SI20110A - Metode in sestavki za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide - Google Patents

Abstract

Zagotovljena je metoda za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide v subjektu. V metodi v smislu izuma damo subjektu sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje IFN-gama v subjektu, v kombinaciji s kortikosteroidom, tako da je odzivnost subjekta na kortikosteroid modulirana, v primerjavi s tem, ko damo subjektu samo kortikosteroid. V eni izvedbi je sredstvo IL-18 antagonist. V drugi izvedbi je sredstvo interlevkin-12 (IL-12) antagonist. Še v nadaljnji izvedbi je sredstvo NK-celični antagonist. V prednostni izvedbi je sredstvo inhibitor proteaze kaspazne družine, prednostno ICE inhibitor. V drugi prednostni izvedbi je sredstvo anti-IL-12 monoklonsko protitelo. V še nadaljnji prednostni izvedbi je sredstvo protitelo antiasialo-GM1 ali protitelo NK1.1. Druga prednostna sredstva vključujejo fosfodiesterazne IV inhibitorje in beta-2 agoniste. Metode v smislu izuma lahko uporabimo pri zdravljenju različnih vnetnih in imunoloških bolezni in motenj. Zagotovljeni so tudi farmacevtski sestavki, ki obsegajo sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje IFN-gama v subjektu, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Prednostni sestavek obsega ICE inhibitor, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.ŕ

Description

BASF Aktiengesellschaft

Metode in sestavki za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide

Standardna terapija za številne imunske in vnetne motnje vključuje dajanje kortikosteroidov, ki imajo sposobnost, da zatirajo imunološke in vnetne odzive. Kortikosteroidi se uporabljajo pri zdravljenju motenj, kot so npr. astma, avtoimunske bolezni (npr. revmatoidni artritis, sistemski lupus erythematosus) in zavračanje transplantatov (pregled kortikosteroidov je razviden npr iz.: Truhan A.P. et a/(1989) Annals of Allergy 62375-391; Baxter J.D. (1992) Hospital Practice 27: 111-134; Kimberly R.P. (1992) Curr. Opin Rheumatol. 4:325-331; Weisman M.H. (1995) Curr. Opin. Rheumatol. 7:183-190). Kortikosteroidi se uporabljajo tudi lokalno pri zdravljenju različnih dermatoloških motenj, kot so npr. kontaktni dermatitis, luskavica, lihen planus, keloidi in urtikarija pigmentoza (pregled razviden iz: Sterry W. (1992) Arch. Dermatol. Res. 284 (dopol.):S27-S29).

Čeprav je uporaba kortikosteroidov terapevtsko koristna, pa je povezana s številnimi stranskimi učinki, ki obsegajo od srednje nevarnih do možnih smrtno nevarnih učinkov. Zapleti, povezani s podaljšano uporabo in/ali uporabo visokih doz steroidov, vključujejo muskuloskeletne učinke (npr. osteoporoza, miopatija, aseptična nekroza kosti), oftalmične učinke (npr. posteriome subkapsulame katarakte), gastrointestinalne učinke (npr. ulkusi, pankreatitis, navzeja, povračanje), kardiovaskularne učinke (npr. hipertenzija, ateroskleroza), učinke’ centralnega živčnega sistema (npr. pseudotumor cerebri, psihiatrične reakcije), dermatološke učinke (npr. hirsutizem, redistribucija podkožne maščobe, poslabšano zdravljenje poškodb, tanjšanje kože) in zatiranje hipotalamus-pituitame-adrenalne osi (npr. Truhan A.P. et al (1989) Annals of Allergy 62:375-391). Za mnoge stranske učinke pri uporabi kortikosteroidov se zdi, da so odvisni od doze (Kimberly R.P. (1992) Curr. Opin. Rheumatol. 4: 325-331).

Zato bi bile zelo zaželene metode in sestavki, ki bi omogočali uporabo nižjih učinkovitih doz kortikosteroidov (imenovano kot steroidni varčevalni učinek), da bi se izognili neželenim stranskim učinkom.

Druga težava, ki omejuje uporabnost kortikosteroidov, je fenomen steroidne odpornosti. Nekatere vnetne ali imunološke bolezni kažejo neodzivnost na zdravljenje s steroidi. Poskusi, da bi uporabili kortikosteroidno terapijo npr. za zdravljenje septičnega šoka pri ljudeh, so privedli do nezadovoljivih rezultatov, tako da se kortikosteroidi na splošno ne priporočajo kot dodatna terapija pri resni sepsi ali septičnemu šoku (razvidno npr. iz: Putterman C. (1989) Israel J. Med. Sci. 25:332338; Bone, R.C. in Brown R.C. (1990) v Vincent J.L. (itd.) Update in Intensive Čare andEmergency Medicine 10” Heidelberg:Springer Verlag, str. 121). Druge motnje, ki pogosto kažejo odpornost proti zdravljenju s kortikosteroidi, vključujejo vnetno črevesno bolezen (npr. Hibi T. el «/.(1995) J. Gastroenterol. 30:121-123) in bolezen presadek-proti-gostitelj (Antin J.H. et al. (1994) Blood 84:1342-1348; Racadot E. et al. (1995) Bone Marrow Transplantation 15:669-677). Tako so še vedno potrebne metode in sestavki, ki bi jih lahko uporabili, da bi premagali ali obrnili kortikosteroidno odpornost pri vnetnih in imunoloških motnjah.

Nadaljnja pomanjkljivost kortikosteroidne terapije je, da se pojavi vindikatomi učinek steroidov, kadar se prekine dajanje kortikosteroida. Vindikatomi učinek steroidov je označen s poslabšanjem vnetnega stanja (stanj), ki se zdravi (zdravijo), po prenehanju steroidne terapije. Metode in sestavki, ki bi jih lahko uporabili, da bi izboljšali vindikatomi učinek steroidov, so še vedno potrebni.

Predloženi izum zagotavlja metode in sestavke za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide v subjektu. Metode in sestavke v smislu izuma lahko npr. uporabimo, da obrnemo steroidno odpornost v subjektu in tako Ie-temu dopustimo zdravljenje s kortikosteroidi. Metode in sestavke v smislu izuma lahko prav tako uporabimo, da povečamo steroidno občutljivost v subjektu in s tem dosežemo terapevtsko učinkovitost kortikosteroidnega zdravljenja pri nižjih dozah (npr., da se izognemo škodljivim stranskim učinkom visokih doz kortikosteroidov ali da dopustimo zdravljenje bolezni, odvisnih od steroidov, z nižjimi dozami).

Še nadalje lahko uporabimo metode in sestavke v smislu izuma, da izboljšamo vindikatomi učinek steroidov, kadar subjektu, ki je izpostavljen zdravljenju s kortikosteroidi, odvzamemo kortikosteroide.

V modulacijskih metodah v smislu izuma damo subjektu sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje IFN-γ v subjektu, v kombinaciji s kortikosteroidom, tako da je odzivnost subjekta na kortikosteroid modulirana, v primerjavi s tem, ko damo subjektu samo kortikosteroid. Tarča, ki se antagonizira, je lahko npr. citokin ali encim, ki regulira proizvajanje IFN-γ, ali celica, ki regulira proizvajanje IFN-γ. Sredstvo damo v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira proizvajanje IFN-γ v subjektu.

V različnih izvedbah damo sredstvo in kortikosteroid istočasno, sredstvo damo najprej in šele nato kortikosteroid ali damo najprej kortikosteroid in nato sredstvo. Metode lahko uporabimo pri profilaktičnih in terapevtskih režimih kortikosteroidnega zdravljenja.

V eni izvedbi metoda vključuje dajanje sredstva, ki je IL-18 antagonist. IL-18 antagonist damo v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira aktivnost IL-18 v subjektu. IL-18 antagonist lahko npr. deluje v stopnji IL-18 sinteze, IL-18 citokinske aktivnosti ali IL-18 interakcije z IL-18 receptorjem. V prednostni izvedbi je IL-18 antagonist inhibitor proteaz kaspazne družine, prednostno inhibitor interlevkin-ΐβ pretvorbenega encima (ICE). V drugi izvedbi je IL-18 antagonist protitelo, protitelesih fragment ali konstruiran vezavni protein, ki veže na IL-18 ali IL-18 receptor.

