DE69927520T2

DE69927520T2 - Verwendung von il-12 antikörpern zur behandlung von psoriasis

Info

Publication number: DE69927520T2
Application number: DE69927520T
Authority: DE
Inventors: Rolf Ehrhardt; Kenneth Hong; Cary Queen
Original assignee: Protein Design Labs Inc
Current assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: CA2353520A1; JP2002531123A; EP1336654A1; EP1137766B1; ATE305506T1; ES2251248T3; US6410824B1; WO2000034459A1; US20140314756A1; US9072725B2; JP3579355B2; JP2004231667A; EP1137766A4; DK1137766T3; JP4671265B2; CA2353520C; US9078876B2; EP1137766A1; US20020194631A1; US20030056233A1

Description

EINFÜHRUNG
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft die Behandlung von Psoriasis, umfassend die Verabreichung von Antikörpern.
Hintergrund
Psoriasis ist eine chronische Hauterkrankung, die durch Schuppen und Entzündung gekennzeichnet ist. Psoriasis beeinträchtigt 1,5 bis 2 Prozent der US-Bevölkerung oder fast 5 Millionen Menschen. Sie tritt in allen Altersgruppen und etwa zu gleichen Anteilen bei Männern und Frauen auf. Menschen mit Psoriasis haben Beschwerden, eine eingeschränkte Beweglichkeit der Gelenke und einen emotionalen Leidensdruck. Wenn sich eine Psoriasis entwickelt, werden Teile der Haut dick, gerötet und überziehen sich mit silbrigen Schuppen, die als Plaque bezeichnet werden. Psoriasis tritt am häufigsten an den Ellbogen, Knien, der Kopfhaut, dem unteren Rücken, im Gesicht, an den Handflächen und Fußsohlen auf. Die Erkrankung kann auch die Fingernägel, Fußnägel und die weichen Gewebe im Mund und den Genitalien befallen. Etwa 10 Prozent der Menschen mit Psoriasis haben eine Gelenksentzündung, die Arthritissymptome erzeugt.
Wenn die Haut verletzt ist, wird ein Wundheilprogramm eingeleitet, das auch als regenerative Maturation bekannt ist. Eine eine Verletzung betreffende Psoriasis ist in diesem alternativen Wachstumsprogramm durch Zellwachstum gekennzeichnet. Auf vielerlei Weise ähnelt eine psoriatische Haut einer Hautheilung von einer Wunde oder einer Reaktion auf einen Auslöser, wie eine Infektion, bei der die Keratinozyten vom normalen Wachstumsprogramm auf regenerative Maturation umschalten. Zellen werden geschaffen und in nur 2 bis 4 Tagen an die Ober fläche geschoben, und die Haut kann die Zellen nicht schnell genug loswerden. Die übermäßigen Hautzellen häufen sich an und bilden erhöhte schuppige Läsionen. Die weißen Schuppen („Plaque" genannt), die gewöhnlich die Läsion abdecken, bestehen aus toten Hautzellen, und die Röte der Läsion wird durch eine vermehrte Blutversorgung im Gebiet von sich schnell teilenden Hautzellen bewirkt.
Die genaue Ursache für Psoriasis beim Menschen ist nicht bekannt, obwohl allgemein angenommen wird, dass sie eine genetische Komponente hat, und in einer neueren Untersuchung festgestellt wurde, dass sie eine Autoimmunkomponente besitzt. Ob eine Person tatsächlich Psoriasis entwickelt, hängt vermutlich davon ab, ob etwas ihr Auftreten „auslöst". Beispiele für potentielle „auslösende Faktoren" sind systemische Infektionen, eine Verletzung der Haut (das Koebner Phänomen), Impfungen, bestimmte Medikationen und intramuskuläre Injektionen oder orale Steroidmedikationen.
Die chronische Hautentzündung der Psoriasis steht mit hyperplastischen epidermalen Keratinozyten und infiltrierenden mononukleären Zellen, einschließlich CD4+-T-Gedächtniszellen, Neutrophilen und Makrophagen, in Verbindung. Wegen dieses stark gemischten Entzündungsbilds und der sich daraus ergebenden komplexen Zusammenhänge zwischen diesen unterschiedlichen Zellen ist es sehr schwierig, die Mechanismen zu analysieren, die der Einleitung und dem Fortschreiten der Erkrankung zugrunde liegen.
Relevante Literatur

