CA2463705A1 - Procede de selection de ligands d'hla-dp4 et ses applications - Google Patents

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Abstract

Procédé de sélection de molécules ligand d'HLA-DP4 comprenant les étapes suivantes: (i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur de formule générale (I) Z1X1X2X3X4X5X6X7X8X9Z2, dans laquelle: Z1 et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés, X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien une cystéine, et X1 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X9 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien C, D, Q, S, T ou E, et X2,X3,X4,X5,X7 et X8 représentent chacun un acide aminé, en présence d e différentes concentrations de molécule(s) à tester, (ii) séparation des différents complexes formés, (iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur, et (iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de liaison IC50 < 1000 nM, et ses applications.

Description

PROCEDE DE SELECTION DE LIGANDS D'HLA-DP4 ET SES APPLICATIONS
La présente Invention est relative à un procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 et à ses applications.
Les lymphocytes T CD4+ font partie des principales cellules régu-latrices de la réponse immunitaire. Spécifiques des antigènes, ils sont en effet capables de reconnaître la présence d'un agent pathogène, d'un allergène ou d'une cellule tumorale et de déclencher une réponse immunitaire. La reconnaissance de ces anti-gènes conduit en effet à l'activation des lymphocytes T CD4+ qui sécrètent la plupart des cytokines nécessaires au recnitement de cellules effectrices que sont les lympho-cytes CD8+ cytotoxiques et les lymphocytes B producteurs d'anticorps. Les lympho-cytes T CD4+ interviennent également dans l'activation des cellules par des contacts cellulaires et par exemple induisent l'activation, par la molécule CD40, des cellules dendritiques présentatrices de l'antigène. L'activation des lymphocytes T CD4+
est un pronostic favorable lors des infections par des virus tels que le virus de l'immunodéfi-cience humaine (VIH), les papillomavirus humains (HPV) ou le virus de l'hépatite C
(HCV) et ces cellules apparaissent comme nécessaires à l'immunité anti-tumorale.
Leur rôle n'est toutefois pas systématiquement bénéfique pour l'organisme. Les mala-dies autoimmunes résultent très souvent d'une activation incontrôlée de lymphocytes T CD4+. C'est le cas de la sclérose en plaque et du diabète insulino-dépendant. Ces lymphocytes contribuent également à l'établissement des maladies allergiques.
L'IL4, qui est principalement sécrétée par les lymphocytes T CD4+, est en effet le principal facteur qui conduit à la production d'IgE. Enfin, le rôle des lymphocytes T
CD4+ dans le déclenchement du rejet de greffe est bien établi. Ainsi, selon la maladie, les traite-menu visent à déclencher l'activation des lymphocytes T CD4+. (vaccination contre un agent pathogène ou une cellule tumorale) ou à diminuer l'état d'activation des lympho-cytes T CD4+ (désensibilisation contre l'allergie, prévention du rejet de greffe).
L'activation des lymphocytes T CD4+ se fait sous l'effet de la pré-sentation de peptides antigéniques par les molécules du complexe majeur d'histo-compatibilité de type II que portent les cellules présentatrices d'antigène (APC pour Antigen Presenting Celn ; chez l'homme, elles sont dénommées molécules HLA II
pour Ha~man Leucocyte Antigen type II. Ces peptides antigéniques, appelés épitopes T,
2 résultent de la dégradation protéolytique des antigènes par les cellules présentatrices d'antigène. Ils ont des longueurs variables, généralement de 13 à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA II.
Il est bien connu qu'au même titre que l'antigène natif, un peptide épitope T est capable de stimuler in vitro des lymphocytes T CD4+ qui lui sont spécifiques ou de les recruter in vivo. Il est donc suffisant pour induire une réponse T CD4+. D'une manière intéres-sante, on sait également que selon les modes de présentation (voie d'administration, doses, adjonction ou non d'un adjuvant), la reconnaissance de ces peptides entraîne soit une activation des lymphocytes T CD4+ (ALEXANDER et al., J. Immacnol., 2000, 164, 1625-1633 ; DEL GUERCIO et al., Vaccine, 1997, 15, 441-448 ; FRANKE et al., Vaccine, 1999, 17, 1201-1205), soit leur anergie (MULLER et al., J. Allergy Clin.
Immunol., 1998, 101, 747-754 ; OLDFIELD et al., J. Immunol., 2001, 167, 1734-1739). Cés peptides épitopes T sont donc susceptibles à la fois de participer à la composition d'un vaccin ou de servir à diminuer l'activation non désirée de lympho-cytes T CD4+. Ils sont également susceptibles de participer à un test de diagnostic de l'état immunitaire de patients ou d'individus normaux reposant sur la détection directe (test de prolifération lymphocytaire) ou indirecte (production d'anticorps, de cyto-kines...) desdits lymphocytes T CD4+ activés.
Un des problèmes majeurs qui limite l'utilisation de ces peptides est l'identification de ces épitopes, étant donné que leur séquence varie d'un individu à
l'autre en raison du polymorphisme des molécules HLA II. En effet, les molécules HLA II sont des hétérodimères constituées d'une chaîne alpha (a) et d'une chaîne béta ((3) polymorphes. II existe quatre types de molécules HLA II par individu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP). La molécule HLA-DR dont la chaîne béta ((3) est codée par le gène DRB1 est la plus exprimée. A ce jour, la chaîne béta codée par le gène DRB 1 est la plus polymorphe et compte 273 allèles. Pour les molécules HLA-DQ
et HLA-DP, les deux chaînes (a et (3) qui les constituent sont polymorphes mais elles présentent moins d'allèles. On compte en effet 21 allèles DQA1 (chaîne a de HLA-DQ), 45 allèles DQB1 (chaîne (3 de HLA-DQ), 19 allèles DPA1 (chaîne a de HLA-DP) et 93 allèles DPB1 (chaîne (3 de HLA-DP). Cependant, la combinaison entre les deux chaînes a et ~i codées par ces allèles donne naissance à de nombreuses molécules
3 HLA-DQ et HLA-DP. Du fait de ce polymorphisme, ces isoformes possèdent des pro-priétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent lier des peptides différents d'un même antigène. Ainsi, chaque individu reconnaît dans un antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II
qui le caractérise. Comme il existe un grand nombre d'allèles I-ILA II, on peut supposer qu'il existe dans une séquence donnée un répertoire important de peptides épitopes T
de séquences très différentes, chacun spécifique d'un allèle différent.
Toutefois, cette diversité de molécules HLA II n'est pas aussi importante à l'échelle de chaque population qu'à l'échelle mondiale comme illustré par le Tableau I ci-dessous.
Tableau I : Fréquences géniques des molécules HLA de classe II les plus abondantes dans la population Caucasienne (Europe, USA) ', d'après Colombani J., 1993, HLA:
fonctions immzmitaires et applications médicales, Eds John Libbey Eurotext.
Molécules Chaîne a Fréquence Chaîne (3 Fréquence Molécules abondantes (%) ini v HLA-DR DRA*0101 100 DRB 1 *01019,3 DRA*0101 /DRB 1 *0101 DRB I * 8,0 DRA*O 101/DRB 1 1501 * 1501 DRB 1 *030110,9 DRA*0101/DRB 1 *0301 DRB 1 *04015,6 DRA*0101/DRB 1 *0401 DRB 1 * 9,2 DRA*0101/DRB 1 1101 * I 101 DRB 1 * 6,0 DRA*0101/DRB 1 1301 * 1301 DRB 1 *070114,0 DRA*0101/DRB 1 *0701 DRB3*0101 9,2 DRA*0101/DRB3*0101 DRB3*0202 12,0 DRA*0101/DRB1*0202 DRB4*0101 28,4 DRA*0101/DRB4*0101 DRBS*0101 7,9 DRA*0101/ DRBS*0101 HLA-DQ DQA I *010117,0 DQB 1 *050114,9 DQA1 *0101/ DQB
1 *0501 DQA 1 *0102 15,8 DQB 1 *06029,8 DQA 1 *0501/ DQB
1 *0301 DQA 1 *0201 12,4 DQB 1 *06035,8 DQA I *0501/ DQB
1 *0201 DQA 1 *0301 14,5 DQB 1 *020121,3 DQA 1 *0301/ DQB
1 *0302 DQA 1 *0501 20,9 DQB 1 *030112,0 DQA 1 *0102/ DQB
1 *0602 DQB 1 *030213,0 DQA 1 *0201/ DQB
1 *0201 HLA-DP DPA1 *010378,2 DPB 1 *01017,1 DPA 1 *0201/ DPB
1 *0101 DPA 1 *0201 21,2 DPB 1 *020111,9 DPA I *0103/ DPB
1 *0201 DPB 1 *03019,1 DPA 1 *0103/ DPB
1 *0301 DPB1*0401 40,1 DPA1*0103/DPB1*0401 DPB1*0402 11,0 DPA1*0103/ DPB1*0402 'Les fréquences géniques des 2 molécules HLA-DP4 sont indiquées en gras Ainsi, pour les molécules HLA-DR et HLA-DQ, une dizaine d'allèles suffisent pour couvrir plus de 60 % de la fréquence génique retrouvée dans la population caucasienne et donc concerner plus de 85 % de la population caucasienne.
4 Pour les molécules HLA-DP, la molécule la plus fréquente est la molécule DP4 issue des allèles DPA 1 *0103 et DPB I *0401 qui ont des fréquences géniques de 78,2 % et 40 % respectivement. Trois autres molécules DP ont des fréquences qui dépassent les 5 % : une molécule DP3 (DPA1*0103/DPB1*0301), une molécule DP2 (DPA1 *0103/DPB 1 *0201) et une molécule DP4 (DPA 1 *0103/DPB 1 *0402) ; les molécules HLA II sont dénommées en fonction de l'allèle DPB 1 codant la chaîne ~ qui est la plus polymorphe.
Ainsi, quatre molécules HLA-DP (1 molécule DP3, I molécule DP2 et 2 molécules DP4) suffisent donc pour couvrir 71 % de la fréquence génique de la population caucasienne, les deux molécules DP4, couvrant à elles seules 51 %.
Chacune de ces molécules DP4 comprend une chaîne a variable codée, soit par DPA 1 *0103 qui est la plus fréquente (78,2 %), soit par DPA1 *0201 (20,2 %), les deux chaînes a différant uniquement au niveau de 3 acides aminés (positions 3 I, 50 et 83 ; Tableau II). Les molécules HLA-DP4 qui présentent une fréquence allélique élevée dans la population caucasienne (de l'ordre de 50 % en Europe et 80 % en Amérique du Nord), sont également présentes à des fréquences non négligeables dans les autres populations (fréquence allélique de l'ordre de 60 % en Amérique du Sud, 60 en Inde, 25 % en Afrique et 15 % au Japon, Colombani et al., précité).
Tableau II : Polymorphisme des chaînes a et ~3 des molécules HLA-DP dans la population Caucasienne (Europe, USA), d'après Colombani J., précité.
Positions polymorphiques*
Chane a AlllesFreq 8 9 11 37 57 5859 67 78 8687 8889 (%) 38 71 401 40.1 L F G F A A E I M G G P M
A K

402 11.0 _ _ _ _ D E _ _ _ _ _ _ _ V _ 201 11.9 - - - - D E - - - - - - -V E

501 1.3 - - - L E - - - - D - -V -101 7.1 V Y G Y - - - - - D E A V
- -301 9.1 V Y L - D E D L V D E A V
V -901 1.1 V H L - D E D I V D E A V
V E

Chaine a Freq 31 5083 Allles (%) 103 78.2 M Q T

201 21.2 Q R A

'' Les séquences, disponibles sur le site internet http://www.ebi.ac.ulJim~t/hla, sont numérotées selon la numérotation de STERN et al. (Natzzre, 1994, 368, 215-221 ) pour la molécule HLA-DR ; comme les résidus en positions 23 et 24 sont absents dans les séquences de DPB, les résidus indiqués aux positions 37, 38, 57, 59, 67, 71, 78, 86, 87, 88 et 89 correspondent respectivement aux positions 35, 36, 55, 56,
5 57, 65, 69, 76, 84, 85, 86 et 87 dans la séquence de DPB.
Pourtant, malgré leur fréquence élevée chacune de ces molécules DP4 n'a été que très partiellement étudiée ; les études les plus nombreuses résultent en fait de l'isolement de clones de lymphocytes T CD4+ restreints aux molécules HLA-DP4 et spécifiques des peptides présentés dans le Tableau III, ci-après, issus des anti-gènes suivants - antigènes de microorganismes pathogènes tels que la toxine tétanique (WYSS CORAY et al., Eacr J. Immunol, 1992, 22, 2295), l'antigène WI-1 de Blastomyces dermatitidis (CHANG et al., Inf. Immun., 2000, 68, 502), la protéine hsp 65 de Mycobacterizcm bovis (GASTON et al., Int. Immunol., 1991, 3, 965-972), l'anti-gène S du virus de l'hépatite B (HBsAg pour Hepatitis B virus S antigen ;
CELIS et al., J. Virol., 1989, 63, 747), la phosphoprotéine du virus de la rage (RV-NS
pour Rabies Virus Non-Structural phosphoprotein) ou la neuraminidase du virus de la grippe (IBV-Nm pour influenza B virus Nezcraminidase ; CELIS et al., J.
Immzcnol., 1990, 145, 305) et la protéine UL21 du virus de l'herpes simplex de type 1 (KOELLE
et al., J. Virol., 2000, 74, 10930-10938), - allergènes tels que l'allergène majeur de Derrnatophagoides ptero-nyssinus (HIGGINS, J. Allergy Clin. Immunol., 1992, 90, 749), et - antigènes tumoraux tels que MAGE-A3 (SCHULTZ et al., Cancer Res., 2000, 60, 6272), et NY-ESO1 (ZENG et al., P. N. A. S., 2001, 98, 3964-3969).
6 Tableau III: Séquences des peptides ligands des molécules HLA-DP4 Peptides Squences Numro Rfrence d'identification TT 947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEQ ID N0:1 Wyss Coray et al., 1992 PSN 265 DPYNCDWDPYHEKYDWDLWNKWCNSEO ID N0:2 Chang et al., S1d FFLLTRILTI SEQ ID N0:3 Celis et al., HBsA 19-28 1989 NS-p2 GVQIVROIRSGERFLKIWSO SEQ ID N0:4 Celis et al., FLU-p1 GISKCRFLKIREGR SEQ ID N0:5 Celis et al., VIB Nm 1990.