V drugi izvedbi metoda vključuje dajanje sredstva, ki je interlevkin-12 (IL-12) antagonist. IL-12 antagonist damo v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira IL12 aktivnost v subjektu. IL-12 antagonist lahko npr. deluje v stopnji IL-12 sinteze, IL12 citokinske aktivnosti ali IL-12 interakcije z IL-12 receptorjem. V prednostni izvedbi je IL-12 antagonist protitelo, protitelesni fragment ali konstruiran vezavni protein, ki veže na IL-12 ali IL-12 receptor. V drugi prednostni izvedbi je IL-12 antagonist sredstvo, ki stimulira proizvajanje ciklične AMP (cAMP) v celicah, ki proizvajajo IL-12. Primeri sredstev, ki jih lahko uporabimo, da stimuliramo cAMP, vključujejo fosfodiesterazne IV inhibitorje in beta-2 agoniste. V še nadaljnji izvedbi je IL-12 antagonist STAT4 inhibitor.

V še nadaljnji izvedbi metoda vključuje dajanje sredstva, ki osiromaši ali eliminira NK-celice in NK podobne celice (imenovano tukaj kot NK-celični antagonist) iz subjekta. NK-celični antagonist damo v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira proizvajanje IFN-γ v subjektu. Prednostni NK-celični antagonisti so protitelesa, specifična za NK-/NK podobne celice, ki osiromašijo te celice in vivo. Primeri prednostnih protiteles za uporabo kot NK-celični antagonisti so protitelesa anti-asialoGM1 in protitelesa NK1.1.

Nadaljnji vidik predloženega izuma se nanaša na metodo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide v subjektu, kjer damo subjektu inhibitor proteaze kaspazne družine, prednostno ICE, skupaj s kortikosteroidom, tako da je modulirana odzivnost subjekta na kortikosteroid, v primerjavi s tem, ko damo subjektu samo kortikosteroid.

Še nadaljnji vidik predloženega izuma se nanaša na metodo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide v subjektu, kjer damo IL-12 antagonist subjektu skupaj s kortikosteroidom, tako da je odzivnost subjekta na kortikosteroid modulirana, v primerjavi s tem, ko damo subjektu samo kortikosteroid. Še z nadaljnjega vidika se izum nanaša na metodo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide v subjektu, kjer damo subjektu NK-celični antagonist (npr. anti-NK-/NK podobno celično protitelo) skupaj s kortikosteroidom, tako daje odzivnost subjekta na kortikosteroid modulirana, v primerjavi s tem, ko damo subjektu samo kortikosteroid.

Še iz nadljnjega vidika se izum nanaša na metodo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide v subjektu, kjer izberemo subjekt, ki potrebuje modulacijo odzivnosti na kortikosteroid, in mu damo sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje IFN-γ v subjektu, tako da je odzivnost subjekta na kortikosteroid modulirana, v primerjavi s tem, ko subjektu damo samo kortikosteroid. Sredstvo damo subjektu v dozi in na način, ki zadostuje, da inhibira proizvajanje IFN-γ v subjektu. Subjekt, ki ga izberemo, je npr. lahko tisti, ki je steroidno odporen pred zdravljenjem, subjekt, ki se odziva na steroide in pri katerem je treba povečati steroidno občutljivost, ali subjekt, kateremu je treba odvzeti steroide in ameliorirati vindikatomi učinek steroidov.

Predloženi izum zagotavlja tudi farmacevtske sestavke za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide v subjektu. V eni izvedbi obsega sestavek v smislu izuma sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje IFN-γ v subjektu, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljivi nosilec. V drugi izvedbi obsega sestavek v smislu izuma IL18 antagonist (kot npr. inhibitor proteaze kaspazne družine, prednostno ICE inhibitor ali anti-IL-18 ali anti-IL-18 receptorsko monoklonsko protitelo), kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. V še nadaljnji izvedbi obsega sestavek v smislu izuma IL-12 antagonist (npr. anti-IL-12 ali anti-IL-12 receptorsko monoklonsko protitelo, fosfodiesterazni IV inhibitor, beta-2 agonist, STAT4 inhibitor), kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. V še nadaljnji izvedbi obsega sestavek v smislu izuma NK-celični antagonist (npr. anti-NK-/NK podobno celično protitelo) kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Farmacevtske sestavke v smislu izuma lahko formuliramo za dajanje na prednosten način dajanja, ki doseže želeni terapevtski učinek. V eni prednostni izvedbi formuliramo farmacevtski sestavek za lokalno dajanje. V drugi prednostni izvedbi formuliramo farmacevtski sestavek za dajanje z inhalacijo. Drugi prednostni načini dajanja vključujejo oralno in intravenozno dajanje.

Metode in sestavke v smislu izuma lahko uporabimo pri zdravljenju katerekoli bolezni ali motnje, pri kateri je želeno, da moduliramo steroidno odzivnost. V prednostnih izvedbah uporabimo metode in sestavke v smislu izuma za zdravljenje subjekta, ki trpi zaradi septičnega šoka. V drugi izvedbi uporabimo metode in sestavke v smislu izuma za zdravljenje subjekta, ki trpi zaradi Crohnove bolezni. V drugi izvedbi uporabimo metode in sestavke za zdravljenje subjekta, ki trpi zaradi astme. V drugi izvedbi uporabimo metode in sestavke za zdravljenje subjekta, ki trpi zaradi avtoimunske bolezni ali motnje. V drugi izvedbi uporabimo metode in sestavke za zdravljenje subjekta, ki trpi zaradi bolezni presadek-proti-gostitelj ali zavračanja transplantatov. V še drugi izvedbi uporabimo metode in sestavke za zdravljenje subjekta, ki trpi zaradi akutne vnetne motnje. V še drugi izvedbi uporabimo metode in sestavke za zdravljenje subjekta, ki trpi zaradi kronične vnetne motnje.

Kratek opis slik

Sl. 1 je stolpni diagram, ki prikazuje nivoje serumskega TNFa (v ng/ml) v miših divjega tipa in ICE deficientnih (ICE KO) miših, obdelanih samo z vehiklom ali deksametazonom (4 mg/kg) 30 minut po LPS v LPS/P. acw&s-modelu septičnega šoka, iz katere je razvidno, da ICE deficientni miši, ne pa miši divjega tipa, kažejo zatiranje proizvajanja TNFa in so tako steroidno odzivne.

Sl. 2 je stolpni diagram, ki prikazuje ravni serumskega TNFa (v ng/ml) v miših divjega tipa (stolpi s pikcami) in ICE deficientnih miših (stolpi s poševnimi črtami), predobdelanih samo z vehiklom ali padajočimi količinami deksametazona (0,05, 0,005 ali 0,0005 mg/kg) v LPS/P. ac«es-modelu septičnega šoka, iz katere je razvidno, da ICE-deficientne miši ohranijo steroidno odzivnost na padajoče steroidne doze v primerjavi z mišmi divjega tipa.

Sl. 3 je stolpni diagram, ki prikazuje z LPS inducirani serumski IL-12 (v pg/ml) v miših B6, predobdelanih samo z vehiklom ali s fosfodiesteraznim IV inhibitorjem rolipramom, iz katere je razvidno, da obdelovanje s fosfodiesteraznim IV inhibitorjem inhibira proizvajanje IL-12.

Sl. 4 je stolpni diagram, ki prikazuje ravni serumskega TNFa (v ng/ml) v miših B6, obdelanih samo z vehiklom (fiziološka raztopina soli) ali ICE inhibitorjem (AcYVAD-CHO) v kombinaciji z deksametazonsko obdelavo v LPS/P. acnev-modelu septičnega šoka.

Sl. 5 je stolpni diagram, ki prikazuje ravni serumskega IL-6 (v ng/ml) v miših B6, obdelanih samo z vehiklom (fiziološka raztopina soli) ali ICE inhibitorjem (AcYVAD-CHO) v kombinaciji z deksametazonsko obdelavo v LPS/P. ac«čj-modelu septičnega šoka.

Sl. 6 je stolpni diagram, ki prikazuje ravni serumskega IL-1 β (v ng/ml) v miših B6, obdelanih samo z vehiklom (fiziološka raztopina soli) ali ICE inhibitorjem (AcYVAD-CHO) v kombinaciji z deksametazonsko obdelavo, v LPS/P. acnes-modelu septičnega šoka.

Predloženi izum je osnovan vsaj delno na odkritju, da so ICE deficientne miši, v primerjavi s kontrolnimi mišmi divjega tipa odzivne na kortikosteroide po LPS-izzivu v modelu septičnega šoka (Primer 1). Poleg tega kažejo ICE deficientne miši povečano občutljivost za nizke doze kortikosteroidov, v primerjavi s kontrolnimi mišmi divjega tipa, kadar uporabimo kortikosteroidno zdravljenje pred LPS-izzivom v modelu septičnega šoka (Primer 2). Predloženi izum je nadalje osnovan vsaj delno na odkritju, da osiromašenje NK-/NK podobnih celic v LPS-izzvanih miših divjega tipa vodi do v bistvu zmanjšanega proizvajanja IFN-γ (v primerjavi s kontrolnimi neobdelanimi mišmi) in da v bistvu poveča stopnjo preživetja (Primer 10).