Gottlieb u.a. (1995) Nat. Med. 1:442-7 behandelte Patienten mit Fragmenten von Diphtherietoxin, das mit humanem Interleukin-2 (DAB389IL-2) verbunden ist, welches selektiv auf aktivierte T-Zellen nicht aber Keratinozyten gerichtet ist. Sie wiesen eine signifikante klinische Verbesserung nach, was zeigt, dass T-Zellen nicht aber Keratinozyten die pathogene Hauptkomponente der Erkrankung sind.
WO 98/41232 offenbart die Verwendung von anti-IL-12-Antikörpern zum Modulieren der Ansprechbarkeit auf Corticosteroide, um Komplikationen in Verbindung mit einer Steroidverwendung zu verhindern.
WO 98/16248 offenbart die Verwendung von anti-IL-12-Antikörpern zum Erhöhen der oralen Antigentoleranz. Beide Dokumente beschreiben die Verwendung von anti-IL-12-Antikörpern in Kombinationstherapien als Modulatoren für die Wirkung des jeweiligen Therapeutikums, d.h. Corticosteroids oder eines Antigens.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines anti-Interleukin-12-Antikörpers zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zum Behandeln von Psoriasis. Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse bezüglich der Behandlung von psoriatischen Mäusen mit Antikörper für IL-12 zeigt. Jede Balkengruppe entspricht einem Experiment. Der durchschnittliche Histologiewert, der durch jeden Balken dargestellt wird, ist darüber angegeben. α-IL-12 steht für anti-IL-12.
2 ist eine schematische Darstellung, die von Woche 14 bis 18 die Schwere der Erkrankung, wie mittels durchschnittlicher Ohrdicke gemessen, von psoriatischen Mäusen, die mit anti-IL-12-Antikörper behandelt wurden, im Vergleich zu Mäusen, die mit einem zum Isotyp passenden Kontrollantikörper (Isotyp) behandelt wurden, zeigt.
BESCHREIBUNG DER SPEZIELLEN AUSÜFHRUNGSFORMEN
Tabelle 1
Therapie mit Antikörpern, die IL-12 neutralisieren
In der vorliegenden Erfindung werden Mittel, die die Wirkungen der Lymphokine Interleukin 12 (IL-12) blockieren, dazu verwendet, um einen Patienten mit Psoriasis zu behandeln. Bei dem Mittel handelt es sich um einen Antikörper, insbesondere einen monoklonaler Antikörper, der IL-12 bindet. Der monoklonale Antikörper kann von jeder geeigneten Art, z.B. Maus, Ratte, Hamster usw., durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (siehe im Allgemeinen Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, 1988) abgeleitet werden. Vorzugsweise ist der Antikörper chimerisch (siehe z.B. Cabilly u.a., US-Patent Nr. 4,816,567) oder humanisiert, d.h. gebildet durch Binden der komplementären determinierenden Regionen (CDR) eines nicht humanen Antikörpers an ein im Wesentlichen humanes Gerüst und konstante Region durch rekombinante DNA-Verfahren (siehe z.B. Queen u.a., US-Patent Nr. 5,585,089). Alternativ kann der Antikörper human sein, wie z.B. durch das Trioma-Verfahren (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,634,664) oder von transgenen Tieren (siehe z.B. Lonberg u.a., WO 93/12227 und Kucherlapati, WO 91/10741) oder durch Phagendisplayverfahren (siehe z.B. Dower u.a., WO 91/17271 und McCafferty u.a., WO 92/01047 und Winter WO 92/20791) erzeugt.
Vorzugsweise hat der monoklonale Antikörper eine Bindungsaffinität (Assoziationskonstante) für sein Antigen von mindestens 10⁸ M^–1 oder besonders bevorzugt von 10⁹ M^–1 oder höher. Ganz besonders bevorzugt neutralisiert der Antikörper IL-12, das heißt blockiert eine oder mehr seiner biologischen Funktionen, zum Beispiel die Fähigkeit, an den Zellrezeptor zu binden. Andere Funktionen, die durch einen neutralisierenden Antikörper blockiert werden können, sind für IFN-γ in der üblicherweise übertragenen vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 60/110,523 und für IL-12 in Gately u.a., US-Patent Nr. 5,780,597 und Gately u.a. WO 99/37682 beispielhaft gezeigt, z.B. das Blockieren der IFN-γ induzierenden Funktion von IL-12. Vorzugsweise blockiert eine Konzentration von 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5 oder 10 μg/ml des Antikörpers 25 %, 50 %, 90 %, 95 %, 99 % oder im Wesentlichen 100 % der Funktion des jeweiligen Lymphokins, insbesondere wenn das Lymphokin auch in einer dieser Konzentrationen oder in einer molaren Konzentration, d.h. 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5 oder 1,0 der Antikörperkonzentration, verwendet wird. Beispielhafte IL-12 neutralisierende Antikörper sind 5F2, 16F2, 16G2 und 20E11 (wie in Gately u.a. WO 99/37682 beschrieben) und ihre chimären und humanisierten Formen. Andere bevorzugte Antikörper haben dieselben oder überlappende Epitope wie die zuvor erwähnten Antikörper, d.h. sie konkurrieren (kreuzweise blockieren) mit ihnen hinsichtlich der Antigenbindung, oder bei ihnen werden einige derselben Aminosäuren des Antigens mittels in-vitro-Mutagenese gezeigt, um zur Bindung beizutragen. Besonders bevorzugte anti-IL-12 Antikörper binden an das p75 IL-12 Heterodimer nicht aber an die einzelnen Untereinheiten, wie beispielsweise p40.
Alternativ kann anstatt eines Antikörpers, ein extrazellulärer Teil eines zellulären Rezeptors (oder seiner Bindungs-Untereinheit) für IL-12 rekombinant mit der Fc-Region eines humanen Immunglobulins (z.B. IgG1) verbunden werden, um seine Halbwertszeit oder andere Eigenschaften zu verbessern. Siehe beispielsweise Ashkenazi u.a. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-9 und Moosmayer u.a. (1995), J. Interferon Cytokine Res. 15:1111-5) für Verfahren zum Aufbauen von solchen Fusionsproteinen („Immunadhäsine"). Rezeptoren für IL-12 und IFN-γ werden in Chua u.a. (1994), J. Immunol. 253:128-36 bzw. Presky u.a. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14002-7 bzw. Aguet u.a. (1988), Cell 55:273-80 beschrieben. Das Fusionsprotein bindet an und neutralisiert IL-12 bzw. IFN-γ und hat Eigenschaften ähnlich einem Antikörper und kann daher für die Behandlung von Psoriasis verwendet werden. Nachfolgend soll der Begriff „Antikörper" auch Fusionsproteine dieses Typs umfassen.
Zur Verabreichung an Patienten wird der Antikörper- (oder das Fusionsprotein-) Medikament typischerweise in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert: Eine Auswahl von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z.B. Wasser für Injektionszwecke (WFI) oder Wasser, das mit Phosphat, Citrat, Acetat usw. bis zu einem pH-Wert von typischerweise 5,0 bis 8,0, meist 6,0 bis 7,0 gepuffert ist, und/oder Salze, wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw., zur Isotonisierung enthält. Der Träger kann auch Hilfsstoffe, wie beispielsweise humanes Serumalbumin, Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren, wie beispielsweise Arginin, Histidin oder Glycin, enthalten, um das aktive Protein zu schützen. Die Antikörperkonzentration in diesen Formulierungen kann umfangreich von etwa 0,01 bis 100 mg/ml variieren, liegt aber meist im Bereich von 1 bis 10 mg/ml. Der formulierte Antikörper ist besonders für die parenterale Verabreichung geeignet und kann als intravenöse Infusion oder subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion gegeben werden und kann auch durch Injektion in die erkrankte Stelle, z.B. in die psoriatischen Läsionen, injiziert werden.
Die Medikamentendosen enthalten typischerweise 0,01 bis 100 mg Antikörper (oder Fusionsprotein), meist aber 0,1 bis 1 oder 1, 2 oder 5 bis 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht oder als Einheitsdosis eine Menge, die ausreicht, um die Krankheit zu lindern, ohne unannehmbare Nebenwirkungen hervorzurufen („therapeutisch wirksame Dosis"). Das Antikörper-Medikament kann einmal oder mehrere Male verabreicht werden, z.B. 1-, 2- oder 3-mal täglich, wöchentlich oder monatlich für ein oder mehrere Tage, Wochen, Monate oder Jahre, oder andauernd, je nach der Natur und Schwere der Erkrankung. Der Antikörper wird oft nach oder in Kombination mit einer oder mehreren immunsuppressiven Medikamenten oder anderen Therapien, zum Beispiel Corticosteroide, Cyclosporin, Methotrexat, Phototherapie (mit oder ohne PUVA) oder andere, die in der Tabelle 1 oben aufgeführt sind, verabreicht. Der anti-IL-12-Antikörper kann auch zusammen oder in Kombination mit anderen Antikörpern, zum Beispiel Adhäsionsmolekülen oder Lymphokinen, wie beispielsweise CD11a, CD40-Ligand, IL-8 oder ihre Rezeptoren (z.B. IL-2 Rezeptor), verwendet werden.
Die Schwere der Psoriasis wird mittels des Psoriasis Area Severity Index (PASI) (siehe z.B. Fleischer u.a. (1999), J. Dermatol. 26:210-215 und Tanew u.a. (1999), Arch Dermatol. 135:519-524) oder verschiedener Psoriasis-Globalbewertungswerten gemessen, wie beispielsweise dem Physician's Global Assessment (PGA), die dem Fachmann für klinische Psoriasisversuche bekannt sind. Die Behandlung mit dem (z.B. humanisierten oder humanen) Antikörper für IL-12 reduziert den PASI (oder Globalbewertungswert) um mindestens 25 % oder 40 %, vorzugsweise aber um 50 % oder sogar 60 oder 70 % oder mehr bei mindestens 50 % vorzugsweise aber 60–70 % oder 75 % oder mehr der behandelten Patienten. Alternativ bewirkt eine solche Behandlung eine größere Reduzierung bei einer kleineren Patientengruppe, d.h. mindestens 75 % vorzugsweise aber 80–90 % oder mehr oder sogar im Wesentlichen vollständige Klärung bei mindestens 20 bis 25 % vorzugsweise aber 30 % bis 40 % oder sogar 50 % oder mehr der Patienten. Diese Verringerung währt typischerweise mindestens 2 vorzugsweise aber 3 oder mehr Monate oder sogar 4 bis 6 oder mehr Monate, ganz besonders bevorzugt vorzugsweise ein Jahr oder länger, entweder während die Behandlung mit dem Antikörper fortgesetzt wird oder nachdem diese gestoppt wurde. Typischerweise ist in einem klinischen Versuch (z.B. einem Versuch der Phase II oder Phase III) die Verbesserung des PASI oder Werts bei den Patienten, die mit anti-IL-12 Antikörper behandelt wurden, bezüglich der Patientenkontrollgruppe, die keine Behandlung oder Placebo oder ein anderes Mittel erhielten, statistisch signifikant und lag zum Beispiel auf dem Niveau von p = 0,05 oder 0,01 oder sogar 0,001.
Alternativ kann der Antikörper für IL-12 nach der induzierten Remission durch ein anderes Medikament, zum Beispiel Corticosteroide, Cyclosporin, Methotrexat, Phototherapie (mit oder ohne PUVA) oder andere in der Tabelle 1 oben aufgeführte Mittel, verabreicht werden. In diesem Fall erhöht die Behandlung mit dem Antikörper die mittlere Rückfallszeit (z.B. 50 % Verschlechterung bei PASI) um mindestens 40 % vorzugsweise aber 50 % und ganz besonders bevorzugt 60–70 % oder mehr oder sogar 100 % (Verdoppelung) oder mehr. Typischerweise ist in einem klinischen Test (z.B. ein Versuch der Phase II oder Phase III) dieser Anstieg der Rückfallszeit bei den mit den anti-IL-12 behandelten Patienten bezüglich der Patientenkontrollgruppe, die keine Behandlung oder Placebo oder ein anderes Mittel erhalten hatte, statistisch signifikant und liegt zum Beispiel auf dem Niveau von p = 0,05 oder 0,01 oder sogar 0,001.
Es wird davon ausgegangen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die bestimmten Verfahren, Protokolle, Zelllinien, Tierarten oder -gattungen, Konstrukte und beschriebenen Reagenzien beschränkt sind, da diese variieren können. Es wird auch davon ausgegangen, dass die hier verwendete Terminologie nur zum Beschreiben der bestimmten Ausführungsformen dient und nicht den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken soll, wobei der Umfang durch die Sprache in den Ansprüche bestimmt wird.
Es ist zu beachten, dass die Singularformen „ein/-e/-er", „und" und „der/die/das", wie hier und in den beigefügten Ansprüchen verwendet, Pluralbezüge umfassen, wenn durch den Zusammenhang nichts anderes angegeben wird. Daher umfasst zum Beispiel der Bezug auf „eine Maus" ein Vielzahl solcher Mäuse und der Bezug auf „das Zytokin" beinhaltet den Bezug auf ein oder mehr Zytokine und Äquivalente davon, die dem Fachmann bekannt sind, und so weiter.
Wenn nicht anders angegeben, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie dem Durchschnittsfachmann, auf dessen Gebiet diese Erfindung liegt, üblicherweise bekannt sind. Obwohl alle Verfahren, Einrichtungen und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, zur Durchführung oder zum Testen der Erfindung verwendet werden können, werden nun die bevorzugten Verfahren, Einrichtungen und Materialien beschrieben.
Die oben und im Text erörterten Veröffentlichungen werden nur bezüglich ihrer Offenbarung vor dem Einreichungstag der vorliegenden Anmeldung berücksichtigt. Hier soll nichts als Zugeständnis dafür ausgelegt werden, dass die Erfinder nicht berechtigt sind, eine solche Offenbarung im Zusammenhang mit der früheren Erfindung vorzunehmen.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um den Durchschnittsfachmann die vollständige Offenbarung und Beschreibung, wie die vorliegende Erfindung durchzuführen und zu verwenden ist, zur Verfügung zu stellen, und sollen den Umfang dessen, was als Erfindung angesehen wird, nicht einschränken. Es wur den Bemühungen unternommen, die Genauigkeit der verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur, Konzentrationen usw.) sicherzustellen, aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen sollten einkalkuliert werden. Wenn nicht anders angegeben sind Teile Gewichtsteile, das Molekulargewicht ist das durchschnittliche Molekulargewicht, die Temperaturangabe erfolgt in Grad Celsius; und der Druck liegt bei oder nahe dem atmosphärischen Druck.
VERSUCHE
Beispiel 1
Materialien und Verfahren
