JPH03504493A - 細胞性免疫の発生及び操作のための合成ペプチドの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞性免疫の発生及び操作の ための合成ペプチドの使用 序− 技蕎」ピ１ 本分野はクラス■抗原に関する免疫系の操作に関する。

１−え 主要組織適合複合体中にコードされているクラスＩ移植抗原、すなわちマウスに おけるＨ−２Ｄ　、　Ｋ及びＬ並びにヒトにおけるＨＬ＾−＾、Ｂ及びＣには、 免疫系の制御及び機能において中心的役割を演する多形性細胞表面糖蛋白質であ る。これらの分子は、ウィルス感染された又は非−自己標的細胞に対する細胞毒 性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）の攻撃を指令する抗原表示（ａｎｔｉｇｅｎ　ｐｒｅ ｓｅｎｔａｔｉｏｎ＞構造又は「制限要素」として機能する。ＣＴＬは一般に、 特異的自己ＭＨＣクラス■生成物との関連において複数の外来抗原の同時認識（ ｃｏ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）の要求を示す。従って、ＣＴＬ認識はｒＭＨＣ −制限的である」と言われる。

免疫系は哺乳類宿主の健康及び福祉の主たる決定因子である。免疫系の機構の極 度の防備にも拘らず、哺乳類宿主はなお、微生物及びウィルス性病原体による感 染並びに新生物細胞のごとき常軌を逸した細胞の出現の結果として種々の疾患に 対して感受性である。はとんどの場合、哺乳類宿主はほとんどの疾患を克服する ことができるが、しばしば、哺乳類宿主に対する種々の結果を伴うかなりの期間 の衰弱させる病気がもたらされる可能性がある。免疫系について、与えられる保 証は病原体の侵入及び抑制の種々の機構、罹病した細胞の性質、並びに疾患に対 する種々の個体の個有の感受性に関連する。病的な又は病気にかかった宿主細胞 の攻撃及び除去により疾患状態を克服する能力を増強するように免疫系を操作で きる可能性にかなりの関心がよせちれている。

ｌ１文１ Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、　畑（１９８６）　４４　：　９５９−９６８及びＴｏｗ ｎｓｅｌｄ　。

Ｎａｔａｒｅ　（ｆ９８６ン３２４　：　５７５−５７７が示唆するところによ れば、ある種のウィルス特異的ＣＴＬが、自己−クラス■と関連してウィルス由 来のプロセシングされたペプチドを認識する。

Ｋｏａｒｉ　１ｓｋｙら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｐ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳ＾ （１９８７）　８４　：　３４００−３４０４は同種特異的（ａｌｌｏｓｐｅｃ ｉｆｉｃ）　Ｔ−細胞とａｌｌｏ−ＭＨＣ分子との間の相互作用の研究を報告し ている。最近の研究にはＭａｒｙａｎｓｋｙら、　Ｊ、Ｉｍ＋ｍｕｎｏ１．　（ １９８Ｂ）　１３６　：　４３４０−４３４７、及びＭａｒｙａｎｓｋｙら、　 Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）　３２４：　５７８　５７９が含まれる。

Ｃ１ａｙｂｅｒｇｅｒら、　Ｎａｔａｒｅ　（１９８７）　３３　：　７８３− ７８５は細胞溶解に対するＡ２ペプチドの効果を記載している。

及■αＡ！ 外来クラスＩ抗原の多形性領域のへソックスの少なくとも１個を含んで成るペプ チドを与えることにより外来抗原に対する宿主の免疫応答を調節するための方法 及び組成物が提供される。この組成物は、外来ＭＨＣ又は他の抗原に関して免疫 応答を増強するため、又は宿主を外来Ｍ　ＨＣに対して寛容にするために用いる ことができる。

几木脛欠１１＠区１ クラス■制限因子に関して免疫系を調節するための方法及び組成物が提供される 。注目のエピトープを提供する生来のＭＨＣに結合するペプチドを用いることが できる。生来のＭＨＣをペプチドに結合することにより、注目の抗原に対する免 疫応答の又は特定のエピトープへの寛容の増強を得ることができる。

対象となるペプチドは、主として疎水性であり、そして指定された宿主のクラス Ｉ主要組織適合抗原（ＭＨＣ）のβ−プリーツを有するシートに結合する少なく とも部分的に非一連続の配列を有することにより特徴付けられる。この配列は、 指定されたクラス■抗原それ自体のα−へソックスのβ−シート結合配列と同一 であるか又は実質的に類似していることができる。結合配列間の介在するアミノ 酸は指示されたクラスＩｖＬ、ｌ）Ｋ以外のクラスＩ抗原のα−へソックスの配 列又は同じ配列であることができる。異る場合、この配列は注目の抗原に対して Ｔ−細胞を刺激し又は寛容化するように選択されるであろう。

組成物は、α−ヘリツクスコンホーメーション中に自然に存在するか又はクラス （ＭＨＣのクレット（ｃｌｅｆｔ）のβ−シートへの結合によりこのようなコン ホーメーションに誘導され得る１０個以上のアミノ酸の配列を有することにより 特徴付けられる。この配列はさらに、アミノ酸２〜３個離れて存在する疎水性残 基を有することにより特徴付けられ、ここで、この疎水性残基は保存されており 　（すなわち、同じアミノ酸であるか又は保存的置換により置換されている）、 この配列はアグレトープ（ａｇｒｅｔｏｐｅ）と称される。保存的置換とは、置 換されたアミノ酸が３個以下の（通常２個以下の炭素又は他のへテロ原子、特に カルコゲン）原子により異り、そして極性に有意な差異が存在しない（すなわち 、荷電したアミノ酸及び高度に極性のアミノ酸、例えばアスパラギン又はグルタ ミンは一般に使用されないであろう）、ことが意図される。

アミノ酸は、非極性及び極性の２つのグループに分けることができ、そしてさら に低極性及び高極性に分けることができ、ここで低極性アミノ酸は非極性アミノ 酸のために容易に置換され得る。非極性脂肪族アミノ酸はＧ、Ａ、、Ｐ、Ｖ、Ｌ 。

