KR101088740B1

KR101088740B1 - 샤페로닌 10을 이용한 면역억제 방법

Info

Publication number: KR101088740B1
Application number: KR1020057008096A
Authority: KR
Inventors: 제프리 알. 힐; 타트자나 바노빅; 할레 모튼; 앨리스 크리스티나 카바나그
Original assignee: 씨바이오 리미티드
Priority date: 2002-11-06
Filing date: 2003-11-06
Publication date: 2011-12-01
Also published as: CA2505141C; DK1569679T3; PT1569679E; EP2818179A1; SI1569679T1; EP1569679A1; CN100525832C; ES2351993T3; CA2505141A1; US20100099605A1; WO2004041300A1; ATE489963T1; DE60335202D1; US8067361B2; EP1569679B1; US20120082690A1; JP2006508099A; KR20050086428A; US7618935B2; CY1110972T1

Abstract

본 발명은 이식에서의 cpn10의 용도에 관한 것이며, 보다 상세하게는 이식편대 숙주질환의 치료 및/또는 예방에 관한 것이다. 본 발명은, cpn10을 공여체 및/또는 수용체 동물 또는 상기 공여체에서 유래된 세포, 조직 또는 기관에 투여하는 방법, 보다 상세하게는 공여체 및 수용체 동물 모두를 치료하기에 효과적인 형태로 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한, 이식편대 숙주질환을 방지 또는 완화시키기 위하여 1종 이상의 면역억제성 물질을 공여체 및/또는 수용체에 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이식편대 숙주질환, 이식 샤페로닌 10

Description

샤페로닌 10을 이용한 면역억제 방법 {CHAPERONIN 10 IMMUNOSUPPRESSION}

본 발명은 이식편대 숙주질환(Graft versus host disease; GVHD), 및 그외 이식 관련 면역학적 반응 및 질환의 치료방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 샤페로닌 10을 이용한 이식편대 숙주질환의 예방학적 및 치료학적 방법에 관한 것이다.

이식편대 숙주질환(GVHD)은 면역학적으로 적합한 세포를 개체내로 도입하는 경우, 예컨대 골수 세포 또는 줄기 세포 이식시 발생될 수 있는 증상이다. GVHD는 신규 이식된 세포가 숙주 조직에 대하여 거부 반응을 나타내는 면역학적 과정을 의미한다. GVHD는 골수 조직, 조혈 줄기 세포, 피폭되지 않은 혈액 생성물 및 림프계 조직을 포함하는 고형 기관의 이식 또는 주입(transfusion)후, 발생될 수 있다.

GVHD는 급성형 및 만성형 두 가지로 나뉜다. 급성 GVHD는 이식후 3개월 이내에 발병되며, 피부염, 장염 및 간염과 같은 임상적인 증상을 나타낸다. 만성 GVHD는 통상 이식후 3개월에 발병되며, 피부, 위장관(GI tract) 및 간과 같은 다수의 기관과 조직에 악영향을 미치는, 자가 면역 증후군이다.

공여체 T 세포는 GVHD 발병을 촉발시킨다. 공여체 T 세포는 숙주세포의 항원을 외부인자로 인식하고, 선천성 면역 시스템의 세포들을 차례로 활성화시킬 수 있는 사이토카인을 증식 및 방출시키는 반응을 한다.

동종 골수 이식 또는 조혈세포 이식은, 백혈병, 골수종, 림프종 및 재생불량성 빈혈과 같은 혈액암의 치료에 가장 효과적인 치료법이다. 심각한 급성 GVHD는, 골수 이식시 사망과 이환의 일차적인 원인이 된다. 만성 GVHD는 또한 사망을 초래하며, 생존자의 경우 종종 심한 불구가 되기도 한다.

면역억제 약물은, 급성 및 만성 GVHD의 예방학적 및 치료학적 처리와 처치에 가장 큰 비중을 차지한다. 상기 약물은 이식 전 및 이식 후에 환자에 투여될 수 있다. 현재, GVHD 치료제로는, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 타크롤리무스, 사크롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸 및 스테로이드가 있다. 면역억제 요법으로, 최대 효과를 위해 약물 병용 투여를 종종 채택하기도 한다.

샤페로닌 10(cpnlO)은 세균에서부터 인간에 이르기까지 다양한 생물에 존재하며, 이는 현존하는 가장 진화적으로 안정한 단백질인, 열 충격 단백질 계통 중 하나이다. 샤페로닌 분자는 후-번역 폴딩, 표적화 및 다른 단백질과의 조합에 관여하지만(Hartman etal., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3394-8), 이들은 최종 조합된 구조의 일부분으로는 포함되지 않는다(Ellis etal., 1991, Annu. Rev. Biochem. 60,321-47). 이러한 단백질은 정상적인 세포에서 매우 중요한 작용을 수행하며, 세포의 스트레스 상태(예, 대사 방해, 감염, 염증, 형질전환)에서는 과다 생성된다.

샤페로닌 10은, 놀랍게도 임신 초기 인자(EPF)와 아미노산 서열이 동일한 것으로 확인되었다(Morton etal., International Publication WO 95/15338). EPF는 수정 후 6-24시간내에 모체의 혈청에 출현하는 임신 관련 물질이다(Morton et al., 1974, Nature, 249: 459-460 ; Morton et al., 1976, Proc. R. Soc. Lond., 193:413-9). 이는 임신기간의 초기부터 절반 이상동안 발현되며, 태아의 계속적인 성장 및 생존에 필수적이다(Morton et al., 1987, Current Topics in Developmental Biology 23:73-92). EPF는 다양한 생리적 기능을 수행하며, 이의 생성은 임신기간에 국한되어 있지 않다.

EPF는 면역억제제, 림포구에서의 분비 억제 인자(Rolfe et al., 1988, Clin. Exp. Immunol. 73, 219-225)로 작용할 수 있으며, 면역억제성 항-림프구 혈청의 로제트(rosette)-저해 특성을 증대시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다(Morton et al., 1974 및 1976, supra). EPF는 마우스에서 트리니트로클로로벤젠에 대한 지연성 과민반응을 억제할 수 있으며(Noonan et al., 1979, Nature, 278, 649-51), 마이토젠-유도성 림프구 증식(Athanasas-Platsis, 1993, PhD Thesis, The University of Queensland) 및 CD4+ T 세포의 IFN-γ 생성을 억제할 수 있다.

그러나, EPF 또는 cpn10이, 이식시 특히 GVHD 예방에 있어서, 면역억제제로서 가능성 있음을 입증하는 직접적인 증거는 없는 실정이다. 열 충격 당백질인 샤페로닌 60은 면역억제제로서 작용할 수 있으나, GVHD 에 대한 치료학적 효과는 확인된 바 없다. 실제, 기존의 기술들은 열 충격 단백질이 이식에 불리한 작용을 할 것으로 개시하고 있다(Ogita et al., 2000, Transplantation, 69, 2273-2277).

