WO2003040299A2 - Procede de selection de ligands d'hla-dp4 - Google Patents

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Definitions

  • CD4 + T cells are one of the main cells that regulate the immune response. Specific to antigens, they are in fact capable of recognizing the presence of a pathogenic agent, an allergen or a tumor cell and of triggering an immune response. The recognition of these antigens in fact leads to the activation of CD4 + T lymphocytes which secrete most of the cyto ines necessary for the recovery of effector cells which are the cytotoxic CD8 + lymphocytes and the B lymphocytes which produce antibodies. CD4 + T lymphocytes also intervene in the activation of cells by cellular contacts and for example induce the activation, by the CD40 molecule, of dendritic cells presenting the antigen.
  • CD4 + T lymphocytes The activation of CD4 + T lymphocytes is a favorable prognosis during infections with viruses such as human immunodeficiency virus (HTV), human papillomavirus (HPV) or hepatitis C virus (HCV) and these cells appear to be necessary for anti-tumor immunity.
  • viruses such as human immunodeficiency virus (HTV), human papillomavirus (HPV) or hepatitis C virus (HCV) and these cells appear to be necessary for anti-tumor immunity.
  • HTV human immunodeficiency virus
  • HPV human papillomavirus
  • HCV hepatitis C virus
  • CD4 + T lymphocytes the role of CD4 + T lymphocytes in triggering transplant rejection is well established.
  • the treatments aim to trigger the activation of CD4 + T lymphocytes (vaccination against a pathogenic agent or a tumor cell) or to decrease the activation state of CD4 + T lymphocytes (desensitization against allergy , prevention of transplant rejection).
  • CD4 + T lymphocytes The activation of CD4 + T lymphocytes occurs under the effect of the presentation of antigenic peptides by the molecules of the major type II histocompatibility complex carried by antigen presenting cells (APC for Antigen Presenting Celî); in humans, they are called HLA II molecules for Human Leukocyte Antigen type II.
  • APC Antigen Presenting Celî
  • HLA II molecules Human Leukocyte Antigen type II.
  • T epitopes result from the proteolytic degradation of antigens by antigen presenting cells. They have variable lengths, generally from 13 to 25 amino acids and have a sequence which makes them capable of binding to HLA IL II molecules. It is well known that, like the native antigen, an epitope T peptide is capable of stimulate specific CD4 + T lymphocytes in vitro or recruit them in vivo.
  • T epitope peptides are therefore likely both to participate in the composition of a vaccine or to serve to decrease the unwanted activation of CD4 + T lymphocytes. They are also likely to participate in a diagnostic test of the immune status of normal patients or individuals based on direct detection (lymphocyte proliferation test) or indirect (production of antibodies, cytokines ...) said activated CD4 + T cells.
  • HLA II molecules are heterodimers consisting of an alpha ( ⁇ ) chain and a polymorphic beta ( ⁇ ) chain.
  • HLA-DR alpha chain
  • ⁇ beta chain
  • HLA-DP 1 HLA-DP
  • the HLA-DR molecule whose beta chain ( ⁇ ) is encoded by the DRB1 gene is the most expressed.
  • the beta chain encoded by the DRB1 gene is the most polymorphic and has 273 alleles.
  • the two chains ( ⁇ and ⁇ ) which constitute them are polymorphic but they have fewer alleles.
  • the combination between the two chains ⁇ and ⁇ encoded by these alleles gives rise to many molecules HLA-DQ and HLA-DP. Due to this polymorphism, these isoforms have different binding properties, which implies that they can bind different peptides of the same antigen.
  • each individual recognizes in an antigen a set of peptides whose nature depends on the HLA II molecules which characterizes it. Since there are a large number of LILA II alleles, it can be assumed that there exists in a given sequence a large repertoire of T epitope peptides of very different sequences, each specific for a different allele.
  • HLA-DP4 The gene frequencies of the 2 HLA-DP4 molecules are indicated in bold. Thus, for the HLA-DR and HLA-DQ molecules, a dozen alleles are sufficient to cover more than 60% of the gene frequency found in the Caucasian population and therefore concern more than 85% of the Caucasian population.
  • HLA-DP molecules the most common molecule is the DP4 molecule from the DPA1 * 0103 and DPB1 * 0401 alleles which have gene frequencies of 78.2% and 40% respectively.
  • DP3 molecule DPA1 * 0103 / DPB1 * 0301
  • DP2 molecule DPA1 * 0103 / DPB1 * 0201
  • DP4 molecule DPA1 * 0103 / DPB 1 * 0402
  • HLA-DP molecules (1 DP3 molecule, 1 DP2 molecule and 2 DP4 molecules) are therefore sufficient to cover 71% of the gene frequency of the Caucasian population, the two DP4 molecules, alone covering 51%
  • Each of these molecules DP4 includes a variable ⁇ chain encoded either by DPA1 * 0103 which is the most frequent (78.2%) or by DPA1 * 0201 (20.2%), the two ⁇ chains differing only at the level of 3 amino acids ( positions 31, 50 and 83; Table II)
  • the HLA-DP4 molecules which have a frequency that is only high in the Caucasian population (of the order of 50% in Europe and 80% in North America), are also present at non-negligible frequencies in other populations (unhealthy frequency of the order of 60% in South America, 60% in India, 25% in Africa and 15% in Japan, Colombam et al, cited above)
  • tetanus toxin WYSS CORAY et al, Eur J. Immunol, 1992, 22, 2295
  • WI-1 antigen of Blastomyces dermatitidis CHANG et al, Inf Immun., 2000, 68, 502
  • the hsp 65 protein from Mycobacterium bovis GASTON et al, Int. Immunol, 1991, 3, 965-972
  • the hepatitis B virus S antigen HBsAg for Hepatitis B virus S antigen
  • CELIS hepatitis B virus S antigen
  • the rabies virus phosphoprotein (RV-NS for Rabies Virus Non-Structural phosphoprotein) or the influenza virus neuraminidase (IBV-Nm for influenza B virus Neuraminidase; CELIS et al, J. Immunol, 1990, 145, 305) and the UL21 protein of Vherpes simplex virus type 1 (KOELLE et al, J. Virol, 2000, 74, 10930-10938),
  • HIGGINS Dermatophagoids pteronyssinus
  • MAGE-A3 SCHULTZ et al. Cancer Ray., 2000, 60, 6272
  • NY-ESO1 ZENG et al, PNA S, 2001, 98, 3964-3969
  • PI and P7 are hydrophobic or aromatic (Y, V, L, F, I, A, M, W) and P9 / P10 are preferably aliphatic; however, a residue Y is tolerated in position P9 / P10 but not a residue F.
  • the residues PI and P7 are preceded by groups of charged residues (K, R, E, N, Q for PI and N, K, E for P7 ), and small residues (A, V) are frequent in positions P3 and P9.
  • Table ILI shows that the only other DP4 ligand peptides exhibiting this motif are the overlapping peptides NY-ESO1 161-180 and NY-ESO1 156-175. Consequently, this motif proposed by FALK et al. does not make it possible to define a binding motif for DP4 molecules shared by all of the ligand peptides of DP4 molecules, identified by functional tests. While tests for binding to DP9 molecules (DONG et al, J.
  • Immunol, 2000, 164, 3177 allow the isolation of specific peptides from DP9 and DP2 respectively, these tests do not make it possible to isolate specific peptides of DP4 (CHICZ et al, cited above): the peptides isolated by the DP2 binding test have a strong affinity for DP2 (binding activity ⁇ 10 nM) whereas peptides known to be restricted to DP4, such as the peptide HBsAg 14-33, exhibit poor activity (20 ⁇ M). In addition, due to the significant differences in the residues of the binding site between the main DP molecules, the binding tests developed for these molecules do not make it possible to identify peptides restricted to DP4.
  • binding motifs shared by all of the peptides capable of binding to HLA-DP4 molecules have not been identified, in particular because there is no simple method for identifying such peptides. to be implemented and adapted to the simultaneous screening of a large number of peptides as overlapping peptide libraries representing the antigen sequence of interest.
  • the peptides that bind to DP4 molecules constitute candidate peptides for specific immunotherapy and vaccination and could be used to diagnose the immune status of normal patients or individuals.
  • the inventors therefore developed a process for selecting HLA-DP4 ligands which enabled them to isolate specific ligands for HLA-DP4, in particular peptides and to specify the binding motif shared by the HLA ligand peptides. -DP4, from the peptides obtained.
  • the subject of the present invention is a method for selecting ligand molecules for HLA-DP4 comprising the following steps:
  • Zi and Z 2 are zero or each represent a peptide of 1 to 100 natural or synthetic amino acids, preferably from 1 to 30 amino acids; even more preferably, from 1 to 10 amino acids,
  • - X 6 represents an aromatic or hydrophobic amino acid, or else a cysteine (C),
  • - X represents an aromatic or hydrophobic amino acid and / or X represents an aromatic or hydrophobic amino acid, or else a cysteine (C), an aspartic acid (D), a glutamine (Q), a serine (S), a threonine (T ) or a glutamic acid (E), and
  • X 3 , X 4 , X 5 , X 7 and X 8 each represent a natural or synthetic amino acid, in the presence of different concentrations of molecule (s) to be tested,
  • residues Xi, X 6 and X 9 of the general formula (I) as defined above, which constitute the anchoring residues in the pockets of the HLA-DP4 molecule, are also called residues PI, P6 respectively. and P9.
  • residues XI (or PI) and X6 (or P6) are the residues which contribute mainly to the binding to HLA-DP4.
  • residue X 9 or P 9 is less important and contributes less to the binding to HLA-DP4.
  • - hydrophobic amino acid an amino acid selected from (one-letter code): A, V, L, I, P, W, F and M.
  • step (i) makes it possible to effectively select specific ligands d 'HLA-DP4, that is to say molecules, in particular peptides, which have a good affinity for HLA-DP4, that is to say a binding activity ⁇ 1000 nM.
  • a tracer peptide in accordance with the invention is selected by implementing a direct test for binding to HLA-DP4, for example by following steps (i) (ii) and (iii) of the protocol defined above but by absence of competitor, corresponding to the molecule to be tested.
  • the appropriate signal detected (fluorescence, etc.) reveals the HLA-DP4 / tracer peptide complexes [step (iii)] and the background noise represents the corresponding signal, obtained in the absence of HLA-DP4.
  • - X 6 is selected from L, I, W, F, M, Y and C
  • - Xi is selected from A, V, L, I, W, F, M and Y
  • / or X 9 is selected from A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T and E.
  • Tracer peptides in accordance with the invention are represented by the peptides NS-p2 (SEQ ID NO: 4), MAG 247-258 (SEQ ID NO: 9), UL21 283-293 (SEQ ID NO: 12), IL3 127 -146 (SEQ ID NO: 13), UNK1 (SEQ ID NO: 14), UL21 283-302 (SEQ ID NO: 18) and MAG 245-258 (SEQ ID NO: 19).
  • the tracer peptide is chosen from the group consisting of biotinylated, radiolabelled peptides and peptides coupled to a fluorochrome.
  • step (ii) the separation of the complexes formed from the unbound peptides is carried out for example, by transfer of the complexes formed on a microtiter plate previously coated with an antibody specific for HLA-DP, by chromatography on a column gel-filtration or by centrifugation.
  • the HLA-DP4 / tracer peptide complexes are detected directly by measuring the radioactivity or the fluorescence emitted by said complexes.
  • the HLA-DP4 / tracer peptide complexes are detected indirectly using streptavidin conjugate, for example by an immunoenzymatic revelation using streptavidin conjugated to an enzyme such as alkaline phosphatase and an alkaline phosphatase substrate such as 4-methyl-umbelliferyl phosphate (MUP).
  • an enzyme such as alkaline phosphatase and an alkaline phosphatase substrate such as 4-methyl-umbelliferyl phosphate (MUP).
  • MUP 4-methyl-umbelliferyl phosphate
  • the tracer peptide is used at a concentration ⁇ 200 nM, preferably less than 20 nM; even more preferably, the tracer is used at the concentration of
  • said HLA-DP4 of step i) is chosen from the group consisting of molecules coded by the alleles DPA1 * 103 / DPB 1 * 0401 and DPA1 * 103 / DPB 1 * 0402.
  • the method according to the invention advantageously makes it possible to select any ligand for HLA-DP4; these are both mineral or organic molecules such as peptides and pseudopeptides.
  • said molecules to be tested represent a library of overlapping peptides covering the sequence of an antigen.
  • the present invention also relates to HLA- ligands
  • DP4 capable of being obtained by the selection process as defined above, corresponding to a mineral or organic molecule, natural or synthetic, exhibiting a HLA-DP4 binding activity of less than 1000 nM.
  • the HLA-DP4 binding activity of a ligand molecule corresponds to the concentration of said ligand molecule which inhibits 50% of the binding to HLA-DP4 of a labeled tracer peptide, in a competitive test such as the HLA-DP4 ligand selection process defined above.
  • modified peptides and peptides such as glycopeptides, lipopeptides, peptides comprising amino acids D, pseudo-peptide bonds (pseudo-peptides) or modifications of the C- ends or N-terminals.
  • the lipid part of the ligopeptide ligand is obtained in particular by adding a lipid motif on an amino function of said peptides or on a reactive function of the side chain of an amino acid of the peptide part; it may comprise one or more chains, derived from C 4 -C 20 fatty acids, possibly branched or unsaturated (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, 2-amino hexadecanoic acid, pimelautide, trimetauxide) or derived from 'a steroid.
  • the process for the preparation of such lipopeptides is described in particular in International Applications WO 99/401 13 or WO 99/51630.
  • the preferred lipid part is in particular represented by an N ⁇ -acetyl-lysine N ⁇ (palmitoyl) group, also called Ac-K (Pam).
  • N ⁇ -acetyl-lysine N ⁇ (palmitoyl) group also called Ac-K (Pam).
  • its peptide sequence corresponds to the general formula (I) Z
  • - Zi and Z 2 are zero or each represent a peptide of 1 to 100 amino acids as defined above, preferably from 1 to 30 amino acids; even more preferably, from 1 to 10 amino acids,
  • - X 6 represents an aromatic or hydrophobic amino acid or else a cysteine (C),
  • - Xi represents an aromatic or hydrophobic amino acid and / or X 9 represents an aromatic or hydrophobic amino acid, or else a cysteine (C), an aspartic acid (D), a glutamine (Q), a serine (S), a threonine (T) or glutamic acid (E), and
  • HLA-DP4 ligand peptide of general formula (I) each represent a natural or synthetic amino acid, provided that said HLA-DP4 ligand peptide of general formula (I) does not correspond to any of the sequences SEQ ID NO: 1 to 17.
  • - X 6 is selected from L, I, W, F, M, Y and C, and
  • - Xi is selected from A, V, L, I, W, F, M and Y, and / or X 9 is selected from A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D , Q, S, T and E.
  • said ligand peptide binds specifically to DPB 1 * 0401 (binding activity to DPB 1 * 0401 at least twice greater than the binding activity to DPB 1 * 0402) and X 6 is different from C, and / or Xi is different from A and V, and / or X 9 represents W or Y or X 9 is different from E and C, and / or X 4 is different from K and R.
