図１は、ヒトミッドカインのペプチド配列(配列番号：２)を表す。完全配列は前駆体に相当する。シグナルペプチドは、下線を付した太字で示す；
− 図２は、ミッドカインペプチドに対して誘導されたCD8⁺ Tリンパ球のペプチド特異性を説明する。Ｔリンパ球株(267.29A、278.11A、314.28)を、HLA-A2を発現する３人の健常個体(267、278、314)からのＴリンパ球の刺激により得た。４週間の培養後、特異性をIFN-γ Elispotにより試験した；

− 図３は、ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球のHLA-A2制限を説明する。制限は、C1R細胞及びC1R-A2細胞(HLA-A2でトランスフェクトしたC1R細胞)を使用するIFN-γ Elispotにより評価した；
− 図４は、ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球による、ミッドカイン発現プラスミドでトランスフェクトした細胞の認識を説明する。C1R-A2細胞を、ミッドカインのコーディング配列を含有する組換えプラスミド(pMDK)pcDNA 3.1でトランスフェクトした。pMDK-トランスフェクトC1R-A2細胞又は非トランスフェクト細胞によるCD8⁺ Tリンパ球の活性化をIFN-γ Elispotにより評価した；

− 図５は、腫瘍細胞におけるミッドカイン発現を説明する。ミッドカイン発現は、C1R-A2、DLD-1及びHep G2細胞において、抗-ミッドカイン抗体を使用するフローサイトメトリにより評価した。灰色面：陰性コントロール。黒線の領域：ミッドカインの天然発現。黒色面：ミッドカイン発現プラスミドでトランスフェクション後の細胞のミッドカイン発現；
− 図６は、ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球による腫瘍株の認識を説明する。腫瘍認識は、HLA-A2⁺ C1R-A2(MDK^-)、DLD-1(MDK^-)及びHep G2(MDK⁺)細胞を使用するIFN-γ Elispotにより試験した。星印の細胞をIFN-γの存在下で培養した；

− 図７は、特異四量体での標識化によるミッドカイン-特異的CD8⁺リンパ球の検出を説明する。Ｔリンパ球株314.7(Ａ及びＣ)及び314.28(Ｂ及びＤ)は、それぞれMDK 114-122及びMDK 13-21ペプチドに特異的である。各株を抗-CD8抗体並びにHLA-A2/MDK 114-112(Ａ及びＢ)及びHLA-A2/MDK 13-21(Ｃ及びＤ)四量体により標識し、フローサイトメトリにより分析した。各細胞集団のパーセンテージは、各象限に示す；
− 図８は、ミッドカインペプチド9-23に特異的なCD4⁺ Tリンパ球のHLA II-制限を説明する。制限は、HLA II分子(HLA-DR7、DR11、DR15、DRB5)でトランスフェクトし、ペプチド9-23をロードしたＬ細胞を使用するIFN-γ Elispotにより評価した；
− 図９は、ミッドカインペプチド9-23に特異的なCD4⁺ Tリンパ球の331.24 T-株による腫瘍溶解物の認識の証明を説明する。腫瘍認識は、HeLa(MDK^-)、HeLa-pMDK(MDK⁺)及びHepG2(MDK⁺)細胞を使用するIFN-γ Elispotにより試験した。

ヒトミッドカインのペプチド配列(配列番号：２)を表す。 ミッドカインペプチドに対して誘導されたCD8⁺ Tリンパ球のペプチド特異性を説明する。 ミッドカインペプチドに対して誘導されたCD8⁺ Tリンパ球のペプチド特異性を説明する。 ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球のHLA-A2制限を説明する。 ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球による、ミッドカイン発現プラスミドでトランスフェクトした細胞の認識を説明する。 腫瘍細胞におけるミッドカイン発現を説明する。 ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球による腫瘍株の認識を説明する。 特異四量体での標識化によるミッドカイン-特異的CD8⁺リンパ球の検出を説明する。 ミッドカインペプチド9-23に特異的なCD4⁺ Tリンパ球のHLA II-制限を説明する。 ミッドカインペプチド9-23に特異的なCD4⁺ Tリンパ球の331.24 T-株による腫瘍溶解物の認識の証明を説明する。