MT 451-466IAFNSGMEPGVVAEKV SEO ID N0:6 Gaston et a1.,1991 MT 456-471GMEPGVVAEKVRNLSV SEQ ID N0:7 Gaston et a1.,1991 Derp 101-119PNAQRFGISNYCQIYP SEO ID N0:8 Higgins, 1992 MAG 247-258TQHFVQENYLEY SEQ ID N0:9 Schultz et al., 2000 NY-ES01 MWITQCFLPVFLAQPPSGOR SEQ ID N0:10Zeng et al., NY-ES01 QLSLLMWITQCFLPVFLAQPP SEO ID N0:11Zeng et al., UL21 283-293RELWWVFYAGD SEQ ID N0:12Koelle et a1.,2000 IL3 127-146GPGAPADVOYDLYLNVANRR SEQ ID N0:13Falk et al., UNK1 EKKYFAATQFEPLAARL SEQ ID N0:14Falk et al., UNK2 KKYFAATQFEPLAARL SEQ ID N0:15Falk et al., UNK3 EKKYFAATQFEPL SEQ ID N0:16Falk et al., UNK 1-13) 1994 Les études précitées qui reposent sur l'isolement de clones de lymphocytes T CD4+ restreints aux molécules HLA-DP4 mettent en oeuvre un test fonctionnel (test de prolifération) qui n'a pas permis de mettre en évidence un motif de liaison aux molécules DP4, partagé par l'ensemble de ces peptides. En outre, ce test est très lourd à mettre en oeuvre du fait qu'il nécessite de nombreux patients correc-terrent échantillonnés, de manière à ce qu'ils représentent la diversité des molécules HLA II de l'ensemble de la population. En outre, les épitopes définis sont ceux utilisés par le système immunitaire des patients lors de l'infection naturelle par un antigène ;
ces épitopes ne sont pas nécessairement les plus efficaces pour induire une réponse immunitaire contre ce même antigène.
En utilisant une autre approche, à savoir l'analyse de quatre peptides naturellement présents sur les molécules DP4 [peptide 127-146 de la chaîne a du
7 récepteur de l'IL3 (IL3 127-146 ; SEQ ID N0:13) et trois peptides d'origine inconnue : LTNK1 (SEQ ID N0:14), LJNK2 (SEQ ID N0:15) et LJNK3 (SEQ ID
N0:16) ; Tableau III], FALK et al. (Immunogenetics, 1994, 39, 230-242) ont proposé
une séquence consensus de liaison aux molécules DP4. Cette séquence comprend trois résidus d'ancrage respectivement en positions P l, P7 et P9/P 10. P 1 et P7 sont hydro-phobes ou aromatiques (Y, V, L, F, I, A, M, W) et P9/P 10 sont de préférence alipha-tiques ; toutefois, un résidu Y est toléré en position P9/P10 mais pas un résidu F. Les résidus P 1 et P7 sont précédés de groupes de résidus chargés (K, R, E, N, Q
pour P 1 et N, K, E pour P7), et des résidus de petite taille (A, V) sont fréquents en position P3 et P9. Le Tableau III montre que les seuls autres peptides ligands de DP4 présentant ce motif sont les peptides chevauchants NY-ESO1 161-180 et NY- ESO1 156-175. En conséquence, ce motif proposé par FALK et al. ne permet pas de définir un motif de liaison aux molécules DP4 partagé par l'ensemble des peptides ligands des molécules DP4, identités par des tests fonctionnels.
Alors que des tests de liaison aux molécules DP9 (DONG et al., J.
Imrnunol., 1995, 154, 4536-4545) et DP2 (CHICZ et al., J. ImmZCnol., 1997, 159, 4935-4942), dérivés de ceux développés pour les molécules DR [MARSHALL et al., J. Irnmunol., 1994, 152, 4946 (HLA-DR 1 ) ; Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al., .l.
Immunol., 2000, 164, 3177 (HLA-DR1, -DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DR11 et -DR13)]
permettent d'isoler des peptides spécifiques de respectivement DP9 et DP2, ces tests ne permettent pas d'isoler des peptides spécifiques de DP4 (CHICZ et al., précité) : les peptides isolés par le test de liaison à DP2 ont une forte affinité pour DP2 (activité de liaison < 10 nM) alors que des peptides connus pour être restreints à DP4 comme le peptide HBsAg 14-33, présentent une activité médiocre (20 pM).
En outre, du fait des différences importantes des résidus du site de liaison, entre les principales molécules DP, les tests de liaison développés pour ces molécules ne permettent pas d'identifier des peptides restreints à DP4.
Ainsi, les motifs de liaison partagés par l'ensemble des peptides capables de se lier aux molécules HLA-DP4 n'ont pas été identifiés, notamment du fait qu'il n'existe pas de procédé d'identification de tels peptides qui soit simple à
mettre en ceuvre et adapté au criblage simultané d'un grand nombre de peptides
8 comme des banques de peptides chevauchants représentant la séquence d'antigène d'intérêt.
Pourtant, compte tenu de la fréquence des molécules DP4, les pep-tides qui se lient aux molécules DP4 constituent des peptides candidats pour l'immunothérapie spécifique et la vaccination et pourraient servir au diagnostic de l'état immunitaire de patients ou d'individus normaux.
Les Inventeurs ont donc développé un procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 qui leur a permis d'isoler des ligands spécifiques d'HLA-DP4, notamment des peptides et de préciser le motif de liaison partagé par les peptides ligands d'HLA-DP4, à partir des peptides obtenus.
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de sélection de molécules ligand d'HLA-DP4 comprenant les étapes suivantes (i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur constitué par un peptide préalablement marqué et apte à être détecté par un signal approprié, lequel peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides présentant un rapport signal/bruit de fond supérieur à 5, à la concentration de 10 nM, dans un test direct de liaison à HLA-DP4, et répondant à la formule générale (I) ZiXiX2X3X~X5X6X7XgXgZ2 dans laquelle - Zi et Z~, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cystéine (C), - X~ représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X~
représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cystéine (C), un acide aspartique (D), une glutamine (Q), une sérine (S), une thréonine (T) ou un acide glutamique (E), et - X~, X3, X~, X5, X~ et Xs représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, en présence de différentes concentrations de molécules) à tester, (ii) séparation des différents complexes formés,
9 PCT/FR02/03555 (iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur par mesure du signal associé audit peptide traceur et (iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de liaison ICso < 1000 nM, correspondant à la concentration de ces molécules qui inhibent 50 % de la liaison du peptide traceur.
Les résidus Xi, X6 et X9 de la formule générale (I) telle que définie ci-dessus, qui constituent les résidus d'ancrage dans les poches de la molécule d'HLA-DP4, sont également dénommés respectivement résidus P1, P6 et P9. Parmi ces rési-dus, les résidus X1 (ou P1) et X6 (ou P6) sont les résidus qui contribuent majoritaire-ment à la liaison à HLA-DP4. Le résidu X9 ou P9 est moins important et contribue plus faiblement à la liaison à HLA-DP4.
Au sens de la présente invention, on entend par - acides aminés naturels ou synthétiques, les 20 a-acides aminés naturels communément trouvés dans les protéines (code à une lettre: A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V), certains acides aminés rarement rencontrés dans les protéines (hydroxyproline, hydroxylysine, méthyllysine, diméthyllysine..), les acides aminés qui n'existent pas dans les protéines tels que la ~3-alanine, l'acide y-aminobutyrique, l'homocystéine, l'ornithine, la citrulline, la canavanine, la norleucine, la cyclohexylalanine..., ainsi que les énantiomères et les diastéréoisomères des acides aminés précédents.
- acide aminé hydrophobe, un acide aminé sélectionné parmi (code à
une lettre) : A, V, L, I, P, W, F et M.
- acide aminé aromatique, un acide aminé sélectionné parmi (code à
une lettre) : F, W et Y.
L'utilisation d'un peptide traceur, tel que défini à l'étape (i) permet de sélectionner effectivement des ligands spécifiques d'HLA-DP4, c'est-à-dire des molécules, notamment des peptides, qui présentent une bonne affinité pour I-c'est-à-dire une activité de liaison < 1000 nM.
Un peptide traceur conforme à l'invention est sélectionné en mettant en oeuvre un test direct de liaison à HLA-DP4, par exemple en suivant les étapes (i) (ü) et (iii) du protocole défini ci-dessus mais en l'absence de compétiteur, corres-pondant à la molécule à tester. Le signal approprié détecté (fluorescence...) révèle les complexes HLA-DP4/peptide traceur [étape (iii)] et le bruit de fond représente le signal correspondant, obtenu en l'absence d'HLA-DP4.
De préférence - X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et S - X~ est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
Des peptides traceurs conformes à l'invention sont représentés par les peptides NS-p2 (SEQ ID N0:4), MAG 247-258 (SEQ ID N0:9), UL21 283-293 (SEQ ID N0:12), IL3 127-146 (SEQ ID N0:13), UNK1 (SEQ ID NO: 14), UL21
10 283-302 (SEQ ID N0:18) et MAG 245-258 (SEQ ID N0:19).
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides biotinylés, radio-marqués ét les peptides couplés à un fluorochrome.
A l'étape (ü), la séparation des complexes formés des peptides non liés est effectuée par exemple, par transfert des complexes formés sur une plaque de microtitration préalablement recouverte d'un anticorps spécifique d'HLA-DP, par chromatographie sur une colonne de gel-filtration ou par centrifugation.
Lorsque le peptide traceur est radiomarqué ou couplé à un fluoro-chrome, notamment à l'europium, les .complexes HLA-DP4/peptide traceur sont détectés de manière directe par la mesure de la radioactivité ou de la fluorescence émise par lesdits complexes.
Lorsque le peptide traceur est biotinylé, les complexes HLA-DP4/peptide traceur sont détectés de manière indirecte à l'aide de streptavidine conju-guée, par exemple par une révélation immunoenzymatique à l'aide de streptavidine conjuguée à une enzyme telle que la phosphatase alcaline et d'un substrat de la phosphatase alcaline tel que le 4-méthyl-umbelliféryl-phosphate (MUP).
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le peptide traceur est utilisé à une concentration < 200 nM, de préférence inférieure à
20 nM ; de manière encore plus préférée, le traceur est utilisé à la concentration de 10 nM.
11 Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit pro-cédé, ladite HLA-DP4 de l'étape i) est choisie dans le groupe constitué par les molé-cules codées par les allèles DPA 1 * 103/DPB 1 *0401 et DPA 1 * 103/DPB 1 *0402.
Le procédé selon l'invention permet avantageusement de sélection-ner n'importe quel ligand d'HLA-DP4; il s'agit aussi bien de molécules minérales ou organiques comme les peptides et les pseudopeptides.
Selon un autre mode de mise en ceuvre avantageux dudit procédé, lesdites molécules à tester représentent une banque de peptides chevauchants recou-orant la séquence d'un antigène.
La présente invention a également pour objet des ligands d'HLA-DP4 susceptibles d'être obtenus par le procédé de sélection tel que défini ci-dessus, correspondant à une molécule minérale ou organique, naturelle ou synthétique, présentant une activité de liaison à HLA-DP4 inférieure à 1000 nM.
L'activité de liaison à HLA-DP4 d'une molécule ligand, telle que définie ci-dessus, correspond à la concentration de ladite molécule ligand qui inhibe 50 % de la liaison à HLA-DP4 d'un peptide traceur marqué, dans un test en compéti-tion comme le procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 défini ci-dessus.
Parmi ces molécules ligand, on peut citer notamment les peptides et les peptides modifiés tels que les glycopeptides, les lipopeptides, les peptides compre-nant des acides aminés D, des liaisons pseudo-peptidiques (pseudo-peptides) ou des modifications des extrémités C-ou N-terminales.
La partie lipidique du lipopeptide ligand est notamment obtenue par addition d'un motif lipidique sur une fonction a-aminée desdits peptides ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie peptidique ; elle peut comprendre une ou plusieurs chaînes, dérivées d'acides gras en C~-CZO, éven-tuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou déri-vées d'un stéroïde. Le procédé de préparation de tels lipopeptides est notamment décrit dans les Demandes internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. La partie lipi-digue préférée est notamment représentée par un groupe Na-acétyl-lysine N~(palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam).
12 Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand d'HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, sa séquence peptidique répond à la formule géné-raie (I) ZiX~XzX3XqX5X6X7XgX9Z2, dans laquelle - Z~ et Zz, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés tels que définis ci-dessus, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien une cystéine (C), XI représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X9 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cystéine (C), un acide aspartique (D), une glutamine (Q), une sérine (S), une thréonine (T) ou un acide glutamique (E), et - X~, X3, X4, X5, X~ et X8 représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, à condition que ledit peptide ligand d'HLA-DP4 de formule générale (I) ne corres-ponde à aucune des séquences SEQ ID NO: 1 à 17.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand - X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et - X, est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide ligand se lie spécifiquement à DPB 1 *0401 (activité de liaison à DPB
1 *0401 au moins deux fois supérieure à l'activité de liaison à DPB 1 *0402) et X6 est différent de C, et/ou X, est différent de A et de V, et/ou X9 représente W ou Y ou X9 est diffé-rent de E et de C, et/ou X~ est différent de K et de R.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide ligand se lie spécifiquement à DPB 1 *0402 (activité de liaison à
DPB 1 *0402 au moins deux fois supérieure à l'activité de liaison à DPB 1 *0401 ) et X~
représente C, et/ou X, représente A ou V, et/ou X9 représente E ou C ou X9 est diffé-rent de Y et W, et/ou X~ représente K ou R.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, Z, et Z~ sont choisis dans le groupe constitué par
13 les séquences de l'antigène qui sont adjacentes à l'épitope CD4+
restreint à HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, et/ou - un ou plusieurs épitopes T CD8+, et/ou - des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide 830-846 de la toxine tétanique TT (O'SULLIVAN et al., J. Immunol., 1991, 147, 2663-2669), le peptide 307-319 de l'hémagglutinine HA du virus de la grippe (O'SULLNAN et al, précité), l'épitope Pan DR ou PADRE (ALEXANDER et al., DEL GUERCIO et al., FRANKE et al, précités) et des peptides issus des antigènes de Plasmodium falcipa-rum tels que le peptide CS.T3 (S1NIGAGLIA et al., Nature, 1988, 336, 778-780) et les peptides CSP, SSP2, LSA-1 et EXP-1 (DOOLAN et al., J. Immzznol., 2000, 165, 1123-1137) et/ou - un ou plusieurs épitopes B, par exemple un peptide ou un glyco-peptide dâns lequel ledit épitope B est constitué par un sucre (ALEXANDER et al., précité).
De telles séquences permettent avantageusement de déclencher ou de moduler une réponse immunitaire, de manière appropriée.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, il présente la séquence SEQ ID N0:84 correspondant au peptide NY-ESO1 87-111.
La présente invention englobe également les peptides ligands tels que définis ci-dessus, polymérisés.
La présente invention a également pour objet un procédé d'identifi-cation de peptides ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus, à partir d'une séquence d'acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes a) l'établissement d'une matrice de liaison à HLA-DP4 par calcul, -pour tous les mutants d'un peptide traceur tel que défini ci-dessus, représentant l'ensemble des substitutions des résidus en position 1, 4, 6 ou 9 dudit peptide traceur par les 19 autres acides aminés naturels-, du rapport des ICSO desdits peptides mutants et dudit peptide traceur, à l'aide du test de liaison à HLA-DP4 tel que défini ci dans le procédé ci-dessus,
14 b) l'évaluation de la liaison à HLA-DP4 de peptides d'au moins 9 acides aminés inclus dans ladite séquence d'acides aminés, par calcul, pour chaque fragment de 9 acides aminés dudit peptide, de la somme des scores de liaison à
HLA-DP4 des résidus en position l, 4, 6 et 9 dudit fragment, à partir de la matrice de liaison établie en a), et c) l'identification des peptides ligands d'HLA-DP4 correspondant à
ceux dont la perte de liaison à HLA-DP4, par rapport audit peptide traceur est la plus faible, c'est à dire ceux dont la somme des scores de liaison présente la valeur la plus faible exprimée en logarithme (log) ; de préférence inférieure à 2, de manière préférée inférieure à 1, de manière encore plus préférée, proche de 0.
Cette matrice de liaison à HLA-DP4 qui est illustrée pour le peptide de référence LJNK 3-15 (SEQ ID NO: 28), par le Tableau XIV de l'exemple 6, permet d'estimer l'activité de liaison à HLA-DP4 de n'importe quel peptide d'au moins acides aminés ; des peptides présentant des scores de liaison de respectivement 0, 1, 2, 3 et 4 correspondent à des peptides présentant une perte de liaison d'un facteur 1, 10, 100, 1000 et 10000 par rapport au peptide UNK 3-15 (ICSO 10 nM), c'est-à-dire présentant une activité de liaison estimée de respectivement 10 nM, 100 nM, nM, 10 pM et 100 pM.
Par exemple, l'antigène tumoral NY-ESO1 comprend un peptide WIT(~CFLPV possédant un score de liaison à DP*0401 et DP*0402, de 0 + 0,3 + 0 +
0,3 = 0,6 correspondant à une activité de liaison estimée (à l'aide de la matrice de liai-son à HLA-DP4) de 39 nM et une activité calculée (par le test de liaison à
DP*0401 et DP*0402) de respectivement 20 nM et 67 nM.
Le procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4 selon l'invention qui est facile à mettre en couvre et automatisable permet, notamment à
l'aide d'un logiciel approprié, de prédire la séquence des peptides ligands d'HLA-DP4 présents dans toutes les protéines représentant des antigènes d'intérêt. Les séquences peptidiques ainsi identifiées peuvent ensuite être vérifiées par un test de liaison à
HLA-DP4, défini dans le procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 selon l'inven-tion.