■であり；非極性芳香族アミノ酸はＦ、Ｗ、Ｙであり；低極性アミノ酸はＨ、Ｃ 、Ｍ　、　Ｓ　、　Ｔであり；そして高極性アミノ酸はり、Ｅ、に、Ｒ，Ｎ、Ｑ である。

β−シートと会合しそして結合するアミノ酸配列は結合ドメインと称されよう、 結合ドメインは２つの部分、すなわちβ−シートと会合し結合しそしてＭＨＣク レフトの領域を占めるアミノ酸残基（結合配列）及び結合残基間に散在するアミ ノ酸残基（エピトープ）から構成されており、ここで一方のグループのアミノ酸 は種々の程度で相補的領域への他方のグループの扱いに関与するであろう。個々 の散在する残基はエピトープ性残基と称され、これは種々の程度で結合ドメイン のエピトープに関与しそしてそれを定義するであろう。これらの残基は、結合ド メインの機能及び目的に依存して広範に変化するであろう。エピトープ性残基は 、結合ドメインが結合するＭＨＣ抗原のＴ−細胞受容体による認識に関与するで あろう。

はとんどの場合、エピトープは少なくとも１個、通常は２個のしばしば荷電した 親水性残基を含有するであろう。クラス■抗原の関連部分の変更のパターン（こ の変更は親水性配列のために介在する主として疎水性の配列を提供する）を用い て、エピトープの定義に関与するアミノ酸を同定することができる。これらは、 注目の抗原のエピトープ部位に関与するアミノ酸により置換され得る。こうして 、特定のエピトープ部位へのＴ−細胞応答を提供するように新規なペプチドが設 計される。

用いられるペプチドは１０個以上のアミノ酸、通常は約１２個以上のアミノ酸、 好ましくは１４個以上のアミノ酸を有するであろう、それは２００個以上のアミ ノ酸を有することができ、通常約６０個以下のアミノ酸、さらに普通には約３６ 個以下のアミノ酸を有するであろう、結合ドメインは通常１０個以上、通常１４ 個以上のアミノ酸を占め、通常約２０個以下のアミノ酸、より普通には約１８個 以下のアミノ酸であり、これらの内３個以上が結合残基であろう、ペプチドの残 りのアミノ酸は種々の理由で存在することができる。残りのアミノ酸の中で、結 合ドメインに隣接するアミノ酸は、Ｔ−細胞刺激に関与し得る注目の抗原に共通 な第２エビＩ・−ブを提供するアミノ酸であろう。これに代えて又はこれに加え て、追加の配列又は延長された配列がペプチドの安定性、特定の細胞区画へのペ プチドの方向付け、投与の容易さ等を提供するであろう。

はとんどの場合、約６０個以下のアミノ酸のペプチドが好ましいであろう。なぜ なら、これらは自動合成機を用いて合成することができるからである。しかしな がら、目的とするペプチドをコードするＤＮＡ配列を考案し、該配列を発現ベク ターに挿入することにより約３５個以上のアミノ酸のペプチドを得ることができ る。これらのベクターは今や一般に入手可能であり又は容易に作ることができ、 そして目的とするペプチドの発現及び単離のために適当な宿主に形質転換するこ とができる。

クラス■抗原の天然配列とは異るペプチドを考案するに当って、ヘリックスドメ イン、α−１又はα−２へリックストメインのいずれかにおけるパターンが決定 される。ヘリックスのターンは３アミノ酸より幾分尺きく約３．２〜３．６アミ ノ酸であり、そしてヘリックスの上方部分又は頂部にあると考えられるアミノ酸 、及びヘリックスの下方部分又は底部にあるであろうと考えられるアミノ酸を決 定することができる０種々の程度で、下方のアミノ酸はβ−シートへの非共有結 合に関与し、他方上方のアミノ酸はエピトープの定義及びＴ−細胞受容体への結 合に関与するであろう。エピトープ配列は主として親水性配列であり、他方アグ レトープ配列は主として疎水性であろう。

はとんどの場合、（ａ　ｂ　ｂ　ａ　ａ　ｂ　ｂ　ａ　ａ）のパターンが存在し 、ここで「ａ」は親水性アミノ酸を意図しそして「ｂ」は疎水性アミノ酸を意図 する。このパターンは、ターンは正確に３ではないという事実について修正され なければならず、従って余分のアミノ酸について修正するためにアミノ酸配列が 挿入されなければならないであろう。さらに正確には、アミノ酸はそれらの空間 的相対位置に関してサークル上に示されるべきであり、そして親水性表面を提供 するアミノ酸はＴ−細胞認識に関与する上方アミノ酸と考えることができよう。

配列を変えてエピトープを変化させ、これによってペプチドにより刺激されるＴ −細胞のサブセットを変化させることを望む場合、アグレトープを定義するアミ ノ酸を保持しそして残りのアミノ酸を注目のエピトープに関連付けることができ る。注目のエピトープの形態に関与するアミノ酸を定義するためにクラス■配列 と同様にしてアミノ酸配列が処理されよう、エピトープのためのアミノ酸の定義 において、通常、使用される配列は注目のエピトープとしての抗原のＴ−細胞刺 激配列であろう。

抗原のＴ−細胞刺激配列は、刺激されるべきＴ−細胞のハブロ！イブにより制限 されるものであろう。空間的に関連しておりそしてＴ−細胞レセプターが結合す るかもしれない表面を提供するアミノ酸を定義するために配列のサークルマツプ が使用されよう。

各ハブロタイブについて証明されなければならないことであるが、疎水性配列は 多数の異るクラス■抗原に共通であろう、すなわち、宿主のハブロタイブのへワ ックスの結合配列に類似するか又はそれと同一の結合配列が通常は選択されるで あろう。あるいは、宿主細胞のハブロタイブのα−へワックスの特定の配列が使 用されるであろう。宿主は一般に各クラス■抗原についてヘテロ接合的であろう から、促進のために１つのハブロイドにより制限されたＴ−細胞の唯一のサブセ ットを選択し、又は異るハブロタイブについて２以上のα−へワックスを有する ことができよう。幾つかの場合には、宿主のクラス■α−へワックスと外来抗原 配列のα−へワックスとの間のより大きな又はより小さな相同性のため１つのへ ワックスが他のものに対して選択され得るであろう。

