JPH10501791A

JPH10501791A - クラスｉｍｈｃペプチドによる細胞傷害性ｔ細胞リンパ球（「ｃｔｌ」）活性の調節

Info

Publication number: JPH10501791A
Application number: JP7525947A
Authority: JP
Inventors: キャロルクレイバーガー，; アランエム．クレンスキー，; ピーターパーヘム，
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1994-04-05
Filing date: 1995-04-05
Publication date: 1998-02-17
Also published as: EP0753005A4; US5723128A; EP0753005A1; EP0753005B1; CA2187193A1; ATE231884T1; DE69529515D1; DE69529515T2; WO1995026979A1; ES2186717T3

Abstract

(57)【要約】クラスＩHLA抗原ドメインの多型性ドメイン由来のフラグメントを用いてＴ細胞活性を調整する。ペプチドはα1-またはα2-ドメイン（特にHLA-A、およびB抗原の）由来である。このペプチドは他の化合物に結合され得、診断および治療において使用される。このペプチドは溶解、CTL増殖をブロックし得、または他の調節効果を有し得る。

Description

【発明の詳細な説明】クラスＩMHCペプチドによる細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球(「CTL」)活性の調節関連出願への交差参照本出願は、1992年３月２日に出願された出願番号第844,716,号の一部継続出願であり、第844,716,号は、1991年９月３日に出願された出願番号第755,584,号の一部継続出願であり、第755,584,号は、1991年３月19日に出願され、今や放棄された出願番号第672,147,号の継続出願であり、第672,147,号は、1987年１月30日に出願され、今や放棄された出願番号第008,846,号の一部継続出願である。序論技術分野本発明の分野は、クラスＩMHCペプチド由来のペプチドフラグメントを用いる細胞傷害性Ｔリンパ球の制御である。背景細胞傷害性Ｔ細胞、特に細胞傷害性Tリンパ球(「CTL」)は、標的細胞表面上の特異的組織適合性遺伝子複合体(「MHC」)抗原、およびMHC抗原の裂溝中に結合したペプチドを認識することによりそれらの活性において拘束される。外来抗原は、同種異系の宿主の移植、ウイルス感染、変異、新形成などの結果であり得る。 MHCタンパク質の関与は、外来抗原を含む細胞に対するCTLによる攻撃に必須のようである。外来抗原の存在をモニターすることにより、CTLは細胞を破壊し得、それは、そうでなければ増殖し得、病原体または新形成細胞の増殖を生じ得る。外来抗原の存在をモニターして、CTLはまた、同種または異種宿主由来の器官、組織および細胞の移植物を認識する。CTLから移植物を防御するために、種々の免疫抑制手順が用いられている。これらの手順は、大部分において、免疫系全体を阻害する免疫抑制薬物の使用を含み、患者を日和見感染に対するリスクに置く。さらに、この処置を、しばしば患者の生涯の間に特定のレベルで維持しなければならず、疾病にかかりやすいことに加えて、患者を薬物の有害な影響に曝す。さらに、この手順が移植物を維持するために十分に防御的でないことがしばしば見出されている。増大した移植成功の機会およびCTL活性を調整することを目的とする他の状況の提供における非常に大きな目的の見地から、CTL活性を調整することを含む現在の治療処置を改善する新たな技法を開発する実質的な機会が存在している。関連文献 Ciaybergerら、J.Exp.Med.(1985)11:1709-1714は、HLA-Aw68およびAw69と比較してHLA-A2抗原を記載する。Townsendら、Cell,(1986)44:959-968は、CTLがヘルパーT細胞と同様の方法で変性または分解タンパク質のセグメントエピトープを認識することを示唆している。HolmesおよびParham，EMBO J.,(1985)４：2849-2 854は、HLA-A2、Aw68およびAw69の関係を記載する。CTL標的特異性は、ヒトクラスＩ分子の構造における変化に極度に感受性であることが教示されている(Durna およびPease、Trasplantation，(1986)41：279-285：Biddisonら、J.Immunol.,( 1980)124:548-552：Spitsら、Immunogenetics,(1982)16：503-512：Gastonら、J .Exp.Med. (1983)158:280-293)。 CTLによる認識に影響する変異がマウス(Nathensonら、Ann.Rev.Immunol.)(198 6)４:471-502：Schulzら、Proc.natl.Acad.Sci.USA(1983)80:2007-2011)およびヒト(Krangel,Biochemistry(1982)21:6313-6321：Krangelら、J.Immunol.(1983) 130:1856-1862：Cowanら、J.Immunol.(1985)135:2835-2841：Taketaniら、同上( 1984)133:816-821；およびVegaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:7394-7398 )において研究されている。これらの報告は、残基147と157との間の領域にかなりの注意を向けているが、その他の領域もまた機能的差異を生成し得る(Ezquerraら、J.Immunol.(1985)134 :2727-2733)。可変性のクラスターか第１の細胞外ドメインのカルボキシ末端および第２の細胞外ドメインのアミノ末端で報告されている(Waysら、J.Biol.Chem . (1985)26:11924-11933)。すべてのクラスＩ分子の残基105-108間の配列は、フィブロネクチン結合テトラペプチドの配列に関連しており(AuffrayおよびNovotn y, J.Human Immunology (1986)15:381-390)、このテトラペプチドは、いずれの方向でも細胞接着特性を有することが見出されている(PierschbacherおよびRuoslaht i，Nature(1984)309:30-33；YamadaおよびKennedy，J.Cell.Biol.(1985)28：99- 104)。単一のモノクローナル抗体で規定されるHLA-A2のエピトープに影響する10 7位における置換がSalterら、J.Exp.Med.(1987)166:283-288により報告されている。発明の要旨クラスＩ抗原α1-およびα2-ドメイン、特にα1-ドメイン、およびより特定すればアミノ酸75〜84を含むα1−ドメインの配列に基づく方法および組成物が提供される。このフラグメントは、少なくとも、クラスＩ抗原の55位と120位との間のアミノ酸の部分を含み、そして細胞傷害性Tリンパ球分化および/または標的細胞の溶解の調整に用いられる。異なるペプチドが、CTLまたはCTLのサブセットに関して異なる効果を引き出し得る。特に目的とするのは、限定された期間、準治療的な（subtherapeutic）量の免疫抑制剤の所定のレジメと組み合わせてペプチドを投与することによる器官移植物の結果を改善するためのペプチドまたはペプチドオリゴマーの使用である。本発明はまた、本発明のペプチドの結合標的として供される分子量70および74 を有する精製タンパク質を含む。図面の簡単な説明図１は、HLA-A2特異的CTLによる細胞溶解の阻害に必要なペプチド配列の最小サイズを示す。図２は、HLA-A2特異的CTLによる細胞溶解の阻害に対するCTLおよび標的細胞の前処理の効果を示す。図３は、CTLによる標的細胞の細胞溶解の間のセリンエステラーゼを含む顆粒の放出に対するペプチドA2.98-113の効果を示す。図４は、クラスＩHLA分子のα1、α2およびα3領域を構成するペプチドのコンセンサス配列、および異なる特異的HLA分子におけるこれら配列の変化を示す。図５は、異なる特異性のCTLによる標的細胞の細胞溶解に対する異なるHLA-A2 エピトープからのペプチドの効果を示す。図６は、ペプチドA2.56-69により引き起こされるクローンA2/B17細胞による細胞溶解に対するHLA-Aw69標的細胞の感作を示す。図７は、標的細胞またはクローンA2/B17細胞のペプチドA2.56-69とのインキュベーションの感作に対する効果を示す。図８は、異所性心臓同種異系移植の生存性を示す。ACIラットを、Lewドナー由来の腹部異所性心臓同種異系移植片のためのレシピエントとして用いた。移植片を毎日触診し、そして触診可能な脈がなかったときに拒絶されたとして記録した。(A)動物を第２日にB7.75-84および/またはCsAの単回用量で処置した。処置を受けなかった動物(n=6)は、10日間の移植片生存性の中央値を有していた。手術の前第-７日および第-１日に20mgのB7.75-84で(n=6)、第-14日、第-12日、第-10 日および第-７日に10mgのB7.75-84で(n=11)、または第２日に20mg/kg CsAで(n=1 7)処置した動物は、それぞれ、８、14、および14日の生存時間の中央値を有していた。第-７日および第-１日に20mgのB7.75-84およびその後の移植後第２日の20 mg/kgのCsAの組み合わせの処置(n=7)は、13日の生存時間の中央値を有していた。手術前の第-14日、第-12日、第-10日、および第-７日に10mgのB7.75-84で、および第２日に20mg/kgのCsAで処置した動物（n=7）における移植片生存性の中央値は、200日であった。(B)動物をB7.75-84および/またはCsAの５用量で処置した。動物を、手術前の第-７日および第-１日に20mg/kgのB7.75-84で(n=6)、第０〜４日に10mgのB7.75-84で(n=9)、または第０〜４日に10mg/kgCsAで(n=18)処置し、それぞれ８、14、10および18日の移植片生存性の中央値を有していた。第-７日および第-１日のCsAの５用量＋20mgのB7.75-84の組み合わせ(n=7)、または第０〜４日のCsA＋10mgのB7.75-84の組み合わせ(n=11)、または第-14日、第-12日、第-10日、および第-７日のCsA＋10mgのB7.75-84の組み合わせでの処置はすべて、＞200日の移植片生存性の中間値を有していた。(C)動物を(B)と同一のレジメを用いて、B2702.75-84および/またはCsAの５用量で処置した。第-14日、第-1 2日、第-10日、および第-７日に20mgのB2702.75-84で(n=10)、または第０〜４日に10mgのCsAで(n=18)で処置した動物は、それぞれ８および18日の移植片生存性の中間値を有していた。第-７日および第-１日のCsA＋20mgのB2702.75-84の組み合わせ（n=8）、第-14日、第-12日、第-10日および第-７日のCsA＋10mgのB2702.75-84 の組み合わせ(n=10)、または第０〜４日のCsA＋10mgのB2702.75-84の組み合わせ (n=8)での処置は、それぞれ、17、19および13日の移植片生存性の中間値を有していた。図９は、同種異系移植拒絶を防ぐB7.75-84の経口投与の効果を示す。B7.75-84 を水中で強制飼養により与えたことを除いて図８に関して記載したように、動物を処置および移植した。第０〜４日に10mg/kgのCsA単独て処置した動物は(n=18) 、18日の移植片生存性の中間値を有していた。第０〜４日に経口的にCsA＋10gの B7.75-84の組み合わせ(n=12)で、または第-14日、第-12日、第-10日および第-７日に経口的に10mgのB7.75-84(n=12)で処置した動物は、＞200日の移植片生存性の中間値を有していた。