WO2007026078A2 - Epitopes t cd4+ des antigenes mage-a restreints a hla-dp4 et leurs applications - Google Patents

Epitopes t cd4+ des antigenes mage-a restreints a hla-dp4 et leurs applications Download PDF

Info

Publication number
WO2007026078A2
WO2007026078A2 PCT/FR2006/002019 FR2006002019W WO2007026078A2 WO 2007026078 A2 WO2007026078 A2 WO 2007026078A2 FR 2006002019 W FR2006002019 W FR 2006002019W WO 2007026078 A2 WO2007026078 A2 WO 2007026078A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mage
peptide
antigen
peptides
hla
Prior art date
Application number
PCT/FR2006/002019
Other languages
English (en)
Other versions
WO2007026078A3 (fr
Inventor
Xiaofei Wang
Gaétan MUNIER
Sandra Moratille
Hélène NUYTTENS
Bernard Maillere
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique filed Critical Commissariat A L'energie Atomique
Publication of WO2007026078A2 publication Critical patent/WO2007026078A2/fr
Publication of WO2007026078A3 publication Critical patent/WO2007026078A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001186—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/065—Thymocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination

Definitions

  • the present invention relates to CD4 + T epitopes of tumor-specific MAGE antigens restricted to HLA-DP4, and to their vaccine and diagnostic applications.
  • Tumor cells express antigens that are recognized by CD4 + and CD8 + T cells and that are tumor specific (for review see Kirkin et al., Cancer Investigation, 2002, 20, 222-236). These tumor-specific antigens, called CT (Cancer Testis) antigens, are also expressed in certain healthy tissues (testes, placenta, ovaries) but are not recognized by T cells because these tissues lack conventional HLA molecules.
  • CT Cancer Testis
  • MAGE-A, MAGE-B and MAGE-C antigens which are expressed in many tumors, represent particularly interesting targets for anti-tumor vaccination.
  • These antigens belong to the MAGE antigen superfamily which also includes ubiquitous antigens (MAGE-D) or specifically expressed in the brain (necdine, MAGEL2).
  • MAGE antigens comprise 3 domains (d1, d2 and d3); the d2 domains show strong homology (> 60%) whereas a lower homology is observed for some of the d1 domains, in particular those of the tumor-specific MAGE antigens and in particular those of the MAGE-A and MAGE-B antigens.
  • MAGE-A antigens are the best known and most documented. They group together 12 different antigens, the MAGE-A1 antigen (or MAGE-I) being the first tumor antigen identified.
  • MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A12 is found in many tumors, whereas that of MAGE-A5, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE -AlO, MAGE-AI l is found in only a few and that of MAGE-A7 has never been detected.
  • MAGE-A1 and MAGE-A3 antigens are found in 15 to 50% of cancers such as melanomas, sarcomas and lung, breast stomach and prostate; the MAGE-Al antigen alone is especially expressed in 80% of liver tumors.
  • the M AGE-A4 antigen has a different expression profile from other MAGE-A antigens and is frequently expressed in lymphomas.
  • CD4 + T lymphocytes have been shown to play an essential role in tumor control. Indeed, the induction of cytotoxic T lymphocytes (CTL) is dependent on the activation of CD4 + T lymphocytes which intervene in particular in the recruitment and maintenance of CTL.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • immunization with CD8 + T epitopes alone induces cytotoxic T lymphocytes specific for the tumor antigen, with a very low frequency (of the order of 10 " to 10 " 7 of CD8 + cells: Zhang et al. Eur J.
  • CD4 + T cells induce the activation of antigen presenting cells (APCs for Antigen Presenting CeII) which In turn, they recruit tumor-specific CD8 + T lymphocytes, and they are involved in the maturation of cytotoxic T lymphocyte effector cells, and the results observed in mice that do not express major class histocompatibility complex molecules.
  • APCs for Antigen Presenting CeII antigen presenting cells
  • CD4 + T cells recognize the tumor peptides presented to them by the class II major histocompatibility complex molecules; in humans, they are called HLA II molecules for Human Leucocyte Antigen class II. Recognition can take place directly (that is, the tumor itself presents these peptides to T cells), but it is likely that the main pathway for activation is via dendritic cells. These cells are in fact the main antigen presenting cells capable of recruiting naive T lymphocytes in vivo. These antigenic peptides, termed T epitopes, result from the proteolytic degradation of the antigens by the antigen presenting cells. They have variable lengths, generally from 13 to 25 amino acids, and possess a sequence which makes them capable of binding HLA IL molecules.
  • a peptide comprising a CD4 + T epitope is able to stimulate specific CD4 + T cells in vitro or to recruit them in vivo. It is therefore sufficient to induce a CD4 + T response.
  • CD4 + T lymphocytes specific for tumor antigens are also useful as reagents in a test for the diagnosis or monitoring of cancer treatment in humans, based on the detection of said T cells.
  • CD4 + either directly, in particular by flow cytometry in the presence of multimers of complex class II molecules / peptide, or indirectly, in particular by a lymphocyte proliferation assay, or an assay of antibodies or cytokines.
  • CD8 + T epitopes capable of being presented by molecules of the major histocompatibility complex of class I, in humans (HLA I molecules or Human Leucocyte Antigen type I), have been identified in the MAGE antigens (US Patent 6,063,900; PCT Application WO 2004/052917; http://www.cancerimmunitv.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm), the known number of CD4 + T epitopes is smaller.
  • the use of these peptides as an antigen is the identification of CD4 + T epitopes, since their sequence varies from one individual to another due to the polymorphism of the HLA IL molecules.
  • the HLA II molecules are heterodimers consisting of polymorphic beta ( ⁇ ) and beta ( ⁇ ) chains
  • the HLA-DR molecule is very polymorphic. Indeed, while its alpha chain has only 3 alleles, the beta ( ⁇ ) chain encoded by the DRB1 gene, which is the most expressed, currently has 458 alleles.
  • the two chains ( ⁇ and ⁇ ) that constitute them are polymorphic but they have fewer alleles.
  • HLA-DQ ⁇ chain There were 28 DQA1 alleles (HLA-DQ ⁇ chain), 60 DQB1 alleles (HLA-DQ ⁇ chain), 22 DPA1 alleles (HLA-DP ⁇ chain), and 116 DPB1 alleles (HLA-DP ⁇ chain). . However, the combination of the two ⁇ and ⁇ chains encoded by these alleles gives rise to numerous HLA-DQ and HLA-DP molecules.
  • these isoforms have different binding properties to each other, which implies that they can bind different peptides of the same antigen.
  • the mode of binding of the peptides to the HLA II molecules is more complex than that of the HLA I molecules and there are no reliable programs for predicting peptides capable of binding to the HLA II molecules.
  • the HLA molecules have a very close three-dimensional structure, but the binding site of the HLA II molecules is an open groove at both ends. For this reason, peptides restricted to HLA II molecules accept peptides of variable size, generally between 13 and 25 amino acids.
  • This throat is characterized by five pockets of specificity (P1, P4, P6, P7 and P9 corresponding to the positions of the residues of the peptide that they accommodate) which house polymorphic residues. Since the sequence differences between the different HLA II molecules are essentially located in the pockets of the peptide binding site, they intervene directly in the repertoire of peptides that bind to each molecule.
  • each individual recognizes in an antigen a set of peptides whose nature depends on the HLA II molecules that characterize it. Since there are a large number of HLA II alleles, there is therefore in a given sequence an important repertoire of T epitopes of very different sequences, each specific for a different allele.
  • a peptide capable of stimulating a CD4 + T-specific response of a tumor antigen in a few individuals may therefore be inactive in the majority of other individuals, because the latter do not recognize the tumor antigen by the same epitopes.
  • MAGE antigens are restricted to an HLA DR molecule and are derived from the MAGE-A3 antigen [http://www.cancerimmunitv.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm; MAGE-A3 267-282 restricted to DR1 (PCT International Application WO 02/095051); MAGE-A3 149-160 restricted to DR4 and DR7 (Kobayashi et al., Cancer Research, 2001, 61, 4773-4778); MAGE-A3 191-205 and 281-295 restricted to DRI 1 (Consogno et al., Blood, 2003, 101, 1038-1044, Manici et al., J.
  • HLA-DR molecules For the HLA-DR molecules, a dozen alleles are necessary to cover more than 60% of the gene frequency found in the Caucasian population and therefore affect more than 85% of this population. Thus, a peptide carrying an HLA-DR restricted epitope is generally not recognized by all predominant HLA-DR molecules in the population. Consequently, each peptide carrying an HLA-DR restricted epitope must be tested against a dozen HLA-DR molecules in order to select the peptides recognized by the majority of these molecules, and it is generally necessary to use a mixture of at least two or three different peptides to obtain an effective vaccine in the majority of individuals in the population to be vaccinated.
  • HLA-DP4 molecules which have only 3 amino acids of difference have the particularity of being very frequent, especially in the Caucasian population. These two DP4 molecules alone cover the majority of the HLA-DP allelic frequency in the Caucasian population (around 50% in Europe and 80% in North America) and are also present at significant frequencies. in other populations (allelic frequency in the order of 60% in South America, 60% in India, 25% in Africa and 15% in Japan).
  • Each of these DP4 molecules comprises an alpha chain encoded either by the DPA1 * O1O3 allele which is the most common (78.2%) or by the DPAl * 0201 allele (20.2%) and a coded beta chain.
  • HLA-DP4 molecules are perfectly capable of presenting peptides to T lymphocytes since many T clones have been isolated from a wide variety of antigens such as tetanus toxin, hepatitis B virus and allergen. major of Dermatophagoides pteronissimus. However, only one HLA-DP (HLA-DP4) and HLA-DQ (HLA-DQ6) restricted CD4 + T epitope was identified, only in the MAGE-A3 antigen
  • the inventors have identified other HLA-DP4-restricted CD4 + T epitopes in the MAGE-A1 antigen; these epitopes, which are different from the known epitope of the MAGE-A3 antigen, are also present in other tumor-specific MAGE antigens, in particular in the MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 and MAGE-A9 antigens, MAGE-A10, MAGE-AI l and MAGE-A12. Furthermore, these peptides, which are capable of being presented by an HLA-DP4 molecule and of inducing specific CD4 + T lymphocytes in naive individuals, are capable of inducing, by themselves, an antigen-specific CD4 + T response (s).
  • the subject of the present invention is therefore the use of a peptide derived from the MAGE-A1 antigen comprising a CD4 + T epitope capable of being presented by an HLA-DP4 molecule and of inducing T lymphocytes specific for at least one MAGE antigen expressed by the tumor cells, which peptide is selected from the group consisting of: a) peptides of 15 to 50 consecutive amino acids of the antigen
  • MAGE-A1 preferably from 15 to 25 amino acids, comprising at least the sequence situated between the following positions:
  • positions 274-282 (SEQ ID NO: 9); these fragments comprise the epitope IX of MAGE, b) the fragments of the peptides defined in a), of 13 or 14 amino acids, comprising at least the sequence situated between the positions 93 to 101, 68 to 76, 107 to
  • the term "individual carrying a DP4 allele” means an individual carrying an allele coding for the beta chain of a DP4 molecule, preferably the allele.
  • the peptides according to the invention have the following properties:
  • HLA-DP4 binding activity the peptides according to the invention have a high affinity for HLA-DP4 (binding activity ⁇ 1000 nM); the binding activity can be measured by an HLA-DP4 / peptide binding test, in competition, with an immuno-enzymatic revelation, according to the principle described in PCT International Application WO 03/040299,
  • the peptides according to the invention are recognized by CD4 + T lymphocytes in the majority of individuals because of the preponderance of the HLA-DP4 molecule in the Caucasian population, but also in populations in South America and India, and to a lesser extent in those in Africa and Japan. These peptides are also capable of inducing CD4 + T cells specific for a MAGE antigen expressed by tumor cells from the precursors present in the majority of naive individuals or to stimulate such cells in the majority of individuals with cancer associated with the expression of a MAGE antigen. In addition, the CD4 + T cells induced by these peptides recognize the epitope of the native antigen naturally present by the dendritic cells.
  • peptides represent potential candidates for prophylactic or therapeutic vaccination against cancers associated with the expression of a MAGE antigen, which are particularly interesting because they can induce a CD4 + T response specific for a MAGE antigen in the majority of individuals in the population.
  • peptides whose sequence is conserved in the various MAGE antigens or which cross-react with CD4 + T epitopes present in other MAGE antigens are capable of inducing a CD4 + T response towards several antigens. MAGE expressed by tumor cells.
  • the immunogenicity of the peptides can be determined, in particular from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), by any appropriate assay known to those skilled in the art, for example: a cell proliferation assay, an ELISPOT assay (cell assay cytokine producers) or an intracellular cytokine assay (IFN-gamma, IL-2, IL-4 and IL-10).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the sequence of the MAGE-Al antigen is available in the databases and corresponds to the access number SWISSPROT P43355.
  • the peptides according to the invention comprise a CD4 + T epitope consisting of a sequence of 9 to 12 amino acids as defined above, flanked at one of its ends, preferably at both ends, with at least 2 amino acids, preferably 3 amino acids.
  • the sequence of 9 to 12 amino acids, typically nine amino acid residues includes Pl, P4, P6 and P9, anchoring to a HLA-DP4 molecule and residues in position I 5 4, 6 and 9 of the said sequence correspond respectively to residues P1, P4, P6 and P9.
  • the anchoring residues are 1 (Pl), S (P4), F (P6) and V (P9).
  • the invention also encompasses the natural or synthetic variants obtained from the preceding sequences, by mutation (insertion, deletion, substitution) of one or more amino acids in the peptide sequence, since said variant retains a high affinity for HLA.
  • -DP4 binding activity ⁇ 1000 nM
  • the natural variants correspond to the homologous peptides derived from other MAGE antigens expressed by the tumor cells and in particular the MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10 and MAGE-AI antigens. 1 and MAGE-A 12.
  • the sequences of the other MAGE antigens are available in the databanks; the access numbers of the other human MAGE-A antigens in the SWISSPROT base are as follows: MAGE-A2: P43356; MAGE-A3: P43357; MAGE-A4: P43358; MAGE-A5: P43359; MAGE-A6: P43360; MAGE-A8: P43361; MAGE-A9: P43362; MAGE-AlO: P43363; MAGE-A1: P43364; MAGE-A12: P43365.
  • sequence of these variants can be deduced easily after optimal alignment of the MAGE antigen sequences expressed by the tumor cells, using appropriate software known to those skilled in the art such as CLUSTAL W (Thompson et al., 1994, NAR 22: 4673-4680).
  • the invention also encompasses modified peptides derived from the foregoing by introduction of any modification at amino acid residue (s), peptide bond or peptide ends, as long as said modified peptide retains a high affinity for HLA.
  • -DP4 binding activity ⁇ 1000 nM