Pred tem je že bilo opisano, da lahko dajanje interferona-γ (IFN-γ) premaga kortikosteroidno zatiranje biosinteze TNFa z murinimi makrofagi (Leudke, C.E. in Cerami, A. (1990) J. Ciin. Invest 86:1234-1240). Poleg tega lahko ICE in druge proteaze kaspazne družine cepijo prekurzorsko obliko IL-18 v njegovo zrelo aktivno obliko (Primer 4). Čeprav ni namen omejevanje z mehanizmom pa v smislu predloženega izuma smatramo, da je sposobnost podeljevanja kortikosteroidne odzivnosti z inhibiranjem ICE-aktivnosti v subjektu rezultat inhibiranja IL-18, predelanega z ICE, tako daje proizvajanje zrelega IL-18 inhibirano, ki tako vodi do zmanjšanega proizvajanja IFN-γ v subjektu. Poleg tega IL-18 v povezavi z IL-12 stimulira NK-/NK podobne celice, da izdelujejo več IFN-γ. Tako za NK/NK-podobne celice smatramo, da tvorijo pozitivno povratno zanko pri proizvajanju IFN-γ, ki je degradivno moduliran z osiromašenim ali eliminacijo NK-/NK podobnih celic.

Glede na prej omenjeno predloženi izum splošno zagotavlja metode in sestavke za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide, pri katerih se tarča, ki regulira proizvajanje IFN-γ, antagonizira v subjektu. Ta tarča, ki regulira proizvajanje IFN-γ in ki se antagonizirana, je lahko IL-18 (ki se lahko antagonizira npr. indirektno z inhibiranjem aktivnosti ICE ali direktno z uporabo anti-IL-18 protitelesa). Alternativno se lahko antagonizira drugi faktor, ki regulira proizvajanje IFN-γ, kot npr. IL-12, da tako modulira kortikosteroidno odzivnost v subjektu. Še nadalje pa lahko uporabimo sredstvo, ki osiromaši ali eliminira NK-/NK podobne celice, da tako inhibira proizvajanje IFN-γ, da moduliramo kortikosteroidno odzivnost v subjektu.

Zaradi bolj jasnega razumevanja predloženega izuma najprej pojasnjujemo številne izraze.

Kot uporabljamo tukaj, se izraz kortikosteroid nanaša na razred terapevtskih sredstev, uporabnih pri zdravljenju vnetnih stanj, vključno tistih, ki so posledica infekcij, zavračanje transplantatov in avtoimunskih motenj. Kortikosteroidi vključujejo tiste, ki so naravni, sintetični ali polsintetični po svojem izvoru in so označeni s prisotnostjo steroidnega jedra iz štirih spojenih obročev, npr. kot je ugotovljeno v strukturah holesterola, dihidroksiholesterola, stigmasterola in lanosterola. Kortikosteroidna zdravila vključujejo: kortizon, kortizol, hidrokortizon (11317-dihidroksi-21-(fosfonooksi)-pregn-4-en-3,20-dion dinatrij), dihidroksikortizon, deksametazon (21 -(acetiloksi)-9-fluoro-11 β, 17-dihidroksi-16ametilpregna-l,4-dien-3,20-dion) in visoko derivatizirana steroidna zdravila, kot npr. bekonaz (beklometazon dipropionat, ki je 9-kloro-l 1β, 17,21-trihidroksi-16pmetilpregna-l,4-dien-3,20-dion-17,21-dipropionat). Drugi primeri kortikosteroidov vključujejo flunizolid, prednizon, prednizolon, metilprednizolon, triamcinolon, deflazakort in betametazon.

Izraz tarča, ki regulira proizvajanje IFN-γ, je namenjen, da vključuje kemijske faktorje (npr. citokine, encime ipd.) in celice, ki direktno ali indirektno kontrolirajo sintezo IFN-γ v subjektu. Primeri za faktorje, ki regulirajo proizvajanje IFN-γ, vključujejo IL-18 (npr. Okamura, H. et al. (1995) Nature 378:88-91; Ushio, S. et al. (1996) J. Immunol. 156:4274-4279) in interlevkin-12 (IL-12) (glej npr. Schoenhaut, D. et al. (1992) J. Immunol. 148:3433; PCT-objava WO 90/05147; evropska patentna prijava EP 433 827 A2). Primeri za celice, ki regulirajo proizvajanje IFN-γ, vključujejo NK- in NK podobne celice.

Kot uporabljamo tukaj, so sredstva, ki antagonizirajo faktor, namenjena, da vključujejo sredstva, ki inhibirajo aktivnost faktorja, in sredstva, ki degradivno regulirajo (tj. inhibirajo) sintezo ali proizvajanja faktorja.

Izraz IL-18 se nanaša na citokin, ki ima aminokislinsko sekvenco, kot jo prikazujejo: Okamura H. et al. (1995) Nature 378:88-91 (miš) ali Ushio S. et al. (1996) J. Immunol. 156:4274-4279 (človek), in druge njegove sesalČje homologe. Citokin IL18 je v tehniki imenovan tudi interferon γ inducimi faktor (IGIF) in IL-Ιγ.

Izraz IL-18 antagonist je namenjen, da vključuje sredstva, ki inhibirajo sintezo ali proizvajanje IL-18, sredstva, ki inhibirajo aktivnost IL-18, potem ko je sintetiziran, sredstva, ki inhibirajo interakcijo IL-18 z IL-18 receptorjem in sredstva, ki inhibirajo aktivnost IL-18 receptorja. Primeri IL-18 antagonistov vključujejo inhibitorje proteaz kaspazne družine (npr. ICE inhibitorje) in protitelesa, protitelesne fragmente in konstruirane vezavne proteine, ki vežejo bodisi na IL-18 ali IL-18 receptor.

Izraz interlevkin-12 (IL-12) se nanaša na citokin, ki ima aminokislinsko sekvenco, kot jo prikazujejo: Schoenhaut, D. et al. (1992) J. Immunol. 148:3433, PCT objava

WO 90/05147, in evropska patentna prijava EP 433 827 A2, in njegove druge sesalčje homologe.

Izraz IL-12 antagonist je namenjen, da vključuje: sredstva, ki inhibirajo sintezo ali proizvajanje IL-12, sredstva, ki inhibirajo aktivnost IL-12, potem ko je sintetiziran, sredstva, ki inhibirajo interakcijo IL-12 z IL-12 receptorjem in sredstva, ki inhibirajo aktivnost IL-12 receptorja. Primeri IL-12 antagonistov vključujejo protitelesa, protitelesne fragmente in konstruirane vezavne proteine, ki vežejo bodisi na IL-12 ali IL-12 receptor, sredstva, ki stimulirajo intracelulamo proizvajanje cAMP v celicah, ki proizvajajo IL-12 (kot npr. inhibitorji fosfodiesteraze IV ali beta-2 agonisti) in sredstva, ki inhibirajo STAT4.

Izraz proteaza kaspazne družine je namenjen, da vključuje člane kaspaznih proteaz, kot jih opisujejo: Alnemri, E. et al. (1996) Celi 87:171, vključno kaspaza-1 (ICE), kaspaza-2 (ICH-1), kaspaza-3 (CPP32, Yama, apopain), kaspaza-4 (TX, ICH-2, ICE_rei-II), kaspaza-5 (ICE_rei-III, TY), kaspaza-6 (Mch2), kaspaza-7 (Mch3, ICE-LAP3, CMH-1), kaspaza-8 (MACH, FLICE, Mch5), kaspaza-9 (ICE-LAP6, Mch6) m kaspaza-10 (Mch4). Nadalje je izraz proteaza kaspazne družine namenjen, da vključuje katerikoli protein, ki deli identičnost aminokislinske sekvence, večjo od 20 %, z ICE v aktivnih domenah proteaz (tj. aktivne domene p 10 in p20 podenot ICE), vsebuje peptidno sekvenco glutamin-alanin-cistein-X-glicin (QACXG), kjer je cistein (C) katalitični aktivni cisteinski ostanek in X pomeni katerokoli amino kislino, in vsebuje sekvenco serin-histidin-glicin (SHG), nameščeno N-terminalno glede na QACXG motiv, v katerem je histidin (H) katalitično esencialni histidinski ostanek. Proteaze kaspazne družine značilno kažejo močno preferenco za hidrolizo peptidnih vezi neposredno po kisli amino kislini (tj. asparaginska ali glutaminska kislina).