第０〜４日に経口的にCsA＋10mgのB2702.75-84(n=9)で処置した動物の移植片生存性の中間値は22日であった。特定の実施態様の説明本発明によれば、宿主由来のまたは宿主とは外来の、１つまたはより多くのクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体抗原の多形性領域の配列を患者に投与することにより、患者におけるCTL活性が調整され、特に阻害される。CTLの標的へのCT Lの結合を阻害するペプチドもまた提供される。ここで、この効果は、CTLの分化の阻害および/またはCTLによる標的細胞の溶解の阻害に起因し得る。多形性領域は、α1-およびα2-ドメインを含み、ここでα1-ドメインを特に目的とし、より詳細には、アミノ酸75〜84を含むα1-ドメインを特に目的とする。ヒトのクラスＩ抗原は、Ａ、Ｂ、およびＣと称され、ここで他の動物は類似のクラスを有し、その中でＡおよびＢ抗原を特に目的とする。より詳細には、CTL活性の調整を提供することにおいて標的細胞のクラスＩMHCに比較的非特異的であることが見出されている特異的なペプチドを目的とする。従って、結合するクラスＩMHCに関して比較的特異的であるペプチド配列と、広範囲のクラスＩMHC抗原を有するCTLに比較的非特異的に結合するペプチドとを区別し得る。本発明のペプチドは、モノマーとして、オリゴマーとして用いられ得、または広範な分子に結合して、増大した生理学的安定性、多機能的特性、投与の容易さなどの特定の特徴を提供し得る。 CTL活性の調整に加えて、本発明のペプチドは種々の他の方法で用いられ得る。本発明のペプチドを用いて、このペプチドに結合する特定のCTLを同定し得る；それらは、Ｔ細胞組成物またはその部分からCTLまたはCTLのサブセットを除去するために用いられ得る；それらは匹敵する活性を有する薬剤を検出するためのアッセイで用いられ得、ここでこの薬剤を用いて、競合アッセイにおいてペプチド標的について本発明のペプチドと競合させ得る；それらは、目的の特定の構造を規定するための合理的薬剤設計で用いられ得る；など。ほとんどの場合、本発明の組成物は、少なくとも８つのアミノ酸、より通常には、少なくとも10のアミノ酸、通常は少なくとも12のアミノ酸のペプチドの純粋な組成物または処方された組成物を含み、このペプチドは以下の伸長配列内の配列および完全伸長配列までを有する、または通常２つを超えない置換、通常１つを超えない置換であって、この置換がCTL活性の調整に影響しない部位にある本発明の組成物の変異体を含み：ここで、 aa⁵⁵はＥまたはＫ、特にＥであり； aa⁶²はＧ、Ｑ、ＥまたはＲ、特にＲまたはＧであり； aa⁶³は酸性アミノ酸またはそのアミド、特にＥであり； aa⁶⁵はＱ、Ｒ、またはＧ、特にＱまたはＲであり； aa⁶⁵はＩ、Ｎ、またはＫ、特にＩまたはＫであり； aa⁶⁷は脂肪族中性またはＹアミノ酸、特にＣ、Ｓ、ＶまたはＹであり； aa⁶⁹は脂肪族中性または塩基性アミノ酸、特にＡ、ＲまたはＴであり； aa⁷⁰はＱ、Ｈ、Ｓ、ＮまたはＫであり； aa⁷¹は脂肪族中性アミノ酸、特にＡ、Ｌ、ＳまたはＴであり； aa⁷⁴はＤ、ＹまたはＨであり； aa⁷⁶はＥまたはＶであり； aa⁷⁷はＤ、ＳまたはＮであり； aa⁷⁹はＲまたはＧであり； aa⁸⁰はＴ、ＩまたはＮであり； aa⁸¹は脂肪族非極性アミノ酸、特にＡまたはＬであり； aa⁸²はＲまたはＬであり； aa⁸³はＧまたはＲであり； aa⁹⁴はＴまたはＩであり； aa⁹⁵は５〜６の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸であり； aa⁹⁷は脂肪族アミノ酸またはＷであり； aa⁹⁹は芳香族アミノ酸であり； aa¹⁰³は５〜６の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸であり； aa¹⁰⁵はＰまたはＳであり； aa^1O7はＧまたはＷであり； aa¹⁰⁹はＬまたはＦであり； aa¹¹³はＹまたはＨであり； aa¹¹⁴はＨ、Ｑ、Ｄ、ＮまたはＲであり； aa¹¹⁶はＹ、Ｄ、Ｓ、ＦまたはＨであり；ここで本発明のペプチドはCTL活性を調整する。特に目的とするペプチドのサブセットは以下の伸長配列内にある：ここで： aa⁹⁴はＴまたはＩであり； aa⁹⁵は５〜６の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸であり； aa⁹⁷は脂肪族アミノ酸またはＷであり； aa⁹⁹は芳香族アミノ酸であり； aa¹⁰³は５〜６の炭素原子の非極性脂肪族アミノ酸であり； aa¹⁰⁵はＰまたはＳであり； aa¹⁰⁷はＧまたはＷであり； aa¹⁰⁹はＬまたはＦであり； aa¹¹³はＹまたはＨであり； aa¹¹⁴はＨ、Ｑ、Ｄ、ＮまたはＲであり； aa¹¹⁶はＹ、Ｄ、Ｓ、ＦまたはＨである。特に目的とする上記の伸長配列内にある配列の別のサブセットは以下の伸長配列内にある配列である：ここで： aa⁵⁵はＥまたはＫ、特にＥであり； aa⁶²はＧ、Ｑ、ＥまたはＲ、特にＲまたはＧであり； aa⁶³はＥおよびＮを含む酸性アミノ酸またはそのアミド、特にＥであり； aa⁶⁵はＱ、ＲまたはＧ、特にＱまたはＲであり； aa⁶⁶はＩ、ＮまたはＫ、特にＮまたはＫであり； aa⁶⁷はＶ、Ｍ、Ｓ、ＣおよびＹを含む脂肪族中性アミノ酸、特にＶであり； aa⁶⁹はＡ、ＴおよびＰを含む脂肪族中性アミノ酸、特にＡであり； aa⁷⁰はＱ、Ｈ、Ｓ、ＮまたはＫ、特にＱまたはＨであり； aa⁷¹はＳ、ＡおよびＴを含む脂肪族中性アミノ酸、特にＳであり； aa⁷⁴はＤ、ＹまたはＨ、特にＤまたはＨであり； aa⁷⁶はＥまたはＶであり； aa⁷⁷はＤ、ＳまたはＮ、特にＤであり； aa⁷⁹はＲまたはＧ、特にＧであり； aa⁸⁰はＴ、ＩまたはＮ、特にＴまたはＩであり； aa⁸¹はＬまたはＡを含む脂肪族非極性アミノ酸、特にＬであり； aa⁸²はＲまたはＬ、特にＲであり； aa⁸³はＧまたはＲ、特にＧである。特に目的とする、少なくとも８つのアミノ酸、通常少なくとも約10のアミノ酸のペプチドの別のシリーズは以下の伸長配列内にある；目的とする８アミノ酸フラグメントが由来する他の伸長配列は以下の配列を含む：特に目的とするのは以下のより短い配列である：これら配列の中で、α1-ドメイン内の配列、即ち55〜85位由来の、より特定すれば55〜80位または70〜85位の、望ましくは配列内にテトラペプチドを含むアミノ酸配列を目的とする。α2-ドメインについては、90〜112位、より特定すれば94〜116位、望ましくは配列内にテトラペプチドまたはを含むアミノ酸配列を目的とする。レセプター結合ペプチドとして供される目的のペプチドは、少なくとも８つのアミノ酸、通常少なくとも10のアミノ酸、より通常には少なくとも12のアミノ酸を有し、しばしば15またはより多くのアミノ酸、そして通常には約30のアミノ酸を超えない、より通常には約24を超えないアミノ酸を有し、望ましくは約12〜21 のアミノ酸を有する。このアミノ酸配列は、通常、天然に存在する配列と、２つを超えるアミノ酸置換、または変異(例えば、欠失または挿入)で異ならず、より通常には、約１のアミノ酸より多くは異ならない。用いられる配列は、通常、MH C拘束性Ｔ細胞の宿主のMHC抗原(特にHLA-Aまたは-Bグループの抗原)のα１ドメインのＣ末端側半分またはα２ドメインのＮ末端側半分の多形性領域由来であり、ここでこのペプチドは、同じMHC抗原または実質的に相同な抗原を有する細胞でのみ活性であり、または異なる宿主または変異配列由来であり、ここでこの配列は、異なるクラスＩMHC抗原を有する宿主由来の所定の範囲のＴ細胞と作用する。これらの配列（異なるクラスＩMHC抗原(特にＡおよびＢ、より特定すればＢ )を有する多くの宿主にわたって作用する）は、汎配列(pan-sequence)と考えられ得る。以下の配列の少なくとも８つのアミノ酸の配列または配列フラグメントを特に目的とする：同じ部位に示された２つまたはより多くのアミノ酸がある場合、示されたアミノ酸のいずれもが存在し得る。特に目的とする領域は、アミノ酸位置110〜116の領域である。本発明のペプチドは広範な方法で改変され得る。このペプチドは、ペプチドに沿って都合の良い任意の部位で、異なる目的のために種々の他の化合物に共有結合により結合され得る。従って、このペプチドは、抗体産生のための免疫化のために宿主に投与するための免疫原に連結され得、または合成、合成遺伝子の発現などにより特定のMHC抗原の非隣接MHC配列に連結され得；脂質またはポリアルキレンオキシ基に連結され得；糖類に連結され得；または核酸に連結され得る。特に目的とするのは、本発明のペプチドを、合成または合成遺伝子の発現により他のペプチドに連結することであり、ここでこの他のペプチドは、宿主に投与されるときに、本発明のペプチドの増加した安定性を提供する。免疫グロブリン定常領域(例えばIgG Fc)のような種々のペプチドを使用し得る。あるいは、本発明のペプチドは、特に、細胞への結合鎖の結合を阻害するように、結合鎖が除去されるかまたは不活性化されている場合、ジフテリア毒素、リシン、アブリンなどのような毒素に連結され得る。特に目的とするのは、HLA-B7または-27、より特定すれば−2702由来のペプチドであり、ここで１またはより多くのアミノ酸は置換され得るが、CTL調整活性を保持している。B7とB2702とは、部位77、80、81、82および83で異なり、部位7 5、76、78、79、および84で同一性を有する。さらに、部位77および81でのアミノ酸がCTL調整活性を損失することなく置換され得ることが見出されている。従って、コンセンサス配列は、REX¹LRX²X³X⁴X⁵Yであり、ここでX¹は任意のアミノ酸、極性または非極性、好ましくは極性、荷電または非荷電のいずれかであり得；X²は、好ましくは、極性または非極性であり得る少なくとも５つの炭素原子のアミノ酸、特にアスパラギンおよびイソロイシンであり；X³は任意の、特に２〜６、より特定すれば３〜５の炭素原子の非極性の脂肪族のアミノ酸であり得；X⁴ は任意のアミノ酸、特に脂肪族の、荷電または非荷電のいずれかの、好ましくは少なくとも約５の炭素原子の、アルギニンおよびロイシンのようなアミノ酸であり得；X⁵は任意のアミノ酸、好ましくは脂肪族の、荷電または非荷電の、極性または非極性の、特にグリシンおよびアルギニンであり得る。好ましくは、X^1-5は、それぞれ、Ｓ、Ｎ、Ｌ、Ｒ、ＧまたはＮ、１、Ａ、Ｌ、Ｒであり、ここで、１つのグループにおけるアミノ酸の１つは、同一部位で他のグループのアミノ酸に置換され得る。互いに結合されていることの他に（結合またはポリペプチド架橋のいずれかにより）（約１〜30のアミノ酸の、より通常には約１〜20のアミノ酸の）、本発明のペプチドは、骨格に結合した複数の本発明のペプチドを有するように、多官能性の骨格に連結し得、ここで本発明のペプチドはアミノ酸以外により連結され得る。従って、種々の結合基が使用され得、ここで本発明のポリペフチドは改変されて結合に便利な官能基を提供し得る。本発明のペプチドを合成することにより、チオール、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシ、ホスフェートなどの種々の官能基が導入され得、ここでこれらの基は、次いで、通常約１〜30の、より通常には、約１〜20の炭素原子を有する、脂肪族基、芳香族基、脂環式基、またはヘテロ環式基への連結のために使用され得る。従って、ポリビニルアルコール、アクリル酸、多糖などが使用されて、本発明のオリゴペプチドが結合する便利な骨格を提供し得る。通常、本発明のペプチドのオリゴマーにおいては、少なくとも２つのそして約 20を超えない、通常約10を超えないオリゴマーが存在する。