実施例１：ミッドカインタンパク質のペプチドに特異的なCD8⁺ T応答の誘導
１)材料及び方法
ａ)ペプチド
HLA-A2分子(白色人種において最も広く表されるクラスI HLA対立遺伝子である)により制限された潜在的なCD8⁺ Tエピトープを表す７つのペプチドを、BIMASプログラム(http://www-bimas.cit.nih.gov)を用いて選択した。選択したペプチドの配列を表IV及び添付の配列表に示す。

Fmocストラテジーに従って固相並行合成でペプチドを合成し、HPLCにより精製し、質量分析(ES-MS)により検証した。

ｂ)ミッドカインペプチドに特異的なHLA-A2-制限CD8⁺ Tリンパ球株の取得
HLA-A2分子を保有する健常個体の末梢血単核細胞(PBMC)をFicollグラジエントで分離した。次いで、PBMCをAIM V培地(Life Technologies)中で培養し、一晩37℃にて５％ CO₂/95％空気の存在下でインキュベートした。CD8⁺ Tリンパ球を非接着性細胞から免疫磁性選別により精製し、凍結した。接着性細胞を、1000U/mlのGM-CSF及び1000U/mlのIL-4を含有するAIM V培地中で５日間培養することにより未成熟樹状細胞に分化させた後、１μg/mlのLPS、1000U/mlのIL-4及び1000U/mlのGM-CSFの存在下で２日間培養することにより成熟樹状細胞に分化させた。成熟樹状細胞を、５μg/mlのβ-2-ミクログロブリン及び10μg/mlの表IVの各ペプチドの存在下でインキュベートした。４時間後、細胞を洗浄し、次いで96-ウェルプレートにおいて、精製CD8 Tリンパ球の存在下に、10％のAB型ヒト血清、IL-6(1000U/ml)及びIL-12(５ng/ml)を含有するIMDM培地中で培養した。各週に、培養物を、20U/mlのIL-2及び10ng/mlのIL-7を含有する培地中で、上記のペプチド混合物をロードした自家成熟樹状細胞で再刺激した。４週間の培養後、各ウェルに含まれるT細胞株の特異性をIFN-γ Elispotにより試験した。

ｃ)ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球へのミッドカインタンパク質の提示
ペプチド-特異的CD8⁺ Tリンパ球株を、CMVプロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの制御下にミッドカインコーディング配列を含んでなる組換えプラスミドpcDNA3.1(Invitrogen)でトランスフェクトしたC1R-A2細胞の存在下で培養した。これらトランスフェクトC1R-A2細胞によるCD8⁺ Tリンパ球の活性化は、下記のようなElispotにより評価した。

ｄ)ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球による腫瘍細胞の認識
ペプチド-特異的CD8⁺ Tリンパ球株を、種々の腫瘍株：DLD-1(ATCC(登録商標) # CCL-221)及びHep G2(ATCC(登録商標) # HB-8065)の存在下で培養した。これら腫瘍細胞によるCD8⁺ Tリンパ球の活性化は、下記のようなElispotにより評価した。

ｅ)Elispot
PBS緩衝液中2.5μg/mlに希釈した抗-IFN-γ抗体(1-D1K, Mabtech)を、ニトロセルロースプレート(Millipore)に１時間37℃にて吸着させた。次いで、プレートをPBSで洗浄した後、10％のAB型ヒト血清(100μg/ウェル)を含有するIscove培地で２時間37℃にて飽和させた。
抗原-提示細胞は、HLA-A及びHLA-B分子を欠き、HLA-A2をコードするcDNAでトランスフェクトし(C1R-A2)、且つ単一ペプチド(10μgのペプチド)若しくはペプチドの混合物(10μgの各ペプチド)をロードしたリンパ芽腫Ｂ細胞株C1R(Hoganら, J. Immunol., 1988, 141, 2519-2525)の細胞、又はミッドカイン発現プラスミドでトランスフェクトしたC1R-A2細胞、或いはミッドカインを発現する腫瘍細胞である。