方法を次の例により説明する。使用されるクラスＩ抗原はＨ−２Ｌｄであり、他 方注目のエピトープはインフルエンザウィルスのエピトープである。下記のもの がＨ−２ＬｄクラスＩ抗原のα−１ドメインの配列である。

旦ＲＩＴ（ＩＩ＾鼾Ｇ　　ＱＥＩＩＦ雄ＶＮ［、±　ＴＩ、ＬＧＹＹここで、下 線を付した文字はエピトープと関連すると考えられるものである。

注目のエピトープの例はインフルエンザウィルスの配列であろう。

ＩＡＳＮＥＮ　　ＭＤＡＭＥＳＳＴＬ　　Ｅ■　ΔＳＮＥ　　ＮＭＤＡＭＥＳＳ Ｔ　　ＬＥＩＡＳＮ　　ＥＮＭＤＡＭＥＳＳ　　ＴＬＥ■　＾Ｓ　　ＮＥＮＭＤ Ａ１４ＥＳ　　５ＴＬＥ３プラス端数のアミノ酸が１つのターンに関与する事実 を可能にするために４つの異る方向にエピドーグに関与するアミノ酸を置換する ことにより、クラスＩ抗原のアグレトープとインフルエンザウィルスのエピトー プとを含んで成る４つの異るバイブリドペプチドを調製する。そして４つのバイ ブリドは ＥＲＩＩＡｒＡＥＧＱ　　ＤＡＷＦＳＶＮＬＥ　　ＴＬＬＧＹＹＥＲＩＴＴＩＡ ＮＧＱ　　ＭＤＨＦＥＶＮＬＬ　　ＴＬＬにＹＹＥＲＩＴＱＴ＾ＳＧＱ　　ＮＭ ＷＦＭＶＮＬＴ　　置ＧＹＹＥＲＩＴＱＩＡＡＧＱ　　ＥＮＷＦＡＶＮＬＳ　　 ＴＬＥＧＹＹ同種宿主の細胞及び該同種宿主の細胞により制限されるＴ−細胞と の組合わせにおいてバイブリドを用いることにより、バイブリドペプチドにより 示されるエピトープを認識するＴ−細胞のサブセットが刺激されるであろう。刺 激されたＴ−細胞サブセットの少なくとも１つはインフルエンザウィルスに感染 された細胞に対して活性であろう。

ペプチドは単一の変更された配列に限定する必要はなく、この様な１つづき配列 を、直接に又はリンカ−配列もしくはスペーサー配列、通常は約３０個のアミノ 酸を越えない短い配列、に連結することができる。ウィルス又は他の微生物につ いて、Ｔ−細胞に対して示される多数の配列に遭遇するであろう。これらの配列 のエピトープのそれぞれはクラスｆα−へワックス配列のエピトープと置き換え 得るであろう。

本発明のべ１チドは自己免疫の場合に使用することができる。自己免疫は、宿主 が免疫応答を示す抗原（病原抗原）と生来の表面抗原、例えば移植抗原との間の 交叉反応性と関連する。すべてではないにしてもほとんどの場合、病原抗原のエ ピトープは生来の抗原のエピトープとは同一ではないであろう。生来の抗原のエ ピトープに対してよりも病原抗原に対してより類似するエピトープをもたらすよ うにクラスＩ配列を変更することにより、このペプチドをクワチンとして使用す ることができる。病原抗原により効果的な応答を与えるために免疫応答を刺激し て、病原抗原よりも生来の抗原により少なく刺激される刺激されなＴ−：ｓ胞を もならすことができる。

応答の変化が、生来の抗原と外来抗原との間の交叉反応性のため、それに対して 宿主が感受性である免疫応答がら宿主を保護するために役立つであろう６ 免疫応答を刺激することを望む多くの状況が存在する。これらの状況には細菌や ウィルスのごとき微生物による侵入の結果として種々の病気が含まれる。細胞性 微生物にはマイコプラズマ、ＤＮＡウィルス又はＲＮＡウィルスを含むウィルス 、例えばレトロウィルス、ラインウィルス、ピコルナウィルス、ＦｅＬＶ、イン フルエンザウィルス、ビスナウィルス、パラミキソウイルス、オルトミクンウイ ルス、肝炎ウィルス、バボバウイルス、レオウィルス、バルボウイルス、ヘルペ スウィルス、ラブドウィルス等が含まれる。

種々の目的のため、クラスＩ抗原の結合ドメインを追加のペプチド配列、特に、 通常外来性の免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｏ＋１ｎａｎｔ）配列に結合させるこ とができる。特に、クラス■結合ドメインは、宿主のクラスＩハブロタイブによ り制限される１又は複数の免疫優性配列に結合させることができる。これは、ク ラスＩ抗原への外来ドメインの結合を非常に増張してより強い免疫応答を提供す る効果を有するであろう。さらに、外来抗原及び結合ドメインのエピトープが同 じものと関連すれば、Ｔ−細胞の２つの異るサブセットが刺激されるであろう。

従って、エピトープのいずれかが感染後に示されればあらかじめ刺激されたＴ− 細胞の増強された集団が存在するであろう。

クラスＩ抗原により示される外来抗原のドメインは特定の存在、例えばウィルス もしくは他の病原体について知ることができ、又は容易に決定することができよ う。これらのドメインはクラス■α−へワックスについて前に記載した制約に適 合するであろう。すなわち、ヘリ力ルコンホーメーションに基き、疎水性面及び 親水性面が存在するであろう。さらに、クラスＩＶｃ原のへワックスの疎水性表 面と外来抗原のドメインの疎水性表面との間に幾らかの保存が存在するであろう 。

