FR3091651A1 - Peptides immunogènes issus de la nucléoprotéine du virus ebola zaïre - Google Patents

Abstract

L’invention concerne une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins un premier peptide immunogène issu de la nucléoprotéine (NP) du virus Ebola Zaïre, qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, ledit peptide étant sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences. L’invention concerne également l’utilisation de ladite composition comme vaccin préventif contre le virus Ebola et comme réactif pour l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola.

Description

PEPTIDES IMMUNOGÈNES ISSUS DE LA NUCLÉOPROTÉINE DU VIRUS EBOLA ZAÏRE

L’invention concerne une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins un peptide immunogène issu de la nucléoprotéine du virus Ebola Zaïre, qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola. L’invention concerne également l’utilisation de ladite composition comme vaccin préventif contre le virus Ebola et comme réactif pour l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola.

Le virus Ebola est un virus de la famille desFiloviridaehautement virulent, responsable d’épidémies de fièvres hémorragiques mortelles, chez l’Homme et le primate non-humain. Ce virus comprend une seule protéine d’enveloppe, la Glycoprotéine (GP), ainsi que des protéines internes dont la Nucléoprotéine (NP). Cinq espèces du virus Ebola ont été identifiées: Zaïre, Soudan, Reston, Forêt de Taï et Bundibugyo. Le virus Ebola Zaïre (EBOV) est responsable de la plupart des flambées épidémiques depuis la découverte du virus Ebola en 1976, avec un taux de létalité moyen d’environ 50 % (25 % à 90 % au cours des flambées récentes).

Aucun vaccin préventif n’a été approuvé pour le traitement des infections par Ebola mais plusieurs vaccins basés sur la glycoprotéine (GP) sont en développement. Il s’agit de vecteurs viraux réplicatifs tels que le virus de la stomatite vésiculaire (rVSV-Ebov), le cytomégalovirus (rCMV), ou le virus parainfluenza humain de type 3 (HPIV3), ainsi que d’adénovirus non-réplicatifs tels que Chad3-EBOV (Chimp adenovirus), EBOLA rAd-5 et Ad26.ZEBOV. On peut citer également, des plasmides (INO-4212 ou VRC-EBODNA023-00-VP) et des nanoparticules contenant la glycoprotéine (GP) recombinante combinées à un adjuvant à base de saponine (Matrix-M™). Les essais précliniques, chez le rongeur ou le primate non-humain se sont révélés concluants, apportant la preuve de concept d’une protection virale par vaccination dans ces modèles. Des essais chez l’homme sont également en cours.

Bien que prometteurs, ces vaccins présentent plusieurs limites. Initialement développés pour la lutte contre le bioterrorisme, ils ne sont pas adaptés à une vaccination à grande échelle en Afrique Sub-Saharienne. Une production massive est compliquée, et une dissémination dans les régions endémiques nécessite un stockage à -80°C pour assurer leur conservation. Par ailleurs, l’existence d’une immunité dirigée contre les vecteurs, comme les adénovirus, peut rendre le vaccin inefficace.

Peu d’études sont consacrées à l’immunité contre le virus Ebola et les corrélats de protection ne sont pas connus. Des titres élevés d’anticorps dirigés contre la GP du virus sont toutefois toujours détectables chez des patients ayant survécu à l’infection virale. La présence de lymphocytes T CD4⁺et CD8⁺dirigés contre les protéines virales, en particulier la NP et la GP a également été montré chez des patients ayant survécu à l’infection virale (Mc Elroy et al., Proc. Natl Sci., 2015, 112, 4719-4724). Compte tenu du rôle majeur des lymphocytes T CD4+ dans l’initiation des réponses humorales et cytotoxiques, la réponse des lymphocytes T CD4+ est nécessaire à l’établissement de l’immunité anti-EBOLA mais les caractéristiques de cette réponse sont peu connues.

Les lymphocytes T CD4+ ont une fonction auxiliaire ou régulatrice et reconnaissent les antigènes comme les antigènes de pathogènes, notamment de virus, sous la forme de peptides présentés par les molécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe II (HLA II chez l’homme). La spécificité de liaison des molécules HLA II étant très variable d’une molécule HLA de classe II à l’autre, ces peptides varient d’un individu à l’autre, compte-tenu du polymorphisme des molécules HLA II dans la population.

Problème technique

Très peu d’épitopes T CD4+ du virus Ebola et en particulier d’Ebola Zaïre (EBOV) ont été décrits jusqu’à présent et uniquement dans des études chez la souris, notamment chez des souris transgéniques pour l’allèle HLA-DR3. Ainsi, cinq épitopes T CD4+ potentiels de la GP et de la NP d’EBOV ont été identifiés sur la base de leur prédiction de liaison aux allèles HLA-DR1, -DR3, -DR4, -DR7, -DR8, -DR11, -DR13 et -DR15. Toutefois, seul un peptide de la GP (EBOV-GP 32-59) mais aucun peptide de la NP d’Ebola Zaïre, est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ spécifiques chez des souris transgéniques pour HLA-DR3 (Boundset al., Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2017, 13, 2824-2836).

Pour mettre au point des vaccins efficaces contre le virus Ebola, il existe donc un réel besoin de disposer d’épitopes T CD4+ d’Ebola Zaïre (EBOV), et en particulier de la nucléoprotéine (NP), capables d’induire une réponse T CD4+ efficace, c’est-à-dire d’intensité élevée chez une majorité d’individus.

Les inventeurs ont identifié de nombreux peptides de la NP et la GP du virus Ebola Zaïre capables de stimuler des lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus Ebola chez un panel de donneurs sains représentatif des populations caucasienne et africaine ( et [Fig. 2] ; [Tableau 2] et [Tableau 3]). Les réponses contre les peptides issus de la NP sont plus intenses que celles contre les peptides de la GP, aussi bien en termes de nombre de donneurs répondeurs, qu’en termes d’intensité de réponse (nombre de lignées positives) et il existe une bonne corrélation entre taux et intensité de réponse, pour les peptides de la NP. De plus les peptides de la NP sont plus conservés et donc potentiellement efficaces contre les différentes souches d’Ebola. Dix peptides pour la NP et huit pour la GP induisent des réponses chez 50% des donneurs ou plus. Quatre peptides issus de la NP et cinq peptides de la GP permettent une couverture vaccinale de l’ensemble de la population de référence (fréquence de répondeurs de 100 %), tout en induisant une intensité de réponse de 20% pour la NP et 23% pour la GP ([Tableau 6] et [Tableau 7] ; |Fig. 3] et [Fig.4]). En combinant plusieurs peptides dans de longs fragments polypeptidiques (LSP), 3 LSP pour la NP comme pour la GP, permettent de couvrir l’ensemble des donneurs testés, avec une intensité de réponse de 29% et 41% respectivement [(Fig. 5] et [Fig. 6]). L’ajout d’autres peptides ou d’autres LSP, sans augmenter le taux de réponse permet d’amplifier l’intensité de réponse.

En conséquence, la présente invention a pour objet une composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins un premier peptide immunogène issu de la nucléoprotéine du virus Ebola Zaïre qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, et éventuellement au moins un deuxième peptide immunogène issu de la glycoprotéine du virus Ebola Zaïre qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola.