Mäuse. Weibliche BALB/cj-Mäuse und BALB/cj-IFNγ^–/–-Mäuse (Spendermäuse) wurden von Jackson Labs (Bar Harbor, ME) erworben. C.B-17/lcr-scid/scid-Mäuse und C.B-17-scid.beige-Doppelmutantenmäuse (Empfängermäuse) wurden von Taconic (Germantown, NY) erworben. Alle Mäuse wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung auf dem Protein Design Labs Tiergelände untergebracht und im Alter zwischen 4 und 12 Wochen verwendet. Sentinel-Mäuse wurden zum Screenen auf die folgenden Pathogene verwendet: MHV, Sendai, PVM, REO3, TMEV GDVIII, M. pulmonis und Parvovirus. Willkürliche Screens von Mäusen auf Madenwürmer wurden auch durchgeführt. Keiner der oben angeführten Pathogene wurde zu irgendeinem Zeitpunkt festgestellt. Es wurden pro Mikroisolator 2–5 Mäuse untergebracht. Alle scid/scid- oder scid/beige-Mäuse wurden mit Handschuhen unter einer Abzugshaube der Klasse II angefasst, mit sterilem Futter und Wasser nach Belieben gefüttert und in einem Laminarströmungszelt (Bioclean Maywood, NJ) in sterilen Mikroisolatoren, die wöchentlich gewechselt wurden, gehalten. Die Spendermäuse wurden in herkömmlichen Käfigen untergebracht, die wöchentlich gewechselt wurden.
Zellreinigung und Injektion in scid/scid-Mäuse. Die Milz wurde von 6 bis 12 Wochen alten Spendermäusen (BALB/cj oder IFNγ^–/–-BALB/cj) und Splenozyten durch mechanische Homogenisierung der ganzen Milz isoliert. CD4⁺-T-Zellen wurden durch positive Selektion gesammelt. Kurz, eine Zellsuspension von gepoolten Splenozyten von 4 bis 5 Spendermäusen wurde mit Magnetkügelchen (DYNABEADS: Katalog # 114.05, Dynal, Lake Success, NX), die mit anti-CD4 (L3T4) Antikörper beschichtet waren, für 2 bis 30 Minuten bei 4°C inkubiert und mittels Magnetzellensortierung mit einem Dynal Magnetic Particle Concentrator (MPC) getrennt. Die Zellen wurden aus dem Zell-Kügelchen-Komplex mit Dynal DETACHaBEAD entfernt und von den Kügelchen mittels Dynal MPC getrennt. Die sich ergebende mit CD4⁺ angereichterte Population betrug > 90 % rein. Die Zellsuspension (10 × 10⁶ Zellen/ml) wurde dann mit Fc-Blockierung inkubiert (anti-CD32, PharMingen, 01241A) (10 μg/ml) und mit anti-CD4-FITC (PharMingen, 9004D) und anti-CD45RB-PE (PharMingen, 01145A) (beide 10 μg/ml) 30 Minuten lang bei 4°C markiert, gewaschen und mittels eines FACSTAR (Becton Dickinson, San Jose, CA) Zellsortierers sortiert. Doppelt positive Zellen (CD4⁺/CD45Rb⁺) wurden gesammelt und die Zellen, die hohe Niveaus an CD45RB (hellste 45 %) exprimierten, ausgewählt. Die gesammelte Zellpopulation betrug > 90 % rein und war lebensfähig. Die Zellen wurden dann in kalter Kalium gepufferte Kochsalzlösung (PBS Sigma D8662) gewaschen und in PBS bei 1,5 × 10⁶ Zellen/ml erneut suspendiert. C.B-17/lcr scid/scid-Mäusen im Alter von 4 bis 6 Wochen wurde intravenös jeweils 3 × 10⁵ Zellen, Gesamtvolumen 200 ml, in die Schwanzvene injiziert.
Einleiten und Behandlung von psoriasiformen Läsionen bei scid-Mäusen. Um die Wirkung von mikrobiellen Produkten und IL-12 zu untersuchen, wurden Empfängermäuse wie folgt behandelt: Eine Kontrollgruppe erhielt mittels CD4⁺CD45Rb^hi sortierte Zellen ohne zusätzliche Behandlung. Einer zweiten Gruppe wurde 20 μg Lipopolysaccharid (LPS) von Salmonella enteritidis (Sigma L-2012) i.p. pro Maus am Tag 1 nach der Zellübertragung gegeben. Eine dritte Gruppe erhielt 10 ng IL-12 (Pharmingen, CA) als solches pro Maus, das i.p. an den Tagen 1 und 3 verabreicht wurde. Der abschließenden Gruppe wurde i.p. eine Kombination aus LPS und IL-12 injiziert. Dosierungsuntersuchungen wurden mittels 2, 10 und 100 ng Dosen IL-12 in Verbindung mit 20 μg LPS durchgeführt. Die LPS- und IL-12-Injektion wurde am Tag 1 nach dem T-Zellenübertragung gegeben und eine zusätzliche Dosis IL-12 wurde am Tag 3 verabreicht. In zusätzlichen Untersuchungen wurden LPS (20 μg) und IL-12 (10 ng) nur einmal wöchentlich 3 Wochen lang verabreicht. Einige Versuchsgruppen erhielten 10 μg Staphylokokkus-Enterotoxin B-Protein von Staphylococcus aureus (Sigma Katalog S4881) i.p. pro Maus einmal am Tag 1 nach der T-Zellenübertragung.
Um die Rolle von IFNγ zu untersuchen, wurden T-Zellen von BALB/c-IFNγ^–/–-Mäusen (Jackson Labs) durch dieselben, oben beschriebenen Verfahren isoliert. Empfänger-scid/scid-Mäusen wurde auch gleichzeitig 20 μg LPS und 10 ng IL-12 am Tag 1 und 10 ng IL-12 am Tag 3 injiziert. Darüber hinaus wurden scid-beige-Mäuse (Taconic), die einen Mangel an T-, B- und NK-Zellen hatten, bei einigen Experimenten als Empfängermäuse für die IFNγ^–/–-T-Zellübertragung verwendet. Für vermittelnde Untersuchungen wurde 0,5 mg anti-IL-12 (Clone C17.8, Phar-Mingen, San Diego, CA) i.p. am Tag 7 und 35 den Mäusen gegeben. Die Kontrollmäuse erhielten entweder PBS oder Ratten-IgG (Sigma) an demselben Tag.
Klinische Bewertung. Die Mäuse wurden durch drei unterschiedliche Untersuchende in wöchentlichen Intervallen, die in der 4. Woche anfingen und in der 10. Woche endeten, bewertet. Um den Krankheitsverlauf festzuhalten, wurden semiquantitative klinische Werte von 0 bis 4 auf der Grundlage der physikalischen Erscheinung und Ohrdicke erstellt. 0 = keine Haut- oder Ohrsymptome; 1 = leichtes, mäßiges Erythem an den Ohren oder Augenlidern mit einer leichten Verdickung des Ohrs (< 2 % der Körperoberfläche); 2 = mäßiges bis schweres Erythem an einer Stelle (meist Ohr und Gesicht) (2 – 10 % der Körperoberfläche), leichtes Abschuppen; 3 = starkes Erythem an zwei oder mehr Stellen (Ohr, Gesicht, Rumpf) (> 10 % der Körperoberfäche), starkes Schuppen; 4 = sehr schweres ausgedehntes Erythem über den ganzen Körper (> 20 % der Körperoberfläche) mit schwerem Schuppen. Bestimmte Beobachtungen auf der Grundlage des Fellzustands, der Ohrmanifestationen, Augenliderscheinung, des Vorhandenseins einer Entzündung an den Gliedern und dem Schwanz wurden zur Kenntnis genommen. Die Ohrdicke wurde mit einer modifizierten Feder-Mikrometerschraube (Oditest; Dyer, Inc.) bestimmt. Die Messungen erfolgten von demselben Teil des Ohrs für alle Datenzeitpunkte sowohl vom rechten als auch linken Ohr. Die Mikrometerschraube wurde sich beruhigen gelassen, während sie sich am Ohr befand, um zu verhindern, dass ein Gewebeödem die abschließende Messung beeinträchtigte.
Histopathologische Analyse und Immunhistologie der Hautgewebeproben. Nekropsien wurden an den Mäusen in der Woche 10–12 nach der Zellübertra gung durchgeführt. Gewebeproben vom Ohr, Augenlid und Schwanz wurden gesammelt und in Paraformaldehydlösung fixiert und Comparative Bioscience (Sunnyvale, CA) zur Schnittherstellung und Analyse vorgelegt. Um die Schwere der Erkrankung festzuhalten, wurden semiquantitative histologische Werte von 0 bis 4 auf der Grundlage der Schwere der Entzündung vergeben. Die anfängliche histologische Bewertung wurde von einem unabhängigen, nicht dazugehörigen Pathologen durchgeführt. Bei späteren Untersuchungen wurde eine Bewertung blind von drei verschiedenen Untersuchern durchgeführt. Mäusen, die eine Ohrdicke von 25 μm oder weniger ohne zusätzliche klinische Zeichen hatten, wurde automatisch ein Histologiewert von Null ohne Schnittanalyse gegeben. 0 = keine Entzündungszeichen; 1 = sehr geringe Herdinfiltrationsgebiete, leichte Akanthose; 2 = geringes Niveau an mononukleärer Zellinfiltration, leichte Verdickung der Epidermis, leichte bis mäßige Akanthose; 3 = hohes Niveau an mononukleärer Zellinfiltration, hohe vaskuläre Dichte, Verdickung der Epidermis (Akanthose, Retezapfen und Hyperplasie der Epidermis und Keratinozyten, Mikroabzesse, Verdünnung der granulären Zellschicht; 4 = sehr umfangreiche Infiltration in Epidermis und Dermis, sehr hohe vaskuläre Dichte, extreme Verdickung der Epidermis, Pustelbildung und Zerstörung von granulären Zellschichten.
Gewebeproben wurden gesammelt und in Tissue Tek OCT-Verbindung eingebettet und mit Trockeneis für Kryostatschnitte gefroren. Gewebeschnitte (5 μm) wurden in 100 % Aceton fixiert und mit PE-konjugiertem IL-12 mAb (p40/70) (Pharmingen, Klon C17.8) gefärbt. Die Gewebe wurden als positiv oder negativ auf der Grundlage von visueller Fluoreszenzmikroskopieerfassung bewertet.
Die Haut infiltrierende Lymphozytenzelltrennung. Die Haut infiltrierende Lymphozyten (SIL) wurden über Enzymverdau isoliert. Kurz, es wurden die Haut, die Ohren und Augenlider mit sterilen Scheren zerkleinert und die Stücke wurden mit HBSS auf einem 100 mm Nylon-Zellsieb (Falcon) gewaschen, um Oberflächenablagerungen zu entfernen. Infiltrierende Zellen wurden durch Inkubation der geschnittenen Stücke in 25 ml warmen (37°C) HBSS-Medien ohne Ca/Mg (BioWhittaker, Walkersville, MD 10-543F), ergänzt mit 25 mM HEPES-Puffer (BioWhittaker 17-737E) und 10 % FCS (HyClone Labs Inc., Logan, UT SH30071.03) für 20 min bei 37°C freigesetzt. Die verbleibenden Stücke wurden auf Nylonnetz gewa schen, in RPMI 1640 Medien (BioWhittaker 12-702F), angereichert mit 25 mM HEPES-Puffer, 10 % FCS, 400 U/ml DNAse (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN 104159), 400 U/ml Collagenase (Boehringer Mannheim 1088874) erneut suspendiert und 90 Minuten lang bei 37°C auf einem Kipper inkubiert. Die sich ergebende Zellsuspension wurde sequentiell durch ein 100 μm und 40 μm Nylon-Netzfilter filtriert und dann zweimal in RPMI 1640, ergänzt mit 25 mM HEPES und 10 % FCS, gewaschen.
In-vitro-Stimulation von SIL und Erfassen von Zytokinen. SIL wurde bei 10⁶/ml in kompletten Medien RPMI 1640, ergänzt mit 10 % FBS (HyClone), 3 × 10^–6 M 2-Mercaptoethanol (Sigma), 2 mM Glutamin (Life Technologies), 10 U/ml Penicillin/100 μg Streptomycin (Life Technologies) und 15 mM HEPES, erneut suspendiert. CD4⁺-sortierte T-Zellen wurden bei 2,5 × 10⁵/ml erneut suspendiert. 200 μl dieser Suspension pro Loch wurde dann in einer 96er Gewebekulturplatte (Falcon 3072) gegeben und 48 Stunden mit αCD3 (PDL, Klon 145-2C11) und αCD28 (Pharmingen) jeweils 1 μg/ml, inkubiert. Die Überstände von drei unterschiedlichen Kulturlöchern wurden gesammelt und mit ELISA auf IFNγ, α und IL-4 getestet. Das ELISA-Verfahren umfasste das Überziehen einer 96er Flachboden-Immulon 4-Platte (Dynatech Labs, Inc 011-010-3850) bei 4°C über Nacht mit 50 μl einer 2 μg/ml Lösung von anti-IFNγ, anti-TNFα oder anti-IL4 Antikörper (alle von Pharmingen) in Carbonatpuffer. Die Platten wurden dann mit PBS/Tween (0,05 % Tween 20 in PBS) gewaschen und mit 200 μl steriler PBS-Lösung mit 3 % BSA (Sigma Rinderalbumin A7030) 1 Stunde bei 37°C blockiert. Zwischen allen folgenden Schritten wurden die Platten mit PBS/Tween gewaschen. IFNγ-, IL-4- und TNFα-Standards sowie Probenüberstände wurden dann den Löchern zugesetzt und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Biotin konjugierte sekundäre Antikörper für anti-IFNγ, anti-TNFα anti-II-4 (alle Antikörper von Pharmingen) wurden dann den jeweiligen Platten bei 2 μg/ml in 3 % BSA/PBS-Lösung zugesetzt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiertes Streptavidin (Jackson ImmunoResearch Labs 016-030-084) wurde dann in einer Konzentration von 1 μg/ml zugesetzt. O-Phenylendiamin (Sigma 4664) wurde dann als Substratpuffer pro Herstellerprotokoll verwendet. Ein Assay wurde dann auf einem Molecular Devices (Sunnyvale, CA) Plattenleser gelesen und die Daten wurden mittels der SOFTmax^TM-Software analysiert.
Ergebnisse
Behandlung von scid/scid-Mäusen, die mit CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen mit LPS plus niedrigen und mittleren Dosen von IL-12 wiederhergestellt wurden, führt zu höherem Auftreten und Schwere der Psoriasis; hohe Dosen an IL-12 verhindern die Einleitung einer Erkrankung. Frühere Studien haben gezeigt, dass scid/scid-Mäuse, die mit geringen Haplotyp fehlangepassten CD4⁺/CD45Rb^hi Balb/c T-Zellen wieder hergestellt wurden, manchmal eine chronische Hautentzündung entwickeln, die einer humanen Psoriasis ähnelt. In ersten Experimenten wurde festgestellt, dass, wenn BALB/c-CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen allein auf C.B-17-scid/scid-Mäuse übertragen wurden, nur ein paar Tiere psoriasiforme Läsionen zeigten und die Expression der Erkrankung ziemlich leicht war. Dieser Befund stimmte mit den vorherigen Beobachtungen, die von Schon u.a. (1997) supra gemacht wurden, überein. Weil, wie gezeigt wurde, bakterielle Mitogene oder bakterielle Superantigene potente Modulatoren von zellvermittelten Immunreaktionen waren und IL-12 eine wichtige Rolle bei der Induktion von verschiedenen Autoimmunzuständen spielte, wurde zuerst getestet, ob die gleichzeitige Verabreichung von solchen Mitteln eine Wirkung auf die Induktion der Psoriasis im scid/scid-Übertragungsmodell hat. Wie in der Tabelle 2 gezeigt ist, entwickelten, wenn die C.B-17-scid/scid-Mäuse mit BALB/c-CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen allein wiederhergestellt wurden, nur 38 % der Mäuse psoriasiforme Hautläsionen und nur 27 % der Mäuse entwickelten schwere Formen der Erkrankung. Wenn nur LPS gleichzeitig verabreicht wurde, beobachteten wir einen leichten Anstieg des Erkrankungsauftretens (50 %), aber die Schwere der Läsionen blieb ähnlich den Läsionen bei Mäusen, die nur Zellen erhalten hatten. In ähnlicher Weise führte die gleichzeitige Verabreichung einer mittleren Dosis (10 ng/Maus) IL-12 allein am Tag 1 und 3 nach der T-Zellübertragung zu einem offensichtlichen Anstieg des Erkrankungsauftretens (67 %), ohne dass die Schwere der Erkrankung beeinflusst wurde. Tabelle 2. In vivo-Verabreichung von IL-12 in Kombination mit LPS nach CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellübertragung führt zu einem signifikanten Anstieg der Erkrankungsexpression.