保存的置換を考慮すると、アミノ酸の分類は以下のように称される：脂肪族非極性Ｇ、Ａ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｖ極性中性Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｑ酸性Ｄ、Ｅ塩基性Ｋ、Ｒ芳香族Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙほとんどの場合、単一の線上に示されたアミノ酸は保存的置換であるが、通常、保存的置換は、置換するアミノ酸とは３つより少ない炭素原子だけ異なる。また、多くの場合、荷電または極性はサイズほど重要ではなく、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、ＫおよびＲは一方を他方に、即ち１つの脂肪族グループを別の脂肪族グループに置換し得る。このペプチドは種々の方法で調製され得る。簡便には、それらはBeckman、App lied Biosystem Inc.,または他の有用なペプチド合成装置のような自動合成機を用いる従来技術により合成され得、また手動で合成され得る。あるいは、特定のペプチドをコードするDNA配列が調製され得、そしてクローン化および発現されて所望のペプチドを提供し得る。この例においては、メチオニンが最初のアミノ酸であり得る。ペプチドはまた、天然供給原から単離され得、そして例えばイオン交換物質でのクロマトグラフィー、サイズによる分離、免疫アフィニティークロマトグラフィーおよび電気泳動を含む公知の技法により精製され得る。本明細書で使用される用語「ペプチド化合物の実質的に純粋な調製物」は、通常、このポリペプチドが天然に会合している物質を約70％以上含まない、そして好ましくはこれら物質を約80％以上含まないペプチドの調製物を意味する；しかし、これらの物質は、ペプチドが薬学的組成物の調製において混合され得る物質を除外する。配列は、それらの最終的な目的に依存して、種々の方法で改変され得る。異なるＮ末端またはＣ末端基が導入され得、このペプチドの固体基質または他分子への連結を可能にする。合成手順においては、任意の分子がＮ末端またはＣ末端に導入され得、これはペプチドが調製される目的に依存して、次の反応を可能にし得る。診断目的のために、広範な標識が末端に連結され得、それは直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供し得る。例えば、蛍光物質が末端、または蛍光物質、酵素、粒子などのような標識への連結を提供する他の分子に導入され得る。例えば、ビオチンなどの連結が末端に導入され得、酵素または蛍光物質とのアビジン結合体に結合し得る。あるいは、種々の反応性部位が、粒子、固体基質、巨大分子などへの連結のために末端に導入され得る。例えば、保護された中間側鎖基を有する固体基質に結合した成長鎖の内部アミノ部分は、メチルジチオ安息香酸(MDTB)と結合され得る。次いで、遊離のメルカプタン基を用いて活性化オレフィンと結合させ得る。従って、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシβグロブリンなどのようなタンパク質がペプチドと結合して、イムノアッセイにおいて、アフィニティークロマトグラフィーのためになどの使用のためのペプチドに対する抗体を産生すための免疫原を提供し得る。あるいは、ペプチドは、目的の結合性ペプチドを含む融合タンパク質を提供するように、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または中間にペプチドを有するDNA配列を調製することにより別のポリペプチドに結合され得る。この方法においては、目的のペプチドに結合する例えば抗体などの巨大分子により調整され得る酵素活性を有する融合タンパク質が産生され得る。従って、本発明のペプチドは、生物学的活性をなお保持しながら、種々の最終目的のために広範な方法で改変され得る。本発明のペプチドはまた、CTLを活性化するために、目的の抗原性ペプチドまたはタンパク質と組み合わせて用いられ得る。従って、本発明のポリペプチドは、CTLがそれに結合して活性化され得るCTLに対する２つのエピトープを提示し得るように、直接的または間接的に、タンパク質に結合され得る。特に目的とするのは、他の決定部位を提供するペプチドまたはタンパク質と組み合わせてリポソームまたは脂質二重層膜に本発明のペプチドを結合し得る場合である。脂質、特にリン脂質に、ペプチドまたはタンパク質を結合するために種々の技法が利用可能であり、リポソーム表面上でのペプチドまたはタンパク質の存在を提供する。ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたは他の脂質が、MBSE、グルタルアルデヒド、メチルジチオ安息香酸などのような二官能性連結剤とともに用いられ得る。結合されたタンパク質を有するリポソームの形成は、文献中に十分な支持を見出し、例えば、米国特許第3,887,698号；第4,261 ,975号および第4,193,983号を参照のこと。改変されたペプチドまたはタンパク質は、水性媒体中で脂質と組み合わされ、そして音波処理されて所望のリポソームを提供する。次いでリポソームは回収され、そして示された方法で使用され得る。本発明のペプチドは、それ自体で、または他のペプチドまたはタンパク質と組み合わせて、本発明のペプチド、あるいは本発明のペプチドと他のペプチドまたはタンパク質との組み合わせに結合するCTLの存在を診断するために用いられ得る。この方法においては、本発明のペプチドと抗原性ペプチドまたはタンパク質との結合体は、先に記載のような連結剤を用いることにより調製され得る。あるいは、本発明のペプチドおよび抗原性ペプチドは、粒子、コンテナー表面などのような固体表面に結合され得る。所望であれば、本発明のペプチドおよび抗原性ペプチドまたはタンパク質は、蛍光性である粒子またはタンパク質に結合され得る。粒子またはタンパク質の結合は、蛍光活性化細胞分取装置における分取および計数を可能にする。本発明のペプチドは、哺乳動物宿主におけるCTL活性を調整するために、特にC TL活性を阻害するために用いられ得る。この調整効果はインビボまたはエクスビボで、例えば、患者の血液を患者から引き抜き、そして血液と混合してCTL活性を阻害するために生理学的に受容可能な媒体中にペプチドが存在するデバイスを通じてこの血液を循環させるアフェレーシスを用いて達成され得る。あるいは、ペプチドは、このデバイスを通して循環されている血液からCTLを除去するようにアフィニティークロマトグラフィーの様式で用いられ得る。ペプチドは、ペプチドが提供される特定の形態（例えば、モノペプチド、オリゴマーペプチド、特定の連結基など）に依存して任意の便利な方法により投与され得る。特に、ペプチドは、動脈内または静脈内のいずれかて血管内投与され得、CTLの調整を提供する。投与されるペプチドの量は、それが投与される形態、それが投与される目的、投与の頻度などで変化し得る。阻害ペプチドの例を以下に呈示し(実施例２および９を参照のこと)、それらは HLA-A2のα₁およびα₂ドメインの両方に由来する。各々の場合において、阻害ペプチドの配列は、CTLのエピトープ特異性と相関する。さらに、実施例４に示されるように、阻害はオクタペプチドにより媒介され、標的細胞へではなくCTLへのペプチドの結合により生じる(実施例５を参照のこと)。個々のペプチドの阻害能力は、CTL特異性と相関するので、これらのペプチドは、種々のＴ細胞レセプターへの結合によって阻害するようである。アロ反応性CTLによる、HLAクラスＩを有する標的細胞の細胞溶解を刺激するペプチドの例を以下の実施例10に呈示する。実施例10〜12における結果の最も単純な解釈は、HLA-A2/B17特異的CTLが、拘束エレメントとして、HLA-Aw69に関連してA2 56-69ペプチドを認識するということである。ペプチドの種々の活性は適切なアッセイにより測定され得る。ペプチドによる CTLの阻害は、標的HLAを有する標的細胞株における特定のHLAに特異的なCTL株を使用することにより測定され得る。標的細胞株は、例えば、⁵¹Crを用いて標識される。これらの細胞は、適切な培地中で組み合わされ、そして標識の放出が、細胞溶解の程度の指標として測定される。ペプチドは細胞が一緒にされたときと同時に添加され得、CTLとともにインキュベートされ得、または標的細胞とともにインキュベートされ得、ペプチドの作用様式を調査し得る。外因性のマーカーを用いる代わりに、ペプチドとともにCTLおよび標的細胞を組み合わせる際にセリンエステラーゼ活性の放出を測定し得る。セリンエステラーゼ活性の存在は顆粒の放出に関連し得る。既に示したように、ペプチドは、それ自体で、または抗原との組み合わせで存在し得、それによって目的の異なる決定部位を提供し得る。本発明のペプチドのみが含まれるか、または他のペプチドとの組み合わせで本発明のペプチドが含まれるかに依存して、活性化または阻害が達成され得る。不可逆的な阻害が所望される場合、本発明のペプチドと抗原との結合体が細胞傷害性薬剤に結合され得、細胞傷害性薬剤を含むリポソームに結合され、あるいは特異的なモノクローナル抗体または免疫グロブリンに結合し、それによって結合体のCTLへの結合が、CTL の補体媒介性溶解を生じる。さらに、特異的ペプチドをまた、特異的または非特異的であり得るCTLの分化をブロックするために供し得る。本発明のペプチドはまた、CTL活性を調整するために用いられ得、ここで調整は細胞溶解活性を阻害することを含み、この阻害は可逆的または不可逆的であり得る。いくつかの例においては、本発明のペプチドは、MHC拘束性CTLの特定のセットまたはサブセットの存在を測定するために用いられ得る。これらの種々の能力が、所望の特性を提供するに十分な量のペプチドと、CTL を含む細胞性組成物とを組み合わせることにより達成され得る。分離が所望される場合は、アフィニティーカラム、結合ビーズ(例えば磁性ビーズ)、またはその他の技法が用いら得、ここでペプチド結合細胞が、結合していないまたは非特異的に結合しているのいずれかの他の細胞から分離され得る。先に示したように、特定のペプチドが、広範なクラスＩMHC抗原を有するCTLに対して作用する。これらの化合物は、レジメを提供することにより移植拒絶に対する防御において特定の用途を見い出し、ここでペプチドは、ボーラス、徐放、デポー、連続注入または投薬の他の形態、投与様式(経口、非経口、吸息など)、投与のために選択された特定の回数、ドナーとレシピエントとの間の移植抗原の差異の程度などに依存して、種々の回数て、そして種々の期間で投与される。ペプチドの投与は、移植日に先立って、移植日に、および移植日後、またはそれらの組み合わせであり得る。種々のレジメが効果的に使用され得、特定のレジメは特異的に規定され得ないことが見出された。ペプチドが移植に先立って投与される場合、投与は移植の少なくとも３日前、好ましくは少なくとも約５日前、そしてより好ましくは移植の少なくとも約７〜20日前に開始すべきであり、一方、ペプチドが移植の開始時にまたは移植後に投与される場合、好ましくは投与は移植後１日以内に、好ましくは移植日に開始され、そして移植過程の間に投与され得る。通常は複数投与があり、通常は約10回より多くなく、より通常は約６回より多くなく、一般には少なくとも約２回であり、しばしば約２〜６回の投与であり、ここで投与は毎日、隔日であり得、通常約３日より多くなく、好ましくは２日間隔より多くない。毎日の複数回投薬が与えられ得るが、１日あたり単回用量が十分であることが見出されている。従って、全体では、レジメは移植手術に先立って20日の期間の間の投与、および移植手術の後の約10日間までの投与を含む。通常、初期用量は、第-20〜+1日の期間中に始まり、ここで０を手術の日として、(-)は手術の日の前であることを示し、そして(+)は手術の日の後であることを示す。好ましくは、この投与が主に手術の前である場合、初期用量は手術の７日前よりは早くなく、そして初期用量が手術後である場合、手術の１日後よりは遅くない。非経口的に投与される場合、移植片はまた、通常は患者の用量に関連する濃度で、ペプチドを含む生理学的に受容可能な媒体中に浴され得る。