Conformément à la présente invention :
- On entend par nucléoprotéine (NP) du virus Ebola Zaïre (ZEBOV), la protéine de séquence SEQ ID NO : 1 ou UniProt AAD14590.1.
- On entend par glycoprotéine (GP) du virus Ebola Zaïre (ZEBOV), la protéine de séquence SEQ ID NO : 25 ou UniProt AKG65268.1.
- Les acides aminés sont désignés à l’aide du code à une lettre. Les positions des peptides issus de la NP du virus Ebola Zaïre sont indiquées en référence à la séquence SEQ ID NO : 1. Les positions des peptides issus de la GP du virus Ebola Zaïre sont indiquées en référence à la séquence SEQ ID NO : 25.
- On entend par épitope T CD4⁺, un peptide de 11 à 25 acides aminés qui lie au moins une molécule HLA II, en particulier au moins un allèle HLA-DR fréquent dans différentes populations tel que présenté au [T ableau 1], et est reconnu par des lymphocytes T CD4⁺spécifiques chez les individus portant cette molécule HLA II; le peptide comprend une séquence de 9 acides aminés incluant les résidus d’ancrage aux molécules HLA II, flanquée d’au moins 1 acide aminé, de préférence au moins 2 ou 3 acides aminés à chacune de ses extrémités.
- On entend par lymphocytes T CD4+ spécifiques, des lymphocytes T CD4+ spécifiques de la NP ou de la GP du virus Ebola.
- On entend par induction d’une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques, la stimulation de lymphocytes T CD4+ humains spécifiques,in vitroouin vivo.
- On entend par fréquence ou taux de répondeursin vitroà un peptide selon la présente invention, le pourcentage d’individus humains d’un groupe de référence pour lesquels des lignées de lymphocytes T CD4⁺humains spécifiques dudit peptide ont été obtenues.
- On entend par intensité de la réponsein vitroà un peptide selon la présente invention, le pourcentage de lignées de lymphocytes T CD4⁺spécifiques dudit peptide qui ont été obtenues dans un groupe d’individus humains de référence par rapport à la totalité des lignées de lymphocytes T CD4⁺spécifiques obtenues avec les différents peptides de la même protéine (NP ou GP).
- On entend par groupe de référence, un ensemble d’individus humains exprimant des molécules HLA II variées, notamment des molécules HLA-DR variées incluant les allèles HLA-DR les plus fréquents dans différentes populations, tel que le groupe de référence des exemples ([Ta bleau2] et [Tableau 3]) .Le groupe de référence est considéré comme représentatif d’une population ou d’un ensemble de populations, c’est-à-dire qu’il fournit des résultats extrapolables à cette ou ces population(s).
- On entend par virus Ebola, n’importe quel isolat du virus Ebola.
- Le pourcentage d’identité d’une séquence d’acide aminé est défini par le pourcentage de résidus d’acides aminés dans une séquence à comparer qui sont identiques à une séquence de référence après alignement des séquences, en introduisant des espaces si nécessaire, de façon à obtenir une identité de séquence maximale. L’alignement de séquences en vue de déterminer le pourcentage d’identité d’une séquence peut être réalisé de différentes façons connues de l’homme du métier, par exemple en utilisant des logiciels publics disponibles comme BLAST (Altschulet al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). Ce logiciel est de préférence utilisé avec des paramètres par défaut.

Le peptide immunogène issu de la NP du virus Ebola Zaïre selon l’invention, est dénommé ci-après peptide NP et le peptide immunogène issu de la GP du virus Ebola Zaïre selon l’invention, est dénommé ci-après peptide GP. Conformément à l’invention, le peptide NP comprend au moins un épitope T CD4+ issu de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 et le peptide GP comprend au moins un épitope T CD4+ issu de la GP de séquence SEQ ID NO : 25, lequel épitope lie au moins un allèle HLA-DR tel que présenté au [Tableau 1]et est apte à induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola.

La capacité des peptides de l’invention de lier des molécules HLA II sont évaluées selon les techniques standards connues de l’Homme du métier telles que celles décrites en particulier dans les exemples. Il s’agit notamment de méthodesin silicoet de tests classiques de liaison spécifiques des molécules HLA II. Les méthodesin silicoutilisent des outils de prédiction de liaison au CMH-II, issus notamment de la base de données IEDB (http://www.iedb.org/) et des logiciels appropriés tels que par exemple les algorithmes NetMHCIIpan et Sturniolo. Les tests classiques de liaison spécifiques des molécules HLA II sont notamment des tests en compétition avec révélation immuno-enzymatique tel que décrit dans le Brevet américain US 6,649,166.

La capacité des peptides de l’invention d’induire une réponse en lymphocytes T CD4⁺humains spécifiques, la spécificité des lymphocytes T CD4⁺induits vis-à-vis des peptides ou de la protéine NP ou GP, ainsi que la capacité des peptides de l’invention d’être reconnus par des lymphocytes T CD4⁺ spécifiques, est évaluée selon les techniques standards connues de l’Homme du métier telles que celles décrites dans les exemples. Il s’agit notamment d’un test de prolifération cellulaire, d’un test ELISPOT (dosage des cellules productrices de cytokines) ou d’un test de dosage de cytokines intracellulaires, spécifiques d’une cytokine produite par des lymphocytes T CD8+ activés telle que IFN-γ, IL-2, IL-4 ou IL-10. Les exemples montrent que les peptides de l’invention sont capables d’induire une réponse en lymphocytes T CD4⁺humains spécifiques à partir de précurseurs présents chez des individus humains naïfs d’un groupe de référence.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide NP ou GP se lie à au moins quatre allèles HLA-DR différents choisi parmi HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*03:01, HLA-DRB1*04:01, HLA-DRB1*04:05, HLA-DRB1*07:01, HLA-DRB1*08:02, HLA-DRB1*09:01, HLA-DRB1*11:01, HLA-DRB1*12:01, HLA-DRB1*13:01, HLA- DRB1*15:01, HLA-DRB3*01:01, HLA-DRB3*02:02, HLA-DRB4*01:01 et HLA-DRB5*01:01 ; ces 15 allèles HLA-DR sont représentatifs des populations Caucasienne et Africaine.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide NP ou GP induit une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques dans un groupe de référence exprimant les allèles HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*03:01, HLA-DRB1*04:01, HLA-DRB1*07:01, HLA-DRB1*09:01, HLA-DRB1*11:01, HLA-DRB1*13:01, HLA-DRB1*15:01, HLA-DRB3*01:01, HLA-DRB3*02:02, HLA-DRB4*01:01 et HLA-DRB5*01:01 ; ces allèles HLA-DR sont représentatifs des populations Caucasienne et Africaine. En particulier, cet ensemble d’allèles permet de couvrir 83 % des individus de la population mondiale ; 88 % des individus d’Europe ; 60 % des individus d’Afrique Centrale ; 70,4% des individus d’Afrique de l’Est ; 21, 2 % des individus d’Afrique Sub-Saharienne ; 73 % des individus d’Afrique du Nord et 63,8 % des individus d’Afrique de l’Ouest.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide NP est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide GP est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 26, 27 et 29 à 58 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.

L’invention englobe les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d’un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de la nucléoprotéine de séquence SEQ ID NO : 1 ou de la glycoprotéine de séquence SEQ ID NO : 25, dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés d’épitope T CD4⁺immunogène du virus Ebola et est capable de stimuler une réponse en lymphocytes T CD4⁺humains spécifiques du virus Ebola, c’est-à-dire qu’ils sont reconnus par des lymphocytes T CD4⁺spécifiques de la séquence sauvage ou d’un variant naturel du virus Ebola. Les mutations sont avantageusement dispersées dans la séquence des peptides ; de préférence elles sont espacées d’au moins 3 acides aminés, de manière préférée d’au moins 5 acides aminés.

Le peptide variant comprend une délétion de 1, 2 ou 3 acides aminés à l’une et/ou l’autre extrémité desdites séquences.