¹ Nachdem CD4⁺/CD45RBhi-Zellen, die aus BALB/cj-Milzen isoliert wurden, auf scid/scid-Mäuse übertragen wurden, wurden die Empfängermäuse wie folgt behandelt. Die PBS-Gruppe erhielt sortierte Zellen ohne zusätzliche Behandlung. Die IL-12-Gruppe erhielt 10 ng IL-12 als solches pro Maus, gegeben i.p. an den Tagen 1 und 3 zusätzlich zu Zellen am Tag 0. Die LPS-Gruppe erhielt 20 μg Lipopolysaccharid (LPS) von Salmonella enteritidis (Sigma L-2012) pro Maus am Tag 1 nach der Zellübertragung. Dosierungsstudien wurden mittels der niedrigen (2 ng), mittleren (10 ng) oder hohen (100 ng) Dosen von IL-12 in Kombination mit 20 μg LPS gegeben. Die LPS- und IL-12-Injektionen wurden am Tag 1 gegeben und eine zusätzliche Dosis IL-12 wurde am Tag 3 verabreicht. In einer unterschiedlichen Experimentenreihe wurden LPS (20 μg) und IL-12 (10 ng) einmal pro Woche drei Wochen lang injiziert. Andere Mäuse erhielten 10 μg Staphylococcal enterotoxid B Protein von Staphylococcus aureus (Sigma Katalog S48881) pro Maus einmal am Tag eins.
² Das Erkrankungsauftreten wird als Zahl der Mäuse wiedergegeben, die über 12 Wochen diese Krankheit hatten: die Kriterien waren die Ohrdicke ≥ 26 μm oder die klinischen Werte ≥ 1. Die Ohrdicke von normalen scid/scid-Mäusen: 21 ± 1 μm (n = 10).
³Die histologischen Werte von erkrankten Mäusen von 1 bis 4 erfolgten auf der Grundlage der Schwere der Entzündung von Ohr, Haut oder Augenlid. Die Mäuse, die eine Ohrdicke von 25 μm oder weniger hatten, wurden als nicht erkrankt (durchschnittliche Ohrdicke von nicht erkrankten Mäusen 22 μm ± 1) kategorisiert und automatisch aus der Schnittanalyse ausgeschlossen. 0 = keine Entzündungszeichen; 1 = sehr niedriges Niveau und 2 = niedriges Niveau an mononukleärer Zellinfiltration, leichte Verdickung der Epidermis; 3 = hohes Niveau an mononukleärer Zellinfiltration, hohe vaskuläre Dichte, Verdickung der Epidermis (Akanthose, Retezapfen und Hyperplasie der Epidermis und Keratinozyten); 4 = sehr ausgedehnte mononukleäre Zellinfiltration in der Epidermis und Dermis, sehr hohe vaskuläre Dichte, extreme Verdickung der Epidermis, Pustelbildung und Verlust der granulären Zellschichten. p gegenüber PBS-Kontrolle: LPS + IL-12 niedrig, p < 0,1, LPS + II-12 mittel, p < 0,008. Statistische Analyse wurde mittels des zweiseitigen Studenten-T-Tests durchgeführt.
⁴ Schwere Erkrankungseinleitung berechnet als Zahl der Tiere, die einen durchschnittlichen Histologiepunkt von ≥ 2,5 und/oder einen klinischen Werkt von ≥ 3 erhielten.
⁵ LPS (20 μg) und IL-12 (10 ng) wurden einmal die Woche 3 Wochen lang gegeben.
⁶ 3 × 10⁵ unsortierte CD4⁺-T-Zellen (CD45Rb^hi und CD45Rb^to) wurden auf scid/scid-Mäuse übertragen. LPS (20 μg) und IL-12 (10 ng) wurden einmal wöchentlich 3 Wochen lang gegeben.