レジメの一部分として、一般に移植の際または後に、それ自体、または特に、ペプチドが移植後投与される場合ペプチドと組み合わせて免疫抑制薬物もまた投与され得る。準治療的用量の免疫抑制化合物が使用され、ここで免疫抑制剤は単一の薬剤または薬剤の組み合わせであり得、ここで組み合わせは準治療的用量以下である。準治療的用量は、ペプチドの非存在下では、移植片が大部分の患者において、100日以内、通常には30日以内、そしてより通常には20日以内に拒絶されることを意図する。シクロスポリンＡ、FK506、移植片拒絶に関連する形質膜タンパク質に対する抗体（例えば、CD4、CD8、CD2、LFA-1、ICAM-1、CD28などに対する抗体）のような種々の免疫抑制剤が公知である。準治療的用量は、治療的用量の約５％より少なくなく、通常には約10％より少なくなく、より通常には約 25％より少なくなく、そして通常には約75％を超えず、より通常には約60％を超えない。組み合わせが用いられる場合、準治療的用量は、主に、有意な副作用を有する薬物に対するが、免疫系に対する影響を最小にすることが実質的な目的である。本発明のレジメが移植の短期間内で終了し、本発明のレジメが毎日または毎日より少なく、そして他のレジメは繰り返しの毎日の投与を含み得る場合、直接比較は困難なので、準治療的用量というときはボーラス量を意図する。言うまでもないが、患者の生涯にわたる他の免疫抑制剤レジメとは対照的に、本発明のレジメは移植の約20日以内、通常には移植の約10日以内で終了し得る。一般に、投与されるペプチドの量は、約0.1〜50mg/kg宿主、より通常には約１〜25mg/kgである。この量は、ペプチド化合物の半減期が６時間より少ない、より特定すれば４時間より少なくそして１時間より大きい場合のペプチド化合物のために用いられる。この範囲のより低い部分の用量およびさらにより低い用量が用いられ得るペプチドは、増大した半減期を有するかまたは例えばコラーゲンマトリックス、実質的に連続的な速度で持続する期間にわたってペプチドを連続的に侵出するポンプの使用などの、持続する期間にわたってペプチドを維持するマトリックス中に導入される、粒子を含む徐放組成物のような、デポーとして提供される。移植に先立ってペプチドが投与される時間に依存して、免疫抑制剤レジメは変化し得る。例えば、ペプチドが第-7日および第-1日に投与される場合、シクロスポリンAの単回準治療的用量は、有意でない防御能力を有することが見出されたが、一方、第０〜４日に、毎日投与すると、防御を有することが示された。第-1 4、-12、-10および-7日にペプチドを、次いで移植後第０〜４日にシクロスポリンAを投与するレジメもまた、実質的な防御効果を有することが見出された。あるいは、移植後第０〜４日の準治療的用量のシクロスポリンAおよびペプチドの組み合わせ投薬を用いることにより、移植片の保持がおおいに増大した。移植は、心臓、腎臓、肺、眼、肝臓、腸、血管、または他の器官のような任意の器官に関し得、ここで器官は同種異系または異種であり、特に１つまたはより多くのクラスＩMHC抗原がレシピエントと比較してドナーにおいて異なっている。別の適用においては、本発明のペプチドは、ゲル電気泳動において70および74 kDのバンドとして現れる形質膜のタンパク質に結合することが見出されている。これらのバンドは、ポリメチレンビオチンとアミノ末端で結合されているペプチドを用いることにより観察され得、ここでメチレンの数は約２〜15の範囲、より通常には約６〜15であり得る。次いで、例えばフィコエリスリンまたはアロフィコシアニンなどのフィコビリタンパク質のような、アビジン(ストレプトアビジンを含む)−蛍光性結合体を用いることにより、ゲル中で分離したタンパク質を、ビオチン標識ペプチドを用い、次いでアビジン-蛍光物質結合体と接触させ、そして非特異的結合標識を洗浄して検出し得る。あるいは、表面にタンパク質を有する細胞を、細胞をペプチドと組み合わせ、非特異的に結合したペプチドを洗浄し、細胞を蛍光結合体と組み合わせ、非特異的に結合した蛍光結合体を洗浄し、そして蛍光活性化細胞分取装置において細胞を検出することにより検出し得る。 70および74kDタンパク質をゲルから単離し得、従来法に従った順序でさらに精製し得る。あるいは、タンパク質は、特異的タンパク質に対する抗血清を産生すために哺乳動物宿主を免疫化するための免疫原として用いられ得る。あるいは、例えばマウスなど適切な哺乳動物宿主では、脾臓を取り出し、脾臓細胞を不死化し、そして得られる不死化脾臓細胞を70および/または74kDタンパク質に特異的な抗体の産生についてスクリーニングし得る。次いでこれらの抗体を用いて、CT Lの溶解活性を阻害するように、CTL上に存在する70および/または74kdタンパク質への結合を阻害し得る。本発明のペプチドは、それ自身でまたは結合体として、生理食塩水、PBS、水性エタノールおよびグルコースなどの生理学的に受容可能な媒体中の処方物として、または適切な賦型剤中の固型処方物として、その濃度が特定の目的についての従来手順に従って経験的に決定される、一般的に製薬学的に有効な用量で調製され得る。この処方物は、殺菌剤、安定剤、緩衝液などを含み得る。宿主に投与される量は、投与されるもの、予防または治療などの投与の目的、阻害または活性化のいずれが所望されるか、宿主の状態、投与の方法、投与の数および投与間隔などに依存して変化する。本発明のペプチドまたは本発明のペプチド結合体の半減期を増大させるために、ペプチドはカプセル化され得、リポソームの間隙中に導入され得、コロイドとして調製され得、またはペプチドの延長された寿命を提供する他の従来技法が用いられ得る。以下の実施例は例示であり、そして制限を意図するものではない。実施例実施例１ HLA-A2 由来のペプチドの調製４つのペプチドを、標準的な固相法を用いる従来の合成法により調製した。本明細書に参考として援用される、EricksonおよびMerrifield：The Proteins 第２巻、第３版(Neurath，H.およびHill，R.L.編)、255-527頁(Academic Press，N .Y.1970)を参照のこと。３つのペプチドは、α₂ドメイン由来のアミノ酸を有し、そして１つのペプチドは、HLA-A2抗原のα₂ドメイン由来のアミノ酸を有していた。４つのペプチドは以下の組成と名称を有した：名称は、ペプチドが由来する主要組織適合性抗原および抗原中のアミノ酸の位置を示す。実施例２ HLA-A2.98-113 およびHLA-A2.94-112由来のペプチドによるHLA-A2特異的CTLの阻害実施例１におけるように調製したペプチド、即ち、HLA-A2.56-69、HLA-A2.94- 112、HLA-A2.98-113およびHLA-Aw68.98-113に対応するペプチドを、10³CPMの⁵¹C r標識Ｂリンパ芽球様細胞標的細胞を添加する前に、30分間、１〜３×10³のCTL とプレインキュベートした。次いで、Claybergerら、J.Exp.Med.(1984)162:1709 -1714；およびReissら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA(1980)77:5432-5436(これらは参考として本明細書に援用される)に記載されているように、細胞傷害性アッセイを行った。最初の研究においては、CTL細胞株は、HLA-A2に特異的な長期CD8⁺CTL株である AJYであり、そして標的細胞は、Ｂリンパ芽球様細胞の細胞株であるJY(HLA-A2， B7)であった。第２の研究においては、CTLはHLA-B17に対して反応性を有するバルク培養物であるPWSBであり、そして標的は、HLA-A1、A32、B17を発現するFMB であった。それぞれの場合において、ペプチドの非存在下で得られた特異的放出の百分率を測定した。第２の研究におけるより低い量の特異的放出は、潜在的に、細胞溶解を阻害に対してより感受性にした。PBS中１mg/mlのペプチドのストックを希釈して、表１に示すようなアッセイ中の最終濃度とした。コントロールインヒビターとして、HLA-A、B、6分子の単一型決定基に対するモノクローナル抗体PA2.6を用いた(Reissら、前出：McMichael，J.Exp.Med.(1980)152:195-203)。使用したペプチドはA2.98-113、A2.94-112、Aw68.94 112およびA2.56-69であった。以下の表に結果を示す。第１の事例では、ペフチドの非存在下で得られた％特異的放出は約54であり、一方、第２の事例では約28であった。 HLA-A2抗原により拘束されているCTLを用いた上記の結果は、特異的細胞傷害性の阻害を示す。A2により拘束されていないCTLを用いる場合、ペプチドの非存在下で得られた標準的な特異的放出に近い結果で、ランダムな標的細胞の溶解が生じる。これらの結果は、107位のトリプトファンが重要であり得ることを示唆する。ペプチドA2.98-113とペプチドAw68.98-113とは、この位置でのトリプトファンのグリシンへの置換を除いて相同である；この置換はHLA-A2特異的CTLによる細胞溶解の阻害の損失を生じる。異なるプロテアーゼ、即ちトリプシンまたはキモトリプシンでのペプチドA2.9 8-113の処理の結果は、108位のアルギニンが重要であるが、ペプチド109-113は重要でないことを示唆する。トリプシンおよびキモトリプシンの主要な作用部位は、それぞれ、Arg、Lys、およびTrp、Phe、Tyrである。キモトリプシンによるペプチドの切断は阻害活性を減少させたがトリプシン処理では減少させなかった (結果は示さず)。実施例３ HLA 由来ペプチドにより引き起こされる細胞溶解の阻害に対するCTLおよび標的細胞の特異性の効果多くの異なるCTL細胞株を研究し、ここで細胞株の特異性は変化した。表２に示す結果は、CTLおよび標的細胞がA2特異性を共有する場合にのみA2由来ペプチドが阻害を提供することを示す。実施例４ HLA-A2 特異的CTLの阻害に必要とされる最小ペプチド配列 HLA-A2特異的CTLによる細胞溶解の阻害に必要とされる最小のペプチド配列を阻害におけるサイズの効果を調べることにより決定した。HLA-A2またはHLA-Aw68 の98〜104位で始まり、そして108位で終わる一連のペプチドを合成した。17個の異なるHLA-A特異株またはクローンによるJY細胞（HLA-A2、B7、DR4、6）の細胞溶解におけるこれらのペプチドの効果を試験した。HLA-A2特異株またはクローンを、Claybergerら（上記）に記載されるように作製した。ペプチド（200mg/ml）を１〜３×10³CTLと30分間プレインキュベートした後、10³CPMの⁵¹Cr-標識標的細胞を添加した。ペプチドは細胞傷害性アッセイ中存在していた。本明細書中に参考として援用するClaybergerら（上記）、およびKrenskyら、Proc ．Natl．Sci ．USA 79：2365(1982)の記載に従って実施した。ペプチドは、リン酸緩衝化生理食塩水中で１mg/mlのストック溶液として調製され、完全培地（10％仔ウシ血清を補充したMEN）で希釈して使用する最終濃度にした。 CTL-A2による細胞溶解の阻害に対する結果を図1Aに示す。ここで、阻害は、(1 −[ペプチド存在下での特異的細胞溶解／ペプチド非存在下での特異的細胞溶解] )×100として表現わされる。図で見られるように、ペプチド104-108は阻害せず、ペプチド102-108および10 3-108は弱い阻害を引き起こし、そして他のペプチドは細胞溶解の良好な阻害を引き起こした。従って、残基101-108を含有するオクタペプチドは阻害効果を引き起こすには十分であった。阻害効果における大きな減少が101位でのシステインの欠失で引き起こされた。この喪失は、システイン101が存在しない場合、２つのペプチド分子のジスルフィド架橋結合の欠失によるためである。実施例５ペプチドA2.98-113の作用の位置ペプチドA2.98-113が（CTLおよび／または標的細胞と）相互作用してHLA-A2特異的CTL介在性細胞溶解における阻害効果を引き起こす位置を、以下のようにして決定した。 