  • modifications which are introduced into the peptides by conventional methods known to those skilled in the art include in a non-limiting manner: the substitution of an amino acid by a non-proteinogenic amino acid (amino acid D or amino acid analogue); adding a chemical group (lipid, oligo or polysaccharide) at a reactive function, in particular the side chain R; modification of the peptide bond (-CO-NH-), in particular by a retro-type or retro-inverso bond (-NH-CO-) or a bond different from the peptide bond; cyclization; the fusion of a peptide (epitope of interest for vaccination, label useful for the purification of the peptide, especially in cleavable form with a protease); the fusion of the sequence of said peptide with that of a protein, in particular an ⁇ or ⁇ chain of an HLA-DP4 molecule or the extracellular domain of said chain, or else a targeting sequence in the endosome derived in particular from the chain invariable
  • the peptide defined in a) is a peptide of the MAGE-A1 antigen selected from the group consisting of: SCILESLFRAVITK (positions 90-104, SEQ ID NO: 10, epitope II); PRALAETSYVKVLEY (positions 268-282: SEQ ID NO: 11, epitope VIII); PTTINFTRQRQPNEG (positions 65-79: SEQ ID NO: 12, epitope I); KKVADLVGFLLLKYR (positions 104-118: SEQ ID NO: 13, epitope III), REPVTKAEMLESVIK (positions 120-134: SEQ ID NO: 14, epitope IV), YKHCFPEIFGKASES (positions 136-150: SEQ ID NO: 15, V epitope) , ASESLQLVFGIDVKE (positions 147-161: SEQ ID NO: 16, epitope VI); EEIWEEIS VME VYDG (positions 212-226:
  • said peptide is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, 11, 13, 14 and 17.
  • the variant peptide in c) is a fragment of another MAGE antigen expressed by the tumor cells whose sequence is homologous to that of the peptide in a) or fragment in b), preferably said homologous fragment is derived from a MAGE-A antigen selected from: MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4 , MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A1, MAGE-A1, and MAGE-A12.
  • said variant peptide is selected from the group consisting of:
  • the fragments from 13 to 50 consecutive amino acids of the MAGE-A9 antigen preferably from 13 to 25 amino acids, comprising at least the VYYTLWSQF sequence (positions 71-79: SEQ ID NO: 19); the peptides including this sequence correspond to the epitope I of MAGE,
  • the fragments from 13 to 50 consecutive amino acids of the MAGE-A2, MAGE-A3 or MAGE-Al 2 antigens preferably from 13 to 25 amino acids, comprising at least the A / VELVHFLLL sequence (positions 114-122: SEQ ID NO: 20); the peptides including this sequence correspond to the epitope III of MAGE, the fragments of 13 to 50 consecutive amino acids of the antigens
  • the sequence SEQ ID NO: 21 corresponds to the following positions: 130-138 of MAGE-A2, MAGE-AS and MAGE-A12, 131-139 of MAGE-A4, 129-138 of MAGE-A9, 155-163 of MAGE- AlO, 133-141 from MAGE-AI l.
  • the peptides including this sequence correspond to the epitope IV of MAGE,
  • the fragments from 13 to 50 consecutive amino acids of the MAGE-A2 antigen preferably from 13 to 25 amino acids, comprising at least the sequence
  • FFPVIFSKA positions 146-154: SEQ ID NO: 22; the peptides including this sequence correspond to the epitope V of MAGE,
  • the fragments from 13 to 50 consecutive amino acids of the MAGE-A9 antigen preferably from 13 to 25 amino acids, comprising at least the FMQVIFGTD sequence (positions 156-164: SEQ ID NO: 23); the peptides including this sequence correspond to the VI epitope of MAGE, the fragments from 13 to 50 consecutive amino acids of the MAGE-A2 and MAGE-AlO antigens, preferably from 13 to 25 amino acids, comprising at least the sequence WEXiLX 2 SMX 3 X 4 X 5 (SEQ ID NO: 24) in wherein X represents S or A, X 2 is S or N 3 X 3 is L or M, X 4 is E or G and X 5 is V or L.
  • SEQ ID NO: 24 correspond to the following positions: 222-230 MAGE-A2 or 247 to 253 of MAGE-A10; the peptides including this sequence correspond to epitope VII of MAGE, and
  • the fragments from 13 to 50 consecutive amino acids of the MAGE-A10 antigen preferably from 13 to 25 amino acids, comprising at least the sequence IRKMSLLKF (positions 306-314: SEQ ID NO: 25); the peptides including this sequence correspond to the IX epitope of MAGE.
  • said fragment is selected from the group consisting of:
  • the RKMVELVHFLLLKYR sequence of the MAGE-A2 antigen (positions 111-125: SEQ ID NO: 27) corresponding to the epitope III
  • the RKVAELVHFLLLKYR sequence of the MAGE-A3 antigen (positions 111-125: SEQ ID NO: 28) corresponding to the epitope III
  • the RKMAELVHFLLLKYR sequence of the MAGE-A12 antigen (positions 111-125: SEQ ID NO: 29) corresponding to the epitope III; the VTKAEMLES VLR REP sequence of the MAGE-A2 antigen;
  • the KGLITKAEMLGSVIK sequence of the MAGE-AI 1 antigen (positions 130-144: SEQ ID NO: 34) corresponding to the IV epitope; the REPFTKAEMLGSVIR sequence of the MAGE-A12 antigen;
  • the variant peptide in c) is a synthetic variant obtained by the substitution of at least one of the residues P1, P6 and / or P9 by an aromatic or hydrophobic amino acid, of the residue P6. by cysteine (C), residue P9 by C, D, Q, S, T or E and / or residue P4 by another natural or synthetic amino acid.
  • Natural amino acid is defined or synthetic, the 20 ⁇ -acids naturally occurring amino commonly found in proteins (A, R, N 5 D, C, Q, E 5 G, H 5 I, L 5 K 5 M 5 F 5 P 5 S 5 T 5 W 5 Y and V) 5 some amino acids rarely encountered in proteins (hydroxyproline, hydroxylysine, methyllysine, dimethyllysine ..), amino acids that do not exist in proteins such as ⁇ -alanine , ⁇ -aminobutyric acid, homocysteine, ornithine, citrulline, canavanine, norleucine, cyclohexylalanine ..., as well as the enantiomers and diastereoisomers of the preceding amino acids.
  • hydrophobic amino acid is meant an amino acid selected from (one-letter code): A 5 V 5 L 5 1 5 P 5 W 5 F and M.
  • aromatic amino acid is meant an amino acid selected from (one-letter code): F 5 W and Y.
  • the peptide has a sequence of 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 amino acids.
  • the peptide is labeled or complexed; it may in particular be complexed with labeled HLA-DP4 molecules, for example biotinylated, to form HLA-DP4 / peptide complexes, in particular multimeric complexes such as tetramers.
  • the DP4 molecule comprises a ⁇ chain encoded by the DPB1 * 0401 allele (HLA-DP401 molecule) or DPB1 * 0402 (HLA-DP402 molecule); the ⁇ chain being encoded by the DPAl * 0103 or DPAl * 0201 allele.
  • the present invention also relates to the use of a polyepitopic fragment comprising the concatenation of at least two identical or different epitopes of which at least one is a CD4 + T epitope of an antigen
  • MAGE included in a peptide as defined above for the preparation of a vaccine intended for the prevention or treatment of a cancer associated with the expression of a MAGE 5 antigen in an individual carrying a DP4 allele , or for the preparation of a diagnostic reagent for the immune status of said individual with respect to this cancer.
  • said polyepitopic fragment has a length of 20 to 1000 amino acids, preferably 20 to 100 amino acids.
  • Said polyepitopic fragment advantageously comprises a label fused at one of its ends for the purification or detection of said fragment.
  • the tag particularly a polyhistidine sequence or an epitope B of an antigen, is preferably separated from the polyepitopic sequence by a protease cleavage site so as to isolate the polyepitopic sequence from the fusion.
  • the polyepitopic fragment comprises the concatenation of at least one CD4 + T epitope of a MAGE antigen included in a peptide as defined above and of at least one epitope selected from the group consisting of :
  • CD8 + T epitope of a MAGE antigen expressed by the tumor cells presented by an HLA I molecule and recognized by cytotoxic T lymphocytes specific for said antigens; such CD8 + T epitopes are described in particular at http: // wvv.cancerimmuestv.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm; preferably the CD8 + T epitope is chosen from MAGE-Al 96-104, MAGE-A3 168-176, MAGE-A10254-262 and MAGE-A12 170-178,
  • a natural or synthetic universal CD4 + T epitope such as the TT 830-846 tetanus toxin peptide (O'SULLIVAN et al., J. Immunol, 1991, 147, 2663-2669), the hemagglutinin peptide of the virus of influenza HA 307-319 (O'SULLIVAN et al, supra), PADRE peptide (KXVAAWTLKAA, Alexander et al., Immunity, 1994, 1, 751-761) and peptides derived from Plasmodium falciparum antigens such as CS.T3 peptide (SINIGAGLIA et al., Nature, 1988, 336, 778-780) and the CSP, SSP2, LSA-I and EXP-I peptides (DOOLAN et al., J. Immunol., 2000, 165, 1123 1137), a B epitope constituted by a sugar (ALEXANDER
  • the present invention also relates to the use of a lipopeptide comprising a peptide or a polyepitopic fragment as defined above, for the preparation of a vaccine intended for the prevention or treatment of a cancer associated with the expression of a MAGE antigen, in an individual carrying a DP4 allele, or for the preparation of a reagent for diagnosing the immune status of said individual with respect to this cancer.
  • Said lipopeptide is especially obtained by adding a lipid on an ⁇ -amino function or on a reactive function of the side chain of an amino acid of said peptide or polyepitopic fragment; it may comprise one or more chains derived from C 4-20 fatty acids, optionally branched or unsaturated (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, 2-amino hexadecanoic acid, pimelautide, trimetauxide) or a derivative thereof of a steroid.
  • the preferred lipid portion is in particular represented by a N ⁇ -acetyl-lysine N ⁇ (palmitoyl) group, also called Ac-K (Pam).
  • the present invention also relates to the use of a fusion protein consisting of a protein or a fragment of protein, fused with a peptide or a polyepitopic fragment as defined above, for the preparation of a vaccine intended for the prevention or treatment of a cancer associated with the expression of a MAGE antigen, in an individual carrying a DP4 allele, or for the preparation of a reagent for diagnosing the immune status of said individual vis-à-vis -vis of this cancer.
  • the fusion protein consists of a MAGE peptide as defined above, fused with a targeting sequence in the endosome, preferably derived from a human invariable chain II or
  • a targeting sequence in the endosome preferably derived from a human invariable chain II or
  • the LAMP-L Protein Targeting sequences in the endosome and their use for the targeting of antigens in the endosome are described in particular in Sanderson et al. (PNAS, 1995, 92: 7217-7222), Wu et al. (PNAS, 1995, 92: 11671-11675) and Thompson et al. (J. Virol., 1998, 72: 2246-2252).
  • the fusion protein consists of a MAGE peptide as defined above, fused with one of the chains of an HLA-DP4 molecule, preferably the beta chain, or with a fragment thereof corresponding to a soluble HLA-DP4 molecule, especially a fragment corresponding to the extracellular domain preceded by the homologous signal peptide or a heterologous signal peptide.
  • Said MAGE peptide is advantageously inserted between the signal peptide and the NH 2 end of the extracellular domain of the ⁇ chain, as described for the HLA-DR molecule (Kolzin et al., PNAS, 2000, 97, 291-296).
  • said MAGE peptide or said polyepitopic fragment are fused with a protein facilitating their purification or their detection, known to those skilled in the art such as in particular Glutathione-S-Transferase (GST) and fluorescent proteins (GFP and derivatives) .
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • GFP and derivatives fluorescent proteins
  • sequence of the peptide or polyepitopic fragment of interest is preferably separated from the rest of the protein by a protease cleavage site, to facilitate the purification of said peptide or said polyepitopic fragment.
  • the present invention also relates to the use of an expression vector comprising a polynucleotide encoding a peptide, a polyepitopic fragment or a fusion protein as defined above, under the control of appropriate regulatory sequences, the transcription and possibly translation for the preparation of a vaccine for the prevention or treatment of cancer associated with the expression of a MAGE antigen, in an individual carrying a DP4 allele, or for the preparation a reagent for diagnosing the immune status of said individual with respect to this cancer.
  • the sequence of said polynucleotide is that of the cDNA encoding said peptide or polyepitopic fragment or said fusion protein.
  • Said sequence may advantageously be modified in such a way that codon usage is optimal in the host in which it is expressed.
  • said polynucleotide may be linked to at least one heterologous sequence.
  • heterologous sequence is understood to mean a nucleic acid sequence coding for a MAGE antigen expressed by the tumor cells, any nucleic acid sequence other than those which, in nature, are immediately adjacent to said nucleic acid sequence encoding said MAGE antigen peptide.
  • said recombinant vector comprises an expression cassette including at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional regulatory and possibly translational sequences (promoter, activator, intron, codon of initiation (ATG), stop codon, polyadenylation signal),
  • nucleic acid molecule of interest in which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known per se; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence in extrachromosomal form, or integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
  • viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses, AAVs and baculoviruses, in which the sequence of interest has been inserted beforehand; said sequence (isolated or inserted in a plasmid vector) may also be associated with a substance enabling it to cross the membrane of the host cells, such as a transporter such as a nanotransporter or a preparation of liposomes, or of cationic polymers, or the to introduce into said host cell using physical methods such as electroporation or microinjection.
  • these methods can advantageously be combined, for example by using electroporation associated with liposomes.
  • the subject of the present invention is also a peptide as defined above, excluding the MAGE-A3 peptides 111-125, 111-126, 113-126, 113-127, 113-128, 114-126, 114 -127, 114-128, 146-160, 281-295 and MAGE-A6 121-144, 140-170, 150-165 and 219-236, as antigen for prophylactic or therapeutic vaccination, diagnosis or therapeutic follow-up. cancer associated with the expression of a MAGE antigen.
  • the present invention also relates to a polyepitopic fragment, a fusion protein, a lipopeptide or an expression vector as defined above, excluding those derived from the MAGE-A3 111-125, 111 peptides.
  • the subject of the present invention is also an immunogenic or vaccinal composition, characterized in that it comprises at least one antigen as defined above and a pharmaceutically acceptable vehicle, a carrier substance or an adjuvant.
  • the immunogenic composition according to the invention is in a galenic form suitable for parenteral (subcutaneous, intramuscular, intravenous), enteral (oral, sublingual), or local (rectal, vaginal) administration.
  • the pharmaceutically acceptable vehicles, the carrier substances and the adjuvants are those conventionally used.
  • the adjuvants are advantageously chosen from the group consisting of: oily emulsions, mineral substances, bacterial extracts, saponin, alumina hydroxide, monophosphoryl lipid A and squalene.
  • the carrier substances are advantageously selected from the group consisting of: unilamellar or multilamellar liposomes, ISCOMS, virosomes, viral pseudoparticles, saponin micelles, solid microspheres of saccharide nature (poly (lactide-co-glycolide)) or gold, and nanoparticles.
  • composition it comprises at least one MAGE peptide including a CD4 + T epitope restricted to HLA-DP4 as defined above and another MAGE peptide including a CD8 + T epitope as defined above, in the form of a mixture of peptides, a polyepitopic fragment and / or an expression vector encoding said peptides or said fragment.
  • the CD8 + T epitope is chosen from MAGE-Al 96-104, MAGE-A3 168-176, MAGE-A10 254-262 and MAGE-A12 170-178.
  • composition comprises at least two MAGE peptides including a CD4 + T epitope restricted to HLA-DP4 as defined above, and in particular one of the following combinations:
  • composition it comprises a peptide including a universal CD4 + T epitope, as defined above.
  • the peptides according to the present invention and the derived products can be used in immunotherapy in the treatment of tumors expressing a MAGE antigen.