Alternativement, ledit peptide variant comprend au plus trois (1, 2 ou 3) substitutions d’acides aminés dans lesdites séquences. De préférence une ou deux substitutions d’acides aminés. Les dites substitutions sont avantageusement des substitutions dispersées telles que définie ci-dessus.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23 et 24 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeursin vitrod’au moins 33 % et/ou une intensité de réponsein vitrod’au moins à 3,5 % dans un groupe de référence ([Tableau 2]). Ladite composition comprend de préférence, au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 6, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 19, 23 et 24 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeursin vitrod’au moins 50 % et/ou une intensité de réponsein vitrod’au moins 5 % dans un groupe de référence ([Tableau 2]). De manière préférée, ladite composition comprend au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 6, 8, 17, 19, 23 et 24; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeursin vitrod’au moins 50 % et une intensité de réponsein vitrod’au moins 5 % dans un groupe de référence ([Tableau 2]).

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 21, 22 et 23 ; de préférence au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 4, 5, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 21 et 23 ; de manière préférée au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 4, 8, 9, 13, 14 et 18.

Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la dite composition comprend au moins un peptide NP conservé, c’est-à-dire dont la séquence est conservée dans au moins une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée une séquence conservée dans Ebola Zaïre Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. De préférence, la séquence dudit peptide présente au moins 75 % d’identité, de préférence au moins 90 %, 95 %, 98 %, 99% ou 100 % d’identité avec la séquence d’une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée avec les séquences d’Ebola Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. La composition comprend avantageusement au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 5, 8, 9, 17, 19, 23 et 24 ; de préférence au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 5, 8, 9, 17 et 19 ; de manière préférée au moins un peptide NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 8, 9 et 17.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 29, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 41, 42, 43, 48, 53 et 57; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeursin vitrod’au moins 33 % et/ou une intensité de réponsein vitrod’au moins à 3,5 % dans un groupe de référence (Tableau II I). Ladite composition comprend de préférence, au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 29, 31, 33, 35, 37, 39, 42 et 43 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeursin vitrod’au moins 50 % et/ou une intensité de réponsein vitrod’au moins 5 % dans un groupe de référence ([Tableau 3]). De manière préférée, ladite composition comprend au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31, 33, 35, 39, 42 et 43 ; de tels peptides présentent avantageusement une fréquence de répondeursin vitrod’au moins 50 % et une intensité de réponsein vitrod’au moins 5 % dans un groupe de référence ([Tableau 3]).

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, ladite composition comprend au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 44, 46 à 51, 53 et 56 à 58 ; de préférence au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31, 33, 39, 41, 48, 53 et 57 ; de manière préférée au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31, 33 et 39.

Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la dite composition comprend au moins un peptide GP conservé, c’est-à-dire dont la séquence est conservée dans au moins une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée une séquence conservée dans Ebola Zaïre Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. De préférence, la séquence dudit peptide présente au moins 75 % d’identité, de préférence au moins 90 %, 95 %, 98 %, 99% ou 100 % d’identité avec la séquence d’une autre espèce du virus Ebola, de préférence Ebola Soudan ; de manière préférée avec les séquences des d’Ebola Soudan, Reston, Bundibugyo et Tai Forest. La composition comprend avantageusement au moins un peptide GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31, 33 et 35; de préférence au moins le peptide GP de séquence SEQ ID NO : 35.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins quatre peptides NP et/ou GP tels que définis ci-dessus, de préférence 4 à 10 (4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) ou plus de peptides NP et/ou GP tels que définis ci-dessus. De préférence, ladite composition comprend au moins 4 peptides NP et/ou au moins 5 peptides GP tels que définis ci-dessus. Selon un mode de réalisation avantageux, la dite composition comprend au moins 4 peptides NP et/ou au moins 5 peptides GP tels que définis ci-dessus dont au moins un peptide conservé tel que défini ci-dessus.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition est apte à induire une fréquence de répondeursin vitroet/ou une intensité de réponsein vitrodéterminée, par exemple une fréquence d’au moins 75 %, 90 % ou de 100 % et/ou une intensité de réponse d’au moins 20 %, 30 % ou 50 % dans un groupe de référence. La séquence et le nombre de peptides permettant d’obtenir la fréquence ou l’intensité de réponse souhaitées sont déterminés à l’aide du profil de réponse des peptides dans le groupe de référence des exemples tel que présenté dans le [Tableau 2]et le[Tableau 3], respectivement pour la NP et la GP. La fréquence et l’intensité de réponse de la composition sont déterminées pour la protéine NP ou GP, en ajoutant les fréquences ou les intensités obtenues pour chacun des peptides NP ou GP présent dans la composition.

A titre d’exemple illustratif de compositions préférées selon l’invention, on peut citer :
a) la composition comprenant :
- un premier peptide NP de séquence SEQ ID NO : 8 ;
- un deuxième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 12 ;
- un troisième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 16 ; et
- un quatrième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 23 ou 24 ; ou un quatrième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 3 ou 15 et un cinquième peptide NP de séquence SEQ ID NO : 13 ; de préférence comprenant les peptides NP de séquence SEQ ID NO : 8, 12, 16 et 23 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeursin vitrode 100 % et une intensité de réponse de 20 % dans un groupe de référence
;
b) la composition comprenant :
- un premier peptide GP de séquence SEQ ID NO : 31 ;
- un deuxième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 33, 42, 54, 55 ou 57 ;
- un troisième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 29, 32, 50, 51 ou 53 ;
- un quatrième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 50 ou 53
- un cinquième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 37 ou 57 ; et éventuellement
- un sixième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 33 ou 49 et
- un septième peptide GP de séquence SEQ ID NO : 29, 32, 34, 35, 37, 39, 42, 43, 52, 53, 56 ou 57 ; de préférence les peptides GP de séquence SEQ ID NO : 29, 31, 33, 37 et 53 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 23 % contre la GP dans un groupe de référence
;
c) la composition comprenant les peptides NP de séquence SEQ ID NO : 3, 6, 8, 12, 16, 17, 19, 23 et 24 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 50 % dans un groupe de référence;
d) la composition comprenant les peptides GP de séquence SEQ ID NO : 29, 31, 33, 35, 37 42, 43 et 53 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 50 % contre la GP dans un groupe de référence ;
- la composition comprenant les peptides NP de séquence SEQ ID NO :8 , 9 et 17 ; de préférence les peptides NP de séquence SEQ ID NO : 5, 8, 9, 17 et 19 ; cette composition comprend des peptides conservés dans les différentes souches d’Ebola et est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 75 % et une intensité de réponse de respectivement 18.5 % et 28 % contre la NP dans un groupe de référence.

Ces exemples qui sont donnés uniquement à titre illustratif ne sont pas limitatifs et d’autres compositions induisant des fréquences et des intensités de réponse équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons de peptides, déterminées à partir des profils de réponse des peptides NP et GP présentées au [Tableau 2] et au [Tableau 3].

Selon un mode de réalisation de l’invention, ladite composition selon l’invention comprend au moins :
(a) un peptide isolé ou un mélange de peptides comprenant ledit ou lesdits peptide(s) NP (premier peptide), et éventuellement ledit ou lesdits peptides GP (deuxième peptide) et/ou troisième peptide(s), éventuellement modifié(s) ;
(b) un polypeptide comprenant au moins un des peptides définis en (a), notamment un polypeptide issu de la protéine NP de séquence SEQ ID NO : 1 ou un polypeptide issu de la protéine GP de séquence SEQ ID NO : 25 ; ledit polypeptide pouvant être éventuellement modifié ;
(c) un polypeptide multiépitopique chimérique comprenant au moins un des peptides définis en (a) ; ledit polypeptide pouvant être éventuellement modifié ;
(d) une protéine de fusion comprenant au moins un des peptides définis en (a); ladite protéine de fusion pouvant être éventuellement modifiée ;
(e) un polynucléotide codant pour au moins peptide, polypeptide, protéine de fusion définis en (a) à (d), éventuellement inséré dans un vecteur, en particulier un vecteur d’expression ; ou
(f) un mélange dudit ou desdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) de fusion et/ou polynucléotide(s) définis en (a) à (e).