ともかく、配列が知られていない場合、Ｔ−細胞応答について試験されるべき抗 原配列間に比較的小数の部分配列候補が存在するであろう。

免疫優性配列の候補の選択を単純化するなめに種々の技法を用いることができる 。免疫優性配列とは注目のクラスＩ抗原ハブロタイブに結合する抗原の配列を意 味する。例えば、Ｎ−Ｃ又は（、−Ｎいずれかの方向で第１のアミノ酸がグリシ ン又は荷電したものであり、次の２個のアミノ酸が非荷電の通常は非−又は低− 極性でありそして次の２個のアミノ酸の内の一方が極性である配列を要求するＲ ｏｔｈｂａｒｄアルゴリズムが存在する。このアルゴリズムを含む配列は免疫優 性配列の候補のようである。さらに、同じハブロタイブにより制限される抗原の 免疫優性配列が知られておれば、これらの配列を結合残基及びそれらの間隔に関 する相同性について注目の抗原と比較して免疫優性配列の選択をさらに単純化す ることができよう。

結合ドメインと追加のペプチド配列とは直接連結される必要はなく、配列を分け る約３０個以下のアミノ酸により架橋されていてもよい、アミノ酸の具体的な数 は臨界的ではなく、通常は便宜上の問題であろう。１個より多くの外来配列が関 与する場合１．これらの外来配列は同じ存在、例えば同じウィルスの抗原、又は 異る存在、例えば異るウィルスの抗原と関連することができる。通常、約１０個 未満の異る配列が存在し、そして通常は同じ配列は反復されない。但し反復した 同じ配列に関心が持たれる場合もある。

あるいは、特定の主要組換適合性複合抗原（ＭＨＣ）に対して宿主を寛容化する ことを望む場合がある。この状況においては、移植された器官のＭ　ＨＣのα− へワックスの一方又は両方に同じ配列が用いられるであろう。α−へワックスの 一方又は両方を含んで成るペプチドの高レベルの注射を行うことにより、新規な ＭＨＣに対して宿主を寛容化し、そうして免疫応答を低下せしめることができよ う。

本発明の組成物はまた、特定の病原体に応答しないＭＨＣ対立遺伝子を有する宿 主に使用することができる。特定の病原体と交叉反応するエピトープと共に結合 ドメインを用いることにより、抗原による感染後の宿主の応答を増強することが できよう。

本発明の組成物はまた、宿主の正常細胞上にまれに又は非常に低濃度で存在する 表面蛋白質を新生物細胞が生産している新生物病の場合に使用することができる 。生来のＭＨＣに関して天然蛋白寅を認識し、そして生来の新生物細胞を効果的 に殺すであろうＴ−細胞集団を発達させることができよう。

本発明の組成物は該組成物の目的及び機能に依存して単一ペプチドとして又は複 数のペプチドの混合物として投与することができる。組成物が単一の結合ドメイ ンにより処理され得る集団の特定のセグメントに向けられる場合、単一化合物で 十分である。例えば、実質的に万能な結合ドメイン又は少なくとも、大部分の集 団のクラスＩ　　ＭＨＣに結合し得る結合ドメインは、特定の病原体に交叉反応 性の抗原エビ１−一プに結合して病原体に対するＴ−細胞免疫応答を得るのに十 分である。

注目の主たる宿主はヒトであるが、本発明に任意のを椎動物、特に家畜、ベット 、動物園の動物等に使用することができる。各場合に、クラスＩ抗原の異る結合 配列が決定されそして使用されるであろう。

製剤は、該製剤が投与される方法、ペプチドの具体的な性質、ペプチドの意図さ れる寿命等により影響されるであろう６製剤には、凍結乾燥粉末、水性もしくは アルコール性媒体、例えば食塩水又はリン酸緩衝液中の分散体、リボゾーム、エ ーロゾル等が含まれる。投与される濃度及び量は、具体的な条件、投与方法、及 び宿主の応答により広範に異るであろう。

通常、約０．０１μｇ／ｋｇ宿主、さらに通常は約０．０５μｇ／ｋｇ宿主が用 いられ、そして約１０μｇ／ｋｇ宿主、さらに普通には約５μｇ／ｋｇ宿主が用 いられるであろう。濃度は一般に約１０μｇ／ｍ１〜ＩＢ／ｍＺであろう。使用 量は宿主の大きさにより変り、宿主が小さくなるに従って上方の範囲が使用され るであろう。

投与の方法は、皮下投与、筋肉的投与、膓空内投与、筋肉投与、吸入、経口投与 等であることができる。１又は複数の投与が行われ、そしてワクチンとして使用 される場合、特に少なくとも２週間の間隔でそして１年に２回までの間隔で投与 される。但し、特に必要な場合にはランダムな反復投与を行うこともできる。

次に、例により本発明を説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるもの ではない。

礼且ｌ囚亙糞 ＣＴＬの生成 Ａ１４９抗原並びにＡ２１６及びＡ１６６抗原を発現する１５９１細胞ＣＬｉｎ ５ｋら、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、（１９８６）　１６４　：　７９４−８１ ３）　１０’個のｉ、ｐ、注射によりＣ３Ｈマウスを免疫した。４週間後に肺臓 を採取し、そして完全培地（１０％のＦＣＳ及び１０−’Ｍ２−メルカプトエタ ノールを含有するＲＰＭＩ）中でマイＩ、マイシン。処理１５９１腫瘍細胞を使 用することにより１５９１−腫瘍特異的ＣＴＬの二次培養物を確立した。１週間 の増殖の後、エフェクター集団を、Ｈ−２Ｌ’又はＨ−２Ｌ”’のいずれかでト ランフフェクトされたし一細胞刺激細胞に移して、特異的ＣＴＬ集団について濃 縮した。ＣＴＬ培地（１５％のラットＣｏｎ＾上清を含む完全培地）中６１−８ ５　Ｈ−２Ｌペプチド（１０μｇ　／ｍｆ）の存在下でＬ−細胞刺激細胞又はＬ −細胞と共に保持する。