La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide ligand tel que défini ci-dessus.
L'objet de l'invention englobe également les molécules d'acide S nucléique recombinantes comprenant au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue.
Au sens de la présente invention, on entend par séquence hétéro-logue relativement à une séquence d'acide nucléique codant un peptide ligand, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement 10 adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant un peptide.
L'objet de la présente invention englobe en particulier - des cassettes d'expression comprenant au moins une molécule d'acide nûcléique conforme à l'invention et les séquences nécessaires au contrôle de la transcription et de la traduction de ladite molécule d'acide nucléique (promoteur,
15 intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et - des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs d'expression, comprennent au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié
dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (iso-lée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de
16 lipides ou de polymères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte, sous forme d'ADN nu.
L'invention a en outre pour objet des cellules procaryotes ou euca-ryotes transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à
S l'invention.
Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une molé-cule d'acide nucléique dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser les vecteurs ou les préparation de lipides tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une composition immunomodulatrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 ou une molécule d'acide nucléique codant un peptide ligand d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, ladite molécule d'acide nucléique est incluse dans un vecteur tel que défini ci-dessus.
Selon le choix du ligand d'HLA-DP4 et de son mode de présentation (voie d'administration, dose, adjonction ou non d'adjuvant), une telle composition immunomodulatrice entraîne, soit une activation des lymphocytes T, soit leur anergie.
En effet, il a été montré qu'une injection unique, par voie sous-cuta-née, d'une faible quantité de peptide entraîne une anergie (OLDFIELD et al., J.
Immamol., 2001, 167, 1734-1739.). En revanche, il est connu que des injections répé-tées de quantités supérieures de peptide en présence d'adjuvant entraîne une activation des lymphocytes T. En outre, l'association à des peptides Z, et Z~ tels que définis ci-dessus, permet également d'augmenter la réponse immunitaire spécifique de l'antigène (ALEXANDER et al., précité).
En conséquence, ladite composition est utilisée aussi bien pour la vaccination contre un agent pathogène ou une cellule tumorale, que pour le traitement des maladies autoimmunes (sclérose en plaques, diabète insulino-dépendant), de l'allergie ou du rejet de greffe.
La présente invention a également pour objet un réactif de diagnos-tic de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un
17 ligand d'HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, éventuellement marqué ou complexé, notamment complexé à des molécules HLA-DP4 marquées (biotinylées), sous la forme de complexes multimériques comme des tétramères.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand d'HLA-DP4 ou d'une molécule d'acide nucléique codant un peptide ligand d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament immunomodula-teur ou d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu.
Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic de l'état immunitaire d'un individu, la détection de la présence, chez ledit individu, de lympho-cytes T CD4+ spécifiques d'un antigène issu d'un agent pathogène ou d'une cellule tumorale, d'un allergène, d'un alloantigène ou d'un autoantigène.
Le réactif conforme à l'invention qui est apte à détecter la présence de lymphôcytes T CD4+ spécifiques d'un antigène est utilisé pour la détection : d'une infection par un agent pathogène, d'un cancer, d'une maladie autoimmune, d'une aller-gie ou d'un rejet de greffe, à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu comprenant les étapes de - mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un réactif de diagnostic tel que défini ci-dessus, et - détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène par tout moyen approprié.
La présente invention a également pour objet un kit de détection de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif tel que défini ci-dessus, associé à un moyen de détection de lymphocytes T
CD4+
spécifiques d'un antigène.
La détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, est effecW ée par tous moyens, connus en eux-mêmes. Par exemple, on peut utiliser des moyens directs comme les tests de prolifération lymphocytaire ou la cytométrie de flux en présence de complexes multimériques tels que définis ci-dessus, ou bien des moyens indirects comme le dosages de cytokines telles que l'IL2, l'IL4, l'IL5 et l'INFy, notamment par des techniques immunoenzymatiques (ELISA, RIA, ELISPOT).
De manière plus précise
18 * pour ce qui concerne le test de prolifération Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clonés) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence desdits ligands d'HLA-DP4 et au besoin de cellules présenta-trices appropriées, telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hété-rologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La prolifération des cellules est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules.
Les peptides tels que définis ci-dessus, permettent de révéler dans la suspension initiale la présence de cellules spécifiques de ces peptides.
* pour ce qui concerne le test ELISPOT
Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T sécré-tant de l'IFN-y, spécifiques d'un peptide tel que défini ci-dessus.
De manière plus précise, les cellules T sont révélées par mesure de la sécrétion d'IFN-y après incubation des PMBC des patients avec lesdits peptides conformément à la méthode décrite dans la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al., (J. Virol., 2000, 74, 1964).
* pour ce qui concerne la mise en oeuvre de complexes multi-mériques et notamment de complexes tétramériques - on met en contact un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) avec des complexes tétramé-riques tels que définis ci-dessus, et - on analyse des cellules marquées par cytométrie de flux.
De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec ledit complexe, on l'enrichit en cellules T
CD4+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4, pour enrichir ledit échantillon.
Les tétramères sont préparés, comme précisé, par exemple dans NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) ou dans KURODA et al.
(J.
Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756).
Brièvement, les tétramères sont fabriqués en incubant, pendant 72 heures à 37°C et dans un tampon phosphate citrate 10 mM, NaCI 0,15 M à
un pH
19 compris entre 4,5 et 7, des molécules HLA II solubles et biotinylées avec un excès d'un facteur 10 de ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus.
La forme tétramérisée est obtenue en ajoutant à la préparation de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à
mole) par rapport aux molécules HLA II. L'ensemble est incubé une nuit à
tempéra-ture ambiante.
Pour utiliser ces tétramères, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clonés) avec un ou plusieurs tétramères (10 à
20 mg/ml) pendant 1 à 3 heures. Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les tétramères grâce au fait que ces constructïons sont fluorescentes.
La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les tétramères des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire.
La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes - mise en contact d'un échantillon cellulaire avec des tétramères marqués par un fluorochrome, préparés à partir de complexes entre des ligands d'HLA-DP4 tels que défini ci-dessus et des molécules HLA-DP4 solubles, et - tri des cellules liées audit tétramères, en cytométrie de flux.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à
des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, avec références aux dessins annexés dans lesquels - la figure 1 illustre l'activité de liaison de peptides aux molécules HLA-DP4 codées respectivement par DPB 1 *040 ( (A) et DPB 1 *0402 (B), déterminée selon le procédé conforme à l'invention avec comme peptide traceur, le peptide biotinylé ( 10 nM) ; le pourcentage de liaison aux molécules DP4 est exprimé
en fonc-tion de la concentration molaire des peptides. La liaison maximale (100 %) correspond à la valeur obtenue pour le peptide traceur seul, en l'absence de peptide compétiteur. UNK: UNK1 (SEQ ID NO: 14), IL: IL3 127-146 (SEQ ID NO: 13), MAG: MAG 245-258 (SEQ ID NO: 19), NSP2: SEQ ID NO: 4, TT: TT 947-963 (SEQ ID NO: 20), DQB: DQB 43-57 (SEQ ID NO: 23), HCI 46-63: SEQ ID N0: 24) et HA: HA 306-318 (SEQ ID NO: 21), 5 - la figure 2 illustre la corrélation entre le score de liaison à HLA-DP4 (estimé par le procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4 conforme à l'invention) et l'affinité pour les molécules HLA-DP4 (déterminée par la valeur d'ICSO, mesurée à l'aide du test de liaison à HLA-DP4 défini dans le procédé
de sélec tion de peptides ligands d'HLA-DP4 conforme à l'invention), analysée sur un 10 ensemble de 44 peptides.
EXEMPLE 1 : PRINCIPE DU TEST DE LIAISON HLA-DP4/PEPTIDE
1) Préparation des peptides Tous les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en syn thèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de 15 masse (ES-MS).
Les peptides sont biotinylés au niveau de leur résidu NHz terminal, selon le protocole tel que décrit dans Texier et al., précité.
2) Préparation des anticorps Les anticorps spécifiques des molécules HLA-DP tel que l'anticorps 20 B7/21 (WATSON et al., Nature, 1983, 304, 358-361), sont purifiés à partir du surna-geant de culture des hybridomes correspondants, sur des colonnes de Protéine A-Sépharose. Ces anticorps sont ensuite couplés sur des colonnes Sépharose 4B ou pro-téine A-Sépharose pour la purification des molécules HLA-DP4.
D'une manière plus précise, après centrifugation à 1100 g, le surna-geant de culture des cellules productrices de l'anticorps B7/21 est filtré à
0,22 pm et son pH est ajusté à 7-8 avec du tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 8. Ce surnageant est ensuite appliqué sur une colonne de Protéine A Sépharose 4 Fast Flow de 10 ml, pré-alablement lavée avec 100 ml de tampon Tris-HC1 0,1 M, pH 8. Puis, la colonne est lavée avec 100 ml de tampon Tris-HCI 0,1 M, pH 8 et 100 ml de tampon Tris-HCl 0,01 M, pHB. Les anticorps sont élués avec le tampon glycine HC1 0,1 M, pH 3.
Le rinçage de la colonne s'effectue avec 100 ml de tampon Tris-HC1 0,1 M, pH 8.
La fraction éluée qui contient l'anticorps B7/21 est immédiatement neutralisée avec du
21 tampon Tris-HC1 1 M, pH 8 avant d'être dialysée extensivement contre du tampon borate 0,1 M, pH 8,2. La quantité d'anticorps obtenus est déterminée à partir de la densité optique (DØ) à 278 nm.
Les colonnes d'affinité destinées à la purification des molécules HLA-DP4 sont préparées de la manière suivante : 0,75 g de Protéine A Sépharose (3 ml de gel final) sont mis à gonfler dans de l'eau puis dans du tampon borate 0,1 M
pH 8,2. 15 mg d'anticorps monoclonal, tel que B7/21 en tampon borate 0,1 M pH
8,2 sont ajoutés au gel, préalablement centrifugé. Le couplage est effectué
pendant deux heures à température ambiante puis contrôlé par l'absorbance à 278 nm du surnageant.
Le gel est ensuite lavé successivement avec 100 ml de tampon borate 0,1 M, pH
8,2, 120 ml de tampon triéthanolamine 0,2 M, pH 8,2 ; 120 ml de tampon diméthylpyrimi-date 20 mM, triéthanolamine 0,2 M, pH 8,2 et 150 ml de tampon éthanolamine 0,2 M
pH 8,2. t~près coulage du gel, celui-ci est rincé avec 150 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8,2. Le contrôle final du couplage est effecW é par une élution en tampon glycine 0,1 M, pH 2,5, NaCI 0,5 M, l'absorbance à 278 nm des fractions de 1 ml devant être inférieure à 0,1. La colonne est immédiatement rincée par 50 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8,2 et 20 ml de tampon borate 0,1 M, NaN3 0,02%, pH 8,2. Elle est conser-vée dans ce tampon à 4°C jusqu'à l'emploi.
3) Purification des molécules HLA-DP4 Les molécules HLA-DP4 sont purifiées à partir de différentes lignées humaines de lymphocytes B transformées par le virus Epstein Barr (EBV) homozygotes pour DP, par immunoaffinité au moyen d'anticorps monoclonaux spéci-fiques de toutes les molécules DP. L'origine des lignées et les allèles qui les caracté-risent sont indiqués dans le Tableau IV.
22 Tableau IV
Lignes Spcificit Allle Allle rfrence HOM2 DP4 DPA 1 *0103DPB I
*0401 BOLETH DP4 DPA 1 *0103DPB 1 *0401 PITOUT DP4 DPA1 *0103DPB I SOUTHWOOD et al., *0401 prcit HHKB DP4 DPA 1 *0103DPB 1 DAVENPORTH et al, *0401 P. N.A.S., 1995, 92, 6567.