次いで、HLA-A2分子に関するこの株の特異性を検証するために、HLA-A2でトランスフェクトしたC1R細胞(30 000細胞/ウェル)及び5000の試験リンパ球をプレートに加え、単一ペプチド(10μgのペプチド)又はペプチドの混合物(10μgの各ペプチド)の存在下又は不在下で、24時間37℃にてインキュベートした。用量-応答分析のために、0.001〜10μg/mlの範囲の種々の濃度でペプチドを使用する。

次いで、ペプチド-特異的CD8⁺ Tリンパ球よる、HLA-A2を発現するミッドカイン-トランスフェクト細胞の認識を分析するために、HLA-A2及びミッドカイン発現プラスミドでトランスフェクトしたC1R細胞(30 000細胞/ウェル)及び5000の試験リンパ球をプレートに加え、24時間37℃にてインキュベートした。
次いで、ペプチド-特異的CD8⁺ Tリンパ球によるミッドカインを発現する腫瘍細胞の認識を分析するために、腫瘍細胞(30 000細胞/ウェル)及び5000の試験リンパ球をプレートに加え、24時間37℃にてインキュベートした。

水、PBS緩衝液/0.05％ Tween及びPBS単独での３回の逐次洗浄後、１％ BSAを含有するPBS中0.25μg/mlに希釈した100μlのビオチン化抗-IFN-γ二次抗体(7-B6-1-biotin, Mabtech)を各ウェルに加えた。周囲温度での１時間のインキュベーション後、プレートを再度洗浄し、次いで1/6000に希釈した100μg/ウェルのExtravidin-AKP(E-2636, Sigma)と共に周囲温度にて１時間インキュベートした。PBS緩衝液中でプレートを洗浄した後、水に希釈した(10mlの水に１錠)NBT/BCIP基質(B-5655, Sigma)100μlを各ウェルに配分した。約10分後にプレートを水中で十分にリンスすることによって免疫酵素法による可視化を停止した。プレートを乾燥後、自動読取機(AID)を使用して着色スポットをカウントした。スポット数が陰性コントロール(ペプチドなしコントロール)で得られるスポット数より３倍以上であり最低50スポットを有するとき、その株は陽性と見なす。提示細胞なしのコントロールにより、HLA-A2に関する応答の特異性を検証することが可能になる(制限コントロール)。

２)結果
ミッドカインタンパク質が腫瘍細胞-特異的細胞性免疫応答を誘導する能力を評価した。このために、最初に、ミッドカイン配列中で、(白色人種で最も頻繁なHLA I分子である)HLA-A2分子により制限されたCD8⁺ Tエピトープを同定した。次に、これらエピトープにより誘導されたCD8⁺ T細胞がミッドカインを発現する腫瘍株を選択的に認識する能力を分析した。

HLA-A2分子を保有する健常個体から採集した細胞を用い、インビトロ応答を誘導する能力について、合成ペプチドを試験した。これらペプチドのうち６つは、CD8⁺ Tリンパ球を誘導した：MDK 13-21、MDK 13-22、MDK 12-21、MDK 14-22、MDK 113-122及びMDK 114-122。図２に示されるように、CD8⁺ Tリンパ球株267.29Aは、ペプチド12-21、13-21及び13-22に特異的である。278.11A株はペプチド13-21、13-22及び14-22に特異的である。314.28株はペプチド114-122に特異的であり、ペプチド113-122にはより低い程度で特異的である。したがって、ペプチド12-21、13-21、13-22、14-22、113-122及び114-122は、健常HLA-A2⁺ドナーにおいて、免疫原性であり、CD8⁺ Tリンパ球を誘導する。