  • said ligand peptide binds specifically to DPB 1 * 0402 (activity of binding to
  • DPB 1 * 0402 at least twice as high as the binding activity to DPB 1 * 0401) and X 6 represents C, and / or Xi represents A or V, and / or X 9 represents E or C or X 9 is different - rent of Y and W, and / or X 4 represents K or R.
  • and Z 2 are chosen from the group consisting of: the sequences of the antigen which are adjacent to the CD4 + epitope restricted to HLA-DP4 as defined above, and / or
  • CD4 + epitopes such as the peptide 830-846 of the tetanus toxin TT (O'SULLIVAN et al, J. Immunol, 1991, 147, 2663-2669), the peptide 307-319 of the HA hemagglutinin of the virus influenza (O'SULLIVAN et al, cited above), the Pan DR or PADRE epitope (ALEXANDER et al, DEL GUERCIO et al, FRANKE et al, cited above) and peptides derived from Plasmodium falciparum antigens such as peptide CS.T3 (SINIGAGLIA et al. Nature, 1988, 336, 778-780) and peptides CSP, SSP2, LSA-1 and EXP-1 (DOOLAN et al, J. Immunol, 2000, 165, 1 123-1137 ) and or
  • B epitopes for example a peptide or a glyco-peptide in which said B epitope consists of a sugar (ALEXANDER et al, cited above).
  • B epitopes for example a peptide or a glyco-peptide in which said B epitope consists of a sugar (ALEXANDER et al, cited above).
  • Such sequences advantageously make it possible to trigger or modulate an immune response, in an appropriate manner.
  • said ligand peptide has the sequence SEQ ID NO: 84 corresponding to the peptide NY-ESO1 87-1 1 1.
  • the present invention also includes the ligand peptides as defined above, polymerized.
  • the subject of the present invention is also a method of identifying peptide ligands for HLA-DP4 as defined above, from an amino acid sequence, characterized in that it comprises at least the following steps a) the establishment of a binding matrix to HLA-DP4 by calculation, for all the mutants of a tracer peptide as defined above, representing all of the substitutions of the residues in position 1, 4, 6 or 9 of said tracer peptide by the 19 other natural amino acids, the ratio of IC 50 of said mutant peptides and of said tracer peptide, using the HLA-DP4 binding test as defined above in the above method , b) evaluation of the binding to HLA-DP4 of peptides of at least 9 amino acids included in said amino acid sequence, by calculation, for each 9 amino acid fragment of said peptide, of the sum of the binding scores to HLA-DP4 residues at position 1, 4, 6 and 9 of said fragment, from the binding matrix established in a), and c) identification of the ligand peptides of HLA
  • This HLA-DP4 binding matrix which is illustrated for the reference peptide UNK 3-15 (SEQ ID NO: 28), by Table XLV of Example 6, makes it possible to estimate the binding activity to HLA- DP4 of any peptide of at least 9 amino acids; peptides with binding scores of 0, 1, 2, 3 and 4 respectively correspond to peptides with a binding loss of a factor of 1, 10, 100, 1000 and 10000 compared to the peptide UNK 3-15 (IC 50 10 nM), that is to say having an estimated binding activity of 10 nM, 100 nM, 1000 nM, 10 ⁇ M and 100 ⁇ M respectively.
  • the process for identifying HLA-DP4 ligand peptides according to the invention which is easy to implement and can be automated makes it possible, in particular using an appropriate software, to predict the sequence of HLA- ligand peptides DP4 present in all proteins representing antigens of interest.
  • the peptide sequences thus identified can then be verified by an HLA-DP4 binding test, defined in the method of selecting HLA-DP4 ligands according to the invention.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule, characterized in that it codes for a ligand peptide as defined above.
  • the subject of the invention also encompasses recombinant nucleic acid molecules comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention linked to at least one heterologous sequence.
  • heterologous sequence relative to a nucleic acid sequence coding for a ligand peptide, any nucleic acid sequence other than those which, in nature, are immediately adjacent to said nucleic acid sequence encoding a peptide.
  • the object of the present invention includes in particular:
  • nucleic acid molecule in accordance with the invention and the sequences necessary for controlling the transcription and translation of said nucleic acid molecule (promoter, intron, initiation codon ( ATG), stop codon, polyadenylation signal), and
  • these expression vectors comprise at least one expression cassette as defined above.
  • Many vectors into which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known in themselves; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence in extrachromosomal form, or else integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
  • viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses and AAVs, in which the sequence of interest has been inserted, may be used, among others. It is also possible to associate said sequence (isolated or inserted into a plasmid vector) with a substance enabling it to cross the membrane of host cells, for example a preparation of liposomes, lipids or cationic polymers, or inject it directly into the host cell, in the form of naked DNA.
  • the invention further relates to prokaryotic or eukaryotic cells transformed with at least one nucleic acid molecule according to the invention.
  • Transformed cells according to the invention can be obtained by any means, known in themselves, making it possible to introduce a nucleic acid molecule into a host cell.
  • a nucleic acid molecule into a host cell.
  • the present invention also relates to an immunomodulatory composition, characterized in that it comprises at least one HLA-DP4 ligand or a nucleic acid molecule coding for an HLA-DP4 ligand peptide as defined above, and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • said nucleic acid molecule is included in a vector as defined above.
  • such an immunomodulatory composition results in either activation of the T lymphocytes or their anergy. Indeed, it has been shown that a single injection, by the subcutaneous route, of a small amount of peptide leads to an anergy (OLDFIELD et al, J. Immunol, 2001, 167, 1734-1739.). On the other hand, it is known that repeated injections of higher amounts of peptide in the presence of adjuvant causes activation of the T lymphocytes. In addition, the association with peptides and Z 2 as defined above, also makes it possible to increase the specific immune response of the antigen (ALEXANDER et al, cited above).
  • said composition is used both for vaccination against a pathogenic agent or a tumor cell, and for the treatment of autoimmune diseases (multiple sclerosis, insulin-dependent diabetes), of allergy or of transplant rejection.
  • the present invention also relates to a reagent for diagnosing the immune state of an individual, characterized in that it comprises at least one HLA-DP4 ligand as defined above, optionally labeled or complexed, in particular complexed to labeled HLA-DP4 molecules (biotinylated), in the form of multimeric complexes such as tetramers.
  • the present invention also relates to the use of an HLA-DP4 ligand or of a nucleic acid molecule coding for an HLA-DP4 ligand peptide as defined above for the preparation of a medicament.
  • immunomodulator or reagent for diagnosing the immune status of an individual.
  • the term “diagnosis of the immune state of an individual” means the detection of the presence, in said individual, of CD4 + T lymphocytes specific for an antigen derived from a pathogenic agent or from 'a tumor cell, an allergen, an alloantigen or an autoantigen.
  • the reagent according to the invention which is capable of detecting the presence of antigen-specific CD4 + T lymphocytes is used for the detection: of an infection by a pathogenic agent, of cancer, of an autoimmune disease, of 'an allergy or transplant rejection, from a patient's biological sample.
  • the present invention also relates to a method of diagnosing the immune state of an individual comprising the steps of:
  • the present invention also relates to a kit for detecting the immune state of an individual, characterized in that it comprises at least one reagent as defined above, associated with a means for detecting specific CD4 + T lymphocytes of an antigen.
  • CD4 + T lymphocytes specific for an antigen is carried out by any means known in themselves.
  • direct means such as lymphocyte proliferation tests or flow cytometry in the presence of multimeric complexes as defined above can be used, or indirect means such as the assay of cytokines such as 1TL2, 1TL4, 1TL5 and INF ⁇ , in particular by immunoenzymatic techniques (ELISA, RIA, ELISPOT).
  • a suspension of cells (PBMC, PBMC depleted in CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with the peptides as defined above or cloned T lymphocytes) is cultured for 3 to 5 days in the presence of said ligands of HLA-DP4 and, if necessary, suitable presenting cells, such as dendritic cells, autologous or heterologous PBMCs, lymphoblastoid cells such as those obtained after infection with the EBV virus or genetically modified cells. Cell proliferation is measured by incorporation of tritiated thymidine into cell DNA.
  • the peptides as defined above make it possible to reveal in the initial suspension the presence of cells specific for these peptides.
  • the ELISPOT test makes it possible to reveal the presence of T cells secreting IFN- ⁇ , specific for a peptide as defined above. More specifically, the T cells are revealed by measuring the secretion of IFN- ⁇ after incubation of the PMBCs of the patients with said peptides in accordance with the method described in International Application WO 99/51630 or Gahéry-Ségard et al, ( J. Virol, 2000, 74, 1964).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • - labeled cells are analyzed by flow cytometry.
  • it prior to bringing the biological sample into contact with said complex, it is enriched in CD4 + T cells, by bringing it into contact with anti-CD4 antibodies, to enrich said sample.
  • the tetramers are prepared, as specified, for example in NOVAK et al. (J. Clin. Investig, 1999, 104, R63-R67) or in KURODA et al. (J. Virol, 2000, 74, 18, 8751-8756
  • the tetramers are produced by incubating, for 72 hours at 37 ° C. and in a 10 mM citrate phosphate buffer, 0.15 M NaCl at a pH between 4.5 and 7, soluble and biotinylated HLA II molecules with a factor 10 excess of HLA-DP4 ligands as defined above.
  • the tetramerized form is obtained by adding to the preparation of streptavidin marked with a fluorochrome in an amount four times less (mole to mole) compared to the HLA II molecules. The whole is incubated overnight at room temperature.
  • a suspension of cells (PBMC, PBMC depleted in CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with the HLA-DP4 ligands as defined above) or lymphocytes is brought into contact.
  • T clones with one or more tetramers (10 to 20 mg / ml) for 1 to 3 hours. After washing, the suspension is analyzed by flow cytometry: the labeling of the cells by the tetramers is visualized by the fact that these constructions are fluorescent.
  • Flow cytometry makes it possible to separate the cells marked by the tetramers from the unmarked cells and thus to perform cell sorting.
  • a further subject of the present invention is thus a method for sorting CD4 + T lymphocytes specific for an antigen, characterized in that it comprises at least the following steps:
  • FIG. 1 illustrates the activity of binding peptides to HLA-DP4 molecules coded respectively by DPB 1 * 0401 (A) and DPB 1 * 0402 (B), determined according to the process in accordance with the invention with the tracer peptide, biotinylated UNK1 peptide (10 nM); the percentage of binding to DP4 molecules is expressed as a function of the molar concentration of the peptides. The maximum binding (100%) corresponds to the value obtained for the tracer peptide alone, in the absence of peptide competitor.
  • UNK UNK1 (SEQ ID NO: 14), IL: IL3 127-146 (SEQ ID NO: 13), MAG: MAG 245-258 (SEQ ID NO: 19), NSP2: SEQ ID NO: 4, TT: TT 947-963 (SEQ ID NO: 20), DQB: DQB 43-57 (SEQ ID NO: 23), HCI 46-63: SEQ ID NO: 24) and HA: HA 306-318 (SEQ ID NO: 21) , - Figure 2 illustrates the correlation between the HLA- binding score
  • DP4 (estimated by the HLA-DP4 ligand peptide identification method according to the invention) and the affinity for HLA-DP4 molecules (determined by the IC 50 value, measured using the binding to HLA-DP4 defined in the process for selecting peptide ligands for HLA-DP4 according to the invention), analyzed on a set of 44 peptides.
  • the peptides are biotinylated at their terminal NH 2 residue, according to the protocol as described in Texier et al, cited above.
  • Antibodies specific for HLA-DP molecules such as antibody B7 / 21 (WATSON et al, N ⁇ twre, 1983, 304, 358-361), are purified from the culture supernatant of the corresponding hybridomas, on columns of Protein A - Sepharosis. These antibodies are then coupled on Sepharose 4B or protein A-Sepharose columns for the purification of HLA-DP4 molecules.
  • the culture supernatant of the cells producing the antibody B7 / 21 is filtered at 0.22 ⁇ m and its pH is adjusted to 7-8 with Tris buffer. 0.1 M HCl, pH 8. This supernatant is then applied to a 10 ml column of Protein A Sepharose 4 Fast Flow, previously washed with 100 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 8. Then, the column is washed with 100 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer, pH 8 and 100 ml of 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 8. The antibodies are eluted with the 0.1 M glycine HCl buffer, pH 3.
  • the column is rinsed with 100 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer, pFI 8.
  • the eluted fraction which contains the antibody B7 / 21 is immediately neutralized with 1 M Tris-HCl buffer, pH 8 before being dialyzed extensively against 0.1 M borate buffer, pH 8.2.
  • the quantity of antibodies obtained is determined from the optical density (OD) at 278 nm.
  • the affinity columns intended for the purification of the HLA-DP4 molecules are prepared in the following manner: 0.75 g of Protein A Sepharose 4B (3 ml of final gel) are put to swell in water and then in buffer 0.1 M borate pH 8.2. 15 mg of monoclonal antibody, such as B7 / 21 in 0.1 M borate buffer pH 8.2 are added to the gel, previously centrifuged. The coupling is carried out for two hours at room temperature and then controlled by the absorbance at 278 nm of the supernatant.
  • the gel is then washed successively with 100 ml of 0.1 M borate buffer, pH 8.2, 120 ml of 0.2 M triethanolamine buffer, pH 8.2; 120 ml of 20 mM dimethylpyrimi- date buffer, 0.2 M triethanolamine, pH 8.2 and 150 ml of 0.2 M ethanolamine buffer pH 8.2. After pouring the gel, it is rinsed with 150 ml of 0.1 M borate buffer, pH 8.2.
  • the final coupling control is carried out by elution in 0.1 M glycine buffer, pH 2.5, 0.5 M NaCl, the absorbance at 278 nm of the 1 ml fractions must be less than 0.1.
  • HLA-DP4 molecules are purified from various human lines of B lymphocytes transformed by the Epstein Barr virus (EBV) homozygous for DP, by immunoaffinity using monoclonal antibodies specific for all molecules DP. The origin of the lines and the alleles which characterize them are indicated in Table IV.
  • EBV Epstein Barr virus
  • HLA-DP4 molecules The purification of HLA-DP4 molecules is carried out from a pellet of these human cells transformed by EBV, according to a protocol derived from those used for the HLA-DR molecules (GORGA et al, J. Biol.Chem., 1987, 262
  • 5 to 6.10 cells are lysed at a concentration of approximately 10 8 cells / ml in lysis buffer (Tris 0.01 M, NaCl 0.15 M, NaN 3 0.02%, pH 7 , NP40 1%, aprotinin 10 ⁇ g / ml, EDTA 5 mM, PMSF 10 ⁇ M) in ice for 30 minutes.
  • the lysis medium is freed from large cellular debris by centrifugation at 1100 g for 10 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant is then ultracentrifuged at 100,000 g at 4 ° C for 1 hour. The rest of the purification takes place in a cold room at 4 ° C.
  • the lysate is passed successively over a column of Sepharose 4B (10 ml of gel prepared in PBS lx), a column of Protein A Sepharose 4B (5 ml of gel prepared in 2 PBS lx) then over the column of anti-DP affinity .
  • the columns are then rinsed with 250 ml of lysis buffer.