SHU DP4 DPA1*0103 DPBI*0402'"

MLF DP4 DPA 1 *0103DPB 1 *0402 BM92 DP4 DPA 1 *0103DPB 1 *0402 'l'origine des lignées est décrite sur le site internet de la Collection européenne de Culture Cellulaire (http: // fuseiv.co.uk/camr/.) La purification des molécules HLA-DP4 est effectuée à partir d'un culot de ces cellules humaines transformées par EBV, selon un protocole dérivé
de ceux utilisés pour les molécules HLA-DR (GORGA et al., ,l. Biol. Chem., 1987, 262, 16087; TEXIER et al., précité).
D'une manière plus précise, 5 à 6.109 cellules sont lysées à une concentration d'environ 108 cellules/ml en tampon de lyse (Tris 0,01 M, NaCI
0,15 M, NaN3 0,02%, pH 7, NP40 1 %, aprotinine 10 l.tg/ml, EDTA 5 mM, PMSF 10 ~tM) dans la glace pendant 30 minutes. Le milieu de lyse est débarrassé des gros débris cellu-laires par centrifugation à 1100 g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est ensuite ultracentrifugé à 100 000 g à 4°C pendant I heure. La suite de la purification se déroule en chambre froide à 4°C. Le lysat est passé successivement sur une colonne de Sépharose 4B (10 ml de gel préparés en PBS 1x), une colonne de Protéine A
Sépharose 4B (5 ml de gel préparés en ZPBS 1x) puis sur la colonne d'affinité
anti-DP.
Les colonnes sont ensuite rincées par 250 ml de tampon de lyse. La colonne Sépharose 4B est jetée. La colonne Protéine A Sépharose 4B est rincée avec 25 ml de tampon TBS 1x (Tris 0,01 M, NaCI 0,15 M, NaN3 0,02%, pH 7) ; 50 ml de tampon (glycine, O,1M; NaCI 0,5M, pH 2,5) et 200 ml de tampon PBS 1x, avant d'ëtre stockée à 4°C. La colonne anti-DP est rincée avec 250 ml de tampon TBS
contenant 1 mM de dodécyl maltoside (DM). Elle est ensuite éluée individuellement avec le tampon d'élution (Na~C03 100 mM, NaCI 500 mM, NaN3 0,02%, DM 1,1 mM, pH
11,5) en 15 fractions de 3 ml. L'éluat est immédiatement neutralisé avec 10%
de
23 tampon (Tris-HCI 2 M, pH 6,8), puis dialysé extensivement à 4°C contre du tampon PBS 1x contenant 1 mM de DM.
4) Test de liaison HLA-DP4-peptide Le test de liaison des peptides aux molécules HLA-DP4 est un test en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, dérivé de celui mis au point pour des molécules HLA-DR (HLA-DR1: MARSHALL et al., précité, HLA-DR1, -DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DR11 et -DR13 : Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al., précité). Il est effectué en plaques 96 puits, ce qui permet d'étudier de nombreux échantillons dans la même expérience. Brièvement, les molécules HLA-DP4 purifiées sont incubées avec un peptide biotinylé qui sert de traceur et différentes concentra-tions du peptide à tester. Le peptide biotinylé est un peptide ligand de DP4, il s'agit d'un peptide reconnu par des lymphocytes T CD4+ spécifiques de DP4 tel que ceux précisés dans le Tableau III ci-dessus ou d'un nouveau peptide isolé à l'aide du présent test de liaison à DP4. Parmi ces peptides, on peut citer par exemple le peptide LNK1 ou le peptide IL3 127-146. L'incubation se fait dans un tampon, dont le pH
peut varier. Il est généralement de 5, l'incubation dure généralement 24h. Après l'incubation, les échantillons sont neutralisés, puis 100 p1 de chaque échantillon est transféré sur une plaque ELISA préalablement sensibilisée par un anticorps anti-DP, tel que B7/21. Les complexes molécules HLA-DP/peptides biotinylés fixés au fond de la plaque par l'intermédiaire de l'anticorps sont révélés au moyen de streptavidine phosphatase et d'un substrat fluorescent. L'activité de chaque peptide est caractérisée par la concentration qui inhibe 50 % de la liaison du peptide biotinylé
(ICSO).
EXEMPLE 2 . DETERMINATION DES PA1RAIVIETRES DU TEST DE
LIAISON
1) Peptide traceur a) Matériel et méthodes La liaison de peptides aux deux molécules DP4 (DP401 codé par l'allèle DPA 1 *0103/DPB 1 *0401 et DP402 codé par l'allèle DPA 1 *0103/DPB 1 *0402) a été analysée en ELISA par le test direct de liaison suivant Les molécules HLA-DP4 purifiées selon le protocole décrit à
l'exemple 1 sont diluées 10 fois en tampon phosphate 10 mM (dilution 1/10).
Elles sont ensuite incubées avec différentes concentrations d'un peptide biotinylé
(10~6M,
24 10-~M et 10-gM) dans du tampon phosphate 10 mM, NaCI 150 mM, DM 1 mM, citrate mM, thimérosal 0,00 3%, pH 5, dans des plaques 96 puits en polypropylène, pendant 24 h à 37°C. Des échantillons sans molécules DP4 sont utilisés comme témoin. A la fin de l'incubation, les échantillons sont neutralisés avec 50 ~l de tampon 5 Tris-HCl 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Ils sont ensuite transférés sur des plaques ELISA maxisorp 96 puits sur lesquelles les anti-corps anti-DP ont été préalablement adsorbés. Très exactement, 10 ~g/ml d'anticorps anti-DP ont été incubés une nuit à 4°C (100 yl/puits) puis les plaques ont été saturées avec le tampon Tris-HCI 100 mM, pH 7,5, BSA 0,3 %, thimérosal 0,003 % pendant 10 une nuit à 4°C. L'incubation des échantillons sur ces plaques est réalisée pendant deux heures à température ambiante, comme la suite du test puis des lavages extensifs sont effectués entre chaque étape en tampon Tris-HCl 0,1 M pH, 7,5, Tween-20 0,05%.
Le peptide biotinylé lié aux molécules HLA-DP est détecté par l'ajout de 100 ~l/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes) dilué au 1/2000 dans le tampon Tris IOmM pH 7, NaCI 0,15 M; Tween 20 0,05 %, BSA 0,2 %, thimérosal 0,003 %, puis par l'ajout de 200 ~l/puits du substrat MUP 100 yM en tampon NaHC03 0,05 M pH 9,8, MgCI~ 1 mM. L'émission de fluorescence par le produit de la réaction enzymatique est mesurée à 450 nm après excitation à 365 nm et le rapport des valeurs obtenues avec ou dans DP4 est déterminé (RF = valeur de fluorescence en présence de DP4/valeur de fluorescence en l'absence de DP4).
b) Résultats La liaison à la molécule DP401 de peptides dérivés des peptides ligands de DP4 précédemment décrits (Tableau III), a été testée - peptide bUL21 283-302 (RELWWVFYAGDRALEEPHAE ; SEQ ID NO: 18) - peptide bIL3 127-146 (SEQ ID NO: 13) - peptide bMAG 245-258 (LLTQHFVQENYLEY ; SEQ ID NO: 19) - peptide bMT 451-466 (SEQ ID N0:6) - peptide bNS-p2 (SEQ ID N0:4) - peptide bTT 947-963 (FNNFTVSFWLRVPKVSA ; SEQ ID NO: 20) - peptide bUNKI (SEQ ID NO: 14) Deux peptides spécifiques respectivement de DR1 et de DR7 ont été
utilisés comme témoin de la spécificité de liaison à DP4 - peptide bHA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT ; SEQ ID NO: 21) décrit par HILL et al., J. Immunol., 1994, 152, 2890, et - peptide bYKL (AAYAAAKAAALAA ; SEQ ID N0:22) décrit par MARSHALL
et al., précité.
5 Les résultats sont illustrés par le Tableau V.
Tableaû V : Sélection des traceurs par un test direct de liaison à HLA-DP4 RF = valeur de fluorescence en prsence de DP4/ valeur de fluorescence en l'absence de DP4 peptide 10-'M 10-'IVI 10-'1VI