Par exemple, la composition comprend un mélange de peptides ; un polypeptide issu de la NP ou de la GP ou un mélange desdits polypeptides; un mélange de peptides et de polypeptides ; un polynucléotide ou un mélange de polynucléotides.

Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, la composition immunogène ou vaccinale comprend au moins un peptide NP isolé, et éventuellement au moins un peptide GP isolé, de préférence un mélange d’au moins 2, de préférence 4 à 10 (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) ou plus desdits peptides NP, et éventuellement GP.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, la composition immunogène ou vaccinale comprend au moins un polypeptide issu de la protéine NP de séquence SEQ ID NO : 1 comprenant au moins un peptide NP, et éventuellement au moins un polypeptide issu de la protéine GP de séquence SEQ ID NO : 25 comprenant au moins un peptide GP. De préférence ledit polypeptide comprend au moins deux peptides NP ou GP, de préférence 3 à 5 (3, 4, 5) ou plus desdits peptides.

Ledit polypeptide issu de la NP est avantageusement un polypeptide d’au plus 100 acides aminés issu de la NP de séquence SEQ ID NO : 1, comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences telles que définies ci-dessus. Ledit peptide consiste avantageusement en une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés, possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins un polypeptide issu de ladite NP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 59 à 66.

A titre d’exemple illustratif de composition préférée selon l’invention, on peut citer la composition comprenant le peptide NP de séquence SEQ ID NO : 12 et les polypeptides NP de séquence SEQ ID NO : 61 et 62 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 29 % .

Cet exemple qui est donné uniquement à titre illustratif n’est pas limitatif et d’autres compositions induisant des fréquences et des intensités de réponse équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons de peptides et/ou polypeptides NP, déterminées à partir des profils de réponse des peptides NP présentés au [Tableau 2] et des séquences des peptides et polypeptides de la NP présentés au [Tableau 6].

Ledit polypeptide issu de la GP est avantageusement un polypeptide d’au plus 100 acides aminés issu de la GP de séquence SEQ ID NO : 25, comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences les séquences SEQ ID NO : 26, 27 et 29 à 58 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences telles que définies ci-dessus. Ledit peptide consiste avantageusement en une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 25 ou une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés, possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 25.

Selon un mode de réalisation préféré de l’invention, ladite composition comprend au moins un polypeptide issu de ladite GP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 67 à 74.

A titre d’exemple illustratif de composition préférée selon l’invention, on peut citer la composition comprenant les polypeptides GP de séquence SEQ ID NO : 68, 69 et 73 ; cette composition est apte à induire une fréquence de répondeurs in vitro de 100 % et une intensité de réponse de 41 % .

Cet exemple qui est donné uniquement à titre illustratif n’est pas limitatif et d’autres compositions induisant des fréquences et des intensités de réponse équivalentes peuvent être aisément obtenues avec d’autres combinaisons de peptides et/ou polypeptides GP, déterminées à partir des profils de réponse des peptides GP présentés au [Tableau 3]et des séquences des peptides et polypeptides de la NP présentés au [Tableau 7].

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, la composition immunogène ou vaccinale comprend un polypeptide multiépitopique chimérique comprenant au moins deux peptides NP ou au moins un peptide NP et un peptide GP ou un troisième peptide tels que définis ci-dessus. On définit ici un polypeptide chimérique comme une succession d’acides aminés qui n’est pas présente dans la nature. Un polypeptide multiépitopique chimérique selon l’invention comprend au moins deux peptides que défini ci-dessus, les séquences desdits peptides étant dans ledit polypeptide, adjacentes, liées par un élément de liaison ou séparées par une séquence comprenant un autre épitope. L’autre épitope est notamment un autre épitope T CD4+, un épitope T CD8+ ou un épitope B de la NP et/ou de la GP du virus Ebola, ou bien un épitope d’un antigène d’un autre pathogène, notamment un virus de fièvre hémorrhagique. Parmi les épitopes B de la NP du virus Ebola on peut citer les peptides 173-187, 361-375, 365-379, 381-395, 417-431, 425-439, 485-499 et 505-515 d’EBOV, lesdites positions étant indiquée en référence à la séquence SEQ ID NO : 1. Parmi les épitopes B de la GP du virus Ebola on peut citer les peptides 41-55, 52-66, 93-107, 112-126, 201-215, 217-231, 221-235, 225-239, 236-250, 301-305, 309-323, 317-331, 321-335, 325-339, 329-343, 333-347, 337-351, 341-355, 345-359, 381-395, 385-399, 389-403, 393-407, 397-411 et 469-483 d’EBOV, lesdites positions étant indiquée en référence à la séquence SEQ ID NO : 25. Le polypeptide multiépitopique peut également comprendre plusieurs copies d’une même séquence de peptide/épitope. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide multiépitopique comprend moins de 100 acides aminés consécutifs de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 et/ou de la GP de séquence SEQ ID NO : 25, de préférence moins de 50, de manière préférée moins de 30. Le polypeptide multiépitopique présente une longueur de 20 à 200 acides aminés, de préférence de 30 à 100 acides aminés, de manière préférée d’environ 50 acides aminés.

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, ledit peptide ou polypeptide tel que défini ci-dessus est un peptide ou un polypeptide modifié comprenant une modification au niveau de résidu(s) d’acide aminé, de la liaison peptidique ou de ses extrémités et ledit peptide ou polypeptide modifié conservant ses propriétés de peptide immunogène de la NP ou de la GP du virus Ebola telles que définies ci-dessus, c’est-à-dire qu’il est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4⁺humains spécifiques. Cette ou ces modification(s), de préférence une ou des modification(s) chimique(s), qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l’homme du métier, incluent de façon non-limitative l’une au moins des modifications chimiques suivantes : l’acétylation du résidu d’acide aminé N-terminal et/ou l’amidation du résidu d’acide aminé C-terminal (Maillère et al., Molecular Immunology, 1195, 32, 1377-1385), la substitution d’un acide aminé par un acide aminé non-protéinogénique (acide aminé D ou analogue d’acide aminé); l’addition de groupement chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d’une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (–CO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d’un peptide (épitope d’intérêt pour la vaccination); la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d’une protéine, notamment une chaîne α d’une molécule HLA I ou HLA II, une chaîne β d’une molécule HLA II ou le domaine extracellulaire de ladite chaîne, ou bien encore une séquence de ciblage de l’endosome dérivée notamment de la chaîne invariable Ii ou de la protéine LAMP-1 ; et le couplage à une molécule appropriée. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité et plus particulièrement la résistance à la protéolyse, ainsi que la solubilité ou l’immunogénicité du peptide ou polypeptide selon l’invention.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ou polypeptide modifié, il comprend une ou plusieurs N6-acetyl-lysine(s), phosphoserine(s) et/ou phosphothreonine(s).

Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide ou polypeptide modifié comprend l’acétylation de son résidu d’acide aminé N-terminal et/ou l’amidation de son résidu d’acide aminé C-terminal.

Selon un autre mode de réalisation avantageux, ledit peptide ou polypeptide modifié est un lipopeptide ou un lipopolypeptide. Ledit lipopeptide ou un lipopolypeptide peut être obtenu, notamment par addition d’un lipide sur une fonction α-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d’un acide aminé dudit peptide ou polypeptide; il peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d’acides gras en C_4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d’un stéroïde. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe N^α-acétyl-lysine N^ε(palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam).

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux, le ou lesdits peptides NP, et éventuellement le ou lesdits peptides GP sont inclus dans une protéine de fusion (protéine chimérique) comprenant ledit ou lesdits peptides fusionnés avec une protéine hétérologue (différente de la NP ou de la GP) ou un fragment polypeptidique hétérologue (fragment d’une protéine différente de NP ou de la GP dont la séquence n’est pas directement adjacente à la séquence dudit peptide dans la séquence de ladite NP ou GP). Ledit ou lesdits peptides peuvent être fusionnés avec l’extrémité NH₂ou COOH de ladite protéine ou dudit fragment polypeptidique hétérologue ou insérés dans la séquence de ladite protéine ou dudit fragment.