  • Said peptides or derivatives are used either as a vaccine or in cell therapy, or even by a combination of both approaches.
  • Cellular therapy comprises, the preparation of antigen presenting cells (dendritic cells) by a conventional protocol comprising the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a patient to be treated and culturing the dendritic cells in the presence of peptide (s).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • s peptide
  • the subject of the present invention is also a reagent for diagnosing the immune status of an individual with respect to a cancer associated with the expression of a MAGE antigen, characterized in that it comprises an antigen such as as defined above.
  • said reagent comprises a peptide or a fusion protein as defined above, optionally labeled or complexed, in particular complexed with labeled HLA-DP4 molecules, for example biotinylated, in the form of multimeric complexes such as tetramers.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing the immune status of an individual with respect to a cancer associated with the expression of a MAGE antigen, characterized in that it comprises: contacting a biological sample of said individual with a peptide as defined above, and
  • said MAGE antigen is selected from the group consisting of: MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10 , MAGE-A1 1 and MAGE-Al 2.
  • the present invention also relates to a kit for detecting the immune status of an individual with respect to a cancer associated with the expression of a MAGE antigen, characterized in that it comprises at least one peptide as defined above, associated with a means for detecting antigen-specific CD4 + T cells expressed by the tumor cells.
  • the method according to the invention makes it possible to follow the evolution of the CD4 + T response directed against a MAGE antigen expressed by tumor cells during a cancer or an antitumor treatment, in particular an antitumor immunotherapy.
  • Detection is performed from a biological sample containing CD4 + T cells, including a sample of mononuclear cells isolated from a peripheral blood sample (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood sample
  • the CD4 + T lymphocytes specific for a MAGE antigen expressed by the tumor cells are detected by any means, known per se.
  • direct means such as flow cytometry in the presence of multimeric complexes as defined above, or indirect means such as lymphocyte proliferation assays and cytokine assays such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma, in particular by immunoenzymatic techniques (ELISA, RIA, ELISPOT) or by flow cytometry (intracellular cytokine assay).
  • a cell suspension (PBMC, PBMC depleted in cells
  • CD8 +, T cells previously enriched by an in vitro culture step with the peptides as defined above or cloned T lymphocytes) is cultured for 3 hours. at 5 days in the presence of said peptides and, if necessary, appropriate presenting cells, such as dendritic cells, autologous or heterologous PBMCs, lymphoblastoid cells such as those obtained after infection with EBV or genetically modified cells.
  • appropriate presenting cells such as dendritic cells, autologous or heterologous PBMCs, lymphoblastoid cells such as those obtained after infection with EBV or genetically modified cells.
  • the presence of CD4 + T cells specific for a MAGE antigen expressed by the tumor cells in the initial suspension is detected using the MAGE peptides, according to one of the following methods:
  • the proliferation of CD4 + T cells specific for a MAGE antigen expressed by the tumor cells is measured by incorporation of tritiated thymidine into the DNA of the cells.
  • the ELISPOT test makes it possible to reveal the presence of cytokine secreting T cells (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma) specific for a peptide as defined above.
  • cytokine secreting T cells IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma
  • the principle of this test is described in Czerkinsky et al., J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109-121 and Schstoff et al., J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167-174, and its implementation is illustrated in International Application WO 99/51630 or Gahéry-Ségard et al., J. Virol., 2000, 74, 1694-1703.
  • Cytokine Detection The presence of MAGE antigen-expressing T cells expressed by tumor cells, secreting cytokines such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, and IFN- ⁇ is detected, either by assaying the cytokines present in the culture supernatant, by an immunoenzymatic test, in particular using a commercial kit, or by detecting intracellular cytokines in flow cytometry.
  • the principle of detection of intracellular cytokines is described in Goulder et al. , J. Exp. Med., 2000, 192, 1819-1832 and Maecker et al., J. Immunol. Methods, 2001, 255, 27-40 and its implementation is illustrated in Draenert et al., J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19-29.
  • multimeric complexes - a biological sample, preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMC), is brought into contact with labeled multimeric complexes, in particular with a fluorochrome, formed by the binding between molecules Soluble HLA-DP4 and MAGE peptides as defined above, and
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the cells labeled with said multimeric complexes are analyzed, in particular by flow cytometry.
  • the biological sample prior to bringing the biological sample into contact with said complexes, it is enriched in CD4 + T cells, bringing it into contact with anti-CD4 antibodies.
  • HLA-DP4 / peptide multimeric complexes can be prepared from native molecules extracted from cells expressing HLA-DP4 or from recombinant molecules produced in appropriate host cells as specified, for example in NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) or in KURODA et al. (J. Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756).
  • HLA-DP4 molecules can in particular be truncated (deletion of the transmembrane domain) and their sequence can be modified in order to make them soluble or to facilitate the pairing of alpha and beta chains (Novak et al., Cited above).
  • the loading of HLA-DP4 molecules with the peptide can be done by contacting a preparation of HLA-DP4 molecules as above, with the peptide.
  • soluble and biotinylated HLA-DP4 molecules are incubated, for 72 hours at 37 ° C., with a 10-fold excess of MAGE peptides as defined above, in a 10 mM phosphate-citrate buffer, NaCl 0.15 M at a pH of between 4.5 and 7.
  • the peptide sequence can be introduced into one of the chains of the DP4 molecule in the form of a fusion protein which allows the preparation of HLA-DP4 / peptide multimeric complexes from appropriate host cells expressing the said protein. fusion. Said complexes can then be labeled, in particular with biotin.
  • the multimeric complexes of the tetramer type are obtained in particular by adding, to the charged HLA-DP4 molecules, streptavidin labeled with a fluorochrome in a quantity four times lower (mole to mole) relative to the HLA-DP4 molecules, the whole being then incubated during sufficient time, for example one night at room temperature.
  • the multimeric complexes can also be formed, either by incubation of HLA-DP4 monomers / peptides with magnetic beads coupled to streptavidin as described for the HLA I molecules (Bodinier et al., Nature, 2000, 6, 707-710), or by insertion of HLA-DP4 / peptide monomers into lipid vesicles as described for the MHC molecules of Murine class II (Prakken, Nature Medicine, 2000, 6, 1406-1410).
  • a suspension of cells (PBMC, PBMC depleted in CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with MAGE peptides as defined above or cloned T lymphocytes) with HLA-DP4 / peptide multimeric complexes at a suitable concentration (for example of the order of 10 to 20 ⁇ g / ml), for a time sufficient to allow the binding between the complexes and CD4 + T cells specific for the MAGE antigen expressed by the tumor cells (for example, of the order of 1 to 3 hours).
  • PBMC PBMC depleted in CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with MAGE peptides as defined above or cloned T lymphocytes
  • HLA-DP4 / peptide multimeric complexes at a suitable concentration (for example of the order of 10 to 20 ⁇ g / ml), for a time sufficient to allow the binding between the complexes and CD4 + T cells specific
  • Flow cytometry makes it possible to separate the cells labeled with the HLA-DP4 / peptide multimeric complexes from the unlabeled cells and thus perform cell sorting.
  • the present invention thus also relates to a method for sorting CD4 + T lymphocytes specific for a MAGE antigen expressed by the tumor cells, characterized in that it comprises at least the following steps:
  • HLA-DP4 / peptide multimeric complexes in particular by a fluorochrome, said complexes being formed by the binding of soluble HLA-DP4 molecules with at least one MAGE peptide such as as defined above, and
  • the subject of the present invention is also a peptide as defined above, excluding the peptides MAGE-A2 127-139, MAGE-A3 111-125, 111-126, 113-126, 113-127, 113- 128, 114-126, 114-127, 114-128, 127-142, 146-160,
  • the present invention furthermore relates to a polyepitopic fragment, a lipopeptide, a polynucleotide, an expression cassette, a recombinant vector and a modified prokaryotic or eukaryotic host cell derived from the preceding peptides.
  • the invention encompasses in particular: a) expression cassettes comprising at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional regulatory and possibly translational sequences (promoter, enhancer, intron, codon of initiation (ATG), stop codon, polyadenylation signal), and b) recombinant vectors comprising a polynucleotide according to the invention.
  • these vectors are expression vectors comprising at least one expression cassette as defined above.
  • polynucleotides, the recombinant vectors and the transformed cells as defined above are particularly useful for the production of the peptides, polyepitopic fragments and fusion proteins according to the invention.
  • the polynucleotides according to the invention are obtained by conventional methods, known per se, according to the standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and his Inc, Library of Congress , USA). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR, by screening genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe, or by total or partial chemical synthesis. Recombinant vectors are constructed and introduced into host cells by conventional methods of recombinant DNA and genetic engineering, which are known per se.
  • Peptides and their derivatives are prepared by standard techniques known to those skilled in the art, in particular by solid phase synthesis or liquid or by expression of a recombinant DNA in a suitable cellular system (eukaryotic or prokaryotic). More precisely,
  • the peptides and their derivatives can be synthesized in solid phase, according to the Fmoc technique, originally described by Merrifield et al. (J. Am Chem Soc., 1964, 85: 2149-) and purified by reverse phase high performance liquid chromatography,
  • the lipopeptides may especially be prepared according to the process described in International Applications WO 99/40113 or WO 99/51630.
  • peptides and derivatives such as variants, polyepitopic fragments and fusion proteins can also be produced from
  • cDNAs obtained by any means known to those skilled in the art; the cDNA is cloned into a eukaryotic or prokaryotic expression vector and the protein or fragment produced in the cells modified by the recombinant vector are purified by any appropriate means, in particular by affinity chromatography.
  • the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the object of the present invention.
  • EXAMPLE 1 BINDING ACTIVITY OF PEPTIDES OF ANTIGENS MAGE WITH RESPECT TO MOLECULES HLA-DP401 and DP402
  • the peptides were synthesized according to the Fmoc strategy in solid phase parallel synthesis, purified by HPLC and controlled by mass spectrometry (ES-MS). The selected sequences that have been synthesized are presented in Table III and the attached sequence listing.
  • HLA-DP4 binding assays encoded by the DPB1 * 0401 and DPB1 * 0402 alleles, designated DP401 and DP402, respectively, are competitive binding assays with enzyme immunoassay disclosed in PCT International Application WO 03/040299. More specifically, the peptide Oxy 271-287
  • the majority (18 out of 19) of the peptides bind with a good affinity (IC 50 ⁇ 1000 nM) to at least one of the DP4 molecules (Table III).
  • the binding activity of some of the natural variants of the MAGE-A1 peptides corresponding to the MAGE-A2, -A3, -A4, -A9, -A10, -Al1 and -A12 peptides which is comparable to that of the MAGE-A1 peptides, as illustrated by the example of the MAGE-A1 120-134 peptide variants, indicate that there is a cross-reaction between the selected MAGE peptides; some of the selected MAGE-A peptides are capable of inducing CD4 + T cells capable of recognizing peptides from another MAGE-A antigen
  • P158 DPB1 * 0402 b) Obtaining HLA-DP4 Restricted MAGE-A-specific CD4 + T-cell Lines
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • AIM V medium LIFE TECHNOLOGIES
  • flasks incubated in flasks in an oven at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • the non-adherent cells were recovered, deposited on an LS + column (MYLTENYI), and the purified CD4 + T cells were frozen.
  • Adherent cells were incubated for 5 days, in AIM V medium containing 100 ⁇ / ml of GM-CSF and 100 ⁇ / ml of IL-4, then the cells differentiated into dendritic cells were then cultured for 2 days, in the presence 1 ⁇ g / ml of LPS, 1000 U / ml of IL-4 and 1000 U / ml of GM-CSF, so as to induce their maturation.
  • the mature dendritic cells (100,000 cells / well) were then incubated with a mixture of peptides (10 ⁇ g of each peptide) for 4 hours at 37 ° C.
  • the mature dendritic cells were then washed and incubated, in the presence of CD4 + T lymphocytes (100,000 cells / well) previously thawed, in medium containing 1000 U / ml of IL-6 and 10 ng / ml of IL-12. . After 7 days, the culture was restimulated once, using mature dendritic cells previously thawed and loaded with the peptide mixture, in medium containing IL-2 (10 U / ml) and IL-7 (5 ng / ml). After two additional stimulations, under the above conditions, the cells were tested in ELISPOT. c) Analysis of the specificity of ELISPOT lines
  • the T lymphocytes were tested in the presence of HLA-DP4 positive cells, namely an L-line of fibroblasts transfected with the cDNA coding for a DP402 molecule.
  • anti-IFN-gamma antibodies (1-D1K, MABTECH) diluted to 1 ⁇ g / ml in PBS buffer were adsorbed on nitrocellulose (MILLIPORE) plates for 1 hour at 37 ° C. The plates were then washed with PBS and then saturated with ISCOVE medium containing 10% human serum of the AB group (100 ⁇ l / well), for 2 h at 37 ° C.
  • ISCOVE medium 10% human serum of the AB group (100 ⁇ l / well)
  • DP4 positive cells 10,000 cells / well
  • test lymphocytes were then added to the plates and incubated for 24 h at 37 ° C., in the presence or in the absence of a single peptide or a mixture of peptides.
  • Enzyme immunoenzymation was stopped after about 10 minutes, by extensive rinsing of the plates in water, and the colored spots were counted using a PLC (AID).
  • the lines are considered positive when the number of spots is greater than three times that obtained with the negative control (control without peptides) with a minimum of 50 spots.
  • the control without presenting cells makes it possible to check the specificity of the response for HLA-DP4 (restriction control). 2) Results
  • DP4 were highlighted; these lines are stimulated by the peptide mixture (mix) presented by HLA-DP4 but not in the absence of the mixture (negative control) or HLA-DP4 (restriction control, Table V).
  • Each line responds to at least one of the peptides of the mixture.
  • the peptide MAGE-Al (MAGE-I) is very immunogenic since it induces 26 lines out of 28.
  • the peptide MAGE-A12 127-141 induces 3 lines
  • the peptide MAGE-A2 111-125 induces a line
  • the other four peptides do not induce lineage.
  • MAGE-Al 268-282, MAGE-A9 68-82 and 153-167 peptides are also immunogenic since they induce, respectively, four, two and one of the eight lines tested.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