  • the Sepharose 4B column is discarded.
  • the Protein A Sepharose 4B column is rinsed with 25 ml of TBS 1x buffer (0.01 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.02% NaN 3 , pH 7); 50 ml of buffer (glycine, 0.1M; 0.5M NaCl, pH 2.5) and 200 ml of PBS lx buffer, before being stored at 4 ° C.
  • the anti-DP column is rinsed with 250 ml of TBS buffer containing 1 mM dodecyl maltoside (DM). It is then eluted individually with the elution buffer (100 mM Na 2 CO 3 , 500 mM NaCl, 0.02% NaN 3 , 1.1 mM DM, pH 1 1.5) in 15 fractions of 3 ml. The eluate is immediately neutralized with 10% of buffer (2 M Tris-HCl, pH 6.8), then dialyse extensively at 4 ° C against buffer
  • DM dodecyl maltoside
  • HLA-DR1 MARSHALL et al, cited above, HLA-DR 1 , -DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DRU and -DR13: Patent FR 99 0879 and TEXIER et al, cited above). It is performed in 96-well plates, which makes it possible to study numerous samples in the same experiment. Briefly, the purified HLA-DP4 molecules are incubated with a biotinyl peptide which serves as a tracer and different concentrations of the peptide to be tested.
  • the biotinyl peptide is a ligand peptide of DP4, it is a peptide recognized by CD4 + T lymphocytes specific for DP4 such as those specified in Table III above or a new peptide isolated using this DP4 binding test.
  • these peptides there may be mentioned for example the peptide UNK1 or the peptide IL3 127-146.
  • the incubation is carried out in a buffer, the pH of which may vary. It is generally 5, the incubation generally lasts 24 hours. After incubation, the samples are neutralized, then 100 ⁇ l of each sample is transferred to an ELISA plate previously sensitized with an anti-DP antibody, such as B7 / 21.
  • the binding of peptides to the two DP4 molecules was analyzed by ELISA by the direct binding test. following: The HLA-DP4 molecules purified according to the protocol described in Example 1 are diluted 10 times in 10 mM phosphate buffer (1/10 dilution).
  • the biotinyl peptide linked to the HLA-DP molecules is detected by the addition of 100 ⁇ l / well of the streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (45 minutes) diluted to 1/2000 in the Tris 10 mM buffer pH 7, 0.15 M NaCl; Tween 20 0.05%, BSA 0.2%, thimerosal 0.003%, then by adding 200 ⁇ l / well of the 100 ⁇ M MUP substrate in 0.05 M NaHCO 3 buffer pH 9.8, 1 mM MgCl.
  • bHA peptide 306-318 PHYVKQNTLKLAT; SEQ ID NO: 21
  • HLLL et al J. Immunol, 1994, 152, 2890
  • bYKL peptide AAYAAAKAAALAA; SEQ ID NO: 22
  • Table V Selection of the tracers by a direct test for binding to HLA-DP4
  • HLA-DP4 molecules purified according to the protocol described in Example 1 were diluted 1/10, 1/20, 1/40 and 1/80, in 10 mM phosphate buffer; 150 mM NaCl, 1 mM DM; citrate 10 mM, thimerosal 0.003% at different pH (pH 4; 5; 5.5; 6; 6.5 and 7), with the peptide bUNKl at different concentrations and several concentrations of competing peptides in 96-well polypropylene plates.
  • the samples were neutralized with 50 ⁇ l of 450 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, 0.003% thimerosal, 0.3% BSA, 1 mM DM.
  • the biotinyl peptide linked to the HLA-DP molecules was detected by the addition of 100 ⁇ l / well of the streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (45 minutes) diluted to 1/2000 in the 10 mM Tris buffer pH 7, 0.15 M NaCl , Tween 20 0.05%, BSA 0.2%, thimerosal 0.003%, then by adding 200 ⁇ l / well of the 100 ⁇ M MUP substrate in 0.05 M NaHCO 3 buffer, pH 9.8, MgCl 2 1 mM.
  • the fluorescence emission by the product of the enzymatic reaction was measured at 450 nm after excitation at 365 nm.
  • EPRAPWIEQEGPEYWDQE SEQ ID NO'24
  • HA 306-318 SEQ ID NO 21 which are known to bind respectively to molecules HLA-DQ3, HLA-DQ2 and HLA-DR (MARSHALL et al, cited above, JOHANSEN and al, Immunogenetics, 1996, 45, 142).
  • FIG. 1 shows that the UNK peptide which is the non-biotinyl counterpart of the tracer peptide bUNK totally inhibits the tracer binding both on the HLA-DPB 1 * 0401 molecule and on the DPB 1 * 0402 molecule.
  • each mutant contains only one of the residues Y4, F5, T8, Q9, F10, El i, P12, L13 substituted with alanine or lysine, the residue K3 substituted with alanine, or one of the residues A6, A7, A 14 and A 15 substituted with lysine.
  • the binding activity of the peptides was determined by the competitive binding test, under the conditions defined in Table VI.
  • the loss of binding of the mutant peptides is expressed by the IC 50 ratio of the mutant peptide and the UNK1 peptide. c) determination of the binding motifs to the DP401 and DP402 molecules
  • - P6 Y, L, W, E, N, T, D, G, H, I, M, P, Q, R, S, V, W or C, - P9 'F, Y, E, D, N, R, V, G, H, I, P, Q, S, T or W.
  • Table Xa Loss of binding to DP401 and DP402 'of the mutants in PI, P4. , P6 and P9 (SEQ ID NO;: 56 to 81)
  • Table Xb Loss of binding to DP401 and DP402 * of the mutants in PI, P4, P6 and P9 (SEQ ID NO: 96 to 129) peptides 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 loss
  • the pocket P4 of the DP4 molecule binding site is very permissive, and to a lesser extent the pocket P9 which also accepts residues Q, S,
  • the DPB 1 * 0401 allele accepts a tyrosine or tryptophan residue in P9 but does not accept cysteine and glutamic acid residues at this position, nor alanine and valine residues in PI, nor lysine and arginine residues in P4 or still of cysteine residue in P6, the DPB allele 1 * 0402 accepts an alanine or valine residue in PI, a lysine or arginine residue in P4, a cysteine residue in P6 and a cysteine or glutamic acid residue in P9 but does not accept tyrosine or tryptophan residue at this position d) Identification of a binding motif in the sequence of DP4 ligand peptides
  • the binding activity of different DP4 ligand peptides was measured by the competitive binding test, under the conditions defined in Table NI. The results are expressed by the IC 50 value (Table XIII) or by the value of the IC 50 ratio of the ligand peptide and the U ⁇ K1 peptide (Table XII).
  • MARTI 1-20, 41-60, 51-73, 62-72, 103-1 18 SEQ ID NO: 90, 91, 87, 92, 93.
  • Table XIII Binding of the peptides Api ml, NY-ESOl and MARTI to DPB1 * 0401 and DPB1 * 0402 *.
  • a binding matrix molecules HLA-DP4 has been established from the binding activities (IC5 0) mutants UNK peptide 3-15 measured by the binding assay DP4 molecules encoded by alleles DPB 1 * 0401 and DPB1 * 0402, as defined above, using as a tracer peptide the peptide UNK 3-15 (Example 5 and Tables LX, Xa, Xb and XI).
  • the contribution of each of the amino acids in position PI, P4, P6 and P9 of said mutant peptides to the binding to the molecules DP * 0401 and DP * 0402 is evaluated by a binding score corresponding to the logarithm (log) of the ratio of IC 50 of mutant peptide and UNK peptide 3-15.
  • the binding of peptides of at least 9 amino acids included in said sequence is calculated from the above matrix by performing, for each 9 amino acid fragment of said peptide, for example overlapping fragments of 9 amino acids covering the entire sequence, the sum of the residue binding scores at positions 1, 4, 6 and 9 of said fragment.
  • the peptides having the lowest binding scores preferably less than 2, preferably less than 1, even more preferably close to 0 are selected; these peptides correspond to those whose binding activity to HLA-DP4, estimated from the binding matrix as defined above, is the highest.
  • Table XV HLA-DP4 binding score and binding activity of different peptides
  • DP * 0401 and DP * 0402 have a low affinity for these molecules (IC50> 1000 nM, true negative peptides).
  • the HLA-DP4 binding matrix can be used to predict the sequence of HLA-DP4 ligand peptides from any amino acid sequence, in particular a sequence representing an antigen of interest.

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Abstract

Procédé de sélection de molécules ligand d'HLA-DP4 comprenant les étapes suivantes: (i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur de formule générale (I) Z1X1X2X3X4X5X6X7X8X9Z2, dans laquelle: Z1 et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés, X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien une cystéine, et X1 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X9 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien C, D, Q, S, T ou E, et X2,X3,X4,X5,X7 et X8 représentent chacun un acide aminé, en présence de différentes concentrations de molécule(s) à tester, (ii) séparation des différents complexes formés, (iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur, et (iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de liaison IC50 < 1000 nM, et ses applications.

Description

PROCEDE DE SELECTION DE LIGANDS DΗLA-DP4 ET SES APPLICATIONS
La présente Invention est relative à un procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 et à ses applications. Les lymphocytes T CD4+ font partie des principales cellules régulatrices de la réponse immunitaire. Spécifiques des antigènes, ils sont en effet capables de reconnaître la présence d'un agent pathogène, d'un allergène ou d'une cellule tumorale et de déclencher une réponse immunitaire. La reconnaissance de ces antigènes conduit en effet à l'activation des lymphocytes T CD4+ qui sécrètent la plupart des cyto ines nécessaires au recaitement de cellules effectrices que sont les lymphocytes CD8+ cytotoxiques et les lymphocytes B producteurs d'anticorps. Les lymphocytes T CD4+ interviennent également dans l'activation des cellules par des contacts cellulaires et par exemple induisent l'activation, par la molécule CD40, des cellules dendritiques présentatrices de l'antigène. L'activation des lymphocytes T CD4+ est un pronostic favorable lors des infections par des virus tels que le virus de l'immunodéfi- cience humaine (VTH), les papillomavirus humains (HPV) ou le virus de l'hépatite C (HCV) et ces cellules apparaissent comme nécessaires à l'immunité anti-tumorale. Leur rôle n'est toutefois pas systématiquement bénéfique pour l'organisme. Les maladies autoimmunes résultent très souvent d'une activation incontrôlée de lymphocytes T CD4+. C'est le cas de la sclérose en plaque et du diabète insulino-dépendant. Ces lymphocytes contribuent également à l'établissement des maladies allergiques. L'IL4, qui est principalement sécrétée par les lymphocytes T CD4+, est en effet le principal facteur qui conduit à la production d'IgE. Enfin, le rôle des lymphocytes T CD4+ dans le déclenchement du rejet de greffe est bien établi. Ainsi, selon la maladie, les traite- ents visent à déclencher l'activation des lymphocytes T CD4+ (vaccination contre un agent pathogène ou une cellule tumorale) ou à diminuer l'état d'activation des lymphocytes T CD4+ (désensibilisation contre l'allergie, prévention du rejet de greffe).
L'activation des lymphocytes T CD4+ se fait sous l'effet de la présentation de peptides antigéniques par les molécules du complexe majeur d'histo- compatibilité de type II que portent les cellules présentatrices d'antigène (APC pour Antigen Presenting Celî) ; chez l'homme, elles sont dénommées molécules HLA II pour Human Leucocyte Antigen type II. Ces peptides antigéniques, appelés épitopes T, résultent de la dégradation protéolytique des antigènes par les cellules présentatrices d'antigène. Ils ont des longueurs variables, généralement de 13 à 25 acides aminés et possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA IL II est bien connu qu'au même titre que l'antigène natif, un peptide épitope T est capable de stimuler in vitro des lymphocytes T CD4+ qui lui sont spécifiques ou de les recruter in vivo. Il est donc suffisant pour induire une réponse T CD4+. D'une manière intéressante, on sait également que selon les modes de présentation (voie d'administration, doses, adjonction ou non d'un adjuvant), la reconnaissance de ces peptides entraîne soit une activation des lymphocytes T CD4+ (ALEXANDER et al., J. Immunol, 2000, 164, 1625-1633 ; DEL GUERCIO et al, Vaccine, 1997, 15, 441-448 ; FRANKE et al., Vaccine, 1999, 17, 1201-1205), soit leur anergie (MULLER et al., J. Allergy Clin. Immunol., 1998, 101, 747-754 ; OLDFIELD et al., J. Immunol, 2001, 167, 1734- 1739). Ces peptides épitopes T sont donc susceptibles à la fois de participer à la composition d'un vaccin ou de servir à diminuer l'activation non désirée de lympho- cytes T CD4+. Ils sont également susceptibles de participer à un test de diagnostic de l'état immunitaire de patients ou d'individus normaux reposant sur la détection directe (test de prolifération lymphocytaire) ou indirecte (production d'anticorps, de cyto- kines...) desdits lymphocytes T CD4+ activés.
Un des problèmes majeurs qui limite l'utilisation de ces peptides est l'identification de ces épitopes, étant donné que leur séquence varie d'un individu à l'autre en raison du polymorphisme des molécules HLA IL En effet, les molécules HLA II sont des hétérodimères constituées d'une chaîne alpha (α) et d'une chaîne béta (β) polymorphes. Il existe quatre types de molécules HLA II par individu (2 HLA-DR, 1 HLA-DQ et 1 HLA-DP). La molécule HLA-DR dont la chaîne béta (β) est codée par le gène DRBl est la plus exprimée. A ce jour, la chaîne béta codée par le gène DRBl est la plus polymorphe et compte 273 allèles. Pour les molécules HLA-DQ et HLA-DP, les deux chaînes (α et β) qui les constituent sont polymorphes mais elles présentent moins d'allèles. On compte en effet 21 allèles DQA1 (chaîne α de HLA- DQ), 45 allèles DQB1 (chaîne β de HLA-DQ), 19 allèles DPA1 (chaîne α de HLA- DP) et 93 allèles DPBl (chaîne β de HLA-DP). Cependant, la combinaison entre les deux chaînes α et β codées par ces allèles donne naissance à de nombreuses molécules HLA-DQ et HLA-DP. Du fait de ce polymorphisme, ces isoformes possèdent des propriétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent lier des peptides différents d'un même antigène. Ainsi, chaque individu reconnaît dans un antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II qui le caractérise. Comme il existe un grand nombre d'allèles LILA II, on peut supposer qu'il existe dans une séquence donnée un répertoire important de peptides épitopes T de séquences très différentes, chacun spécifique d'un allèle différent.
Toutefois, cette diversité de molécules HLA II n'est pas aussi importante à l'échelle de chaque population qu'à l'échelle mondiale comme illustré par le Tableau I ci-dessous.
Tableau I : Fréquences géniques des molécules HLA de classe II les plus abondantes dans la population Caucasienne (Europe, USA) *, d'après Colombani J., 1993, HLA: fonctions immunitaires et applications médicales, Eds John Libbey Enrotext.