bUL21 283-302 8,3 13,3 10,1 bIL3 127-146 10 20 17,3 bMAG 245-258 1,5 6,7 5,4 bMT 451-466 5,5 4 2 bNS-p2 1 4,2 7,8 bTT 947-963 1,7 3,6 2,7 bUNKl 21,6 21,7 20 bHA 306-318 4,9 4,7 2,7 bYKL 4,8 3,2 3 Les résultats montrent que - les peptides bUNKI, bIL3 127-146 ont une forte capacité de liai-10 son à DP4, - les peptides bTT 947-963 et bMT 451-466 ont une faible capacité
de liaison et les peptides bNS-p2, bUL21 283-302 et bMAG 245-258 ont une capacité de liaison intermédiaire.
15 Les peptides présentant un RF > 5 à la concentration de 10-g M sont considérés comme des bons traceurs utilisables dans le test de liaison.
Le peptide UNK1 qui a donné les meilleurs résultats a été utilisé
pour optimiser le test de liaison.

2) temps, pH, concentration du peptide traceur De manière à disposer d'un test sensible et spécifique de DP4, la concentration en molécules HLA-DP4, la concentration du peptide biotinylé, le pH et le temps d'incubation peptides-molécule HLA-DP4 ont été optimisés avec le peptide bUNK 1.
a) Matériels et méthodes Les molécules HLA-DP4 purifiées selon le protocole décrit à
l'exemple 1 ont été diluées au 1/10, 1/20, 1/40 et 1/80, en tampon phosphate 10 mM ;
NaCI 150 mM, DM 1 mM ; citrate 10 mM, thimérosal 0,003 % à différents pH (pH 4 ;
5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 et 7), avec le peptide bUNKI à différentes concentrations et plusieurs concentrations de peptides compétiteurs dans des plaques 96 puits en polypropylène.
A la fin de l'incubation à 37°C, les échantillons ont été neutralisés avec 50 p1 de tampon Tris-HCl 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Ils ont ensuite été transférés sur des plaques ELISA maxisorp 96 puits sur lesquelles les anticorps anti-DP ont été préalablement adsorbés. Très exactement, 10 ~g/ml d'anticorps anti-DP ont été incubés une nuit à 4°C (100 pl/puits) puis les plaques ont été saturées avec le tampon Tris-HCI 100 mM pH 7,5, BSA 0,3 %, thimérosal 0,003 % pendant une nuit à 4°C. L'incubation des échantillons sur ces plaques a été
réalisée pendant deux heures à température ambiante, comme la suite du test puis des lavages extensifs ont été effectués entre chaque étape en tampon Tris-HCl 0,1 M, pH
7,5, Tween-20 0,05 %. Le peptide biotinylé lié aux molécules HLA-DP a été
détecté
par l'ajout de 100 ~l/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes) diluée au 1/2000 dans le tampon Tris 10 mM pH 7, NaCI 0,15 M, Tween 0,05 %, BSA 0,2 %, thimérosal 0,003 %, puis par l'ajout de 200 p.l/puits du substrat MUP 100 ~M en tampon NaHC03 0,05 M, pH 9,8, MgCl2 1 mM. L'émission de fluo-rescence par le produit de la réaction enzymatique a été mesuré à 450 nm après exci-tation à 365 nm. La liaison maximale a été déterminée en incubant le peptide biotinylé
avec la molécule de CMH II en l'absence de peptide compétiteur. La spécificité
de liaison a été contrôlée par l'ajout d'un excès de peptide non biotinylé. Le bruit de fond obtenu ne diffère pas significativement de celui obtenu en incubant le peptide bioti-nylé sans les molécules de CMH II.

Les résultats sont exprimés sous la forme de la concentration de peptide compétiteur qui inhibe 50 % de la liaison maximale du peptide marqué
(ICSO).
b) Résultats Les conditions optimales sont présentées dans le Tableau VI
Tableau VI: Conditions du test de liaison aux molécules DP4 Molcules DPA1*0103/DPB1*0401DPA1*0103/DPB1*0402 Peptide biotinyl bUNK 1-17 bUNK 1-17 Concentration 10 nM 10 nM

pH 5 5 Temps d'incubation24h 24h Concentration Dilution 1/20 1/40' en 'ales dilutions indiquées sont effectuées à partir de la préparation de molécules HLA-DP4 purifiées obtenues à l'exemple 1.
EXEMPLE 3 : SENSIBILITE ET SPECIFICITE DU TEST DE LIAISON AUX

a) Spécificité
Les résultats, illustrés par la figure 1 montrent que l'activité de liai-son mesurée dans le test est spécifique d'HLA-DP4 dans la mesure où
- des peptides connus pour être des ligands de molécules DP4 lient effectivement les molécules HLA-DP*0401 et 0402. Il s'agit du peptide IL3 127-(naturellement présent sur une molécule DP4), des peptides spécifiques de lympho-cytes T CD4+ restreints à DP4 : NS-p2 (ou NSP2), TT 947-963 et dans une moindre mesure le peptide MAL 245-258, et - des peptides connus pour lier d'autres molécules HLA II ne se lient pas aux molécules HLA-DP*0401 et 0402. Il s'agit des peptides : DQB 43-57 (DVEVYRAVTPLGPPD, SEQ ID N0:23), HCI 46-63 (EPRAPWIEQEGPEYWDQE, SEQ ID N0:24) et HA 306-318 (SEQ ID N0:21) qui sont connus pour se lier respectivement à des molécules HLA-DQ3, HLA-DQ2 et HLA-DR (MARSHALL et al., précité, JOHANSEN et al., Immunogenetics, 1996, 45, 142).
La spécibcité du test résulte de l'utilisation - d'un anticorps spécifique des molécules HLA-DP pour la purifica-tion et pour l'adsorption sur les plaques ELISA, et du peptide biotinylé qui se lie avec une forte affinité, la figure 1 montre que le peptide UNK qui est la contrepartie non biotinylé du peptide traceur bLJNK inhibe totalement la liaison du traceur aussi bien sur la molécule HLA-DPB 1 *0401 que sur la molécule DPB 1 *0402.
b) Sensibilité
La sensibilité du test est reflétée par l'ICSO observée avec le peptide non-biotinylé (UNK1) correspondant au traceur (bUNKI). La figure 1 indique des valeurs de respectivement 8 et 9 nM pour DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402, traduisant une bonne sensibilité.
La figure 1 montre également que les activités de liaison des peptides aux molécules DPB 1 *401 et DPB 1 *402, bien que comparables, sont distinctes. Ces résultats confirment que les molécules DPB 1 *401 et DPB 1 *402 pré-sentent des différences qui peuvent être détectées par ce test de liaison.

PARTIR D'UNE BANQUE DE PEPTIDES
1) Matériels et méthodes Les peptides chevauchants couvrant la séquence totale de l'allergène majeur du venin d'abeille (Api ml), décrits dans le Brevet FR 99 00879, ont été syn-thétisés et soumis aux tests de liaison à la molécule DP401 et à la molécule DP402, dans les conditions définies dans le Tableau VI.
2) Résultats Les résultats sont présentés dans le Tableau VII, ci-après Tableau VII : Liaison des peptides de Api ml aux molécules HLA-DPB1*0401 et DPB1*0402 Peptide ICso (nM) 1-18 > 10000 > 10000 5-22 > 10000 > 10000 9-26 > 10000 > 10000 13-30 > 10000 > 10000 17-34 > 10000 > 10000 21-38 > 10000 > 10000
25-42 > 10000 > 10000 29-46 > 10000 > 10000 33-50 > 10000 > 10000 37-54 > 10000 > 10000 41-58 > 10000 > 10000 45-62 > 10000 > 10000 49-66 > 10000 > 10000 _ > 10000 > 10000 57-74 > 10000 > 10000 61-78 > 10000 > 10000 69-86 > 10000 > 10000 73-90 > 10000 > 10000 85-102 > 10000 > 10000 89-106 > 10000 > 10000 93-110 > 10000 > 10000 97-114 > 10000 > 10000 101-118 > 10000 > 10000 105-122 > 10000 > 10000 109-126 > 10000 > 10000 113-130 > 10000 > 10000 117-134 > 10000 > 10000 Ces résultats montrent que le peptide 77-94 de l'antigène majeur du S venin d'abeille 94 (Api ml 77-94 : TISSYFVGKMYFNLIDTK, SEQ ID N0:17) est un peptide ligand des molécules DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402.

EXEMPLE 5 . DETERMINATION DES MOTIFS DE LIAISON AUX

1) Matériel et méthodes a) détermination d'un peptide minimum dérivé d'LJNK 1 capable de se lier aux molé-5 cules DP4 Des peptides dérivés du peptide UNK1 (LJNK 1-17, SEQ ID N0:14) comprenant des délétions croissantes à l'une des extrémités NH~ ou COOH ou bien aux deux extrémités, ont été synthétisés. La séquence de ces peptides (UNK 1-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 4-16, 5-17, 6-17, 7-17, 3-17 et 1-15) correspondant respective-10 ment aux SEQ ID NO: 25-26, 16 et 27-34 est présentée dans le Tableau VIII.
L'acti-vité de liaison des peptides, exprimée par la valeur ICSO, a été déterminée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau VI.
b) détermination des résidus du peptide UNK1 impliqués dans la liaison aux molé-cules DP4 15 Des mutants du peptide LJNK 3-15 (KYFAATQFEPLAA ;
SEQ ID NO: 28) ont été synthétisés ; chaque mutant contient un seul des résidus Y4, F5, T8, Q9, F10, E11, P12, L13 substitué en alanine ou en lysine, le résidu K3 substi-tué en alanine, ou bien l'un des résidus A6, A7, A 14 et A 15 substitué en lysine.
La séquence de ces peptides (UNK K3A, Y4A, FSA, TBA, Q9A, 20 F10A, E11A, P12A, L13A, Y4K, FSK, A6K, A7K, TBK, Q9K, F10K, E11K, P12K, L13K, A14K et A15K) correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N0:35 à
55 est présentée dans le Tableau IX.
L'activité de liaison des peptides, exprimée par la valeur ICso, a été
déterminée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au 25 Tableau VI. La perte de liaison des peptides mutants est exprimée par le rapport des ICSO du peptide mutant et du peptide UNK1.
c) détermination des motifs de liaison aux molécules DP401 et DP402 Les résidus F en P1, T en P4, F en P6 ou L en P9 du peptide UNK1 ont été substitués par l'un des résidus suivants 30 -P1:Y,L,E,N,T,D,G,H,I,M,P,Q,R,S,VouW, -P4:F,L,E,D,N,Y,R,S,G,HouP, -P6:Y,L,W,E,N,T,D,G,H,I,M,P,Q,R,S,V,WouC, -P9:F,Y,E,D,N,R,V,G,H,I,P,Q,S,TouW.
La séquence de ces peptides, correspondant aux séquences SEQ ID
NO: 56 à 81 et SEQ ID NO: 96 à 129, est présentée respectivement dans les Tableaux Xa et Xb.
S La perte de liaison des peptides mutants aux molécules DP4 a été
déterminée par le test décrit pour les mutants alanine et lysine.
2) Résultats a) détermination d'un peptide UNK 1 minimum Les résultats sont présentés dans le Tableau VIII, ci-après Tableau VIII : Liaison à DP401 et DP402 des peptides dérivés de UNK1 (LTNK 1-17) peptides Positions ICSO
des (nM) squences Les résultats obtenus montrent que - la perte de liaison observée avec les peptides UNK 1-11, UNK 1 12, UNK 4-16, UNK 5-17 suggère que le peptide minimum à une taille de 13 à 15 acides aminés, - la perte de liaison observée avec les peptides UNK 6-17 et UNK 7-17 suggère que le résidu F en position 5 est le premier résidu d'ancrage des peptides dans le site de liaison des molécules DP4 (résidu P1).
b) détermination des résidus du peptide UNK1 impliqués dans la liaison aux molé-cules DP4 Les résultats sont présentés dans le Tableau IX, ci-après Tableau IX : Perte de liaison à DP401 et DP402 des mutants alanine et lysine PEPTIDEI 2 4 5 6 7 8 9 l0I1l2131415 DP*0401DP*0402 UNK1 E K Y F A A T Q F E P LA A R I 1,00 K L

