JP3798426B2 - 自己免疫疾患の治療におけるｉｌ−１２およびｉｌ−１２アンタゴニストの使用 - Google Patents
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Description
発明の背景
ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）は、多くの事故免疫症状の発症、悪化および／または再発に関与している。例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＨＦ−αはともに、多発性硬化症［コフロン（Choflon）ら、ヨーロピアン・サイトカイン・ネットワーク（Eur.Cytokine Netw.）第３巻（６）、１９９２年、５２３〜５３１頁；シュタインマン（Steinman）、サイエンティフィック・アメリカン（Scientific American）、９月号、１０７〜１１４頁；ホフマン（Hofman）ら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）、第１７０巻、１９８９年、６０７〜６１２頁；パニッチ（Panitch）ら、ニューロロジー（Neurology）、第３７巻、１９８７年、１０９７〜１１０２頁］およびＩ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭ）［カスタノ（Castano）ら、マニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Annu.Rev.Immunol.）、第８巻、１９９０年、６４７〜６７９頁；キャンベル（Campbell）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J.Clin.Invest.）、第８７巻、１９９１年、７３９〜７４２頁］の経過に関連している。ＴＮＦ−αはリューマチ性関節炎の発症を促進することが見いだされており［フェルドマン（Feldman）ら、プログレス・イン・グロウス・ファクター・リサーチ（Progress in Growth Factor Reaearch）、第４巻、１９９２年、２４７〜２５５頁］、ＴＦＮ−γの投与は関節炎の対象における改善に関連している［ベイズ（Veys）ら、ジャーナル・オブ・リューマトロジー（J.Rheumatology）、第１５巻（４）、１９８８年、５７０〜５７４頁］。全身性紅斑性狼傷（ＳＬＥ）［フナウチ（Funauchi）ら、トーホク・ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Tohoku J.Exp.Med.）、第１６４巻、１９９１年、２５９〜２６７頁；バンクハースト（Bankhurst）、ジャーナル・オブ・リューマトロジー、第１４巻（補１３）、１９８７年、２７５〜２７８頁］、自己免疫甲状腺炎［タング（Tang）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol.）、第２３巻、１９９３年、２７５〜２７８頁］、および自己免疫性炎症性眼疾（例えば、自己免疫性ブドウ膜網膜炎）［チャーテリス（Charteris）ら、イムノロジー（Immunology）、第７５巻、１９９２年、４６３〜４６７頁］に関連した自己免疫疾患プロセスにおけるＩＦＮ−γの関与が研究により示されている。自己免疫性肺炎の発症［デグチ（Deguchi）ら、クリニカル・イクスペリメンタル・イムノロジー（Clin.Exp.Immunol.）、第８５巻、１９９１年、３９２〜３９５頁］およびおよびギラン−バレ症候群［バロン（Baron）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第９０巻、１９９３年、４４１４〜４４１８頁］もＴＮＦ−α活性に関連している。
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に示されたように、本来は、Ｔ細胞および天然キラー細胞からＩＮＦ−γを誘導する因子として固定されたヘテロ二量体サイトカインである。ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２ではＩＬ−１２が天然キラー細胞刺激因子またはＮＫＳＦと呼ばれている。１９９１年６月２６日公開のＥＰ４３３８２７には、ＩＬ−１２が細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）として開示されている。さらに、よく知られた天然キラー細胞の細胞障害活性アクチベーターであるＩＦＮ−αおよびＩＬ−２で得られるレベルと比肩しうるレベルで標的細胞を溶解する能力を増大せることにより、ＩＬ−１２はインビトロにおいて天然キラー細胞を刺激する。同定されているＩＬ−１２のさらなるインビトロ活性は、ＴＮＦ−αの誘導；Ｔ細胞増殖の補助刺激因子としての誘導；ＩＬ−２により誘導される天然キラー芽細胞の増殖の抑制；ＩＬ−２により誘導されるＴ細胞受容体−γδ−陽性細胞の増殖の抑制；前駆細胞からのＴ細胞の分化抑制；Ｔｈ１増殖促進（Ｔｈ２増殖ではない）；Ｔ細胞の細胞障害活性の増強；細胞障害性リンパ球の発生促進；天然キラーおよび天然キラー芽細胞の細胞障害性活性の増強；ＩＬ−２で治療された患者の末梢血単核細胞におけるエクスビボでの天然キラー活性の増強；天然キラー細胞への分子付着の誘導；天然キラー芽細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムＢのｍＲＮＡの誘導；天然キラー細胞上のＩＬ−２受容体サブユニット（ｐ５５、ｐ７５）の誘導；ＩＦＮ−γ依存的機構および独立機構によるＩｇＥ合成の抑制；胎児胸腺器官培養物におけるＴ細胞発生の転調；および骨髄性およびＢ細胞の前駆細胞の増殖を促進するキットリガンド（kit ligand）との相乗作用を包含する。ＩＬ−１２の既知インビボ活性は、ＩＦＮ−γの誘導；脾臓、肝臓、肺ならびに腹腔内の天然キラー細胞活性の増強；アロ特異的細胞障害性リンパ球の発生促進；マウス・脾臓における髄質外造血の誘導：骨髄における造血の可逆的抑制；マウスにおける貧血、リンパ球減少症ならびに好中球減少症の可逆的誘導；抗ＩｇＤにより誘導されるＩｇＥ、ＩｇＧ１ならびにＩＬ−４のに発現抑制；トキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）処理されたＳＣＩＤマウスの生存率の上昇；クリプトコッカス・モデル（cryptococcoses model）での生体負荷の軽減；腫瘍増殖抑制；および腫瘍細胞に対する免疫性促進を包含する。さらにＩＬ−１２は、敗血症ショックのシュワルツマン反応モデルにおいてインビボ誘導される。
ＩＬ−１２はＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生を誘導することができるが、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのレベルにより影響される自己免疫疾患とＩＬ−１２のインビボでのレベルとの関係は確認されていない。さらにそのうえ、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αに関連した自己免疫疾患に対する、ＩＬ−１２または内在性ＩＬ−１２のアンタゴニスト（ＩＬ−１２抗体のごとき）の投与効果も試験されていない。
発明の概要
本発明は、自己免疫症状または疾患の治療（例えば、治癒、改善、遅延もしくは発症の予防、再発もしくはぶり返しの予防）方法を提供する。好ましい具体例において、症状は、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γからなる群より選択されるサイトカインのレベルの増大により促進されるものである。かかる症状は、多発性硬化症、全身性紅斑性狼傷、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、ギラン−バレ症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病および自己免疫性炎症性眼疾を包含するが、これらに限らない。多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病が、本明細書記載の本発明により治療するための特に好ましい症状である。
特定の具体例において、本発明治療方法は、治療上有効量のＩＬ−１２アンタゴニスト、好ましくは、ＩＬ−１２と免疫反応する抗体または他の種を哺乳動物対象に投与することからなる。特定の好ましい具体例において、約０．０５ないし約２５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．２ないし約２ｍｇ／ｋｇの用量でＩＬ−１２アンタゴニストを投与する。アンタゴニストを医薬上許容される担体と混合して投与することもできる。
他の具体例において、本発明方法は、治療上有効量のＩＬ−１２を哺乳動物対象に投与することからなる。特定の具体例において、約０．００１ないし約１０００μｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０１ないし約１００μｇ／ｋｇの用量でＩＬ−１２を投与してもよい。ＩＬ−１２を医薬上許容される担体と混合して投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＬＰおよびｒｍＩＬ−１２でインビトロ刺激されたリンパ節および脾臓細胞を用いる実験的アレルギー性脳髄膜炎（ＥＡＥ）の養子転移（adoptive transfer）に関するデータのグラフである。材料および方法に記載のごとく、ＰＬＰで免疫され、抗原のみ（白丸）または抗原および２０ｍｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−１２（黒丸）で刺激されたマウスから１０日後に脾臓およびリンパ節を集めた。３０ｘ１０6個の細胞を用いて疾病を転移させた。結果を、（ａ）リンパ節（ｎ＝７）および（ｂ）脾臓細胞（ｎ＝５）についての平均スコアとして表す。データは少なくとも２つの別個の実験のものを表す。実施例１参照。
図２は、ＰＬＰおよびＩＬ−１２でインビトロ刺激されたＬＮＣからのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生に関するデータのグラフである。ＰＬＰで免疫されたマウス由来のＬＮＣ（２．５ｘ１０6個／ｍｌ）を、３０ｘ１０6個の細胞を用いる細胞転移の９６時間前に、ＰＬＰのみ、ＰＬＰおよびｒｍＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、あるいはＰＬＰ、ｒｍＩＬ−１２および抗ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍｌ）とともに培養した。（ａ）プールされた培養物上清中の、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α。（ｂ）刺激されたリンパ節細胞の転移後の平均疾病スコア。ＰＬＰのみ、およびＰＬＰ＋ＩＬ−１２についてはｎ＝３、ＰＬＰ＋ＩＬ−１２＋抗−ＩＦＮ−γについてはｎ＝４。実施例１参照。