La présente Invention est relative à des épitopes T CD4+ dérivés d'un antigène MAGE-A1 qui sont restreints à HLA-DP4, et à leurs applications vaccinales et diagnostiques.

Description

EPITOPES T CD4+ DES ANTIGENES MAGE-A RESTREINTS A HLA-DP4 ET LEURS APPLICATIONS
La présente Invention est relative à des épitopes T CD4+ des antigènes MAGE spécifiques de tumeurs, restreints à HLA-DP4, et à leurs applica- tions vaccinales et diagnostiques.
Les cellules tumorales expriment des antigènes qui sont reconnus par les lymphocytes T CD4+ et CD8+ et qui sont spécifiques des tumeurs (pour une revue voir Kirkin et al., Cancer Investigation, 2002, 20, 222-236). Ces antigènes spécifiques de tumeurs, dénommés antigènes CT (Cancer Testis) sont également exprimés dans certains tissus sains (testicules, placenta, ovaires) mais ne sont pas reconnus par les lymphocytes T du fait que ces tissus sont dépourvus de molécules HLA conventionnelles. Les antigènes MAGE-A, MAGE-B et MAGE-C qui sont exprimés dans de nombreuses tumeurs, représentent des cibles particulièrement intéressantes pour la vaccination anti-tumorale. Ces antigènes appartiennent à la superfamille des antigènes MAGE qui inclut également des antigènes ubiquitaires (MAGE-D) ou exprimés spécifiquement dans le cerveau (necdine, MAGEL2). Les antigènes MAGE comprennent 3 domaines (dl, d2 et d3) ; les domaines d2 présentent une forte homologie (> 60 %) alors qu'une homologie plus faible est observée pour certains des domaines dl, notamment ceux des antigènes MAGE spécifiques de tumeurs et en particulier ceux des antigènes MAGE-A et MAGE-B. Les antigènes MAGE-A sont les plus connus et les plus documentés. Ils regroupent 12 antigènes différents, l'antigène MAGE-Al (ou MAGE-I) étant le premier antigène tumoral identifié. L'expression de MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE- A4, MAGE- A6, MAGE-A12 est retrouvée dans de nombreuses tumeurs alors que celle de MAGE- A5, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-AlO, MAGE-AI l n'est retrouvée que dans quelques-unes et celle de MAGE-A7 n'a jamais été détectée. Hormis pour les cellules leucémiques, les lymphomes et les carcinomes du rein, les antigènes MAGE-Al et MAGE-A3 sont retrouvés dans 15 à 50 % des cancers tels que les mélanomes, les sarcomes et les cancers du poumon, du sein, de l'estomac et de la prostate ; l'antigène MAGE-Al à lui seul est notamment exprimé dans 80 % des tumeurs hépatiques. L'antigène M AGE- A4 a un profil d'expression différent des autres antigènes MAGE- A et est fréquemment exprimé dans les lymphomes. II a été montré que les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle essentiel dans le contrôle des tumeurs. En effet, l'induction de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) est dépendante de l'activation des lymphocytes T CD4+ qui interviennent en particulier dans le recrutement et le maintien des CTL. Ainsi, l'immunisation avec des épitopes T CD8+ seuls, induit des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l'antigène tumoral, avec une fréquence très faible (de l'ordre de 10" à 10~7 des cellules CD8+ ; Zhang et al., Eur. J. Immunol., 2005, 35 :). Par l'intermédiaire de contacts cellulaires et la sécrétion de nombreuses cytokines, les lymphocytes T CD4+ induisent l'activation des cellules présentatrices d'antigène (APC pour Antigen Presenting CeII) qui à leur tour recrutent des lymphocytes T CD8+ spécifiques des tumeurs. Ils interviennent également dans la maturation des cellules effectrices que sont les lymphocytes T cytotoxiques. En outre, les résultats observés chez des souris n'exprimant pas de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I, indiquent également que les lymphocytes T CD4+ exercent un contrôle des tumeurs via des mécanismes indépendants des CTL probablement via l'activation de macrophages. Enfin, les lymphocytes T CD4+ peuvent être eux-mêmes cytotoxiques.
Les lymphocytes T CD4+ reconnaissent les peptides de tumeurs que leur présentent les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II; chez l'homme, elles sont dénommées molécules HLA II pour Human Leucocyte Antigen class II. La reconnaissance peut avoir lieu de manière directe (c'est à dire que la tumeur présente elle-même ces peptides aux lymphocytes T) mais il est vraisemblable que la voie principale d'activation se fasse par l'intermédiaire des cellules dendritiques. Ces cellules sont en effet les principales cellules présentatrices de l'antigène aptes à recruter in vivo les lymphocytes T naïfs. Ces peptides anti- géniques, appelés épitopes T, résultent de la dégradation protéolytique des antigènes par les cellules présentatrices d'antigène. Us ont des longueurs variables, généralement de 13 à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA IL II est bien connu qu'au même titre que l'antigène natif, un peptide comprenant un épitope T CD4+ est capable de stimuler in vitro des cellules T CD4+ qui lui sont spécifiques ou de les recruter in vivo. Il est donc suffisant pour induire une réponse T CD4+. Ces observations sont en faveur de l'utilisation de tels peptides antigéniques spécifiques des antigènes MAGE exprimés par les cellules tumorales comme les antigènes MAGE-A, MAGE-B ou MAGE-C, et capables de stimuler une forte réponse T CD4+, pour la préparation d'une composition vaccinale anti-tumorale chez l'Homme, notamment en association avec des épitopes T CD 8+ spécifiques de ces antigènes MAGE spécifiques de tumeurs.
En outre, de tels peptides qui sont reconnus par des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'antigènes tumoraux sont également utiles comme réactifs dans un test de diagnostic ou de suivi du traitement d'un cancer chez l'Homme, reposant sur la détection desdites cellules T CD4+, soit de manière directe, notamment par cytométrie de flux en présence de multimères de complexes molécules de classe II/peptide, soit de manière indirecte, notamment par un test de prolifération lymphocytaire, ou bien un dosage d'anticorps ou de cytokines.
Toutefois, alors que de nombreuses séquences d'épitopes T CD8+ aptes à être présentés par des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I, chez l'homme (molécules HLA I ou Human Leucocyte Antigen type I), ont été identifiées dans les antigènes MAGE (Brevet US 6,063,900 ; Demande PCT WO 2004/052917 ; http://www.cancerimmunitv.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm, le nombre d'épitopes T CD4+ connu est plus restreint. Un des problèmes majeurs qui limite l'utilisation de ces peptides comme antigène est l'identification des épitopes T CD4+, étant donné que leur séquence varie d'un individu à l'autre en raison du polymorphisme des molécules HLA IL En effet, lès molécules HLA II sont des hétérodimères constitués d'une chaîne alpha (α) et d'une chaîne béta (β) polymorphes. Il existe quatre types de molécules HLA II par individu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP), dénommées en fonction de l'allèle codant la chaîne béta qui est la plus polymorphe. La molécule HLA-DR est très polymorphe. En effet, alors que sa chaîne alpha ne compte que 3 allèles, la chaîne béta (β) codée par le gène DRBl, qui est la plus exprimée, compte à ce jour 458 allèles. Pour les molécules HLA-DQ et HLA-DP, les deux chaînes (α et β) qui les constituent sont polymorphes mais elles présentent moins d'allèles. On a dénombré 28 allèles DQAl (chaîne α de HLA-DQ), 60 allèles DQBl (chaîne β de HLA-DQ), 22 allèles DPAl (chaîne α de HLA-DP) et 116 allèles DPBl (chaîne β de HLA-DP). Cependant, la combinaison entre les deux chaînes α et β codées par ces allèles donne naissance à de nombreuses molécules HLA-DQ et HLA-DP.
Du fait de ce polymorphisme, ces isoformes possèdent des propriétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent lier des peptides différents d'un même antigène. Ainsi, le mode de liaison des peptides aux molécules HLA II est plus complexe que celui des molécules HLA I et il n'existe pas de programmes fiables de prédiction des peptides capables de se lier aux molécules HLA II. En effet, les molécules HLA possèdent une structure tridimensionnelle très proche mais le site de fixation des molécules HLA II est une gorge ouverte aux deux extré- mités. Pour cette raison, les peptides restreints aux molécules HLA II acceptent des peptides de taille variable, généralement comprise entre 13 et 25 acides aminés. Cette gorge est caractérisée par cinq poches de spécificité (Pl, P4, P 6, P7 et P9 correspondant aux positions des résidus du peptide qu'elles accommodent) qui abritent des résidus polymorphes. Comme les différences de séquences entre les différentes molécules HLA II sont essentiellement localisées dans les poches du site de fixation des peptides, elles interviennent directement dans le répertoire de peptides qui se lient à chaque molécule.
Ainsi, chaque individu reconnaît dans un antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II qui le caractérisent. Comme il existe un grand nombre d'allèles HLA II, il existe donc dans une séquence donnée un répertoire important d'épitopes T de séquences très différentes, chacun spécifique d'un allèle différent. Un peptide capable de stimuler une réponse T CD4+ spécifique d'un antigène tumoral chez quelques individus peut donc être inactif chez la majorité des autres individus, parce que ces derniers ne reconnaissent pas l'antigène tumoral par les mêmes épitopes.
La plupart des épitopes T CD4+ des antigènes MAGE sont restreints à une molécule HLA DR et sont issus de l'antigène MAGE-A3 [http://www.cancerimmunitv.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm; MAGE-A3 267- 282 restreint à DRl (Demande Internationale PCT WO 02/095051) ; MAGE- A3 149- 160 restreint à DR4 et DR7 (Kobayashi et al., Cancer Research, 2001, 61, 4773- 4778) ; MAGE-A3 191-205 et 281-295 restreints à DRI l (Consogno et al., Blood, 2003, 101, 1038-1044 ; Manici et al., J. Exp. Med., 1999, 189, 871-876) et MAGE- A3 121-134 restreint à DR13 (Brevet US 6,716,809) ; MAGE-Al 281-292 restreint à DR15 (Demande Internationale PCT WO 00/78806) ; MAGE-A6 102-116, 121-144, 140-170, 145-160, 150-165 et 246-263 restreints à DR4 (Tatsumi et al., Clinical Cancer Research, 2003, 9, 947-954) MAGE-Al 281-292 restreint à DRl 5 (Demande Internationale PCT WO 00/78806) ; MAGE-A6 102-1 16, 121-144, 140-170, 145- 160, 150-165 et 246-263 restreints à DR4 (Tatsumi et al., Clinical Cancer Research, 2003, 9, 947-954)].
Toutefois, pour les molécules HLA-DR, une dizaine d'allèles sont nécessaires pour couvrir plus de 60 % de la fréquence génique retrouvée dans la population caucasienne et donc concerner plus de 85 % de cette population. Ainsi, un peptide portant un épitope restreint à HLA-DR n'est généralement pas reconnu par l'ensemble des molécules HLA-DR prépondérantes dans la population. En conséquence, chaque peptide portant un épitope restreint à HLA-DR doit être testé vis-à-vis d'une dizaine de molécules HLA-DR afin de sélectionner les peptides reconnus par la majorité de ces molécules, et il est généralement nécessaire d'utiliser un mélange d'au moins deux ou trois peptides différents pour obtenir un vaccin efficace chez la majorité des individus de la population à vacciner.
Deux molécules HLA-DP4 (DP401 et DP402) qui ne présentent que 3 acides aminés de différence possèdent la particularité d'être très fréquentes, notamment dans la population caucasienne. Ces deux molécules DP4 couvrent à elles seules la majorité de la fréquence allélique d 'HLA-DP dans la population caucasienne (de l'ordre de 50 % en Europe et 80 % en Amérique du Nord) et sont également présentes à des fréquences non négligeables dans les autres populations (fréquence allélique de l'ordre de 60 % en Amérique du Sud, 60 % en Inde, 25 % en Afrique et 15 % au Japon). Chacune de ces molécules DP4 comprend une chaîne alpha codée, soit par l'allèle DPA1*O1O3 qui est le plus fréquent (78,2 %), soit par l'allèle DPAl *0201 (20,2 %) et une chaîne béta codée par l'allèle DPBl*0401 (molécule HLA-DP401) ou DPBl*0402 (molécule HLA-DP402). Les molécules HLA-DP4 sont parfaitement aptes à présenter des peptides aux lymphocytes T dans la mesure où de nombreux clones T ont été isolés à partir d'antigènes très variés tels que la toxine tétanique, le virus de l'hépatite B et l'allergène majeur de Dermatophagoïdes pteronissimus. Toutefois, un seul épitope T CD4+ restreint à HLA-DP (HLA-DP4) et HLA-DQ (HLA-DQ6) a été identifié, uniquement dans l'antigène MAGE-A3
(MAGE-A3 243-258 ; Brevet US 6,716,809 ; Schultz et al., J. Immunol., 2004,
172 : 1304-1310), indiquant que ces deux molécules HLA II ne seraient apparemment que faiblement utilisées pour la reconnaissance des tumeurs.
Les inventeurs ont identifié d'autres épitopes T CD4+ restreints à HLA-DP4, dans l'antigène MAGE-Al ; ces épitopes qui sont différents de l'épitope connu de l'antigène MAGE-A3 sont également présents dans d'autres antigènes MAGE spécifiques de tumeur, notamment dans les antigènes MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-AI l et MAGE-A12. En outre, ces peptides qui sont aptes à être présentés par une molécule HLA-DP4 et à induire des lymphocytes T CD4+ spécifiques chez des individus naïfs, sont susceptibles d'induire, à eux seuls, une réponse T CD4+ spécifique d'antigène(s) MAGE exprimé(s) par des cellules tumorales, chez la majorité des individus vaccinés. La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'un peptide dérivé de l'antigène MAGE-Al comprenant un épitope T CD4+ apte à être présenté par une molécule HLA-DP4 et à induire des lymphocytes T spécifiques d'au moins un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, lequel peptide étant sélectionné dans le groupe constitué par : a) les peptides de 15 à 50 acides aminés consécutifs de l'antigène
MAGE-Al, de préférence de 15 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence située entre les positions suivantes :
- positions 68-76 (SEQ ID NO :1) ; ces fragments comprennent l'épitope I de MAGE, - positions 93-101 (SEQ ID NO :2 ) ; ces fragments comprennent l'épitope II de MAGE,
- positions 107-115 (SEQ ID NO :3) ; ces fragments comprennent l'épitope III de MAGE,
- positions 123-131 (SEQ ID NO :4) ; ces fragments comprennent l'épitope IV de MAGE,
- positions 139-147 (SEQ ID NO :5) ; ces fragments comprennent l'épitope V de MAGE, - positions 150-158 (SEQ ID NO :6) ; ces fragments comprennent l'épitope VI de MAGE,
- positions 215-223 (SEQ ID NO :7) ; ces fragments comprennent l'épitope VII de MAGE, - positions 271-279 (SEQ ID NO :8) ; ces fragments comprennent l'épitope VIII de MAGE,
- positions 274-282 (SEQ ID NO :9) ; ces fragments comprennent l'épitope IX de MAGE, b) les fragments des peptides définis en a), de 13 ou 14 acides aminés, comprenant au moins la séquence située entre les positions 93 à 101, 68 à 76, 107 à
115, 123 à 131, 139 à 147, 150 à 158 et 215 à 223, à l'exclusion du peptide MAGE-
Al 68-81, et c) les variants des peptides définis en a) de 13 à 50 acides aminés, de préférence de 13 à 25 acides aminés, et les variants des fragments en b) de 13 ou 14 acides aminés, qui présentent une activité de liaison à une molécule HLA-DP4 inférieure ou égale à 1000 nM et sont capables d'induire des lymphocytes T CD4+ reconnaissant l'un des épitopes MAGE défini en a) ou en b), pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
On entend par individu porteur d'un allèle DP4, un individu porteur d'un allèle codant pour la chaîne béta d'une molécule DP4, de préférence l' allèle
DPBl*0401 ou DPBl*0402. Les peptides selon l'invention présentent les propriétés suivantes :
- activité de liaison à HLA-DP4 : les peptides selon l'invention possèdent une forte affinité pour HLA-DP4 (activité de liaison < 1000 nM) ; l'activité de liaison peut-être mesurée par un test de liaison HLA-DP4/peptide, en compétition, avec une révélation immuno-enzyrnatique, selon le principe décrit dans la Demande Internationale PCT WO 03/040299,
- immunogénicité : les peptides selon l'invention sont reconnus par des lymphocytes T CD4+ chez la majorité des individus du fait de la prépondérance de la molécule HLA-DP4 dans la population caucasienne mais aussi dans les populations d'Amérique du Sud et d'Inde, et dans une moindre mesure, dans celles d'Afrique et du Japon. Ces peptides sont également capables d'induire des cellules T CD4+ spécifîques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales à partir des précurseurs présents chez la majorité des individus naïfs ou bien de stimuler de telles cellules chez la majorité des individus atteints d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE. En outre, les lymphocytes T CD4+ induits par ces peptides reconnaissent l'épitope de l'antigène natif naturellement présenté par les cellules dendritiques. En conséquence, de tels peptides représentent des candidats potentiels pour la vaccination prophylactique ou thérapeutique contre les cancers associés à l'expression d'un antigène MAGE, particulièrement intéressants du fait qu'ils peuvent induire une réponse T CD4+ spécifique d'un antigène MAGE chez la majorité des individus de la population. En outre, les peptides dont la séquence est conservée dans les différents antigènes MAGE ou qui présentent une réaction croisée avec des épitopes T CD4+ présents dans d'autres antigènes MAGE sont capables d'induire une réponse T CD4+ vis-à-vis de plusieurs antigènes MAGE exprimés par les cellules tumorales. L'immunogénicité des peptides peut être déterminée, notamment à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs), par tout essai approprié connu de l'Homme du métier comme par exemple : un test de prolifération cellulaire, un test ELISPOT (dosage des cellules productrices de cytokines) ou un test de dosage des cytokines intracellulaires (IFN-γ, IL-2, IL-4 et IL-IO).
La séquence de l'antigène MAGE-Al est disponible dans les bases de données et correspond au numéro d'accès SWISSPROT P43355.