본 발명자들은 현재 GVHD의 치료학적 처리 및 처치에 사용되는 면역억제제에, 다음과 같은 상당한 문제점들이 있음을 상기하였다:

(i) 극심한 부작용을 야기하며, 예컨대 통제를 위해 추가적인 약물이 필요할 수 있는 고혈압, 40%에 이르는 환자에서 발생되며 약물의 독성을 제한하기 위하여 의사는 부적합한 투여를 빈번히 처방하여야 하는 신독성, 떨림, 두통, 우울, 지각이상, 시야 불선명, 및 발작과 같은 CNS 효과, 세균, 진균 또는 바이러스의 감염 위험성 증가, 암, 특히 피부암에 대한 위험성 증가, 식욕 감소, 구토 및 모발 성장 증가를 야기하며;

(ii) 상당수의 환자들에서 GVHD는 약물에 내성을 나타내며, 병용 약물 요법이 요구되며;

(iii) 약 값이 매우 비싸며; 및

(iv) 상기 약물은 항생제, NSAID, 항-간질제 및 항-진균제와 같은 다른 치료제, 루벨라 및 폴리오와 같은 면역화제, 및 그레이프후르트와 같은 천연식품(사이클로스포린의 경우)과 부정적인 상호작용을 갖는다.

따라서, 현재 사용되고 있는 치료제에 비하여 부작용이 매우 적으며, 시판되는 약물에 내성을 보이는 환자에게서 매우 효과적인, GVHD의 치리 및 처치용 신규 약물의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은, cpn10이 GVHD의 처리 및 처지에 있어서 새로운 치료법으로서의 상당한 임상적 가능성이 있음을 뜻밖에 발견하였다.

본 발명은 넓게는, 이식에서의 cpn10의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이식편대 숙주질환의 치료 또는 예방에 관한 것이다.

본 발명은, 넓게는 공여체 및/또는 수용체 동물 또는 세포, 조직 또는 공여체 유래 기관에 대한 cpn10 투여를 제공하며, 보다 상세하게는 공여체 및 수용체 동물 모두에 대한 치료를 제공한다.

이에, 제 1측면으로, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 GVHD의 치료학적 또는 예방학적 처리 방법을 제공한다:

(i) 약학적 유효량의 샤페로닌 10(cpn10) 또는 cpn10 유도체를 공여체 동물 또는 이로부터 수득된 세포, 기관 또는 조직에 투여하는 단계; 및

(ii) 약학적 유효량의 cpn10 또는 cpn10 유도체를 수용체 동물에 투여하여, 세포, 조직 또는 기관들중 1종 이상을 수용체 동물에 이식할때 수반되는 1종 이상의 이식편대 숙주질환(graft versus host disease: GVHD) 증상을 지연, 완화, 억제 또는 감소시키는 단계.

바람직하기로는, 약학적 유효량의 cpn10 또는 cpn10 유도체는 상기 (ii) 단계 이전 또는 이후에 수용체 동물에 투여한다.

바람직하기로는, 동물에 투여되는 약학적 유효량의 cpn10 또는 cpn10 유도체는 0.1 - 100 mg/kg(체중)이다. 보다 바람직하기로는, 0.1 - 10 mg/kg(체중)이다.

바람직하기로는, 상기 동물은 포유류이다.

바람직하기로는, 상기 동물은 인간이다.

적합하기로는, 상기 세포, 조직 또는 기관은 골수 또는 골수로부터 유래된 것이다.

적합하기로는, 상기 GVHD의 치료학적 또는 예방학적 처리방법은, 상기 공여체 동물 및/또는 상기 수용체 동물에 사이클로스포린, 타크로리무스, 시로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸 및 메톡트레세이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 면역억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

적합하기로는, 상기 GVHD의 치료학적 또는 예방학적 처리는, 상기 공여체 동물 및/또는 상기 수용체 동물에 스테로이드를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

제 2측면에 있어서, 본 발명은 약학적 유효량의 cpn10 또는 cpn10 유도체를 동물에 투여하여, 상기 동물에서 TNFα의 생성을 저해, 억제 또는 감소시키는 단계를 포함하는, 동물에서 TNFα의 생성을 저해, 억제 또는 감소시키는 방법을 제공한다.

바람직하기로는, 상기 동물은 포유류이다.

바람직하기로는, 상기 동물은 인간이다.

상기 측면에 있어서, 본 발명은 또한 약학적 유효량의 cpn10 또는 cpn10 유도체를 동물에서 유래된 세포, 조직 또는 기관에 투여하여, 상기 동물에 의한 TNFα의 생성을 저해하는 단계를 포함하는, 동물에서 유래된 1종 이상의 세포, 조직 또는 기관에 의한 TNFα의 생성을 저해, 억제 또는 감소시키는 방법을 제공한다.

제 3측면에 있어서, 본 발명은 약학적 유효량의 cpn10 또는 cpn10 유도체를 동물에 투여하여, 상기 동물에서 IL-10 생성을 유도, 증대 또는 증가시키는 단계를 포함하는, 동물에서의 IL-10 생성을 유도, 증대 또는 증가시키는 방법을 제공한다.

바람직하기로는, 상기 동물은 포유류이다.

바람직하기로는, 상기 동물은 인간이다.

상기 측면에 있어서, 본 발명은 또한 약학적 유효량의 cpn10 또는 cpn10 유도체를 동물에서 유래된 세포, 조직 또는 기관에 투여하여, 상기 동물에 의한 TNFα의 생성을 저해하는 단계를 포함하는, 동물에서 유래된 1종 이상의 세포, 조직 또는 기관에 의한 TNFα의 생성을 저해, 억제 또는 감소시키는 방법 을 제공한다.

제 4측면에 있어서, 전술한 측면들중 어느 한 측면에 따른 방법에서 사용되는, 약학적 유효량의 cpn10 또는 cpn10 유도체와, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형체를 포함하는, 약학적 조성물을 제공한다.

바람직하기로는, 1종 이상의 그외 다른 면역억제성 물질은, 면역억제성 약물 또는 B 또는 T 림프구나 이들의 활성화를 매개하는 표면 리셉터에 대한 특이 항체이다.

바람직하기로는, 상기 면역억제성 약물은 사이클로스포린, 타크로리무스, 시로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸 및 메톡트레세이트들중 어느 하나이다.

제 5측면에 있어서, 스테로이드를 추가로 포함하는 제4측면의 약학적 조성물을 제공한다.

바람직하기로는, 상기 cpn10 단백질은 도 1에 기재된 아미노산 서열이다(서열번호 1)

본원에서, "포함한다" , "포함한다" 및 "포함하는"는, 독점적이기 보다는 포괄하는 의미로 사용되며, 다른 모든 완전체 또는 완전체 군을 제외하지 않으며, 언급한 완전체 또는 완전체 군을 포함하는 것으로 이해된다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 cpn10이 마우스의 생체내 이식 모델에서 유의적인 면역억제 활성을 나타내며, cpn10 처리시 GVHD 마우스의 생존율이 증가됨을 증명하였다. 이는 cpn10의, 유용한 면역억제 효과와 GVHD 생체내 모델에서 생존율 증가 효과를 최초로 입증한 것이다.

cpn10 처리 효과는, 이식 시 공여체 및 수용체 동물 모두에 cpn10을 처리하였을 때 증가된다. 또한 본 발명은, cpn10이 리포폴리사카라이드-매개성 TNFα의 방출을 저해하고, 마우스 대식세포의 IL-10 생성을 촉진시킴을 개시한다. IL-10은 LPS에 대한 후천적 및 선천적 면역 반응의 강력한 저해자로, 가능성 있는 면역억제성 사이토카인이다.