ｉ　、　的クローン　ＣＴＬ 同種特異的ＣＴＬクローンＬ３がＣ５７ＢＬ／６抗−ＤＢ＾／２混合リンパ球培 養物（ＭＬＣ）、Ｇｌａｓｅｂｒｏｏｋ及びＰｉｔｃｈ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１ ９７９）２７８　：　１７１−１７３、から誘導された（Ｄｒ、　Ｏ，Ｋａｎａ ｇａｕ＋ａ、　５ｃｒｉｐｐｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ ＾から入手した）。同様特異的ＣＴＬクローンＬ９．４、Ｌｉ３．ｂ４及びり、 １３．Ｄ、８はすでに記載されており（Ｌｉｎｓｋら、前掲）そしてＤｒ、　Ｊ 、　Ｆｏｒｍａｎ、テキサス大学、Ｈｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｅｎｔ 、ｅｒ、　Ｄａｌｌａｓ、　Ｔｘから入手した。Ｌ９．４は（Ｃ３Ｈｘｄｍ２） Ｆ　＋抗−ＢＡＬＢ／ｃ培養物に由来し、他方Ｌ１３．４及びＬｉ３．Ｄ８はＣ ＢＡ抗−＾、＾Ｌ培養物に由来した。すべてのクローンがＨ−２Ｌ’と反応性で あることが示されており、そして刺激細胞としてマイトマイシン処理ＢＡＬＢ／ ｃ牌細胞を含むＣＴＬ培地中に維持される。

標的セルライン及び動物 ネズミ腫瘍セルラインＰ８１５（Ｈ−２ｄ）、ＥＬ４（ト２）ｂ及びＣ３ＨＬｔ ｋ−細胞（Ｈ−２Ｋ）を標的細胞として使用した。Ｋ２ａ−７及びＨ２３−１２ ，１はそれぞれＨ−２Ｌ’又はＨ−２Ｌ”’のし一細胞怒染体である。下記のマ ウスはＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＨＥ ）から入手可能である：　Ｃ３Ｈ／　ＨｅＪ　（ＫｋＤ’　）、ＢＡＬＢ／　ｃ Ｊ（ＫｄＤｄＬ’）、ＢＡＬＢ／ｃ　Ｈ−２”２（Ｋ’Ｄｄ）、ＢＯＢ／　Ｂｎ Ｊ（Ｋ９Ｄ９）、Ａ、ＣＡ／　５ｎＪ（Ｋ’Ｄ’）、ＲＩ［Ｉ　Ｓ／Ｊ（ＫｒＤ ｒ）、＾ＳＬ’　５ｎＪ（Ｋ”ＤＳ）。Ｂ１０．ＲＫＲ，１（ＫにＤｒ）及びＢ ＩＯ，＾５Ｒ２（ＫｋＤＳ）マウスはＤｒ、　Ｃｈｅｌｌａ　Ｖａｖｉｄ、　Ｍ ａｙｏ　Ｃｌ１ｎｉｃ、　Ｒｏｃｈｅｒｔｅｒ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入取 した。牌細胞は４８時間コンカナバリンＡ誘導し、そして標的として使用された 。ハムスターセルラインｔｋ−ｔｓ　１３（＾ＴＣＣＣＲＬ　１６３２）及びヒ トβ−リンパ芽球ライン旧Ｌ　２Ｃ１３（Ｌｅｖｙら、Ｃａｎｃａ　（１９６８ ）　２２　：　５１７−５２４ら標的として使用した。

ヘブｌ」シケ金滅エ アブライド・バイオシステムス・モデル４３０Ａ自動ペプチド合成機によりペプ チドを合成し、そして弗化水素を用いて樹脂から開裂せしめそして脱保護した（ Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａｒ　Ｌａｂ　Ｉｎｃ、。

Ｂｅｌｍｏｎｔ、　ＣＡ、及び＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｔｎｃ 、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ。

ＣＡ）。これらを、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０上で１０％酢酸を用いてクロマ トグラフィー処理し、次に凍結乾燥した。次に、ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより 室温にてＢｒｏｗｎｌｅｅ　２０ミクロン、３００人、２５×１、　ｃｍ　Ａｑ ｕａｐｈｏｒｏｃｔｙｌ　Ｐｒｅｐ−１０カートリツジカラム上で０．１％トリ フルオロ酢酸−アセトニトリルグラジェントを用いて精製した。ペプチドを３０ ％プロパツール中に２ｍｇ／ｎｌ！の濃度で再懸濁しそしてさらにアッセイ媒体 により適当な濃度に稀釈”Ｃｒ標識された標的細胞をペプチドの適当なアリコー トと共に９６ウエル・マイクロタイタープレートに移し、そしてＣＴＬ培地によ り全容１００μｌとした。室温にて３０分間のインキュベーションの後、細胞を ３回洗浄し、そして１００μｌのＣＴＬ培地に再懸濁した。種々のエフェクタ一 対標的比においてＣＴＬを４時間アッセイで試験した。放出された”Ｃｒの比％ を次の様にして決定した：　（ＥＲ−ＳＲ）／（ＦＲ−ＳＲ）ｘｌＯＯ；ここで ＥＲは実験的ＣＴＬ介在放出の平均であり、ＳＲは自律放出の平均であり；そし てＦＲは５０μｌの１％ＮＰ−４０を含有する１５０μ！のＲＰＭＩ中で溶解さ れた標的細胞からの全放出の平均である。

周−及 り力、ｌグ１ぶＪコ聾ケ生滅。

１５９１は、正常ト２に全酸物に加えてＣ３Ｈ組織上に通常見出されない幾つか の新規なりラス■エピトープを発現する、ＵＶで誘導されたＣＢＨ線維肉腫であ る（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳΔ（１９８５）　８２　： 　５１４０−５１４４　〕、すでに、１５９１ゲノムからの３個の新規なりラス Ｉ遺伝子がクローニングされており、そしてそれらの生成物はこれらのエピトー プの発現の要因であり、そして幾つかのＣＴＬクローン並びにウィルス特異的及 び同種反応性ＣＴＬ培養物によるこれらの生成物の認識が試験されている〔１． １ｎｓｋら、前掲；５ｔｒａｕｓｓ　　ら、　　Ｊ、　　Ｉｍｎ＋ｕｎｏｇｅｎ ｉｃｓ　　（１９８６）　　１．３：　　１０１−１１１）　　。

Ａ１４９と称する新規な遺伝子の１つはＢＡＬＢ／ｃ由来のＦｌ　−２［、’に 高度に相同性であり、そしてＨ−２し反応性ＣＴＬクローンのセブセットにより 認識される別個の生成物をコードする。