Les peptides selon l'invention comprennent un épitope T CD4+ constitué par une séquence de 9 à 12 acides aminés telle que définie ci-dessus, flanquée à l'une de ses extrémités, de préférence aux deux extrémités, par au moins 2 acides aminés, de préférence 3 acides aminés. La séquence de 9 à 12 acides aminés, généralement de 9 acides aminés, inclut les résidus Pl, P4, P6 et P9, d'ancrage à une molécule HLA-DP4 et les résidus en position I5 4, 6 et 9 de ladite séquence corres- pondent respectivement aux résidus Pl, P4, P6 et P9. Par exemple, dans les peptides comprenant l'épitope II qui inclut la séquence ILESLFRAV (SEQ ID NO : 2), les résidu d'ancrage sont 1(Pl), S(P4), F(P6) et V(P9). L'invention englobe également les variants naturels ou synthétiques obtenus à partir des séquences précédentes, par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du peptide, dès lors que ledit variant conserve une forte affinité pour HLA-DP4 (activité de liaison < 1000 nM) et est immunogène.
Les variants naturels correspondent aux peptides homologues issus d'autres antigènes MAGE exprimés par les cellules tumorales et en particulier des antigènes MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE- A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-AI l et MAGE-A 12. Les séquences des autres antigènes MAGE sont disponibles dans les banques de données ; les numéros d'accès des autres antigènes MAGE-A humains dans la base SWISSPROT, sont les suivants : MAGE-A2 : P43356; MAGE-A3 : P43357 ; MAGE-A4 : P43358 ; MAGE-A5 : P43359 ; MAGE- A6 : P43360; MAGE-A8 : P43361 ; MAGE-A9 : P43362 ; MAGE-AlO : P43363 ; MAGE-AI l : P43364 ; MAGE-A12 : P43365. La séquence de ces variants peut être déduite aisément après alignement optimal des séquences des antigènes MAGE exprimés par les cellules tumorales, à l'aide d'un logiciel approprié connu de l'Homme du métier comme CLUSTAL W (Thompson et al., 1994, N.A.R, 22:4673- 4680).
En outre, d'autres variants peuvent être aisément construits étant donné que les résidus d'acides aminés impliqués dans la liaison à HLA-DP4 (résidus d'ancrage Pl, P4, P6 et P9) et l'effet des modifications de ces résidus sur la liaison à HLA-DP4 sont connus de l'Homme du métier ; la Demande Internationale PCT WO 03/040299 enseigne notamment que le résidu en P6 doit être aromatique ou hydro- phobe ou consister en un résidu de cystéine (C), et au moins l'un des résidus Pl, P9 est tel que Pl est aromatique ou hydrophobe et/ou P9 est aromatique ou hydrophobe ou consiste en un résidu C, D, Q, S, T ou E, alors que le résidu en P4 peut être n'importe quel résidu d'acide aminé.
L'invention englobe également les peptides modifiés dérivés des précédents par introduction de toute modification au niveau de résidu(s) d'acide aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités des peptides, dès lors que ledit peptide modifié conserve une forte affinité pour HLA-DP4 (activité de liaison < 1000 nM) et est immunogène. Ces modifications qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l'Homme du métier, incluent de façon non-limitative : la substitution d'un acide aminé par un acide aminé non-protéinogénique (acide aminé D ou analogue d'acide aminé) ; l'addition de groupement chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d'une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (-CO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion d'un peptide (épitope d'intérêt pour la vaccination ; étiquette utile pour la purification du peptide, notamment sous forme clivable par une protéase) ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d'une protéine, notamment une chaîne α ou β d'une molécule HLA-DP4 ou le domaine extracellulaire de ladite chaîne ou bien encore une séquence de ciblage dans l'endosome dérivée notamment de la chaîne invariable Ii ou de la protéine LAMP-I ; le couplage à une molécule appropriée, notamment un marqueur, par exemple un fluorochrome. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité et plus particulièrement la résistance à la protéolyse, ainsi que la solubilité, Pimmunogénicité ou à faciliter la purification ou la détection, soit du peptide selon l'invention, soit de cellules CD4+ spécifiques dudit peptide.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, le peptide défini en a) est un peptide de l'antigène MAGE-Al sélectionné dans le groupe constitué par : SCILESLFRAVITK (positions 90-104 ; SEQ ID NO :10 ; épitope II) ; PRALAETSYVKVLEY (positions 268-282 : SEQ ID NO :11 ; épitope VIII) ; PTTINFTRQRQPNEG (positions 65-79 : SEQ ID NO :12 ; épitope I) ; KKVADLVGFLLLKYR (positions 104-118 : SEQ ID NO :13 ; épitope III), REPVTKAEMLESVIK (positions 120-134 : SEQ ID NO :14 ; épitope IV), YKHCFPEIFGKASES (positions 136-150 : SEQ ID NO :15 ; épitope V), ASESLQLVFGIDVKE (positions 147-161 : SEQ ID NO : 16 ; épitope VI) ; EEIWEEIS VME VYDG (positions 212-226 : SEQ ID NO :17, épitope VII) et LAETSYVKVLEYVIK (positions 271-285 : SEQ ID NO : 18 ; épitope IX).
De préférence, ledit peptide est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 10, 11, 13, 14 et 17.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, le peptide variant en c) est un fragment d'un autre antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, dont la séquence est homologue à celle du peptide en a) ou du fragment en b), de préférence ledit fragment homologue est issu d'un antigène MAGE-A sélectionné parmi : MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE- A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-AlO, MAGE-Al 1 et MAGE-A12. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide variant est sélectionné dans le groupe constitué par :
- les fragments de 13 à 50 acides aminés consécutifs de l'antigène MAGE-A9, de préférence de 13 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence VYYTLWSQF (positions 71-79 : SEQ ID NO : 19) ; les peptides incluant cette séquence correspondent à l'épitope I de MAGE ,
- les fragments de 13 à 50 acides aminés consécutifs des antigènes MAGE-A2, MAGE-A3 ou MAGE-Al 2, de préférence de - 13 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence A/VELVHFLLL (positions 114-122 : SEQ ID NO :20) ; les peptides incluant cette séquence correspondent à l'épitope III de MAGE, - les fragments de 13 à 50 acides aminés consécutifs des antigènes
MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE- A4, MAGE-A9, MAGE-AlO, MAGE-AI l ou MAGE-A 12, de préférence de 13 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence X1TKAEX2LX3X4 dans laquelle X1 représente F, V ou I ; X2 représente M ou I ; X3 représente G ou E et X4 représente S ou R (SEQ ID NO :21). La séquence SEQ ID NO : 21 correspond aux positions suivantes : 130-138 de MAGE-A2, MAGE- AS et MAGE-A12, 131-139 de MAGE-A4, 129-138 de MAGE-A9, 155-163 de MAGE-AlO, 133-141 de MAGE-AI l. Les peptides incluant cette séquence correspondent à l'épitope IV de MAGE,
- les fragment de 13 à 50 acides aminés consécutifs de l'antigène MAGE-A2, de préférence de 13 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence
FFPVIFSKA (positions 146-154 : SEQ ID NO :22) ; les peptides incluant cette séquence correspondent à l'épitope V de MAGE,
- les fragments de 13 à 50 acides aminés consécutifs de l'antigène MAGE-A9, de préférence de 13 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence FMQVIFGTD (positions 156-164 : SEQ ID NO :23) ; les peptides incluant cette séquence correspondent à l'épitope VI de MAGE, - les fragments de 13 à 50 acides aminés consécutifs des antigènes MAGE-A2 et MAGE-AlO, de préférence de 13 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence WEXiLX2SMX3X4X5 (SEQ ID NO :24) dans laquelle Xi représente E ou A, X2 représente S ou N3 X3 représente L ou M, X4 représente E ou G et X5 représente V ou L. La séquence SEQ ID NO :24 correspond aux positions suivantes : 222 à 230 de MAGE-A2 ou 247 à 253 de MAGE-A10 ; les peptides incluant cette séquence correspondent à l'épitope VII de MAGE, et
- les fragments de 13 à 50 acides aminés consécutifs de l'antigène MAGE-A10, de préférence de 13 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence IRKMSLLKF (positions 306-314 : SEQ ID NO :25) ; les peptides incluant cette séquence correspondent à l'épitope IX de MAGE.
Les positions sont indiquées relativement à la séquence de chacun des différents antigènes MAGE-A, comme précisé dans le Tableau ci-après : Tableau I : Position des épitopes I à IX dans la séquence des antigènes MAGE
Figure imgf000013_0001
* les positions sont celles des résidus d'ancrage Pl et P9 sauf pour le séquences de
12 acides aminés (°)
De préférence, ledit fragment est sélectionné dans le groupe constitué par :
- la séquence SISVYYTLWSQFDEG de l'antigène MAGE-A9 (positions 68-82 ; SEQ ID NO :26) correspondant à l'épitope I,
- la séquence RKMVELVHFLLLKYR de l'antigène MAGE-A2 (positions 111-125 : SEQ ID NO :27) correspondant à l'épitope III, - la séquence RKVAELVHFLLLKYR de l'antigène MAGE-A3 (positions 111-125 : SEQ ID NO :28) correspondant à l'épitope III,
- la séquence RKMAELVHFLLLKYR de l'antigène MAGE-A12, (positions 111-125 : SEQ ID NO :29) correspondant à l'épitope III, - la séquence REP VTKAEMLES VLR de l'antigène MAGE-A2
(positions 127-141 : SEQ ID NO :30) correspondant à l'épitope IV,
- - la séquence KELVTKAEMLERVIK de l'antigène MAGE-A4 (positions 128-142 : SEQ ID NO :31) correspondant à l'épitope IV5
- la séquence KEPVTKAEMLESVIK de l'antigène MAGE-A9 (positions 126-140 : SEQ ID NO :32) correspondant à l'épitope IV,
- - la séquence KEPITKAEILESVIK de l'antigène MAGE-AlO (positions 152-166 : SEQ ID NO :33) correspondant à l'épitope IV,
- la séquence KGLITKAEMLGSVIK de l'antigène MAGE-AI l (positions 130-144 : SEQ ID NO :34) correspondant à l'épitope IV, - la séquence REPFTKAEMLGSVIR de l'antigène MAGE-A12
(positions 127-141 : SEQ ID NO :35) correspondant à l'épitope IV,
- la séquence CQDFFPVIF SKASEY de l'antigène MAGE-A2 (positions 143-157 : SEQ ID NO :36) correspondant à l'épitope V,
- la séquence ASEFMQVIFGTDVKE de l'antigène MAGE-A9 (positions 153-167 : SEQ ID NO :37) correspondant à l'épitope VI,
- la séquence EKIWEELSMLEVFEG de l'antigène MAGE-A2 (positions 219-233 : SEQ ID NO :38) correspondant à l'épitope VII,
- la séquence EVIWEALNMMGLYDG de l'antigène MAGE-AlO (positions 244-258 ; SEQ ID NO :39) correspondant à l'épitope VII, et - la séquence HAEIRKMSLLKFLAK de l'antigène MAGE-AlO
(positions 303-317 : SEQ ID NO :40) correspondant à l'épitope IX.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, le peptide variant en c) est un variant synthétique obtenu par la substitution d'au moins un des résidus Pl, P6 et/ou P9 par un acide aminé aromatique ou hydrophobe, du résidu P6 par une cystéine (C), du résidu P9 par C, D, Q, S, T ou E et/ou du résidu P4 par un autre acide aminé naturel ou synthétique. On entend par acide aminé naturel ou synthétique, les 20 α-acides aminés naturels communément trouvés dans les protéines (A, R, N5 D, C, Q, E5 G, H5 I, L5 K5 M5 F5 P5 S5 T5 W5 Y et V)5 certains acides aminés rarement rencontrés dans les protéines (hydroxyproline, hydroxylysine, méthyllysine, diméthyllysine..), les acides aminés qui n'existent pas dans les protéines tels que la β-alanine, l'acide γ-amino- butyrique, l'homocystéine, l'ornithine, la citrulline, la canavanine, la norleucine, la cyclohexylalanine..., ainsi que les énantiomères et les diastéréoisomères des acides aminés précédents.
On entend par acide aminé hydrophobe, un acide aminé sélectionné parmi (code à une lettre) : A5 V5 L5 15 P5 W5 F et M.
On entend par acide aminé aromatique, un acide aminé sélectionné parmi (code à une lettre) : F5 W et Y.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, le peptide présente une séquence de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 acides aminés.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, le peptide est marqué ou complexé ; il peut être notamment complexé à des molécules HLA-DP4 marquées, par exemple biotinylées, pour former des complexes HLA- DP4/peptides, en particulier des complexes multimériques comme des tétramères. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, la molécule DP4 comprend une chaîne β codée par l'allèle DPBl*0401 (molécule HLA-DP401) ou DPBl *0402 (molécule HLA-DP402) ; la chaîne α étant codée par l'allèle DPAl*0103 ou DPAl*0201.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un fragment polyépitopique comprenant la concaténation d'au moins deux épitopes identiques ou différents dont l'un au moins est un épitope T CD4+ d'un antigène
MAGE inclus dans un peptide tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE5 chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
De préférence, ledit fragment polyépitopique présente une longueur de 20 à 1000 acides aminés, de préférence de 20 à 100 acides aminés. Ledit fragment polyépitopique comprend avantageusement une étiquette fusionnée à l'une de ses extrémités, pour la purification ou la détection dudit fragment. L'étiquette, notamment une séquence polyhistidine ou un épitope B d'un antigène, est de préférence séparée de la séquence polyépitopique par un site de clivage d'une protéase de façon à isoler la séquence polyépitopique, à partir de la fusion.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, le fragment polyépitopique comprend la concaténation d'au moins un épitope T CD4+ d'un antigène MAGE inclus dans un peptide tel que défini ci-dessus et d'au moins un épitope sélectionné dans le groupe constitué par :
- un épitope T CD8+ d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, présenté par une molécules HLA I et reconnu par des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques desdits antigènes ; de tels épitopes T CD8+ sont notamment décrits sur le site http://wλvw.cancerimmυnitv.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm; de préférence l'épitope T CD8+ est choisi parmi MAGE-Al 96-104, MAGE-A3 168- 176, MAGE-A10254-262 et MAGE-A12 170-178,
- un épitope T CD4+ universel naturel ou synthétique tel que le peptide de la toxine tétanique TT 830-846 (O'SULLIVAN et al., J. ImmunoL, 1991, 147, 2663-2669), le peptide de l'hémagglutinine du virus de la grippe HA 307-319 (O'SULLIVAN et al, précité), le peptide PADRE (KXVAAWTLKAA; Alexander et al., Immunity, 1994, 1, 751-761) et des peptides issus des antigènes de Plasmodium falciparum tels que le peptide CS.T3 (SINIGAGLIA et al., Nature, 1988, 336, 778- 780) et les peptides CSP, SSP2, LSA-I et EXP-I (DOOLAN et al., J. Immunol., 2000, 165, 1123-1137), - un épitope B constitué par un sucre (ALEXANDER et al., précité), ledit épitope B étant de préférence sous la forme d'un glycopeptide, et
- un épitope B d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales reconnu spécifiquement par des anticorps dirigés contre ledit antigène tumoral. La combinaison de l'épitope T CD4+ avec l'un au moins des épitopes tels que définis ci-dessus permet avantageusement de déclencher ou de moduler une réponse immunitaire anti-tumorale. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un lipopeptide comprenant un peptide ou un fragment polyépitopique tels que définis ci- dessus, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
Ledit lipopeptide est notamment obtenu par addition d'un lipide sur une fonction α-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé dudit peptide ou fragment polyépitopique ; il peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexa- décanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d'un stéroïde. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe Nα-acétyl-lysine Nε(palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam). La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine de fusion constituée par une protéine ou un fragment de protéine, fusionnés avec un peptide ou un fragment polyépitopique tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
Le peptide ou le fragment polyépitopique peuvent être fusionnés avec l'extrémité NH2 ou COOH de ladite protéine ou insérés dans la séquence de ladite protéine. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, la protéine de fusion est constituée par un peptide MAGE tel que défini ci-dessus, fusionné avec une séquence de ciblage dans l'endosome, dérivée de préférence d'une chaîne invariable humaine Ii ou de la protéine LAMP-L Les séquences de ciblage dans l'endosome et leur utilisation pour le ciblage d'antigènes dans l'endosome sont notamment décrits dans Sanderson et al. (P.N.A.S., 1995, 92 : 7217-7222), Wu et al. (P.N.A.S., 1995, 92 :11671-11675) et Thompson et al. ( J. Virol., 1998, 72 :2246- 2252). Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, la protéine de fusion est constituée par un peptide MAGE tel que défini ci-dessus, fusionné avec l'une des chaînes d'une molécule HLA-DP4, de préférence la chaîne béta, ou bien avec un fragment de celle-ci correspondant à une molécule HLA-DP4 soluble, notamment un fragment correspondant au domaine extracellulaire précédé du peptide signal homologue ou d'un peptide signal hétérologue. Ledit peptide MAGE est avantageusement inséré entre le peptide signal et l'extrémité NH2 du domaine extracellulaire de la chaîne β, comme décrit pour la molécule HLA-DR ( Kolzin et al., PNAS, 2000, 97, 291-296). Alternativement, ledit peptide MAGE ou ledit fragment poly- épitopique sont fusionnés avec une protéine facilitant leur purification ou leur détection, connue de l'Homme du métier comme notamment la Glutathione-S- Transférase (GST) et les protéines fluorescentes (GFP et dérivées). Dans ce cas, la séquence du peptide ou du fragment polyépitopique d'intérêt est de préférence séparée du reste de la protéine par un site de clivage d'une protéase, pour faciliter la purification dudit peptide ou dudit fragment polyépitopique.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un peptide, un fragment polyépitopique ou une protéine de fusion tels que définis ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, de la transcription et éventuellement de la traduction, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer. Conformément à l'invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l'ADNc codant pour ledit peptide ou fragment polyépitopique ou ladite protéine de fusion. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée. En outre, ledit polynucléotide peut être lié à au moins une séquence hétérologue. Au sens de la présente invention, on entend par séquence hétérologue relativement à une séquence d'acide nucléique codant pour un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant ledit peptide de l'antigène MAGE.