CTL（１×10⁶CTL-A2）および／または標的細胞（⁵⁷Cr標識JY標的細胞）を100 μgのA2.98-113と30分間37℃で、あるいは、コントロールペプチド（Aw68.98-11 3）とともにインキュベートした。これらのペプチドの配列を実施例１に示す。付加的なコントロールとして、細胞をペプチドを含まない完全培地でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を完全培地で３回洗浄し、そして⁵¹Cr 放出アッセイ（実施例２を参照のこと）で試験をした。結果を図２に示す。ここで、標的細胞ではなくCTLをA2.98-113で前処理した場合、溶解の阻害が見られ得た。CTLまたは標的細胞をコントロールペプチド（Aw6 8.98-113）で前処理した場合、阻害効果は観測されなかった。実施例６ CTL 生存性に対するA2.98-113の効果によるCTLの阻害の機構 CTLが、A2.98-113により誘導される自己溶解により阻害されるかどうかを決定するために、⁵¹Cr標識CTL-A2細胞または未標識CTL-A2細胞のいずれかを完全培地中で６時間37℃でペプチドと６時間インキュベートした。６時間のインキュベーション後、トリパンブルー排除または⁵¹Cr放出により判断される細胞生存性の減少は検出できなかった（結果を示さず）。実施例７セリンエステラーゼ含有顆粒の放出に対するA2.98-113の効果によるCTLの阻害の機構 CTLによる標的細胞の細胞溶解の過程におけるセリンエステラーゼ含有顆粒の放出に対するA2.98-113の効果は、以下のようにして測定した。放出の特異性を、３×10⁵のHLA-A2特異的CTLをJY細胞（HLA-A2；B7；Dr4、6）またはIBW4細胞（HLA-A3；B35；DR1）とともに２時間Ｖ底マクロタイターウェル中でインキュベートすることにより測定した。CTL：標的細胞の比は、1:0.01、1 :0.05、1:0.10、1:0.5、および1:1であった。インキュベーション後、プレートを２分間1000RPMで回転させ、そして上清を、本明細書中で参考として援用されるYoungら、Cell 47：183(1986)の記載に本質的に従ってセリンエステラーゼ活性についてアッセイした。反応混合物は、20μlの上清＋200μlの基質（２ ×10^-4M N-ベンジルオキシカルボニル-L-リジンチオベンジルエステル、2.2×10^-4 Ｍニトロ安息香酸、0.1M Tris-HCl、pH 8.0）であった。37℃で30分後、吸光度を410nmで測定した。全セリンエステラーゼ活性を、0.01％ Triton X-100を刺激細胞の代わりに用いて測定した。図3Aに示す結果は、顆粒の放出が起こるのは、HLA-A2特異的CTLをJY細胞とインキュベートした時（黒丸）であるが、HLA-A2 特異的CTLをIBW4細胞とインキュベートした時（黒四角）でないことを示す。セリンエステラーゼ含有顆粒の放出に対するペプチドA2.98-113の効果を、HLA -A2特異的CTLを100μgのペプチド（A2.98-113またはAw68.98-113のいずれか）、あるいは完全培地のみと30分間37℃でプレインキュベートした後、1:0.01、1:0. 05、1:0.1、1:0.5および1:1のCTL：標的細胞の比でJY標的細胞を添加した以外は、同様に測定した。図3Bに示すように、エステラーゼ放出の完全阻害が、1:0.1のエフェクター対標的比において100μg/mlのA2.98-113を用いたときに見られた（黒四角）。コントロールペプチドAw68.98-113はエステラーゼ放出について全く効果を有さなかった（黒三角）。なぜなら、この場合における放出は、完全培地でプレインキュベートしたコントロール細胞を用いて得られた放出と等しかったからである（黒丸）。実施例５における結果と合わせて、これらの結果は、A2.98-113ペプチドはCTL に直接結合することによるＴ細胞活性化の初期に起こる事象を阻止することを示す。この結合は、抗原レセプターに対してのものであり得る。実施例８ HLA-A2 およびHLA-B17により共有されるエピトープに対して、HLA-B17に対して、およびHLA-A2に対して特異的なCTLの単離種々の特異性を有するCTLを、正常ドナー（HLA-A3；B7；DR6）の末梢血リンパ球より誘導したが、それは、本質的にClaybergerら(1985)（上記）の記載に従った。HLA-A2およびHLA-B17間で共有されるエピトープに対して特異的なCTLについて、細胞を、放射線照射した（10,000R）B-リンパ芽球様細胞株Mag（HLA-A26,3 3；B17,51）を用いる初代培養において刺激し、ついでSB細胞株（HLA-A1,2；B17 ,44；DR2,6）を刺激細胞(stimulator)として用いてクローン化した。B17に対して特異的なCTLを同一の初代培養より誘導したが、刺激細胞としてSH細胞株（HLA -A3,w33；B7,17(w57)）を用いてクローン化した。HLA-A2特異的CTLを、初代培養においてJY細胞株で刺激した細胞より誘導し、そして刺激細胞としてHerluff細胞株（HLA-A2；B12,35；DR4,7）を用いてクローン化した。これらのCTLクローンの詳細な特異性を、HLA-B17を発現する11個の標的、HLA-A2を発現する８個の標的および無関連なHLA分子を有する15個の標的からなるパネルを用いて評価した。所望の特異性の複数のクローンを得た。HLA-A2型標的細胞およびHLA-B17型標的細胞の両方の細胞溶解を引き起こす独立したクローンをクローンA2/B17と称した。クローンA2/B17の標的細胞の細胞溶解は抗体MA2.1により阻害された。すべてのHLA-B17標的細胞を溶解したが、他を全く溶解しなかった第２のクローンをB 17と称した。すべてのHLA-A2標的細胞を溶解したが、他を全く溶解しなかった第３のクローンをCTL-A2と称した。クローンA2/B17の標的特異性およびこのクローンによる細胞溶解はモノクローナル抗体MA2.1により阻止されるという発見は、クローンA2/B17の細胞はHLA-A2 およびHLA-B17により共有されるエピトープを認識することを示す。実施例９異なる特異性のCTLによる標的細胞の細胞溶解に対する異なるHLA-A2エピトープ由来のペプチドの効果上記実施例２〜７は、α₂ドメイン中のトリプトファン107周辺の領域に由来するペプチドの効果に関連する。βプリーツシートの２つのストランド間の折れ曲りに存在するこの残基（Bjorkmanら、(1987)、上記）は、HLA-A2の主要な血清学的エピトープに対して重要である。Salterら、J ．Exp．Med. 166：283(1987)；L ayetら、J ．Immunol. 138：2197(1987)。もう一つの重要なエピトープはα₁ドメインのαヘリックス領域の残基62-65を含有する（Bjorkmanら、上記）。このエピトープは、本来、モノクローナル抗体 MA2.1により明らかにされ（McMichaelら、Hum ．Immunol. 1：121(1980)）、そしてHLA-A2およびHLA-B17のすべての公知のサブタイプにより共有される（WayおよびParham、Biochem ．J. 216：423(1983)）。HLA-A2およびHLA-B17および８個の他のHLA-A,B,Cタンパク質のアミノ酸配列の比較の結果は、62位でのグリシン残基のみが独特であることを示し、この残基が共有する決定基に寄与することを示唆する（Waysら、J ．Immunol. 137：217(1986)）。上記の２領域由来のペプチドを、異なるHLA特異性を有するCTL（すなわち、クローンA2/B17、クローンCTL-A2、およびクローンB17（実施例８を参照のこと、上記））による標的細胞の細胞溶解に対する阻害効果について試験した。CTLを以下のペプチド：A2.56-69、Aw68.56-69、A2.69-113、またはAw68.98-113とインキュベートした。検討したエピトープおよびこの研究で使用したペプチドを図４に示す。ここで、８個のHLA-A,B分子の３つの細胞外ドメイン（α₁、α₂およびα₃）におけるタンパク質配列を標準的な１文字アミノ酸コードを用いて示す。HLA-B17のHLA.Bw5 8サブタイプの配列はWaysら、J ．Biol．Chem. 260：11924(1985)からであり、HL A-A3.1の配列はStrachenら、EMBO J. 3：887(1984)からであり、そしてHLA-A2/2 8ファミリーの残りの配列はHolmesら、J ．Immunol. 139：936(1987)からである。ペプチドA2.56-69およびAw68.56-69、ならびにA2.98-113およびAw68.98-113（これらは、それぞれα₁およびα₂より誘導される）を、クロスハッチで示す。HL A-A2およびHLA-B17のサブタイプ（グリシン62）およびサブタイプのHLA-A2およびHLA-Aw69（トリプトファン107）により共有されるエピトープに対して重要であると見出される２つの残基を、点を付しそして垂直の矢により示す。コンセンサス配列は、23個のHLA-A,B,C配列の全体に由来した。 CTLを100μg/ml、200μg/ml、または300μg/mlの濃度のペプチドとインキュベートした。コントロールサンプルをペプチドの非存在下でインキュベートした。 100μg/mlでアッセイにおいて使用したペプチドの最終モル濃度は、A2.98-113では4.9×10^-5Ｍであり：Aw68.98-113では5.2×10^-5Ｍであり；A2.56-69では5.9× 10^-5Ｍであり；およびAw68.56-69では5.9×10^-5Ｍであった。CTL細胞を20分間ペプチドとインキュベートした後、10³の⁵¹Cr標識T7529細胞（HLA-Aw33：B17(w58) ；DR6）またはJY細胞（HLA-A2；B17；DR4,6）を添加した。すべての場合において、エフェクター：標的比は1:1であった。標的細胞からの⁵¹クロム酸放出により測定された細胞傷害性に対する結果を図５に示す。図5Aおよび5BにクローンA2/B17の細胞に対するペプチドの効果の結果を示す；図5CにクローンB17の細胞に対する効果を示す、そして図5DにCTL-A2に対する効果を示す。ペプチドを以下に示す：（白丸）A2.56-69；（白四角）Aw68 .56-69；（白三角）Aw.98-113；および（黒四角）Aw68.98-113。共有される血清学上のエピトープを包含するペプチドA2.S6-69は、クローンA2/B17細胞によるHL A-A2およびHLA-B17の両方を発現する標的細胞の死滅を特異的に阻害した。対照的に、このペプチドは、クローンB17細胞によるHLA-B17発現細胞の溶解に対して全く効果を有しなかった。クローンA2/B17細胞は、HLA-Aw68.1の残基56-69に由来するペプチド、または一連の無関係のペプチドにより阻害されなかった。A2.9 8-113ペプチドはクローンA2/B17細胞によるHLA-B17発現標的細胞の溶解に影響しないが、HLA-A2を発現する標的で高濃度においていくらかの阻害が観測された。この差異は、クローンA2/B17細胞により認識されるHLA-A2およびHLA-B17のエピトープが全く同一というわけではないことを示す。これらの結果は、アロ反応性CTLを阻害するペプチドの能力はα₂ドメインの残基101-108を含有する領域に拘束されないこと、およびそれらがHLA-A2の第２のエピトープから誘導され得ることを示す。クローンA2/B17を用いてペプチドA2.56-69で達成される結果、およびこのペプチドの阻害効果に関するPWSB細胞株での結果の不一致（表２を参照のこと）は、 PWSB細胞のポリクローナル特性により説明され得る。すなわち、PWSB株は恐らく、HLA-A2またはHLA-B17に特異的な別々のクローンを含有するCTLの混合物である。