Molécules Chaîne α Fréquence Chaîne β Fréquence Molécules abondantes (%) (%)
HLA-DR DRA*0101 100 DRB1*0101 9,3 DRA*0101/DRB1*0101
DRB1*1501 8,0 DRA*0101/DRB1*1501
DRB1*0301 10,9 DRA*0101/DRB1*0301
DRB 1*0401 5,6 DRA*0101/DRB1*0401
DRB1*1101 9,2 DRA*0101/DRB1*1101
DRB1*1301 6,0 DRA*0101/DRJB 1*1301
DRB 1*0701 14,0 DRA*0101/DRB1*0701
DRB3*0101 9,2 DRA*0101/DRB3*0101
DRB3*0202 12,0 DRA*0101/DRB 1*0202
DRB4*0101 28,4 DRA*0101/DRB4*0101
DRB5*0101 7,9 DRA*0101/DRB5*0101
HLA-DQ DQA1*0101 17,0 DQB 1*0501 14,9 DQA1*0101/DQB1*0501
DQA1*0102 15,8 DQB 1*0602 9,8 DQA 1*0501/ DQB 1*0301
DQA1*0201 12,4 DQB 1*0603 5,8 DQA1*0501/ DQB 1*0201
DQA 1*0301 14,5 DQB 1*0201 21,3 DQA1*0301/ DQB 1*0302
DQA 1*0501 20,9 DQB 1*0301 12,0 DQA 1*0102/ DQB 1*0602
DQB 1*0302 13,0 DQA 1*0201/ DQB 1*0201
HLA-DP DPA1*0103 78,2 DPB1*0101 7,1 DPA1*0201/DPB1*0101
DPA1*0201 21,2 DPB 1*0201 11,9 DP A 1*0103/ DPB 1*0201
DPB 1*0301 9,1 DPA 1*0103/ DPB 1*0301
DPB1*0401 40,1 DPA1*0103/DPB1*0401
DPB1*0402 11,0 DPA1*0103/DPB1*0402
*Les fréquences géniques des 2 molécules HLA-DP4 sont indiquées en gras. Ainsi, pour les molécules HLA-DR et HLA-DQ, une dizaine d'allèles suffisent pour couvrir plus de 60 % de la fréquence génique retrouvée dans la population caucasienne et donc concerner plus de 85 % de la population caucasienne. Pour les molécules HLA-DP, la molécule la plus fréquente est la molécule DP4 issue des allèles DPA1*0103 et DPB1*0401 qui ont des fréquences géniques de 78,2 % et 40 % respectivement. Trois autres molécules DP ont des fréquences qui dépassent les 5 % une molécule DP3 (DPA1*0103/DPB1*0301), une molécule DP2 (DPA1*0103/DPB1*0201) et une molécule DP4 (DPA1*0103/DPB 1*0402) , les molécules HLA II sont dénommées en fonction de l'allèle DPBl codant la chaîne β qui est la plus polymorphe
Ainsi, quatre molécules HLA-DP (1 molécule DP3, 1 molécule DP2 et 2 molécules DP4) suffisent donc pour couvrir 71 % de la fréquence génique de la population caucasienne, les deux molécules DP4, couvrant à elles seules 51 % Chacune de ces molécules DP4 comprend une chaîne α variable codée, soit par DPA1*0103 qui est la plus fréquente (78,2 %), soit par DPA1*0201 (20,2 %), les deux chaînes α différant uniquement au niveau de 3 acides aminés (positions 31 , 50 et 83 ; Tableau II) Les molécules HLA-DP4 qui présentent une fréquence allé que élevée dans la population caucasienne (de l'ordre de 50 % en Europe et 80 % en Amérique du Nord), sont également présentes à des fréquences non négligeables dans les autres populations (fréquence alléhque de l'ordre de 60 % en Amérique du Sud, 60 % en Inde, 25 % en Afrique et 15 % au Japon, Colombam et al , précité)
Tableau II : Polymorphisme des chaînes α et β des molécules HLA-DP dans la population Caucasienne (Europe, USA), d'après Colombam J , précité
Positions polymorphiques* Chaîne β Allèles Freq(%) 8 9 11 37 38 57 58 59 67 71 78 86 87 88 89
401 401 L F G F A A A E I K M G G P M
402 110 . . . . D E
201 119 - - - - V D E - - E
501 13 - - - L V E D - - -
101 71 V Y G Y D E A V
301 91 V Y L - V D E D L - V D E A V
901 11 V H L - V D E D I E V D E A V
Chaîne α Allèles Freq (%) 31 50 83
103 782 M Q T
201 212 Q R A * Les séquences, disponibles sur le site internet http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla. sont numérotées selon la numérotation de STERN et al. {Nature, 1994, 368, 215-221) pour la molécule HLA-DR ; comme les résidus en positions 23 et 24 sont absents dans les séquences de DPB, les résidus indiqués aux positions 37, 38, 57, 59, 67, 71, 78, 86, 87, 88 et 89 correspondent respectivement aux positions 35, 36, 55, 56, 57, 65, 69, 76, 84, 85, 86 et 87 dans la séquence de DPB.
Pourtant, malgré leur fréquence élevée chacune de ces molécules DP4 n'a été que très partiellement étudiée ; les études les plus nombreuses résultent en fait de l'isolement de clones de lymphocytes T CD4+ restreints aux molécules HLA- DP4 et spécifiques des peptides présentés dans le Tableau III, ci-après, issus des antigènes suivants :
- antigènes de microorganismes pathogènes tels que la toxine tétanique (WYSS CORAY et al, Eur J. Immunol, 1992, 22, 2295), l'antigène WI-1 de Blastomyces dermatitidis (CHANG et al, Inf Immun., 2000, 68, 502), la protéine hsp 65 de Mycobacterium bovis (GASTON et al, Int. Immunol, 1991, 3, 965-972), l'antigène S du virus de l'hépatite B (HBsAg pour Hepatitis B virus S antigen ; CELIS et al, J. Virol, 1989, 63, 747), la phosphoprotéine du virus de la rage (RV-NS pour Rabies Virus Non-Structural phosphoprotein) ou la neuraminidase du virus de la grippe (IBV-Nm pour influenza B virus Neuraminidase ; CELIS et al, J. Immunol, 1990, 145, 305) et la protéine UL21 du virus de Vherpes simplex de type 1 (KOELLE et al, J. Virol, 2000, 74, 10930-10938),
- allergènes tels que l'allergène majeur de Dermatophagoïdes ptero- nyssinus (HIGGINS, J. Allergy Clin. Immunol, 1992, 90, 749), et
- antigènes tumoraux tels que MAGE-A3 (SCHULTZ et al. Cancer Ray., 2000, 60, 6272), et NY-ESO1 (ZENG et al, P. N. A. S, 2001, 98, 3964-3969).
Tableau III: Séquences des peptides Iigands des molécules HLA-DP4
Figure imgf000007_0001
Les études précitées qui reposent sur l'isolement de clones de lymphocytes T CD4+ restreints aux molécules HLA-DP4 mettent en œuvre un test fonctionnel (test de prolifération) qui n'a pas permis de mettre en évidence un motif de liaison aux molécules DP4, partagé par l'ensemble de ces peptides. En outre, ce test est très lourd à mettre en œuvre du fait qu'il nécessite de nombreux patients correctement échantillonnés, de manière à ce qu'ils représentent la diversité des molécules HLA II de l'ensemble de la population. En outre, les épitopes définis sont ceux utilisés par le système immunitaire des patients lors de l'infection naturelle par un antigène ; ces épitopes ne sont pas nécessairement les plus efficaces pour induire une réponse immunitaire contre ce même antigène.
En utilisant une autre approche, à savoir l'analyse de quatre peptides naturellement présents sur les molécules DP4 [peptide 127-146 de la chaîne α du récepteur de 1TL3 (IL3 127-146 ; SEQ ID NO: 13) et trois peptides d'origine inconnue : UNK1 (SEQ ID NO: 14), UNK2 (SEQ ID NO: 15) et UNK3 (SEQ ID NO: 16) ; Tableau III], FALK et al. (Immunogenetics, 1994, 39, 230-242) ont proposé une séquence consensus de liaison aux molécules DP4. Cette séquence comprend trois résidus d'ancrage respectivement en positions PI, P7 et P9/P10. PI et P7 sont hydro- phobes ou aromatiques (Y, V, L, F, I, A, M, W) et P9/P10 sont de préférence alipha- tiques ; toutefois, un résidu Y est toléré en position P9/P10 mais pas un résidu F. Les résidus PI et P7 sont précédés de groupes de résidus chargés (K, R, E, N, Q pour PI et N, K, E pour P7), et des résidus de petite taille (A, V) sont fréquents en position P3 et P9. Le Tableau ILI montre que les seuls autres peptides ligands de DP4 présentant ce motif sont les peptides chevauchants NY-ESO1 161-180 et NY- ESO1 156-175. En conséquence, ce motif proposé par FALK et al. ne permet pas de définir un motif de liaison aux molécules DP4 partagé par l'ensemble des peptides ligands des molécules DP4, identifiés par des tests fonctionnels. Alors que des tests de liaison aux molécules DP9 (DONG et al, J.
Immunol, 1995, 154, 4536-4545) et DP2 (CHICZ et al, J. Immunol, 1997, 159, 4935-4942), dérivés de ceux développés pour les molécules DR [MARSHALL et al, J. Immunol, 1994, 152, 4946 (HLA-DR1) ; Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al, J. Immunol, 2000, 164, 3177 (HLA-DR1, -DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DRU et -DR13)] permettent d'isoler des peptides spécifiques de respectivement DP9 et DP2, ces tests ne permettent pas d'isoler des peptides spécifiques de DP4 (CHICZ et al, précité) : les peptides isolés par le test de liaison à DP2 ont une forte affinité pour DP2 (activité de liaison < 10 nM) alors que des peptides connus pour être restreints à DP4 comme le peptide HBsAg 14-33, présentent une activité médiocre (20 μM). En outre, du fait des différences importantes des résidus du site de liaison, entre les principales molécules DP, les tests de liaison développés pour ces molécules ne permettent pas d'identifier des peptides restreints à DP4.
Ainsi, les motifs de liaison partagés par l'ensemble des peptides capables de se lier aux molécules HLA-DP4 n'ont pas été identifiés, notamment du fait qu'il n'existe pas de procédé d'identification de tels peptides qui soit simple à mettre en œuvre et adapté au criblage simultané d'un grand nombre de peptides comme des banques de peptides chevauchants représentant la séquence d'antigène d'intérêt.
Pourtant, compte tenu de la fréquence des molécules DP4, les peptides qui se lient aux molécules DP4 constituent des peptides candidats pour l'immunothérapie spécifique et la vaccination et pourraient servir au diagnostic de l'état immunitaire de patients ou d'individus normaux.
Les Inventeurs ont donc développé un procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 qui leur a permis d'isoler des ligands spécifiques d'HLA-DP4, notamment des peptides et de préciser le motif de liaison partagé par les peptides ligands d'HLA-DP4, à partir des peptides obtenus.
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de sélection de molécules ligand d'HLA-DP4 comprenant les étapes suivantes :
(i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur constitué par un peptide préalablement marqué et apte à être détecté par un signal approprié, lequel peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides présentant un rapport signal/bruit de fond supérieur à 5, à la concentration de 10 nM, dans un test direct de liaison à HLA-DP4, et répondant à la formule générale (I) Z,X|X2X3X X5X6X7X8X9Z2 dans laquelle :
- Zi et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés,
- X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cysteine (C),
- X| représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cysteine (C), un acide aspartique (D), une glutamine (Q), une serine (S), une thréonine (T) ou un acide glutamique (E), et
- X?, X3, X4, X5, X7 et X8 représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, en présence de différentes concentrations de molécule(s) à tester,
(ii) séparation des différents complexes formés, (iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur par mesure du signal associé audit peptide traceur et
(iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de liaison IC 0 < 1000 nM, correspondant à la concentration de ces molécules qui inhibent 50 % de la liaison du peptide traceur.
Les résidus Xi, X6 et X9 de la formule générale (I) telle que définie ci-dessus, qui constituent les résidus d'ancrage dans les poches de la molécule d'HLA- DP4, sont également dénommés respectivement résidus PI, P6 et P9. Parmi ces résidus, les résidus XI (ou PI) et X6 (ou P6) sont les résidus qui contribuent majoritaire - ment à la liaison à HLA-DP4. Le résidu X9 ou P9 est moins important et contribue plus faiblement à la liaison à HLA-DP4.
Au sens de la présente invention, on entend par :
- acides aminés naturels ou synthétiques, les 20 α-acides aminés naturels communément trouvés dans les protéines (code à une lettre: A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V), certains acides aminés rarement rencontrés dans les protéines (hydroxyproline, hydroxylysine, méthyllysine, diméthyllysine..), les acides aminés qui n'existent pas dans les protéines tels que la β-alanine, l'acide γ- aminobutyrique, l'homocystéine, l'ornithine, la citrulline, la canavanine, la norleucine, la cyclohexylalanine.., ainsi que les énantiomères et les diastéréoisomères des acides aminés précédents.
- acide aminé hydrophobe, un acide aminé sélectionné parmi (code à une lettre) : A, V, L, I, P, W, F et M.
- acide aminé aromatique, un acide aminé sélectionné parmi (code à une lettre) : F, W et Y. L'utilisation d'un peptide traceur, tel que défini à l'étape (i) permet de sélectionner effectivement des ligands spécifiques d'HLA-DP4, c'est-à-dire des molécules, notamment des peptides, qui présentent une bonne affinité pour HLA-DP4 c'est-à-dire une activité de liaison < 1000 nM.
Un peptide traceur conforme à l'invention est sélectionné en mettant en œuvre un test direct de liaison à HLA-DP4, par exemple en suivant les étapes (i) (ii) et (iii) du protocole défini ci-dessus mais en l'absence de compétiteur, correspondant à la molécule à tester. Le signal approprié détecté (fluorescence...) révèle les complexes HLA-DP4/peptide traceur [étape (iii)] et le bruit de fond représente le signal correspondant, obtenu en l'absence d'HLA-DP4.
De préférence :
- X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et - Xi est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
Des peptides traceurs conformes à l'invention sont représentés par les peptides NS-p2 (SEQ ID NO:4), MAG 247-258 (SEQ ID NO:9), UL21 283-293 (SEQ ID NO:12), IL3 127-146 (SEQ ID NO: 13), UNK1 (SEQ ID NO: 14), UL21 283-302 (SEQ ID NO: 18) et MAG 245-258 (SEQ ID NO: 19).
Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, le peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides biotinylés, radio- marqués et les peptides couplés à un fluorochrome.
A l'étape (ii), la séparation des complexes formés des peptides non liés est effectuée par exemple, par transfert des complexes formés sur une plaque de microtitration préalablement recouverte d'un anticorps spécifique d'HLA-DP, par chromatographie sur une colonne de gel-filtration ou par centrifugation.
Lorsque le peptide traceur est radiomarqué ou couplé à un fluorochrome, notamment à l'europium, les complexes HLA-DP4/peptide traceur sont détectés de manière directe par la mesure de la radioactivité ou de la fluorescence émise par lesdits complexes.