동종이계의 골수 이식(BMT)에 수반되는 급성 GVHD는, 공여체 T 세포가 이종의 숙주 항원을 인지하고, Th1이 우세한 양상으로 분화하는 T 세포 매개성 질환이다. Th1 사이토카인으로부터 유래된 T 세포는, 리포폴리사카라이드(LPS)에 접촉시, 세포변성 가능한 함량의 염증성 사이토카인(예, TNFα)을 방출하도록 수용체의 단핵구 세포를 촉진한다. LPS는 GVHD와 선행된 방사선 조사에 의해 손상된 위장관 점막을 통하여 누출된다. 따라서, TNFα는 조절되지 않은(dysregulate) 세포독성 사이토카인의 생성과 더불어, 숙주 조직의 세포자살을 유도한다. BMT 모델에서의 GVHD 사망은, T 세포에 의한 면역억제, 특히 IL-2 형성을 저해하는 물질에 의해 방지된다.

본 발명은 골수 이식의 측면에서 예시한다. 그러나, 이러한 발상은 숙주에서 면역 반응을 개시할 수 있는 면역 세포(immuno-competent cell)를 포함한, 그외 다른 세포, 조직 및 기관에 적용가능한 것으로 이해될 것이다. 이러한 세포, 조직 및 기관의 비한정적인 예로는 간, 폐, 심장, 신장, 줄기세포 및 전구세포(progenitor cell)가 있다.

본원에서, 본 발명은 넓게는 모든 동물에 적용가능할 수 있으나, 구체적으로는 포유류이고, 바람직하기로는 인간에 적용가능하다. 예를들면, 본 발명은 가축, 가금, 실험용 동물 및 퍼포먼스 동물(예, 경주마, 낙타)의 이식에 관한 것일 수 있다.

본 발명에서, "분리된"은 본래의 자연적인 상태로부터 벗어나거나, 인간 조작이 수행된 물질을 의미한다. 분리된 물질은 실질적으로 또는 필수적으로, 본래의 자연적인 상태에서 정상적으로 동반하는 성분들이 결핍되어 있거나, 또는 본래의 자연적인 상태에서 정상적으로 동반하는 성분들과 함께 인공적인 상태로 존재하도록 조작될 수 있다. 분리된 물질은 천연형, 화학 합성형 또는 재조합형일 수 있다.

"단백질"은 아미노산 폴리머를 의미한다. 아미노산은 공지된 바와 같이 천연의 또는 비천연의 아미노산 D- 및 L-아미노산일 수 있다.

"펩타이드"는 아미노산을 50개 이하로 갖는 단백질이다.

"폴리펩타이드"는 아미노산을 50개 초과하여 갖는 단백질이다.

용어 "핵산"은, 본원에서, 단일- 또는 이중-가닥의 mRNA, RNA, cRNA, RNAi 및 cDNA와 게놈 DNA를 포함한 DNA를 지칭한다.

"면역억제성 물질"은 자가면역 또는 이식된 동종이계의 또는 이종개체의 세포, 조직 또는 기관에 대한 면역 반응을 예방학적으로 또는 치료학적으로 억제할 수 있거나 이식편대 숙주질환을 억제할 수 있는 물질을 의미한다.

바람직하기로는, 개체에 투여되는 cpn10의 약학적 유효량은 0.1 내지 100 mg이다.

더욱 바람직하기로는, 개체에 투여되는 cpn10의 치료학적 유효량은 0.1 내지 10 mg이다.

전술한 약학적 유효량은 보통 70 kg의 인간에 대해 계산된 것으로, 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 투여량은 개체의 몸무게, 나이, 성별, 전반적인 건강 상태 및 체력과, 그외 적용되는 다른 치료법에 따라 결정될 수 있다. 더욱이, cpn10의 투여 함량은 투여 빈번도 및 시기에 상호 의존적일 것이다.

전술한 cpn10의 약학적 유효량을, 동물 예컨대 가금 및 가축에 투여할 수 있을 것으로 이해될 것이다. 투여량은, 당업자에게 명확하게 이해되는 바와 같이, 동물의 무게 및 종류에 의존적으로 결정된다.

인간 또는 그외 다른 동물에 투여된 cpn10은, 이에 한정되진 않으나 재조합 cpn10(서열번호 1)을 포함하는 분리된 cpn10, 천연의 cpn10, 페길화된(pegylated) cpn10, 재조합 cpn10-GSM 또는 cpn10 단백질의 유도체들 중 어느 한 가지 형태일 수 있다.

당업자는 하기 포유류의 cpn10 서열을 용이하게 참조할 수 있으나, 적합한 cpn10 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 당업계에 알려져 있다:

(i) 인간 cpn10 (NCBI Entrez Accession No. U07550; Chen et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1219,189-190)

(ii) 마우스 cpnlO (NCBI Entrez Accession No. U09659; Dickson et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 26858-864); 및

(iii) 렛 cpnl0 (NCBI Entrez Accession No. X71429; Ryan et al., 1994, FEBS Lett., 337, 152-156).

이식 과정이전에, 공여체 및 수용체 둘다에 cpn10을 처리할 수 있다.

바람직하기로는, 이식전에 상기 공여체에 cpn10을 7일이하의 기간동안 처리한다. 보다 바람직하기로는, 이식전에 상기 공여체에 cpn10을 2 내지 5일간 처리한다.

바람직하기로는, 이식이전 7일이하 및 이식 후 90일 이하의 기간동안, 상기 공여체에 cpn10를 처리한다. 보다 바람직하기로는, 이식전 2 내지 5일간 및 이식후 60일 이하의 기간동안, 상기 수용체에 cpn10을 처리한다. 보다 더 바람직하기로는, 이식전 2 내지 5일 및 이식 후 10 내지 30일간, 수용체에 cpn10을 처리한다.

본원에서, 본 발명의 "유도체" 단백질은 단백질이며, 예컨대 cpn10 단백질은 일예로 당업계에 공지된 바와 같이 다른 화학 모이어티와 접합되거나 또는 복합체를 이루거나, 또는 후-번역 수정 방법에 의하여 변형된 것이며, 융합 파트너 단백질을 포함하는 cpn10 단백질이다.

본 발명의 그외 유도체들은, 이에 한정되진 않으나, 페길화, 측쇄 변이, 무천연성 아미노산 및/또는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 합성시 이들의 유도체 결합, 및 폴리펩타이드, 단편, 및 본원의 다양체에 구조적인 제한을 부과하는 크로스링커의 사용 및 그외 방법의 이용을 포함한다. 본 발명에 포함되는 측쇄 변이의 예들로는, 아미노기의 변이, 즉 아세틱 안하이드리드에 의한 아실레이션; 숙시닉 안하이드리드 및 테트라하이드로프탈릭 안하이드리드를 이용한 아미노기의 아실레이션; 메틸아세티미데이트를 이용한 아미디네이션; 시아네이트를 이용한 아미노기의 카르바모일레이션; 피리독살-5-포스페이트를 이용한 라이신 피리독실레이션및 후속되는 NaBH₄에 의한 환원반응; 알데하이드 반응과 NaBH₄에 의한 후속 환원반응을 이용한 환원성 알킬레이션; 및 2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉산(TNBS)를 이용한 아미노기의 트리니트로벤질레이션을 포함한다.

상기 카르복시 기는 일예에 따라 O-아실리소유레아 형성과 후속되는 유도체화를 통한 카르모디미드 활성화에 의해, 상응하는 아미드로 변이될 수 있다.

아르기닌 잔기의 구아니딘 기는 2,3-부탄디온 페닐글리옥살 및 글리옥살과 같은 시약으로, 헤테로사이클릭 축합(condensation) 산물 형성에 의해 변이될 수 있다.