Proteaze kaspazne družine so znane pri ljudeh in drugih organizmih, vključno miših in Caenorhabditis elegans. Primeri za proteaze kaspazne družine vključujejo npr.: Ich-1 (Wang, L. et al. (1994) Celi 78:739-750); ICH-2 (Kamens, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:15250-15256); Mch2 (Femandes-Alnemri, T. et al. (1995) Cancer Res. 55:2737-2742); CPP32 (Femandes-Alnemri, T. et al. (1994) J. Biol. Chem.

269:30761-30764); Yama/CPP32p (Tewari, M. et al. (1995) Celi 8L801-809); produkt mišjega gena Nedd2 (Kumar, S. et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 185:1155-1161; Kumar, S. et al. (1994) Genes Dev. 8:1613-1626); produkt C. elegans gena, ced-3 (Yuan, J. et al. (1993) Celi 75:641-652); humani protein TX (Faucheu, C., et al., (1995) EMBO J. 14:1914-1922); ICE_relII in ICE_reiIII (Munday, N.A. et al. (1995)7 Biol. Chem. 270:15870-15876).

Izraz interlevkin- 1β pretvorbeni encim (ICE) je namenjen, da se nanaša na proteazo, ki ima aminokislinsko sekvenco, kot jo opisujejo: Cerretti D.P. et al. (1992) Science 256:97-100 (Človek) ali Nett, M.A. et al. (1992) J. Immunol. 149:3254-3259 (miš) in njene druge sesalčje homologe.

Izraz ICE inhibitor je namenjen, da vključuje kemijska sredstva, ki inhibirajo proteolitično aktivnost ICE. Primeri ICE inhibitorjev so znani v tehniki, vključno npr. sredstva, prikazana v: US-patentu št. 5,585,357 (pirazolilni derivati); US-patentu št. 5,677,283 (pirazolilni derivati); US-patentu št. 5,656,627 (inhibitorji, ki obsegajo vodikovo vezno skupino, hidrofobno skupino in elektronegativno skupino); US-patent št. 5,411,985 (spojine gama-piron-3-ocetne kisline); US-patent št. 5,430,128 (tripeptidilni derivati); US-patent št. 5,434,248 (tripeptidilne spojine); US-patent št. 5,565,430 (spojine Ν,Ν'-diacilhidrazinoocetne kisline); US-patent št. 5,416,013 (peptidilni derivati); PCT-objava WO 94/21673 (alfa-ketoamidni derivati); PCTobjava WO 97/22619 (N-acilamino spojine); PCT-objava WO 97/22618 (aminokislinski ali di- ali tripeptid amidni derivati); PCT-objava WO 95/35308 (inhibitorji, ki obsegajo vodikovo vezno skupino, hidrofobno spojino in elektronegativno skupino); PCT-objava WO 93/14777 (peptidilni derivati); PCT-objava WO 93/16710 (peptidilni derivati); PCT-objava WO 95/05152 (substituirani ketonski derivati); PCT-objava WO 94/03480 (derivati 4-amino-2,2-difluoro-3-okso-l,6-heksandiojske kisline); PCTobjava WO 94/00154 (peptidilni derivati); PCT-objava WO 93/05071 (peptidilni derivati); evropska prijava EP 519 748 (peptidilni derivati); evropska prijava EP 590 650 (ciklopropenski derivati); evropska prijava EP 628 550 (piridazini); evropska prijava EP 644 198 (alfa-heteroariloksimetil ketoni); evropska prijava EP 644 197 (peptidni fosfiniloksimetil ketoni); evropska patentna prijava EP 547 699 (peptidilni derivati); britanska prijava GB 2,278,276 (spojine gama-piron-3-ocetne kisline) in kanadska prijava 2,109,646 (para-nitroanilidni peptidi). Predloženi izum obsega uporabo ICE inhibitorjev, prikazanih v katerikoli od zgoraj navedenih publikacij, v metodah, opisanih tukaj.

Dodatni prednostni ICE inhibitorji za uporabo v metodah v smislu izuma vključujejo ICE inhibitorje asparaginsko kislino, substituirano s sulfonamidi, s formulo I:

R* o _/z0

X''^S^N

R²

RR

OR kjer je

R¹ vodik, Ci-C6-alkil ali benzil;

R² je -CHO-, -COR^a ali -CN;

vsak R^a je neodvisno vodik ali Ci-e-alkil;

X je vez, CH₂, CHR⁵, NH, NR⁵ ali O;

R³ je aril, substituiran aril, heteroaril, substituiran heteroaril, cikloalkil, substituiran cikloalkil, heterocikel ali substituiran heterocikel;

Y je odsoten, NR⁵, CO, S, O, SO2, -O(CHR⁵)„-, CHR⁵, NR⁵CO, NCR⁵, CONR⁵, OCHR⁵, CHR⁵O, SCHR⁵, CHR⁵S, SO2NR⁵, C^-alkil, NR⁵SO2, CH2CHR⁵, CHR⁵CH2, COCH₂ ali CH₂CO;

R⁴ je odsoten, aril, substituiran aril, Ci-Cg-alkil, heteroaril, substituiran heteroaril, cikloalkil, Cj-Ce-alkil, substituiran cikloalkil, heterocikloalkil ali substituiran heterocikloalkil;

vsak R’ je neodvisno vodik, Ci-C6-alkil, aril, -(CH₂)_n-aril ali -(CH₂)_n-cikloalkil;

vsak n je neodvisno 0 do 5, m je 1 ali 2, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estre, amide in predzdravila.

V eni izvedbi izuma je R² CHO.

V drugi izvedbi izuma je R¹ vodik.

V drugi izvedbi izuma je R^a vodik.

V drugi izvedbi izuma je X vez.

V drugi izvedbi izuma je R fenil ali substituiran fenil.

V drugi izvedbi izuma je Y vez.

V drugi izvedbi izuma je Y O.

V drugi izvedbi izuma je Y CH₂.

V drugi izvedbi izuma je R⁴ fenil ali substituiran fenil.

V drugi izvedbi izuma je R² CHO, R^a je H, R¹ je vodik, X je vez, R³ in R⁴ sta fenil ali substituiran fenil in Y je vez, CH₂ ali O.

V drugi izvedbi izuma je m 1 in R⁵ je vodik.

Drugi prednostni ICE inhibitorji, substituirani s sulfonamidi, imajo formulo II:

kjer je

R¹ vodik, Ci-C6-alkil ali benzil;

R²je -CHO, -COR^aali -CN;

vsak R^a je neodvisno vodik ali Ci-C6-alkil;

X je vez, CH₂, CHR⁵, NH, NR⁵ ali O;

Y je vez, NR⁵, CO, S, O, SO₂, CHR⁵, NR⁵CO, CONR⁵, OCHR⁵, CHR⁵O,

-O(CHR⁵)n-, SCHR⁵, CHR⁵S, SO2NR⁵, NR⁵SO2, CH2CHR⁵, CHR⁵CH2, COCH₂ ali CH₂CO;

vsak R⁵ je neodvisno vodik, Ci-Cg-alkil, aril ali -(CH₂)_n-aril;

vsak n je neodvisno od 0 do 5;

m je 1 ali 2;

vsak Z je neodvisno vodik ali arilna, substituirana arilna, heteroarilna, substituirana heteroarilna, cikloalkilna, substituirana cikloalkilna, heterociklična ali substituirana heterociklična skupina, ki je pripojena na fenilno skupino, ki vsebuje Z kot substituent;

R^b, R^c, R^d in R^e so vsak neodvisno vodik, Ci-C6-alkil, Ci-C6-alkoksi, -OH, Ci-C6tioalkoksi, halogen, trifluorometil, dialkilamino, -NO2, -CN, -CF3, -CO2-alkil, -SO3H, -CHO, -CO-alkil, -CONH-alkil, -CONHR^q, -CON(alkil)2, -(CH₂)_n-NH₂, -(CH₂)_n-NHalkil-NHR^q, -NHCOR^q, -(CH₂)_nOH, -(CH₂)_n-CONH₂ ali -(CH₂)_nCO₂H; in R^q je vodik ali Ci-Cg-alkil, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estri, amidi in predzdravila.

V drugi izvedbi glede na spojine s formulo II je R¹ vodik.

V drugi izvedbi glede na spojine s formulo II je R² CHO.

V drugi izvedbi glede na spojine s formulo II je R^a vodik.

V drugi izvedbi glede na spojine s formulo II je X vez.

V drugi izvedbi glede na spojine s formulo II je Y vez, O ali CH₂.

V drugi izvedbi glede na spojine s formulo II sta R^b in Rc vodik.