Lorsque le peptide traceur est biotinylé, les complexes HLA- DP4/peptide traceur sont détectés de manière indirecte à l'aide de streptavidine conjuguée, par exemple par une révélation immunoenzymatique à l'aide de streptavidine conjuguée à une enzyme telle que la phosphatase alcaline et d'un substrat de la phosphatase alcaline tel que le 4-méthyl-umbelliféryl-phosphate (MUP).
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, le peptide traceur est utilisé à une concentration < 200 nM, de préférence inférieure à 20 nM ; de manière encore plus préférée, le traceur est utilisé à la concentration de Selon encore un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, ladite HLA-DP4 de l'étape i) est choisie dans le groupe constitué par les molécules codées par les allèles DPA1 * 103/DPB 1 *0401 et DPA1 * 103/DPB 1*0402.
Le procédé selon l'invention permet avantageusement de sélection- ner n'importe quel ligand d'HLA-DP4; il s'agit aussi bien de molécules minérales ou organiques comme les peptides et les pseudopeptides.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, lesdites molécules à tester représentent une banque de peptides chevauchants recouvrant la séquence d'un antigène. La présente invention a également pour objet des ligands d'HLA-
DP4 susceptibles d'être obtenus par le procédé de sélection tel que défini ci-dessus, correspondant à une molécule minérale ou organique, naturelle ou synthétique, présentanT une activité de liaison à HLA-DP4 inférieure à 1000 nM.
L'activité de liaison à HLA-DP4 d'une molécule ligand, telle que définie ci-dessus, correspond à la concentration de ladite molécule ligand qui inhibe 50 % de la liaison à HLA-DP4 d'un peptide traceur marqué, dans un test en compétition comme le procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 défini ci-dessus.
Parmi ces molécules ligand, on peut citer notamment les peptides et les peptides modifiés tels que les glycopeptides, les lipopeptides, les peptides compre- nant des acides aminés D, des liaisons pseudo-peptidiques (pseudo-peptides) ou des modifications des extrémités C-ou N-terminales.
La partie lipidique du lipopeptide ligand est notamment obtenue par addition d'un motif lipidique sur une fonction -aminée desdits peptides ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie peptidique ; elle peut comprendre une ou plusieurs chaînes, dérivées d'acides gras en C4-C20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou dérivées d'un stéroïde. Le procédé de préparation de tels lipopeptides est notamment décrit dans les Demandes internationales WO 99/401 13 ou WO 99/51630. La partie lipi- dique préférée est notamment représentée par un groupe Nα-acétyl-lysine Nε(palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam). Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand d'HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, sa séquence peptidique répond à la formule générale (I) Z|X,X2X3X4X5X6X7X8X9Z2, dans laquelle :
- Zi et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés tels que définis ci-dessus, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés,
- X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien une cysteine (C),
- Xi représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X9 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cysteine (C), un acide aspartique (D), une glutamine (Q), une serine (S), une thréonine (T) ou un acide glutamique (E), et
- X2, X3, X4, X5, X7 et X8 représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, à condition que ledit peptide ligand d'HLA-DP4 de formule générale (I) ne corresponde à aucune des séquences SEQ ID NO: 1 à 17.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand :
- X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et
- Xi est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide ligand se lie spécifiquement à DPB 1*0401 (activité de liaison à DPB 1 *0401 au moins deux fois supérieure à l'activité de liaison à DPB 1 *0402) et X6 est différent de C, et/ou Xi est différent de A et de V, et/ou X9 représente W ou Y ou X9 est diffé- rent de E et de C, et/ou X4 est différent de K et de R.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide ligand se lie spécifiquement à DPB 1 *0402 (activité de liaison à
DPB 1*0402 au moins deux fois supérieure à l'activité de liaison à DPB 1*0401) et X6 représente C, et/ou Xi représente A ou V, et/ou X9 représente E ou C ou X9 est diffé- rent de Y et W, et/ou X4 représente K ou R.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, Z| et Z2 sont choisis dans le groupe constitué par : - les séquences de l'antigène qui sont adjacentes à l'épitope CD4+ restreint à HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, et/ou
- un ou plusieurs épitopes T CD8+, et/ou
- des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide 830-846 de la toxine tétanique TT (O'SULLIVAN et al, J. Immunol, 1991, 147, 2663-2669), le peptide 307-319 de l'hémagglutinine HA du virus de la grippe (O'SULLIVAN et al, précité), l'épitope Pan DR ou PADRE (ALEXANDER et al, DEL GUERCIO et al, FRANKE et al, précités) et des peptides issus des antigènes de Plasmodium falcipa- rum tels que le peptide CS.T3 (SINIGAGLIA et al. Nature, 1988, 336, 778-780) et les peptides CSP, SSP2, LSA-1 et EXP-1 (DOOLAN et al, J. Immunol, 2000, 165, 1 123-1137) et/ou
- un ou plusieurs épitopes B, par exemple un peptide ou un glyco- peptide dans lequel ledit épitope B est constitué par un sucre (ALEXANDER et al, précité). De telles séquences permettent avantageusement de déclencher ou de moduler une réponse immunitaire, de manière appropriée.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand, il présente la séquence SEQ ID NO:84 correspondant au peptide NY-ESO1 87-1 1 1. La présente invention englobe également les peptides ligands tels que définis ci-dessus, polymérisés.
La présente invention a également pour objet un procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus, à partir d'une séquence d'acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) l'établissement d'une matrice de liaison à HLA-DP4 par calcul, -pour tous les mutants d'un peptide traceur tel que défini ci-dessus, représentant l'ensemble des substitutions des résidus en position 1, 4, 6 ou 9 dudit peptide traceur par les 19 autres acides aminés naturels-, du rapport des IC50 desdits peptides mutants et dudit peptide traceur, à l'aide du test de liaison à HLA-DP4 tel que défini ci dans le procédé ci-dessus, b) l'évaluation de la liaison à HLA-DP4 de peptides d'au moins 9 acides aminés inclus dans ladite séquence d'acides aminés, par calcul, pour chaque fragment de 9 acides aminés dudit peptide, de la somme des scores de liaison à HLA- DP4 des résidus en position 1, 4, 6 et 9 dudit fragment, à partir de la matrice de liaison établie en a), et c) l'identification des peptides ligands d'HLA-DP4 correspondant à ceux dont la perte de liaison à HLA-DP4, par rapport audit peptide traceur est la plus faible, c'est à dire ceux dont la somme des scores de liaison présente la valeur la plus faible exprimée en logarithme (log) ; de préférence inférieure à 2, de manière préférée inférieure à 1, de manière encore plus préférée, proche de 0.
Cette matrice de liaison à HLA-DP4 qui est illustrée pour le peptide de référence UNK 3-15 (SEQ ID NO: 28), par le Tableau XLV de l'exemple 6, permet d'estimer l'activité de liaison à HLA-DP4 de n'importe quel peptide d'au moins 9 acides aminés ; des peptides présentant des scores de liaison de respectivement 0, 1, 2, 3 et 4 correspondent à des peptides présentant une perte de liaison d'un facteur 1, 10, 100, 1000 et 10000 par rapport au peptide UNK 3-15 (IC50 10 nM), c'est-à-dire présentant une activité de liaison estimée de respectivement 10 nM, 100 nM, 1000 nM, lO μM et 100 μM.
Par exemple, l'antigène tumoral NY-ESO1 comprend un peptide WITQCFLPV possédant un score de liaison à DP*0401 et DP*0402, de 0 + 0,3 + 0 + 0,3 = 0,6 correspondant à une activité de liaison estimée (à l'aide de la matrice de liaison à HLA-DP4) de 39 nM et une activité calculée (par le test de liaison à DP*0401 et DP*0402) de respectivement 20 nM et 67 nM.
Le procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4 selon l'invention qui est facile à mettre en œuvre et automatisable permet, notamment à l'aide d'un logiciel approprié, de prédire la séquence des peptides ligands d'HLA-DP4 présents dans toutes les protéines représentant des antigènes d'intérêt. Les séquences peptidiques ainsi identifiées peuvent ensuite être vérifiées par un test de liaison à HLA-DP4, défini dans le procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 selon l'inven- tion. La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide ligand tel que défini ci- dessus.
L'objet de l'invention englobe également les molécules d'acide nucléique recombinantes comprenant au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue.
Au sens de la présente invention, on entend par séquence hétérologue relativement à une séquence d'acide nucléique codant un peptide ligand, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant un peptide.
L'objet de la présente invention englobe en particulier :
- des cassettes d'expression comprenant au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention et les séquences nécessaires au contrôle de la transcription et de la traduction de ladite molécule d'acide nucléique (promoteur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et
- des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs d'expression, comprennent au moins une cassette d'expression telle que définie ci- dessus. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (iso- lée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte, sous forme d'ADN nu.
L'invention a en outre pour objet des cellules procaryotes ou euca- ryotes transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention.
Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une molécule d'acide nucléique dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser les vecteurs ou les préparation de lipides tels que définis ci- dessus.
La présente invention a également pour objet une composition immunomodulatrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ligand d'HLA- DP4 ou une molécule d'acide nucléique codant un peptide ligand d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Avantageusement, ladite molécule d'acide nucléique est incluse dans un vecteur tel que défini ci-dessus.
Selon le choix du ligand d'HLA-DP4 et de son mode de présentation (voie d'administration, dose, adjonction ou non d'adjuvant), une telle composition immunomodulatrice entraîne, soit une activation des lymphocytes T, soit leur anergie. En effet, il a été montré qu'une injection unique, par voie sous-cutanée, d'une faible quantité de peptide entraîne une anergie (OLDFIELD et al, J. Immunol, 2001, 167, 1734-1739.). En revanche, il est connu que des injections répétées de quantités supérieures de peptide en présence d'adjuvant entraîne une activation des lymphocytes T. En outre, l'association à des peptides
Figure imgf000017_0001
et Z2 tels que définis ci- dessus, permet également d'augmenter la réponse immunitaire spécifique de l'antigène (ALEXANDER et al, précité).
En conséquence, ladite composition est utilisée aussi bien pour la vaccination contre un agent pathogène ou une cellule tumorale, que pour le traitement des maladies autoimmunes (sclérose en plaques, diabète insulino-dépendant), de l'allergie ou du rejet de greffe.
La présente invention a également pour objet un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, éventuellement marqué ou complexé, notamment complexé à des molécules HLA-DP4 marquées (biotinylées), sous la forme de complexes multimériques comme des tétramères.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand d'HLA-DP4 ou d'une molécule d'acide nucléique codant un peptide ligand d'HLA- DP4 tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament immunomodula- teur ou d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu.
Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic de l'état immunitaire d'un individu, la détection de la présence, chez ledit individu, de lympho- cytes T CD4+ spécifiques d'un antigène issu d'un agent pathogène ou d'une cellule tumorale, d'un allergène, d'un alloantigène ou d'un autoantigène.
Le réactif conforme à l'invention qui est apte à détecter la présence de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène est utilisé pour la détection : d'une infection par un agent pathogène, d'un cancer, d'une maladie autoimmune, d'une aller- gie ou d'un rejet de greffe, à partir d'un échantillon biologique d'un patient.
La présente invention a également pour objet une méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu comprenant les étapes de :
- mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un réactif de diagnostic tel que défini ci-dessus, et - détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène par tout moyen approprié.
La présente invention a également pour objet un kit de détection de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif tel que défini ci-dessus, associé à un moyen de détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène.
La détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, est effectuée par tous moyens, connus en eux-mêmes. Par exemple, on peut utiliser des moyens directs comme les tests de prolifération lymphocytaire ou la cytométrie de flux en présence de complexes multimériques tels que définis ci-dessus, ou bien des moyens indirects comme le dosages de cytokines telles que 1TL2, 1TL4, 1TL5 et l'INFγ, notamment par des techniques immunoenzymatiques (ELISA, RIA, ELISPOT).
De manière plus précise : * pour ce qui concerne le test de prolifération :
Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) est cultivée pendant 3 à 5 jours en présence desdits ligands d'HLA-DP4 et au besoin de cellules présentatrices appropriées, telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hété- rologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La prolifération des cellules est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules. Les peptides tels que définis ci-dessus, permettent de révéler dans la suspension initiale la présence de cellules spécifiques de ces peptides.
* pour ce qui concerne le test ELISPOT :
Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T sécrétant de l'IFN-γ, spécifiques d'un peptide tel que défini ci-dessus. De manière plus précise, les cellules T sont révélées par mesure de la sécrétion d'IFN-γ après incubation des PMBC des patients avec lesdits peptides conformément à la méthode décrite dans la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al, (J. Virol, 2000, 74, 1964).
* pour ce qui concerne la mise en œuvre de complexes multi- mériques et notamment de complexes tétramériques :
- on met en contact un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) avec des complexes tétramériques tels que définis ci-dessus, et
- on analyse des cellules marquées par cytométrie de flux. De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec ledit complexe, on l'enrichit en cellules T CD4+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4, pour enrichir ledit échantillon.
Les tétramères sont préparés, comme précisé, par exemple dans NOVAK et al. (J. Clin. Investig, 1999, 104, R63-R67) ou dans KURODA et al. (J. Virol, 2000, 74, 18, 8751-8756
Brièvement, les tétramères sont fabriqués en incubant, pendant 72 heures à 37°C et dans un tampon phosphate citrate 10 mM, NaCl 0,15 M à un pH compris entre 4,5 et 7, des molécules HLA II solubles et biotinylées avec un excès d'un facteur 10 de ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus.
La forme tétramérisée est obtenue en ajoutant à la préparation de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mole) par rapport aux molécules HLA II. L'ensemble est incubé une nuit à température ambiante.
Pour utiliser ces tétramères, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) avec un ou plusieurs tétramères (10 à 20 mg/ml) pendant 1 à 3 heures. Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les tétramères grâce au fait que ces constructions sont fluorescentes.
La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les tétramères des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire.
La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- mise en contact d'un échantillon cellulaire avec des tétramères marqués par un fluorochrome, préparés à partir de complexes entre des ligands d'HLA-DP4 tels que défini ci-dessus et des molécules HLA-DP4 solubles, et
- tri des cellules liées audit tétramères, en cytométrie de flux. Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'objet de la présente invention, avec références aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 illustre l'activité de liaison de peptides aux molécules HLA-DP4 codées respectivement par DPB 1*0401 (A) et DPB 1 *0402 (B), déterminée selon le procédé conforme à l'invention avec comme peptide traceur, le peptide UNK1 biotinylé (10 nM) ; le pourcentage de liaison aux molécules DP4 est exprimé en fonction de la concentration molaire des peptides. La liaison maximale (100 %) correspond à la valeur obtenue pour le peptide traceur seul, en l'absence de peptide compétiteur. UNK: UNK1 (SEQ ID NO: 14), IL: IL3 127-146 (SEQ ID NO: 13), MAG: MAG 245-258 (SEQ ID NO: 19), NSP2: SEQ ID NO: 4, TT: TT 947-963 (SEQ ID NO: 20), DQB: DQB 43-57 (SEQ ID NO: 23), HCI 46-63: SEQ ID NO: 24) et HA: HA 306-318 (SEQ ID NO: 21), - la figure 2 illustre la corrélation entre le score de liaison à HLA-
DP4 (estimé par le procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4 conforme à l'invention) et l'affinité pour les molécules HLA-DP4 (déterminée par la valeur d'ICso, mesurée à l'aide du test de liaison à HLA-DP4 défini dans le procédé de sélection de peptides ligands d'HLA-DP4 conforme à l'invention), analysée sur un ensemble de 44 peptides.