설피드릴 기는, 예컨대 시스테익산에 과의산 산화, 4-클로로머큐리페닐설포닉산, 4-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 페닐머큐리 클로라이드 및 그외 수은제를 이용한 수은제 유도체의 형성, 그외 티올 화합물가 혼합된 디설파이드 형성, 말레이미드, 말레릭 안하이드라이드 또는 그외 치환된 말레이미드를 이용한 반응; 요드화아세트산 또는 요드화아세트아미드를 이용한 카르복시메틸레이션; 및 염기 pH에서 시아네이트를 이용한 카르바모일레이션과 같은 방법에 의해 변이될 수 있다.

트립토판 잔기는 예켠대, 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 설포닐 할라이드를 이용한 인돌 고리의 알킬화 또는 N-브로모숙시니미드를 이용한 산화에 의해 변이될 수 있다.

타이로신 잔기는 테트라니트로메탄을 이용한 니트로화에 의하여, 3-니트로타이로신 유도체가 형성됨으로써 변이될 수 있다.

히스티딘 잔기의 이미다졸 고리는, 디에틸피로카르보네이드를 이용한 크라베톡실레이션 또는 요드화아세트산 유도체를 이용한 알킬레이션에 의하여 변이될 수 있다.

합성기 결합되는 무천연성 아미노산 및 펩타이드 유도체들의 예로서, 이에 한정되는 것은 아니나, 4-아미노 부티릭산, 6-아미노헥사노익산, 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜타노익산, 4-아미노-3-하이드록시-6-메틸헵타노익산, t-부틸글리신, 노르루신, 노르발린, 페닐글리신, 오르니틴, 사르코신, 2-티에닐 알라닌 및/또는 아미노산의 D-이성질체들의 활용을 포함한다.

유도체는 또한 융합 파트너 및 에피토프 태그(epitope tag)를 포함할 수 있다. 공지의 융합 파트너로는, 이에 한정되진 않으나, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 인간 IgG의 Fc 부위, 말토스 결합 단백질(MBP) 및 헥사히스티딘(HIS₆)이 있으며, 이들은 친화성 크로마토그래피를 통한 융합 단백질 정제에 매우 유용하다. 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 폴리펩타이드의 정제시, 친화성 크로마토그래피에 적절한 기질로는, 각각의 글루타티온-, 아밀로스- 및 니켈- 또는 코발트-접합된 수지가 있다. 이러한 기질의 대부분은 "키트" 형태로 사용가능하며, 예컨대 (HIS₆) 융합 파트너를 이용할 수 있는 QIA 발현 시스템(Qiagen)과 파마시아의 GST 정제 시스템이 있다.

융합 파트너의 특별한 일예로는 GST가 있으며, 이는 Ryan et al.(supra)에 기재되어 있다. 또한 경우에 따라, 융합 파트너는 인자 X_a 또는 트롬빈과 같은 단백질 절단 부위를 포함하며, 이들은 이에 상응하는 프로테아제가 본 발명의 융합 폴리펩타이드를 부분적으로 절단할 수 있도록 하며, 따라서 본원의 재조합 폴리펩타이드는 이들로부터 분리된다. 분리된 폴리펩타이드는 이후 크로마토그래피에 의한 정제 과정에 의하여 융합 파트너로부터 정제된다. 일예로, GST-cpn10의 절단으로, 유도체 GSM-cpn10 단백질이 생성된다.

본 발명에 따른 융합 파트너는 "에피토프 태그" 범주로 포함될 수 있으며, 특이 항체를 이용할 수 있을 정도의 통상 짧은 펩타이드 서열로 이루어진다. 특이 단일클론 항체를 쉽게 이용할 수 있기 위한 에피토프 태그의 공지의 예로는, c-myc, 햄어글루티닌 및 FLAG 태그가 있다.

본 발명의 (단편, 다양체, 유도체 및 상동체를 포함한) CpnlO 단백질은, 화학 합성 및 재조합 발현을 포함한, 당업자에게 공지된 적절한 공정에 의해 제조될 수 있다.

바람직하기로는 cpnlO은 재조합 cpnlO이다.

예를 들면, 재조합 cpnlO 단백질은 하기 단계를 포함하는 공정으로 제조될 수 있다:

(i) cpn10을 코드화하는 핵산을 포함하며, 상기 cpn10은 발현벡터에서 1종 이상의 조절성 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하도록 연결된, 발현 구조체를 제조하는 단계;

(ii) 적합한 숙주 세포를 상기 발현 구조체로 형질감염 또는 형질전환시키는 단계; 및

(iii) 재조합 단백질을 상기 숙주 세포에서 발현시키는 단계.

"발현 벡터" 는 플라스미드와 같이 자가-복제성을 갖는 별도의 염색체 벡터 또는 숙주 게놈내 삽입되는 벡터 중 어느 하나일 수 있다.

"작동가능하도록 연결된"은 상기 조절성 뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 재조합 핵산에 관련있게 위치하여 전사 개시, 조절 또는 통제하는 것을 의미한다.

일반적으로, 조절성 뉴클레오타이드 서열은 발현에 사용되는 숙주 세포에 적합한 것이다. 적합한 발현 벡터 및 적절한 조절 서열의 여러가지 형태는, 다양한 숙주 세포에 대하여 공지되어 있다.

통상적으로, 상기 1종 이상의 조절성 뉴클레오타이드 서열은, 이에 한정되는 것은 아니나, 프로모터 서열, 리더 서열, 신호 서열, 리보소말 결합 부위, 전사 개시 서열, 전사 종결 서열, 번역 개시 서열, 번역 종결 서열, 스플라이스 공여/수용 서열 및 인핸서 또는 활성화 서열을 포함한다.

지속발현 프로모터(Constitutive promoter) 또는 유도성 프로모터는 공지된 것으로써 본 발명에 포함되며, 예컨대 테트라사이클린- 억제성 프로모터 및 메탈로티오닌-유도성 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터들은 자연적으로 존재하는 프로모터 또는 1종 이상의 프로모터 요소와 조합된 하이브리드 프로모터일 수 있다.

바람직한 예로서, 발현 벡터는 선별 마커 유전자를 포함하여, 형질전환된 숙주 세포를 선별할 수 있도록 한다. 선별 마커 유전자는 공지된 것이며, 사용되는 숙주에 따라 다양하다.

발현을 위한 적절한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있으며, 예컨대 E. coli(예, DH5α), 효모세포, 배큘로바이러스 발현 시스템으로 활용가능한 SF9 세포, CHO 세포, COS, CV-1 및 293 세포가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

재조합 cpnlO 단백질은, 일예로, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press, 1989), 원용에 의해 통합됨, 특히 16 및 17장 ; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Eds. Ausubel et al.,(John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), 원용에 의해 통합됨, 특히 제 10 및 16장; 및 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Eds. Coligan et al.,(John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999), 원용에 의해 통합됨, 특히 제 1, 5 및 6장에 개시된 바와 같이, 당업자라면 표준방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다.

pGEX 시스템을 이용한 재조합 합성 cpn10의 생산 및 정제 예로, 국제특허 제 95/15338호가 있다. 활성의 cpn10을 생산하는 것으로 알려진 고수율의 박테리아 발현 시스템(Ryan et al., supra)을 사용하여, 본원에 기재된 실험들에서 사용되는 cpn10(서열번호 1)을 생산하였다.