V drugi izvedbi glede na spojine s formulo II, kjer so R^b, R^c in R^d vodik, je R^e Ci-C6-alkil.

V drugi prednostni izvedbi glede na spojine s formulo II je R^b ali R^c nameščen v para položaju fenilnega obroča glede na X in je R^b ali R^c -OCH₃.

V drugi izvedbi glede na spojine s formulo II je m 1 in R⁵ je vodik.

Prednostne spojine vključujejo:

3-(bifenil-2-sulfoamino)-4-okso-masleno kislino

3- (2-benzil-benzensulfonilamino)-4-okso-masleno kislino

4- okso-3-(2-fenoksi-benzensulfonilamino)-masleno kislino

4-okso-3-(2-p-toliloksi-benzensulfonilammo)-masleno kislino

3- [2-(4-izopropil-fenoksi)-benzensulfonilamino]-4-okso-masleno kislino

4- okso-3 -(2-m-toliloksi-benzensulofnilamino)-masleno kislino

3-[2-(3-izopropil-fenoksi)-benzensulfonilamino]-4-okso-masleno kislino in 3 -(4'-metil-bifenil-2-sulfonilamino)-4-okso-masleno kislino.

Drugi ICE inhibitorji vključujejo spojine s formulo III:

kjer je

R¹ vodik, Ci-Cg-alkil ali benzil;

R²je -CHO, -COR^aali -CN;

vsak R^a je neodvisno vodik ali Ci-Cg-alkil;

X je vez, CH₂, CHR⁵, NH, NR⁵ ab O;

R³ je vodik, Ci-C₆-alkil, aril ali -(CH₂)_n-aril;

vsak nje neodvisno od 0 do 5;

m je 1 ali 2;

Z je odsoten ali je arilna, substituirana arilna, heteroarilna, substituirana heteroarilna, cikloalkilna, substituirana cikloalkilna, heterociklična ali substituirana heterociklična skupina, ki je pripojena na fenilno skupino, ki vsebuje Z kot substituent;

R¹ bi R^s sta vsak neodvisno vodik, Cj-Ce-alkil, hidroksi, halogen, trifluorometil, dialkilamino, -NO2, -CN, -CO2H, -CO2-alkil, -SO3H, -CHO, -CO-alkil, -CONH2, -CONH(CH2)n-aril, -CONH(CH2)„-substituban aril, -CONH-alkil, -CONHR^q, -CON(alkil)2, -(CH₂)_n-NH₂, -(CH₂)_n-NH-alkil, -NHR^q, -NHCOR^q, -OR^q, -SR^q ali -(CH₂)_n-aril, in

R^q je vodik ali Ci-C₈-alkil, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estre, amide in predzdravila.

V prednostni izvedbi spojin s formulo III je R^f v orto položaju glede na X na fenilnem obroču in je R⁸ vodik.

V prednostni izvedbi spojin s formulo III je Z vodik, m je 1, R⁵ je vodik in R^a je vodik.

V prednostni izvedbi spojin s fonnulo III je spojina tribenzensulfonilamino-4-oksomaslena kislina.

Zgoraj opisane ICE inhibitorje, s sulfonamidi substituirano asparaginsko kislino, lahko na splošno naredimo takole:

(1:4:sled)

Nu

O

Nu = nldfiofil

Drugi sulfonamidni ICE inhibitorji, ki jih lahko uporabimo v smislu izuma, so spojine s formulo IV:

kjer je R¹

R³ je vodik,

Cj-Cg-alkil,

-(CH₂)„-aril ali -(CH₂)_n-heteroaril;

R⁴ je C_rC₆-alkil,

-(CH₂)_n-aril ali -(CH₂)_n-heteroaril;

R⁵ in R⁶ sta vsak neodvisno vodik, Ci-C6-alkil,

-(CH₂)_n-aril ali -(CH₂)_n-heteroaril;

R⁷ je Ci-Ce-alkil,

-(CH₂)_n-aril ali

-(CH₂)_n-heteroaril; vsak nje O do 6; vsak m je O, 1, 2 ali 3;

A je alanin, levcin, izolevcin, prolin, fenilalanin, glicin, tirozin, serin, treonin, triptofan, cistein, metionin, valin, asparagin, glutamin, asparaginska kislina, lizin, glutaminska kislina, arginin ali histidin;

R²je-(CH₂)_n-Zin

Z je aril, heteroaril, cikloalkil, Ci-Cč-alkil, —

(CH₂)_nH <^CH2>7 <^R<\ ’

ⁿ fluorenil, substituiran fluorenil, substituiran aril, substituiran heteroaril ali substituiran cikloalkil, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estri, amidi in predzdravila.

V prednostni izvedbi spojin s formulo IV je R¹ O

R⁷0‘ (^A)m

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo IV je R¹ O

m je 0 in R⁷ je -(CH₂)_n-aril.

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo IV je R¹ O

m je 0 in R⁷ je -CH₂-aril.

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo IV je R² -(CH₂)_n-aril.

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo IV je aril fenil ali naftil.

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo IV je R² -(CH₂)_n-cikIoalkil.

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo IV je R¹

O /(CITpH— fenil ali -SO₂-fenil.

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo IV je R²

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo IV je R²

Drugi sulfonamidni ICE inhibitorji vključujejo spojine s formulo V:

kjer je R' -CH₂-CH₂-aril, -CH₂-cikloalkiI, -CH₂CH₂-cikloalkil ali -CHjCHo-heteroaril;

R je

R^a

O

O

II bdi'

R^eO o

R^L ;n

O

R^L o ch₃

ali C.

O o

O

R^a je -(CH₂)_n-aril ali -(CH₂)_n-heteroaril; R^b je aril ali heteroaril;

R^c je -CH₂-aril ali aril;

R^d je vodik ali Ci-C6-alkil;

R^e je -CH₂-aril ali -CH₂-heteroaril, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estre amide in predzdravila.

V prednostni izvedbi spojin s formulo V je R¹

R^eO

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo V je R¹

O

II .s. ·

Rb^ll^ ^R o

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo V je R^e -(CH₂)_n-aril.

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo V je aril fenil ali naftil.

V drugi prednostni izvedbi spojin s formulo V je R^b aril.

Prednostne spojine vključujejo:

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-fenoksi-etansulfonilamino)-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbomlamino-4-okso-5-(3-fenil-propan-l-sulfonilamino)-pentanojsko kislino;

3-benzensulfonilamino-4-okso-5-(2-feniletan-l-sulfonilainino)-pentanojsko kislino;

5-benzensulfonilamino-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-metansulfonilamino-4-okso-pentanojsko kislino;

-benziloksikarbonilamino-5-(naftalen-1 -sulfonilamino)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(2-cikloheksil-etansulfonilamino)-4-okso-pentanojsko kislino;

-benziloksikarbonilamino-5-(2-naftalen-1 -il-etansulfonilamino)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(7,7-dimetil-2-okso-biciklo[2.2.1]hept-l-(R)ilmetansulfonilamino)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-benziloksikarbomlamino-5-(indan-l-ilmetansulfonilamino)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(9-fluoro-9H-fluoren-9-ilmetansulfomlamino)-4-oksopentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(7,7-diinetil-2-okso-biciklo[2.2.1]hept-l-(S)ilmetansulfonilamino)-4-okso-pentanojsko kislino;

- [2-(2-benziloksikarbonilamino-3 -metil-butirilamino)-propionilamino]“4-okso-5-(2fenil-etansulfonilamino)-pentanoj sko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-4-karboksi-butirilamino)-3-metilbutirilamino]-4okso-5-(2-fenil-etansulfonilamino)-pentanojsko kislino;

- { 2-[4-karboksi-2-(3-fenil-propionilamino)-butirilamino]-3 -metilbutirilamino} -4okso-5-(2-fenil-etansulfonilamino)-pentanojsko kislino;

3-(2-{2-[2-acetilamino-3-(4-hidroksi-feiul)-propionilamino]-4-karboksibutirilamino}3 -metil-butirilamino)-4-okso-5-(2-fenil-etansulfonilamino)-pentanoj sko kislino;

3-(2-acetilamino-3-metil-butirilamino)-5-(7,7-dimetil-2-okso-biciklo[2.2.1]hept-l-(S) ilmetansulfonilamino)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-(2-acetilamino-propilamino)-5-(7,7-dimetil-2-okso-biciklo[2.2.1]hept-l-(S)-ilmetan sulfonilamino)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-propionilamino]-5-(7,7dimetil-2-okso-biciklo[2.2.1 ] hept-1 -ilmetansulfonilamino)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-{2-[4-karboksi-2-(3-fenil-propionilamino)-butirilamino]-3-metil-butirilamino}-5(7,7-dimetil-2-okso-biciklo[2.2.1]hept-l-ilmetansulfonilamino)-4-okso-pentanojsko kislino;