ペプチド-特異的CD8⁺ Tリンパ球株のHLA-A2制限を図３に示す。HLA-A2(C1R-A2)細胞のみがペプチドを特異的Ｔリンパ球株に提示することができる。C1R(HLA-A2^-)細胞は、ペプチドの存在下でさえも、該リンパ球株を刺激しない。

提示細胞がミッドカインを正確にプロセシングすることができたことを検証するために、C1R-A2細胞を、ミッドカインコーディング配列を含んでなる組換えプラスミドpcDNA3.1でトランスフェクトした。図４は、CD8⁺ Tリンパ球株278.11A(ペプチド13-22及び14-22に特異的)、297.58(ペプチド12-21、13-21及び14-22に特異的)及び314.48(ペプチド114-122に特異的)が、該トランスフェクト細胞及びペプチドをロードしたC1R-A2細胞によって活性化されるが、非トランスフェクト細胞によっては活性化されないことを示している。

ミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球による、ミッドカインを発現する又は発現しない腫瘍株の認識も調べた。図６は、種々の株によるミッドカインの発現又は非発現を示す。図７では、CD8⁺ Tリンパ球株267.29A(ペプチド13-22、12-22及び13-21に特異的)、278.11A(ペプチド13-22及び14-22に特異的)及び314.48(ペプチド114-122に特異的)が天然でミッドカインを発現するHep G2細胞は認識するが、ミッドカインを発現しないC1R-A2及びDLD-1細胞は認識しないことが認められる。認識は、Hep G2細胞がIFN-γの存在下で培養されたとき、細胞上でのHLA分子の増加した発現に起因して、少しばかり良好である。297.58株(ペプチド12-21、13-21及び14-22に特異的)は、Hep G2細胞を、IFN-γの存在下で培養したときにのみ認識する。

これら結果は全て、ミッドカインが、ミッドカイン発現腫瘍細胞を選択的に認識するHLA-A2-制限CD8⁺ Tリンパ球の活性化を誘導することができる２つのオーバーラップペプチド群に分けられる６つのペプチドを含有していることを示す。

実施例２：特異四量体での標識化によるミッドカインペプチドに特異的なCD8⁺ Tリンパ球の検出
実施例１で得た各リンパ球株(500 000細胞)を、200μlのPBS/２％ FCS中50μg/mlの四量体で、暗所にて４℃で１時間標識した。この四量体は、ペプチド13-21又は114-122をロードし、フィコエリトリン-標識ストレプトアビジンと複合体化したビオチン化HLA-A2分子であり、Novakら(J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67)又はKurodaら(J. Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756)に記載された技術に従って製造する。次いで、細胞をPBS中で２回洗浄した後、FITC抗-CD8抗体(BD Biosciences)を用いて30分間４℃にて標識した。PBS中での洗浄後、１％パラホルムアルデヒド(PAF)を含有する50μlのPBSで細胞を固定した。FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)で標識化を分析した。結果を図７に示す。

実施例３：ミッドカインタンパク質のペプチドに特異的なCD4⁺ T応答の誘導
１)材料及び方法
ａ)ペプチド
ヒトミッドカインの全体配列(SwissProt P21741, 配列番号：２及び図１)をカバーする15アミノ酸(15-マー)のペプチドを、HLA-DR及びHLA-DP4分子のP1ポケットに固定するために、３又は４位での芳香族又は疎水性残基の存在に従って選択した。
選択したペプチドの配列を表Ｖ及び添付の配列表に示す。
ペプチドを、Fmocストラテジーに従って固相並行合成で合成し、HPLCにより精製し、質量分析(ES-MS)により検証した。