この遺伝子の生成物はＨ−２Ｌ”９と称される。Ｈ−２Ｌ＋４”分子はα１ドメ インにおいてＨ−２Ｌ’抗原と同一であり、そしてα２ドメインにおいて６個の アミノ酸置換によってのみ異る。機能的には、この生成物は、２つのト２　Ｌ　 ｄ−反応性ｍＡｂとの反応性の欠如により及び幾つかの他のＨ−２Ｌ’−特異的 ＣＴＬクローンのための標的として役立つ能力がないことによりＨ−２Ｌｄから 区別される。

この領域におけるＨ−２Ｌ’と［４Ｌ１４９との間の同一性を利用して、ト２Ｌ ’のα１ドメインに対して特異的なＨ−２Ｌ反応性ＣＴＬの個別のセットを生じ させた。要約すれば、１５９１で免疫したＣ３Ｈマウスからの牌細胞を、Ｈ−２ Ｌ”’を発現するマイトマイシンＣ処理された１５９１腫瘍細胞の存在下でイン ビトロ培養しな。１週間のインビトロ増殖の後、培養物を、Ｈ−２Ｌｄを発現す るＣ３Ｈ−Ｌ細胞トランスフェクタントにより刺激した。

ＣＴＬはインターロイキン−２含有培地の存在下で増殖するために特異的抗原刺 激を必要とするので、Ｈ−２１刺激細胞と反応性の細胞のみがこれらの条件下で 増殖することが期待されよう。次に、Ｈ−２Ｌ’　トランスフェクタントによる 抗−１５９１ＣＴＬの刺激が、Ｈ−２ＬＩ４ｓ及びＨ−２Ｌ’の間で共有される 構造的特徴、すなわちα１ドメイン内にコードされているＣＴＬエピトープ、を 優先的に認識するＣＴＬを濃縮する。確かに、こうして生成されたＣＴＬは抗− Ｈ−２１特異的反応性を示し、Ｈ−２Ｌｄ及びＡ１４９　トランスフェクタント の両者を溶解するが同系り一細胞の溶解を示さなかった。

・　　応　ＣＴＬによるＨ−２Ｌペプ　ドの籾：ＣＴＬはＨ−２にハブロタイブ 細胞上に発現されたＨ−２Ｌ’生成物及び１４Ｌ１４９生成物間の交叉反応性に 基いて選択されたので、これらのＣＴＬは両Ｈ−２Ｌ分子に共通の領域がらのペ プチドを認識することができる　（Ｆに示すようにＨ−２に制限要素と関連する ）。Ｈ−２Ｌｄのα１ドメインからのアミノ酸６１−８５に対応するペプチドが 合成された。このペプチドが選択されたのは、これが、他の幾つかの１１−２生 成物の間でも高度に多形性である２つのＨ−２Ｌ分子により共有される領域に由 来するからである。この領域は、クラスＩ抗原のために予想され（Ｎｏｖｏｔｎ ｙ及び＾ｎｆｆｒａｙ、　Ｎｕｄｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８４） 　１２　：　２４３−２５５）　、そして最近ＨＬ＾−２八分子の結晶構造によ って確認された（Ｂｊｏｒｋｍａｎら、　Ｎａｔａｒｅ　（１９８７）　３２９ 　：　５０６−５１２　；　５１２−５１８〕α−ヘリカル領域に対応する。

これらのＣＴＬはＨ−２Ｌｄ由来ペプチドの存在下で同系標的細胞を溶解した。

これらのＣＴＬによるＣ３Ｈ細胞の溶解は６１−８５　Ｈ−２Ｌｄの配列及びコ ンホーメーションに依存するようであった。なぜなら、６ｌ−８５Ｈ−２Ｄ’ペ プチド又はＤ−Ｇｉｎ及びＤ−Ｌｅｕ残基を含有する６１−８５８−２Ｌｄペプ チドの類似体の存在下では殺細胞は観察されなかったからである。さらに、２つ の変更されていないペプチド、すなわちＴ−細胞受容体ペプチド及びクラス■ペ プヂドはこれらのＣＴＬによる細胞溶解を中介することができなかった。Ｈ−２ しではなくＨ−２Ｌ’４１　Ｌ−細胞トランフフェクタント上での増殖について 平行して選択された抗−１５９１ＣＴＬの集団は匹敵する抗−Ｈ−２Ｌ特異的反 応性を示し、Ｈ−２Ｌｄ及びＡ１４９トランフエクタントの両者を溶解したがＨ −２Ｌｄペプチドとの反応性を示さなかった。従って、Ｈ−２Ｌ’上での増殖に ついての選択は、ペプチド反応性を示すおそらく少％の抗−Ｈ−２Ｌ　ＣＴＬ細 胞を濃縮するために重要であろう。

Ｈ−２Ｌベブ　ドの＝：がＭＨＣｌ　されるＨ−２Ｌ’ペプチド認識がＭＨＣ制 限的であることを示すため、種々のＭＨＣハブロタイブを有する腫瘍細胞及び肺 細胞芽球の大パネルを、ト２Ｌ反応性抗−１５９１ＣＴＬにこのペプチドを与え る能力について試験した。Ｈ−２レペプチドの非存在下では、Ｈ−２’ハブロタ イブ細胞（ＢＡＬＢ／ｃ　ｎ芽球及びＰ８１５脂満細胞腫細胞）は効果的に溶解 され、他方ｋ　、　ｒ　、　ｓ、又はｆハブロタイブ牌細胞については有意な溶 解は観察されなかった。

これら４種のハブロタイブの内、Ｈ−２にハブロタイブ細胞（Ｃ３Ｈ脛芽球及び Ｌ−細胞）のみがＨ−２Ｌｄペプチドの存在下で溶解した。さらに、■−２９ハ ブロタイブ細胞（ＢＵＢ牌芽球）の有意な溶解がペプチドの非存在下で観察され た。この交叉反応性は、２つの新規な１５９１腫瘍抗原及びＨ−２９クラス１分 子の間で観察され得る強い構造的相同性を反映しているようであるＣ　Ｌｉｎ５ ｋら、前掲、Ｌｉ　Ｉ　１ｅｈｏｊら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ！、＾ｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳ＾（１９８４）８１　：　２４９９−２５０３）。