実施例10 HLA-A2 由来ポリペプチドにより引き起こされるCTLに対する標的細胞の感作クローンA2/B17をペプチドA2.56-69および⁵¹Cr標識標的細胞と５：１のエフェクター対標的比で５時間インキュベートし、その後放出される⁵¹クロム酸を測定した。ペプチドの濃度は10、30、100、および300μg/mlであった。クローンA2/B 17細胞による標的細胞の特異的溶解の百分率に及ぼすペプチドの効果の結果を図６に表す。標的細胞は以下のとおりであった：（黒四角）、IBW4（HLA-A3; B35; DRI）；（黒三角）、LB（HLA-Aw68.1; B40,DR6）；（黒丸）、Pally（HLA-Aw68 .2,26; B14,38; DRI,4）または（白菱形）、IDF（HLA-Aw69,26; B15，38，DR5）。ペプチドの非存在下において、クローンA2/B17細胞はHLA-Aw69、HLA-Aw68.1、およびHLA-Aw68.2を発現する標的を溶解しない（データは示さず）。クローンA2 /B17細胞がこれらの標的を溶解し得ないことは、62位周辺の重要な残基がHLA-A2 およびHLA-B17において見出される残基と異なることに起因する。しかし、ペプチドA2.56-69が細胞傷害性アッセイ中に含まれた場合、A2/B17細胞によりHLA-Aw 69を発現する標的が有意に溶解された（図５）。対照的に、HLA-Aw68.1、HLA-Aw 68.2または無関係なHLA-A3分子を発現する標的は溶解されなかった。ペプチドA2.56-69の存在下でのクローンA2/B17細胞によるHLA-Aw69細胞の溶解は、標的細胞のHLA-Aw69にのみ結合するモノクローナル抗体DRII-351によりブロックされた。対照的にモノクローナル抗体MA2.1は溶解を阻害しなかった（結果は示さず）。MA2.1は残基56〜69により形成されるHLA-A2およびHLA-B17のエピトープに結合するが、HLA-Aw69またはペプチドA2.56-69には結合しない。これらの結果はHLA-Aw69分子のペプチドA2.56-69による感作における関与を示す。 A2.98-113ペプチドのHLA-A2を発現しないＢ細胞株への添加は、種々のHLA分子を発現する標的細胞を使用した場合、溶解に対する感作を引き起こさなかった。このことは広範囲のペプチドの濃度（0.1μg/mlから300μg/mlを使用した）を通しても真であった。 A2.56-69の結合において、HLA-Aw69分子はHLA-A2の天然構造を模倣するエピトープを提示し得る。HLA-A2/28ファミリーの他のメンバーではなくHLA-Aw69が感作され得ることは興味深い。HLA-Aw69はHLA-Aw6B由来のα₁ならびにHLA-A2.1由来のα₂およびα₃を有する組換え分子である（HolmesおよびParham，EMBO J. 4: 2849(1985)）。従って、HLA-2.1およびHLA-Aw69はわずか６アミノ酸のみ異なるが、それはすべてα₁ドメイン中にあり、ならびに３残基はA2.56-69ペプチド中に存在する。実施例11 感作におけるペプチド相互作用の位置感作がCTLまたは標的のペプチドとの相互作用から生じたかどうかを評価するために、細胞をA2.56-69で前処理し、洗浄し、そして次に細胞溶解について試験した。より詳細には、１×10⁶のクローンA2/B17細胞または⁵¹Cr標識IDF（HLA-Aw 69,26; B18,38; DR5）を100μgのペプチドまたは培地と30分間37℃でインキュベートし、３回洗浄し、そして⁵¹クロム酸の放出により測定される細胞傷害性を測定した。図７に表す結果から見られるように、HLA-Aw69を発現する標的細胞は、CTLではなく標的をA.56-69で前処理した場合に溶解した。実施例1 2セリンエステラーゼ含有顆粒の放出に対するペプチドA2.56-69の効果 A2/B17細胞とHLA-Aw69発現細胞との共存培養の間のセリンエステラーゼ含有顆粒の放出に対するペプチドA2.56-69の効果は、CTLがクローンA2/B17由来であり、標的細胞がHLA-Aw69発現標的細胞であり、そして細胞をペプチドA.2.56-69の存在下または非存在下で共存培養すること以外は、本質的に前出の実施例７に記載のとおりに測定し得る。実施例13 種々のアミノ酸60〜84のHLAペプチドおよびHLA-B2702/05.145-169の溶解に対する効果ペプチドを合成し、そしてそれらは以下の配列を有した：上記の配列のHLA-A2、-B2705、-Bw46、-Bw62、およびCw4に特異的な長期CTLの溶解に対する効果を実施例２および３に記載のように測定し、そしてHLA-B27およびHLA-Cw4に特異的なCTLもまた含んだ。B2702.60-84ペプチドを除いていずれのペプチドも溶解を阻害または増強しなかった。このペプチドはすべてのCTLによる溶解をそのHLA特異性にかかわらずブロックした。この効果は、前処理実験（実施例５におけるように）により示されるように、標的ではなくCTLとの相互作用に起因した。これらのペプチドをCTL前駆体からのCTLの分化に対する効果について限界希釈アッセイにおいて試験した。手順をSkinnerおよびMarbrook（J ．Exp．Med. 143: 1562; 1976）から以下のように改変した：正常HLA型のドナー由来のPBLをFicoll -Hypaqueで精製し、そして丸底マイクロタイターウェル中で目的のHLA対立遺伝子を発現する照射（10,000 R）EBVトランスフォームＢリンパ芽球と共存培養した。応答個体PBLをウエルあたり3000、6000、10000および30000細胞で添加し、一方、刺激細胞（stimulator）をウェルあたり6000細胞で添加した。20〜４の複製物を、10%ウシ胎児血清＋L-グルタミンを補充したRPMI-1640培地中の応答細胞の各々の濃度について設定した。プレートを６日間５% CO₂/95%空気湿潤インキュベーター中でインキュベートし、この時各々のウェルの内容物をマルチチャンネルピペットを用いて５回ピペッティングすることにより混合した。50μlのアリコートをＶ底マイクロタイターウェルに移し、そこに既知のHLA型の1000の⁵¹C r標識標的を添加した。溶解を４時間の細胞傷害性アッセイ（実施例２）にて測定した。特異的溶解が＞10%であった場合にウェルを陽性であるとした。CTL前駆体頻度を、コンピュータープログラムを用いて直線回帰解析により決定した。 B2702.60-84、Bw46.60-84およびBw62.60-84ペプチドはすべてCTLの分化をブロックしたが、他のペプチドは効果を有さなかった。限界希釈分析により測定されるCTL前駆体頻度に対する HLA 領域に対応するペプチドの効果正常ドナー（HLA-A3; B-7，38; Cw4; DR4,6）由来のPBLを10〜100μg/mlペプチドの存在下でJY（HLA-A2; B7; DR4,6）またはHOM2（HLA-A3; B27）とともに培養した。６日後、溶解をHLA-A2.1またはHLA-B2705のいずれかを発現する⁵¹Cr標識CIR細胞で試験した。結果をHLA-A2特異的溶解について示すが、同様な結果がH LA-B27特異的溶解について得られた。効果は対立遺伝子特異的ではなかった。というのは多数の異なるHLA分子に特異的なCTLの分化が阻害されたからである。いずれのペプチドもクラスII拘束性応答（混合リンパ球応答およびマイトジェン誘導性増殖を含む）に影響しなかった。正常ドナー由来のPBLを、10%ウシ胎児血清およびL-グルタミンを補充したRPMI -1640中、丸底マイクロタイターウェル当たり５×10⁵細胞で培養した。培養物に５×10³の照射（10,000 R）EBVトランスフォームＢリンパ芽球または10μg/mlフィトヘマグルチニンＰ（phytahemagglutinin P）（PHA-P）のいずれかを補充した。細胞をPHA-Pについては37℃で３日間、そしてアロ抗原については５日間インキュベートし、この時点で³Hチミジンを添加した（２μCi/ウエル）。16時間後にウェルを回収し、そして³Hチミジン取り込みをシンチレーションカウンターにより測定した。実施例14 溶解および分化に対する短縮配列の効果 B2702.60-84ペプチドとB2705.60-84ペプチドとは３アミノ酸だけが異なるので、これらの差異の効果を調査するためにさらにペプチドを調製した。３つのさらなるペプチドを合成した：実施例13に記載の手順に従うと、HLA-B2702/05の残基60〜69に対応するペプチドは、上記のアッセイにおいて効果を有さなかった。HLA-B2702の残基75〜84に対応するペプチドは、すべてのクラスＩ特異的CTL応答をブロックしたが、他方H LA-B2705と同じ領域に対応するペプチドはブロックしなかった。どの残基が阻害効果を媒介したかを決定するために、３つのさらなるペプチドを合成した。この中で残基77、80および81のそれぞれの位置で、単一のアミノ酸変化を導入し、B2702の配列をB2705の配列に変換した。B2702.75-84(D)ペプチドおよびB2702.75-84(L)ペプチドはなおCTLの存在による溶解およびプレCTLの分化をブロックしたが、他方、B2702.75-84(T)ペプチドは阻害活性を有さなかった。従って、80位のイソロイシンが阻害に必要である。以下のアッセイによりB2702.60-84、B38.60-84およびB2702.75-84が、プラスチックに予め結合された場合、細胞を結合させたことも見出された。他のどのペプチドもこの効果を有することが見いだせなかった。しかし、B2702.60-84ペプチドを残基67のシステインを介してウシ血清アルブミンまたはビーズに結合させた場合、ブロッキング効果および細胞をプラスチックに結合させる能力は消失した。プラスチック結合手順は以下のとおりであった：ペプチド（100μg/ml）をPBS に溶解し、そして50μlを丸底マイクロタイターウェルに添加するかまたは５〜1 0μlをペトリディッシュに添加した。37℃で60分間または４℃で一晩の後、溶液を取り除き、そしてプレートを10%ウシ血清アルブミンを補充したRPMI-1640中で２回洗浄した。細胞を添加し、そして４℃で30分間インキュベートした。ペトリディッシュへの結合を、ディッシュを緩やかに撹拌して顕微鏡下で検査することにより測定した。マイクロタイターウェルへの結合は、500 rpm、３分間の遠心分離を行って測定した。結合しなかった細胞はウェルの底に小さなペレットを形成したが、結合した細胞はペレットを形成しなかった。結合は４℃、25℃、または37℃で等しく生じ、そして外因的に添加した２価のカチオンに依存しなかった。というのはEDTAを含有する培地において結合が観察されたからである。しかし、細胞を１% NaN₃とプレインキュベートするかまたはパラホルムアルデヒドで固定した場合には、結合は観察されなかった。このことは生存細胞および恐らくATPの生成が必要であることを示す。実施例15 ペプチドオリゴマーの調製多数のペプチドオリゴマーを、B2702.75-84配列およびその変異体を含んで調製した。ここでこの配列中のイソロイシンをスレオニンに置換した。このオリゴマーは対および配列（84-75/75-84）の「反転ダイマーペプチド（inverted dime r peptide）」、尾部から頭部（tail-to-head）または「後方向（backward）」配列（84-75/84-75）ならびに８つの分枝を有するポリリジンに共有結合されたペプチド（MAP₈02.75-84）を有するダイマーを含んだ。以下の表は種々の配列を示す： MAPは、ペプチドが共有結合されている分枝リジン骨格からなる多抗原性ペプチドである。本発明者らは８つの分枝リジンを用いた。結合アッセイは、アミノ末端で-(CH₂)₁₂-ビオチンと結合したペプチドに基づいた。次いでストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を蛍光活性化細胞分取装置（FACS）における検出に使用した。沈殿もまたビオチン化化合物の使用に基づいているが、ストレプトアビジン−アガロースを用いて目的のペプチドが結合したタンパク質を単離した。