약학적 조성물

본 발명은 세포, 조직 또는 기관 이식에 의해 야기되는 의학적 증상 또는 질환, 특히 GVHD에 대한 cpn10의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 cpn10 또는 cpn10 유도체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

적절하게는, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.

적절하게는, 상기 약학적 조성물은 cpn10 또는 cpn10 유도체, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및 1종 이상의 그외 다른 면역억제성 물질을 포함한다. 바람직하기로는 상기 그외 다른 면역억제성 물질은 면역억제성 약물 또는 B 림프구, T 림프구 또는 이의 활성화를 매개하는 표면 수용체에 대한 특이 항체이다. 더욱 바람직하기로는, 상기 면역억제성 물질은 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸 및 메토트렉세이트들 중 하나이다. 상기 약학적 조성물은 또한 스테로이드를 포함할 수 있다.

"약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 고형 또는 액상 필러, 희석제 또는 전신 투여에서 안전하게 사용될 수 있는 캡슐성 물질을 의미한다. 투여 경로에 따라, 당업계에 공지된 다양한 담체를 사용할 수 있다. 이러한 담체는 설탕, 전분, 셀룰로스 및 이들의 유도체, 말트, 젤라틴, 탈크, 칼슘 설페이트, 식물성 오일, 합성 오일, 폴리올, 알기닉산, 포스페이트 완충화된 용액, 유화제, 아이소토닉 식염수 및 하이드로클로라이드, 브로마이드 및 설페이트를 포함한 미네랄 산 염과 같은 염, 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트와 같은 유기 산, 및 피로겐-결핍성 물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 개시한 유용한 참고자료로는 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991)가 있으며, 이는 본 발명에 통합된다.

모든 안정한 투여 경로를 통하여, 본 발명의 조성물을 환자에 제공할 수 있다. 일예로, 경구, 직장내, 비경구, 혀 밑으로, 구강으로, 정맥내로, 동맥내로, 근육내로, 진피내, 피하내, 흡입으로, 안구내로, 복막내, 대뇌뇌실내, 피부 등을 통하여실시할 수 있다. 예켠대 면역원성 조성물, 백신 및 DNA 백신의 투여는 근육내 및 피하내 주사가 적합하다.

투여 형태로서, 정제, 분산제, 현탁제, 주사제, 액제, 시럽제, 트로키제, 캡슐제, 좌제, 에어졸제, 경피투과성 패치 등을 포함한다. 투여 형태로는, 또한 이러한 목적에 맞게 특별히 제작한 주입 또는 이식 통제성 방출 기구이거나, 상기 형태에서 추가적으로 작동하도록 변형된 다른 이식 형태를 포함할 수 있다. 예컨대 아크릴 수지, 왁스, 지방족 고급 알콜류, 폴리아세틱 및 폴리글리콜릭 산을 포함하는 소수성 폴리머와, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스와 같은 특정 셀룰로스 유도체로의 코팅에 의해, 치료학적 물질의 통제성 방출을 이룰 수 있다. 또한, 그외 폴리머 기질, 리포좀 및/또는 미소구체에 의해 통제성 방출을 이룰 수 있다.

상기 조성물은 투약 제형에 맞는 방식으로 그리고 약학적으로 효과있는 함량 투여될 수 있다. 본원에서, 환자에 투여되는 투여량은 적당한 시기동안 환자에게 유용한 반응을 미칠 수 있을 정도로 충분하여야 한다. 투여되는 물질의 함량은 환자에 따라 다를수 있으며, 환자의 나이, 성별, 체중 및 표준 건강 상태, 전문가의 판단에 의존적인 인자들을 종합하여, 결정된다.

도 1은 cpn10 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)이다.

도 2는 마우스의 복막내 대식세포의 LPS- 및 동종항원-유도성 염증 반응 및 T세포 분화에 대한 cpn10의 생체내 처리 효과이다.

도 3은 골수 이식 및 이식 후 cpn10을 처리하였을 때의 마우스 생존율을 나타낸 것이다. 이식 후 일정 기간동안(0 내지 21일), 비히클(동계, n=8 및 동종 대조군, n=10) 또는 cpn10(10 및 100 ㎍/동물/일: cpn10 10 ㎍/일 동종이계의, n=10 및 cpn10 100 ㎍/일 동종이계의, n=10) 중 어느 하나를 동물에 피하 주사하였다. B. 마우스 GVHD 임상 수치는 시간에 따라 나타내었다(0-45 days; ** P < 0.01).

도 4는 골수 이식 및 이식 후 cpn10을 처리하였을 때의 마우스 생존율을 나타낸 것이다. 이식 5일 전에 수용체 및 공여체 마우스에 cpn10 (100 ㎍/day) 또는 희석제 대조군을 피하 주사하였다. 동물은 5그룹으로 나누었다: 그룹1:동계 대조 군(n=8)은 동계의 B6D2F1 골수 및 T 세포로 이식된 B6D2F1이고; 그룹2: 동종이계의 대조군(n=10)은 희석제 전처리된 N6 공여체의 세포로 이식된, 희석제 전처리한 B6D2F1 수용체로 구성되며; 그룹3: 동종이계의 전처리된 수용체(n=10), 수용체 B6D2F1 마우스는 이식전에 cpn10으로 처리되었으며, 비히클 전처리된 B6 공여체 세포로 이식되었으며; 그룹4: 수용체 B6D2F1 마우스는 비히클로 전처리되었으며, 단지 cpn10 전-처리된 B6 공여체(동종이계의: 공여체 전처리됨, n=10)로 이식되었으며; 및 그룹 5: B6D2F1 수용체 및 B6 공여체 둘다 이식전에 cpn10으로 전처리되었다(동종이계의: 전처리된 수용체 및 공여체, n=10). (*P < 0. 01 동종이계의 대조군에 비교하여). B. 마우스의 GVHD 임상 수치는 시간에 따라 나타내었다(0-30 일, *** P < 0.001).

방법들

이식

Hill et al., 1997, Blood, 90,3204-3213, 및 Hill et al., 1999, J. Clin. Invest., 104, 459-467에 기재된 표준 방법에 따라, 마우스를 이식하였다. 0일날, 위장 독성의 최소화하기 위하여, B6D2F1 마우스에 1400 cGy의 전신 방사능 조사(TBI, l37Cs source)를 3시간 간격으로 2회 실시하였다. B6 마우스(동종이계의) 또는 B6D2F1 마우스(동계의) 유래의, 골수 세포 5 x 10⁶ 및 나일론 울로 정제한 비장 공여체 T 세포 2 x 10⁶ 를 Leibovitz's L-15 배지 0.25 ㎖에 현탁하고, 방사능 조사한 수여체에 정맥주사하였다.

재조합 cpn10의 제조

XLl-Blue E. coli 세포에, 발현 벡터 pPL550를 이용하여 cpnlO을 형질전환시키고, 37℃에서 증식시켰다. 대수성장기 세포에, 42℃로 4시간 동안 가온하여 단백질 발현을 유도하였다. 세포는 펠렛화한 후, 0.025M TrisHCl pH8.0 30 ㎖에 현탁한 후 -30℃로 보관하였다.

1L 배양액으로부터 수득한 세포 펠렛을 녹이고, 라이소좀(100 ㎍/㎖, 37℃에서 15분)으로 라이시스한 다음, 초음파 분쇄하고(5 x 10 sec, 4℃) 세포 부산물은 원심분리하여(30 min, 4℃, 48384 x g) 제거하였다.