Im Gegensatz dazu zeigten Empfängermäuse, die entweder 1 oder 10 ng IL-12 am Tag 1 und Tag 3 zusammen mit 20 μg LPS am Tag 1 nach einer T-Zellübertragung erhielten, ein Ansteigen bei der Schwere und dem Auftreten der Erkrankung. Insbesondere zeigte die Verabreichung von mittleren Dosen von IL-12 (10 ng/Maus) zusammen mit LPS ein 73 %iges Auftreten der Erkrankung mit einem durchschnittlichen Histologiewert der erkrankten Mäuse von 2,25 ± 1,1, was signifikant höher war, als wenn PBS gleichzeitig verabreicht wurde (p < 0,008). Darüber hinaus war der prozentuale Anteil der Tiere mit schwerer Erkrankung in der mittleren IL12-Dosisgruppe auch höher (42 %) im Vergleich zu der niedrigen IL-12-Dosisgruppe (36 %) und signifikant höher im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe (27 %). Interessanterweise hemmte die gleichzeitige Verabreichung von LPS (20 μg/Maus) und eine hohe Dosis IL-12 (100 ng/Maus) vollständig die Entwicklung der Erkrankung (Auftreten 0 %). Wenn LPS und mittlere Dosen IL-12 (10 ng) gleichzeitig einmal pro Woche drei Wochen lang verabreicht wurden, betrug das Auftreten der Erkrankung 80 % (8/10) mit einem durchschnittlichen klinischen Wert von 2,5 ± 1 (Tabelle 2). Dieses spezielle Induktionsprotokoll war auch mit einem beschleunigten Krankheitsbeginn verbunden, wenn die Tiere in dieser Gruppe schon 4 Wochen nach der T-Zellübertragung erkrankten. Im Gegensatz dazu entwickelten Tiere, die nur eine Dosis LPS und IL-12 (10 ng) erhalten hatten, die Krankheit im Durchschnitt 6–8 Wochen nach der T-Zellübertragung und Tiere, die T-Zellen erhielten, entwickelten Krankheitszeichen im Durchschnitt erst 8 bis 10 Wochen nach der T-Zellübertragung.
Tiere, die unsortierte CD4⁺-T-Zellen erhalten hatten, erkrankten nie, selbst wenn sie mit drei Verabreichungen LPS (20 μg) und IL-12 (10 ng) behandelt wurden (Tabelle 2), was zeigt, dass eine LPS- und IL-12-Verabreichung nur auf naive T-Zellen wirken kann und die regulatorischen Wirkungen von CD45Rb^to-Zellen können nicht durch die Verabreichung von mikrobiellen Faktoren und IL-12 überwunden werden. Es ist festzuhalten, dass Mäuse, die keine T-Zellen oder nur T-Zellen allein erhielten, zusammen mit Mäusen untergebracht waren, die T-Zellen plus LPS und IL-12 erhielten, um sicherzustellen, dass andere exogene Faktoren keine Rolle bei der Einleitung der Erkrankung spielten.
Bei einer anderen Experimentenreihe wurde getestet, ob andere mikrobielle Produkte, wie beispielsweise SEB, auch einen Einfluss auf die Krankheitsexpression ausüben. Wie in der Tabelle 2 gezeigt ist, konnte SEB die Krankheit mit einem stärkeren Auftreten und einer stärkeren Schwere einleiten (durchschnittlicher klinischer Wert 1,5 ± 0,9) als Zellen allein; auf diese Weise wird gezeigt, dass die Fähigkeit von bakteriellen Bestandteilen, die Expression von psoriasiformen Läsionen zu modulieren, für LPS nicht einzigartig ist.
Außerdem wurde in gesonderten Zellübertragungsuntersuchungen festgestellt, das scid/scid-Mäuse, die Zellen erhielten, die aus den Hautläsionen von erkrankten Mäusen isoliert wurden, keine Psoriasis entwickelten, wenn nicht LPS und IL-12 gleichzeitig verabreicht wurden, was anzeigt, dass die Übertragung von entzündlichen psoriatischen T-Zellen allein nicht ausreicht, um eine chronische entzündliche Reaktion der Haut zu induzieren.
Psoriatische Hautläsionen von scid/scid-Mäusen, die mit LPS und IL-12 behandelt wurden, ähneln stark der Humanpathologie. Tiere, die CD4⁺/CD45Rb^hi-Zellen zusammen mit LPS und IL-12 erhielten, entwickelten bereit 4 bis 5 Wochen nach der Zellübertragung Krankheitssymptome. Mäuse, die keine klinischen Anzeichen einer Erkrankung in der Woche 10 nach der T-Zellübertragung zeigten, blieben für weitere 4–6 Beobachtungswochen krankheitsfrei. Daher wurden die Mäuse mit Beginn der Woche 4 beobachtet und Nekropsien wurden an den Testtieren zwischen der Woche 10–12 durchgeführt. Klinische Anzeichen einer Erkrankung umfassten durchweg eine stärkere Rötung des Ohrs und eine verdickte Haut an Ohren und Augenlidern. Einige Tiere zeigten auch Anzeichen einer signifikanten Hautentzündung am Schwanz. In schweren Fällen wurde eine Hautentzündung über den ganzen Körper mit erhöhter Schuppung und Haarverlust (klinischer Wert 4) beobachtet. Die Ohrdicke variierte typischerweise von einer Basislinie von 21 ± 1,1 μm bei nicht erkrankten Tieren bis zu einem pathologischen Bereich von 26 bis 50 μm. Haut, die ernstlich durchweg beeinträchtigt wurde, wurde schuppig, ulzerierte und zeigte typischerweise eine plaqueartige Erhöhung. Eine Hautentzündung bei psoriatischen Mäusen lag im Bereich von leichtem, um die Basis der Ohren und um die Augenlider (klinischer Wert 1–2), bis schwerem Haarverlust, der sich auf über 75 % des Körpers erstreckte (klinischer Wert 3–4). Da die Ohrdicke sehr gut mit der Schwere der Erkrankung und den klinischen Werten korrelierte, verwendeten wir in den meisten Experimenten die Messung der Ohrdicke als Indikator für die gesamte Hautentzündung.
Andere psoriasisähnliche Modelle bei Mäusen sind dahingehend kritisiert worden, dass sie nicht die histologischen Charakteristika besitzen, die in menschlichen Formen der Erkrankung gefunden werden. Unterschiede beim Aufbau der Mäusehaut wurden für die Diskrepanzen verantwortlich gemacht. Ein Fehlen von Retezapfen oder Aleveolarkammverlängerung bei Mäusen, einem Hauptkennzeichen der humanen Erkrankung, wurde der relativ flachen dermoepidermalen Verbindung bei Mäusen zugeschrieben. Eine histologische Analyse der Läsionen, die durch unser Protokoll induziert wurde, wurde durchgeführt, indem Biopsien von Hautproben aus mehreren Bereichen von erkrankten Mäusen genommen wurden und 3 μm Schnitte, die mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt waren, untersucht wurden. Proben, die vom Ohr, dem Augenlid und dem Schwanz der erkrankten Mäuse genommen wurden, die T-Zellen plus LPS (20 μg/Maus) und IL-12 (10 ng/Maus) erhalten hatten, wurden für die histologische Bewertung präpariert und mikroskopisch von einem unabhängigen Pathologen untersucht. Es wurde festgestellt, dass die meisten Läsionen typische Zeichen von Parakeratose und Hyperkeratose mit einer gewissen Ulkus- oder Erosions- und Pustelbildung aufwiesen. Es wurde auch eine Verdickung der Epidermis (Akanthose) mit Proliferation der Keratinozyten und mäßig tiefen Retezapfen in der Subkutis festgestellt; die entzündliche Zellinifiltration bestand aus primär mononukleären Zellen, die aus Lymphozyten mit weniger Monozyten, Makrophagen und Plasmazellen bestanden. Veränderliche Zahlen von Neutrophilen mit ein paar Eosinophilen wurden auch entdeckt. Kapillaren und andere Gefäße waren zahlreich, enthielten große Zahlen von umrandeten Neutrophilen und waren typischerweise von Lymphozyten umgeben. Die Kombination dieser Charakteristika zeigt, dass die psoriasiformen Läsionen in diesem Modell sehr gut mit denen beim Menschen gefundenen vergleichbar sind. Schnitte von normalen scid/scid-Mäusen, die keine T-Zellen erhielten, wurden in demselben Alter wie die erkrankten Mäuse genommen. Die Epidermis ist 1–2 Zellen dick und die Dermis enthält fast keine Lymphozyten. Darüber hinaus ist die Gefäßdichte gering. Die Verbindung der Dermis mit der Epidermis erfolgt direkt und enthält keine Abzesse.
CD4⁺-T-Zellen aus der Haut von Mäusen mit Psoriasis sind CD45Rb^to und erzeugen hohe Niveaus an IFNγ und niedrige Niveaus an IL-4. Um das Aktivierungs/Zytokin-Profil von die Haut infiltrierenden Lymphozyten (SIL) zu vergleichen, reinigten wir diese Population von den Hautläsionen von erkrankten und nicht erkrankten Mäusen. Isolierte SIL wurden in vitro mit anti-CD3 und anti-CD28 48 Stunden lang stimuliert und die Überstände wurden auf die Erzeugung von IFNγ, TNFα und IL-4 getestet. Lymphozyten, die aus der Haut von Mäusen isoliert wurden, die T-Zellen erhielten, aber kleine klinischen Krankheitszeichen zeigten, sekretierten keine detektierbaren Niveaus an IFNγ oder IL-4. Im Gegensatz dazu exprimierten Zellen von erkrankten Mäusen sehr hohe Niveaus an IFNγ und TNFα und niedrige Niveaus an IL-4 (Tabelle 3). Naive CD4⁺/CD45Rb^hi-Spenderzellen von der Milz von BALB/c wurden auf eine ähnliche Weise stimuliert und zeigten keine detektierbaren Niveaus an getestetem Zytokin. Weiterhin war die Mehrzahl der CD4⁺-Zellen, die aus dem entzündeten Gewebe von Erkrankten isoliert wurden, CD45Rb^to. Die Daten legen nahe, dass sich die Mehrzahl der naiven T-Zellen, die in scid/scid-Mäuse übertragen wurden, in der Mikroumgebung der Haut in die Th1-artigen Speicher-/Effektor-T-Zellen aufteilen. Tabelle 3: CD4⁺-T-Zellen, die aus psoriatischen Läsionen von scid/scid-Mäusen isoliert wurden, erzeugen hohe Niveaus an Interferon-gamma und niedrige Niveaus an IL-4.