ｂ)HLA II/ペプチド結合アッセイ
HLA II分子への結合についてのアッセイは、それぞれHLA-DR及びHLA-DP4分子に関して米国特許US 6,649,166及びPCT国際出願WO 03/040299に記載されるような、免疫酵素法による可視化を用いる競合結合アッセイである。種々の抗原に由来するペプチドの結合活性を測定するこれらアッセイの実施は、米国特許US 6,649,166並びにPCT国際出願WO 02/090382、WO 03/040299及びWO 2004/014936に説明されている。

より具体的には、Texierら, J. Immunol., 2000, 164, 3177-3184に記載されたプロトコルに従ってNH₂-末端残基でビオチン化したペプチド：HA 306-318(PKYVKQNTLKLAT、配列番号：31)、A3 152-166(EAEQLRAYLDGTGVE、配列番号：32)、MT 2-16(AKTIAYDEEARRGLE, 配列番号：33)、B1 21-36(TERVRLVTRHIYNREE、配列番号：34)、YKL(AAYAAAKAAALAA、配列番号：35)、LOL 191-210(ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT、配列番号：36)、Oxy 271-287(EKKYFAATQFEPLAARL、配列番号：37)及びE2/E168(AGDLLAIETDKATI、配列番号：38)を、下記表に記載の条件下でトレーサとして使用する。

各試験の感受性は、トレーサに対応する非ビオチン化ペプチドで観察されたIC₅₀値に反映される。ビオチン化トレーサペプチドの最大結合を50％阻害する競合ペプチドの濃度(nM)(IC₅₀)を各ペプチドについて算出した。結果は、相対活性(競合ペプチドのIC₅₀の参照ペプチド(トレーサに対応する非ビオチン化ペプチド)のIC₅₀に対する比)の形で表す。100未満の相対活性が活性ペプチドを特徴付ける。

ｃ)ミッドカインペプチドに特異的で優勢なHLA II分子により制限されたCD4⁺ Tリンパ球株の取得
Olerup SSP^TM HLA-DPB1及びHLA-DRB1キットを使用するSSPによりHLA-DR及びHLA-DP遺伝子型を事前に決定した健常個体の末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficollグラジエントで分離した。次いで、PBMCをAIM V培地(Life Technologies)中で培養し、フラスコ中、37℃のインキュベータにおいて５％ CO₂/95％空気の存在下でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、非接着性細胞を回収し、次いで磁性ビーズにカップリングした抗-CD4抗体(Miltenyi Biotec kit)を用いてCD4⁺ Tリンパ球を精製し、凍結した。接着性細胞を、1000U/mlのGM-CSF及び1000U/mlのIL-4を含有するAIM V培地中で５日間インキュベートした後、樹状細胞(未成熟樹状細胞)に分化した細胞を引き続き１μg/mlのLPS、1000U/mlのIL-4及び1000U/mlのGM-CSFの存在下で２日間培養してその成熟化を誘導した。

次いで、成熟樹状細胞(100 000細胞/ウェル)を、ペプチドの混合物(グルタミン(24mM, Sigma)、アスパラギン(55mM, Sigma)、アルギニン(150mM, Sigma)、ペニシリン(500IU/ml, Invitrogen)、ストレプトマイシン(50mg/ml, Invitrogen)及び10％のヒト血清を補充したIMDN培地(Invitrogen)中10μgの各ペプチド)と、４時間37℃にてインキュベートした。引き続いて、成熟樹状細胞の洗浄後、事前に解凍したCD4⁺ Tリンパ球(100 000細胞/ウェル)の存在下、1000U/mlのIL-6及び10ng/mlのIL12を含有する培地中でインキュベートした。

7日(D7)後、最初に、事前に解凍し、且つミッドカインの全体配列をカバーするペプチドの２つの混合物(ペプチドMDK1〜MDK9の混合物、次いでペプチドMDK 1〜MDK 18の混合物)をロードした成熟樹状細胞により、IL-2(10U/ml)及びIL-7(５mg/ml)を含有する培地中で、培養物を刺激した。IL-7(５ng/ml)のみを含有する培地中でのロードした樹状細胞による３回の更なる刺激(D14、D21、D28)後、最終刺激の少なくとも６日後に、Elispotにより細胞を試験した。