이온-교환 크로마토그래피 및 소수성 결합 크로마토그래피를 이용하여 상기 라이세이트로부터 cpn10를 정제하였다. 상기 단백질은 SDS-PAGE를 이용한 10-20% 트리스-트리신 겔(100 x 100 x 1mm; Novex)상에서의 ~ 10kDa 밴드로, 컬럼 분획들에서 동정하였다.

라이세이트는 마크로프렙 하이Q(BIO-PAD) 200 ㎖ 컬럼에 주입하고, 이동 완충액으로는 0.025M TrisHCl pH 8.0을 사용하고, 유속은 8 ㎖/min로 하였다. 비결합성 분획은 회수하여 pH 6.8로 적정하였다. 시료는 EconoPac S cartridge (BIO-RAD) 5 ㎖에 주입하고, 이동 완충액으로는 0.025 M 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.8을 사용하였고, 유속 2 ㎖/min로 하였다. 0.025M 소듐 포스페이트 완충액 pH6.8에 서 NaCl를 0에서 1M 농도의 농도구배로 30분간 2 ㎖/min으로 흘려주어 용출시켰다.

CpnlO를 함유하는 분획을 모으고, 여기에 3M (NH₄)₂SO₄가 용해된 0.05M 소듐 포스페이트 완충액 pH 6.8을 동일 부피로 첨가하였다. 시료는 5 ㎖ Econo-pac Methyl HIC 카트리지에 주입하고, 이동 완충액으로는 1.5M (NH₄)₂SO₄를 함유한 0.05M 소듐 포스페이트 완충액 pH6.8를 사용하고, 유속은 2 ㎖/min로 하였다. 0.025M 소듐 포스페이트 완충액 pH6.8상에서 NaCl로 1.5에서 0M의 농도구배로 15분간 2 ㎖/min으로 흘려주어 용출시켰다.

CpnlO를 함유하는 분획을 모우고, 식염수로 하룻밤동안 투석한 후, 적합한 용액에 현탁하여 -30℃에서 보관하였다.

CpnlO 처리

재조합 인간 cpnlO은 주사전에 PBS로 희석하였다. 기재한 바와 같이 BMT 전 또는 후에, 매일(10 ㎍/dose 또는 100 ㎍/dose) cpn10을 마우스에 피하 주사하였다. 대조군 마우스에는 단지 희석제만을 주사하였다.

GVHD 평가

전신성 GVHD 정도는, 생존율 및 5개의 임상 변수 즉, 체중 감소, 자세(헌칭:hunching), 활성도, 털 질감 및 피부 무결성(skin integrity)(최대 지수 = 10) (Cooke etal., 1996, Blood, 88,3230-3239 ; Hill etal., 1999, J. Clin. Invest. , 104, 459- 467)의 변화를 총 합산한 스코링 시스템으로 평가하였다. 각각의 마우스 귀에 번호표를 붙이고, 각 기준에 따라 0 에서 2의 등급을 매주 매겼다. 임 상으로 심각한 GVHD 상태의 동물(scores > 6)을 윤리적 지침서에 따라 취사시키고, 다음날 죽은 것으로 간주하였다.

통계학적 분석

생존곡선은, Kaplan-Meier 평가를 이용하여 구하였고, 로그 순위 분석으로 비교하였다. 평균 Whitney-U 검정을 임상적 수치에 대한 통계학적 분석에 사용하였다. P < 0.05은 통계학적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실시예 1- 마우스 대식세포의 생체외 실험

생체외 실험을 실시하여, 생리학적 세포 집단에서의 cpn10 기능을 확인하였다.

마우스

암컷 C57BL/6(B6,H-2^b, Ly-5.2⁺), B6 Ptprc^a Ly-5^a(H-2^b, Ly-5.1⁺) 및 B6D2F1(H-2^b, Ly-5.2⁺) 마우스를 호주 연구 센터(Perth, Western Australia, Australia)로부터 구입하였다. C57BL/6IL-10^-/- 마우스(B6, H-2^b, Ly-5.2⁺)는 호주 국립대학(Canberra, Australia)으로부터 제공받았다. 이식시 수용체로 사용한 마우스는 8 내지 14주된 것이다. 마우스는 멸균된 초미세분리(micro-isolator) 사육장에 넣고, 이식후 멸균된 산성 물(pH 2.5)과 정상적인 음식을 첫 2주간 섭취케 하였다.

골수 이식

표준방법(Hill et al., 1997 supra)에 따라 마우스를 이식하였다. 간단히 설명하면, 1일날, 위장 독성의 최소화하기 위하여, B6D2F1 마우스에 1300 cGy로 전신 방사능 조사(¹³⁷Cs source at 108 cGy/min)를 3시간 간격으로 2회 실시하였다. 공여체의 골수(5 x 10⁶/동물) 및 비장 T 세포(3 x 10⁶/동물)는 Leibovitz's L-15 배지(Gibco BRL, Gaithersburg MD) 0.25 ㎖에 현탁하고, 이를 수용체에 정맥주사하였다. 매일 생존율을 관찰하였고, GVHD 임상 수치는 매주 측정하였다. cpn10 또는 대조군인 희석제는 동물 당 100 ㎍의 투여량으로 피하 주사하였다. 전술한 바와 같이 전신성 GVHD 정도를 평가하였다.

세포 배양

배양 배지는 페니실린 50 units/㎖, 스트렙토마이신 50 ㎍/㎖, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 파이루베이트, 0.1 mM 불-필수 아미노산, 0.02 mM 베타-머캅토에탄올 및 10 mM HEPES가 보충된 10% FCS/IMDM (JRH Biosciences, Lenexa, KS)를 사용하였다. 실험은 5% 이산화탄소가 공급되는 습윤 배양기내에서, pH7.75 및 37℃의 조건에서 실시되었다.

LPS의 생체외 자극 실험으로, 배양 상층액내에서 표준농도(graded concentration)의 LPS, TNFα 및 IL-10를 사용하여, 5시간 및 48시간으로 각각 복막내 대식세포 또는 비장세포(splenocyte)를 자극하였다. 동종-항원의 생체외 실험으로, 정제한 C57BL/6 T 세포는 96웰 플레이트(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에서 10⁵ 방사능 조사한(2000cGy) 복막내 대식 세포(primary MLC)와 함께 배양하였고, 72시간에 상층액을 수거하였다. 배양액에 ³H-티미딘(1 uCi/웰)을 첨가하고, 16시간 후에 1205 베타플레이트 리더(Wallac, Turku, Finland)로 증식을 측정하였다. 마이토젠의 생체외 자극으로, 정제한 C57BL/6 T 세포를 최종 농도 10 ㎍/㎖로 CD3 및 CD28이 코팅 처리된 편평한 바닥형의 96웰 플레이트에서 배양하였다. 상층액을 48시간 후에 수거하고, ³H-티미딘(1 uCi/웰)을 첨가하였다. 증식은 16시간 후에 결정하였다.