Die Erzeugung von IFNγ, IL-4 und TNFα durch SIL oder CD4+ SIT wurde wie in Material und Verfahren beschrieben gemessen. Die Daten stellen die Mittel und Standardabweichung dar.
¹20 × 10⁵ Zellen von psoriasiformen Läsionen von 5–10 Empfänger-scid/scid-Mäusen, die eine Krankheit nach einer Rekonstitution mit CD4+/CD45Rb^hi-Zellen von normalen BALB/c-Mäusen zusammen mit LPS und IL-12 entwickelten, wurden 48 Stunden lang kultiviert. Bei den Daten handelt es sich um einen Wert, der für 3 Experimente mit ähnlichen Werten repräsentativ ist.
² 2,0 × 10⁵ Zellen von der Haut von 8–10 Empfänger-scid/scid-Mäusen, die keine Krankheitssymptome zeigten, wurden 48 Stunden lang kultiviert. Die Daten stammen von einem Experiment, das für 2 unabhängige Experimente mit ähnlichen Werten repräsentativ ist.
³ 2,0 × 10⁵ mittels Durchflusszytometrie sortierte CD4⁺/CD45RB^hi-Zellen von Milzzellen, die von BALB/cj-Mäusen isoliert wurden, wurden 48 Stunden lang kultiviert. Zellreinheit ≥ 90%.