-(2- { 2-[2-acetilamino-3 -(4-hidroksi-fenil)-propiomlamino]-4-karboksi-butirilamino } 3-metil-butirilamino)-5-(7,7-dimetil-2-okso-biciklo[2.2. ljhept-1ilmetansulfonilamino)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-4-karboksi-butirilamino)-3-metil-butirilamino]-5(7,7-dimetil-2-okso-biciklo[2.2.1]hept-l-ibnetansulfonilamino)-4-okso-pentanojsko kislino;

3- (l,2,3,4-tetrahidro-l-okso-izokinolin-2-il)-acetanino-5-benzensulfonilamino-4hidroksi-pentanojsko kislino;

(S)-5-(biciklo[2.2.1jhept-l-ilmetansulfonilamino)-4-okso-3-[2-(l-okso-3_J4-dihidro1 H-izokinolin-2-il)-acetilamino]-pentanoj sko kislino; (S)-4-okso-3-[2-(l-okso-3,4-dihidro-lH-izokinolin-2-il)-acetilamino]-5-(2-feniletansulfonilamino)-pentanojsko kislino; in

4- okso-3 - [2-( 1-okso-3,4-dihidro-1 H-izokinolin-2-il)-acetilamino]-5fenibnetansulfonilamino-pentanojsko kislino.

Drugi sulfonamidni ICE inhibitorji vključujejo spojine s formulo VI:

.COOH

o

CH· o

kjer je R'

VI

Ο

II

ο

C ο ch₃

ο ali

R^eO

C

O

R^a je -(CH₂)_n-aril ali -(CH₂)_n-heteroaril

R^b je aril ali heteroaril

R^c je -CH₂-aril ali aril

R^d je vodik ali Ci-C₆-alkil

R^e je -CH₂-aril ali -CH₂-heteroaril, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estre, amide in predzdravila.

V prednostni izvedbi spojin s formulo VI je R¹ O

V prednostni izvedbi spojin s formulo VI je R¹ O

II

V prednostni izvedbi spojin s formulo Vije R^e -(CH₂)_n-aril.

V prednostni izvedbi spojin s formulo Vije aril fenil ali naftil.

V prednostni izvedbi spojin s formulo VI je R^b aril.

Zgoraj opisane spojine s formulami IV, V ali VI lahko pripravimo na splošno s pretvorbo ustreznega izhodnega sulfonamida i v Boc-sulfonamid 2 z uporabo reagenta, kot je npr. di-terc.butil dikarbonat. Boc-sulfonamid 2 lahko nato reagira z ustrezno substituiranim asparaginska kislina bromometilketon β-terc.butil estrom 3 v prisotnosti baze, nato pa ga obdelamo s kislino, da dobimo želeni produkt 4.

Shema 1

O

H₂N— S—R² -► Boc—N n u q di terc.-butil dikarbonat ⁿ 1

O u

-sII

O

*>

J

O ¹¹ o

1. Boc—N—S—R²

H i' baza O

2. HCiaIiCF₃COOH

Alternativno lahko spojine s formulami IV, V ali VI pripravimo na splošno z reakcijo ustrezno substituiranega aldehida asparaginske kisline j. z nitrometanom v prisotnosti baze, kot je kalijev terc.butoksid, da dobimo nitroalkohol 2. Z redukcijo 2 v amin 3 in nato z reakcijo z ustreznim sulfonilkloridom dobimo produkt 4, le-tega pa lahko oksidiramo v keton 5 z reagentom, kot je Dess Martinov perjodinan ali s Swemovo oksidacijo. S kislo deprotekcijo t-butil estra s HCI ali trifluoroocetno kislino dobimo želeni produkt 6.

Shema 2 ,1 H ,1 H

R—N^COOMe ^R —N^COOH : £ ^Ξ—COOt-Bu COOt-Bu i h

R¹— K /CHO

R¹— N^C^OH ⁼—COOt-Bu

OH , H ?^H „ OH ^{R N}>A\/^N02 ^rI—Nx/O_/-NH₂ —COOt-Bu 1 —COOt-Bu 2

OH —COOt-Bu 3

R^-SO^Cl R¹~^N\_rxk^/N~SO₂—R²

-COOt-Bu ^{rI S0}2 R² R¹——SO?—R²

-—COOt-Bu 5 •a^H

Še druge ICE inhibitorske spojine, ki jih lahko uporabimo v smislu izuma vključujejo hidroksamatne spojme, vključno spojme s formulo VII:

t^a (CH₂)_n—Q

VII kjer je R¹

ο

II

R^{4/ X}(A)_m r⁷o (A)

O ^{11 R} \ /S. / ali ll^X(A)Jf _r6^ o ^m vsak Rje neodvisno vodik ali Ci-Ce-alkil;

R³ je vodik, Ci-C₆-alkil, -(CH₂)_n-aril, -(CH₂)_n-heteroaril, -(CH₂)_p-X-aril ali (CH₂)_p-X-heteroaril;

R⁴ je Ci-Cfi-alkil, -(CH₂)_n-aril, -(CH₂)_n-heteroaril, -(CH₂)_rX-aril ali -(CH₂)_rXheteroaril;

R⁵ in R⁶ sta vsak neodvisno vodik, Cj-Cg-alkil, -(CH₂)_n-aril, -(CH₂)_n-heteroaril, (CH₂)j-X-aril ali -(CH₂)j-X-heteroaril;

R⁷ je Ci-C₆-alkil, -(CH₂)_p-aril, -(CH₂)_p-heteroaril, -(CH₂)j-X-aril ali -(CH₂)j-Xheteroaril;

vsak nje neodvisno 0 do 6;

vsak p je neodvisno 1 do 6;

vsak j je neodvisno 2 do 6;

vsak m je 0 do 2;

A je alanin, valin, serin, treonin, glutaminska kislina, lizin, arginin, histidin, glutamin ali alfa amino maslena kislina;

R^a je vodik, Ci-C6-alkil ali -(CH₂)„-fenil;

X je O ali S in

Q je Ci-C6-alkil, -(CH₂)_n-aril, -(CH₂)_n-heteroaril, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estri, amidi in predzdravila.

V eni izvedbi spojin s formulo VII je vsak R vodik.

V drugi izvedbi spojin s formulo Vlije R¹

Ο

in m je 0.

V drugi izvedbi spojin s formulo VII je R¹ o

m je 0 in R⁷ je -(CH₂)_n-aril.

V drugi izvedbi spojin s formulo Vlije Q -(CH₂)_n-fenil ali (CH₂)_n-naftil.

V drugi izvedbi spojin s formulo VII je R^a vodik ali metil.

V drugi izvedbi spojin s formulo Vlije Q -CH₂-fenil, -CH₂-naftil, -CH₂CH₂-fenil ali CH₂CH₂-naftil.

Druge hidroksamatne ICE inhibitorske spojine vključujejo spojine s formulo VIII

kjer je Z

Cntn vsak g je neodvisno vodik, C_rC₆-alkil, C_rC₆-alkoksi, -(CH₂)_nCO₂R, -(CH₂)_n-aril, aril, -(CH₂)_n-heteroaril ali -heteroaril;

UjeOaliCH₂;

'I ^r5\ /S ali _r6^ o ^m vsak Rje neodvisno vodik ali Ci-C₆-alkil;

R³ je vodik, Ci-C₆-alkil, -(CH₂)_n-aril, -(CH₂)_n-heteroaril, -(CH₂)_p-X-aril ali -(CH₂)_p-X-heteroaril;

R⁴ je Ci-C₆-alkil, -(CH₂)„-aril, -(CH₂)_n-heteroaril, -(CH₂)j-X-aril ali -(CH₂)j-Xheteroaril;

R⁵ in R⁶ sta vsak neodvisno vodik, Ci-C₆-alkil, -(CH₂)_n-aril, -(CH₂)_n-heteroaril, (CH₂)j-X-aril ali -(CH₂)j-X-heteroaril;

R⁷ je Ci-C₆-alkil, -(CH₂)_p-aril, -(CH₂)_p-heteroaril, -(CH₂)j-X-aril ali -(CH₂)j-Xheteroaril;

vsak n je neodvisno 0 do 6;

vsak p je neodvisno 1 do 6;

vsak j je neodvisno 2 do 6;

vsak m je 0 do 2;

A je alanin, valin, serin, treonin, glutaminska kislina, lizin, arginin, histidin, glutamin ali alfa amino maslena kislina in

X je O ali S in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estri, amidi in predzdravila.

V eni izvedbi spojin s formulo VIII je Z O

g g in vsak g je vodik.