EXEMPLE 1 : PRINCIPE DU TEST DE LIAISON HLA-DP4/PEPTIDE
1) Préparation des peptides
Tous les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS).
Les peptides sont biotinylés au niveau de leur résidu NH2 terminal, selon le protocole tel que décrit dans Texier et al, précité.
2) Préparation des anticorps
Les anticorps spécifiques des molécules HLA-DP tel que l'anticorps B7/21 (WATSON et al, Nαtwre, 1983, 304, 358-361), sont purifiés à partir du surnageant de culture des hybridomes correspondants, sur des colonnes de Protéine A- Sépharose. Ces anticorps sont ensuite couplés sur des colonnes Sépharose 4B ou protéine A-Sépharose pour la purification des molécules HLA-DP4.
D'une manière plus précise, après centrifugation à 1100 g, le surna- géant de culture des cellules productrices de l'anticorps B7/21 est filtré à 0,22 μm et son pH est ajusté à 7-8 avec du tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 8. Ce surnageant est ensuite appliqué sur une colonne de Protéine A Sépharose 4 Fast Flow de 10 ml, préalablement lavée avec 100 ml de tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 8. Puis, la colonne est lavée avec 100 ml de tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 8 et 100 ml de tampon Tris-HCl 0,01 M, pH8. Les anticorps sont élues avec le tampon glycine HCl 0,1 M, pH 3. Le rinçage de la colonne s'effectue avec 100 ml de tampon Tris-HCl 0,1 M, pFI 8. La fraction éluée qui contient l'anticorps B7/21 est immédiatement neutralisée avec du tampon Tris-HCl 1 M, pH 8 avant d'être dialysée extensivement contre du tampon borate 0,1 M, pH 8,2. La quantité d'anticorps obtenus est déterminée à partir de la densité optique (D.O.) à 278 nm.
Les colonnes d'affinité destinées à la purification des molécules HLA-DP4 sont préparées de la manière suivante : 0,75 g de Protéine A Sépharose 4B (3 ml de gel final) sont mis à gonfler dans de l'eau puis dans du tampon borate 0,1 M pH 8,2. 15 mg d'anticorps monoclonal, tel que B7/21 en tampon borate 0,1 M pH 8,2 sont ajoutés au gel, préalablement centrifugé. Le couplage est effectué pendant deux heures à température ambiante puis contrôlé par l'absorbance à 278 nm du surnageant. Le gel est ensuite lavé successivement avec 100 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8,2, 120 ml de tampon triéthanolamine 0,2 M, pH 8,2 ; 120 ml de tampon diméthylpyrimi- date 20 mM, triéthanolamine 0,2 M, pH 8,2 et 150 ml de tampon éthanolamine 0,2 M pH 8,2. Après coulage du gel, celui-ci est rincé avec 150 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8,2. Le contrôle final du couplage est effectué par une élution en tampon glycine 0,1 M, pH 2,5, NaCl 0,5 M, l'absorbance à 278 nm des fractions de 1 ml devant être inférieure à 0,1. La colonne est immédiatement rincée par 50 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8,2 et 20 ml de tampon borate 0,1 M, NaN3 0,02%, pH 8,2. Elle est conservée dans ce tampon à 4°C jusqu'à l'emploi. 3) Purification des molécules HLA-DP4 Les molécules HLA-DP4 sont purifiées à partir de différentes lignées humaines de lymphocytes B transformées par le virus Epstein Barr (EBV) homozygotes pour DP, par immunoaffinité au moyen d'anticorps monoclonaux spécifiques de toutes les molécules DP. L'origine des lignées et les allèles qui les caractérisent sont indiqués dans le Tableau IV.
Tableau IV
Figure imgf000023_0001
l'origine des lignées est décrite sur le site internet de la Collection européenne de Culture Cellulaire (http: // fuseiv.co.uk/cainr/.)
La purification des molécules HLA-DP4 est effectuée à partir d'un culot de ces cellules humaines transformées par EBV, selon un protocole dérivé de ceux utilisés pour les molécules HLA-DR (GORGA et al, J. Biol.Chem., 1987, 262,
16087; TEXIER et al, précité).
D'une manière plus précise, 5 à 6.10 cellules sont lysées à une concentration d'environ 108 cellules/ml en tampon de lyse (Tris 0,01 M, NaCl 0,15 M, NaN3 0,02%, pH 7, NP40 1%, aprotinine 10 μg/ml, EDTA 5 mM, PMSF 10 μM) dans la glace pendant 30 minutes. Le milieu de lyse est débarrassé des gros débris cellulaires par centrifugation à 1 100 g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant est ensuite ultracentrifugé à 100 000 g à 4°C pendant 1 heure. La suite de la purification se déroule en chambre froide à 4°C. Le lysat est passé successivement sur une colonne de Sépharose 4B (10 ml de gel préparés en PBS lx), une colonne de Protéine A Sépharose 4B (5 ml de gel préparés en 2PBS lx) puis sur la colonne d'affinité anti-DP. Les colonnes sont ensuite rincées par 250 ml de tampon de lyse. La colonne Sépharose 4B est jetée. La colonne Protéine A Sépharose 4B est rincée avec 25 ml de tampon TBS lx (Tris 0,01 M, NaCl 0,15 M, NaN3 0,02%, pH 7) ; 50 ml de tampon (glycine, 0,1M; NaCl 0,5M, pH 2,5) et 200 ml de tampon PBS lx, avant d'être stockée à 4°C. La colonne anti-DP est rincée avec 250 ml de tampon TBS contenant 1 mM de dodécyl maltoside (DM). Elle est ensuite éluée individuellement avec le tampon d'élution (Na2CO3 100 mM, NaCl 500 mM, NaN3 0,02%, DM 1,1 mM, pH 1 1,5) en 15 fractions de 3 ml. L'éluat est immédiatement neutralisé avec 10% de tampon (Tris-HCl 2 M, pH 6,8), puis dialyse extensivement à 4°C contre du tampon
PBS lx contenant 1 mM de DM.
4) Test de liaison HLA-DP4-peptide
Le test de liaison des peptides aux molécules HLA-DP4 est un test en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, dérivé de celui mis au point pour des molécules HLA-DR (HLA-DR1 : MARSHALL et al, précité, HLA-DR 1, -DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DRU et -DR13 : Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al, précité). Il est effectué en plaques 96 puits, ce qui permet d'étudier de nombreux échantillons dans la même expérience. Brièvement, les molécules HLA-DP4 purifiées sont incubées avec un peptide biotinyle qui sert de traceur et différentes concentrations du peptide à tester. Le peptide biotinyle est un peptide ligand de DP4, il s'agit d'un peptide reconnu par des lymphocytes T CD4+ spécifiques de DP4 tel que ceux précisés dans le Tableau III ci-dessus ou d'un nouveau peptide isolé à l'aide du présent test de liaison à DP4. Parmi ces peptides, on peut citer par exemple le peptide UNK1 ou le peptide IL3 127-146. L'incubation se fait dans un tampon, dont le pH peut varier. Il est généralement de 5, l'incubation dure généralement 24h. Après l'incubation, les échantillons sont neutralisés, puis 100 μl de chaque échantillon est transféré sur une plaque ELISA préalablement sensibilisée par un anticoφs anti-DP, tel que B7/21. Les complexes molécules HLA-DP/peptides biotinylés fixés au fond de la plaque par l'intermédiaire de l'anticoφs sont révélés au moyen de streptavidine phosphatase et d'un substrat fluorescent. L'activité de chaque peptide est caractérisée par la concentration qui inhibe 50 % de la liaison du peptide biotinyle (IC50). EXEMPLE 2 : DETERMINATION DES PARAMETRES DU TEST DE LIAISON 1) Peptide traceur a) Matériel et méthodes
La liaison de peptides aux deux molécules DP4 (DP401 codé par l'allèle DPA1*0103/DPB 1 *0401 et DP402 codé par l'allèle DPAl *0103/DPB 1 *0402) a été analysée en ELISA par le test direct de liaison suivant : Les molécules HLA-DP4 purifiées selon le protocole décrit à l'exemple 1 sont diluées 10 fois en tampon phosphate 10 mM (dilution 1/10). Elles sont ensuite incubées avec différentes concentrations d'un peptide biotinyle (10"6M, 10"7M et 10"8M) dans du tampon phosphate 10 mM, NaCl 150 mM, DM 1 mM, citrate 10 mM, thimérosal 0,00 3%, pH 5, dans des plaques 96 puits en polypropylène, pendant 24 h à 37°C. Des échantillons sans molécules DP4 sont utilisés comme témoin. A la fin de l'incubation, les échantillons sont neutralisés avec 50 μl de tampon Tris-HCl 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Ils sont ensuite transférés sur des plaques ELISA maxisoφ 96 puits sur lesquelles les anti- coφs anti-DP ont été préalablement adsorbés. Très exactement, 10 μg/ml d'anticoφs anti-DP ont été incubés une nuit à 4°C (100 μl/puits) puis les plaques ont été saturées avec le tampon Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, BSA 0,3 %, thimérosal 0,003 % pendant une nuit à 4°C. L'incubation des échantillons sur ces plaques est réalisée pendant deux heures à température ambiante, comme la suite du test puis des lavages extensifs sont effectués entre chaque étape en tampon Tris-HCl 0,1 M pH, 7,5, Tween-20 0,05%. Le peptide biotinyle lié aux molécules HLA-DP est détecté par l'ajout de 100 μl/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes) dilué au 1/2000 dans le tampon Tris lOmM pH 7, NaCl 0,15 M; Tween 20 0,05 %, BSA 0,2 %, thimérosal 0,003 %, puis par l'ajout de 200 μl/puits du substrat MUP 100 μM en tampon NaHCO3 0,05 M pH 9,8, MgCl 1 mM. L'émission de fluorescence par le produit de la réaction enzymatique est mesurée à 450 nm après excitation à 365 nm et le rapport des valeurs obtenues avec ou dans DP4 est déterminé (Rp = valeur de fluorescence en présence de DP4/valeur de fluorescence en l'absence de DP4). b) Résultats
La liaison à la molécule DP401 de peptides dérivés des peptides ligands de DP4 précédemment décrits (Tableau III), a été testée :
- peptide bUL21 283-302 (RELWWVFYAGDRALEEPHAE ; SEQ ID NO: 18) - peptide bIL3 127-146 (SEQ ID NO: 13)
- peptide bMAG 245-258 (LLTQHFVQENYLEY ; SEQ ID NO: 19)
- peptide bMT 451-466 (SEQ ID NO:6)
- peptide bNS-p2 (SEQ ID NO:4)
- peptide bTT 947-963 (FNNFTVSFWLRVPKVSA ; SEQ ID NO: 20) - peptide bUNKl (SEQ ID NO: 14)
Deux peptides spécifiques respectivement de DR1 et de DR7 ont été utilisés comme témoin de la spécificité de liaison à DP4 : peptide bHA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT ; SEQ ID NO: 21) décrit par HLLL et al, J. Immunol, 1994, 152, 2890, et peptide bYKL (AAYAAAKAAALAA ; SEQ ID NO:22) décrit par MARSHALL et al, précité.
Les résultats sont illustrés par le Tableau V. Tableau V : Sélection des traceurs par un test direct de liaison à HLA-DP4
Figure imgf000026_0001
Les résultats montrent que :
- les peptides bUNKl, bIL3 127-146 ont une forte capacité de liai- son à DP4,
- les peptides bTT 947-963 et bMT 451-466 ont une faible capacité de liaison et
- les peptides bNS-p2, bUL21 283-302 et bMAG 245-258 ont une capacité de liaison intermédiaire. Les peptides présentant un RF > 5 à la concentration de 10" M sont considérés comme des bons traceurs utilisables dans le test de liaison.
Le peptide UNK1 qui a donné les meilleurs résultats a été utilisé pour optimiser le test de liaison. 2) temps, pH, concentration du peptide traceur
De manière à disposer d'un test sensible et spécifique de DP4, la concentration en molécules HLA-DP4, la concentration du peptide biotinyle, le pH et le temps d'incubation peptides-molécule HLA-DP4 ont été optimisés avec le peptide bUNKl . a) Matériels et méthodes
Les molécules HLA-DP4 purifiées selon le protocole décrit à l'exemple 1 ont été diluées au 1/10, 1/20, 1/40 et 1/80, en tampon phosphate 10 mM ; NaCl 150 mM, DM 1 mM ; citrate 10 mM, thimérosal 0,003 % à différents pH (pH 4 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 et 7), avec le peptide bUNKl à différentes concentrations et plusieurs concentrations de peptides compétiteurs dans des plaques 96 puits en polypropylène. A la fin de l'incubation à 37°C, les échantillons ont été neutralisés avec 50 μl de tampon Tris-HCl 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Ils ont ensuite été transférés sur des plaques ELISA maxisoφ 96 puits sur lesquelles les anticoφs anti-DP ont été préalablement adsorbes. Très exactement, 10 μg/ml d'anticoφs anti-DP ont été incubés une nuit à 4°C (100 μl/puits) puis les plaques ont été saturées avec le tampon Tris-HCl 100 mM pH 7,5, BSA 0,3 %, thimérosal 0,003 % pendant une nuit à 4°C. L'incubation des échantillons sur ces plaques a été réalisée pendant deux heures à température ambiante, comme la suite du test puis des lavages extensifs ont été effectués entre chaque étape en tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, Tween-20 0,05 %. Le peptide biotinyle lié aux molécules HLA-DP a été détecté par l'ajout de 100 μl/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes) diluée au 1/2000 dans le tampon Tris 10 mM pH 7, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,05 %, BSA 0,2 %, thimérosal 0,003 %, puis par l'ajout de 200 μl/puits du substrat MUP 100 μM en tampon NaHCO3 0,05 M, pH 9,8, MgCl2 1 mM. L'émission de fluorescence par le produit de la réaction enzymatique a été mesuré à 450 nm après excitation à 365 nm. La liaison maximale a été déterminée en incubant le peptide biotinyle avec la molécule de CMH II en l'absence de peptide compétiteur. La spécificité de liaison a été contrôlée par l'ajout d'un excès de peptide non biotinyle. Le bruit de fond obtenu ne diffère pas significativement de celui obtenu en incubant le peptide biotinyle sans les molécules de CMH II. Les résultats sont exprimés sous la forme de la concentration de peptide compétiteur qui inhibe 50 % de la liaison maximale du peptide marqué (IC50) b) Résultats
Les conditions optimales sont présentées dans le Tableau VI Tableau VI: Conditions du test de liaison aux molécules DP4
Molécules DPA1*0103/DPB1* 0401 DPA1*0103 DPB1*0402
Peptide biotinyle bUNK l-17 bUNK 1-17
Concentration 10 nM 10 nM
PH 5 5
Temps d'incubation 24h 24h
Concentration en Dilution 1/20 à 1/40* HLA-DP4 les dilutions indiquées sont effectuées a partir de la préparation de molécules HLA-DP4 purifiées obtenues a l'exemple 1
EXEMPLE 3 : SENSIBILITE ET SPECIFICITE DU TEST DE LIAISON AUX MOLECULES DP4 a) Spécificité
Les résultats, illustrés par la figure 1 montrent que l'activité de liaison mesurée dans le test est spécifique d'HLA-DP4 dans la mesure où
- des peptides connus pour être des ligands de molécules DP4 lient effectivement les molécules HLA-DP*0401 et 0402 II s'agit du peptide IL3 127-146
(naturellement présent sur une molécule DP4), des peptides spécifiques de lymphocytes T CD4+ restreints à DP4 NS-p2 (ou NSP2), TT 947-963 et dans une moindre mesure le peptide MAG 245-258, et
- des peptides connus pour lier d'autres molécules HLA II ne se lient pas aux molécules HLA-DP*0401 et 0402 II s'agit des peptides • DQB 43-57
(DVEVYRAVTPLGPPD, SEQ ID NO 23), HCl 46-63
(EPRAPWIEQEGPEYWDQE, SEQ ID NO'24) et HA 306-318 (SEQ ID NO 21) qui sont connus pour se lier respectivement à des molécules HLA-DQ3, HLA-DQ2 et HLA-DR (MARSHALL et al , précité, JOHANSEN et al, Immunogenetics, 1996, 45, 142).