図３は、ＰＬＰで刺激されたＬＮＣを用いるＥＡＥの養子転移に対するＩＬ−１２のインビボ投与の効果に関するデータのグラフである。ＰＬＰで免疫されたマウス由来のＬＮＣを、材料および方法に記載されたように抗原とともに培養し、無処理のマウスに転移させた。ｒｍＩＬ−１２（０．３μｇ／マウス）を、細胞転移から０、１および２日目に投与し（黒丸）、マウスを疾病の徴候についてモニターした。対照マウスには同体積のセイラインを与えた（白丸）。（ａ）３０ｘ１０6個のＬＮＣ細胞の転移後の平均臨床スコア（ｎ＝５）。（ｂ）１０ｘ１０6個のＬＮＣ細胞の転移後の平均臨床スコア（ｎ＝４）。実施例１参照。
図４では、ＰＬＰで刺激されたＬＮＣを用いるＥＡＥの養子転移に対する抗ＩＬ−１２抗体のインビボ投与の効果に関するデータのグラフを示す。材料および方法に記載のごとくＰＬＰで免疫されたマウス由来のＬＮＣを抗原とともに培養し、３０ｘ１０6個の細胞を無処理マウスに転移させた。抗ＩＬ−１２抗体（ヒツジ・抗マウスポリクローナル抗体、２００μｇ／マウス）を、細胞転移の日に開始する腹腔内注射により投与した（黒丸）。対照マウスには等量のヒツジ・ＩｇＧを与えた（白丸）。（ａ）αＩＬ−１２抗体投与後の０ないし６日目までの隔日の平均臨床スコア。（ｂ）αＩＬ−１２抗体投与後の０ないし１２日目までの隔日の平均臨床スコア（ｎ＝５〜７）。実施例１参照。
図５および６は、ＩＬ−１２投与によるＮＯＤマウスにおける疾病発生率に関するデータのグラフを示す。
詳細な説明
本発明は、自己免疫疾患の治療方法を提供する。「自己免疫疾患」は、対象自身の免疫系が対象の細胞または組織に対して反応し、その細胞または組織にダメージを生じる症状である。かかるサイトカインの血清または組織レベルの増加がかかる自己免疫症状の発症、再発、あるいは発症促進を行う場合、特定の自己免疫症状は「サイトカインのレベルの上昇により促進される」。ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αのレベルの上昇により促進される自己免疫症状は、多発性硬化症、全身性紅斑性狼傷、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、ギラン−バレ症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病および自己免疫性炎症性眼疾を包含するが、これらに限らない。
「ＩＬ−１２アンタゴニスト」は、（１）ＩＬ−１２に結合する種またはその生物学的に活性のあるフラグメント、および（２）受容体へのＩＬ−１２の結合を妨害する種または他の結合蛋白を包含する。ＩＬ−１２に結合するアンタゴニストは、抗体（モノ−またはポリクローナル）およびそのフラグメント（Ｆabフラグメントを包含する）、キメラ抗体ならびにそのフラグメント、レクチン、ＩＬ−１２受容体もしくはそのフラグメント、反応性ペプチドもしくはそのフラグメント、およびＩＬ−１２受容体の生物学的活性を模倣するように設計された有機小型分子を包含するが、これらに限らない。ＩＬ−１２の結合を妨害するアンタゴニストは、化学的もしくは遺伝学的に修飾されたＩＬ−１２のペプチド、ＩＬ−１２のサブユニットならびにそのフラグメント、ＩＬ−１２サブユニットのホモポリマーならびにそのフラグメント、およびＩＬ−１２受容体の生物学的活性を模倣するように設計された有機小型分子を包含するが、これらに限らない。好ましくは、ＩＬ−１２の結合を妨害するアンタゴニストは、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αを誘導する受容体へのＩＬ−１２の結合を妨害し、ＩＬ−１２が受容体に結合した場合と同レベルのかかる因子を誘導しない。
当業者によく知られた方法によりＩＬ−１２アンタゴニストを製造することができる。例えば、既知方法により抗体産生ハイブリドーマを得ることによりモノクローナルＩＬ−１２抗体を製造することができる（例えば、ゴディング（Goding）、１９８３年、モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Monoclonal antibodies:pinciples and practices）、アカデミック・プレス・インコーポレイテッド、ニューヨーク；ヨコハマ（Yokohama）、１９９２年、カレント・プロトコールズ・イン・イミュノロジー．ユニット２．５（Current Protocoles in Immunology.Unit2.5）中、「プロダクション・オブ・モノクローナル・アンチボディーズ（Production of Monoclonal Antibodies）」、グリーン・パブリッシング・アソシエイションおよびジョン・ウィリー・アンド・サンズ）。既知方法により、ＩＬ−１２またはそのフラグメントを哺乳動物対象に接種することによりＩＬ−１２に対するポリクローナル血清および抗体を製造することができる。チッゾナイト（Chizzonite）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）、第１４８巻、１９９２年、３１１７頁には、ＩＬ−１２受容体の同定および単離が記載されている。既知方法により、所望抗体の開裂および収集によって、抗体、受容体または他の反応性ペプチドのフラグメントを対応する抗体から製造することができる（例えば、ゴディング、上記；アンドリュー（Andrew）ら、１９９２年、カレント・プロトコールズ・イン・イミュノロジー．ユニット２．８中、「フラグメンテイション・オブ・イムノグロブリンズ（Fragmentation of Immunoglobulins）」、グリーン・パブリッシング・アソシエイションおよびジョン・ウィリー・アンド・サンズ参照）。既知方法によりキメラ抗体を製造してもよい。
ＩＬ−１２を用いる本発明方法においては、所望の自己免疫症状の治療をすることができるかぎり、いかなる形態のＩＬ−１２を用いてもよい。例えば、ＩＬ−１２が、３５ｋＤサブユニットにジスルフィド結合した４０ｋＤサブユニットからなっていてもよい。ＩＬ−１２がヘテロ二量体である場合、４０ｋＤサブユニットはＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に示されたヒトＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットに対して実質的相同性を有し、同じＰＣＴ出願に示されたヒト・ＩＬ−１２の３５ｋＤサブユニットに対して実質的相同性を有する３５ｋＤサブユニットにジススフィド結合している。「実質的相同性」は、アミノ酸レベルで７５％以上の相同性を意味するが、哺乳動物対象における所望の自己免疫症状を治療する能力を保持していることを意味する。本発明に用いてもよいもう１つの形態のＩＬ−１２は、哺乳動物対象における所望の自己免疫症状を治療する能力のあるＩＬ−１２サブユニットである。かかるＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットは、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に開示されたヒト・ＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットに対して実質的相同性を有し、かかるＩＬ−１２の３５ｋＤサブユニットはかかるＰＣＴ出願に開示されたヒト・ＩＬ−１２の３５Ｄｋサブユニットに対して実質的相同性を有する。ＩＬ−１２の生物学的活性を保持しているＩＬ−１２サブユニットのフラグメントも、本発明による哺乳動物対象における自己免疫症状の治療に有用である。
本発明での使用に関し、適当な形質転換宿主においてＩＬ−１２サブユニットの一方または両方をコードしているＤＮＡ配列の発現により、ＩＬ−１２を組み換え的に製造することが好ましい。例えば、既知方法を用いて、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に示されたヒト・ＩＬ−１２をコードしているＤＮＡ配列をｐＥＤ（カウフマン（Kaufman）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第１９巻、４４８４〜４４９０頁（１９９１年））のごとき発現ベクターに結合する。かかる発現ベクターにおいて、既知方法を用いてＣＣＡＣＣのごとき、翻訳を最適化する配列（コザック，エム（Kozak,M.）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１２巻、８５７〜８７１頁（１９８４年））を開始コドンの５’側に付加してもよい。次いで、ＩＬ−１２サブユニットを含む発現ベクターを宿主細胞中に形質転換し、蛋白発現を誘導し、最大にしてヘテロ二量体ヒト・ＩＬ−１２を製造してもよい。ヘテロ二量体ＩＬ−１２の製造のために、ＩＬ−１２サブユニットをコードしているＤＮＡ配列が別々の発現プラスミド上に存在していてもよく、また、１つの発現プラスミド上に並んで存在していてもよい。
ＩＬ−１２のサブユニットまたはフラグメントを用いて本発明を実施する場合には、既知方法を用いて組み換え的にそれを製造してもよい。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に示したヒト・ＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットをコードしているＤＮＡ配列を発現ベクターに結合し、宿主細胞中に形質転換し、発現を誘導し、最大にしてヒト・ＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットを製造してもよい。同様に、該ＰＣＴ出願に示したヒト・ＩＬ−１２の３５ｋＤサブユニットをコードしているＤＮＡ配列を発現ベクターに結合し、宿主細胞中に形質転換し、発現を誘導し、最大にして対応蛋白を製造してもよい。もちろん、ＩＬ−１２サブユニットをコードしている縮重ＤＮＡ配列を用いて本発明において使用するＩＬ−１２を製造してもよく、ＩＬ−１２サブユニットのアリール変異体をコードしているＤＮＡも同様に製造することができる。化学的または遺伝学的に修飾された形態のＩＬ−１２およびそのサブユニットを、上記ＰＣＴに出願に開示の方法により製造することもできる。
いずれの適当な発現ベクターを用いても本発明に使用するＩＬ−１２を製造することができる。哺乳動物での発現用には、上記ｐＥＤのほかに、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ミズシマ（Mizushuma）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第１８巻、５３２２頁（１９９０年））；ｐＸＭ、ｐＪＬ３ならびにｐＪＬ４（ゴウ（Gough）ら、ＥＭＢＯジャーナル第４巻、６４５〜６５３頁（１９８５年））；およびｐＭＴ２（ｐＭＴ２−ＶＷＦから誘導されたもの、ＡＴＣＣ番号６７１２２；ＰＣＴ／ＵＳ８７／０００３３参照）のごとき多数の発現ベクターが知られている。酵母、昆虫、および細菌細胞における使用に適する発現ベクターも知られている。
本発明において有用なＩＬ−１２の組み換え的製造に適する宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル・ＣＯＳ細胞、マウス・３Ｔ３細胞、マウス・Ｌ細胞、ＮＳＯ（ガルフル（Galfre）およびミルステイン（Milstein）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第７３巻、３〜４６頁（１９８１年））のごとき骨髄腫細胞、幼若ハムスター・腎臓細胞等のごとき哺乳動物細胞を包含する。既知方法を用いての、ＩＬ−１２サブユニットをコードしているＤＮＡ配列での酵母、昆虫、および細菌細胞の形質転換、そして蛋白発現の誘導および増幅によりＩＬ−１２を製造してもよい。