V drugi izvedbi spojin s formulo VIII je R o r⁷o

(A) τη in m je 0.

V eni izvedbi spojin s formulo VIII je R¹ r⁷o m je 0 in R⁷ je -(CH₂)_n-aril.

V eni izvedbi spojin s formulo Vilije R⁷ -(CH₂)_n-fenil.

V prednostni izvedbi spojin s formulo VIII je Z

in vsak g je vodik.

Prednostne hidroksamatne ICE inhibitorske spojine vključujejo:

3-benziloksikarbonil-amino-4-okso-5-fenilacetilaminooksi-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-pirolidin-l-iloksi)-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-5-(3,5-diokso-10-oksa-4-aza-triciklo[5.2.1.0^2,6]dek-8-en-4 iloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(2-okso-2,3-dihidro-indol-l-iloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(7-metoksikarbonilmetil-2-okso-oktahidro-indol-liloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-oktahidro-indol-l-iloksi)-pentanojsko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-propionilamino]-5-(7metoksikarbonilmetil-2-okso-oktahidro-indol-l-iloksi)-4-okso-pentanojsko kislino; 3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-propionilamino]-4-okso-5-(2okso-2,3-dihidro-indol- l-iloksi)-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(2,5-diokso-pirolidin-l-iloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2,2,3-trinietil-5-okso-pirolidin-l-iloksi)pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(l,3-diokso-oktahidro-izoindol-2-iloksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(l,3-diokso-l,3-dihidro-izoindol-2-iloksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[3-(4-bromo-fenil)-2,5-diokso-2,5-dihidro-pirol-liloksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3- benziloksikarbonilamino-5-(3,5-diokso-4-aza-triciklo[5.2.1.0^2,6]dec-8-en-4-iloksi)4- okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(2,4-diokso-3-aza-spiro[5.5]undec-3-iloksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5- (2-bifenil-4-il-5-okso-pirolidin-l-iloksi)-4-okso-3-(2-propenil-penta-2,4dieniloksikarbonil amino)-pentanojsko kislino;

5-benzoilaminooksi-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(3-fenil-propionil-aniinooksi)-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(2-naftalen-l-il-acetil-aminooksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(3-naftalen-l-il-propionilaminooksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[metil-(3-feml-propionil)-aminooksi]-4-oksopentanojsko kislino;

5-(benzoil-metil-aminooksi)-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-5-[metil-(3-naftalen-l-il-propionil)-aminooksi]-4-oksopentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[metil-(naftalen-l-il-acetil)-aminooksi]-4-oksopentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[benzil-(3-fenil-propioml)-aminooksi]-4-oksopentanojsko kislino;

5-[benzil-(3 -naftalen-1 -il-propionil)-aminooksi]-3 -benziloksikarbonilamino-4-21 pentanojsko kislino;

5-(3-benzil-2-okso-pirolidin-l-iloksi)-4-okso-3-(2-propenil-penta-2,4dieniloksikarbonilaminoj-pentanojsko kislino;

5-(3-metil-2-okso-pirolidin-l-iloksi)-4-okso-3-(2-propenil-penta-2,4dieniloksikarbonilamino)-pentanoj sko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-[metil-(fenilacetil)-aminooksi]-pentanojsko kislino ali

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-( 1-okso-l,3-dihidro-izoindol-2-iloksi)pentanojsko kislino.

Hidroksamatne ICE inhibitorje, kot so opisani zgoraj, lahko npr. pripravimo, kot je opisano v Primeru 12.

Še nadaljnji tipi ICE inhibitorjev, ki jih lahko uporabimo v smislu izuma, vključujejo aspartatne estrske inhibitorje, vključno spojine s formulo IX:

IX kjer je R¹ R³OC(O)-,

R³CO-, r³so₂-,

R⁵N(R^a)CHR⁶CO-,

Ο

ο ·νη₂ ο

ιι

C ο

ο —c

ιι

C ο

ιι

Ο vsak R^a je neodvisno vodik, Ci-Cč-alkil ali -(CH₂)_n-aril; R² je-(CRR)„-aril,

-(CRR)„-X-aril,

-(CRR)_n-heteroaril,

-(CRR)_n-X-heteroaril,

-(CRR)_n-(substituiran heteroaril), -(CRR)_n-(substituiran aril), -(CRR)_n-X-(substituiran aril),

-(CRR)_n-aril-aril,

-(CRR)_n-aril-heteroaril,

-(CRR)_n-aril-(CH₂)_n-aril,

-(CRR)„-CH(aril)₂,

-(CRR)„-cikloalkil,

-(CRR)_n-X-cikloalkil,

-(CRR)_n-heterocikel,

-(CRR)_n-X-heterocikel,

-(CRR)n-substituiran heterocikel,

-(CRR)-CH /CH;,) —aril ^(CH2)n^—aril.

— substituiran aril

-(CRR) — CH (CH^-aril

O (CRR)-N

,(ch₂)/

-(CRR)-CH — heteroaril (^CH2)—,

O

O

N—S—[aril ali substituiran aril) , 'II O

H

N—CO(CH₂)—[ aril ali substituiran aril) O ν^Λ

N- aru _f

a „γΚ°(εΗ₂)_ηΗτΐι —(CRR)—N

- (CRR)_nCH

ali

vsak Rje neodvisno vodik, Ci-C₆-alkil, halogen ali hidroksi; Xje O ali S;

R³ je Ci-Cfi-alkil, aril, heteroaril,

-(CHR)_n-aril,

-(CHR)_n-heteroaril,

-(CHR)_n-substituiran heteroaril,

-(CHR)_n-substituiran aril,

-(CRR)_nC(O)ORa,

-(CRR)_nS(CH₂)_n-aril, cikloalkil, substituiran cikloalkil, heterocikel, substituiran heterocikel,

-(CRR)_nC(O)NR^aR^a,

-(CRR)_n-SO₂-(CH₂)„-aril,

-(CRR)_n-SO₂-C_rC₆-alkil,

J-CH₂C(R^a)H-,

-CHR⁶C(O)-heteroaril,

-(CRR)_nS(CH₂)„C(O)OR^a,

-(CRR)_n-SO₂-(CH₂)_nC(O)OR^a,

-(CRR)_nS(CH₂)_n-aril,

-(CRR)_n-SO₂-(CH₂)_n-aril,

-(CRR)_nSC(O)C_rC₆-alkil,

-(CRR)_nS(O)(CH₂)_n-aril,

-(CRR)_nS(O)(CH₂)_nCO₂R^a,

-(CH₂)_nNHC(O)C_rC₆-alkil

-(CH₂)_nC(O)NR^bR^b.

O R

Λ^V(CH₂)„

ο ιι aril —S

O

II

I'^jr^C_<CRR,“ ali ^ril

0=S=0 I 0 N. ¹¹ vsak Rje neodvisno Ci-C6-alkil, Ci-Cg-alkilaril, aril ali vodik;

vsak J je neodvisno -CO₂R^b,

-CONR^bR^b,

-SO₂NR^bR^b ali -SO₂R^b;

vsak R^b je neodvisno vodik, Ci-C₆-alkil, aril, substituiran aril; arilalkil, heteroarilalkil, substituiran arilalkil ali substituiran heteroarilalkil;

R⁴ je vodik,

Cj-Ce-alkil,

CH₃OC(O)-,

-fenil ali

C_rC₆-alkil C(O)-;

R⁵ je Ci-C6-alkil-CO-,

-(CH₂)_n-aril,

C_rC₆-alkil-OC(O)-,

Ci-C₆-alkil-X-(CH₂)_nCO,

C₁-C₆-alkil-X-(CH₂)_nOC(O)-,

-C(O)(CRR)„-aril,

-C(O)NR^aR^a,

-SO₂-Ci-C6-alkil,

-C(O)(CH₂)_nC(O)NR^aR^a,

-C(O)O(CH₂)_n-aril,

-C(O)O(CH₂)_n-substituiran aril,

-C(O)(CRR)_nNHC(O)O(CH₂)_n-aril,

-(CH₂)_nX(CH₂)_n-aril, -Ci-C6-alkil-X-Ci-C6-alkil aril ali

0 0

II II U

-C-CH-NHC-CH-NHCCJ-C6 alkil

I I (CH2)_n CH2-^heteroaril I

CO₂R^a

R^5aje

C(O)C_rC₆-alkil,

-C(O)OC,-C₆-alkil,

Ο Ο β η

-C-CH-NHCCi-C₆ alkil (CH₂)_n aril ali substituiran aril,

C(O)O(CH₂)„-aril,

C(O)(CH₂)_n-aril ali O 0

I! II

CCHNHCCi-C<5 alkil I

CH₂ heteroaril

R⁶ je vodik,

Ci-C6-alkil, -(CH₂)„-aril, -(CH₂)_nCO₂R^a, s hidroksilom substituiran Ci-C₆-alkil ali z imidazolom substituiran Ci-C₆-alkil;

vsak n je neodvisno 0 do 3, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estre, amide in predzdravila.