La spécificité du test résulte de l'utilisation
- d'un anticoφs spécifique des molécules HLA-DP pour la purification et pour l'adsoφtion sur les plaques ELISA, et - du peptide biotinyle qui se lie avec une forte affinité, la figure 1 montre que le peptide UNK qui est la contrepartie non biotinyle du peptide traceur bUNK inhibe totalement la liaison du traceur aussi bien sur la molécule HLA- DPB 1*0401 que sur la molécule DPB 1 *0402. b) Sensibilité
La sensibilité du test est reflétée par l'IC 0 observée avec le peptide non-biotinylé (UNK1) correspondant au traceur (bUNKl). La figure 1 indique des valeurs de respectivement 8 et 9 nM pour DPB 1*0401 et DPB 1*0402, traduisant une bonne sensibilité. La figure 1 montre également que les activités de liaison des peptides aux molécules DPB 1 *401 et DPB 1 *402, bien que comparables, sont distinctes. Ces résultats confirment que les molécules DPB 1 *401 et DPB 1*402 présentent des différences qui peuvent être détectées par ce test de liaison. EXEMPLE 4 : CRIBLAGE DE PEPTIDES LIGANDS DE HLA-DP4 A PARTIR D'UNE BANQUE DE PEPTIDES
1) Matériels et méthodes
Les peptides chevauchants couvrant la séquence totale de l'allergène majeur du venin d'abeille (Api ml), décrits dans le Brevet FR 99 00879, ont été synthétisés et soumis aux tests de liaison à la molécule DP401 et à la molécule DP402, dans les conditions définies dans le Tableau VI.
2) Résultats
Les résultats sont présentés dans le Tableau VU, ci-après :
Tableau VII : Liaison des peptides de Api ml aux molécules HLA-DPB1*0401 et DPBl*0402
Peptide IC50 (nM)
DP0401 DP0402
1-18 > 10000 > 10000
5-22 > 10000 > 10000
9-26 > 10000 > 10000
13-30 > 10000 > 10000
17-34 > 10000 > 10000
21-38 > 10000 > 10000
25-42 > 10000 > 10000
29-46 > 10000 > 10000
33-50 > 10000 > 10000
37-54 > 10000 > 10000
41-58 > 10000 > 10000
45-62 > 10000 > 10000
49-66 > 10000 > 10000
53-70 > 10000 > 10000
57-74 > 10000 > 10000
61-78 > 10000 > 10000
65-82 5000C ) 6500
69-86 > 10000 > 10000
73-90 > 10000 > 10000
77-94 45C 1 175
81-98 225C ) 1225
85-102 > 10000 > 10000
89-106 > 10000 > 10000
93-110 > 10000 > 10000
97-114 > 10000 > 10000
101-118 > 10000 > 10000
105-122 > 10000 > 10000
109-126 > 10000 > 10000
113-130 > 10000 > 10000
117-134 > 10000 > 10000
Ces résultats montrent que le peptide 77-94 de l'antigène majeur du venin d'abeille 94 (Api ml 77-94 : TISSYFVGKMYFNLIDTK, SEQ ID NO: 17) est un peptide ligand des molécules DPB 1 *0401 et DPB 1*0402. EXEMPLE 5 : DETERMINATION DES MOTIFS DE LIAISON AUX MOLECULES DP4
1) Matériel et méthodes a) détermination d'un peptide minimum dérivé d'UNKl capable de se lier aux molé- cules DP4
Des peptides dérivés du peptide UNK1 (UNK 1-17, SEQ ID NO: 14) comprenant des délétions croissantes à l'une des extrémités NH2 ou COOH ou bien aux deux extrémités, ont été synthétisés. La séquence de ces peptides (UNK 1-11, 1- 12, 1-13, 2-14, 3-15, 4-16, 5-17, 6-17, 7-17, 3-17 et 1-15) correspondant respective- ment aux SEQ ID NO: 25-26, 16 et 27-34 est présentée dans le Tableau VIII. L'activité de liaison des peptides, exprimée par la valeur IC5o, a été déterminée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau VI. b) détermination des résidus du peptide UNK1 impliqués dans la liaison aux molécules DP4 Des mutants du peptide UNK 3-15 (KYFAATQFEPLAA ;
SEQ ID NO: 28) ont été synthétisés ; chaque mutant contient un seul des résidus Y4, F5, T8, Q9, F10, El i, P12, L13 substitué en alanine ou en lysine, le résidu K3 substitué en alanine, ou bien l'un des résidus A6, A7, A 14 et A 15 substitué en lysine.
La séquence de ces peptides (UNK K3A, Y4A, F5A, T8A, Q9A, F10A, El 1A, P12A, L13A, Y4K, F5K, A6K, A7K, T8K, Q9K, F10K, El IK, P12K, L13K, A14K et A15K) correspondant respectivement aux séquences SEQ ID NO:35 à 55 est présentée dans le Tableau IX.
L'activité de liaison des peptides, exprimée par la valeur IC50, a été déterminée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau VI. La perte de liaison des peptides mutants est exprimée par le rapport des IC50 du peptide mutant et du peptide UNK1. c) détermination des motifs de liaison aux molécules DP401 et DP402
Les résidus F en PI, T en P4, F en P6 ou L en P9 du peptide UNK1 ont été substitués par l'un des résidus suivants : - PI : Y, L, E, N, T, D, G, H, I, M, P, Q, R, S, V ou W,
- P4 : F, L, E, D, N, Y, R, S, G, H ou P,
- P6 : Y, L, W, E, N, T, D, G, H, I, M, P, Q, R, S, V, W ou C, - P9 ' F, Y, E, D, N, R, V, G, H, I, P, Q, S, T ou W.
La séquence de ces peptides, correspondant aux séquences SEQ ID NO- 56 à 81 et SEQ ID NO' 96 à 129, est présentée respectivement dans les Tableaux Xa et Xb. La perte de liaison des peptides mutants aux molécules DP4 a été déterminée par le test décrit pour les mutants alanine et lysine 2) Résultats a) détermination d'un peptide UNK1 minimum
Les résultats sont présentés dans le Tableau VILI, ci-après :
Tableau VIII • Liaison à DP401 etDP402des peptides dérivés de UNK1 (UNK1- 17) peptides Positions des séquences ICso (nM)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 401 402
UNK 1-17 E K K Y F A A T Q F E P L A A R L 11 14
UNK 1-11 E K K Y F A A T Q F E 55 95
UNK 1-12 E K K Y F A A T Q F E P 93 100
UNK 1-13 E K K Y F A A T Q F E P L 14 28
UNK 2-14 K K Y F A A T Q F E P L A 15 23
UNK 3-15 K Y F A A T Q F E P L A A 19 23
UNK 4-16 Y F A A T Q F E P L A A R 38 25
UNK 5-17 F A A T Q F E P L A A R L 65 38
UNK 6-17 A A T Q F E P L A A R L 15000 6000
UNK 7-17 A T Q F E P L A A R L 15000 12500
UNK 3-17 K Y F A A T Q F E P L A A R L 18 14
UNK 1-15 E K K Y F A A T Q F E P L A A 18 17
Les résultats obtenus montrent que .
- la perte de liaison observée avec les peptides UNK 1-11, UNK 1- 12, UNK 4-16, UNK 5-17 suggère que le peptide minimum à une taille de 13 à 15 acides aminés,
- la perte de liaison observée avec les peptides UNK 6-17 et UNK 7- 17 suggère que le résidu F en position 5 est le premier résidu d'ancrage des peptides dans le site de liaison des molécules DP4 (résidu PI). b) détermination des résidus du peptide UNK1 impliqués dans la liaison aux molé- cules DP4
Les résultats sont présentés dans le Tableau LX, ci-après Tableau IX : Perte de liaison à DP401 et DP402 des mutants alanine et Iysi ne
PEPTIDE 1 2 3 4 s 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 DP*0401 DP*0402
UNK1 E K K Y F A A T Q F E P L A A R L 1 1,00
UNK 3-15 K Y F A A T Q F E P L A A 1,5 1.7 £i P4 ÏÂ £9
UNK K3A A Y F A A T Q F E P L A A 0,9 1
UNK Y4A K A F A A T Q F E P L A A 1,2 0,9
UNK F5A K Y A A A T Q F E P L A A 41 5,7
UN T8A K Y F A A A Q F E P L A A 0,8 0,8
UNKQ9A K Y F A A T A F E P L A A 0,8 0,6
UNKF10A K Y F A A T Q A E P L A A 336 62
UNKE11A K Y F A A T Q F A P L A A 0,5 0,5
UNKP12A K Y F A A T Q F E A L A A 1,2 0,9
UNK 13A K Y F A A T Q F E P A A A 3,1 2,3
UNK Y4K K K F A A T Q F E P L A A 1,2 1
UN F5K K Y K A A T Q F E P L A A 569 297
UNK A6K K Y F K A T Q F E P L A A 1,6 1
UNK A7K K Y F A K T Q F E P L A A 2 1.2
UN T8K K Y F A A K Q F E P L A A 31 3,6
UNKQ9K K Y F A A T K F E P L A A 1,6 0,9
UNK FIOK K Y F A A T Q K E P L A A 420 350
UNKE11K K Y F A A T Q F K P L A A 1,3 0,7
UNKP12K K Y F A A T Q F E K L A A 1,8 1,4
UNKL13K K Y F A A T Q F E P K A A 81 70
UNKA14K K Y F A A T Q F E P L K A 1,7 1,4
UNKA15K K Y F A A T Q F E P L A K 1,7 1,4
Les résultats montrent une perte de liaison pour F5A, F10A, F5K, F10K et L13K, ce qui suggère fortement que les résidus d'ancrage des peptides dans le site de liaison des molécules DP4 sont respectivement la F5 en position PI, la F10 en position P6 et la L13 en position P9. c) détermination des motifs de liaison aux molécules DP401 et DP402
Les résultats sont présentés dans les Tableaux Xa, Xb et le Tableau XI, ci-après : Tableau Xa : Perte de liaison à DP401 et DP402' des mutants en PI, P4. , P6 et P9 (SEQ ID NO; : 56 à 81)
PEPTIDE l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12 13 14 15 16 17 DP*0401 DP*0402
UNK1 E K K Y F A A T Q F E P L A A R L 1,00 1,00
UNK 3-15 K Y F A A T Q F E P L A A 1,4 1,4 £1 £4 £6 £2
UNK F5Y K Y Y A A T Q F E P L A A 3 3,9
UNK F5 K Y L A A T Q F E P L A A 3,6 6
UNKF5E K Y E A A T Q F E P L A A 117 123
UNK F5N K Y N A A T Q F E P L A A 398 76
UNKF5T K Y I A A T Q F E P L A A 234 126
UN T8F K Y F A A F Q F E P L A A 2,7 1,7
UNK T8L K Y F A A L Q F E P L A A 1,9 2,6
UNK T8E K Y F A A E Q F E P L A A 2,7 3,7
UN T8D K Y F A A D Q F E P L A A 2 2,3
UNK T8N K Y F A A N Q F E P L A A 4,1 4,8
UNK T8Y K Y F A A Y Q F E P L A A 4,1 2,4
UNKT8R K Y F A A R Q F E P L A A 17 6,7
UNKT&S K Y F A A S Q F E P L A A 2,7 3,4
UNKF10Y K Y F A A T Q Y E P L A A 2,4 3,4
UN F10L K Y F A A T Q L E P L A A 7,2 6,7
UNKF10W K Y F A A T Q W E P L A A 2,2 2,5
UNKF10E K Y F A A T Q E E P L A A 1405 1190
UNK F ION K Y F A A T Q N E P L A A 2460 1809
UN F10T K Y F A A T Q 1 E P L A A 1171 476
UN L13F K Y F A A T Q F E P F A A 1,7 4
UNKL13Y K Y F A A T Q F E P Y A A 2 15
UNKL13E K Y F A A T Q F E P E A A 11 8
UNKL13D K Y F A A T Q F E P D A A 9,4 9
UN L13N K Y F A A T Q F E P N A A 17 10
UN L13R K Y F A A T Q F E P R A A 64 43
UN 13V K Y F A A T Q F E P V A A 2,5 1,9 les valeurs supé :rieure s à 10 sont ind liqu' ées en s ?ras
Tableau Xb : Perte de liaison à DP401 et DP402* des mutants en PI, P4, P6 et P9 (SEQ ID NO: 96 à 129) peptides 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 perte
UNK E K K Y F A A T Q F E P L A A R L DP*040I DP*0402
UNKF5D K Y D A A T Q F E P L A A 150 57
UNKF5G K Y G A A T Q F E P L A A 160 55
UNKF5H K Y H A A T Q F E P L A A 150 36
UNKF5I K Y I A A T Q F E P L A A 3 2
UNKF5M K Y M A A T Q F E P L A A 3 3
UN F5P K Y P A A T Q F E P L A A 100 48
UNKF5Q K Y Q. A A T Q F E P L A A 260 97
UNKF5R K Y R A A T Q F E P L A A 140 54
UNKF5S K Y S A A T Q F E P L A A 160 42
UN F5V K Y V A A T Q F E P L A A 11 6
UNKF5W K Y WA A T Q F E P L A A 0,5 1
UNKT8G K Y F A A G Q F E P L A A 1 2 UNI -T8P K Y F A A P Q F E P L A A 3 2 UNKT8H K Y F A A H Q F E P L A A 6 2
UNKF10D K Y F A A T Q D E P L A A 2700 120
UNKF10G K Y F A A T Q G E P L A A >7100 3700
UNKF10H K Y F A A T Q H E P L A A 2400 220
UNKF10I K Y F A A T Q I E P L A A 7 6
UNKF10M K Y F A A T Q M E P L A A 4 1
UNKF10P K Y F A A T Q P E P L A A 210 12
UNKFIOQ K Y F A A T Q Q E P L A A >7100 230
UNKF10R K Y F A A T Q R E P L A A >7100 370
UNKF10S K Y F A A T Q S E P L A A 500 33
UNKF10V K Y F A A T Q V E P L A A 42 22
UNKF10W K Y F A A T Q vv E P L A A
UNKF10C K Y F A A T Q ç E P L A A 17 2
UNKL13G K Y F A A T Q F E P G A A 15 12
UNKL13H K Y F A A T Q F E P H A A 13 35
UNK L 131 K Y F A A T Q F E P I A A 1 3
UNKL13P K Y F A A T Q F E P P A A 9 3
UNKL13Q K Y F A A T Q F E P Q A A 8 2
UNKL13S K Y F A A τ Q F E P S A A 9 5
UNKL13T K Y F A A T Q F E P T A A 5 3
UNKL13W K Y F A A T Q F E P w A A 1 13 les valeurs supérieures à 10 sont indiquées en gras. Tableau XI Spécificité de la liaison aux molécules DP4J
Figure imgf000036_0001
Les acides aminés qui provoquent respectivement une perte de liaison d'un facteur supérieur a 10 et inférieur a 10 sont indiquées dans la colonne (-) et la colonne (+) , les résidus d'ancrage sont représentes en gras et les différences entre DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402 sont soulignées
Les résultats obtenus montrent que
- les poches PI, P6 et P9 du site de liaison des molécules DP4 acceptent des résidus aromatiques et hydrophobes,
- la poche P4 du site de liaison des molécules DP4 est très permis- sive, et dans une moindre mesure la poche P9 qui accepte également les résidus Q, S,
T et D, et
- l'allèle DPB 1 *0401 accepte un résidu tyrosine ou tryptophane en P9 mais n'accepte pas de résidus cysteine et acide glutamique à cette position, ni de résidus alanine et valine en PI, ni de résidus lysine et arginine en P4 ou bien encore de résidu cysteine en P6 , l'allèle DPB 1 *0402 accepte un résidu alanine ou valine en PI, un résidu lysine ou arginine en P4, un résidu cysteine en P6 et un résidu cysteine ou acide glutamique en P9 mais n'accepte pas de résidu tyrosine ou tryptophane à cette position d) Identification d'un motif de liaison dans la séquence de peptides ligands de DP4
L'activité de liaison de différents peptides ligands de DP4 a été mesurée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau NI. Les résultats sont exprimés par la valeur IC50 (Tableau XIII) ou par la valeur du rapport des IC50 du peptide ligand et du peptide UΝK1 (Tableau XII).