（この手順は供給者であるPierceの推奨に従った）。カルシウム流入の測定は、Grynkiewiczら、1985，J Biol Chem 260(6):3440 -50に記載される手順に従って実施した。FACSを用いて検出された結合およびタンパク質の沈殿の両方において、結合が非結合ペプチドで阻害され得ることが見出された。実施例16 ラットモデルにおける同種異系移植片防御材料および方法動物成熟雄性で特定の病原体を有さないACI（RT1^a）、PVG（RT1^c）、Brown Norway （BN）（RT1ⁿ）、およびLewis（Lew）（RT1^l）ラット、体重200〜250gをこれらの研究において使用した。動物をBantin and Kingman，Fremont，CA（PVG）またはCharles River，Boston，MA（ACI、BNおよびLew）から購入した。ACIラットを BNまたはLewドナーからの心臓または皮膚の同種異系移植片のレシピエントとして供した。動物をFalk Cardiovascular Research Buildingにおいて研究所の指針に従って標準的な条件下で維持した。ペプチドペプチドを、Protein and Nucleic Acid Facility，Beckman Center，Stanfor d University School of Medicineにおいて、またはMultiple Peptide Systems （San Diego，CA）によりFmoc化学を用いて自動化ペプチド合成機によって合成した。ペプチドを調製用逆相HPLCにより精製し、そして分析用逆相HPLCにより＞ 98%均質であることが示された。アミノ酸組成をアミノ酸分析により確認した。リンパ節増殖アッセイ ACIまたはPVGラット（200g）に生理食塩水中に溶解した２mgのB7.75-84を第０日に静脈内注射した。その後示した日に、３匹の動物の左の後ろ足に同系ドナー由来の５×10⁶の脾臓細胞を注射し、そして右の後ろ足に同種異系Lewドナー由来の５×10⁶の脾臓細胞を注射した（Moellerら、1993．Transplantation，55:650 ）。足注射の７日後に、動物を屠殺し、そして膝窩リンパ節を取り出した。単一細胞懸濁液を調製し、そして細胞数を血球計算板を用いて測定した。 CTL前駆体についての限界希釈アッセイ限界希釈分析を本質的に前記のとおりに行った（Moellerら、1993、前出；Ski nnerおよびMarbrook．1976．J．Exp．Med．143:1562）。簡単に記載すると、脾臓を未処置の動物または少なくとも60日前に同種異系移植片を受けた動物から取り出し、そして次に単一細胞懸濁液に細片化した。応答細胞をウェル当たり1000 〜40,000細胞（１濃度当たり24の複製物）で10%ウシ胎児血清（Hyclone，Logan ，UT）、２mM L-グルタミン、５×10^-5M β-メルカプトエタノール、100 U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、Concanavalin A活性化ラット脾臓細胞由来20%上清、および50μ Mα-メチルマンノシドを補充したRPMI 1640中、丸底マイクロタイターウェル中にプレートした。次いで５×10⁵の照射（2000 rad ）刺激細胞を各々のウェルに添加し、そしてプレートを湿潤CO₂インキュベーター中でインキュベートした。５日後、アリコートを取り出して⁵¹Cr標識Concanav alin A活性化芽細胞の溶解について試験した。上清のアリコートをガンマカウンターで計数し、そしてCTL前駆体頻度を直線回帰により決定した（Skinnerおよび Marbrook．1976、前出）。特異的放出が＞10%であった場合にウェルを陽性であるとした。器官移植血管化した心臓同種異系移植片を異所的にレシピエントラットの腹部に、Ono およびLindsay（OnoおよびLindsey．1969．J．Thorac．Cardiovasc．Surg．57:2 25）の技術を改変して用いて移植した。腹部同種異系移植片を移植片機能を評価するために毎日触診し、そして触診可能な心室収縮が停止したときに拒絶が完了したとみなした。完全厚の皮膚移植片をBillinghamおよびMedawar（1951．J，Exp．Biol．28:38 5）に記載の技術を改変して用いて実施した。ドナーおよびレシピエントの両方の毛を剃り、そしてドナーの皮膚を標準的な２×２cm片に切断し、そして皮下脂肪を外科手術的に除去した。単一のドナーから複数の移植片を得、冷生理食塩水中に保存し、そして同じ日に移植した。ドナー移植片と同じサイズの皮膚片をレシピエントの側腹から取り出し、そして疎性結合組織を筋膜から外科手術的に取り除いた。次いで同種異系移植片を4-0 vicryl縫合糸を用いてレシピエント筋膜に適合させた。１層の粗いガーゼおよび８層の細かいガーゼスポンジをレシピエントの皮膚および移植片の周辺の筋膜に2-0 vicryl縫合糸を用いて縫いつけ、確実にドナー皮膚をレシピエント筋膜に固定し、そして移植片を血管再生させた。手術後６日目に包帯を除去し、そして次に同種異系移植片を毎日、拒絶の証拠について検査した。拒絶は、紅斑、連続的な漿液浸出、潰瘍または移植片壊死により表された。免疫抑制オリーブ油中に溶解したシクロスポリンＡ（CsA，Sandoz Pharmaceuticals Co rporation，Base，Switzerland）を強制飼養チューブを通して所定の用量で経口で与えた。ペプチドを水または生理食塩水中に溶解し、そして示すように静脈内でまたは強制飼養により与えた。統計的解析スチューデントｔ検定を、Graphpad InSat統計プログラムを用いて計算して異なる群における異種移植片生存性を比較した値がｐ＜0.05であった場合に差を有意であるとした。結果インビボでペプチドの単回投与により免疫したラット由来の細胞はインビボまたはインビトロにおいて同種異系チャレンジに対して非応答性である。最初の研究は、A2.75-84ペプチドでもなく、またMHCクラスＩ分子、RT1^a、由来の同じ残基に対応するペプチドでもなく、B7.75-84およびB2702.75-84ペプチドの両方が、インビボでのラット脾臓細胞のアロ特異的CTLへの分化をブロックした（示さず）。それゆえ本発明者らはインビボにおいてペプチドで処置したラットから得た脾臓細胞がエクスビボにおいてCTLに分化し得るかどうかを試験した。予備的実験において、ラット中でのB7.75-84ペプチドの半減期は２〜３時間であると決定した。従って、本発明者らは用量当たり２〜20 mgのペプチド（６〜60 mg/kg）を投与することを選択した。この量は11ペプチド（undecapeptide ）CsAの用量（10〜20 mg/kg）に匹敵する。PVG（RT1^c）またはACI（RT^a）ラットを生理食塩水あるいは２mgのA2.75-84、B7.75-84、B2702.75-84、またはRT1^a. 75-84ペプチドの単回静脈内注射で処置した。処置したラットの脾臓をペプチド処置後の異なる日に取り出し、限界希釈条件下で５日間Lew（RT1^l）刺激細胞とともに培養し、そして⁵¹Cr標識Lew芽細胞の溶解についてアッセイした（表５）。生理食塩水、A2.75-84ペプチド、またはRT1^a.75-84ペプチドのいずれかで処置したPVGラットから単離した脾臓細胞中のLew特異的細胞の前駆体頻度は、脾臓を取り出した日にかかわらず55,000中約１であった。同じ頻度が、摘脾の日または 24時間前にB7.75-84またはB2702.75-84ペプチドのいずれかで処置した動物由来の脾臓において見出された。しかし、B7.75-84またはB2702.75-84ペプチドで摘脾の７〜10日前に処置した動物から得た脾臓細胞は、Lew特異的CTLの前駆体頻度において８〜10倍の減少を示した。ペプチドがインビボにおいてアロ反応性に影響し得るかどうかを評価するために、足への非自己脾臓細胞の注射後の排出リンパ節中の細胞の蓄積に対するペプチドの効果について試験した（Moellerら、1993，前出；TwistおよびBarnes．19 73．Transplantation，15:182; Fanslowら、1990．Science 248:739）。PVGまたはACIラット（１群当たり３匹）に４つ各々のペプチドの２mgまたは生理食塩水の単回静脈注射を与えた。処置の日に、あるいは処置の１、７または10日後に、右の足に５×10⁶の同系脾臓細胞を注射し、そして左の足に５×10⁶の同種異系Le w脾臓細胞を注射した。足の注射の７日後に、排出リンパ節を取り出し、単一細胞懸濁液を調製し、そして細胞数を測定した。同種異系細胞で注射した側から回収された細胞数対同系細胞で注射した側から回収された細胞数の比は、生理食塩水、A2.75-84ペプチド、またはRt1^a.75-84ペプチドで処置した動物において約３：１であった。同様な比が、足への注射の24時間以内にB7.75-84またはB2702.75 -84ペプチドで処置した動物から得られた。しかし、足のチャレンジの７または1 0日前にB7.75-84ペプチドで処置した動物において１：１に下がった。足のチャレンジの７または10日前にB2702.75-84ペプチドで処置した動物における比は約２：１であり、このことはこれがラットのアロ抗原に対するインビボでの応答の抑制において幾分より有効でなかったことを示す。これらのペプチドのいずれもが可溶性タンパク質抗原であるキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）に対する抗体応答を調整し得なかった。KLHでの免疫の前、同時、または後のペプチドの投与は、７または14日後に得た血清において検出された抗KLH抗体の力価を変化させなかった（示さず）。心臓同種異系生存性はB7.75-84ペプチド＋CsAの短期コースの静脈内投与により誘導される。 B7.75-84およびB2702.75-84ペプチドがインビボにおいて細胞性免疫をブロックしたので、本発明者らは同種異系移植片の生存性に対するペプチドの効果を検討した。ACI（RT1^a）レシピエントに、Lewドナー由来の腹部異所性心臓同種異系移植片を与えた（Moellerら、1993，前出；OnoおよびLindsey．1969，前出）。移植片の機能を毎日の腹部の触診によりモニターし、そして触診可能な心室収縮が停止したときに拒絶が完了したと記録した。移植片は治療を受けていないコントロール動物において９〜12日生存した（図８）。同種異系移植片生存性は、移植の２週間前または４日後のいずれかに２〜５用量noB7.75-84で処置したレシピエントにおいて同様（７〜13日）であった（図8aおよび8b）。それゆえ、ペプチド治療とCsAの準治療的（subtherapeutic）レジメとを併用することを選択した。CsAを移植の２日後に単回用量（20 mg/kg）として投与した場合、17匹中16匹の動物が第23日までにその移植片を拒絶した（図8a）。しかし、外科手術の２週間前の10 mgのB7.75-84での４回の処置および外科手術の２日後のCsAの単回用量を受けた７匹の動物中４匹が、それらの移植片無期限に保持した（＞200日）（C sA単独と比較してp ＝ .0023）。移植前第-7日および第-1日に20 mgのB7.75-84 で処置し、そして次に外科手術後の第２日に単回用量のCsAで処置したすべての動物は、第16日までにそれらの移植片を拒絶した。与えたB7.75-84の総用量は２つの群において同じであったので、この結果はペプチド投与のタイミングが重要であることを示す。動物に外科手術後第０〜４日にCsA（10 mg/kg）を毎日与えた別の処置プロトコル（図8b）もまた評価した。これらの移植片の大部分（14/17）は移植後第30 日までに拒絶された。移植前第-7および-1日に20 mgのB7.75-84で処置した動物の50%（4/8）はそれらの移植片を＞200日保持した（CsA単独と比較してp ＝ .08 49）。