ｄ)Elispot
PBS緩衝液中2.5μg/mlに希釈した抗-IFN-γ抗体(1-D1K, Mabtech)を、ニトロセルロースプレート(Millipore)に１時間37℃にて吸着させた。次いで、プレートをPBSで洗浄した後、10％のAB型ヒト血清(100μg/ウェル)を含有するIscove培地で２時間37℃にて飽和させた。抗原-提示細胞は、上記のように調製した未成熟自家樹状細胞、又はHLA-DR及びHLA-DP4分子に関して株の特異性を検証するための、試験すべきHLA-DR若しくはHLA-DP4分子の１つをコードするcDNAでトランスフェクトしたマウス線維芽細胞の株(Ｌ株)(Yuら, Hum. Immunol., 1990, 27, 132-135)のいずれかである。次いで、樹状細胞(10⁵細胞/ウェル)又はHLA-DR若しくはHLA-DP4分子の１つでトランスフェクトしたＬ細胞(30 000細胞/ウェル)及び5000の試験リンパ球をプレートに加え、単一ペプチド(10μg)又はペプチドの混合物(10μgの各ペプチド)の存在下又は不在下で、24時間37℃にてインキュベートした。

水、PBS緩衝液/0.05％ Tween及びPBS単独での３回の逐次洗浄後、１％ BSAを含有するPBS中0.25μg/mlに希釈した100μlのビオチン接合抗-IFN-γ二次抗体(7-B6-1-biotin, Mabtech)を各ウェルに加えた。１時間のインキュベーション後、プレートを再度洗浄した後、1/6000に希釈した100μl/ウェルのExtravidin-AKP(E-2636, Sigma)とインキュベートした。PBS緩衝液中でプレートを洗浄した後、水に希釈した(10mlの水に１錠)NBT/BCIP基質(B-5655, Sigma)100μlを各ウェルに配分した。約10分後にプレートを水で十分にリンスすることによって免疫酵素的可視化を停止し、自動読取機(AID)を使用して着色スポットをカウントした。スポット数が陰性コントロール(ペプチドなしコントロール)で得られるスポット数より３倍以上であり最低50スポットを有するとき、その株を陽性と見なす。提示細胞なしのコントロールにより、HLA-DR又はHLA-DP4に関する応答の特異性を検証することが可能になる(制限コントロール)。

ｅ)ミッドカインペプチドに特異的なCD4⁺ Tリンパ球による腫瘍細胞の認識
試験した腫瘍株は、ミッドカインを発現するHep G2株、ミッドカインを発現しないHeLa腫瘍株及び実施例１に記載したミッドカイン発現プラスミドで一過性にトランスフェクトしたHeLa細胞に対応するHeLa-pMDK株である。採集した細胞を凍結/解凍サイクルにより溶解した。ミッドカインペプチド9-23に特異的なCD4⁺ Tリンパ球の331.24株を、腫瘍株溶解物を予めロードした樹状細胞の存在下でインキュベートし、活性化を上記のElispotにより評価した。

２)結果
ａ)HLA II分子に関するミッドカインペプチドの結合活性
クラスII HLA分子の結合部位のほとんどが、ミッドカインのＮ-末端部分、すなわちシグナルペプチド(1-22；表VII)に局在する。

Ｎ-末端領域のペプチドは、少なくとも４つのHLA II分子に関して良好な親和性を有する。特に、ペプチド9-23は、高親和性をしばしば反映する相対親和性(10未満の相対活性)で８つの異なるHLA II分子に結合する。他のペプチド(例えば、ペプチド1-15、4-18及び14-28)もまた、幾つかのHLA II分子に結合する。
他方、残りの配列に由来するペプチドは、４つのHLA II分子に良好な親和性で結合するＣ-末端領域(110-124)のペプチドを除き、白色人種に優勢な少なくとも４つのHLA II分子に関して有意な結合活性を示さない。