組み換え的に製造されたＩＬ−１２を培地または細胞抽出液から慣用的精製法により精製することができる。市販蛋白濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon）またはミリポア・ペリコン（Millipore Pellicon）限界濾過ユニットを用いてＩＬ−１２を含有する培地または細胞抽出液を濃縮してもよい。濃縮工程後、濃縮物をゲル濾過媒体のごとき精製マトリックスに適用することができる。別法として、アニオン交換樹脂、例えば、懸垂したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基材を用いることもできる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白精製に通常に使用される他のタイプのものであってもよい。別法として、カチオン交換工程を用いてもよい。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基からなる種々の不溶性マトリックスを包含する。さらに培養上清からのＩＬ−１２の精製は、１またはそれ以上のカラム工程、例えば、レクチン−アガロース、ヘパリン−トヨパールRまたはトバクロムブルー３ＧＡセファロースRによるカラム工程；あるいはフェニルエーテル、ブチルエーテル、もしくはプロピルエーテルのような樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー；あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーによるカラム工程を包含してもよい。最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、懸垂したメチルもしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて本発明および組成物に使用するＩＬ−１２をさらに精製することができる。上記精製工程のいくつかまたはすべてを種々組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換え蛋白を得ることができる。本発明に使用するＩＬ−１２サブユニットまたはフラグメントの精製は、ヘテロ二量体蛋白の精製のための最適プロトコールとは異なるかもしれない。
好ましくは、ヒト・ＩＬ−１２を上記のごとく組み換え的に製造する場合、以下の方法によりそれを精製してもよい。ヒト・ＩＬ−１２が産生されている細胞を濾過によってならし培地から除去し、１０〜３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８〜８．３で平衡化したＱ−セファロースファストフローTM（ファルマシア（Pharmacia）から市販されている）または同等のアニオン交換媒体にならし培地を負荷する。次いで、カラムを同じバッファーで十分に洗浄し、さらに３０〜４５ｍＭヒスチジン，ｐＨ５．１〜５．８で洗浄し、次いで、もとの平衡化バッファーで洗浄する。２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８〜８．５および０．１５〜０．５０Ｍ ＮａＣｌを含有するバッファーで組み換えヒト・ＩＬ−１２がカラムから溶離される。２０〜５０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ５．７〜６．４で平衡化したＣＭ−セファロースファストフローTM（ファルマシアから市販されている）または同等のカチオン交換媒体に溶離物質を負荷し、同じバッファーで十分に洗浄する。２０〜４０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ６．８〜７．５および０．２〜０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するバッファーでカラムを洗浄する。ＣＭ−セファロースファストフローTMカラムに使用する溶離バッファーで洗浄され平衡化されたアミコンTMＳＩＹ３０または同等のスパイラルカートリッジ膜を用いて溶離物質を濃縮する。該物質を濃縮して、Ｓ２００セファクリルTM（ファルマシアから市販されている）または同等のサイズ排除樹脂である最終クロマトグラフィー工程のカラム体積の約５％とする。リン酸緩衝化セイライン，ｐＨ７．２〜７でサイズ排除カラムを平衡化し、溶離を行い、本発明方法で使用するために組み換えヒト・ＩＬ−１２のピークを集め、濾過する。蛋白精製の当業者は、別の精製方法を用いて、組み換え的に製造された本発明に使用するためのヒト・ＩＬ−１２を得ることもできる。
本来的にＩＬ−１２を産生する細胞の培養物または抽出液からＩＬ−１２を精製し、本発明に用いてもよい。本来的に産生されたＩＬ−１２に関する典型的な精製スキームはＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２およびＥＰ４３３８２７に記載されている。
本発明方法を実施することにおいて有用な、ＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２を含有する医薬組成物は、医薬上許容される担体、希釈剤、塩、バッファー、安定剤および／または当該分野で知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、投与された宿主に対して毒性がない物質を意味する。担体または他の物質の特性は投与経路に依存する。
種々の医薬組成物は、１ミリリットルあたり約０．１マイクログラムないし約１ミリグラムのＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２を含有すべきであると、現在のところ考えられる。
種々の投与経路で投与を行うことができる。腹腔内注射がＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２の好ましい投与方法である。静脈、皮内または皮下注射を用いてもよい。注射のためには、好ましくは、ＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２は、パイロジェン不含かつ非経口的に許容される水溶液の形態で投与されよう。当然考慮すべきｐＨ、等張性、安定性等を有する、かかる非経口的に許容される蛋白溶液の製造は当業者の範囲内である。
治療に使用するＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２の量は、症状の重さ、投与経路、ＩＬ−１２アンタゴニストのＩＬ−１２との反応性、またはＩＬ−１２の活性に依存するであろうし、最終的には、治療を行う者により決定されよう。本発明治療方法の実施に際して、治療上有効量のＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２を投与する。用語「治療上有効量」は、有意な患者の利益（例えば、治癒、改善、発症の遅延もしくは予防、再発もしくはぶり返しの防止）を示すに十分な本発明方法または組成物の各活性成分の総量を意味する。患者に投与すべき治療上有効量を決定するための１の通常の方法は、有意な患者の利益が治療を行う者により観察されるまで、定期的に用量を増加していく投与を行うことである。該用語を単独で投与される個々の活性成分に用いる場合、該用語は当該成分についてのみいう。該用語を組み合わせ投与に用いる場合、混合して、連続してあるいは同時に投与されるかどうかにかかわらず、該用語は、治療効果を生じる活性成分の合計量をいう。本発明におけるＩＬ−１２アンタゴニストの治療上有効量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇないし約２５ｍｇ／ｋｇの範囲であると考えられる。本発明におけるＩＬ−１２の治療上有効量は、約０．００１ないし約１０００μｇ／ｋｇの範囲であると考えられる。個々の患者および序湖面駅症状の重さに応じて投与回数を変更してもよい。
本発明の実施に用いるＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２を、単独で、あるいはステロイドもしくは他の抗炎症治療および他のサイトカインの投与のごとき他の自己免疫症状の治療と組み合わせて投与してもよい。
本発明方法を以下の実施例においてさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定せずに説明するものである。
実施例１
実験的なアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）はＴ細胞により媒介される中枢神経系（ＣＮＳ）の自己免疫疾患である。ミエリン抗原でマウスを免疫することにより、マウスの感受性株において疾病を誘導することができ、あるいは別法として、抗原刺激されたＣＤ４+Ｔ細胞を用いて感受性マウスに疾病を能動的に転移させることもできる［ペチネリ（Pettinelli）、ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J.Immnol.）、第１２７巻、１９８１年、１４２０頁］。ＥＡＥは、霊長類における多発性硬化症についての許容される動物モデルとして広く認識されている［アルボード（Alvord）ら編、１９８４年、イクスペリメンタル・アラージック・エンケファロミエリティス−ア・ユースフル・モデル・フォー・マルチプル・スクレロシス（Experimental allergic encephalomyelitis-A useful model for multiple sclerosis）、アラン・アリール・リス（Alan R.Liss）、ニューヨーク］。ミエリンプロテオリピッド蛋白（ＰＬＰ）の合成ペプチドでインビトロ再刺激された免疫されたマウス由来のリンパ球の養子転移後のＥＡＥ誘導に対するＩＬ−１２アンタゴニストの投与効果。
ＰＬＰで感作されたＬＮＣの養子転移
メスのＳＪＬ／Ｊマウス（７〜１０週）をザ・ジャクソン・ラボラトリー（The Jackson Laboratory）から購入し、５匹をケージに入れて標準的な齧歯類用飼料と任意に水を与えた。残基１３９〜１５１からなるマウス・ＰＬＰペプチド（ジェネティクス・インスティテュート（Genetics Institute）のジー・ブラウン（G.Brown）から提供された）１５０μｇをマウスの脇腹２カ所から免疫した。２ｍｇ／ｍｌのマイコバクテリア・ツベルクローシス（Mycobacteria Tuberculosis）Ｈ３７ＲＡ（ディフコ（Difco））を含有する完全フロイントのアジュバント２００μｌ中に入れてＰＬＰを投与した。免疫の日に、０．７５ｘ１０10個のバルダテラ・ペルツッシス（Bordatella pertussis）枯草菌（アサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ・パブリック・ヘルス・ラボラトリーズ（Massachusetts Public Health Laboratories））をマウスに静脈注射した。免疫１０日後、脾臓およびリンパ節（膝後面、腋の下および腕）を集め、１０％ＦＢＳ（ハイクロン（Hyclone））、５ｘ１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含有するＲＰＭＩ−１６４０中に細胞を再懸濁した。２μｇ／ｍｌの濃度でＰＬＰを培養物に添加した。９６時間後、細胞を集め、２回洗浄し、３０ｘ１０6個の細胞（ＬＮＣまたは脾臓細胞のいずれか）を無処理のＳＪＬ／Ｊマウスに腹腔内注射した。