UNK K Y F A A T Q F E P LA A I,5 1,7 UNK A Y F A A T Q F E P LA A 0,9 I

UNK K A F A A T Q F E P LA A 1,2 0,9 UNK K Y A A A T Q F E P LA A 41 5,7 FSA

UNK K Y F A A A Q F E P LA A 0,8 0,8 UNK K Y F A A T A F E P LA A 0,8 0,6 FlOA

UNK K Y F A A T Q F A P LA A 0,5 0,5 EI

UNK K Y F A A T Q F E A LA A 1,2 0.9 UNK K Y F A A T Q F E P AA A 3,l 2,3 Ll3A

UNK K K F A A T Q F E P LA A 1,2 1 F_SK

UNK K Y F K A T Q F E P LA A 1,6 l UNK K Y F A K T Q F E P LA A 2 1.2 UNK K Y F A A K Q F E P LA A 31 3,6 UNK K Y F A A T K F E P LA A 1,6 0,9 FIOK

UNKEIIKK Y F A A T Q F K P LA A 1,3 0,7 UNK K Y F A A T Q F E K LA A l,8 1,4 UNKL(3KK Y F A A T Q F E P KA A 81 70 UNK K Y F A A T Q F E P LK A 1,7 l,4 UNK K Y F A A T Q F E P LA K 1,7 1,4 Les résultats montrent une perte de liaison pour FSA, F10A, FSK, F10K et L13K, ce qui suggère fortement que les résidus d'ancrage des peptides dans le site de liaison des molécules DP4 sont respectivement la FS en position P1, la F10 en position P6 et la L 13 en position P9.
c) détermination des motifs de liaison aux molécules DP401 et DP402 Les résultats sont présentés dans les Tableaux Xa, Xb et le Tableau XI, ci-après Tableau Xa : Perte de liaison à DP401 et DP402~' des mutants en P1, P4, et (SEQ
ID
NO:

81) PEPTIDEI 2 4 5 67 8 9 1011 1213l4IS16 l7 DP*0401DP*0402 UNKI E K Y F AA T Q F E PL A A R L 1.00 1,00 K

UNK K Y F AA T Q F E PL A A l,4 l,4 UNK K Y Y AA T Q F E PL A A 3 3,9 FSY

UNK K Y L AA T Q F E PL A A 3,6 6 FSL

FSE

FSN

FST

UNK K Y F AA F Q F E PL A A 2,7 1,7 UNK K Y F AA L Q F E PL A A 1,9 2,6 UNK K Y F AA E Q F E PL A A 2,7 3,7 UNK K Y F AA D Q F E PL A A 2 2,3 UNK K Y F AA N Q F E PL A A 4,1 4,8 UNK K Y F AA Y Q F E PL A A 4, I 2,4 UNK K Y F AA R Q F E PL A A 17 6,7 UNK K Y F AA S Q F E PL A A 2,7 3,4 T$S

UNK K Y F AA T Q Y E PL A A 2,4 3,4 FIOY

UNK K Y F AA T Q L E PL A A 7,2 6,7 UNK K Y F AA T Q W E PL A A 2,2 2,5 FIOW

FIOE

F
l OT

UNK K Y F AA T Q F E PF A A 1,7 4 Ll3Y

UNK K Y F AA T Q F E PD A A 9,4 9 UNK K Y F AA T Q F E PV A A 2,5 l,9 '~ 10 indiques en les sont gras.
valeurs suprieures Tableau Xb : Perte de liaison à DP401 et DP402'~
des mutants en P1, P4, P6 et P9 (SEQ ID 110: 96 à 129) peptides1 2 4 5 7 8 9 10l 13l41 l6 17 perte 3 6 ! S
l2 UNK E K Y F A T Q F E L A A R L DP*0401 K A P DP*0402 FSD A P

FSG A P

FSH A P

FSI A P

UNK K Y IvI A T Q F E L A A 3 3 FSM A P

FSP A P

FSQ A P

FAR A P

FSS A P

FSV A P

UNK K Y W A T Q F E L A A 0,5 l FSW A P

UNK T8G K Y F A A G Q F E P L A A l 2 UNK.~'8P K Y F A A P Q F E P L A A 3 2 l OD

UNK F K Y FA A T Q E P L AA >7100 3700 l OG

l OH

UNK F K Y FA A T Q IvIE P L AA 4 l l OM

I OP

UNK F K Y FA A T Q Q E P L AA >7100 230 I OQ

UNK F K Y FA A T Q R E P L AA >7100 370 l OS

I OV

UNKF10W K Y FA A T Q W E P L AA l UNKLl3G K Y FA A T Q F E P AA 15 12 LINK Ll3PK Y FA A T Q F E P P AA 9 3 UNKLl3S K Y FA A T Q F E P S AA 9 5 UNKLl3W K Y FA A T O F E P W AA l 13 * les valeurs supérieures à 10 sont indiquées en gras.

Tableau XI : Spécificité de la liaison aux molécules DP4'~

+ - + . + - +

DP* F,Y,L,H,T,S F,L,Y,K R F,Y,L,H,V,A F,Y,VH,G, 0401 I,M,WA,G,P,H,T,A, W,I,MG,T,P A,I,P,K,R

K,R,D S,G,P, S,K,R,W~L E,N, M

E,N,Q,I,M,Q, E,D,N,Q,S,T, C~ E,D,N, Q~ D
V

V,W,C

D F,Y,LH,T,S F,L,Y, F,Y,L,H,V,A,F,V,A,Y,H, P*

0402 A,I,M,G,P, H,T,A, W,I,MG,T,P,I,P,L,W,G, V,W K,R,D S,G,P, C S,K,R,M,,Q,K,R,N

E,N,Q,1~M(~,E E,D,N,S,T,D, C D,N,V, Q E

K,W,C, R

~' Les acides aminés qui provoquent respectivement une perte de liaison d'un facteur supérieur à
10 et inférieur à 10 sont indiquées dans la colonne (-) et la colonne (+) ;
les résidus d'ancrage sont représentés en gras et les différences entre DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402 sont soulignées.

Les résultats obtenus montrent que - les poches P1, P6 et P9 du site de liaison des molécules DP4 acceptent des résidus aromatiques et hydrophobes, - la poche P4 du site de liaison des molécules DP4 est très permis-10 sive, et dans une moindre mesure la poche P9 qui accepte également les résidus Q, S, T et D, et - l'allèle DPB 1 *0401 accepte un résidu tyrosine ou tryptophane en P9 mais n'accepte pas de résidus cystéine et acide glutamique à cette position, ni de résidus alanine et valine en P1, ni de résidus lysine et arginine en P4 ou bien encore 15 de résidu cystéine en P6 ; l'allèle DPB 1 *0402 accepte un résidu alanine ou valine en P1, un résidu lysine ou arginine en P4, un résidu cystéine en P6 et un résidu cystéine ou acide glutamique en P9 mais n'accepte pas de résidu tyrosine ou tryptophane à
cette position.

d) Identification d'un motif de liaison dans la séguence de peptides ligands de DP4 L'activité de liaison de différents peptides ligands de DP4 a été
mesurée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau VI. Les résultats sont exprimés par la valeur ICSO (Tableau XIII) ou par la valeur du rapport des ICSO du peptide ligand et du peptide LJNK1 (Tableau XII).
Les peptides testés correspondant respectivement aux séquences SEQ ID NO: suivantes, sont présentés dans les tableaux XII et XIII:
- TT 947-963 (SEQ ID N0:20), - UNK1 (SEQ ID N0:14), - NY-ESO1 87-11, 119-143, 158-180, 166-180 (SEQ ID N0:94, 83, 82, 95), - UL21 283-302 (SEQ ID N0:18), - IL3 127-146 (SEQ ID N0:13) - NS-P2 (SEQ ID N0:4) Api-ml 65-72, 69-86, 73-90, 77-94, 81-98 (SEQ ID N0:85, 88, 89, 17, 86) - MAG 245-258 (SEQ ID N0:19) - MART1 1-20, 41-60, 51-73, 62-72, 103-118 (SEQ ID N0:90, 91, 87, 92, 93).
En parallèle, les séquences de ces peptides ligands de DP4 ont été
alignées et la présence d'un motif de liaison à DP4 tel que défini au Tableau XI, a été
recherchée (Tableaux XII et XIII).

Tableau XII: Alignement des séquences des peptides ligand de DP4 Peptides Squences oaal~oaoz~

TT947-963 FNNFTVSFWLRVPKVSA 0,570,75 NY-ES01158-180LLP~'IWITQCFLPVFLAQPPSGQRR 2 7 UL21283-302RELWWVFYAGDRALEEPHAE 2,862,78 IL3127-146GPGAPADVQYDLYLNVANRR 3,983,06 NS-p2 GVQIVRQIRSGERFLKIWSQ 4,693,89 NY-ES01 PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR 12 ~

Api m1 TISSYFVGKMYFNLIDTK 30 10 Api m1 T I S S Y FVG KMYFN L I DT K 30 10 Api m1 DKFYDCLKNSADTSSYF NT 371,4 MAG 245-258LLTQHFVQENYLEY 30,238,89 MAG245-258LLTQHFVQENYLEY 30,238,89 Apim181-98YFVGKMYFNLIDTKCYKL 150 70 ~ 0401: activité relative de liaison des peptides à DP81' 0401 par rapport au peptide UNK1 (activité de liaison égale à 1) ~ 0402: activité relative de liaison des peptides à DPB1' 0402 par rapport au peptide UNK1 (activité de liaison égale à 1) Tableau XIII: Liaison des peptides Api ml, NY-ESO1 et MARTI à DPB1*0401 et DPB1*0402'~.
ICso (nM) s enc Se~

peptides e 401 402 N

Api ml 65-72 DKFYDCLKNSADTISSYF 50000 6500 Api ml 69-86 DCLKNSADTISSYFVGKM > 10000> 10000 Api ml 73-90 NSADTISSYFVGKMYFNL > 10000> 10000 Api ml 77-94 TISSYFVGKMYFNLIDTK 450 175 Api ml 81-98 YFVGRMYFNLIDTKCYKL 2250 1225 MART1 1-20 MPREDAHFIYGYPKKGHGHS > 10000> 10000 MART1 41-60 LLIGCWYCRRRNGYRALMDK > 10000> 10000 MARTL 51-73~~ RRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR 8000 4000 MART1 62-72 LMDKSLHVGTQCALTRRCPQ > 100001> 10000 MART1 103-118 AYEKLSAEQSPPPYSP > 10000> 10000 NY-ESO1 PGVLLKEFTVSGN_ILTIR_LTAA_DHR 110 117 119-143~''~*

NY-ESOl 158-180 LLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR 20 67 NY-ESO1 166-180 FLPVFLAQPPSGQRR > 10000> 100001 ~ Les acides aminés compatibles avec le motif de liaison aux allèles DPB 1 *0401 S et DPB 1 *0402 sont indiqués en gras et les motifs de liaison complets sont soulignés.
~'~' La séquence de ce peptide est décrite dans Zarour et al., PNAS, 2000, 97, 400-405.
~+~ La séquence de ce peptide est décrite dans Zarour et al., Cancer Res., 2000, 60, 4646-4952.
Les résultats montrent qu'il existe pour la plupart des peptides ligands de DP4 une forte corrélation entre la présence d'au moins 2 résidus P
1 et P6 ou P6 et P9 tels que définis au Tableau XI et une afimité élevée pour les molécules DP4 (ICSO< 1000nM). Ces résultats montrent également que les résidus les plus importants dans la liaison à HLA-DP4 sont les résidus aromatiques ou hydrophobes en position P 1 et P6 ; ces mêmes résidus en position P9 sont moins importants.