ｂ)ミッドカインペプチドによる特異的CD4⁺ T応答の誘導
ミッドカインタンパク質が特異的CD4⁺ Tリンパ球の刺激をインビトロで誘導する能力を、健常個体(腫瘍を有しない個体)からの血液サンプルを用いて評価した。この評価は、これらペプチドがCD4⁺前駆体リンパ球(これらはナイーブな個体では非常に低い頻度で存在するのであるが)を動員する能力、すなわちインビトロ免疫化を実施する能力を評価することを含んでいた。

CD4⁺ Tリンパ球株331.16、331.24及び343.1は、ミッドカイン配列全体をカバーするペプチドの２つのプールでロードした成熟自家樹状細胞によるＴリンパ球のインビトロ刺激により得た。特異性研究をIFN-γ Elispotにより行った。この研究により、これら３つの株がペプチド9-23に特異的であることが示された。各株を、HLA-DR又はHLA-DP4分子でトランスフェクトしペプチド9-23をロードしたＬ細胞によって刺激される能力について、IFN-γ Elispotにより試験した。図８は、ペプチド9-23がDR7分子によってドナー331の株(331.16及び331.24)に提示され得ること、及び343.1株はDR11-制限されるがDR15-及びDRB5-制限されないことを示す。

CD4⁺ Tリンパ球株331.24を、腫瘍株溶解物を予めロードした樹状細胞の存在下でインキュベートし、その活性化をIFN-γ Elispotにより評価した。図９は、331.24株がトランスフェクトHeLa細胞の溶解物をロードした樹状細胞によって刺激されるが、非トランスフェクトHeLa細胞によっては刺激されないことを示す。このことから、Ｔリンパ球株331.24の特異性及びトランスフェクト細胞の溶解物中に存在するミッドカインを認識する能力が確証される。これは、Hep G2腫瘍株により天然に産生されるミッドカインを認識する。

全ての結果が、ペプチド9-23は８つの異なるHLA II分子に結合し、異なるクラスII HLA分子により制限された特異的CD4⁺ T応答をインビトロで誘導することを示している。更に、このペプチドに対して誘導されたCD4⁺ T細胞は、ミッドカインを発現し、樹状細胞により提示される腫瘍の溶解物を認識することができる。このペプチドはシグナルペプチド(1-22)とオーバーラップしているので、これら実験から、ペプチド9-22もCD4⁺ Tエピトープを含んでなると推論することができる。なぜならば、ミッドカインシグナルペプチドは細胞内で、アミノ酸22と23との間で切断されるからである。興味深いことに、ペプチド9-23及び9-22は、CD8⁺ Tエピトープを含んでなるペプチド12-21、13-21、13-22及び14-22を含んでいることに気付く。よって、ペプチド9-23及び9-22は、ミッドカインを発現する腫瘍に特異的なCD4⁺ T及びCD8⁺ T応答を誘導することができる。

上記から明らかなように、本発明は、いかなる様式でも、より明示的に記載されたに過ぎない実現、実施及び適用の方法のものに制限されない；それどころか、本発明は、本発明の背景及び範囲から逸脱しないで、当業者が想起し得る異形体を全て包含する。

Claims (24)