疾病の臨床的評価
ＥＡＥの臨床的徴候についてマウスを観察し、以下のように０ないし３のスケールで評点づけを行った。
０．５−端部が弱かった尾
１．０−完全に弱った尾
１．５−弱った尾および後足の衰弱（不安定で重い足取り）
２．０−部分的な後足の麻痺
３．０−完全な両方の後足の麻痺
細胞転移前のＩＬ−１２インビトロ投与
細胞転移前に、組み換えネズミ・ＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ、ｒｍＩＬ−１２、ジェネティクス・インスティテュート）を、抗原を添加したリンパ節または脾臓細胞のインビトロ培養物に添加した。９６時間後、細胞を２回洗浄し、３０ｘ１０6個の細胞を無処理のＳＪＬ／Ｊマウスに転移し、続いて起こる疾病の経過に対するＩＬ−１２の効果を調べた。
別々の実験において、抗原のみ、抗原とＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、あるいは抗原とＩＬ−１２とＩＦＮ−γに対する中和抗体（５μｇ／ｍｌ、エンドジェン（Endogen）ら得た）とともに、ＬＮＣを培養した。培養期間の最後に上清を集め（３個のフラスコから集めた）、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ（ジェンザイム（Genzyme）から得た）により測定した。各群からの３０ｘ１０6個の細胞を無処理のマウスに転移させ、疾病の徴候をモニターした。
ＰＬＰで刺激されたＬＮＣの転移後のＩＬ−１２および抗ＩＬ−１２抗体のインビボ投与
３０ｘ１０6個または１０ｘ１０6個のＰＬＰで刺激されたＬＮＣの転移後、ｒｍＩＬ−１２（０．３μｇ／マウス、２００μｌ、腹腔内注射）をマウスに投与した。ＩＬ−１２を細胞転移０、１および２日目に投与した。対象マウスには同体積の担体のみを与えた。ＩＬ−１２がＰＬＰで刺激されたＬＮＣの転移後の疾病の誘導に関与しているかどうかを調べるために、１日おきに６または１２日間、全部でネズミ・ＩＬ−１２に対する２００μｇのヒツジ・ポリクローナル抗体で処理（２００μｌ、腹腔内注射）し、疾病の徴候についてマウスをモニターした。対照マウスには同量のヒツジ・ＩｇＧを与えた。マウスをモニターした。
ＰＬＰで感作されたＴ細胞の再刺激に対するｒｍＩＬ−１２のインビトロでの効果
方法のところで説明したようにＰＬＰで免疫したマウス由来のＬＮＣを、ｒｍＩＬ−１２（２０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において抗原で９６時間インビトロで処理し、その後、それらを無処理ＳＪＬ／Ｊマウスへの疾病の転移能について試験した。インビトロでＰＬＰのみで刺激されたＬＮＣを与えられたマウスは６ないし８日目の間に疾病の臨床的徴候を表した。すべての対照マウスはスコアが２またはそれ以上（７匹中７匹）であり、７匹中４匹が完全な後ろ足の麻痺を進行させ、１ないし４日間継続した（図１ａ）。すべての対照マウスは１９日目までに回復した。対照的に、ＰＬＰおよびＩＬ−１２とともにインビトロで培養された細胞を受け取ったマウスは、急速な臨床的徴候とともに重いＥＡＥを発症した（図１ａ）。６日目までには、７匹中４匹のマウスが２またはそれ以上の臨床スコアを有し、８日目までにはすべてのマウスが両方の後足の麻痺を発症していた。この特別な実験において、７匹中５匹のマウスが麻痺から回復しなかった。
さらに、ｒｍＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において抗原で９６時間インビトロで刺激されたＰＬＰ免疫マウス由来の脾臓細胞を試験して、それらが疾病を無処理ＳＪＬ／Ｊマウスに転移させることができるかどうかについて調べた。３０ｘ１０6個のＰＬＰ刺激脾臓細胞の養子転移後の疾病の重さは、同数のＰＬＰ刺激ＬＮＣにより誘導された疾病よりも軽く、５匹マウスのうち２匹が完全な後足の麻痺を発症し、残りの３匹のマウスは穏やかな疾病の徴候しか示さなかった（図１ｂ）。ＬＮＣに関して観察された結果と同様に、転移前の脾臓細胞のインビトロ培養物へのｒｍＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）の添加は引き続いて起こる疾病を悪化させた（図１ｂ）。ＰＬＰおよびｒｍＩＬ−１２で刺激された脾臓細胞を受け取ったマウスは、６日目までに臨床的徴候を表し、１２日目までには完全な後足の麻痺を進行させた。これらのマウスの平均麻痺期間は５．４日（２〜８日の範囲）であった。
ＰＬＰおよびＩＬ−１２でのＬＮＣのインビトロ刺激後のサイトカイン産生
抗原でのインビトロ刺激の間のサイトカイン産生に及ぼすＩＬ−１２の効果を調べるために、ＰＬＰで感作したマウス由来のＬＮＣを、ＰＬＰのみ、ＰＬＰとＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、またはＰＬＰ、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γに対する中和抗体とともに培養した。インビトロ培養の最後に、上清中のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより測定し、無処理マウスへの疾病の転移能に関して細胞を試験した。ＰＬＰでのＬＮＣのインビトロ刺激の間におけるＩＬ−１２添加は、細胞培養上清中のＩＦＮ−γの１０倍以上の増加およびＴＮＦ−αの２倍の増加を引き起こした（図２ａ）。抗原とＩＬ−１２とともにＬＮＣを培養している間のＩＦＮ−γに対する中和抗体の添加は、完全にＩＦＮ−γ検出をブロックしたが、上清中のＴＮＦ−αの増加には何の影響も及ぼさず、対照と比較してＴＮＦ−αは約２倍増加したままであった（αＩＦＮ−γ抗体に関して対照１００ｐｇ／ｍｌに対して１８０ｐｇ／ｍｌ）。さらにそのうえ、ＩＦＮ−γに対する中和抗体の存在下においてＰＬＰとＩＬ−１２でインビトロ刺激された細胞の転移はやはり、ＰＬＰおよびＩＬ−１２のみで刺激された細胞の転移後に見られたのと同じ動態および期間を伴う重い疾病を誘導することができた（図２ｂ）。
疾病の進行に対するＩＬ−１２インビボ投与の効果
３０ｘ１０6個のＰＬＰ刺激ＬＮＣの転移後、マウスにｒｍＩＬ−１２（０．３μｇ／マウス）またはセイラインを３日間与え、引き続き起こる疾病の経過をモニターした。対照における疾病の発症および進行は、両方の後足の完全麻痺を進行させている８０％のマウスに関してＬＮＣ転移後６〜８日の間に明らかとなった臨床的徴候に関して上で述べたのと同様であった。対照マウスにおける疾病のピークは約３日間継続し、その後、マウスは自発的に回復した（図３ａ）。同じインビトロ培養物から得た同数の感作されたＬＮＣの転移後から３日間のｒｍＩＬ−１２（０．３μｇ／マウス）の投与は疾病の経過を劇的に変化させた。徴候の発症時はＩＬ−１２処理マウスよりもわずかに早かったが（５日目）、引き続き起こる疾病のピークへの進行はすべてのマウスについて加速され、すべてのマウスは８日目までに完全な後足の麻痺を示した。麻痺の期間も有意に延長され、１４日間まで継続した（１１〜１４日間の範囲）。対照マウスが十分に回復した後も継続した長い麻痺を示した数匹のｒｍＩＬ−１２処理マウスを屠殺した。
別々の実験において、最適以下の数のＬＮＣ（１０ｘ１０6個）の転移後において、疾病の重さに対するｒｍＩＬ−１２のインビボ投与の効果を試験した。この少ない数のＬＮＣを受け取った対照マウスは温和な疾病を発症し（図３ｂ）、４匹の動物のうち１匹が完全な後足の麻痺を進行させ、残りの３匹の対照においては最小の疾病のみが進行した。対照的に、１０ｘ１０6個のＬＮＣ細胞の転移後にｒｍＩＬ−１２でインビボ処理したマウスは、すべてがスコア２またはそれ以上の完全な臨床的徴候を発症し、４匹のマウスのうち３匹が完全な後足の麻痺を進行させた。５ｘ１０6個程度のＬＮＣ細胞の転移後のｒｍＩＬ−１２の効果も明らかであり、５匹のマウスのうち３匹がスコア１に達した。この細胞数において、対照は疾病の徴候を示さなかった（データ示さず）。
疾病の経過に対する抗ＩＬ−１２抗体投与の効果
内在性ＩＬ−１２が疾病の転移に必須の役割を果たすかどうかを調べるために、３０ｘ１０6個のＰＬＰ刺激ＬＮＣ細胞の転移後、ネズミ・ＩＬ−１２に対するヒツジ・ポリクローナル抗体２００μｇでマウスを１日おきに６または１２日間にわたり処理した。対照には同量のヒツジ・ＩｇＧを与えた。ヒツジ・ＩｇＧ処理対照における臨床的徴候の発生は、ＰＬＰ刺激ＬＮＣを受け取った未処理マウスにおいて見られたのと同様であった（６〜７日目、図４ａ）。疾病の徴候を発症したすべての対照マウスはスコア２またはそれ以上であった（７０％のマウスが完全な麻痺を発症した）。転移後最初の６日間の抗ＩＬ−１２抗体の投与は疾病の重さを減じなかったが、臨床的徴候の発生は約７日間まで遅延された。次いで、これらのマウスは疾病を発症し、すべてのマウスのスコアは２またはそれ以上となり（８０％のマウスが完全な麻痺を発症した）、対照動物と同様の経時変化をたどった。抗ＩＬ−１２抗体の長期投与によりこの疾病転移の遅延が維持されうるかどうかを調べるために、我々は、ＰＬＰ刺激ＬＮＣの養子転移後１２日間にわたりマウスを処理した。ＰＬＰ刺激ＬＮＣの養子転移後１２日間にわたり１日おきに抗ＩＬ−１２抗体で処理したマウスは、より長く維持された疾病の発症の動態の遅延を示しただけでなく、劇的に臨床的疾病を減じ、５匹のマウスのうち２匹のみが穏やかな疾病の徴候を示したにすぎなかった（図４ｂ）。
実施例２
ＮＯＤ／ＬｔＪマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ）をＩＬ−１２で処理して、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）についての一般に受け入れられている動物モデル［クタニ（Kutani）ら、アドバ・イムノロ（Adv.Immunol.）第５１巻、１９９２年、２８５頁］についてのサイトカインの影響を調べた。メスのＮＯＤマウスは自発的に、膵臓におけるベータ細胞の破壊を伴うＩＤＤＭ様疾病を発症し、生後１２〜１４週あたりから尿中にグルコースを漏出する。発明者らの動物においては、メスのＮＯＤマウスは、生後３０週までに約８８％の疾病発生率を示す。
メスのＮＯＤマウスを２つの異なるプロトコールで処理した。処理Ａにおいては、生後９〜１１週において開始される２週間にわたる１週３回の腹腔内注射により１０、１または０．１μｇ（０．５、０．０５または０．００５ｍｇ／ｋｇ）のネズミ・ＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２）をマウスに与えた。処理Ｂにおいては、生後９週において開始される１週１回の腹腔内注射により１または０．１μｇのｍＩＬ−１２をマウスに与え、生後２５週まで処理を継続した。
３種すべての用量を与えられた処理Ａのマウスは、統計学的に有意な疾病発生率の減少を示し、１０μｇの用量が最も有効であった（疾病発生率１７％）（表１および図５参照）。毎週１μｇを与えられた処理Ｂのマウスは、測定可能な疾病発生率の変化を示さなかった（８０％）（表１および図６参照）。
本明細書に引用したすべての特許および文献を参照により本明細書に記載されているものと見なす。
ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）は、多くの事故免疫症状の発症、悪化および／または再発に関与している。例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＨＦ−αはともに、多発性硬化症［コフロン（Choflon）ら、ヨーロピアン・サイトカイン・ネットワーク（Eur.Cytokine Netw.）第３巻（６）、１９９２年、５２３〜５３１頁；シュタインマン（Steinman）、サイエンティフィック・アメリカン（Scientific American）、９月号、１０７〜１１４頁；ホフマン（Hofman）ら、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.）、第１７０巻、１９８９年、６０７〜６１２頁；パニッチ（Panitch）ら、ニューロロジー（Neurology）、第３７巻、１９８７年、１０９７〜１１０２頁］およびＩ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、ＩＤＤＭ）［カスタノ（Castano）ら、マニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Annu.Rev.Immunol.）、第８巻、１９９０年、６４７〜６７９頁；キャンベル（Campbell）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（J.Clin.Invest.）、第８７巻、１９９１年、７３９〜７４２頁］の経過に関連している。ＴＮＦ−αはリューマチ性関節炎の発症を促進することが見いだされており［フェルドマン（Feldman）ら、プログレス・イン・グロウス・ファクター・リサーチ（Progress in Growth Factor Reaearch）、第４巻、１９９２年、２４７〜２５５頁］、ＴＦＮ−γの投与は関節炎の対象における改善に関連している［ベイズ（Veys）ら、ジャーナル・オブ・リューマトロジー（J.Rheumatology）、第１５巻（４）、１９８８年、５７０〜５７４頁］。全身性紅斑性狼傷（ＳＬＥ）［フナウチ（Funauchi）ら、トーホク・ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Tohoku J.Exp.Med.）、第１６４巻、１９９１年、２５９〜２６７頁；バンクハースト（Bankhurst）、ジャーナル・オブ・リューマトロジー、第１４巻（補１３）、１９８７年、２７５〜２７８頁］、自己免疫甲状腺炎［タング（Tang）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol.）、第２３巻、１９９３年、２７５〜２７８頁］、および自己免疫性炎症性眼疾（例えば、自己免疫性ブドウ膜網膜炎）［チャーテリス（Charteris）ら、イムノロジー（Immunology）、第７５巻、１９９２年、４６３〜４６７頁］に関連した自己免疫疾患プロセスにおけるＩＦＮ−γの関与が研究により示されている。自己免疫性肺炎の発症［デグチ（Deguchi）ら、クリニカル・イクスペリメンタル・イムノロジー（Clin.Exp.Immunol.）、第８５巻、１９９１年、３９２〜３９５頁］およびおよびギラン−バレ症候群［バロン（Baron）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、第９０巻、１９９３年、４４１４〜４４１８頁］もＴＮＦ−α活性に関連している。
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に示されたように、本来は、Ｔ細胞および天然キラー細胞からＩＮＦ−γを誘導する因子として固定されたヘテロ二量体サイトカインである。ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２ではＩＬ−１２が天然キラー細胞刺激因子またはＮＫＳＦと呼ばれている。１９９１年６月２６日公開のＥＰ４３３８２７には、ＩＬ−１２が細胞障害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）として開示されている。さらに、よく知られた天然キラー細胞の細胞障害活性アクチベーターであるＩＦＮ−αおよびＩＬ−２で得られるレベルと比肩しうるレベルで標的細胞を溶解する能力を増大せることにより、ＩＬ−１２はインビトロにおいて天然キラー細胞を刺激する。同定されているＩＬ−１２のさらなるインビトロ活性は、ＴＮＦ−αの誘導；Ｔ細胞増殖の補助刺激因子としての誘導；ＩＬ−２により誘導される天然キラー芽細胞の増殖の抑制；ＩＬ−２により誘導されるＴ細胞受容体−γδ−陽性細胞の増殖の抑制；前駆細胞からのＴ細胞の分化抑制；Ｔｈ１増殖促進（Ｔｈ２増殖ではない）；Ｔ細胞の細胞障害活性の増強；細胞障害性リンパ球の発生促進；天然キラーおよび天然キラー芽細胞の細胞障害性活性の増強；ＩＬ−２で治療された患者の末梢血単核細胞におけるエクスビボでの天然キラー活性の増強；天然キラー細胞への分子付着の誘導；天然キラー芽細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムＢのｍＲＮＡの誘導；天然キラー細胞上のＩＬ−２受容体サブユニット（ｐ５５、ｐ７５）の誘導；ＩＦＮ−γ依存的機構および独立機構によるＩｇＥ合成の抑制；胎児胸腺器官培養物におけるＴ細胞発生の転調；および骨髄性およびＢ細胞の前駆細胞の増殖を促進するキットリガンド（kit ligand）との相乗作用を包含する。ＩＬ−１２の既知インビボ活性は、ＩＦＮ−γの誘導；脾臓、肝臓、肺ならびに腹腔内の天然キラー細胞活性の増強；アロ特異的細胞障害性リンパ球の発生促進；マウス・脾臓における髄質外造血の誘導：骨髄における造血の可逆的抑制；マウスにおける貧血、リンパ球減少症ならびに好中球減少症の可逆的誘導；抗ＩｇＤにより誘導されるＩｇＥ、ＩｇＧ１ならびにＩＬ−４のに発現抑制；トキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）処理されたＳＣＩＤマウスの生存率の上昇；クリプトコッカス・モデル（cryptococcoses model）での生体負荷の軽減；腫瘍増殖抑制；および腫瘍細胞に対する免疫性促進を包含する。さらにＩＬ−１２は、敗血症ショックのシュワルツマン反応モデルにおいてインビボ誘導される。
ＩＬ−１２はＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生を誘導することができるが、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのレベルにより影響される自己免疫疾患とＩＬ−１２のインビボでのレベルとの関係は確認されていない。さらにそのうえ、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αに関連した自己免疫疾患に対する、ＩＬ−１２または内在性ＩＬ−１２のアンタゴニスト（ＩＬ−１２抗体のごとき）の投与効果も試験されていない。
発明の概要
本発明は、自己免疫症状または疾患の治療（例えば、治癒、改善、遅延もしくは発症の予防、再発もしくはぶり返しの予防）方法を提供する。好ましい具体例において、症状は、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γからなる群より選択されるサイトカインのレベルの増大により促進されるものである。かかる症状は、多発性硬化症、全身性紅斑性狼傷、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、ギラン−バレ症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病および自己免疫性炎症性眼疾を包含するが、これらに限らない。多発性硬化症およびインスリン依存性糖尿病が、本明細書記載の本発明により治療するための特に好ましい症状である。
特定の具体例において、本発明治療方法は、治療上有効量のＩＬ−１２アンタゴニスト、好ましくは、ＩＬ−１２と免疫反応する抗体または他の種を哺乳動物対象に投与することからなる。特定の好ましい具体例において、約０．０５ないし約２５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．２ないし約２ｍｇ／ｋｇの用量でＩＬ−１２アンタゴニストを投与する。アンタゴニストを医薬上許容される担体と混合して投与することもできる。
他の具体例において、本発明方法は、治療上有効量のＩＬ−１２を哺乳動物対象に投与することからなる。特定の具体例において、約０．００１ないし約１０００μｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０１ないし約１００μｇ／ｋｇの用量でＩＬ−１２を投与してもよい。ＩＬ−１２を医薬上許容される担体と混合して投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＬＰおよびｒｍＩＬ−１２でインビトロ刺激されたリンパ節および脾臓細胞を用いる実験的アレルギー性脳髄膜炎（ＥＡＥ）の養子転移（adoptive transfer）に関するデータのグラフである。材料および方法に記載のごとく、ＰＬＰで免疫され、抗原のみ（白丸）または抗原および２０ｍｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−１２（黒丸）で刺激されたマウスから１０日後に脾臓およびリンパ節を集めた。３０ｘ１０6個の細胞を用いて疾病を転移させた。結果を、（ａ）リンパ節（ｎ＝７）および（ｂ）脾臓細胞（ｎ＝５）についての平均スコアとして表す。データは少なくとも２つの別個の実験のものを表す。実施例１参照。
図２は、ＰＬＰおよびＩＬ−１２でインビトロ刺激されたＬＮＣからのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生に関するデータのグラフである。ＰＬＰで免疫されたマウス由来のＬＮＣ（２．５ｘ１０6個／ｍｌ）を、３０ｘ１０6個の細胞を用いる細胞転移の９６時間前に、ＰＬＰのみ、ＰＬＰおよびｒｍＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、あるいはＰＬＰ、ｒｍＩＬ−１２および抗ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍｌ）とともに培養した。（ａ）プールされた培養物上清中の、ＥＬＩＳＡにより測定されたＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α。（ｂ）刺激されたリンパ節細胞の転移後の平均疾病スコア。ＰＬＰのみ、およびＰＬＰ＋ＩＬ−１２についてはｎ＝３、ＰＬＰ＋ＩＬ−１２＋抗−ＩＦＮ−γについてはｎ＝４。実施例１参照。
図３は、ＰＬＰで刺激されたＬＮＣを用いるＥＡＥの養子転移に対するＩＬ−１２のインビボ投与の効果に関するデータのグラフである。ＰＬＰで免疫されたマウス由来のＬＮＣを、材料および方法に記載されたように抗原とともに培養し、無処理のマウスに転移させた。ｒｍＩＬ−１２（０．３μｇ／マウス）を、細胞転移から０、１および２日目に投与し（黒丸）、マウスを疾病の徴候についてモニターした。対照マウスには同体積のセイラインを与えた（白丸）。（ａ）３０ｘ１０6個のＬＮＣ細胞の転移後の平均臨床スコア（ｎ＝５）。（ｂ）１０ｘ１０6個のＬＮＣ細胞の転移後の平均臨床スコア（ｎ＝４）。実施例１参照。