EXEMPLE 6 : PREDICTION DE LA SEQUENCE DE PEPTIDES LIGANDS
D'HLA-DP4 A PARTIR D'UNE SEQUENCE D'ACIDES AMINES
1) Matériels et méthodes Une matrice de liaison aux molécules HLA-DP4 a été établie à partir des activités de liaison (ICSO) des mutants du peptide UNK 3-15 mesurées par le test de liaison aux molécules DP4 codées par les allèles DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402, tel que défini ci-dessus, en utilisant comme peptide traceur le peptide UNK 3-15 (exemple 5 et Tableaux IX, Xa, Xb et XI). La contribution de chacun des acides aminés en position P l, P4, P6 et P9 desdits peptides mutants à la liaison aux molécules DP*0401 et DP*0402 est évaluée par un score de liaison correspondant au logarithme (log) du rapport des ICSO du peptide mutant et du peptide UNK 3-15.
Le score de liaison aux molécules DP*0401 et DP*0402, obtenu pour chacun des acides aminés en position P1, P4, P6 et P9 desdits peptides mutants constitue la matrice de liaison à HLA-DP4 présentée dans le Tableau XN ci-dessous:

U M CD N ~ Of~OO M a~O

C~jO ~ r ~ O O O

O O O p O O O

O O O

O O

V tC~N ~.,~OO ~

O r- tD I~ M
~

O O O O

7 Cfl~ p CD

O O H ~ O
O O

N N .- N

N N M f~ O p ~ ~ I~

N D N ~ r, O

Is~ f~~ c0 j N ~ M ~ N

O ~ M O~O~O ~ M M M

N O M O ~- O N O

M ~ O M

~t C ~t O~

N O ~ O ~

.O

N p u'7t1~a0 p 00 Z M r- r t~ O 00 cC N O M ~ r- O M O

V ~ ~ M CO O ct M p M

O O O O O
Q

p M O p M I~

0. ~ 0 A o 00 M lI)00 ~ CO p ~ N N N
O

N ~ N N N

00 ~ 00 00 M M M

OO O

O O O O O O O O

" O ~ r t~ M M

t _~ _ ~ I' _ _ y N O M ~ N ~

N O ~ ' Vr O 00 r u O

'y",~ N M M

CC
11O ~ O O O O O

H ~ M O~ p ~ ~ 0 0 ~pp 0 O N ~ O N O

O
CC Q s M M ~ ~ M ~ 07 I

O ~ M O r- O M O

O
C O M O 00 a0 CO

a O O O O

~tn C

O ~ '~TtD 07a- ~ t0 O

a a a a a a a a a w, N

O O

O O

WO 03/040299 ' ' PCT/FR02/03555 A partir d'une séquence en acides aminés, la liaison des peptides d'au moins 9 acides aminés inclus dans ladite séquence est calculée à partir de la matrice ci-dessus en effectuant, pour chaque fragment de 9 acides aminés dudit peptide, par exemple des fragments chevauchant de 9 acides aminés couvrant la totalité de cette séquence, la somme des scores de liaison des résidus en position l, 4, 6 et 9 dudit fragment.
Des peptides présentant des scores de liaison de respectivement 0, l, 2, 3 et 4 correspondent à des peptides présentant une perte de liaison d'un facteur 1, 10, 100, 1000 et 10000 par rapport au peptide UNK 3-15 (ICSO 10 nM), c'est- à -dire, présentant une activité de liaison estimée, de respectivement 10 nM, 100 nM, nM, 10 yM. et 100 pM.
Les peptides présentant les scores de liaison les plus faibles, de préférence inférieur à 2, de manière préférée inférieur à 1, de manière encore plus préférée proche de 0 sont sélectionnés; ces peptides correspondent à ceux dont l'activité de liaison à HLA-DP4, estimée à partir de la matrice de liaison telle que définie ci-dessus, est la plus élevée.
2) Résultats La corrélation entre le score de liaison des peptides (estimé à l'aide de la matrice de liaison à HLA-DP4, Tableau XN) et leur affinité pour les molécules HLA-DP4 (mesurée par le test de liaison tel que défini ci-dessus) a été
analysée pour 44 peptides étudiés aux exemples 4 et 5.
Les résultats sont illustrés par le Tableau XV et la figure 2.

Tableau XV: Score de liaison et activité de liaison à HLA-DP4 de différents peptides Peptide DP'0401 DP'0402 ICso score ICso score (nM) de (nM) de liaison liaison TT 947-963 4,61 0,90 7 1,08 UNK 1 9,47 0,00 10,00 0,00 NY-ES01158-18030,00 0,60 70,00 0,60 UL21283-30222,89 1,77 20,00 2,01 IL3127-146 30,37 1,94 30,00 1,86 NSP2 40,00 2,44 40,00 2,69 NY-ES01119-143100,00 2,16 100,00 1,90 NY-ES0187-11186,12 1,73 87,00 1,26 MAG 245-258250,00 0,90 400,00 1,68 MART151-73 8000,00 3,76 4000,002,45 Api-m11-18 10000,001,89 10000,002,08 Api-m15-22 10000,004,88 10000,003,33 Api-m19-26 10000,003,58 10000,003,33 Api-m113-3010000,002,92 10000,002,38 Api-m117-3410000,002,92 10000,002,38 Api-m121-3810000,004,08 10000,003,40 Api-m125-4210000,003,97 10000,002,64 Api-m129-4610000,002,56 10000,001,86 Api-m133-5010000,002,56 10000,001,86 Api-m137-5410000,004,00 10000,003,07 Api-m141-5810000,004,00 10000,003,07 Api-m145-6210000,003,23 10000,002,45 Api-m149-6610000,003,23 10000,002,45 Api-m153-7010000.003,15 10000,002,45 Api-m157-7410000,003,15 10000,002,90 Api-m161-7810000,003,15 10000,002,90 Api-m165-8250000,003,64 6500,002,90 Api-m169-8610000,002,70 10000,001,94 Api-m 1 10000,001,78 10000,001,18 Api-m177-94450 1,34 175,00 1,18 Api-m181-982250 1,34 1225,000,78 Api-m185-10210000,001,71 10000,000,78 Api-m189-10610000,001,71 10000,000,78 Api-m193-11010000.004,27 10000,003,02 Api-m197-11410000,004,98 10000,003,46 Api-m1101-11810000,003,67 10000,003,21 Api-m1105-12210000,003,65 10000,003,21 Api-m1109-12610000,003,65 10000,003,44 Api-m1113-13010000,003,96 10000,003,50 Api-m 1 117-13410000,001,86 10000,001,98 MART11-20 10000,003,16 10000,002,16 MART141-60 10000,002,48 10000,002,20 MART162-72 10000,004,00 10000,002,46 MART1103-11810000,004,11 10000,002,95 Ces résultats montrent qu'il existe une forte corrélation entre le score de liaison et l'affinité des peptides pour HLA-DP4. En effet, en prenant comme seuil d'activité un score de liaison < 2 et une activité de liaison ICSO < 1000 nM
- 80 % des peptides présentant un score de liaison < 2 pour les molécules HLA-DP4 (DP*0401 et DP*0402) présentent une affinité élevée pour ces molécules (ICSO < 1000 nM, peptides vrais positifs) et - 82 % et 76 % des peptides présentant un score de liaison >_ 2 pour les molécules HLA-DP4 (respectivement DP*0401 et DP*0402) présentent une faible affinité pour ces molécules (ICSO >_1000 nM, peptides vrais négatifs).
En conséquence, la matrice de liaison à HLA-DP4 peut-être utilisée pour prédire la séquence de peptides ligands d'I-ILA-DP4 à partir de n'importe qu'elle séquence d'acides aminés, notamment une séquence représentant un antigène d'intérêt.

LISTE DE SÉQUENCES
<110> COMMISSARIAT A L'ÉNERGIE ATOMIQUE
SEDAC THERAPEUTICS
MAILLERE, Bernard CASTELLI, Florence BUHOT, Cécile GEORGES, Bertrand <120> Procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 et ses applications <130> sF263ext70 <140>
<141>
<160> 129 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21-<212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 1 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu <210> 2 <211> 24 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 2 Asp Pro Tyr Asn Cys Asp Trp Asp Pro Tyr His Glu Lys Tyr Asp Trp Asp Leu Trp Asn Lys Trp Cys Asn <210> 3 <211> 10 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 3 Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile <210> 4 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 4 Gly Val Gln Ile Val Arg Gln I1e Arg Ser Gly Glu Arg Phe Leu Lys Ile Trp Ser Gln <210> 5 <211> 14 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 5 Gly Ile Ser Lys Cys Arg Phe Leu Lys Ile Arg Glu Gly Arg <210> 6 <211> 16 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 6 Ile Ala Phe Asn Ser Gly Met Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val <210> 7 <211> 16 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 7 Gly Met Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn Leu Ser Val <210> 8 <211> 1E
<212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 8 Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro <210> 9 <211> 12 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 9 Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr <210> 10 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 10 Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg <210> 11 <211> 21 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 11 Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro <210> 12 <211> 11 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 12 Arg Glu Leu Trp Trp Val Phe Tyr Ala Gly Asp <210> 13 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 13 Gly Pro Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val S
Ala Asn Arg Arg <210> 14 <211> 17 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 14 Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu <210> 15 <211> 16 <212> PRT
<213> Sëquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 15 Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu <210> 16 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 16 Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu <210> 17 <211> 18 <212> PRT

<213> Séquence artificielle <400> 17 Thr Ile Ser Ser Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys <210> 18 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:pepride synthétique <400> 18 Arg Glu Leu Trp Trp Val Phe Tyr Ala Gly Asp Arg Ala Leu Glu Glu Pro His Ala Glu <210> 19 <211> 14 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <400> 19 Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr <210> 20 <211> 17 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 20 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala <210> 21 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 21 Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr <210> 22 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 22 Ala Ala Tyr Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ala <210> 23 <211> 15 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 23 Asp Val Glu Val Tyr Arg Ala Val Thr Pro Leu Gly Pro Pro Asp <210> 24 <211> 18 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 24 Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu <210> 25 <211> 11 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 25 Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu <210> 26 <211> 12 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 26 Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro <210> 27 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 27 Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala <210> 28 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 28 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 29 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 29 Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg <210> 30-<211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 30 Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu <210> 31 <211> 12 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 31 Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu <210> 32 <211> 11 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 32 Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu <210> 33 <211> 15 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 33 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu <210> 34 <211> 15 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 34 Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 35 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <400> 35 Ala Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 36 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 36 Lys Ala Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 37 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 37 Lys Tyr Ala Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 38-<211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 38 Lys Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 39 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 39 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Ala Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 40 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 90 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Ala Glu Pro Leu Ala Ala <210> 41 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 41 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Ala Pro Leu Ala Ala <210> 42 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 42 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Ala Leu Ala Ala <210> 43 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 43 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Ala Ala Ala <210> 44 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 94 Lys Lys Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 45 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 45 Lys Tyr _Lys Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 46 <211> 13 <212> PRT
<213> Sëquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 46 Lys Tyr Phe Lys Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 47 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 47 Lys Tyr Phe Ala Lys Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 98 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 48 Lys Tyr Phe Ala Ala Lys Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 49 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 49 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Lys Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 50 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 50 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Lys Glu Pro Leu Ala Ala <210> 51 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <900> 51 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Lys Pro Leu Ala Ala <210> 52 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de 1a séquence artificielle: peptide synthétique <400> 52 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Fhe Glu Lys Leu Ala Ala <210> 53 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 53 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Lys Ala Ala <210> 54 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 54 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Lys Ala <210> 55 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 55 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Lys <210> 56 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 56 Lys Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 57 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 57 Lys Tyr Leu Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 58 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <400> 58 Lys Tyr Glu Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 59 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <900> 59 Lys Tyr Asn Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 60 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 60 Lys Tyr Thr Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 61 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 61 Lys Tyr Phe Ala Ala Phe Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 62 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 62 Lys Tyr Phe Ala Ala Leu Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 63 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 63 Lys Tyr Phe Ala Ala Glu Gln Phe Glu Pro Leu Ala A1a <210> 69 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 64 Lys Tyr Phe Ala Ala Asp Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 65 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 65 Lys Tyr Phe Ala Ala Asn Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 66 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 66 Lys Tyr Phe Ala Ala Tyr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 67 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 67 Lys Tyr Phe Ala Ala Arg Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 68 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 68 Lys Tyr Phe Ala Ala Ser Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 69 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 69 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Tyr Glu Pro Leu Ala Ala <210> 70 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 70 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr G1n Leu Glu Pro Leu Ala Ala <210> 71 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 71 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Trp Glu Pro Leu Ala Ala <210> 72 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 72 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Glu Glu Pro Leu Ala Ala <210> 73 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 73 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Asn Glu Pro Leu Ala Ala <210> 74 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 74 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Thr Glu Pro Leu Ala Ala <210> 75 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 75 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Phe Ala Ala <210> 76 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 76 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Tyr Ala Ala <210> 77 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 77 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Glu Ala Ala <210> 78 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 78 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Asp Ala Ala <210> 79 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 79 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Asn Ala Ala <210> 80 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 80 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Arg Ala Ala <210> 81 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 81 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr G1n Phe Glu Pro Val Ala Ala <210> 82 <211> 23 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
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<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 83 Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg <210> 84 <211> 25 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
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<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 85 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ser Ser Tyr Phe <210> 86 <211> 18 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
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<213> Séquence artificielle <220> _ <223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 87 Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg <210> 88 <211> 18 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 88 Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser Tyr Phe Val Gly Lys Met <210> 89 <211> 18 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 89 Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu <210> 90 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 90 Met Pro ärg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly His Gly His Ser <210> 91 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 91 Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys <210> 92 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 92
26 Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg Cys Pro Gln <210> 93 <211> 16 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 93 Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser Pro Pro Pro Tyr Ser Pro <210> 94 <211> 25 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 94 Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln <210> 95 <211> 15 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <900> 95 Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser G1y Gln Arg Arg <210> 96
27 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 96 Lys Tyr Asp Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 97 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:peptiàe synthétique <400> 97 Lys Tyr Gly Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 98 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 98 Lys Tyr His Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 99 <211> 13~
<212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 99 Lys Tyr Ile Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
28 <210> 100 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 100 Lys Tyr Met Ala Ala Thr G1n Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 101 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220> _ <223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 101 Lys Tyr Pro Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 102 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 102 Lys Tyr Gln Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 103 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 103 Lys Tyr Arg Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
29 <210> 104 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 104 Lys Tyr Ser Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 105 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 105 Lys Tyr Val Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 106 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 106 Lys Tyr Trp Ala A1a Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 107 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 107 Lys Tyr Phe Ala Ala Gly Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 108 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 108 Lys Tyr Phe Ala Ala Pro Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 109 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 109 Lys Tyr Phe Ala Ala His Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala <210> 110 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 110 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Asp Glu Pro Leu Ala Ala <210> 111 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 111 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Gly Glu Pro Leu Ala Ala <210> 112 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 112 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln His Glu Pro Leu Ala Ala <210> 11~
<211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 113 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Ile Glu Pro Leu Ala Ala <210> 114 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 114 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Met Glu Pro Leu Ala Ala <210> 115 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 115 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Pro Glu Pro Leu Ala Ala <210> 116 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description àe la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 116 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Gln Glu Pro Leu Ala Ala <210> 117 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 117 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Arg Glu Pro Leu Ala Ala <210> 118 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 118 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Ser Glu Pro Leu Ala Ala <210> 119 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 119 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Val Glu Pro Leu Ala Ala <210> 120 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 120 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Trp Glu Pro Leu Ala Ala <210> 121 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 121 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Cys Glu Pro Leu Ala Ala <210> 122 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 122 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Gly Ala Ala <210> 123 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 123 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro His Ala Ala <210> 124 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220> _ <223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 124 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Ile Ala Ala <210> 125 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 125 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Pro Ala Ala <210> 126 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 126 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Gln Ala Ala <210> 127 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 127 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Ser Ala Ala <210> 128 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 128 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Thr Ala Ala <210> 129 <211> 13 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide synthétique <400> 129 Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Trp Ala Ala