ハムスター繊維芽細胞系ｔｋ−ｔｓ１３及びヒトリンパ芽球系ＷＩＬ２Ｃ１３の 抗原表示活性も試験した。これらの標的のいずれも抗−１５９１エフエクターに 対してＨ−２レベプチドを表示することができなかった。抗−１５９１エフエク ターがＨ−２にハブロタイブ制限的態様でＨ−２１ｄペプチドを認識することは 明らかである。さらに、これらのＣＴＬハブロタイブ制限はクラス■ＭＨＣ分子 に依存するようである。なぜなら、Ｌ−細胞はクラス■生成物を発現しないこと が知られているからである。

さらに、抗−１５９１ＣＴＬはＨ−２Ｌ’ペプチドの存在下でクラス■陰性Ｈ− ２にハブロタイブ胸腺腫ＲＩＥを溶解することができなかった。

特異的Ｈ−２’クラス■生成物に対するＨ−２にハブロタイブ制限因子を遺伝的 にマツプするため、２つのＨ−２に由来組換同系交配様からの牌芽球の、ペプチ ド反応性ＣＴＬに抗原を表示する能力を試験した。Ｈ−２１ハブロタイブ（ＲＩ ［Ｓ）及びＨ−２ｓハブロタイブ（＾、ＳＷ）のいずれもＨ−２Ｌ反応性抗−１ ５９１ＣＴＬにＨ−２Ｌ’ペプチドを表示することができないようである。従っ て、Ｈ−２に及びＨ−２ｒ又はＨ−２ｇハブロタイブ先祖に由来する組換同系交 配マウスを用いてＨ−２Ｌ’ペプチド制限因子を同定した。Ｂ１０．ＲＫＲ（１ （ｋ［１ｒ）及びＢＩＯ，＾５Ｒ２（ＫｋＤＳ）のいずれら抗−１５９１ＣＴＬ にＨ−２Ｌ’ペプチドを表示することができず、ペプチド反応性ＣＴＬのこの集 団について支配的要素として機能するのがＨ−２０に分子であることが支持され た。

５立　原トしテ（１）Ｈ−２しを至誠すルｒ−１５９１ＣＴＬＨ−２Ｌ’　）− ランスフェクタント上で選択された抗−１５９１ＣＴＬ集団はＣ３ＨＬ−細胞と 関連するＨ−２Ｌｄペプチドを効率的に認識するようであるから、これらのＣＴ ＬがＨ−Ｚにハブロタイブ制限要素の非存在下においてもＨ−２Ｌ’生成物と反 応するか否かを決定することに興味がもたれた。無傷の同種抗原の非存在下でＣ ＴＬ集団と反応するペプチドを選択するため、抗−１５９１ＣＴＬを、トランス フェクトされていないし一細胞の存在下で）Ｉ−２Ｌ’ペプチドと共に８週間増 殖せしめた。次に、これらのエフェクターは無傷のｌｌ−２しを担持する標的を 溶解することができることが示された。これらの細胞はまた、Ｈ−２’ハブロタ イブＰ８１５及びＢＡＬＢ／ｃ芽球標的を効果的に認識した。

さらに、ＢＡＬＢ／ｃ芽球は無傷のＨ−２Ｌ’抗原の発現に完全に依存した。な ぜなら、Ｈ−２Ｌ’生成物を欠（ＢＡＬＢ／　ｃ−Ｈ−２ｄ閣２　（１（ｄ［） ｄ）牌芽球は抗−ペプチドエフェクターにより溶解されず、そしてＨ−２１’ペ プチドを表示することができなかったようであるからである。従って、無傷のＨ −２Ｌ’分子は抗−Ｌ２レエフェクターのための個別の抗原標的として機能し、 あるいはこれらのＣＴＬに内因性Ｈ−２レベブチドを表示する制限要素として機 能する。

Ｌ扶−捧窺蝮旦工りのベブ　ド゛− 前記の結果が示唆するところによれば、Ｈ−２に制限要素と関連するＨ−２Ｌｄ ペプチドは無傷のＨ−２Ｌ’分子により示される抗原決定基を模倣する。この抗 原相同性がＨ−２Ｌ’抗原と反応する他のＣＴＬにより検出されるであろう構造 的保存性を反映することを示すため、Ｈ−２Ｌ’ペプチドを認識するＨ−２Ｌｄ −反応性ＣＴＬクローンのパネルの能力を試験した。試験したクローンの３種Ｌ ３．Ｌ９．４及びＬｉ３．Ｄ、４がＨ−２レベブチドの存在下でＣ３Ｈ−Ｌ−細 胞を溶解した。第四のＨ−２Ｌｄ−反応性クローンＬ１３．Ｄ、８はＣ３ＨＬ− 細胞十Ｈ−２Ｌ’ペプチドとの反応性を示さないようであり、このペプチドは多 くのＨ−２Ｌ反応性ＣＴＬにより認識される重要な抗原決定基であるようである が他のＨ−２Ｌ反応性ＣＴＬは個別の構造を認識するようであることが示された 。２つのＣＴＬ　、　Ｌ３及びＬ９．４はもともとＨ−２１ハブロタイブクラス Ｉ生成物を発現しない標的細胞に対して生じたものであるＣ　Ｌｉｎ５ｋら、前 掲；　Ｇｌａｓｅｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｆｉｔｅｈ、前掲（１９７９）　）から 、上記のことは特に意味がある。さらに、上に試験した抗−１５９１エフエクタ ーによるＨ−２Ｌ’ペプチドの認識の場合のように、ＣＴＬクローンＬ３による ペプチド認識はＨ−２に制限要素により介在され得る。

あわせて、これらの結果は、多くの）ｆ−２Ｌ−反応性ＣＴＬのための認識構造 としてのＨ−２Ｌ’分子のアミノ酸６１−８５の重要性を示している。さらに、 このペプチドを認識するＣＴＬは種々のＨ−２バツクグラウンドに由来し、そし てなおすべてがＨ−２に制限要素を利用することができたから、Ｈ−２０にはこ のペプチドの表示に特に適するであろう。