図４では、ＰＬＰで刺激されたＬＮＣを用いるＥＡＥの養子転移に対する抗ＩＬ−１２抗体のインビボ投与の効果に関するデータのグラフを示す。材料および方法に記載のごとくＰＬＰで免疫されたマウス由来のＬＮＣを抗原とともに培養し、３０ｘ１０6個の細胞を無処理マウスに転移させた。抗ＩＬ−１２抗体（ヒツジ・抗マウスポリクローナル抗体、２００μｇ／マウス）を、細胞転移の日に開始する腹腔内注射により投与した（黒丸）。対照マウスには等量のヒツジ・ＩｇＧを与えた（白丸）。（ａ）αＩＬ−１２抗体投与後の０ないし６日目までの隔日の平均臨床スコア。（ｂ）αＩＬ−１２抗体投与後の０ないし１２日目までの隔日の平均臨床スコア（ｎ＝５〜７）。実施例１参照。
図５および６は、ＩＬ−１２投与によるＮＯＤマウスにおける疾病発生率に関するデータのグラフを示す。
詳細な説明
本発明は、自己免疫疾患の治療方法を提供する。「自己免疫疾患」は、対象自身の免疫系が対象の細胞または組織に対して反応し、その細胞または組織にダメージを生じる症状である。かかるサイトカインの血清または組織レベルの増加がかかる自己免疫症状の発症、再発、あるいは発症促進を行う場合、特定の自己免疫症状は「サイトカインのレベルの上昇により促進される」。ＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αのレベルの上昇により促進される自己免疫症状は、多発性硬化症、全身性紅斑性狼傷、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、ギラン−バレ症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病および自己免疫性炎症性眼疾を包含するが、これらに限らない。
「ＩＬ−１２アンタゴニスト」は、（１）ＩＬ−１２に結合する種またはその生物学的に活性のあるフラグメント、および（２）受容体へのＩＬ−１２の結合を妨害する種または他の結合蛋白を包含する。ＩＬ−１２に結合するアンタゴニストは、抗体（モノ−またはポリクローナル）およびそのフラグメント（Ｆabフラグメントを包含する）、キメラ抗体ならびにそのフラグメント、レクチン、ＩＬ−１２受容体もしくはそのフラグメント、反応性ペプチドもしくはそのフラグメント、およびＩＬ−１２受容体の生物学的活性を模倣するように設計された有機小型分子を包含するが、これらに限らない。ＩＬ−１２の結合を妨害するアンタゴニストは、化学的もしくは遺伝学的に修飾されたＩＬ−１２のペプチド、ＩＬ−１２のサブユニットならびにそのフラグメント、ＩＬ−１２サブユニットのホモポリマーならびにそのフラグメント、およびＩＬ−１２受容体の生物学的活性を模倣するように設計された有機小型分子を包含するが、これらに限らない。好ましくは、ＩＬ−１２の結合を妨害するアンタゴニストは、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αを誘導する受容体へのＩＬ−１２の結合を妨害し、ＩＬ−１２が受容体に結合した場合と同レベルのかかる因子を誘導しない。
当業者によく知られた方法によりＩＬ−１２アンタゴニストを製造することができる。例えば、既知方法により抗体産生ハイブリドーマを得ることによりモノクローナルＩＬ−１２抗体を製造することができる（例えば、ゴディング（Goding）、１９８３年、モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Monoclonal antibodies:pinciples and practices）、アカデミック・プレス・インコーポレイテッド、ニューヨーク；ヨコハマ（Yokohama）、１９９２年、カレント・プロトコールズ・イン・イミュノロジー．ユニット２．５（Current Protocoles in Immunology.Unit2.5）中、「プロダクション・オブ・モノクローナル・アンチボディーズ（Production of Monoclonal Antibodies）」、グリーン・パブリッシング・アソシエイションおよびジョン・ウィリー・アンド・サンズ）。既知方法により、ＩＬ−１２またはそのフラグメントを哺乳動物対象に接種することによりＩＬ−１２に対するポリクローナル血清および抗体を製造することができる。チッゾナイト（Chizzonite）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.）、第１４８巻、１９９２年、３１１７頁には、ＩＬ−１２受容体の同定および単離が記載されている。既知方法により、所望抗体の開裂および収集によって、抗体、受容体または他の反応性ペプチドのフラグメントを対応する抗体から製造することができる（例えば、ゴディング、上記；アンドリュー（Andrew）ら、１９９２年、カレント・プロトコールズ・イン・イミュノロジー．ユニット２．８中、「フラグメンテイション・オブ・イムノグロブリンズ（Fragmentation of Immunoglobulins）」、グリーン・パブリッシング・アソシエイションおよびジョン・ウィリー・アンド・サンズ参照）。既知方法によりキメラ抗体を製造してもよい。
ＩＬ−１２を用いる本発明方法においては、所望の自己免疫症状の治療をすることができるかぎり、いかなる形態のＩＬ−１２を用いてもよい。例えば、ＩＬ−１２が、３５ｋＤサブユニットにジスルフィド結合した４０ｋＤサブユニットからなっていてもよい。ＩＬ−１２がヘテロ二量体である場合、４０ｋＤサブユニットはＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に示されたヒトＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットに対して実質的相同性を有し、同じＰＣＴ出願に示されたヒト・ＩＬ−１２の３５ｋＤサブユニットに対して実質的相同性を有する３５ｋＤサブユニットにジススフィド結合している。「実質的相同性」は、アミノ酸レベルで７５％以上の相同性を意味するが、哺乳動物対象における所望の自己免疫症状を治療する能力を保持していることを意味する。本発明に用いてもよいもう１つの形態のＩＬ−１２は、哺乳動物対象における所望の自己免疫症状を治療する能力のあるＩＬ−１２サブユニットである。かかるＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットは、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に開示されたヒト・ＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットに対して実質的相同性を有し、かかるＩＬ−１２の３５ｋＤサブユニットはかかるＰＣＴ出願に開示されたヒト・ＩＬ−１２の３５Ｄｋサブユニットに対して実質的相同性を有する。ＩＬ−１２の生物学的活性を保持しているＩＬ−１２サブユニットのフラグメントも、本発明による哺乳動物対象における自己免疫症状の治療に有用である。
本発明での使用に関し、適当な形質転換宿主においてＩＬ−１２サブユニットの一方または両方をコードしているＤＮＡ配列の発現により、ＩＬ−１２を組み換え的に製造することが好ましい。例えば、既知方法を用いて、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に示されたヒト・ＩＬ−１２をコードしているＤＮＡ配列をｐＥＤ（カウフマン（Kaufman）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第１９巻、４４８４〜４４９０頁（１９９１年））のごとき発現ベクターに結合する。かかる発現ベクターにおいて、既知方法を用いてＣＣＡＣＣのごとき、翻訳を最適化する配列（コザック，エム（Kozak,M.）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１２巻、８５７〜８７１頁（１９８４年））を開始コドンの５’側に付加してもよい。次いで、ＩＬ−１２サブユニットを含む発現ベクターを宿主細胞中に形質転換し、蛋白発現を誘導し、最大にしてヘテロ二量体ヒト・ＩＬ−１２を製造してもよい。ヘテロ二量体ＩＬ−１２の製造のために、ＩＬ−１２サブユニットをコードしているＤＮＡ配列が別々の発現プラスミド上に存在していてもよく、また、１つの発現プラスミド上に並んで存在していてもよい。
ＩＬ−１２のサブユニットまたはフラグメントを用いて本発明を実施する場合には、既知方法を用いて組み換え的にそれを製造してもよい。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２に示したヒト・ＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットをコードしているＤＮＡ配列を発現ベクターに結合し、宿主細胞中に形質転換し、発現を誘導し、最大にしてヒト・ＩＬ−１２の４０ｋＤサブユニットを製造してもよい。同様に、該ＰＣＴ出願に示したヒト・ＩＬ−１２の３５ｋＤサブユニットをコードしているＤＮＡ配列を発現ベクターに結合し、宿主細胞中に形質転換し、発現を誘導し、最大にして対応蛋白を製造してもよい。もちろん、ＩＬ−１２サブユニットをコードしている縮重ＤＮＡ配列を用いて本発明において使用するＩＬ−１２を製造してもよく、ＩＬ−１２サブユニットのアリール変異体をコードしているＤＮＡも同様に製造することができる。化学的または遺伝学的に修飾された形態のＩＬ−１２およびそのサブユニットを、上記ＰＣＴに出願に開示の方法により製造することもできる。
いずれの適当な発現ベクターを用いても本発明に使用するＩＬ−１２を製造することができる。哺乳動物での発現用には、上記ｐＥＤのほかに、ｐＥＦ−ＢＯＳ（ミズシマ（Mizushuma）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、第１８巻、５３２２頁（１９９０年））；ｐＸＭ、ｐＪＬ３ならびにｐＪＬ４（ゴウ（Gough）ら、ＥＭＢＯジャーナル第４巻、６４５〜６５３頁（１９８５年））；およびｐＭＴ２（ｐＭＴ２−ＶＷＦから誘導されたもの、ＡＴＣＣ番号６７１２２；ＰＣＴ／ＵＳ８７／０００３３参照）のごとき多数の発現ベクターが知られている。酵母、昆虫、および細菌細胞における使用に適する発現ベクターも知られている。
本発明において有用なＩＬ−１２の組み換え的製造に適する宿主細胞は、例えば、チャイニーズハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル・ＣＯＳ細胞、マウス・３Ｔ３細胞、マウス・Ｌ細胞、ＮＳＯ（ガルフル（Galfre）およびミルステイン（Milstein）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）第７３巻、３〜４６頁（１９８１年））のごとき骨髄腫細胞、幼若ハムスター・腎臓細胞等のごとき哺乳動物細胞を包含する。既知方法を用いての、ＩＬ−１２サブユニットをコードしているＤＮＡ配列での酵母、昆虫、および細菌細胞の形質転換、そして蛋白発現の誘導および増幅によりＩＬ−１２を製造してもよい。