사이토카인 ELISA

IFNγ, IL-10, IL-4 및 TNFα분석에서 사용한 항체는, PharMingen(San Diego, CA)에서 구입하였고, 제조사의 지시서에 따라 분석을 수행하였다. 간략하게 설명하면, 시료는 1: 3 내지 1: 24로 희석하였고, 특이적인 일차 단일클론 항체(mAb)로 사이토카인을 포착하고, 비오틴-표지된 이차 mAb로 이를 검출하였다. 비오틴-표지 분석은 스트렙타비딘 및 기질(Kirkegaard and Perry laboratories, Gaithersburg, MD)을 이용하여 실시하였다. 플레이트는 pectraflour Plus microplate reader (Tecan, Durham, NC)를 이용하여 450 nm에서 형광을 측정하였다. 재조합 사이토카인(PharMingen)은 ELISA 분석에 표준물질로 이용하였다. 시료 및 표준물질은 2 배수로 실시하였고, 분석 민감성에 있어서 IFNγ는 0.063 U/㎖, IL-10, IL-4 및 TNFα 15 pg/㎖이었다.

결과

cpn10의 생체내 투여는 복막내 대식세포의 TNFα 생성율을 감소시켰다(도 2A). B6 마우스(n=3)는 5일간 cpnlO(100㎍, 매일 한번)(cpnl0+) 또는 대조군은 희석제(cpnlO-)를 처리하였다. 6일째에 복막을 세척하여 복막내 대식세포를 수거하였고, 처리군에서 각각의 동물로부터 수집하였다. 세포는 LPS 존재하지 않거나(기재하지 않음) 또는 존재하는(1㎍/㎖) 상태에서 2 x 10⁵/웰로 접종하였다. 배양 상층액은 5시간 후에 수집하고, ELISA로 TNFα의 농도를 평가하였다. 결과는 CD11b 염색을 기초로, 10⁵ 대식세포에 대한 생산율로 나타내었다. 도 2A는 두개의 동일한 실험의 결과를 나타낸다. TNFα의 LPS-유도성 분비는 40% 감소되었다.

cpnlO 처리는 비장세포에서의 IL-10 생성을 증대시켰다(도 2B). B6 마우스를 상술한 바와 같이, cpn10 또는 대조군 희석제 중 어느 하나로 처리하였다. 6일 후 각각의 처리군 동물로부터 비장세포를 수거하고, LPS 존재하지 않는 경우(기재하지 않음) 또는 존재하는 경우(10 ㎍/㎖)에서 5 x l0⁵/웰로 배양하였다. 배양 상층액은 48시간에 수집하고, ELISA로 IL-10(pg/㎖) 농도를 측정하였다. 두개의 동일한 실험에서 얻은 결과는 도 2B에 나타나 있다. 대조군 동물에 비하여 IL-10 생산이 현저히 증가되었다.

cpn10 의 생체내 처리로, IL10^-/- 복막내 대식세포로부터의 TNFα 생산이 감소되었다(도 2C). IL10^-/-B6 마우스에 cpnlO 또는 대조군 희석제를 처리하고, 6일째 복막 세척으로 복막내 대식세포를 수거하였고, 처리군의 각각의 동물로부터 모았다. LPS 존재(0.1, 1 및 10 ㎍/㎖) 또는 존재하지 않은(LPS0) 조건에서 5시간 배양한 후, 배양 상층액에서의 TNFα의 함량을 측정하였다. cpn10이 처리된 IL-10^-/-마우스의 복막내 대식세포가 LPS에 의해 생체외로 자극되는 경우, TNFα 분비에 유사한 감소가 관찰되었으므로, cpn10에 의해 매개된 LPS-유도성 TNFα 생성 감소에는 IL-10이 필요하지 않았다. 따라서, TNFα 분비 감소 및 IL-10 생성 증가는 cpn10 처리의 독립적인 결과인 것으로 보인다.

CpnlO 처리는 T세포 IFNγ 또는 IL-4 분비에 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. 기존 보고들에서, cpn10은 마이토젠 반응으로 T 세포 증식을 저해할 수 있는 것으로 추측되었다(Morton H. 1998 Immunol. CellBiol., 76,483-496). Thl 면역 반응은 대개 TNFα 및 IFNγ와 같은 전염증성 사이토카인으로 특징된다. Th2 반응은 IL-4 및 IL-10 분비에 관여하며, 조절성 T 세포(Treg) 반응은 IL-10 및 TGFβ 생성으로 특징된다. Th2 및 Treg 반응은 증식을 억제하고, Th1 반응은 사이토카인 생성을 억제하므로, cpn10 의 T세포 분화에 영향을 미치는 능력을 조사하였다.

cpn10의 생체내 투여는, 동종항원에 대한 T 림프구의 증식성 반응에 영향을 미치지 않았다(도 2D). B6 마우스(n=3)에 매일 cpn10 또는 대조군 희석제를 주사하였다. 비장세포 유래의 T 세포 집단을, 혼합성 림프구 배양액(MLC)내에서 7일간 동종이계의 비장세포로 생체외 자극하였다. 정제된 T 세포(0.5 x 10⁵, l X 10⁵ 및 2 x lO⁵/웰)는 방사능 조사한 동종이계의 B6D2F1 복막내 대식세포(0.5 x 10⁵/웰) 로 자극하였고, 표준 ³[H] 티미진 통합 분석을 통하여 72시간째에 증식을 측정하였다. 도 2D에 나타낸 수치는 3배수 실험치의 평균 + 편차이다. MLC내에서, T 세포 증식은 cpn10 처리군과 대조군 동물간에 유의할만한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 cpn10이 T세포 성장 조절자가 아님을 의미한다.

도 2E 내지 G는 T 세포 분화에 있어서, cpn10 의 생체내 투여 효과를 나타낸다. B6 동물에 전술한 바와 같이 cpnlO로 생체내 처리하였다. cpn10 처리 및 비히클 처리된 동물로부터 유래한 T 세포(2 x l0⁶/웰)를, 방사능 조사한 동종이계의 B6D2F1 비장세포(3 x lO⁶/웰) (primary mixed lymphocyte culture)로 7일간 배양하여 자극하였다. 7일째에, T 세포는 수집하고, T세포를 자극하는 CD3 및 CD28에 대한 항체가 결합된 플레이트로 다시 자극하였다. 배양 상층액을 24시간에 수거하고, IFNγ, IL-4 및 IL-10의 농도를 ELISA로 측정하였다. 도 4E 내지 G에서, 농도값은 3배수 실험치의 평균 + 편차로 나타내었다.

cpn10 을 처리한 동물과 대조군 동물간에, T세포 IL-4 분비(도 2E) 및 IFNγ 분비(도 2F)에 있어서 모두 유의적인 차이점이 없었다.

반대로, T 세포 IL-10 분비는 현저히 증가되었다(도 2G). cpn10는 생체내에 비하여 세포 배양(MLC) 동안 생체외로 처리하는 경우, IL-10 분비에서 유사한 증가가 또한 관찰되었으며, 증식, IFNγ 및 IL-4는 영향을 받지 않았다(실험결과 미첨부). 이러한 결과는, cpn10이 LPS 및 동종항원의 자극에 대한 반응으로 IL-10 생성을 증강시킬 수 있음을 의미하며, cpn10-증강성 IL-10 생성은 T세포 유래된 IL-10의 일부일 수 있음을 시사한다.

실시예 2 - 생체내 GVDH 모델에서 cpn10의 이식전 및 이식후 처리 효과

생체내 실험을 수행하여, 이식전 후 및 이식중에 cpn10 처리가 GVHD를 방지할 수 있는지를 실험하였다.