Conformément à l'invention ledit vecteur recombinant comprend une cassette d'expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation),
De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétro virus, les lentivirus, les AAV et les baculovirus, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l'introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l'électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes.
La présente invention a également pour objet un peptide tel que défini ci-dessus, à l'exclusion des peptides MAGE-A3 111-125, 111-126, 113-126, 113-127, 113-128, 114-126, 114-127, 114-128, 146-160, 281-295 et MAGE-A6 121- 144, 140-170, 150-165 et 219-236, comme antigène pour la vaccination prophylactique ou thérapeutique, le diagnostic ou le suivi thérapeutique d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE. La présente invention a également pour objet un fragment poly- épitopique, une protéine de fusion, un lipopeptide ou un vecteur d'expression tels que définis ci-dessus, à l'exclusion de ceux dérivés des peptides MAGE-A3 111-125, 111- 126, 113-126, 113-127, 113-128, 114-126, 114-127, 114-128, 146-160, 281-295 et MAGE-A6 121-144, 140-170, 150-165 et 219-236, comme antigène pour la vaccination prophylactique ou thérapeutique, le diagnostic ou le suivi thérapeutique d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE. La présente invention a également pour objet une composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène tel que défini ci-dessus et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse ou un adjuvant.
La composition immunogène selon l'invention se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse), entérale (orale, sublinguale), ou locale (rectale, vaginale).
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés. Les adjuvants sont avantageusement choisis dans le groupe constitué par : des émulsions huileuses, des substances minérales, des extraits bactériens, la saponine, Phydroxyde d'alumine, le monophosphoryl -lipide A et le squalène.
Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nanoparticules.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend au moins un peptide MAGE incluant un épitope T CD4+ restreint à HLA- DP4 tel que défini ci-dessus et un autre peptide MAGE incluant un épitope T CD8+ tel que défini ci-dessus, sous forme d'un mélange de peptides, d'un fragment poly- épitopique et/ou d'un vecteur d'expression codant lesdits peptides ou ledit fragment.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation de ladite composition, l'épitope T CD8+ est choisi parmi MAGE-Al 96-104, MAGE- A3 168-176, MAGE-A10 254-262 et MAGE-A12 170-178.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend au moins deux peptides MAGE incluant un épitope T CD4+ restreint à HLA-DP4 tels que défini ci-dessus, et notamment l'une des combinaisons suivantes :
- les peptides MAGE-Al 90-104, MAGE-A2 111-125 et MAGE- 12 127-141, - les peptides MAGE-Al 268-282, MAGE-A12 127-141, MAGE-A9
68-82 et MAGE-A9 153-167.
De telles combinaisons permettent avantageusement d'induire des lymphocytes T CD4+ chez la quasi-totalité des individus vaccinés.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend un peptide incluant un épitope T CD4+ universel, tel que défini ci-dessus.
Les peptides selon la présente invention et les produits dérivés (fragment polyépitopique, lipopeptide, vecteur recombinant) peuvent être utilisés en immunothérapie dans le traitement des tumeurs exprimant un antigène MAGE. Lesdits peptides ou produits dérivés sont utilisés, soit comme vaccin, soit en thérapie cellulaire, ou bien encore par une combinaison des deux approches.
La thérapie cellulaire comprend, la préparation de cellules présentatrices d'antigènes (cellules dendritiques) par un protocole classique comprenant l'isolement de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d'un patient à traiter et la mise en culture des cellules dendritiques en présence de peptide(s). Dans une seconde étape les cellules présentatrices d'antigène chargées avec le peptide sont réinjectées au patient.
La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu vis-à-vis d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, caractérisé en ce qu'il comprend un antigène tel que défini ci-dessus. De préférence, ledit réactif comprend un peptide ou une protéine de fusion tels que définis ci-dessus, éventuellement marqués ou complexés, notamment complexés à des molécules HLA-DP4 marquées, par exemple biotinylées, sous la forme de complexes multimériques comme des tétramères. La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu vis-à-vis d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un peptide tel que défini ci-dessus, et
- la détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, in vitro, par tout moyen approprié. Selon un mode de mise en œuvre avantageux de ladite méthode, ledit antigène MAGE est sélectionné dans le groupe constitué par : MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE- AÏ 1 et MAGE-Al 2.
La présente invention a également pour objet un kit de détection de l'état immunitaire d'un individu vis-à-vis d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un peptide tel que défini ci- dessus, associé à un moyen de détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène exprimé par les cellules tumorales.
La méthode selon l'invention permet de suivre l'évolution de la réponse T CD4+ dirigée contre un antigène MAGE exprimé par des cellules tumorales au cours d'un cancer ou bien d'un traitement antitumoral, notamment une immunothérapie antitumorale.
La détection est effectuée à partir d'un échantillon biologique contenant des cellules T CD4+, notamment un échantillon de cellules mononucléées isolées à partir d'un prélèvement de sang périphérique (PBMCs).
Les lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales sont détectés par tous moyens, connus en eux-mêmes. Par exemple, on peut utiliser des moyens directs comme la cytométrie de flux en présence de complexes multimériques tels que définis ci-dessus, ou bien des moyens indirects comme les tests de prolifération lymphocytaire et les dosages de cytokines telles que l'IL-2, l'IL-4, riL-5, IL-10 et l'IFN-γ, notamment par des techniques immuno- enzymatiques (ELISA, RIA, ELISPOT) ou par cytométrie de flux (dosage des cytokines intracellulaires).
De manière plus précise : Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules
CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence desdits peptides et au besoin de cellules présentatrices appropriées, telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hété- rologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La présence de cellules T CD4+ spécifiques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, dans la suspension initiale est détectée à l'aide des peptides MAGE, selon l'une des méthodes suivantes :
* test de prolifération :
La prolifération des cellules T CD4+ spécifiques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules.
* test ELISPOT :
Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T sécrétant des cytokines (IL-2, l'IL-4, l'IL-5, IL-IO et l'IFN-γ), spécifiques d'un peptide tel que défini ci-dessus. Le principe de ce test est décrit dans Czerkinsky et al., J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109-121 et Schmittel et al., J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167-174, et sa mise en œuvre est illustrée dans la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al., J. Virol., 2000, 74, 1694-1703.
* détection des cytokines : La présence de cellules T spécifiques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, sécrétant des cytokines telles que l'IL-2, l'IL-4, l'IL-5, IL-IO et l'IFN-γ est détectée, soit par dosage des cytokines présentes dans le surnageant de culture, par un test immunoenzymatique, notamment à l'aide d'un kit commercial, soit par détection des cytokines intracellulaires en cytométrie de flux. Le principe de détection des cytokines intracellulaires est décrit dans Goulder et al. , J. Exp. Med., 2000, 192, 1819-1832 et Maecker et al., J. Immunol. Methods, 2001, 255, 27-40 et sa mise en œuvre est illustrée dans Draenert et al., J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19- 29.
* complexes multimériques - un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), est mis en contact avec des complexes multimériques marqués, notamment par un fluorochrome, formés par la liaison entre des molécules HLA-DP4 solubles et des peptides MAGE tels que définis ci-dessus, et
- les cellules marquées par lesdits complexes multimériques sont analysées, notamment par cytométrie de flux.
De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec lesdits complexes, on l'enrichit en cellules T CD4+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4.
Les complexes multimériques HLA-DP4/peptide peuvent être préparés à partir de molécules natives extraites de cellules exprimant HLA-DP4 ou de molécules recombinantes produites dans des cellules hôte appropriées comme précisé, par exemple dans NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) ou dans KURODA et al. (J. Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756). Ces molécules HLA-DP4 peuvent notamment être tronquées (délétion du domaine transmembranaire) et leur séquence peut-être modifiée afin de les rendre solubles ou bien de faciliter l'appariement des chaînes alpha et béta (Novak et al., précité). Le chargement de molécules HLA-DP4 avec le peptide peut se faire par mise en contact d'une préparation de molécules HLA-DP4 comme ci-dessus, avec le peptide. Par exemple, des molécules HLA-DP4 solubles et biotinylées sont incubées, pendant 72 heures à 37°C, avec un excès d'un facteur 10 de peptides MAGE tels que définis ci-dessus, dans un tampon phosphate-citrate 10 mM, NaCl 0,15 M à un pH compris entre 4,5 et 7.
Alternativement, la séquence du peptide peut-être introduite dans l'une des chaînes de la molécule DP4 sous forme d'une protéine de fusion qui permet la préparation de complexes multimériques HLA-DP4/peptides à partir de cellules hôtes appropriées exprimant ladite protéine de fusion. Lesdits complexes peuvent ensuite être marqués, notamment par la biotine.
Les complexes multimériques de type tétramère sont notamment obtenus en ajoutant aux molécules HLA-DP4 chargées, de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mole) par rapport aux molécules HLA-DP4, l'ensemble étant ensuite incubé pendant une durée suffisante, par exemple une nuit à température ambiante.
Les complexes multimériques peuvent également être formés, soit par incubation de monomères HLA-DP4/peptides avec des billes magnétiques couplées à la streptavidine comme décrit pour les molécules HLA I (Bodinier et al., Nature, 2000, 6, 707-710), soit par insertion de monomères HLA-DP4/peptides dans des vésicules lipidiques comme décrit pour les molécules du CMH de classe II murines (Prakken, Nature Medicine, 2000,6, 1406-1410). Pour utiliser ces complexes multimériques HLA-DP4/peptide notamment de type tétramère, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec des peptides MAGE tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) avec des complexes multimériques HLA-DP4/peptide à une concentration appropriée (par exemple de l'ordre de 10 à 20 μg/ml), pendant une durée suffisante pour permettre la liaison entre les complexes et les lymphocytes T CD4+ spécifiques de l'antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales (par exemple, de l'ordre de 1 à 3 heures). Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les complexes multi- mériques qui sont fluorescents.
La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les complexes multimériques HLA-DP4/peptide des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire.
La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact, in vitro, d'un échantillon cellulaire avec des complexes multimériques HLA-DP4/peptide marqués, notamment par un fluorochrome, lesdits complexes étant formés par la liaison de molécules HLA-DP4 solubles avec au moins un peptide MAGE tel que défini ci-dessus, et
- le tri des cellules liées auxdits complexes HLA-DP4/peptide, notamment en cytométrie de flux.
La présente invention a également pour objet un peptide tel que défini ci-dessus, à l'exclusion des peptides MAGE-A2 127-139, MAGE-A3 111-125, 111-126, 113-126, 113-127, 113-128, 114-126, 114-127, 114-128, 127-142, 146-160,
156-170 et 281-295, MAGE-A6 121-144, 140-158, 140-170, 150-165, 155-170 et
219-236. La présente invention a en outre pour objet un fragment poly- épitopique, un lipopeptide, un polynucléotide, une cassette d'expression, un vecteur recombinant et une cellule hôte procaryote ou eucaryote modifiée, dérivés des peptides précédents. L'invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et b) des vecteurs recombinants comprenant un polynucléotide conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs sont des vecteurs d'expression comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
Les polynucléotides, les vecteurs recombinants et les cellules transformées tels que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des peptides, fragments polyépitopiques et protéines de fusion selon l'invention.
Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes. Les peptides et leurs dérivés (variants, peptides modifiés, lipo- peptides, fragments polyépitopiques, protéines de fusion) tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d'un ADN recombinant dans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procaryote). De manière plus précise, ^
- les peptides et leurs dérivés (variants, fragments polyépitopiques) peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse,
- les lipopeptides peuvent être notamment préparés selon le procédé décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. - les peptides et dérivés tels que les variants, les fragments poly- épitopiques et les protéines de fusion peuvent également être produits à partir des
ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier ; l'ADNc est clone dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d' affinité.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'objet de la présente invention.
EXEMPLE 1 : ACTIVITE DE LIAISON DES PEPTIDES DES ANTIGENES MAGE VIS-A-VIS DES MOLECULES HLA-DP401 et DP402
1) Matériels et méthodes a) Peptides
Des peptides de 15 acides aminés (15-mères) représentatifs de l'antigène MAGE-Al (SWISSPROT P43355), ainsi que les variants naturels issus des antigènes MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE- A4, MAGE-A9 MAGE-AlO, MAGE-Al 1 et MAGE-A12 (SWISSPROT P43356, P43357, P43362, P43363, P43364, P43365) ont été sélectionnés en fonction de la présence de plusieurs résidus aromatiques ou hydrophobes qui sont les principaux résidus d'ancrage pour les molécules HLA-DP.
Les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS). Les séquences sélectionnées qui ont été synthétisées sont présentées dans le Tableau III et la liste de séquences jointe en annexe.
K) Test de liaison HLA-DP4/peptide
Les tests de liaison aux molécules HLA-DP4 codées par les allèles DPBl*0401 et DPBl*0402, dénommées respectivement DP401 et DP402 sont des tests de liaison en compétition avec une révélation immuno-enzymatique décrits dans la Demande Internationale PCT WO 03/040299. De manière plus précise, le peptide Oxy 271-287
(EKICYFAATQFEPLAARL, SEQ ID NO :41) biotinylé au niveau du résidu NH2 terminal, selon le protocole décrit dans Texier et al., J. Immunol., 2000, 164,
3177-3184), est utilisé comme peptide traceur dans les conditions telles que précisées
; dans le Tableau ci-après.
TABLEAU II : Conditions des tests de liaison aux molécules HLA-DP4
Allèles Traceurs Concentration du pH Temps traceur optimal d'incubation (nM) (h)
DBPl *401 Oxy 271-287 10 5 24 DPB 1*402 Oxy 271-287 10 5 24
2) Résultats
La majorité (18 sur 19) des peptides se lient avec une bonne affinité (IC50 < 1000 nM) à l'une au moins des molécules DP4 (Tableau III). En outre, l'activité de liaison de certains des variants naturels des peptides MAGE-Al correspondant aux peptides MAGE-A2, -A3, -A4, -A9,-A10,-Al l et -A 12 qui est comparable à celle des peptides MAGE-Al, comme illustré par l'exemple des variants du peptide MAGE-Al 120-134, indique qu'il existe une réaction croisée entre les peptides MAGE sélectionnés ; certains des peptides MAGE-A sélectionnés sont susceptibles d'induire des lymphocytes T CD4+ capables de reconnaître des peptides issus d'un autre antigène MAGE-A
Tableau III : Activités de liaison des peptides MAGE vis-à-vis des molécules HLA-DP4 (IC50 en nM)
Peptide" A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 DP401 DP402
MAGE190-104 T S C l L E S L F R A V l T K 155 100
MAGE1268-282 P R A L A E T S Y V K V L E Y 13 16
MAGE2111-125 R K M V E L V H F L L L K Y R 6 4
MAGE2143-157 C Q D F F P V I F S K A S E Y 335 50
MAGE2219-233 E K I W E E L S M L E V F E G 43 37
MAGE3111-125* R K V A E L V H F L L L K Y R 100 35
MAGE968-82 S I S V Y Y T L W S Q F D E G 15 30
MAGE9153-167 A S E F M Q V I F G T D V K E 40 21
MAGE10244-258 E V I W E A L N M M G L Y D G 245 64
MAGE10303-317 H A E I R K M S L L K F L A K 730 175
MAGE11130-144** K G L I T K A E M L G S V I K 260 184
MAGE12127-141 R E P F T K K A E M L G S V I R 120 47
MAGE12111-125* R K M A E L V H F L L L K Y R 32 18
MAGE1 120-134** R E P V T K A E M L E S V I K 3500 424
MAGE2 127-141** R E P V T K A E M L E S V L R 1600 310
MAGE3 127-141** R E P V T K A E M L G S V V G 26458 4183
MAGE4 128-142** K E L V T K A E M L E R V I K 1500 414
MAGE9 126-140** K E P V T K A E M L E S V I K 1800 639
MAGE10 152-166** K E P I T K A E 1 L E S V I K 1500 570