組み換え的に製造されたＩＬ−１２を培地または細胞抽出液から慣用的精製法により精製することができる。市販蛋白濃縮フィルター、例えば、アミコン（Amicon）またはミリポア・ペリコン（Millipore Pellicon）限界濾過ユニットを用いてＩＬ−１２を含有する培地または細胞抽出液を濃縮してもよい。濃縮工程後、濃縮物をゲル濾過媒体のごとき精製マトリックスに適用することができる。別法として、アニオン交換樹脂、例えば、懸垂したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基材を用いることもできる。マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白精製に通常に使用される他のタイプのものであってもよい。別法として、カチオン交換工程を用いてもよい。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基からなる種々の不溶性マトリックスを包含する。さらに培養上清からのＩＬ−１２の精製は、１またはそれ以上のカラム工程、例えば、レクチン−アガロース、ヘパリン−トヨパールRまたはトバクロムブルー３ＧＡセファロースRによるカラム工程；あるいはフェニルエーテル、ブチルエーテル、もしくはプロピルエーテルのような樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー；あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーによるカラム工程を包含してもよい。最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、懸垂したメチルもしくは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて本発明および組成物に使用するＩＬ−１２をさらに精製することができる。上記精製工程のいくつかまたはすべてを種々組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換え蛋白を得ることができる。本発明に使用するＩＬ−１２サブユニットまたはフラグメントの精製は、ヘテロ二量体蛋白の精製のための最適プロトコールとは異なるかもしれない。
好ましくは、ヒト・ＩＬ−１２を上記のごとく組み換え的に製造する場合、以下の方法によりそれを精製してもよい。ヒト・ＩＬ−１２が産生されている細胞を濾過によってならし培地から除去し、１０〜３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８〜８．３で平衡化したＱ−セファロースファストフローTM（ファルマシア（Pharmacia）から市販されている）または同等のアニオン交換媒体にならし培地を負荷する。次いで、カラムを同じバッファーで十分に洗浄し、さらに３０〜４５ｍＭヒスチジン，ｐＨ５．１〜５．８で洗浄し、次いで、もとの平衡化バッファーで洗浄する。２０〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８〜８．５および０．１５〜０．５０Ｍ ＮａＣｌを含有するバッファーで組み換えヒト・ＩＬ−１２がカラムから溶離される。２０〜５０ｍＭ ＭＥＳ，ｐＨ５．７〜６．４で平衡化したＣＭ−セファロースファストフローTM（ファルマシアから市販されている）または同等のカチオン交換媒体に溶離物質を負荷し、同じバッファーで十分に洗浄する。２０〜４０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ６．８〜７．５および０．２〜０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するバッファーでカラムを洗浄する。ＣＭ−セファロースファストフローTMカラムに使用する溶離バッファーで洗浄され平衡化されたアミコンTMＳＩＹ３０または同等のスパイラルカートリッジ膜を用いて溶離物質を濃縮する。該物質を濃縮して、Ｓ２００セファクリルTM（ファルマシアから市販されている）または同等のサイズ排除樹脂である最終クロマトグラフィー工程のカラム体積の約５％とする。リン酸緩衝化セイライン，ｐＨ７．２〜７でサイズ排除カラムを平衡化し、溶離を行い、本発明方法で使用するために組み換えヒト・ＩＬ−１２のピークを集め、濾過する。蛋白精製の当業者は、別の精製方法を用いて、組み換え的に製造された本発明に使用するためのヒト・ＩＬ−１２を得ることもできる。
本来的にＩＬ−１２を産生する細胞の培養物または抽出液からＩＬ−１２を精製し、本発明に用いてもよい。本来的に産生されたＩＬ−１２に関する典型的な精製スキームはＰＣＴ／ＵＳ９１／０６３３２およびＥＰ４３３８２７に記載されている。
本発明方法を実施することにおいて有用な、ＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２を含有する医薬組成物は、医薬上許容される担体、希釈剤、塩、バッファー、安定剤および／または当該分野で知られた他の物質を含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、投与された宿主に対して毒性がない物質を意味する。担体または他の物質の特性は投与経路に依存する。
種々の医薬組成物は、１ミリリットルあたり約０．１マイクログラムないし約１ミリグラムのＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２を含有すべきであると、現在のところ考えられる。
種々の投与経路で投与を行うことができる。腹腔内注射がＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２の好ましい投与方法である。静脈、皮内または皮下注射を用いてもよい。注射のためには、好ましくは、ＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２は、パイロジェン不含かつ非経口的に許容される水溶液の形態で投与されよう。当然考慮すべきｐＨ、等張性、安定性等を有する、かかる非経口的に許容される蛋白溶液の製造は当業者の範囲内である。
治療に使用するＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２の量は、症状の重さ、投与経路、ＩＬ−１２アンタゴニストのＩＬ−１２との反応性、またはＩＬ−１２の活性に依存するであろうし、最終的には、治療を行う者により決定されよう。本発明治療方法の実施に際して、治療上有効量のＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２を投与する。用語「治療上有効量」は、有意な患者の利益（例えば、治癒、改善、発症の遅延もしくは予防、再発もしくはぶり返しの防止）を示すに十分な本発明方法または組成物の各活性成分の総量を意味する。患者に投与すべき治療上有効量を決定するための１の通常の方法は、有意な患者の利益が治療を行う者により観察されるまで、定期的に用量を増加していく投与を行うことである。該用語を単独で投与される個々の活性成分に用いる場合、該用語は当該成分についてのみいう。該用語を組み合わせ投与に用いる場合、混合して、連続してあるいは同時に投与されるかどうかにかかわらず、該用語は、治療効果を生じる活性成分の合計量をいう。本発明におけるＩＬ−１２アンタゴニストの治療上有効量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇないし約２５ｍｇ／ｋｇの範囲であると考えられる。本発明におけるＩＬ−１２の治療上有効量は、約０．００１ないし約１０００μｇ／ｋｇの範囲であると考えられる。個々の患者および序湖面駅症状の重さに応じて投与回数を変更してもよい。
本発明の実施に用いるＩＬ−１２アンタゴニストまたはＩＬ−１２を、単独で、あるいはステロイドもしくは他の抗炎症治療および他のサイトカインの投与のごとき他の自己免疫症状の治療と組み合わせて投与してもよい。
本発明方法を以下の実施例においてさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定せずに説明するものである。
実施例１
実験的なアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）はＴ細胞により媒介される中枢神経系（ＣＮＳ）の自己免疫疾患である。ミエリン抗原でマウスを免疫することにより、マウスの感受性株において疾病を誘導することができ、あるいは別法として、抗原刺激されたＣＤ４+Ｔ細胞を用いて感受性マウスに疾病を能動的に転移させることもできる［ペチネリ（Pettinelli）、ジャーナル・オブ・イミュノロジー（J.Immnol.）、第１２７巻、１９８１年、１４２０頁］。ＥＡＥは、霊長類における多発性硬化症についての許容される動物モデルとして広く認識されている［アルボード（Alvord）ら編、１９８４年、イクスペリメンタル・アラージック・エンケファロミエリティス−ア・ユースフル・モデル・フォー・マルチプル・スクレロシス（Experimental allergic encephalomyelitis-A useful model for multiple sclerosis）、アラン・アリール・リス（Alan R.Liss）、ニューヨーク］。ミエリンプロテオリピッド蛋白（ＰＬＰ）の合成ペプチドでインビトロ再刺激された免疫されたマウス由来のリンパ球の養子転移後のＥＡＥ誘導に対するＩＬ−１２アンタゴニストの投与効果。
ＰＬＰで感作されたＬＮＣの養子転移
メスのＳＪＬ／Ｊマウス（７〜１０週）をザ・ジャクソン・ラボラトリー（The Jackson Laboratory）から購入し、５匹をケージに入れて標準的な齧歯類用飼料と任意に水を与えた。残基１３９〜１５１からなるマウス・ＰＬＰペプチド（ジェネティクス・インスティテュート（Genetics Institute）のジー・ブラウン（G.Brown）から提供された）１５０μｇをマウスの脇腹２カ所から免疫した。２ｍｇ／ｍｌのマイコバクテリア・ツベルクローシス（Mycobacteria Tuberculosis）Ｈ３７ＲＡ（ディフコ（Difco））を含有する完全フロイントのアジュバント２００μｌ中に入れてＰＬＰを投与した。免疫の日に、０．７５ｘ１０10個のバルダテラ・ペルツッシス（Bordatella pertussis）枯草菌（アサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ・パブリック・ヘルス・ラボラトリーズ（Massachusetts Public Health Laboratories））をマウスに静脈注射した。免疫１０日後、脾臓およびリンパ節（膝後面、腋の下および腕）を集め、１０％ＦＢＳ（ハイクロン（Hyclone））、５ｘ１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含有するＲＰＭＩ−１６４０中に細胞を再懸濁した。２μｇ／ｍｌの濃度でＰＬＰを培養物に添加した。９６時間後、細胞を集め、２回洗浄し、３０ｘ１０6個の細胞（ＬＮＣまたは脾臓細胞のいずれか）を無処理のＳＪＬ／Ｊマウスに腹腔内注射した。
疾病の臨床的評価
ＥＡＥの臨床的徴候についてマウスを観察し、以下のように０ないし３のスケールで評点づけを行った。
０．５−端部が弱かった尾
１．０−完全に弱った尾
１．５−弱った尾および後足の衰弱（不安定で重い足取り）
２．０−部分的な後足の麻痺
３．０−完全な両方の後足の麻痺
細胞転移前のＩＬ−１２インビトロ投与
細胞転移前に、組み換えネズミ・ＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ、ｒｍＩＬ−１２、ジェネティクス・インスティテュート）を、抗原を添加したリンパ節または脾臓細胞のインビトロ培養物に添加した。９６時間後、細胞を２回洗浄し、３０ｘ１０6個の細胞を無処理のＳＪＬ／Ｊマウスに転移し、続いて起こる疾病の経過に対するＩＬ−１２の効果を調べた。