Selon une disposition avantageuse, ladite protéine chimérique est constituée par un ou plusieurs peptides tels que défini ci-dessus, fusionnés avec l’une des chaînes d’une molécule HLA, de préférence la chaîne béta d’une molécule HLA II ou la chaîne alpha d’une molécule HLA I, ou bien avec un fragment de celle-ci correspondant à une molécule HLA soluble, notamment un fragment correspondant au domaine extracellulaire précédé du peptide signal homologue ou d’un peptide signal hétérologue. Ledit peptide est avantageusement inséré entre le peptide signal et l’extrémité NH₂du domaine extracellulaire de la chaîne α ou β, comme décrit pour la molécule HLA-DR ( Kolzinet al., PNAS, 2000, 97, 291-296).

La présente invention a également pour objet une composition immunogène ou vaccinale comprenant au moins un polynucléotide codant pour au moins un peptide, polypeptide, et/ou ou protéine chimérique tels que définis ci-dessus.

Conformément à l’invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l’ADNc codant pour ledit ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), et/ou ou protéine(s) chimériques. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l’usage des codons soit optimal chez l’hôte dans lequel elle est exprimée.

Ces polynucléotides peuvent être insérés dans un vecteur d’expression, sous le contrôle transcriptionnel d’un promoteur approprié, pour permettre l’expression du ou desdits peptide(s) ou polypeptide(s) conforme à l'invention dans une cellule de l’hôte.

De nombreux vecteurs sont connus en eux-mêmes ; le choix d’un vecteur approprié dépend de l’utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d’intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l’hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des acides nucléiques nus (ADN ou ARN) ou des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d’intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu’un transporteur comme un nanotransporteur ou une préparation de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l’introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l’électroporation ou la microinjection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l’électroporation associée à des liposomes.

De préférence, ledit vecteur est un vecteur d’expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression du peptide, polypeptide, protéine de fusion tels que définis ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d’expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d’épissage).

Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, ladite composition comprend au moins un polynucléotide codant ledit ou lesdits peptide(s), polypeptide(s), et/ou protéine(s) de fusion tels que définis ci-dessus, inséré dans un acide nucléique nu, de préférence un ADN nu.

D’autres compositions conformes à l'invention peuvent également comprendre une cellule présentatrice d’antigène modifiée, comprenant au moins un peptide, polypeptide, protéine chimérique, polynucléotide et/ou un vecteur tels que définis ci-dessus, la cellule pouvant être modifiée de façon stable ou transitoire. La cellule est notamment une cellule présentatrice d’antigène naturelle telle qu’une cellule dendritique ou une cellule présentatrice de l’antigène artificielle, telle que des exosomes dérivés de cellules dendritiques. La composition selon l’invention peut comprendre une cellule dendritique chargée avec au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique selon l’invention, ou transformée avec au moins un polynucléotide ou un vecteur selon l’invention.

La composition immunogène ou vaccinale selon l’invention comprend avantageusement un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse et/ou un adjuvant.

Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés.

Les adjuvants sont avantageusement choisis parmi: les émulsions huileuses, les substances minérales, les extraits bactériens, les oligonucléotides contenant des CpG, la saponine, l’hydroxyde d’alumine, le monophosphoryl –lipide A et le squalène.

Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nano-particules.

La composition conforme à l’invention peut comprendre en outre des adjuvants habituellement utilisés dans les vaccins, et permettant par exemple de favoriser l’administration du principe actif, de le stabiliser, d’augmenter son immunogénicité.

La composition immunogène ou vaccinale comprend une dose efficace d’un ou plusieurs peptide(s), polypeptide(s), protéine(s), polynucléotide(s), et/ou vecteur(s), permettant d'obtenir un effet préventif sur une infection par un virus Ebola. Cette dose est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l’âge, le sexe et le poids du sujet. La composition est généralement administrée selon les protocoles usuels de vaccination, à des doses et pendant une durée suffisante pour induire une réponse cellulaire en lymphocytes T CD4+ dirigés contre la protéine NP, et éventuellement contre la protéine GP (lorsque la composition comprend des peptides immunogènes de la GP). L'administration peut être orale, parentérale ou locale, de préférence par injection, notamment sous-cutanée ou intramusculaire, La composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie.

La composition selon la présente invention est avantageusement utilisée comme vaccin pour la prévention des infections par le virus Ebola, notamment Ebola Zaïre, Soudan, Reston, Bundibuygo et Tai Forest ; de préférence Ebola Zaïre.

La présente invention a également pour objet une méthode de vaccination contre le virus Ebola, caractérisée en ce qu’elle comprend l’administration d’une composition vaccinale telle que définie ci-dessus, à un individu, par tout moyen approprié tel que défini ci-dessus.

L’administration de la composition selon l’invention à un individu, induit une réponse une réponse cellulaire en lymphocytes T CD4+ dirigés contre la protéine NP, et éventuellement contre la protéine GP (lorsque la composition comprend des peptides immunogènes de la GP). L’individu est de préférence un individu humain.

Selon un mode de réalisation, ladite composition immunogène ou vaccinale est utilisée en combinaison avec une autre composition vaccinale contre le virus Ebola, notamment une composition comprenant une protéine recombinante GP ou un vecteur codant ladite protéine. Lesdites compositions vaccinales sont utilisées simultanément, séparément ou de façon séquentielle.

La présente invention a également pour objet l’utilisationin vitrode la composition telle que définie ci-dessus comme réactif pour le diagnostic d’une infection par le virus Ebola.

La présente invention a également pour objet l’utilisationin vitrode la composition elle que définie ci-dessus comme réactif pour l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola chez un individu ayant été exposé au virus Ebola ou ayant été vacciné contre le virus Ebola.

La présente invention a également pour objet une méthodein vitro, d'immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola chez un individu ayant été exposé au virus Ebola ou ayant été vacciné contre le virus Ebola, caractérisée en ce qu’elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu comprenant des lymphocytes T CD4+ avec une composition selon l’invention telle que définie ci-dessus, et
- la détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus Ebola, par tout moyen approprié.

L’individu est de préférence un individu humain. L’échantillon biologique est notamment du sang total, des cellules mononucléées du sang périphériques (PBMC) isolés, des lymphocytes ou des lymphocytes T CD4+ isolés, notamment à partir de PBMC.

La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic ou d’immunomonitorage comprenant la composition telle que définie ci-dessus. De préférence, ledit réactif comprend au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique tels que définis ci-dessus, par exemple marqué et/ou complexé à une molécule HLA, notamment complexé à des molécules HLA marquées, par exemple biotinylées, sous la forme de complexes multimériques HLA/peptide tels que des tétramères de complexes HLA/peptide, marqués. De préférence, ledit réactif est inclus dans un coffret (kit).

La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé d’analyse de lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus Ebola, caractérisé en ce qu’il comprend au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact,in vitro,d'un échantillon cellulaire comprenant des lymphocytes T CD4+ avec des complexes multimériques HLA /peptide, marqués, notamment par un fluorochrome, lesdits complexes étant formés par la liaison de molécules HLA solubles avec au moins un peptide, polypeptide ou protéine chimérique issu de la NP ou GP du virus Ebola Zaïre selon l’invention, et
- l’analyse des cellules liées auxdits complexes HLA I/peptide, notamment en cytométrie de flux.

Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l’analyse des cellules (lymphocytes T CD4+) comprend le tri desdites cellules.

La présente invention a également pour objet un peptide immunogène de la protéine NP du virus Ebola Zaïre apte à induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humain spécifiques tel que définis ci-dessus.