*: variant de magel 104-118 **: variant de magel 120-134 °les résidus d'ancrage à DP4 (Pl, P4, P6 et P9) sont indiqués en gras
Sept peptides présentant une forte affinité pour DP401 et DP402 (MAGE-Al 90-104 et 268-282 ; MAGE-A2111-125 et219-233 ; MAGE-A968-82 et 153-167 ; MAGE-A 12127-141) ont été choisis pour les tests d'immunogénicité. EXEMPLE 2 : IMMUNOGENICITE DES PEPTIDES MAGE IN VITRO
La capacité des peptides ayant une bonne affinité pour les molécules HLA-DP4 à induire in vitro une stimulation de lymphocytes T spécifiques a été évaluée à partir de prélèvements sanguins d'individus sains (non porteurs de tumeur). Il s'agit d'évaluer la capacité à recruter des lymphocytes précurseurs CD4+ alors qu'ils sont chez un individu naïf à une très faible fréquence, c'est-à-dire d'effectuer une immunisation in vitro au moyen de ces peptides. 1) Matériels et méthodes a) individus testés
Des prélèvements sanguins ont été effectués sur cinq individus sains exprimant HLA-DP4. Les allèles du gène DPBl de ces individus sont présentés dans le Tableau IV.
Tableau IV : Allèles DPBl des individus testés individu TYPAGE
P78 DPB1*0402 DPB1*1301
P121 DPB1*0401 DPB1*0402
P122 DPB1*0401
P126 DPB1*0401
P129 DPB1*0401 DPB1*0402
P156 DPB1*0401
P158 DPB1*0402 b) Obtention de lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antiRène MAGE-A et restreintes à HLA-DP4 Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) ont été séparées sur un gradient de Ficoll. Les PBMCs ont ensuite été mises en culture dans du milieu AIM V (LIFE TECHNOLOGIES) et incubées dans des flasques, à l'étuve à 37°C en présence de 5% CO2. Après une nuit d'incubation, les cellules non adhérentes ont été récupérées, déposées sur une colonne LS+ (MYLTENYI), puis les lymphocytes T CD4+ ainsi purifiés ont été congelés. Les cellules adhérentes ont été incubées pendant 5 jours, dans du milieu AIM V contenant lOOOU/ml de GM-CSF et lOOOU/ml d'IL-4, puis les cellules différenciées en cellules dendritiques ont ensuite été cultivées pendant 2 jours, en présence de 1 μg/ml de LPS, 1000 U/ml d'IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF, de manière à induire leur maturation. Les cellules dendritiques matures (100 000 cellules/puits) ont alors été incubées avec un mélange de peptides (10 μg de chaque peptide), pendant 4 heures à 37°C. Les cellules dendritiques matures ont ensuite été lavées puis incubées, en présence des lymphocytes T CD4+ (100 000 cellules/puits) préalablement décongelés, dans du milieu contenant 1000 U/ml d'IL-6 et 10 ng/ml d'IL-12. Après 7 jours, la culture a été restimulée une première fois, au moyen de cellules dendritiques matures préalablement décongelées et chargées par le mélange de peptides, dans du milieu contenant de l'IL-2 (10 U/ml) et de l'IL-7 (5 ng/ml). Après deux stimulations supplémentaires, dans les conditions précédentes, les cellules ont été testées en ELISPOT. c) Analyse de la spécificité des lignées en ELISPOT
Afin de vérifier leur spécificité vis-à-vis de la molécule HLA-DP4, les lymphocytes T ont été testés en présence de cellules HLA-DP4 positives, à savoir une lignée L de fibroblastes transfectés par l'ADNc codant pour une molécule DP402
(Yu et al. Hum. Immunol., 1990, 27, 132-135) ou la lignée H0M2 de lymphocytes B humains transformés par le virus Epstein Barr (DPAl *0103/ DPBl *0401, EACC).
De manière plus précise, des anticorps anti-IFN-γ (1-D1K, MABTECH) dilués à 1 μg/ml dans du tampon PBS ont été adsorbés sur des plaques de nitrocellulose (MILLIPORE) pendant 1 heure à 37°C. Les plaques ont ensuite été lavées avec du PBS puis saturées avec du milieu ISCOVE contenant 10 % de sérum humain du groupe AB (100 μl/puits), pendant 2 h à 37 0C. Des cellules DP4 positives (10 000 cellules/puits) et 5000 lymphocytes à tester ont ensuite été ajoutés dans les plaques et incubées 24 h à 37 0C, en présence ou en l'absence d'un seul peptide ou d'un mélange de peptides. Après un lavage avec du tampon PBS Tween 0,05%, puis avec du PBS seul, 100 μl d'anticorps secondaire anti-IFN-γ conjugué à la biotine (7-B6-1- biotin, MABTECH), dilué à 0,25 μg/ml dans du PBS contenant 1% BSA3 a été ajouté dans chaque puits. Après une heure d'incubation, les plaques ont été lavées à nouveau et incubées avec 100 μl/puits d'Extravidin-AKP (E-2636, SIGMA,), diluée au 1/6000. Après lavage des plaques en tampon PBS, 100 μl de substrat NBT/BCIP (B-5655, SIGMA) dilué dans de l'eau (1 tablette dans 10 ml d'eau) ont été distribués dans chaque puits. La révélation immunoenzymatiqye a été arrêtée après environ 10 minutes, par ringage extensif des plaques dans l'eau, et les spots colorés ont été comptés à l'aide d'un automate (AID). Les lignées sont considérées positives lorsque le nombre de spots est supérieur à trois fois celui obtenu avec le témoin négatif (témoin sans peptides) avec un minimum de 50 spots. Le témoin sans cellules présentatrices permet de vérifier la spécificité de la réponse pour HLA-DP4 (témoin de restriction). 2) Résultats
28 lignées spécifiques d'un antigène MAGE-A et restreintes à HLA-
DP4 ont été mises en évidence ; ces lignées sont stimulées par le mélange de peptides (mix) présenté par HLA-DP4 mais pas en l'absence du mélange (témoin négatif) ou d'HLA-DP4 (témoin de restriction, Tableau V).
Tableau V : Immunogénicité des peptides
(induction avec le mélange des sept peptides)
Nombre de spots
individu Numéro Témoin contrôle mélange Mage-2 Mage-9 Mage-1 Mage-9 Mage-12 Mage-1 Mage-2 de là négatif de là de 111-125 153-167 90-104 68-82 127-141 268-282 219-233 lignée restriction peptides
P78 13 25 6 88 49 13 92 12 10 9 11
22 37 10 92 65 34 177 16 35 27 24
32 1 4 117 0 0 185 0 0 0 0
P121 6 2 0 92 9 2 123 3 3 2 2
9 3 0 392 2 3 366 0 4 5 1
19 4 0 216 5 3 153 3 280 8 9
21 2 0 106 4 2 147 6 1 0 1
24 19 1 140 23 23 208 21 15 34 19
30 5 2 171 4 7 329 12 7 10 10
34 5 1 36 23 4 73 9 4 5 3
38 18 0 68 15 13 104 35 8 17 5
40 1 0 208 4 3 250 6 6 5 2
44 5 1 62 15 8 63 6 110 8 7
48 6 0 225 6 5 253 7 8 9 6
49 2 0 87 5 2 122 2 3 2 1
P122 12 9 2 173 2 6 178 18 12 7 6
26 1 3 12 11 10 65 8 8 5 8
27 5 0 37 4 2 70 1 1 0 0
28 1 0 31 4 3 85 1 0 0 0
29 3 1 85 7 6 196 2 2 1 3
P129 7 5 1 97 3 2 1 2 307 22 6
12 1 1 39 2 1 112 0 2 1 3
14 0 1 23 1 1 97 1 3 2 2
24 2 0 6 21 1 70 0 4 1 1
30 0 1 28 0 1 86 8 6 7 5
34 3 2 22 115 19 5 2 3 4 1
37 4 0 19 1 2 51 3 3 3 7
39 7 1 23 4 7 93 5 5 2 3
Chaque lignée répond à au moins un des peptides du mélange. Le peptide MAGE-Al (MAGE-I) est très imrnunogène puisqu'il induit 26 lignées sur 28.
Lorsque l'on utilise le mélange des sept peptides pour l'induction de lymphocytes T
CD4+, le peptide MAGE-A12 127-141 induit 3 lignées, le peptide MAGE-A2 111- 125 induit une lignée et les quatre autres peptides n'induisent pas de lignée.
Compte tenu de la prépondérance de la réponse pour le peptide MAGE-Al 90-104, une expérience d'induction a été réalisée avec un mélange contenant uniquement les six autres peptides (Tableau VI). Tableau VI : Immunogénicité des peptides
(induction avec le mélange sans le peptide MAGE-Al 90-104)
Nombre de spots individu Numéro Témoin contrôle de mélange Mage-2 Mage-9 Mage-9 Mage-12 Mage-1 Mage-2 de là négatif la restriction de 111-125 153-167 68-82 127-141 268-282 219-233 lignée peptides
P126 21 12 6 85 37 30 27 38 72 38
31 4 5 68 3 5 3 65 14 10
36 11 5 55 9 4 5 6 62 7
42 7 3 61 11 2 3 6 67 10
54 12 13 81 58 21 51 60 45 22
55 23 23 100 39 107 22 47 30 48
57 30 9 155 33 26 16 20 137 34
59 6 65 121 3 3 125 3 14 7
Dans ce contexte, on observe que les peptides MAGE-Al 268-282, MAGE-A9 68-82 et 153-167 sont également immunogènes étant donné qu'ils induisent respectivement, quatre, deux et une des huit lignées testées.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation d'un peptide dérivé de l'antigène MAGE-Al comprenant un épitope T CD4+ apte à être présenté par une molécule HLA-DP4 et à induire des lymphocytes T spécifiques d'au moins un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, lequel peptide étant sélectionné dans le groupe constitué par : a) les peptides de 15 à 50 acides aminés consécutifs de l'antigène MAGE-Al, de préférence de 15 à 25 acides aminés, comprenant au moins la séquence située entre les positions suivantes : 93 à 101, 271 à 279, 68 à 76, 107 à 115, 123 à 131, 139 à 147, 150 à 158, 215 à 223 et 274 à 282, b) les fragments des peptides définis en a), de 13 ou 14 acides aminés, comprenant au moins la séquence située entre les positions 93 à 101, 68 à 76, 107 à 115, 123 à 131, 139 à 147, 150 à 158 et 215 à 223, à l'exclusion du peptide MAGE- AÏ 68-81, et c) les variants des peptides définis en a) de 13 à 50 acides aminés, de préférence de 13 à 25 acides aminés, et les variants des fragments définis en b), de 13 ou 14 acides aminés, qui présentent une activité de liaison à une molécule HLA-DP4 inférieure ou égale à 1000 nM et sont capables d'induire des lymphocytes T CD4+ reconnaissant l'un des épitopes défini en a) ou en b), pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le peptide est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences situées entre les positions suivantes de l'antigène MAGE-Al : 90 à 104, 268 à 282, 65 à 79, 104 à 118, 120 à 134, 136 à 150, 147 à 161, 212 à 226 et 271 à 285.
3°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le peptide variant est un fragment d'un autre antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales dont la séquence est homologue à celle du peptide en a) ou du fragment en b). 4°) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit fragment homologue est un fragment d'un antigène MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE- A4, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-Al 1 ou MAGE-A 12 comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO :19 à 25.
5°) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit fragment est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 26 à
40. 6°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le peptide variant en c) est un variant synthétique obtenu par la substitution d'au moins un des résidus Pl, P6 et/ou P9 par un acide aminé aromatique ou hydrophobe, du résidu P6 par une cystéine (C)5 du résidu du résidu P9 par C, D, Q, S, T ou E et/ou du résidu P4 par un autre acide aminé naturel ou synthétique. 7°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le peptide présente une séquence de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23 ou 24 acides aminés.
8°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le peptide est marqué ou complexé. 9°) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit peptide est complexé à des molécules HLA-DP4 marquées.
10°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite molécule DP4 comprend une chaîne β codée par Pallèle
DPBl*0401 ou DPBl*0402. 11°) Utilisation d'un fragment polyépitopique comprenant la concaténation d'au moins deux épitopes identiques ou différents dont l'un au moins est un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
12°) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le fragment polyépitopique comprend la concaténation d'au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 et d'au moins un épitope T CD8+ d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales et/ou un épitope T CD4+ universel. 13°) Utilisation selon la revendication 12, caractérisée l'épitope T CD8+ est choisi parmi : MAGE-Al 96-104, MAGE-A3 168-176, MAGE-AlO 254- 262 et MAGE-A12 170-178.
14°) Utilisation d'une protéine de fusion constituée par une protéine ou un fragment de protéine, fusionné à un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un fragment polyépitopique tel que défini à la revendication 12 ou la revendication 13, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
15°) Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ladite protéine ou ledit fragment est sélectionné dans le groupe constitué par une chaîne alpha ou béta d'une molécule HLA-DP4, un fragment de ladite chaîne correspondant à une molécule HLA-DP4 soluble et une séquence de ciblage dans l'endosome.
16°) Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite séquence de ciblage est dérivée de la chaîne invariable Ii ou de la protéine LAMP-I .
17°) Utilisation d'un lipopeptide obtenu par addition d'un lipide sur une fonction α-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé d'un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou d'un fragment polyépitopique tel que défini à l'une quelconque des revendications 11 à 13, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
18°) Utilisation d'un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10, un fragment polyépitopique tel que défini à l'une quelconque des revendications 11 à 13 ou une protéine de fusion telle que définie à l'une quelconque des revendications 14 à 16, sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, pour la préparation d'un vaccin destiné à la prévention ou au traitement d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, chez un individu porteur d'un allèle DP4, ou pour la préparation d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire dudit individu vis-à-vis de ce cancer.
19°) Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10, à l'exclusion des peptides MAGE-A3 111-125, 111-126, 113-126, 113-127, 113- 128, 114-126, 114-127, 114-128, 146-160, 281-295 et MAGE-A6 121-144, 140-170, 150-165 et 219-236 comme antigène pour la vaccination prophylactique ou thérapeutique, le diagnostic ou le suivi thérapeutique d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE. 20°) Fragment polyépitopique, protéine de fusion, lipopeptide ou vecteur d'expression tels que définis à l'une quelconque des revendications 11 à 18, à l'exclusion de ceux dérivés des peptides MAGE-A3 111-125, 111-126, 113-126, 113- 127, 113-128, 114-126, 114-127, 114-128, 146-160, 281-295 et MAGE- A6 121-144, 140-170, 150-165 et 219-236, comme antigène pour la vaccination prophylactique ou thérapeutique, le diagnostic ou le suivi thérapeutique d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE.
21°) Composition immunogène ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un antigène tel que défini à la revendication 19 ou la revendication 20 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse ou un adjuvant.
22°) Composition immunogène ou vaccinale selon la revendication
21, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini à la revendication 19 et un peptide incluant un épitope T CD 8+ d'un antigène MAGE, sous la forme d'un mélange de peptides, d'un fragment polyépitopique et/ou d'un vecteur d'expression codant lesdits peptides ou ledit fragment.
23°) Composition immunogène ou vaccinale selon la revendication
22, caractérisée en ce que ledit épitope T CD8+ est choisi parmi MAGE-Al 96-104, MAGE-A3 168-176, MAGE-A10254-262 et MAGE-A12 170-178.
24°) Composition immunogène ou vaccinale selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de peptides sélectionné dans le groupe constitué par le mélange des peptides MAGE-Al 90-104, MAGE-A2 111-125 et MAGE-12 127-141 et le mélange des peptides MAGE- Al 268-282, MAGE-A12 127-141, MAGE-A9 68-82 et MAGE-A9 153-167.
25°) Composition irnrnunogène selon l'une quelconque des revendications 21 à 24, caractérisée en ce qu'elle comprend un épitope T CD4+ universel.
26°) Réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu vis-à- vis d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, caractérisé en ce qu'il comprend un antigène tel que défini à la revendication 19 ou la revendication 20.
27°) Méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu vis-à- vis d'un cancer associé à l'expression d'un antigène MAGE, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10, et
- la détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, in vitro, par tout moyen approprié.
28°) Méthode selon la revendication 27, caractérisée en ce que ledit antigène MAGE est sélectionné dans le groupe constitué par : MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-AI l et MAGE-A12. 29°) Procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène MAGE exprimé par les cellules tumorales, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact, in vitro, d'un échantillon cellulaire avec des complexes multimériques HLA-DP4/peptide marqués, formés par la liaison de molécules HLA-DP4 solubles avec au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10, et
- le tri des cellules liées auxdits complexes HLA-DP4/peptide.
30°) Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10, à l'exclusion des peptides M AGE-A2 127-139, MAGE-A3 111-125, 111-126, 113-126, 113-127, 113-128, 114-126, 114-127, 114-128, 127-142, 146-160, 156-170 et 281-295, MAGE-A6 121-144, 140-158, 140-170, 150-165, 155-170 et 219-236. 31°) Fragment polyépitopique comprenant la concaténation d'au moins deux épitopes identiques ou différents dont l'un au moins est un peptide selon la revendication 30.
32°) Protéine de fusion constituée par une protéine ou un fragment de protéine, fusionné à un peptide selon la revendication 30 ou un fragment polyépitopique selon la revendication 31.
33°) Lipopeptide obtenu par addition d'un lipide sur une fonction α- aminée ou une fonction réactive de la chaîne latérale d'un peptide selon la revendication 30 ou d'un fragment polyépitopique selon la revendication 31. 34°) Polynucléotide codant pour un peptide selon la revendication
30, un fragment polyépitopique selon la revendication 31 ou une protéine de fusion selon la revendication 32.
35°) Vecteur d'expression comprenant un polynucléotide selon la revendication 34 sous le contrôle de séquences régulatrices appropriées, de la transcription et éventuellement de la traduction.
36°) Cellule hôte modifiée par un polynucléotide selon la revendication 34 ou un vecteur d'expression selon la revendication 35.
PCT/FR2006/002019 2005-09-01 2006-09-01 Epitopes t cd4+ des antigenes mage-a restreints a hla-dp4 et leurs applications WO2007026078A2 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0508968 2005-09-01
FR0508968A FR2889959A1 (fr) 2005-09-01 2005-09-01 Epitopes t cd4+ des antigenes mage-a restreints a hla-dp4 et leurs applications