Claims (26)

REVENDICATIONS

1°) Procédé de sélection de molécules ligand d'HLA-DP4, caracté-risé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:

(i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur constitué par un peptide préalablement marqué et apte à être détecté par un signal approprié, lequel peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides présentant un rapport signal/bruit de fond supérieur à 5, à la concentration de 10 nM, dans un test direct de liaison à HLA-DP4, et répondant à la formule générale (I) Z1X1X2X3X4X5X6X7X8X9Z2, dans laquelle:

- Z1 et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de
1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien une cystéine, - X1 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X9 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien une cystéine (C), un acide aspartique (D), une glutamine (Q), une sérine (S), une thréonine (T) ou un acide glutamique (E), et - X2, X3, X4, X5, X7 et X8 représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, en présence de différentes concentrations de molécule(s) à tester, (ü) séparation des différents complexes formés, (iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur par mesure du signal associé audit peptide traceur, et (iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de liaison IC50 < 1000 nM, correspondant à la concentration de ces molécules qui inhibent 50 % de la liaison du peptide traceur.
2°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites molécules à tester représentent une banque de peptides chevauchants recouvrant la séquence d'un antigène.
3~) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caracté-risé en ce que l'HLA-DP4 de l'étape i) est choisie dans le groupe constitué
par les molécules codées par les allèles DPA1*103/DPB1*0401 et DPA1*103/DPB1*0402.
4~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caracté-risé en ce que dans ledit peptide traceur de formule générale (I):
X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et - X1 est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
5~) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit pep-tide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides de séquence SEQ ID
NO: 4, 9, 12, 13, 14, 18 et 19.~
6~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caracté-risé en ce que ledit peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides biotinylés, radiomarqués et les peptides couplés à un fluorochrome.
7~) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caracté-risé en ce que ledit peptide traceur est utilisé à une concentration < 200 nM, de préfé-rence inférieure à 20 nM ; de manière encore plus préférée à la concentration de 10 nM.
8~) Ligand d'HLA-DP4 susceptible d'être obtenu par le procédé de sélection selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il correspond à une molécule minérale ou à une molécule organique, naturelle ou synthétique, présentant une activité de liaison à HLA-DP4 inférieure à 1000 nM.
9~) Ligand d'HLA-DP4 selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite molécule organique est un peptide ou un peptide modifié tel qu'un glyco-peptide, un lipopeptide ou un pseudopeptide.
10~) Peptide ligand d'HLA-DP4 selon la revendication 9, caractérisé
en ce que sa séquence peptidique répond à la formule générale (I) Z1X1X2X3X4X5X6X7X8X9Z2, dans laquelle:
- Z1 et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cystéine, - X1 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X9 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cystéine (C), un acide aspartique (D), une glutamine (Q), une sérine (S), une thréonine (T) ou un acide glutamique (E), et - X2, X3, X4, X5, X7 et X8 représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, à condition que ledit peptide ligand d'HLA-DP4, de formule générale (I) ne corres-ponde à aucune des séquences SEQ ID NO: 1 à 17.
11~) Peptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que:
- X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et - X1 est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
12~) Peptide selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la molécule HLA-DPB1*0401 et X6 est différent de C, et/ou X1 est différent de A et de V, et/ou X9 représente W ou Y ou X9 est différent de E et de C, et/ou X4 est différent de K et de R.
13~) Peptide selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la molécule DPB1*0402 et X6 représente C, et/ou X1 représente A
ou V, et/ou X9 représente E ou C ou X9 est différent de Y et W, et/ou X4 représente K
ou R.
14~) Peptide selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO:84.
15~) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 10 à 14.
16~) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 et les séquences nécessaires au contrôle de la transcription et de la traduction de ladite molécule d'acide nucléique.
17°) Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 ou une cassette d'expression selon la revendication 16.
18°) Cellule transformée par au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 ou un vecteur selon la revendication 17.
19°) Composition immunomodulatrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 ou une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15.
20°) Réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14.
21 °) Méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu comprenant les étapes de:
- mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un réactif de diagnostic selon la revendication 20, et - détection de lymphocytes T CD4+spécifiques d'un antigène.
22°) Kit de détection de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé
en ce qu'il comprend au moins un réactif selon la revendication 20, associé à
un moyen de détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène.
23°) Utilisation d'un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15, pour la préparation d'un médicament immunomodulateur ou d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu.
24°) Procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un anti-gène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:
- mise en contact de cellules avec des tétramères marqués par un fluorochrome, préparés à partir des complexes entre un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 et des molécules HLA-DP4 solubles, et - tri des cellules liées audit tétramères, en cytométrie de flux.
25°) Procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4 selon la revendication 10, à partir d'une séquence d'acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes:

a) l'établissement d'une matrice de liaison à HLA-DP4 par calcul, -pour tous les mutants d'un peptide traceur tel que défini à la revendication 1, repré-sentant l'ensemble des substitutions des résidus en position 1, 4, 6 ou 9 dudit peptide traceur par les 19 autres acides aminés naturels-, du rapport des IC50 desdits peptides mutants et dudit peptide traceur, à l'aide du test de liaison à HLA-DP4 tel que défini dans le procédé de sélection de la revendication 1, b) l'évaluation de la liaison à HLA-DP4 de peptides d'au moins 9 acides aminés inclus dans ladite séquence d'acides aminés, par calcul, pour chaque fragment de 9 acides aminés dudit peptide, de la somme des scores de liaison à
HLA-DP4 des résidus en position 1, 4, 6 et 9 dudit fragment, à partir de la matrice de liaison établie en a), et c) l'identification des peptides ligands d'HLA-DP4 correspondant à
ceux dont la perte de liaison à HLA-DP4, par rapport audit peptide traceur est la plus faible, c'est à dire ceux dont la somme des scores de liaison présente la valeur la plus faible exprimée en logarithme (log); de préférence inférieure à 2, de manière préférée inférieure à 1, de manière encore plus préférée, proche de 0.
26°) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ledit peptide traceur est le peptide de séquence SEQ ID NO:28.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000048630A1 (fr) 1999-02-17 2000-08-24 Csl Limited Complexes immunogenes et methodes y relatives
US20040072262A1 (en) 2002-10-11 2004-04-15 Montero-Julian Felix A. Methods and systems for detecting MHC class I binding peptides
WO2005033278A2 (fr) * 2003-09-30 2005-04-14 Ludwig Institute For Cancer Research Efficacite in vivo de ny-eso-1 associee a iscom
JP2007511760A (ja) * 2003-11-03 2007-05-10 ベックマン コールター インコーポレーティッド Ｍｈｃ結合ペプチドを検出するための溶液ベースの方法
JP2007536522A (ja) * 2004-05-07 2007-12-13 ベックマン コールター インコーポレーティッド Ｃｔｌの媒介による抗原提示細胞の溶解を検出するためのｍｈｃ架橋系
EP2226332A1 (fr) 2004-06-17 2010-09-08 Beckman Coulter, Inc. Épitopes de tuberculose par mycobacterium et ses procédés d'utilisation
FR2882628B1 (fr) * 2005-03-04 2011-03-18 Centre Nat Rech Scient Souris transgeniques et leurs applications comme modele experimental
DE102005041616B4 (de) * 2005-09-01 2011-03-17 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Melanom-assoziierte MHC Klasse I assoziierte Oligopeptide und für diese kodierende Polynukleotide und deren Verwendungen
FR2891462B1 (fr) * 2005-09-30 2009-10-16 Commissariat Energie Atomique Epitopes t cd4+ de la survivine et leurs applications
FR3008099B1 (fr) 2013-07-05 2020-08-07 Commissariat Energie Atomique Peptides immunogenes de l'antigene tumoral cycline b1

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6537764B1 (en) * 1995-01-19 2003-03-25 Children's Medical Center Corporation Method of identifying inhibitors of C—C chemokine receptor 3
US6027890A (en) * 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
AU9572098A (en) * 1997-10-08 1999-04-27 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Novel human cancer antigen ny eso-1/cag-3 and gene encoding same
US6207391B1 (en) * 1998-03-31 2001-03-27 Tularik Inc. High-throughput screening assays for modulators of STAT4 and STAT6 activity
WO2000023053A2 (fr) * 1998-10-20 2000-04-27 Salvatore Albani Procede d'isolement, de quantification, de caracterisation et de modulation de cellules specifiques d'antigenes
JP4776852B2 (ja) * 2000-01-28 2011-09-21 アメリカ合衆国 癌抗原ｎｙｅｓｏ−１由来の新規ｍｈｃクラスｉｉ拘束ｔ細胞エピトープ
FR2843115B1 (fr) 2002-08-02 2007-11-09 Commissariat Energie Atomique Melange de peptides issus des proteines c et ns3 du virus de l'hepatite c et leurs applications
FR2874612A1 (fr) 2004-08-27 2006-03-03 Commissariat Energie Atomique Epitotes t cd4+ du vih restreints a hla-dp4 et leurs applications
WO2006075253A2 (fr) 2005-01-11 2006-07-20 Commissariat A L'energie Atomique Peptides destines a desensibiliser des sujets allergiques au poil de chien ou aux squames, et compositions contenant ces peptides
FR2881746B1 (fr) 2005-02-07 2007-04-13 Centre Nat Rech Scient Epitopes t cd4+des antigenes de latence de type i et ii du virus epstein-barr aptes a etre reconnus par la majorite des individus de la population caucasienne et leurs applications
FR2889959A1 (fr) 2005-09-01 2007-03-02 Commissariat Energie Atomique Epitopes t cd4+ des antigenes mage-a restreints a hla-dp4 et leurs applications
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