Selon un mode de réalisation de l’invention, ledit peptide NP est sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, il s’agit d’un polypeptide d’au plus 100 acides aminés issu de la NP de séquence SEQ ID NO : 1, comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2 à 24 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences telles que définies ci-dessus. Ledit peptide consiste avantageusement en une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 1 ou une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés, possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1. De préférence, ledit polypeptide issu de ladite NP est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 59 à 66.

La présente invention a également pour objet un peptide immunogène de la protéine GP du virus Ebola Zaïre apte à induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humain spécifiques tel que définis ci-dessus, ledit peptide GP étant sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 26, 27, 30, 31, 33, 34, 36, 38 à 44, 46 à 53 et 56 à 58 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.

Selon un autre mode de réalisation de l’invention, il s’agit d’un polypeptide d’au plus 100 acides aminés issu de la GP de séquence SEQ ID NO : 25, comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 26, 27, 30, 31, 33, 34, 36, 38 à 44, 46 à 53 et 56 à 58 et les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences ou une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences telles que définies ci-dessus. Ledit peptide consiste avantageusement en une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO : 25 ou une séquence de 20 à 100 acides aminés (20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 ou 90, 95 ou 100), de manière préférée de 30 à 70 acides aminés, possédant au moins 70%, d’identité, de préférence au moins 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% ou 99% % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 25. De préférence, ledit polypeptide issu de ladite GP est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 67 à 74.

La présente invention a également pour objet un polypeptide multiépitopique chimérique ou une protéine chimérique comprenant au moins un peptide NP et/ ou GP tel que défini ci-dessus, ainsi qu’un polynucléotide codant au moins un peptide NP et/ ou GP, un polypeptide multiépitopique chimérique et/ou ou une protéine chimérique comprenant au moins un peptide NP et/ ou GP tels que défini ci-dessus, éventuellement inséré dans un vecteur d’expression tel que défini ci-dessus, notamment un vecteur viral ou un acide nucléique nu tels que définis ci-dessus.

Les peptides et leurs dérivés tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'homme du métier. Par exemple, les peptides et leurs dérivés peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) ou en phase liquide, et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse. Les lipopeptides peuvent être notamment préparés selon le procédé décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. Les peptides et t leurs dérivés tels que définis ci-dessus peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l’homme du métier ; l’ADNc est cloné dans un vecteur d’expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d’affinité.

Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes. Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.

La présente invention sera mieux comprise à l’aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l’identification et la caractérisation des peptides immunogènes issus de la nucléoprotéine et de la glycoprotéine du virus Ebola Zaïre selon la présente invention, ainsi qu’aux figures annexées, sur lesquels :

Figure 1

montre le taux de réponse et l’intensité de réponse des lymphocytes T CD4+ vis-à-vis des peptides de la NP. A. Nombre de donneurs répondeurs pour chacun des peptides de 20-mers NP testés. B. Nombre de lignées de lymphocytes T positives pour chacun des peptides de 20-mers NP testés.

Figure 2

montre le taux de réponse et l’intensité de réponse des lymphocytes T CD4+ vis-à-vis des peptides de la GP. A. Nombre de donneurs répondeurs pour chacun des peptides de 20-mers GP testés. B. Nombre de lignées de lymphocytes T positives pour chacun des peptides de 20-mers GP testés.

Figure 3

montre un exemple de combinaisons de peptides de la NP. A. Pourcentage de donneurs répondeurs en fonction du cumul de peptides. B. Intensité de réponse (en % de lignées positives) en fonction du cumul de peptides.

Figure 4

montre un Exemple de combinaisons de peptides de la GP. A. Pourcentage de donneurs répondeurs en fonction du cumul de peptides. B. Intensité de réponse (en % de lignées positives) en fonction du cumul de peptides.

Figure 5

montre un exemple de combinaisons de longs fragments peptidiques (LSP) issus de la NP. A. Pourcentage de donneurs répondeurs en fonction du cumul de LSP. B. Intensité de réponse (en % de lignées positives) en fonction du cumul de LSP.

Figure 6

montre un exemple de combinaisons de longs fragments peptidiques (LSP) issus de la GP. A. Pourcentage de donneurs répondeurs en fonction du cumul de LSP. B. Intensité de réponse (en % de lignées positives) en fonction du cumul de LSP.

EXEMPLES

Matériels et méthodes

1.Design et production des peptides

Les séquences de la NP (UniProt AAD14590.1 ; SEQ ID NO : 1) et de la GP (UniProt AKG65268.1 ; SEQ ID NO : 25) du virus Ebola proviennent du Centre américain pour les informations biotechnologiques (NCBI). La souche Zaïre de 1976 a été utilisée (ZEBOV). Les peptides ont été sélectionnés à l’aide de l’outil de prédiction de liaison au CMH-II, issu de la base de données IEDB (http://www.iedb.org/). Les algorithmes NetMHCIIpan et Sturniolo ont été utilisés pour prédire la capacité de liaison d’un peptide donné aux molécules HLA de classe II sélectionnées. Des peptides de 20-mers contenant les cœurs proches ont ensuite été définis, de manière à ce que les cœurs ne soient pas en position 1 ou en position 20 du peptide. Les peptides de 20-mers ont été synthétisés par Pepscan (Pays-Bas), avec une pureté minimale de 80%.
2.Préparation des cellules

Les prélèvements sanguins (Couche leuco plaquettaire) proviennent de l’Établissement Français du Sang (Centre de Rungis). Les cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) ont été isolées par gradient de ficoll. Les cellules dendritiques (DC) immatures ont été obtenues à partir des PBMC par différenciation des cellules adhérentes après 5 jours de culture en milieu AIM-V contenant 1000 U/ml d’IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF (R&D Systems). Les DC matures ont été obtenues à partir des DC immatures après avoir été cultivées pendant deux jours en présence de LPS. Les lymphocytes T CD4⁺ont été purifiés à partir des PBMC à l’aide de microbilles magnétiques couplées à des anticorps anti-CD4 (Miltenyi Biotec). Le génotypage des donneurs a été réalisé par NGS par la société DKMS Life Science (Dresden, Allemagne).
3.Obtention de lignées de lymphocytes T CD4 ⁺ spécifiques des peptides

Les lymphocytes T CD4⁺(1 à 3 X 10⁵) ont été mis en culture en plaque 96 puits à fond rond avec des DC matures autologues préalablement chargées avec des pools de peptides (10 µg/ml). La culture est faite dans du milieu IMDM supplémenté par du Sérum AB (milieu IMDM complet) contenant 1000U/ml d’IL-6 (R&D Systems) et 10ng/ml d’IL-12 (R&D Systems). 25 lignées lymphocytaires ont été ensemencées pour chaque pool de peptides. La culture est stimulée au bout d’une semaine par ajout de 10000 à 30000 DC chargées avec les pools de peptides, de 20U/ml d’IL-2 (R&D Systems) et de 10ng/ml d’IL-7 (R&D Systems). Une autre stimulation est faite après 14 et 21 jours de culture. Entre 5 et 7 jours après la dernière stimulation, un test de spécificité est réalisé par ELISpot. Chaque puits de culture constitue une lignée de lymphocytes T CD4⁺.
4.Evaluation de la spécificité de Lymphocytes T CD4 cultivés avec les peptides par ELISpot