IFNγ-defziente CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen sind in der Lage, psoriasiforme Läsionen bei scid-Mäusen zu induzieren. Um zu untersuchen, ob IFNγ eine primäre Rolle bei der Induktion von psoriasiformen Läsionen spielt, haben wir zuerst naive T-Zellen von IFNγ-defizienten (IFNγ^–/–) Mäusen in C.B.17-scid/scid-Mäuse übertragen. Interessanterweise haben wir festgestellt, dass trotz eines Mangels an IFNγ, CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen von IFNγ^–/–-Spendern in der Lage waren, psoriasiforme Läsionen bei scid/scid-Mäusen zu induzieren. Eine Induktion der Erkrankung trat ähnlich häufig auf, aber die Dicke des Ohrs von erkrankten IFNγ^–/–-T-Zell-scid/scid-Mäusen lag im Durchschnitt unter der von Kontrollmäusen, und Hautläsionen auf den Augen und im Gesicht waren zwar vorhanden, aber weniger ausgeprägt. Der durchschnittliche klinische Wert der erkrankten Mäuse betrug 0,9 ± 1,0 und es wurde nur ein Fall von schwerer Psoriasis (klinischer Wert ≥ 3) festgestellt. Darüber hinaus wurde der Krankheitsbeginn (10–12 Wochen nach der Zellübertragung) im Vergleich zu den Kontrollmäusen (im Durchschnitt 6– 8 Wochen nach der Zellübertragung) verzögert. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen schien es, dass insbesondere die Hyperkeratose in der Haut von IFNγ^–/–-T-Zell-scid/scid-Mäusen weniger ausgeprägt war.
Das Fehlen einer vom Spender abgeleiteten IFNγ-Produktion wurde durch Testen der Überstände von isolierten Lymphozyten aus der Haut von erkrankten, mit CD4⁺/CD45Rb^hi-IFNγ^–/– rekonstituierten scid/scid-Mäusen 48 Stunden nach der Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 verifiziert. Keine erfassbaren Niveaus an IFNγ (≤ 30 pg) wurden bei Testung mittels ELISA in den Proben gefunden (Tabelle 3). Die Expression von TNFα wurde auch gemessen und als erhöht aber deutlich niedriger als die TNFα-Niveaus festgestellt, die bei mit CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen rekonstituierten Mäusen von Wildtyp-Tieren beobachtet wurden (Tabelle 3 oder 4). Tabelle 4: Anti-IL-12-Behandlung reduziert die T-Zell-entzündlichen Reaktionen signifikant, IFNγ^–/–-entzündliche T-Zellen erzeugen TNF-α.

Die Produktion von IFNγ, IL-4 und TNFα durch 2,0 × 10⁵ SIL wurde wie in Material und Verfahren beschrieben gemessen. Die Daten stellen die Mittel und Standardabweichungen dar. Alle Mäuse wurden in der Woche 10 nach der T-Zellübertragung geopfert. Die Kontroll- und Behandlungsgruppen bestanden aus 4–5 Mäusen. Die Lymphozyten von jeder Gruppe wurden für die in vitro-Stimulation ungeachtet des Krankheitsstatus gepoolt.
¹ Zellen wurden aus psoriasiformen Läsionen von 5–10 erkrankten scid/scid-Mäusen nach der Rekonstitution mit CD4⁺/CD45Rb^hi und LPS plus IL-12-Verabreichung isoliert. Die Mäuse erhielten keine Behandlung. Die Daten stammen aus einem Experiment, die für 3 unabhängige Experimente mit ähnlichen Werten repräsentativ sind.
² Die Mäuse wurden zweimal i.p. mit 0,5 mg ant-IL-12-mAb (Klon C17,8 Ratten-IgG₁) am Tag 7 und 35 behandelt. Die Mäuse wurden in der Woche 10 nach der T-Zellübertragung geopfert. Die Daten stammen von einem Experiment, das für 2 unabhängige Experimente mit ähnlichen Werten repräsentativ ist.
³ Zellen wurden aus psoriatischer Haut aus den Ohren und Augenlidern von Empfänger-scid/scid-Mäusen isoliert, die mit CD4⁺/CD45RB^hi-Zellen von BALB/cj-IFNγ^–/–-Mäusen rekonstituiert wurden.

Um weiter auszuschließen, dass winzige Niveaus an IFNγ, die durch Wirts-NK-Zellen sekretiert wurden, ausreichen, um die Krankheit zu induzieren, injizierten wir IFNγ^–/–-T-Zellen in scid-beige-Mäuse. Diese Mäuse tragen zusätzlich zu den scid-Mutationen die beige-Mutation, die einen Mangel an NK-Zellen zusätzlich zu einem T-, B-Zellmangel, der bereits in der scid-Mutation vorhanden ist, bewirkt. scid/beige-Mäuse, die IFNγ^–/–-CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen empfingen, entwickelten auch einen sehr signifikanten Anstieg der Ohrdicke, allerdings war der Krankheitsbeginn wieder signifikant verzögert und das Auftreten der Krankheit im Vergleich zu Mäusen, die IFNγ^–/–-CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen empfangen hatten, reduziert (Tabelle 5). Darüber hinaus war die Schwere der Erkrankung, wie mittels Ohrdicke und klinischem Wert gemessen (Tabelle 5), abgeschwächt. Interessanterweise stimmte trotz des Vorhandenseins einer schweren mononukleären Zellinfiltration die Akanthose mit den obigen Ergebnissen überein und war bei diesen Tieren weniger ausgeprägt. Diese Ergebnisse zeigen, dass IFNγ die Keratinozytenproliferation nicht aber die mononukleäre Zellinfiltration/Aktivierung bei Psoriasis reguliert. Tabelle 5: Auftreten und klinischer Wert von CD4⁺/CD45Rb^hi-scid-Mäusen

¹Alle Mäuse wurden entweder mit IFNγ^–/–- oder IFNγ^–/–-CD4+-CD45Rb^hi-T-Zellen und LPS plus II-12 rekonstituiert.
² Die Mäuse erhielten entweder PBS oder Kontroll-Ab (Ratten-IgG1).
² Die Antikörperbehandlung wird in Material und Verfahren und der Tabelle 3 beschrieben.
⁴ scid/scid- und scid/beige-Mäuse, die mit CD4⁺/CD45 RB^hi-Zellen von BALB/cj-IFNγ^–/–-Mäusen rekonstituiert wurden.
⁵ Erkrankungsauftreten wird als Zahl der Mäuse mit der Krankheit über einen Zeitraum von 10 Wochen gewertet: Die Kriterien sind Dicke des Ohrs ≥ 26 μm oder klinischer Wert ≥ 1.
⁶ Durchschnittlicher klinischer Wert + Standardabweichung wurde von allen Mäusen in der Gruppe bewertet, wie in Material und Verfahren beschrieben. p gegenüber IFNγ^+/+-scid/scid: anti-IL-12: p < 0,0000001. IFNγ^–/–-scid/scid: p < 0,003, IFNγ^–/–-scid/beide: p < 0,01. Die statische Analyse wurde mittels des zweiseitigen Studenten-T-Tests durchgeführt.
⁷ Schwere Krankheitsinduktion berechnet als Zahl der Tiere, die einen durchschnittlichen Histologiewert von ≥ 2,5 und/oder einen klinischen Wert von ≥ 3 erhielten.