上記のデーターが示すところによれば、Ｈ−２”制限要素と関連するＨ−２Ｌ’ ペプチドはＨ−２Ｌ’分子により表されるＴ−細胞エピトー１を模倣する。ＨＬ ＾−Ａ２の結晶グラフ分析により証明されるように、種々のクラス１分子の間で 多形性であるヘリックス上のアミノ酸残基の多くがクレット側に向いている。

それにも拘らず、上記のデーターが示すところによれば、多形性残基の少なくと も幾らかはＴ−細胞受容体により直接認識される。α１ヘリツクス由来のペプチ ドは無傷の分子上の同種反応性Ｔ−細胞により見られる抗原構造を再現すること ド抗原を認識したのみならず、同種性ＭＨＣ生成物のみとの反応性も示した。

上記の結果が示すところによれば、ＣＴＬに対して同種性であるように宿主の制 限要素の性質を実際に変えるためにペプチドを使用することができる。さらに、 同種宿主のα−へリックス又は結合ドメインを、病原体、新生物細胞等と交叉反 応性であり得る注目の抗原と連結することにより、ＣＴＬ応答を刺激して宿主を その後の感染又は腫瘍への暴露又はそれに対する攻撃から宿主を保護することが できる。こうして、宿主はホリスティック効果によりよりよく疾患に応答しそし てより迅速に疾患から回復するであろう。

本明細書に記載されるすべての公表及び特許出願は本発明か関与する分子におけ る通常の知識を有するもののレベルを示すものである。すべての公表及び出願は 、個々の公表又は特許出願が特定的に且つ別個的に引用により組み込まれるべき ことが示されているのと同じ程度に引用により本明細書に組み入れられる。

前記の発明は理解を明確にする目的で説明及び例により幾分詳細に記載したが、 ある種の変化及び変更を添付された請求の範囲の範囲内で行うことができること は自明であろう。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１個の結合ドメインを含んで成るペプチドを用いて第一抗原に対 する細胞性宿主の免疫応答を調節する方法において使用するための組成物であっ て、前記結合ドメインが、クラスＩ抗原のヘリックスの１つの結合に関連するア ミノ酸との相同性を有するアミノ酸と、次の内の少なくとも１つ： （１）前記第一抗原のクラスＩ免疫優性配列との相同性を有するエピトープを定 義する点在するアミノ酸；（２）前記１つのヘリックスの点在するアミノ酸と同 一である点在するアミノ酸（ここで、前記ペプチドは前記１つのヘリックスに天 然に連結しているクラスＩ抗原の定常領域を実質上含有しない）；又は （３）前記第一抗原のクラスＩ免疫優性配列に連結された（１）及び（２）のい ずれか又は両者；の非連続配列を含んで成ることを特徴としており、 但し、前記結合ドメインが（２）である場合には該結合ドメインは第二抗原のク ラスＩ免疫優性配列に結合することができ、 前記の方法が、前記ペプチドの有効量を前記細胞性宿主に投与することを含んで 成る； 前記組成物。 ２．前記ペプチドが少なくとも１０個のアミノ酸を有し、そして約６０個より多 くのアミノ酸を有しない、請求項１に記載の方法において使用するための組成物 。 ３．少なくとも１個の結合ドメインを含んで成るペアチドを用いて第一抗原に対 する細胞性宿主の免疫応答を調節する方法において使用するための組成物であっ て、前記結合ドメインが、前記宿主のクラスＩ抗原のヘリックスの１つの結合に 関連するアミノ酸との相同性を有するアミノ酸及び前記宿主により制限される前 記第一抗原のクラスＩ免疫優性配列との相同性を有するエピトープを規定する点 在するアミノ酸を含んで成ることを特徴とし； 前記方法が、前記ペプチドの免疫調節有効量を前記細胞性宿主に投与することを 含んで成る： 前記組成物。 ４．少なくとも１個の結合ドメインを含んで成るペプチドを用いて第一抗原に対 する細胞性宿主の免疫応答を制御する方法において使用するための組成物であっ て、前記結合ドメインが、前記宿主のクラスＩ抗原のヘリックスの１つの結合に 関連するアミノ酸との相同性を有するアミノ酸及び前記第一抗原の又は第二抗原 のクラスＩ免疫優性配列に連結した前記宿主により制限される前記第一抗原のク ラスＩ免疫優性配列との相同性を有するエピトープを規定する点在するアミノ酸 の非連続配列を含んで成ることを特徴とし；前記方法が、前記ペプチドの免疫調 節量を前記細胞性宿主に投与することを含んで成る； 前記組成物。 ５．約１４〜６０アミノ酸のペアチドであって、クラスＩ抗原のヘリックスの１ つの結合と関連するアミノ酸との相同性を有するアミノ酸、及び下記の少なくと も１つ：（１）前記第一抗原のクラスＩ免疫優性配列との相同性を有するエピト ープを規定する点在するアミノ酸；（２）前記１つのヘリックスの点在するアミ ノ酸と同一の点在するアミノ酸（ここで、前記ペプチドは前記１つのヘリックス に天然に連結しているクラスＩ抗原の定常領域を実質的に含有しない）；又は （３）前記第一抗原のクラスＩ免疫優性配列に連結された（１）及び（２）のい ずれか又は両者；但し、前記結合ドメインが（２）である場合、該結合ドメイン は第二抗原のクラスＩ免疫優性配列に結合していてもよい′前記ペプチド。 ６．前記クラスＩ抗原がネズミクラスＩ抗原である、請求項５に記載のペプチド 。 ７．前記結合ドメインが（１）を含んで成る、請求項５に記載のペプチド。 ８．前記結合ドメインが（２）を含んで成る請求項５に記載のペアチド。 ９．前記結合ドメインが前記第一又は第二抗原のクラスＩ免疫優性配列に結合し ている、請求項５に記載のペプチド。 １０．生理的に許容されるキャリヤー中に免疫応答を生じさせるのに十分な量で 請求項５に記載のペプチドを含んで成るワクチン。