Des anticorps anti-IFN-γ humain (clone 1-D1K, Mabtech, Suède) ont été adsorbés à 2,5µg/ml en PBS 1X (Mabtech) sur des plaques 96 puits Multiscreen HA (Millipore). Après une nuit d’incubation à 4°C, les plaques ont été saturées en les incubant 2 heures à 37°C avec du milieu l’IMDM complet. Les lymphocytes T CD4⁺ont été incubés pendant 16 heures à 37°C dans ces plaques après avoir été lavés dans du milieu AIM-V contenant 0,5ng/ml d’IL-7, en présence de cellules présentatrices (50000 PBMC/puits) incubés en présence de 10µg/ml de peptides. Après l’incubation, les plaques ont été lavées avec de l’eau distillée, du PBS /Tween 0,05% et enfin du PBS. L’anticorps anti-IFN-γ humain 7-B6-1 biotinylé (Mabtech) à 0,25µg/ml en PBS 1X/BSA 1% a été ajouté dans les plaques (100µL/puits) puis incubé 1h30 à 37°C. Après plusieurs lavages en PBS ou PBS/tween 0,05%, la sécrétion d’IFN-γ a été mise en évidence par l’ajout de l’Extravidine-Phosphatase Alcaline et du substrat NBT/BCIP (Sigma-Aldrich, France). Après 5 à 10 minutes d’incubation, la réaction a été stoppée par lavage à l’eau courante. Après séchage, les spots, reflétant la sécrétion d’IFN- γ par chaque lymphocyte T CD4⁺activé, ont été comptés sur un lecteur ELISpot (AID). Une lignée de lymphocytes T CD4⁺est considérée comme spécifique de l’antigène si le nombre de spots dans les puits contenant l’antigène est au moins deux fois plus élevé que le puits ne contenant pas l’antigène, la différence entre les deux types de puits étant au moins supérieure à 25.

Résultats

1.Sélection des peptides par prédiction in silico

Les peptides ont été sélectionnés à l’aide de l’outil de prédiction de liaison au CMH-II, issu de la base de données IEDB (http://www.iedb.org/). Seules les molécules HLA-DR les plus abondamment exprimées à la surface des Cellules Présentatrices d’Antigène (CPA) ont été étudiées. Les allèles DRB1 parmi les plus fréquents dans différentes populations [Tableau 1] ont été sélectionnés.

[Tableau 1] : Fréquence allélique (%) des principales molécules HLA-DRB1 (données issues de www.allefrequencies.net )
Les allèles sélectionnés sont indiqués en gras.

Les allèles HLA-DRB3*01:01, HLA-DRB3*02:02, HLA-DRB4*01:01 et HLA-DRB5*01:01 ont été ajoutées. Ainsi, 15 allèles HLA-DR, représentatifs des populations Caucasienne et Africaine, cités ci-après ont été sélectionnés : HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*03:01, HLA-DRB1*04:01, HLA-DRB1*04:05, HLA-DRB1*07:01, HLA-DRB1*08:02, HLA-DRB1*09:01, HLA-DRB1*11:01, HLA-DRB1*12:01, HLA-DRB1*13:01, HLA- DRB1*15:01, HLA-DRB3*01:01, HLA-DRB3*02:02, HLA-DRB4*01:01 et HLA-DRB5*01:01.
Les algorithmes NetMHCIIpan et Sturniolo ont permis de prédire la capacité de liaison d’un peptide donné aux molécules HLA de classe II sélectionnées. Pour chaque peptide, un rang est déterminé, son affinité prédite étant comparée à celle de 200000 peptides naturels. Dans notre cas, les peptides de 9-mers (coeur) avec un rang inférieur à 10% pour au moins 4 allèles HLA-DR, ou les peptides ayant un rang inférieur à 5% pour au moins 1 allèle ont été sélectionnés. Des peptides de 20-mers contenant les cœurs proches ont ensuite été définis, de manière à ce que les cœurs ne soient pas en position 1 ou en position 20 du peptide. 23 peptides 20-mer pour la NP et 33 peptides 20-mer pour la GP ont été sélectionnés pour être testésin vitro.
2.Obtention de lignées de lymphocytes T CD4 ⁺ spécifiques de la NP et de la GP de ZEBOV

16 donneurs sains comportant des molécules HLA variées et représentatives de la population caucasienne ont été sélectionnés. Des lignées de lymphocytes T CD4⁺ont été obtenues par co-culture des lymphocytes T CD4⁺avec des cellules dendritiques autologues préalablement chargées avec des pools de peptides. Après amplification des lymphocytes T, chaque lignée a été testée par ELISpot pour sa capacité à reconnaitre des pools de peptides puis dans un second test, les peptides individuels contenus dans le pool reconnu par les lignées. Afin de s’assurer de la capacité de chaque donneur à pouvoir répondre, des lignées lymphocytaires CD4⁺spécifiques d’un pool de peptides spécifiques du Cytomegalovirus, Epstein-barr et de la grippe ont également été produites.

Le Le[Tableau 2 ]et le[Tableau 3]présentent les réponses individuelles en lymphocytes T CD4+ spécifiques contre des différents peptides de la NP et de la GP d’Ebola respectivement. Les lignées de lymphocytes T CD4 ont été obtenues par stimulationin vitropar des cellules dendritiques préalablement chargées avec les peptides de la NP ou de la GP. La spécificité pour ces peptides a été évaluée par Elispot IFNγ. Le[Tableau 2 ]et le[Tableau 3]indiquent le taux de répondeurs (en %) et l’intensité de réponse (pourcentage de lignées positives) pour chacun des peptides.

[Tableau 2]: Réponse individuelle des lymphocytes T CD4 contre les peptides NP

[Tableau 3] : Réponse individuelle des lymphocytes T CD4+ contre les peptides GP

Il est à noter que seul un peptide (GP18-37) n’induit de réponse chez aucun des donneurs. Pour chaque peptide, l’intensité de réponse est variable en fonction des donneurs, de 1 à 14 lignées positives. Par ailleurs, le nombre de lignées positives totales par donneur est également extrêmement variable, de 1 à 83 et de 1 à 105 pour la NP et la GP respectivement.

Les résultats obtenus sont très hétérogènes en fonction des peptides étudiés. Dans le cadre de la vaccination contre le virus Ebola, il est nécessaire de sélectionner les peptides qui permettent d’induire une réponse cellulaire importante chez un maximum d’individus. Les données peuvent donc être analysées selon deux paramètres : le taux (nombre de donneurs répondeurs) [Fig.1A] et [Fig.2A] et l’intensité (nombre de lignées totales positives) de réponse pour chaque peptide [Fig.1B] et [Fig.2B] pour les peptides issus de la NP et la GP respectivement. Dix peptides pour la NP et 8 pour la GP induisent des réponses chez 50% des donneurs ou plus. On peut noter une bonne corrélation entre taux et intensité de réponse, en particulier pour la NP. En effet, les peptides répondant chez le plus grand nombre de donneurs sont également ceux pour lesquels le nombre de lignées positives est le plus élevé. Ces peptides peuvent donc permettre une bonne couverture de la population, tout en induisant une réponse efficace.

Les peptides identifiés et étudiés sont issus de la souche Zaïre du virus Ebola. La conservation de la séquence peptidique entre les différentes souches du virus Ebola a été étudiée pour les peptides présentant un fort taux de réponse. Les résultats sont représentés en pourcentage d’identité de séquence par rapport à la souche Zaïre. Le pourcentage d’identité des peptides entre les différentes souches est plus élevé pour les peptides de la NP que de la GP [Tableau 4 ] et [Tableau 5].Ces peptides, en particulier les peptides NP, devraient ainsi pouvoir être utilisés dans une composition vaccinale pour l’ensemble des souches du virus Ebola.