Les peptides testés correspondant respectivement aux séquences SEQ ID ΝO: suivantes, sont présentés dans les tableaux XII et XIII:
- TT 947-963 (SEQ ID ΝO:20), - UNKl (SEQ ID NO: 14),
- NY-ESO1 87-1 1, 1 19-143, 158-180, 166-180 (SEQ ID NO:94, 83, 82, 95),
- UL21 283-302 (SEQ ID NO: 18), - IL3 127-146 (SEQ ID NO: 13) - NS-P2 (SEQ ID NO:4)
- Api-ml 65-72, 69-86, 73-90, 77-94, 81-98 (SEQ ID NO:85, 88, 89,
17, 86)
MAG 245-258 (SEQ ID NO: 19)
MARTI 1-20, 41-60, 51-73, 62-72, 103-1 18 (SEQ ID NO:90, 91, 87, 92, 93).
En parallèle, les séquences de ces peptides ligands de DP4 ont été alignées et la présence d'un motif de liaison à DP4 tel que défini au Tableau XI, a été recherchée (Tableaux XII et XIII).
Tableau XII: Alignement des séquences des peptides ligand de DP4
Figure imgf000038_0001
' 0401 activité relative de liaison des peptides à DPB1* 0401 par rapport au peptide UNK1 (activité de liaison égale à 1) ' 0402 activité relative de liaison des peptides à DPB1* 0402 par rapport au peptide UNK1 (activité de liaison égale a 1)
Tableau XIII: Liaison des peptides Api ml, NY-ESOl et MARTI à DPBl*0401 et DPB1*0402*.
Figure imgf000039_0001
Les acides aminés compatibles avec le motif de liaison aux allèles DPB 1*0401 et DPB 1 *0402 sont indiqués en gras et les motifs de liaison complets sont soulignés.
La séquence de ce peptide est décrite dans Zarour et al., PNAS, 2000, 97, 400-405. La séquence de ce peptide est décrite dans Zarour et al., Cancer Res., 2000, 60, 4646-4952.
Les résultats montrent qu'il existe pour la plupart des peptides ligands de DP4 une forte corrélation entre la présence d'au moins 2 résidus PI et P6 ou P6 et P9 tels que définis au Tableau XI et une affinité élevée pour les molécules
DP4 (IC5o< lOOOnM). Ces résultats montrent également que les résidus les plus importants dans la liaison à HLA-DP4 sont les résidus aromatiques ou hydrophobes en position PI et P6 ; ces mêmes résidus en position P9 sont moins importants. EXEMPLE 6 : PREDICTION DE LA SEQUENCE DE PEPTIDES LIGANDS DΗLA-DP4 A PARTIR D'UNE SEQUENCE D'ACIDES AMINES
1) Matériels et méthodes
Une matrice de liaison aux molécules HLA-DP4 a été établie à partir des activités de liaison (IC50) des mutants du peptide UNK 3-15 mesurées par le test de liaison aux molécules DP4 codées par les allèles DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402, tel que défini ci-dessus, en utilisant comme peptide traceur le peptide UNK 3-15 (exemple 5 et Tableaux LX, Xa, Xb et XI). La contribution de chacun des acides aminés en position PI, P4, P6 et P9 desdits peptides mutants à la liaison aux molécules DP*0401 et DP*0402 est évaluée par un score de liaison correspondant au logarithme (log) du rapport des IC50 du peptide mutant et du peptide UNK 3-15. Le score de liaison aux molécules DP*0401 et DP*0402, obtenu pour chacun des acides aminés en position PI, P4, P6 et P9 desdits peptides mutants constitue la matrice de liaison à HLA-DP4 présentée dans le Tableau XIV ci-dessous:
Tableau XIV: Matrice de liaison à HLA-DP4
4-.
O
Figure imgf000041_0001
A partir d'une séquence en acides aminés, la liaison des peptides d'au moins 9 acides aminés inclus dans ladite séquence est calculée à partir de la matrice ci-dessus en effectuant, pour chaque fragment de 9 acides aminés dudit peptide, par exemple des fragments chevauchant de 9 acides aminés couvrant la totalité de cette séquence, la somme des scores de liaison des résidus en position 1, 4, 6 et 9 dudit fragment.
Des peptides présentant des scores de liaison de respectivement 0, 1,
2, 3 et 4 correspondent à des peptides présentant une perte de liaison d'un facteur 1,
10, 100, 1000 et 10000 par rapport au peptide UNK 3-15 (IC50 10 nM), c'est- à -dire, présentant une activité de liaison estimée, de respectivement 10 nM, 100 nM, 1000 nM, 10 μM. et 100 μM.
Les peptides présentant les scores de liaison les plus faibles, de préférence inférieur à 2, de manière préférée inférieur à 1, de manière encore plus préférée proche de 0 sont sélectionnés; ces peptides correspondent à ceux dont l'activité de liaison à HLA-DP4, estimée à partir de la matrice de liaison telle que définie ci-dessus, est la plus élevée. 2) Résultats
La corrélation entre le score de liaison des peptides (estimé à l'aide de la matrice de liaison à HLA-DP4, Tableau XIV) et leur affinité pour les molécules HLA-DP4 (mesurée par le test de liaison tel que défini ci-dessus) a été analysée pour 44 peptides étudiés aux exemples 4 et 5.
Les résultats sont illustrés par le Tableau XV et la figure 2.
Tableau XV: Score de liaison et activité de liaison à HLA-DP4 de différents peptides
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Ces résultats montrent qu'il existe une forte corrélation entre le score de liaison et l'affinité des peptides pour HLA-DP4. En effet, en prenant comme seuil d'activité un score de liaison < 2 et une activité de liaison IC50 < 1000 nM : - 80 % des peptides présentant un score de liaison < 2 pour les molécules HLA-DP4 (DP*0401 et DP*0402) présentent une affinité élevée pour ces molécules (ICso < 1000 nM, peptides vrais positifs) et
- 82 % et 76 % des peptides présentant un score de liaison > 2 pour les molécules HLA-DP4 (respectivement DP*0401 et DP*0402) présentent une faible affinité pour ces molécules (IC50 >1000 nM, peptides vrais négatifs).
En conséquence, la matrice de liaison à HLA-DP4 peut-être utilisée pour prédire la séquence de peptides ligands d'HLA-DP4 à partir de n'importe qu'elle séquence d'acides aminés, notamment une séquence représentant un antigène d'intérêt.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Procédé de sélection de molécules ligand d'HLA-DP4, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur constitué par un peptide préalablement marqué et apte à être détecté par un signal approprié, lequel peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides présentant un rapport signal/bruit de fond supérieur à 5, à la concentration de 10 nM, dans un test direct de liaison à HLA-DP4, et répondant à la formule générale (I) Z1X1X2X3X4X5X6X7X8X9Z2; dans laquelle : - Zi et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés,
- X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien une cysteine, - Xi représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X9 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien une cysteine (C), un acide aspartique (D), une glutamine (Q), une serine (S), une thréonine (T) ou un acide glutamique (E), et
- X2, X , X4, X5, X7 et Xs représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, en présence de différentes concentrations de molécule(s) à tester, (ii) séparation des différents complexes formés, (iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur par mesure du signal associé audit peptide traceur, et (iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de liaison IC50 < 1000 nM, correspondant à la concentration de ces molécules qui inhibent 50 % de la liaison du peptide traceur.
2°) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites molécules à tester représentent une banque de peptides chevauchants recouvrant la séquence d'un antigène. 3°) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que 1ΗLA-DP4 de l'étape i) est choisie dans le groupe constitué par les molécules codées par les allèles DPA 1 * 103/DPB 1 *0401 et DPA 1 * 103/DPB 1 *0402.
4°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caracté- risé en ce que dans ledit peptide traceur de formule générale (I) :
- X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et
- Xi est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
5°) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit pep- tide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides de séquence SEQ ID NO: 4, 9, 12, 13, 14, 18 et 19.
6°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce~que ledit peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides biotinylés, radiomarqués et les peptides couplés à un fluorochrome. 7°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit peptide traceur est utilisé à une concentration < 200 nM, de préférence inférieure à 20 nM ; de manière encore plus préférée à la concentration de 10 nM.
8°) Ligand d'HLA-DP4 susceptible d'être obtenu par le procédé de sélection selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il correspond à une molécule minérale ou à une molécule organique, naturelle ou synthétique, présentant une activité de liaison à HLA-DP4 inférieure à 1000 nM.
9°) Ligand d'HLA-DP4 selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite molécule organique est un peptide ou un peptide modifié tel qu'un glyco- peptide, un lipopeptide ou un pseudopeptide.
10°) Peptide ligand d'HLA-DP4 selon la revendication 9, caractérisé en ce que sa séquence peptidique répond à la formule générale (I) ZιX1X2X3X4X5X6X7Xs Z2! dans laquelle :
- Zi et Z2, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de 1 à 30 acides aminés ; de manière préférée, de 1 à 10 acides aminés, - X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cysteine,
- X| représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cysteine (C), un acide aspartique (D), une glutamine (Q), une serine (S), une threonine (T) ou un acide glutamique (E), et
- X2, X3, X4, X5, X7 et X8 représentent chacun un acide aminé naturel ou synthétique, à condition que ledit peptide ligand d'HLA-DP4, de formule générale (I) ne corres- ponde à aucune des séquences SEQ ID NO: 1 à 17.
11°) Peptide selon la revendication 10, caractérisé en ce que :
- X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et
- Xi est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E. 12°) Peptide selon la revendication 1 1, caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la molécule HLA-DPB1 *0401 et X6 est différent de C, et/ou Xi est différent de A et de V, et/ou X9 représente W ou Y ou X9 est différent de E et de C, et/ou X est différent de K et de R.
13°) Peptide selon la revendication 1 1, caractérisé en ce qu'il se lie spécifiquement à la molécule DPB 1 *0402 et X6 représente C, et/ou Xi représente A ou V, et/ou X représente E ou C ou X est différent de Y et W, et/ou X4 représente K ou R.
14°) Peptide selon la revendications 10, caractérisé en ce qu'il présente la séquence SEQ ID NO:84. 15°) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 10 à 14.
16°) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 et les séquences nécessaires au contrôle de la transcription et de la traduction de ladite molécule d'acide nucléique. 17°) Vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend un insert constitué par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 ou une cassette d'expression selon la revendication 16.
18°) Cellule transformée par au moins une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15 ou un vecteur selon la revendication 17.
19°) Composition immunomodulatrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 ou une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15.
20°) Réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14.
21°) Méthode de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu comprenant les étapes de :
- mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un réactif de diagnostic selon la revendication 20, et
- détection de lymphocytes T CD4+spécifiques d'un antigène.
22°) Kit de détection de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif selon la revendication 20, associé à un moyen de détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène. 23°) Utilisation d'un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 15, pour la préparation d'un médicament immunomodulateur ou d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu.
24°) Procédé de tri de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un anti- gène, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- mise en contact de cellules avec des tétramères marqués par un fluorochrome, préparés à partir des complexes entre un ligand d'HLA-DP4 selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 et des molécules HLA-DP4 solubles, et
- tri des cellules liées audit tétramères, en cytométrie de flux. 25°) Procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4 selon la revendication 10, à partir d'une séquence d'acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) l'établissement d'une matrice de liaison à HLA-DP4 par calcul, -pour tous les mutants d'un peptide traceur tel que défini à la revendication 1, représentant l'ensemble des substitutions des résidus en position 1, 4, 6 ou 9 dudit peptide traceur par les 19 autres acides aminés naturels-, du rapport des IC50 desdits peptides mutants et dudit peptide traceur, à l'aide du test de liaison à HLA-DP4 tel que défini dans le procédé de sélection de la revendication 1, b) l'évaluation de la liaison à HLA-DP4 de peptides d'au moins 9 acides aminés inclus dans ladite séquence d'acides aminés, par calcul, pour chaque fragment de 9 acides aminés dudit peptide, de la somme des scores de liaison à HLA- DP4 des résidus en position 1, 4, 6 et 9 dudit fragment, à partir de la matrice de liaison établie en a), et c) l'identification des peptides ligands d'HLA-DP4 correspondant à ceux dont la perte de liaison à HLA-DP4, par rapport audit peptide traceur est la plus faible, c'est à dire ceux dont la somme des scores de liaison présente la valeur la plus faible exprimée en logarithme (log) ; de préférence inférieure à 2, de manière préférée inférieure à 1, de manière encore plus préférée, proche de 0.
26°) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que ledit peptide traceur est le peptide de séquence SEQ ID NO:28.
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