이식후 cpn10 처리

공여체 B6 마우스 유래의 골수세포(5 x lO⁶/animal) 및 정제한 T 세포(전술함)를, 치사량의 방사능을 조사(1100 cGy)한 B6D2F1 수용체 세포(동종이계 그룹)에 이식하였다. 동계의 대조군 그룹의 B6D2F1 수용체에는, 동량의 B6D2F1 골수세포와 T 세포를 공급하였다. 이식후(0 내지 21일), 동물에 비히클(동종 ,n=8 및 동종이계의 대조군 그룹, n=10) 또는 cpn10(10 및 100 ㎍/animal/day : cpnlO lO ㎍/day 동종이계, n=10 및 cpnlO 100 ug/day 동종이계, n=10)을 피하 주사였다. 생존 동물에서의 GVHD 심각도를 측정하여, GVHD 임상 수치(상술한 바와 같이)를 결정하였다. 비히클을 처리한 동종이계의 대조군(^**P<0.01)에 비하여, 14일째 및 21일째에 cpn10을 100 ㎍/㎖로 주사한 동종이계의 동물에서, 임상적으로 온화한 GVHD가 관찰되었다. 비히클 주사한 동종이계 그룹과 cpn10을 주사한 동종이계 그룹간의 생존율에상에는 별다른 차이가 없었다. 도 3은 Kaplan- Meier 분석에 의한 마우스 생존곡선을 나타낸다.

골수 이식(BMT) 이후에 cpn10을 처리한 경우 GVHD 사망은 방지되지 않았으며, 단지 GVHD 임상적 수치(도 3B)로 결정된 바와 같이 이환이 감소되었다. 비히클을 처리한 동종이계의 대조군(^**P<0.01)에 비하여 cpn10을 100 ug/day로 처리한 14 및 21일째의 동종이계 동물에서, 임상적으로 온화한 GVHD가 관찰되었다.

cpn10의 전처리 투여

수용체 B6D2F1과 공여체 B6 마우스에, cpn10(100 ㎍/day/피하내로) 또는 대조군 희석제를 이식전 5일간 처리하였다. 6일째에 B6 마우스로부터 수거한 골수 세포(5 x lO⁶/animal) 및 T 세포(3 x lO⁶/animal)를 취사량으로 방사능 조사된 B6D2F1 수용체로 이식하였다. 수용체 5개 그룹을 형성시켰다:

그룹1: 동종의 대조군(n=8)은 동종 B6D2F1의 골수세포 및 T 세포로 이식된 B6D2F1이다.

그룹2: 동종이계의 대조군(n=10)은 희석제로 전-처리된 B6 공여체의 세포로 이식된, 희석제로 전처리된 B6D2F1 수용체로 구성된다.

그룹3: 동종이계의 전처리된 수용체(n=10), 수용체 B6D2F1 마우스는 cpn10으로 이식전 처리되었고, 비히클로 전처리된 B6 공여체 세포로 이식되었다.

그룹4: 단지 희석제로만 전처리되었으며, cpn10 전처리된 B6 공여체(동종이계의 전처리된 공여체, n=10)로부터 이식된, 수용체 B6D2F1 마우스.

그룹5: B6D2F1 수용체 및 B6 공여체 마우스 모두 이식전에 cpn10으로 전처리되었다(동종이계의 전처리된 수용체 및 공여체, n=10).

GVHD 임상적 수치는 상술한 바와 같이 측정하여, 생존 동물에서의 GVHD 심각도를 결정하였다.

7일째 그룹 5(이식 전에 cpn10으로 수용체 및 공여체 모두 전처리됨)에서, 동종이계의 대조군 그룹에 비하여, 현저히 낮은 임상적 수치가 확인되었다(도 4B; ^***P<0.001). 도 4는 Kaplan-Meier 분석에 의한 마우스 생존 곡선이다.

이식전에 5일간 이식 공여체 및 수용체에 cpn10을 처리하면, GVHD 사망율이 현저히 지연되었다(*P<0.01 vs 동종이계의 대조군). 또한 상기 임상적 수치로 판단한 GVHD의 심각도는, BMT 이후 초기에 감소되었다. BMT 이전에 처리하는 경우 cpn10의 GVHD 사망율을 지연시키는 효과는, 본원의 항-염증성 작용, 예를들면 TNFα 생성(Hill et al., 1998 J. Clin. Invest. , 102,115-123 ; Hill et al., 1997, supra)과 일치된 결과이다. BMT 이후에 cpn10 처리가 GVHD의 발병을 방지하지 못한 것은, 도 3에서 확인된 바와 같이, 본 실시예에서 채택한 투여량 및 계획에서는, T 세포 활성화 및 분화에 작용하지 않는다는 것과 일치된다.

이러한 모델에서 이식 조건화(치사율의 방사능 조사)는 진행성 위장관 손상, LPS 누출 및 염증성 사이토카인 형성의 과정을 확립하고, 이후 추가적인 위장관 손상을 유도하여 상기 과정이 양성 피드백 고리로서 계속된다. 이러한 과정은 방사능 조사에 의한 손상으로부터 창자를 보호할 수 있는 약학적 물질(예컨대 IL-11 및 각질세포 성장 인자; Krijanovski etal., 1999, Blood, 94, 825-831), LPS 대항제(Cooke et al., 2001, J. Clin. Invest., 107, 1581-1589) 또는 자신의 TNFα에 대한 저해제(Hill et al., 1997 supra)에 의하여 저지될 수 있다. 그러나 이러한 물질은 TNFα가 완전히 중화(neutralize)되지 않거나 또는 T 세포 활성화 및 분화에 추가적으로 작용하지 않는 한, GVHD를 방지하기보다는 지연시킨다. 따라 서, cpn10 처리로 인한 GVHD 사망 지연은, BMT 이후 LPC 시그널링 및 이에 연속된 TNFα 초기 생성의 한계와, 수반되는 동종반응성 T 세포 기능에 영향을 미치지 못하는 것과 일치한다.

따라서, cpn10은 GVHD의 치료에 있어서 매우 중요한 치료제일 가능성을 갖고 있다. 공여체 및 수용체 모두 이식전에 cpn10으로 투여하는 경우 GVHD 치료 효능이 증가되는 것으로 관찰되었으며, 이는 이식후에 TNFα가 조직 또는 기관 원(source)으로부터 유래된 것이라는 사실과 일치된다(Cooke et al., 2000, J. Immunol., 165, 6612-6619; Speiser et al., 1997, J. Immunol., 158, 5185-5190).

더욱이, cpn10은 이차적인 후천 면역 반응을 제한하는 기존의 면역억제성 물질과 조합한 형태로, GVHD 치료에 사용될 수 있다.

본원을 통하여, 본 발명의 바람직한 실시예들을 기재하였으나, 실시예 또는 특정 구성의 수집에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면, 본원의 측면에서, 다양한 변경 및 변이를 특정 실시예로서 가할 수 있으나, 이는 본 발명의 범위에 포함된다.

본원에 언급된 모든 컴퓨터 프로그램, 알고리즘, 특허 및 과학 논문은 원용에 의해 본원에 통함된다.

Claims

약학적 유효량의, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 샤페로닌 10(cpn10), 및 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하는, 이식편대 숙주질환(graft versus host disease: GVHD)을 치료하기 위한 약학 조성물.
제1항에 있어서, 1종 이상의 다른 면역억제성 제제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 다른 면역억제성 제제는 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 및 메토트렉세이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 약학적 조성물.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 분리된 폴리펩티드.
제1항에 따른 약학 조성물 또는 제4항에 따른 분리된 폴리펩티드를 이식편대 숙주질환(graft versus host disease: GVHD)을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하는 방법.
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