[Tableau 4] : Conservation des séquences des peptides issus de la NP entre les différentes souches du virus Ebola

[Tableau 5] : Conservation des séquences des peptides issus de la GP
entre les différentes souches du virus Ebola
3.Sélection des peptides d’intérêt
a) Combinaison de peptides de 20-mer

Les résultats obtenus ici montrent que tous les donneurs testés peuvent développer une réponse des lymphocytes T CD4 vis-à-vis des protéines virales NP et GP. Néanmoins, les peptides permettant cette réponse varient en fonction des individus. Dans le but d’optimiser une composition vaccinale, il est nécessaire de déterminer un cocktail minimal de peptides permettant de couvrir l’ensemble de la population. Ainsi, on peut observer que 4 peptides issus de la NP, et 5 peptides de la GP permettent d’obtenir cette couverture, tout en induisant une intensité de réponse de 20% pour la NP et 23% pour la GP ( et [Fig. 4] respectivement). L’ajout de peptides supplémentaires permet alors de gagner en intensité de réponse. Cette exemple est non-limitatif, d’autres combinaisons de peptides permettant d’induire un taux de réponse de 100 % dans le groupe d’individus étudié peuvent être sélectionnées à partir des taux de réponse des peptides NP et GP présentées aux [Tableau 2] et [Tableau 3].
b) Combinaison de longs fragments d’intérêt

De manière à limiter le nombre de peptides, il est possible de définir des longs fragments peptidiques (LSP) couvrant les 20-mers identifiés. Ceux-ci sont construits de manière à regrouper les peptides 20-mers chevauchants et d’intérêt [Tableau 6] et [Tableau 7].

[Tableau 6] : Longs fragments peptidiques issus de la NP

[Tableau 7] : Longs fragments peptidiques issus de la GP

Par exemple, les peptides NP14-33, NP27-46 et NP39-58 peuvent être regroupés sous la forme du LSP NP14-58. Ces LSP peuvent ensuite être combinés, de manière à obtenir une couverture de donneurs optimale. On voit alors que 3 LSP pour la NP (NP226-290, NP147-207, NP205-224) comme pour la GP (GP123-186, GP31-79, GP545-595) permettent de couvrir l’ensemble des donneurs testés, avec une intensité de réponse de 29% et 41% respectivement (F igures 5 et 6, respectivement). L’ajout d’autres LSP, sans augmenter le taux de réponse permet d’amplifier l’intensité de réponse. A partir des résultats obtenus pour les 20-mers, il est possible définir d’autres LSP et d’autres combinaisons de LSP.

Conclusion
Des peptides capables de stimuler des lymphocytes T CD4⁺spécifiques du virus Ebola chez un panel de donneurs sains représentatif des populations caucasienne et africaine (groupe de référence) ont été identifiés dans la NP et la GP du virus Ebola Zaïre. Les réponses contre les peptides issus de la NP sont plus intenses que celles contre les peptides de la GP, aussi bien en termes de nombre de donneurs répondeurs, qu’en termes d’intensité de réponse (nombre de lignées positives). Dix peptides pour la NP et 8 pour la GP induisent des réponses chez 50% des donneurs ou plus. On peut également noter une bonne corrélation entre taux et intensité de réponse, en particulier pour la NP. Ces peptides, en particulier les peptides NP, peuvent donc permettre une bonne couverture de la population, tout en induisant une réponse efficace. De plus les peptides de la NP sont globalement plus conservés et donc potentiellement efficaces contre les différentes souches d’Ebola. 4 peptides issus de la NP et 5 peptides de la GP permettent d’obtenir une couverture vaccinale optimale de la population étant donné qu’ils sont capables d’induire un taux de réponse de 100 % dans le groupe de référence, tout en induisant une intensité de réponse de 20% pour la NP et 23% pour la GP. En combinant plusieurs peptides dans de longs fragments polypeptidiques (LSP), 3 LSP pour la NP comme pour la GP, permettent de couvrir l’ensemble des donneurs testés avec une intensité de réponse de 29% et 41% respectivement. L’ajout d’autres peptides ou d’autres LSP, sans augmenter le taux de réponse permet d’amplifier l’intensité de réponse..

Claims (15)

1. Composition immunogène ou vaccinale contre le virus Ebola, comprenant au moins un premier peptide immunogène issu de la nucléoprotéine (NP) du virus Ebola Zaïre, qui est capable d’induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, ledit peptide étant sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 2 à 24, les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences qui possèdent au moins 85 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, et les séquences comprenant une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.
2. Composition selon la revendication 1, comprenant au moins un peptide de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23 et 24 ; de préférence, au moins un peptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 2, 3, 6, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 19, 23 et 24 ; de manière préférée, au moins un peptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 6, 8, 17, 19, 23 et 24.
3. Composition selon la revendication 2, comprenant au moins un peptide conservé de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 3, 5, 8, 9, 17, 19, 23 et 24 ; de préférence au moins un peptide conservé de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 5, 8, 9, 17 et 19 ; de manière préférée au moins un peptide conservé de ladite NP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 8, 9 et 17.
4. Composition, selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, comprenant au moins un deuxième peptide immunogène issu de la glycoprotéine (GP) du virus Ebola Zaïre, qui est apte à induire une réponse en lymphocytes T CD4+ humains spécifiques du virus Ebola, ledit peptide étant sélectionné dans le groupe constitué par : les séquences SEQ ID NO : 26, 27 et 29 à 58, les séquences comprenant au plus trois mutations d’acides aminés dans lesdites séquences qui possèdent au moins 85 % d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 25, et les séquences comprenant une délétion d’au plus trois acides aminés aux extrémités desdites séquences.
5. Composition selon la revendication 4, comprenant au moins un peptide de ladite GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 29, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 41, 42, 43, 48, 53 et 57; de préférence au moins un peptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 29, 31, 32, 33, 35, 37, 39, 42 et 43 ; de manière préférée, au moins un peptide choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31, 33, 35, 39, 42 et 43.
6. Composition selon la revendication 5, comprenant au moins un peptide conservé de ladite GP choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 31, 33 et 35; de préférence au moins un peptide conservé de ladite GP de séquence SEQ ID NO : 35.
7. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, comprenant au moins 4 desdits peptides de la NP et/ou de la GP, de préférence 4 à 10 ou plus desdits peptides.
8. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, qui est apte à induire une fréquence de répondeursin vitrod’au moins 75 %, de préférence de 100 %, et/ou une intensité de réponsein vitrod’au moins 20 %, de préférence d’au moins 50 %, dans un groupe de référence exprimant les allèles HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*03:01, HLA-DRB1*04:01, HLA-DRB1*07:01, HLA-DRB1*09:01, HLA-DRB1*11:01, HLA-DRB1*13:01, HLA-DRB1*15:01, HLA-DRB3*01:01, HLA-DRB3*02:02, HLA-DRB4*01:01 et HLA-DRB5*01:01.
9. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant au moins un troisième peptide immunogène choisi parmi un autre peptide immunogène du virus Ebola ou un peptide immunogène d’un autre pathogène.
10. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, comprenant au moins:
    a) un peptide isolé ou un mélange de peptides comprenant ledit ou lesdits premier peptide(s), et éventuellement ledit ou lesdits deuxième et/ou troisième peptide(s) ;
    b) un polypeptide comprenant au moins un des peptides définis en a), notamment un polypeptide issu de la NP de séquence SEQ ID NO : 1 ou de la GP de séquence SEQ ID NO : 25 ou un polypeptide multiépitopique chimérique ;
    c) une protéine de fusion comprenant au moins des peptides définis en a) ;
    d) un polynucléotide codant au moins un peptide, polypeptide, protéine de fusion défini en a) à c) ; ou un mélange dudit ou desdits peptide(s), polypeptide(s), protéine(s) de fusion et/ou polynucléotide(s) définis en a) à d).
11. Composition selon la revendication 10, dans laquelle ledit polynucléotide est sous forme d’acide nucléique nu.
12. Composition selon la revendication 10, comprenant au moins un polypeptide issu de ladite NP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 59 à 66.
13. Composition selon la revendication 10 ou 12, comprenant au moins un polypeptide issu de ladite GP sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 67 à 74.
14. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, pour son utilisation comme vaccin dans la prévention d’une infection par le virus Ebola.
15. Utilisationin vitrod’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, pour le diagnostic d’une infection par le virus Ebola ou l’immunomonitorage de la réponse cellulaire contre le virus Ebola.
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