これは、第２日にCsAの単回用量と併用して同じペプチドレジメを与えた動物がそれらの移植片を第16日までに拒絶したという知見とは対照的である（図 8b）。第-14、-12、-10、および-7日の10 mgのB7.75-84およびそれに続く移植後第０〜４日のCsAでの動物の処置は、23/29の動物の寛容を生じた（CsA単独と比較してｐ＜.0001）。最後に、移植後第０〜４日にB7.75-84ペプチドおよびCsAで同時に処置した7/11の動物は、それらの移植片を＞200日保持した（CsA単独と比較してp ＝ .0090）。まとめると、これらの結果は、準治療的用量のCsAと併用した場合、B7.75-84ペプチドが寛容を誘導し得たことを示す。ペプチド処置は、移植の前または後の期間において投与した場合、有効であった。同種異系生存性に対するCsAおよびペプチドの相乗効果は、ペプチド配列に依存した：移植前の２週間の期間または外科手術後４日間、第０〜４日にCsAと併用したB2702.75-84ペプチドで処置した動物における移植物は、CsA単独で処置した動物における同種異系移植片と同様に拒絶された（図8c）。 B7.75-84ペプチド＋準治療的用量のCsAで処置した動物は、ドナー特異的寛容を示した。 B7.75-84＋CsAの併用で処置した動物の大部分はそれらの移植片を拒絶しなかったが、この動物が寛容でなかった可能性も残っている。処置が一般的な免疫抑制状態を生じ得たか、あるいは移植片が抗原提示機能を消失したかまたはMHCをダウンレギュレートし得た。寛容とこれらの他の可能性を区別するために、少なくとも100日間それらの移植片を保持した動物に、第１の移植片の近傍に第２の腹部心臓同種異系移植片を再移植した。さらなるペプチドまたはCsA処置を与えなかった。Brown Norway（BN）（RT1ⁿ）ドナー由来の心臓同種異種移植片を受けた動物（ｎ＝４）は、第14日までにBN同種異種移植片を拒絶したが、一方もとのドナーと同じ系統由来の第２の心臓移植片を受けた動物（ｎ＝３）は第２の同種異系移植片を無期限に受容した。この寛容の組織特異性を評価するために、それらの心臓移植片を＞100日維持した動物に、完全厚腹部皮膚同種異系移植物を与えた（ｎ＝４）：左側の移植片はBNドナー由来であり、そして右はLewドナー由来であった。再び、さらなるペプチドまたはCsAを投与しなかった。BN皮膚移植片は第11日に拒絶されたが、Lew皮膚移植片拒絶の徴候を示さなかった（＞200日）。興味深いことに、第２の同種異系移植片（心臓または皮膚）の拒絶は、もとの心臓同種異系移植片の機能に影響しなかった。経口投与したB7.75-84ペプチドは特異的不応答性を誘導する。薬物が与えられる経路はしばしばその効力に影響し得る。Carpenterおよびその共同研究者らは、ラットMHCクラスII分子の非ヘリックス領域に対応する合成ペプチドの胸腺内注射が血管化した同種異系移植片の生存性を延長したことを報告した（Sayeghら、1993．Transplant Proc．25:357）。対照的に、Fabreおよび共同研究者らは、完全フロイントアジュバント中で投与した場合、RT1A^a分子の残基57-80に対応する合成ペプチドが寛容原性よりむしろ免疫原性であったことを見出した（Fangmannら、1993．Transplant Proc．25:183）。本発明者らはB7. 75-84ペプチドの経口での投与が同種異系移植片に対して寛容を誘導するかどうかを求めた。ペプチド単独で処置した動物は通常の反応速度でそれらの移植片を拒絶した（図９）。しかし、移植前第-14、-12、-10、および-7日に経口でペプチドを与えた8/12の動物ならびに外科手術後第０〜４日間CsAと併用して第０〜４日処置した9/12の動物はそれらの移植片を＞200日間維持した（図９）（CsA単独と比較して、それぞれp ＝ .005および.0007）。さらに、それらの心臓同種異系移植物を保持していた動物にドナーおよび第３者由来の次の皮膚同種異系移植片を与えた場合、それらは第３者移植片を拒絶したがドナー皮膚移植片を拒絶しなかった。従って、B7.75-84ペプチドの免疫調節効果は、経口投与または静脈内投与のいずれによっても達成し得た。アネルギーがB7.75-84ペプチドにより誘導される寛容に関与する。それによってB7.75-84ペプチドがアロ抗原に対する応答を改変した機構を調査するために、いくつかの免疫学的パラメーターを検討した。蛍光活性化細胞分取装置分析は、ペプチド処置した動物から単離した胸腺または脾臓中のCD4+および CD8+サブセットの細胞の絶対数または百分率は、未処置の動物に対して差がないことを示した。ペプチド処置動物から得た脾臓細胞のマイトジェンまたはアロ抗原誘導性増殖は、コントロールの増殖と同じであった。さらに、寛容性動物由来の脾臓細胞は、未処置の動物におけるアロ応答を直接抑制し得なかった。このことは「サプレッサー」細胞が含まれていなかったことを示す。しかし、ドナー反応性細胞は寛容性動物において示され得た。限界希釈分析を用いて、本発明者らは、未処置のACI動物から得た脾臓細胞におけるLew特異的CTLの前駆体頻度は、３03,611中１であったことを見出した。100日より多くLew心臓同種異系移植片を維持したACIラットから得た脾臓細胞におけるLew特異的CTL前駆体の頻度は、98, 646中１であった。これらの結果は、アネルギー性ドナー反応性細胞がインビボにおいて存在し、そしてこれらの細胞がインビトロで限界希釈培養物に添加した外因性サイトカインによりアネルギーから開放されたことを示唆する（JenkinsおよびMiller．1992．Faseb J．6:2428; Atteisら、1991．J．Exp．Med．175:491 ）。ラットMHCクラスＩ分子について利用可能な唯一の配列はRT1A分子（これはB 7.75-84の10アミノ酸中７つが同一であり、このことはRT1A配列の10残基（RT1A. 75-84（配列番号52））中５つのみ同一であるB2702.75-80ペプチドとは対照的である）であることに留意するべきである。上記の結果から、クラスＩMHC抗原の多型性領域のフラグメントの、種々の目的のために、特にCTL誘導性疾患または移植物のCTL誘導性拒絶を阻害するために、CTL活性の調整における使用を見出すことが明らかである。特に、本発明の組成物は異なるMHC抗原を有するCTLの広範なスペクトラムにわたって使用され得、そして防御効果を提供し得る。さらに、本発明の組成物は、宿主内に存在する他の細胞に比較して、CTLに関して薬剤の効果を濃縮することが所望される場合、分子をCTLに指向させるために使用し得る。あるいは、本発明の組成物を目的の抗原に結合させて、CTLを活性化してCTLにより認識される抗原以外の抗原を有する細胞を溶解させ、そして従ってCTLを誘導して宿主に対して潜在性である抗原を有する細胞を溶解させ得る（新形成における寄生病のように）。本発明の化合物はウイルス性疾患の処置における使用を見出し得る。あるいは、本発明の化合物を使用して、CTLのサブセットを単離する、CTLの特定のサブセットの存在を同定する、自己免疫疾患を阻害するなどのために、本発明のペプチドの一方または他方に特異的に結合するＴ細胞を同定し得る。特定のペプチド化合物の包括的なブロッキング能力は、宿主のスペクトラムにわたるそれらの一般的な使用を可能にし、そして免疫系を全体的に衰弱させることなく、移植レシピエントを防御するための別の手順を提供する。さらに、この処置は時間が限定されており、その結果、防御は免疫抑制レジメが終了した後長く持続する。特定の特異性を有するCTLの精製に対するペプチド化合物の特異的な効果は、ドナー特異的応答の発達をブロックしながら、記憶応答をさせないことを可能にする。本明細書中に引用したすべての出版物および特許出願は、各々の出版物または特許出願が特定して個別に参考として援用されることが示されるのと同様に本明細書中に参考として援用される。上記の発明は、理解を明確さの目的のために例示および実施例により幾分詳細に記載したが、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなく特定の変化または改変がそれらになされることが、本発明の教示の観点から当業者に容易に明らかであることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/74 ＺＮＡ 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/74 ＺＮＡ (72)発明者クレンスキー，アランエム. アメリカ合衆国カリフォルニア 94305, スタンフォード，メイフィールドアベニュー 812 (72)発明者パーヘム，ピーターアメリカ合衆国カリフォルニア 94305, スタンフォード，アルバラードコート 734

Claims

【特許請求の範囲】１．MHC不適合性ドナー宿主由来の移植物の、レシピエント宿主による受容の期間を延長する方法であって、以下の工程：該ドナー宿主に所定のレジメに従って、該移植物の受容の期間を延長するに有効な量で、(1)該レシピエント宿主のクラスＩB75-84 MHC抗原配列由来のアミノ酸配列、その変異配列（ここで天然配列から３つより少ない変異が存在する）、または移植拒絶を阻害することにおいて該レシピエント宿主に対して活性なクラスＩB75-84 MHC抗原配列を有するペプチドを含む化合物；および(2)準治療的用量での免疫抑制剤の組み合わせを投与する、工程；これにより該移植物の受容の期間が、該ペプチドの非存在下での該準治療的用量での免疫抑制剤の投与から生じた期間に比較して延長される、を包含する、方法。２．前記投与する工程が前記移植の第-20日から第+1日の期間内に開始し、そして少なくとも２回別の日に投与する工程を包含する、請求項１に記載の方法。３．前記投与する工程が第-7日から第-14日の期間または第０日に開始する、請求項２に記載の方法。４．前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡである、請求項１に記載の方法。５．前記ペプチドがHLA-B7.75-84の配列を有する、請求項１に記載の方法。６．MHC不適合性ドナー宿主由来の移植物の、レシピエント宿主による受容の期間を延長する方法であって、以下の工程：該ドナー宿主に所定のレジメに従って、該移植物の受容の期間を延長するに有効な量で、(1)HLA B75-84抗原配列由来のアミノ酸配列またはその変異配列（ここで天然配列から３つより少ない変異が存在する）を有するペプチドを含む化合物；および(2)準治療的用量での免疫抑制剤の組み合わせを投与する、工程；これにより該移植物の受容の期間が、該ペプチドの非存在下での該準治療的用量での免疫抑制剤の投与から生じた期間に比較して延長される、を包含する、方法。７．前記化合物が少なくとも２コピーの前記ペプチドを含む、請求項６に記載の方法。８．前記投与する工程が経口である、請求項６に記載の方法。９．前記投与する工程が血管内である、請求項６に記載の工程。１０．前記投与する工程が前記移植の第-20日から第+1日の期間内に開始し、そして少なくとも２回別の日に投与する工程を包含する、請求項６に記載の方法。１１．前記投与する工程が第-7日から第-14日の期間または第０日に開始する、請求項１０に記載の方法。１２．前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡである、請求項６に記載の方法。１３．１〜10コピーの以下のアミノ酸配列、 RESLRNLRGY（配列番号50）、を有するペプチドを含む化合物：ただし、１コピーのみである場合は、該ペプチドは天然のHLA-B7配列以外に結合している。１４．前記化合物が２コピーの前記ペプチド配列を有し、ここで該コピーが直列に任意の方向にある、請求項１３に記載の化合物。１５．２〜10コピーの以下のアミノ酸配列、 RENLRIALRY（配列番号13）を有するペプチドを含む化合物：ただし80位以外で該配列中に２つまでの変異が存在し得る。