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007026078A2 true WO2007026078A2 (fr) 2007-03-08
WO2007026078A3 WO2007026078A3 (fr) 2007-07-26

Family

ID=35884022

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2006/002019 WO2007026078A2 (fr) 2005-09-01 2006-09-01 Epitopes t cd4+ des antigenes mage-a restreints a hla-dp4 et leurs applications

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2889959A1 (fr)
WO (1) WO2007026078A2 (fr)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7718575B2 (en) 2001-10-17 2010-05-18 Commissariat A L'energie Atomique Method of selecting HLA-DP4 ligands and the applications thereof
WO2015001526A1 (fr) 2013-07-05 2015-01-08 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Peptides immunogènes de l'antigène tumoral cycline bl
WO2020127996A2 (fr) 2018-12-21 2020-06-25 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Melanges d'epitopes t cd8+ immunogenes de la cycline b1
CN112194719A (zh) * 2020-09-01 2021-01-08 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) Crt抗原和mage-a1抗原的制备及其应用
US11945851B2 (en) * 2017-06-07 2024-04-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology MAGE-A vaccines and methods of treatment using the same

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995004542A1 (fr) * 1993-08-06 1995-02-16 Cytel Corporation Clonage et description des caracteristiques du gene mage-1 complet
US5843448A (en) * 1991-05-23 1998-12-01 Ludwig Institute Of Cancer Research Tumor rejection antigen precursor
US6716809B1 (en) * 1997-09-12 2004-04-06 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-A3 peptides presented by HLA class molecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843448A (en) * 1991-05-23 1998-12-01 Ludwig Institute Of Cancer Research Tumor rejection antigen precursor
WO1995004542A1 (fr) * 1993-08-06 1995-02-16 Cytel Corporation Clonage et description des caracteristiques du gene mage-1 complet
US6716809B1 (en) * 1997-09-12 2004-04-06 Ludwig Institute For Cancer Research Mage-A3 peptides presented by HLA class molecules

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CASTELLI F A ET AL: "HLA-DP4, the most frequent HLA II molecule, defines a new supertype of peptide-binding specificity" JOURNAL OF IMMUNOLOGY, THE WILLIAMS AND WILKINS CO. BALTIMORE, US, vol. 169, no. 12, 15 décembre 2002 (2002-12-15), pages 6928-6934, XP002238415 ISSN: 0022-1767 *
SCHULTZ ERWIN S ET AL: "Functional analysis of tumor-specific Th cell responses detected in melanoma patients after dendritic cell-based immunotherapy." JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 172, no. 2, janvier 2004 (2004-01), pages 1304-1310, XP002370810 ISSN: 0022-1767 cité dans la demande *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7718575B2 (en) 2001-10-17 2010-05-18 Commissariat A L'energie Atomique Method of selecting HLA-DP4 ligands and the applications thereof
WO2015001526A1 (fr) 2013-07-05 2015-01-08 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Peptides immunogènes de l'antigène tumoral cycline bl
US11945851B2 (en) * 2017-06-07 2024-04-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology MAGE-A vaccines and methods of treatment using the same
WO2020127996A2 (fr) 2018-12-21 2020-06-25 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Melanges d'epitopes t cd8+ immunogenes de la cycline b1
FR3090319A1 (fr) 2018-12-21 2020-06-26 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Melanges d’epitopes t cd8+ immunogenes de la cycline b1
CN112194719A (zh) * 2020-09-01 2021-01-08 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) Crt抗原和mage-a1抗原的制备及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
FR2889959A1 (fr) 2007-03-02
WO2007026078A3 (fr) 2007-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1931377B1 (fr) Epitopes t cd4+ de la survivine et leurs applications
CA2881594C (fr) Composition de vaccin contre le cancer
EP2296697A1 (fr) Peptides immunogenes issus de la proteine midkine comme vaccin anticancereux
JP2015524788A (ja) Ｔｈ１細胞のＫＩＦ２０Ａエピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン
WO2007026078A2 (fr) Epitopes t cd4+ des antigenes mage-a restreints a hla-dp4 et leurs applications
JP6255593B2 (ja) Ｔｈ１細胞のＣＤＣＡ１エピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン
CA2480696C (fr) Epitopes peptidiques communs a des antigenes d&#39;une meme famille multigenique
EP3016974B1 (fr) Peptides immunogènes de l&#39;antigène tumoral cycline b1
WO2006027468A2 (fr) Epitopes t cd4+ du vih restreints a hla-dp4 et leurs applications
CA2477762A1 (fr) Peptides utilisables en immunotherapie antitumorale
WO2020127996A2 (fr) Melanges d&#39;epitopes t cd8+ immunogenes de la cycline b1
JP2018508181A (ja) Ｔｈ１細胞のためのＧＰＣ３エピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン
WO2020245433A1 (fr) Melanges d&#39;epitopes t cd8 immunogènes du virus ebola
FR3091651A1 (fr) Peptides immunogènes issus de la nucléoprotéine du virus ebola zaïre

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06794377

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2