IL-12 wird stark in psoriasiformen Läsionen exprimiert und die In-vivo-Neutralisation of IL-12-reguliert TNFα und IFNγ herunter und hemmt die Krankheitsentwicklung. Wir konzentrierten uns als nächstes auf IL-12, da dieses proinflammatorische Zytokin eine Schlüsselrolle bei der Induktion von IFNγ spielt. Wir führten immunhistochemische Studien durch, um das Vorhandensein von heterodimerem IL-12 in entzündetem Gewebe festzustellen. Es gibt eine sehr signifikante Menge an IL-12 (p35/p40, (p70)) Heterodimer, das im Gewebe von erkrankten, mit CD4⁺/CD45Rb^hi behandelten Mäusen exprimiert wird. Im Gegensatz dazu konnte eine deutlich geringere Färbung bei mit CD4⁺/CD45Rb^hi behandelten Mäusen beobachtet werden, denen anti-IL-12-mAb (0,5 mg/Maus) am Tag 7 und 35 injiziert wurde.
Um weiter die Rolle von IL-12 bei der Induktion von psoriasiformen Läsionen zu bewerten, haben wir anti-II-12-mAb (0,5 mg) am Tag 7 und 35 nach der T-Zellübertragung an scid/scid-Mäuse verabreicht, die Wildtyp-CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen erhalten hatten. Zwei Dosen anti-IL-12-mAb wurden gegeben, um den Ab-Titer über die gesamte Zeit der Krankheitsinduktion nach der Übertragung von CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellen hoch genug zu halten. Bei zwei unabhängigen Experimenten waren die Mäuse (5er Gruppe), die mit anti-IL-12-mAb behandelt wurden, vollständig vor der Entwicklung der Krankheit geschützt. Nur eine Maus von 10 entwickelte eine sichtbare leichte Psoriasis in Form von leichtem Haarverlust und Erythem um die Augenlider (klinischer Wert 1), allerdings entwickelten diese Maus und alle anderen Mäuse, die mit anti-IL-12-mAb behandelt wurden, keine Verdickung des Ohrs. Im Gegensatz dazu zeigten Kontrollmäuse, die mit Ratten-IgG-Kontrollantikörpern oder mit PBS behandelt wurden, ein 90%iges Auftreten (9 von 10 Mäusen entwickelten die Krankheit) mit einem durchschnittlichen klinischen Wert von 2,4 ± 0,7. Das erhöhte Auftreten und die Schwere der Krankheit in dieser Gruppe war auch mit einem signifikant höheren Anstieg der Ohrdicke im Verlauf der Zeit verbunden.
Die Ohren und die Haut von Mäusen, die anti-IL-12 erhielten, wurden auf Zytokinproduktion von infiltrierenden Lymphozyten untersucht. Während es sehr wenige Lymphozyten in der Haut von mit anti-IL-12 behandelten Mäusen gab, wur den diese isoliert und auf IFNγ-, IL-4- und TNFα-Produktion getestet. Nur niedrige Niveaus an IFNγ, IL-4 und TNFα wurden in den Überständen von Zellen, die von behandelten Tieren isoliert wurden, im Vergleich zu der Zytokinproduktion von Überständen, die von Kontrolltieren erhalten wurden, erfasst (Tabelle 4).
Die obigen Ergebnisse werden durch die Analyse der histopathologischen Schnitte, die von Tieren erhalten wurden, die mit anti-IL-12-mAb behandelt wurden, bestätigt. Mäusen, die mit 0,5 mg anti-IL-12-mAb am Tag 7 und 35 behandelt wurden, fehlten alle Anzeichen für eine signifikante Entzündung, Akanthose oder Hyperkeratose. Daher scheint die anti-IL-12-Verabreichung die Entwicklung von psoriasiformen Läsionen zu verhindern, indem die Keratinozytenhyperproliferation und die mononkleäre Zellinfiltration höchstwahrscheinlich sowohl durch Runterregulierung der IFNγ- als auch der TNFα-Produktion gehemmt wird.
Diskussion
Die obigen Daten zeigen, wie immunmodulatorische Impulse, in diesem Fall mikrobielle Antigene und das pro-inflammatorische Lymphokin IL-12, die Fähigkeit von T-Zellen beeinflussen, Psoriasis in diesem neu entwickelten CD4⁺/CD45Rb^hi-T-Zellübertragungsmodell zu induzieren. Es wird gezeigt, dass die gleichzeitige Verabreichung von LPS und IL-12 (1 und 10 ng) zu einem schnelleren Entstehen und zu einem stärkeren Auftreten von Psoriasis bei C.B-17-scid-Mäusen führte. Außerdem waren die beobachteten Läsionen bei den behandelten Mäusen auch schwerer. In zusätzlichen Experimenten wurde gezeigt, dass die gleichzeitige Verabreichung von SEB auch zu einem signifikanten Anstieg von Krankheitsauftreten und -expression führte. Diese Befunde legen die Bedeutung von bakteriellen oder viralen Infektionen vor dem Auftreten von psoriasiformen Läsionen nahe. Vor allem waren die Hautläsionen, die durch dieses Induktionsverfahren entwickelt wurden, charakteristisch und bemerkenswert ähnlich den humanen psoriatischen Läsionen und zeigten die meisten klinischen und histologischen Kennzeichen. Das Schuppen und die Verdickung von Haut, die makroskopisch sichtbar war, resultierte aus einer merklichen Hyper-, Parakeratose und Akanthose. Sie werden weiter durch das mikroskopische Sichtbarwerden von Retezapfen, Ulkus- und Pustelbildung und der oft schweren epidermalen Hyperplasie dokumentiert. Die entzündliche Zellinfiltration war primär mononukleär und bestand aus Lymphozyten mit weniger Monozyten, Makrophagen und Plasmazellen. Darüber hinaus exprimieren die Mehrzahl der CD4+-T-Zellen, die aus psoriasiformen Läsionen isoliert werden, niedrige Niveaus an CD45Rb, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass bei neueren Untersuchungen am Menschen festgestellt wurde, dass psoriatische Plaque isolierende T-Zellen einen Gedächtnis-Phänotyp besitzen. Neben der Ähnlichkeit zur humanen Histologie, die in dieser Studie beobachtet wurde, gibt es auch gewisse Unterschiede. Am bemerkenswertesten ist das Fehlen von CD8+-T-Zellen in der Epidermis von psoriatischen Plaques, das bei humaner Psoriasis festgestellt werden kann. Allerdings ist bis jetzt eine primäre Rolle für CD8+-T-Zellen in der Pathophysiologie von Psoriasis nicht identifiziert worden und erfolgreiche anfängliche Therapien, die auf CD4+-T-Zellen und nicht auf CD8+-T-Zellen abzielen, deuten auf die CD4+-T-Zellen als primären Schuldigen der Erkrankung hin.
Mehrere Mechanismen könnten für die krankheitsfördernden Wirkungen von LPS, IL-12 und SEB verantwortlich sein. Zuerst können diese Immunmodulatoren die Proliferation und Unterteilung von naiven Th0-Zellen in Th1-Zellen unterstützen. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass mikrobielle Produkte, wie beispielsweise LPS, direkt die TNFα-, IL-6- und in einem geringeren Umfang die IL-12-Produktion durch von Mäusehaut stammende, dendritische Zellen stimulieren können; und so für das Einstellen des pro-inflammatorischen Zustands für autoreaktive T-Zellen verantwortlich sein können. CD45Rb^hi-T-Zellen nach der Übertragung in SCID-Mäuse erfordern zusätzliche IL-12-abhängige Signale, um sich zu den autoimmunen Effektorzellen zu entwickeln.
Zusätzlich zu ihren immunstimulatorischen Wirkungen auf Makrophagen und ihren Wirkungen auf die Entwicklung von Th1-Effektorzellen, können LPS, IL-12 und SEB auch den Leukozytenhandel in Empfängermäusen dahingehend modulieren, dass er zur kutanen Lokalisierung von Th1-Effektorzellen führt. LPS fördert die Leukozytenrekrutierung durch Stimulation der endothelialen Zellexpression von E-Selektin, ICAM-1 und VCAM1 Adhäsionsmolekülen sowohl direkt als auch durch seine Fähigkeit, die Produktion von IL-1, TNFα und IFN-γ zu induzieren.
Die pro-inflammatorischen Wirkungen dieser Zytokine auf die Leukozytenadhäsion und Migration sind auch bekannt.
IFNγ und IL-12 sind zwei sehr wichtige immunregulatorische Zytokine, die, wie gezeigt wurde, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen spielen. IL-12 aktiviert primär NK- und T-Zellen, während IFNγ primär Makrophagen aktiviert und die Hochregulation von Molekülen der Klasse II auf Gewebezellen einleitet. Man hat vielleicht erwartet, dass IFNγ entscheidend für die Induktion von autoimmunen Effektorzellen bei Psoriasis ist. Die obigen Daten zeigen jedoch, dass IFNγ nur am Krankheitsprozess teilnehmen kann, indem es die Schwere der Erkrankung erhöht, höchstwahrscheinlich durch Begünstigen der Keratinozytenproliferation, aber sicher nicht durch die Induktion und das Erhalten von pathogenen, inflammatorischen T-Zellen in psoriatischer Haut. Dies wird durch die Tatsache gestützt, dass die Histologie, die bei Läsionen von Mäusen, die IFNγ^–/–-Spender-T-Zellen erhalten hatten, beobachtet wurde, etwas weniger oder gleiche Zeichen einer Entzündung zeigte, aber eine Hyperkeratose oder Akanthose war deutlich bei scid/scid- oder scid/beige-Mäusen verringert. Außerdem war, obwohl die klinische Schwere der Krankheit, wie durch Ohrdicke und makroskopische Beobachtung gemessen, im Vergleich zu den Kontrolltieren abgeschwächt war, die Manifestationswahrscheinlichkeit der Krankheit sehr ähnlich. Dies wurde auch bestätigt, wenn IFNγ^–/–-T-Zellen in T-, B- und NK-Zell-defiziente scid/beige-Mäuse übertragen wurden.
Diese Ergebnisse zeigen, dass IFNγ ein wichtiger Kofaktor bei der Induktion einer abweichenden Keratinozytenproliferation ist.
Das Fehlen von vom Wirt stammendem IFNγ wurde durch die Messung von IFNγ aus ganzen, mit anti-CD3 und anti-CD28 stimulierten Zellen verifiziert, die von den entzündlichen Läsionen von Tieren isoliert wurden, die IFNγ^–/–-T-Zellen erhielten. Wie erwartet konnten wir kein messbares Niveau an IFNγ feststellen, wodurch weiter die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass IFNγ durch non-T-Zellen in die Haut, einschließlich NK-Zellen, sekretiert werden könnte.
Im Gegensatz zu IFNγ wurde ein absolutes Erfordernis für IL-12 bei der Entwicklung von chronischen psoriasiformen Läsionen bei scid/scid-Mäusen durch mehrere Beobachtungen, die bei diesen Studien gemacht wurden, gezeigt. Zuerst führten mittlere und niedrige Dosen IL-12 (1 und 10 ng/Maus), die nach einer Spender-T-Zellübertragung verabreicht wurden, zu stärkerem Auftreten und Schwere der Krankheit. Darüber hinaus zeigte ein in-situ-Färben von entzündetem Gewebe eine signifikante Gabe von heterodimerem IL-12 (p70), während die IL-12-Färbung in dem nicht entzündeten Kontrollgewebe überhaupt nicht vorhanden war. Am wichtigsten war, dass die in vivo-Neutralisation von IL-12 mit einem mAb, das auf IL-12 p70 Heterodimer reagierte, 7 Tage nach der T-Zellübertragung in der Lage war, die Krankheitsinduktion vollständig aufzuheben. Ein interessanter Aspekt dieser Studien war, dass hohe Dosen an IL-12 (100 ng/Maus) die Krankheitsinduktion hemmten anstatt die Krankheitsentwicklung förderten.
Zusammenfassend beinhaltete die chronische, in dieser Studie beschriebene Hautkrankheit Merkmale, die normalerweise nur bei humaner Psoriasis, wie beispielsweise Retezapfen, schwerer Akanthose und Infiltration von Th1-Zellen in die Dermis, beobachtet wurde. Die klinischen und histopathologischen Abnormalitäten wurden stark durch die in vivo-Verabreichung von LPS und IL-12 erhöht, was eine wichtige Rolle von infektiösen Erreger(n) bei der Pathogenese der Krankheit zeigt. Außerdem wird zum ersten Mal gezeigt, dass die Induktion von psoriasiformen Läsionen von IL-12 abhing aber unabhängig von IFN-γ war. Diese Ergebnisse gewähren einen Einblick in die bestimmten pathogenen Anforderungen von Th1-fördernden Zytokinen und Zellen für die Entwicklung von psoriasiformen Läsionen und in die Verhinderung und Behandlung von Psoriasis beim Menschen.
Beispiel 2
Die Tiere wurden auf die Wirkung der Behandlung mit Antikörpern für IL-12 auf eine laufende psoriatische Krankheit und eine solche der späten Stufe getestet. Die Erkrankung wurde durch die im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren induziert, d.h. unter Verwendung von 3 × 10⁵ CD4⁺CD45Rb^hi-Zellen, die anschließend an eine Injektion von LPS und IL-12 in scid/scid-Mäuse übertragen wurden. Die Behandlung mit dem anti-IL-12-Antikörper betrug immer 1 mg/Maus/Dosis. Die Ergebnisse von vier separaten Experimenten sind in der 1 gezeigt. Bei dem ersten Experiment (n = 5 unbehandelt; n = 2 behandelt) erhielten die Mäuse Injektionen mit anti-IL-12 in den Wochen 9 und 10 (d.h. etwa 5 Wochen nach dem Auftreten von psoriatischen Symptomen) und wurden in der Woche 14 für die Histologie geopfert. Obwohl die unbehandelten Mäuse einen durchschnittlichen Histologiewert von 2,5 hatten, was mäßige bis starke Symptome anzeigt, hatten die behandelten Mäuse einen Histologiewert von nur 0,25, was fast keine Symptome anzeigt. Daher waren die beiden Injektionen mit dem anti-IL-12-Antikörper zum Erleichtern von bestehenden Psoriasissymptomen äußerst wirksam.
In einem zweiten Experiment wurden 3 Mäusegruppen entweder unbehandelt gelassen, mit einem für den Isotyp angepassten Kontrollantikörper, der nicht an IL-12 bindet behandelt oder mit dem anti-IL-12-Antikörper behandelt (n = 4 pro Gruppe). Die Behandlung erfolgte in der Woche 9 und 10 und die Histologieproben wurden in der Woche 12 genommen. Wieder hatten die unbehandelten und kontrollbehandelten Mäuse beträchtliche psoriatische Symptome, und die mit anti-IL-12 behandelten Mäuse wiesen viel niedrigere Niveaus auf. In einem dritten Experiment blieben die Mäuse unbehandelt (n = 5) oder wurden mit anti-IL-12 in den Wochen 9 und 10 behandelt (n = 6), aber die Hälfte der behandelten Mäuse wurde für die Histologie in der Woche 12, wie zuvor, und die andere Hälfte später in der Woche 17 geopfert. Die behandelten Mäuse zeigten wieder ein drastisches Abfallen des Histologiewerts, der in der Woche 17 weitgehend aufrechterhalten wurde, d.h. sieben Wochen nachdem die Behandlung beendet war.
Schließlich wurde in einem vierten Experiment (n = 4 für die Gruppe, die mit anti-IL-12 behandelt wurde und die, die mit an den Isotyp angepasstem Kontrollantikörper behandelt wurde) die Behandlung erst in der Woche 14 eingeleitet, etwa 10 Wochen nach dem Auftreten der psoriatischen Symptome, so dass die Symptome sehr gut etabliert waren (Ohrdicke > 40 μm). Die Behandlung erfolgte wöchentlich von Woche 14 bis 17. Trotz der gut etablierten Krankheit war die anti-IL-12-Behandlung äußerst wirksam bei der Verringerung der Symptome (bis zum durchschnittlichen Histologiewert von 0,25). Dieses Ergebnis wurde durch wö chentliche Messung der Ohrdicke und einer unabhängigen Messung der Krankheitsschwere, wie in der 2 gezeigt, bestätigt.
Durch Kombination all dieser Experimente war der durchschnittliche Histologiewert der unbehandelten oder kontrollbehandelten Mäuse bei der Opferung 2,53, während der durchschnittliche Histologiewert der Mäuse, die mit anti-IL-12-Antikröper behandelt wurden, bei nur 0,65 lag, einem statistisch äußerst signifikanten Ergebnis (p = 1,7 × 10-9 durch den zweiseitigen Studenten-T-Test).

Claims

Verwendung eines Anti-Interleukin-12-Antikörpers zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zur Behandlung von Psoriasis.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Anti-Interleukin-12-Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der monoklonale Antikörper in der Lage ist, Interleukin-12 mit einer Bindungsaffinität von mindestens 10⁸ M^–1 zu binden.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Anti-Interleukin-12-Antikörper in der Lage ist, Interleukin-12 zu neutralisieren.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der monoklonale Antikörper ein chimerer monoklonaler Antikörper oder ein humanisierter monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei der monoklonale Antikörper 5F2, 16F2, 16G2 oder 20E11 in chimerer oder humanisierter Form ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der monoklonale Antikörper ein humaner monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die pharmazeutische Formulierung geeignet ist, einem Patienten oral, topisch, subkutan, intramuskulär oder intravaskulär verabreicht zu werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die pharmazeutische Formulierung geeignet ist, Anti-Interleukin-12-Antikörper in einer Dosis von 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht zu verabreichen.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Anti-Interleukin-12-Antikörper in einer Dosis von 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Behandlung geeignet ist, PASI um mindestens 50 % zu reduzieren.