1. 白色人種において優勢なHLA分子により制限された少なくとも１つのCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープを含んでなるミッドカインタンパク質に由来するペプチド又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、抗ガンワクチンの製造のための使用。
2. 前記ペプチドが配列番号２の配列のヒトミッドカインタンパク質からなることを特徴とする請求項１に記載の使用。
3. 前記ペプチドが、少なくとも１つのHLA-A2分子-制限CD8⁺ Tエピトープを含んでなるミッドカインタンパク質の少なくとも８アミノ酸のフラグメントであり、前記ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも14〜21位又は114〜122位を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の使用。
4. 前記ペプチドが、ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の12〜21位、13〜21位、13〜22位、14〜22位、113〜122位又は114〜122位からなることを特徴とする請求項３に記載の使用。
5. 前記ペプチドが、白色人種において優勢な少なくとも４つの異なるHLA II分子により制限された少なくとも１つのCD4⁺ Tエピトープを含んでなるミッドカインの少なくとも８アミノ酸のフラグメントであり、前記ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも９〜15位、14〜28位又は110〜124位を含んでなることを特徴とする請求項１に記載の使用。
6. 前記ペプチドが前記ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の１〜15位、４〜18位又は14〜28位からなることを特徴とする請求項５に記載の使用。
7. 前記ペプチドが、HLA-A2分子により制限された少なくとも１つのCD8⁺ Tエピトープ及び白色人種において優勢な少なくとも４つの異なるHLA II分子により制限された少なくとも１つのCD4⁺ Tエピトープを含んでなり、前記ミッドカインタンパク質のアミノ酸配列の９〜21位、９〜22位、９〜23位又は110〜124位からなることを特徴とする請求項１、３及び５のいずれか１項に記載の使用。
8. 前記ペプチドが少なくとも２つの同一の又は異なるエピトープの連結を含んでなる複数エピトープペプチドであり、該少なくとも２つの同一の又は異なるエピトープのうちの少なくとも１つが請求項１〜７のいずれか１項に記載のミッドカインCD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tエピトープであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
9. 前記複数エピトープペプチドが別の腫瘍抗原のCD4⁺ T又はCD8⁺ Tエピトープを含んでなることを特徴とする請求項８に記載の使用。
10. 前記ペプチドが異種のタンパク質又はタンパク質フラグメントに融合していることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
11. 前記ペプチドがリポペプチドであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
12. 前記ポリヌクレオチドが請求項２〜１０のいずれか１項に記載のペプチドをコードすることを特徴とする請求項１に記載の使用。
13. 前記ポリヌクレオチドが発現ベクターに挿入されていることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
14. 前記ワクチンが医薬的に許容され得るビヒクル、担体物質及び/又はアジュバントを含んでなることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
15. ミッドカインに対する細胞性応答の免疫モニタリング試薬であってガンの予後の評価用又はガン治療のモニタリング用に意図される試薬の製造についての請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
16. 前記ペプチドがHLA分子/ペプチド複合体の四量体の形態であり、該四量体が標識されていることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
17. ガンが、食道ガン、胃ガン、結腸ガン、膵臓ガン、甲状腺ガン、肺ガン、乳ガン、膀胱ガン、子宮ガン、卵巣ガン及び前立腺ガン、肝細胞ガン腫、骨肉腫、神経芽細胞腫、グリア芽細胞腫、星状芽細胞腫、白血病及びウィルムス腫瘍からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
18. 請求項３〜１１のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチド又は請求項１３に記載のベクター及び医薬的に許容され得るビヒクル、担体物質又はアジュバントを含んでなることを特徴とするワクチン組成物。
19. − ガンを有する個体の生物学的サンプルを請求項１〜１０及び１６のいずれか１項に記載のペプチドと接触させ、
    − ミッドカイン-特異的CD4⁺ T及び/又はCD8⁺ Tリンパ球を任意の適切な手段により検出することを含んでなることを特徴とする、ガンを有する個体におけるミッドカインに対する細胞性応答の免疫モニタリング用のインビトロ方法。
20. 請求項１〜１０及び１６のいずれか１項に記載のペプチドを含んでなることを特徴とするミッドカインに対する細胞性応答の免疫モニタリング用キット。
21. ミッドカインから得られた、請求項３〜１１のいずれか１項に記載のペプチド。
22. 請求項２１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
23. 請求項２２に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
24. 請求項２２に記載のポリヌクレオチド又は請求項２３に記載のベクターで改変された宿主細胞。