別々の実験において、抗原のみ、抗原とＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、あるいは抗原とＩＬ−１２とＩＦＮ−γに対する中和抗体（５μｇ／ｍｌ、エンドジェン（Endogen）ら得た）とともに、ＬＮＣを培養した。培養期間の最後に上清を集め（３個のフラスコから集めた）、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ（ジェンザイム（Genzyme）から得た）により測定した。各群からの３０ｘ１０6個の細胞を無処理のマウスに転移させ、疾病の徴候をモニターした。
ＰＬＰで刺激されたＬＮＣの転移後のＩＬ−１２および抗ＩＬ−１２抗体のインビボ投与
３０ｘ１０6個または１０ｘ１０6個のＰＬＰで刺激されたＬＮＣの転移後、ｒｍＩＬ−１２（０．３μｇ／マウス、２００μｌ、腹腔内注射）をマウスに投与した。ＩＬ−１２を細胞転移０、１および２日目に投与した。対象マウスには同体積の担体のみを与えた。ＩＬ−１２がＰＬＰで刺激されたＬＮＣの転移後の疾病の誘導に関与しているかどうかを調べるために、１日おきに６または１２日間、全部でネズミ・ＩＬ−１２に対する２００μｇのヒツジ・ポリクローナル抗体で処理（２００μｌ、腹腔内注射）し、疾病の徴候についてマウスをモニターした。対照マウスには同量のヒツジ・ＩｇＧを与えた。マウスをモニターした。
ＰＬＰで感作されたＴ細胞の再刺激に対するｒｍＩＬ−１２のインビトロでの効果
方法のところで説明したようにＰＬＰで免疫したマウス由来のＬＮＣを、ｒｍＩＬ−１２（２０μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において抗原で９６時間インビトロで処理し、その後、それらを無処理ＳＪＬ／Ｊマウスへの疾病の転移能について試験した。インビトロでＰＬＰのみで刺激されたＬＮＣを与えられたマウスは６ないし８日目の間に疾病の臨床的徴候を表した。すべての対照マウスはスコアが２またはそれ以上（７匹中７匹）であり、７匹中４匹が完全な後ろ足の麻痺を進行させ、１ないし４日間継続した（図１ａ）。すべての対照マウスは１９日目までに回復した。対照的に、ＰＬＰおよびＩＬ−１２とともにインビトロで培養された細胞を受け取ったマウスは、急速な臨床的徴候とともに重いＥＡＥを発症した（図１ａ）。６日目までには、７匹中４匹のマウスが２またはそれ以上の臨床スコアを有し、８日目までにはすべてのマウスが両方の後足の麻痺を発症していた。この特別な実験において、７匹中５匹のマウスが麻痺から回復しなかった。
さらに、ｒｍＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下において抗原で９６時間インビトロで刺激されたＰＬＰ免疫マウス由来の脾臓細胞を試験して、それらが疾病を無処理ＳＪＬ／Ｊマウスに転移させることができるかどうかについて調べた。３０ｘ１０6個のＰＬＰ刺激脾臓細胞の養子転移後の疾病の重さは、同数のＰＬＰ刺激ＬＮＣにより誘導された疾病よりも軽く、５匹マウスのうち２匹が完全な後足の麻痺を発症し、残りの３匹のマウスは穏やかな疾病の徴候しか示さなかった（図１ｂ）。ＬＮＣに関して観察された結果と同様に、転移前の脾臓細胞のインビトロ培養物へのｒｍＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）の添加は引き続いて起こる疾病を悪化させた（図１ｂ）。ＰＬＰおよびｒｍＩＬ−１２で刺激された脾臓細胞を受け取ったマウスは、６日目までに臨床的徴候を表し、１２日目までには完全な後足の麻痺を進行させた。これらのマウスの平均麻痺期間は５．４日（２〜８日の範囲）であった。
ＰＬＰおよびＩＬ−１２でのＬＮＣのインビトロ刺激後のサイトカイン産生
抗原でのインビトロ刺激の間のサイトカイン産生に及ぼすＩＬ−１２の効果を調べるために、ＰＬＰで感作したマウス由来のＬＮＣを、ＰＬＰのみ、ＰＬＰとＩＬ−１２（２０ｎｇ／ｍｌ）、またはＰＬＰ、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γに対する中和抗体とともに培養した。インビトロ培養の最後に、上清中のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡにより測定し、無処理マウスへの疾病の転移能に関して細胞を試験した。ＰＬＰでのＬＮＣのインビトロ刺激の間におけるＩＬ−１２添加は、細胞培養上清中のＩＦＮ−γの１０倍以上の増加およびＴＮＦ−αの２倍の増加を引き起こした（図２ａ）。抗原とＩＬ−１２とともにＬＮＣを培養している間のＩＦＮ−γに対する中和抗体の添加は、完全にＩＦＮ−γ検出をブロックしたが、上清中のＴＮＦ−αの増加には何の影響も及ぼさず、対照と比較してＴＮＦ−αは約２倍増加したままであった（αＩＦＮ−γ抗体に関して対照１００ｐｇ／ｍｌに対して１８０ｐｇ／ｍｌ）。さらにそのうえ、ＩＦＮ−γに対する中和抗体の存在下においてＰＬＰとＩＬ−１２でインビトロ刺激された細胞の転移はやはり、ＰＬＰおよびＩＬ−１２のみで刺激された細胞の転移後に見られたのと同じ動態および期間を伴う重い疾病を誘導することができた（図２ｂ）。
疾病の進行に対するＩＬ−１２インビボ投与の効果
３０ｘ１０6個のＰＬＰ刺激ＬＮＣの転移後、マウスにｒｍＩＬ−１２（０．３μｇ／マウス）またはセイラインを３日間与え、引き続き起こる疾病の経過をモニターした。対照における疾病の発症および進行は、両方の後足の完全麻痺を進行させている８０％のマウスに関してＬＮＣ転移後６〜８日の間に明らかとなった臨床的徴候に関して上で述べたのと同様であった。対照マウスにおける疾病のピークは約３日間継続し、その後、マウスは自発的に回復した（図３ａ）。同じインビトロ培養物から得た同数の感作されたＬＮＣの転移後から３日間のｒｍＩＬ−１２（０．３μｇ／マウス）の投与は疾病の経過を劇的に変化させた。徴候の発症時はＩＬ−１２処理マウスよりもわずかに早かったが（５日目）、引き続き起こる疾病のピークへの進行はすべてのマウスについて加速され、すべてのマウスは８日目までに完全な後足の麻痺を示した。麻痺の期間も有意に延長され、１４日間まで継続した（１１〜１４日間の範囲）。対照マウスが十分に回復した後も継続した長い麻痺を示した数匹のｒｍＩＬ−１２処理マウスを屠殺した。
別々の実験において、最適以下の数のＬＮＣ（１０ｘ１０6個）の転移後において、疾病の重さに対するｒｍＩＬ−１２のインビボ投与の効果を試験した。この少ない数のＬＮＣを受け取った対照マウスは温和な疾病を発症し（図３ｂ）、４匹の動物のうち１匹が完全な後足の麻痺を進行させ、残りの３匹の対照においては最小の疾病のみが進行した。対照的に、１０ｘ１０6個のＬＮＣ細胞の転移後にｒｍＩＬ−１２でインビボ処理したマウスは、すべてがスコア２またはそれ以上の完全な臨床的徴候を発症し、４匹のマウスのうち３匹が完全な後足の麻痺を進行させた。５ｘ１０6個程度のＬＮＣ細胞の転移後のｒｍＩＬ−１２の効果も明らかであり、５匹のマウスのうち３匹がスコア１に達した。この細胞数において、対照は疾病の徴候を示さなかった（データ示さず）。
疾病の経過に対する抗ＩＬ−１２抗体投与の効果
内在性ＩＬ−１２が疾病の転移に必須の役割を果たすかどうかを調べるために、３０ｘ１０6個のＰＬＰ刺激ＬＮＣ細胞の転移後、ネズミ・ＩＬ−１２に対するヒツジ・ポリクローナル抗体２００μｇでマウスを１日おきに６または１２日間にわたり処理した。対照には同量のヒツジ・ＩｇＧを与えた。ヒツジ・ＩｇＧ処理対照における臨床的徴候の発生は、ＰＬＰ刺激ＬＮＣを受け取った未処理マウスにおいて見られたのと同様であった（６〜７日目、図４ａ）。疾病の徴候を発症したすべての対照マウスはスコア２またはそれ以上であった（７０％のマウスが完全な麻痺を発症した）。転移後最初の６日間の抗ＩＬ−１２抗体の投与は疾病の重さを減じなかったが、臨床的徴候の発生は約７日間まで遅延された。次いで、これらのマウスは疾病を発症し、すべてのマウスのスコアは２またはそれ以上となり（８０％のマウスが完全な麻痺を発症した）、対照動物と同様の経時変化をたどった。抗ＩＬ−１２抗体の長期投与によりこの疾病転移の遅延が維持されうるかどうかを調べるために、我々は、ＰＬＰ刺激ＬＮＣの養子転移後１２日間にわたりマウスを処理した。ＰＬＰ刺激ＬＮＣの養子転移後１２日間にわたり１日おきに抗ＩＬ−１２抗体で処理したマウスは、より長く維持された疾病の発症の動態の遅延を示しただけでなく、劇的に臨床的疾病を減じ、５匹のマウスのうち２匹のみが穏やかな疾病の徴候を示したにすぎなかった（図４ｂ）。
実施例２
ＮＯＤ／ＬｔＪマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ）をＩＬ−１２で処理して、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）についての一般に受け入れられている動物モデル［クタニ（Kutani）ら、アドバ・イムノロ（Adv.Immunol.）第５１巻、１９９２年、２８５頁］についてのサイトカインの影響を調べた。メスのＮＯＤマウスは自発的に、膵臓におけるベータ細胞の破壊を伴うＩＤＤＭ様疾病を発症し、生後１２〜１４週あたりから尿中にグルコースを漏出する。発明者らの動物においては、メスのＮＯＤマウスは、生後３０週までに約８８％の疾病発生率を示す。
メスのＮＯＤマウスを２つの異なるプロトコールで処理した。処理Ａにおいては、生後９〜１１週において開始される２週間にわたる１週３回の腹腔内注射により１０、１または０．１μｇ（０．５、０．０５または０．００５ｍｇ／ｋｇ）のネズミ・ＩＬ−１２（ｍＩＬ−１２）をマウスに与えた。処理Ｂにおいては、生後９週において開始される１週１回の腹腔内注射により１または０．１μｇのｍＩＬ−１２をマウスに与え、生後２５週まで処理を継続した。
３種すべての用量を与えられた処理Ａのマウスは、統計学的に有意な疾病発生率の減少を示し、１０μｇの用量が最も有効であった（疾病発生率１７％）（表１および図５参照）。毎週１μｇを与えられた処理Ｂのマウスは、測定可能な疾病発生率の変化を示さなかった（８０％）（表１および図６参照）。
Claims (9)
- 哺乳動物対象における自己免疫症状を治療するための医薬組成物であって、治療上有効量のＩＬ−１２特異的抗体またはＩＬ−１２結合活性を有するそのフラグメントを含む医薬組成物。
- 該自己免疫症状がＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γからなる群より選択されるサイトカインのレベルの上昇により促進されるものである請求項１の医薬組成物。
- 該自己免疫症状が、多発性硬化症、全身性紅斑性狼傷、リューマチ性関節炎、自己免疫性肺炎、ギラン−バレ症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病および自己免疫性眼疾からなる群より選択されるものである請求項２の医薬組成物。
- 該自己免疫症状が多発性硬化症である請求項３の医薬組成物。
- 該抗体またはＩＬ−１２結合活性を有するそのフラグメントが０．０５ないし２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される請求項１の医薬組成物。
- 該抗体またはＩＬ−１２結合活性を有するそのフラグメントが医薬上許容される担体と混合されて投与される請求項１の医薬組成物。
- 該自己免疫症状がインスリン依存性糖尿病である請求項３記載の医薬組成物。
- 該抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される請求項１記載の医薬組成物。
- 該ＩＬ−１２結合活性を有するフラグメントがＦａｂおよびＦ（ａｂ'）2からなる群より選択される請求項１記載の医薬組成物。
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