V eni izvedbi spojin s formulo IX je R¹ fenil-CH₂-OC(O)-.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R¹ fenil-SO₂-.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R¹ CH₃-OC(O)-.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R¹ fenil-CH₂CH₂-CO-.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R¹

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R¹

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R¹ fenil-CH₂-CO-.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R¹

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je vsak R^a vodik.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R² -(CH₂)_n-fenil.

V eni izvedbi spojin s formulo IX je R² -(CH₂)_n-naftil.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R² -(CH₂)_n-O-fenil.

V drugi izvedbi spojni s formulo IX je R² -(CH₂)_n-O-naftil.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R -(CH₂)_n-S-fenil. ·

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je R² -(CH₂)_n-CH-(fenil)₂.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je vsak R^a vodik; R¹ je benziloksikarbonil; R² je aril-X(CRR)_n-, aril-(CRR)_n-, heteroaril-(CRR)_n- ali cikloalkil-(CRR)_n-; nje 1, 2 ali 3; Xje O ali S; in Rje vodik, metil ali benzil.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je vsak R^a vodik;

R¹ je benziloksikarbonil in R² je-(CH₂)_n-naftil,

-(CH₂)„-fenil,

-(CH₂)_n-cikloalkil,

-(CH₂)_nO(CH₂)_n-naftil,

-(CH₂)„O(CH₂)_n-fenil ali -(CH₂)_nS(CH₂)_n-fenil.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je vsak R^a vodik; R¹ je benziloksikarbonil in R² je -CFk-naftil.

V drugi izvedbi spojin s formulo IX je vsak R^a vodik; R² je benziloksikarbonil,

O

O

II —c—CH—NHC—CHNHC-CHNHCC,-C<alkil,

I \ .

CH^CH₃ CH₂CH₂CO₂H ^CH2^heteroaril —C—CH—NHC—CHNHC CHNHCC,-Cz-alkil,

I \ , I pu arn Ί

CH₃ ch₃ CH₂CH₂CO₂H 2

-C-CH-CH2-S-aril ali I ch₃ o o

II II

-C-CHCH₂-S-aril.

I II ch₃ o

Druge aspartatne estrske ICE inhibitorske spojine, ki jih lahko uporabimo v smislu izuma, vključujejo spojine s formulo X:

/CO₀H r ² O

O

X kjer je R¹

-C(O)OCH₂-fenil,

-SO₂-fenil,

-C(O)OCH₃,

C(O)CH₂CH₂-fenil,

O O i «

Č-CHNHCCH3, ch₃

-C(O)CH₂-tienil,

-C(O)C_rC₆-alkil,

-(CH₂)₃-fenil,

O

C —C—CH-NHCOCH₂ fenil h₃c ^xch₃ 0 0

-CCH-NHS-CH3,

I II ch₃ o

000 II II II

-C-CH-NH-C-CH-NHCCH3, ch₃ (ch₂)₂ fenil

0

-C-CH-NHCCH3, ch₂ ch₃

0 0

D II II

-CCHNHC(CH₂)3CNH₂ ch₃

Ο Ο

II II

C-CHCH₂S-fenil,

I β

CH₃ 0

Ο

-C-CH-NHCNH₂, ch₃ ο ιι

C—CHi ι -ο.

-CCH-C- tienil,

I ch₃ ο ο

II β

-c-chch₂-s-ch₃

I i ch₃ ο ο ο

II β

-C(CH₂)2CNH₂, ο ο

II II

-C(CH₂)₃CNH₂,

Ο Ο

II I

-cchch₂cnh₂, ch₃

-S(CH₂)_nSCH₃,

U II o o o o

-cchch₂sch_3} ch₃ o

-CCHNHC-CHNHCOCHnfenil,

I II ² ch₃ o o o —C—CH—NHCOCH, fenil

Λ

H₃C^{z x}CH₃ fenil

O=S=O ^{0 0} Λ

II II N —cch₂ch₂c—/ \

0 0

II II II

C-CH-NHC-CHNHCCH₃,

CH₃ (CH₂)2

I

C0₂H χ

Č-CH—N N- fenil

I V_7 CH,

II

II

-CCH-SCH₂ fenil,

I ch₃ o

II •c0

X

CH-N N- fenil

U ,

CH

II

-cO

II

O

II

CH—NHC— CH-NHCOCH/enil h₃c

CH, (CH₂)₂ co₂h

O

II o

II

O

II —C—CH—NHC—CH—NHCCHNHCCH, h₃c ch₃

II

OH

O

II —c

cnh46

Ο

-C-CH-NHC(CH₂)₂ fenil, I

CH₃

O

II

-c•CH—NHC—CH ^{1 x}ch₂ch₃

CH,

O

II

-cO

II

O

II

CH—NHC— CH —NHCCHNHCCH, h₃c

CH,

O O

II II

-C—CH—NHCCH, (CH₂)2 CH₂ CO₂H imidazoil h₃c

OH

O O

II II

-CCHCH₂CNH(CH₂)₂ fenil, I ch₃ o

II o

II

O

II

C—CH—NHC—CH—NHCCHNHCCHh₃c

CH,

OH

Β

CCH-CH₂-S-fenil,

I ch₃ o o

B

CCHCH₂-S-fenil,

I B ch₃ o

II

C-CHCH₂-S-(CH₂)₂ fenil,

I ch₃ o o

II II

-C-CH-CH₂-S(CH₂)₂ fenil,

I II ch₃ o o

II

-C-CHCH₂SCH₂ fenil,

I ch₃

O O

II U

-C-CH-CH₂-S(CH₂)₂ fenil,

I II ch₃ o o o » II

-C-CH—SCH₂ fenil,

I II ch₃ o o o —C—CH—NHCCH₉CH₉ fenil

Λ

Η₃σΥΗ₃

-S-CHCH₂SCH₃,

II I II o ch₃ o

O o

II II

-cchch₂scch₃, ch₃ o

II

-cchch₂co₂h,

I ch₃

II

-CCHCH₂S-(CH₂)₃- fenil,

I ch₃ o o

II II :C-CH-CH₂S-(CH₂)₃ fenil, ' I II ch₃ o

C-CH-CH₂S(CH2)2 CO₂H, ch₃

O O

II II

C-CHCH2S(CH2)2CO₂H ali

I II ch₃ o o

-CCHCH₂S-(CH₂)2CO₂H in

I II ch₃ o

R²je

-CH₂CH₂-fenil,

-CH₂-naftil,

-CH₂CH₂-cikloheksil,

-CH₂O-naftil,

-CH₂O-fenil,

-CH₂S-fenil,

-CH₂-substituiran naftil,

-CH₂CH(fenil)₂,

-CH₂-imidazol,

-(CH₂)₃-fenil,

-C(CH₃)H-naftil,

-CH[CH₂-fenil]₂,

-C(OH)H-naftil,

-CH₂-NH-fenil, /

- CH₉—CH ⁴ \

CH₂ substituiran fenil naftil

-CH₂-naftil-fenil,

-CH₂-fluorenil,

-CH₂-naftil-tienil,

Ο II ,N-S— substituiran fenil, 0

O

II ,N—COCH2 fenil,

-CH₂-benzofuranil, -CH₂-benzotienil, -CH₂-naftil-CH₂-fenil, -CH₂-substituiran fenil,

-CH2- substituiran indolil,

O

C— fenil

O

COCHo 1 2 fenil

Z — CH₉—CH ^z \ fenil

CH₂ fenil fenil

Z

vsak n je neodvisno O do 3, in njihove farmacevtsko sprejemljive soli, estre, amide in predzdravila.

Prednostne aspartat estrske ICE inhibitorske spojine vključujejo:

3-benziloksikarbonilamino-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(3-fenil-propioniloksi)-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-5-(3-cikloheksil-propioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(naftalen-l-il-oksi)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-fenoksiacetoksi-pentanoj sko kislino; 3-beziloksikarbonilamino-4-okso-5-fenilsulfanilacetoksi-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-5[(6-metoksi-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(nafitalen-2-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbomlamino-5-(3-naftalen-2-il-propioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

-benziloksikarbonilamino-5-(3,3 -difenil-propioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-5-[(lH-indol-3-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

-benziloksikarbonilamino-5-(indol-1 -il-acetoksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-benzilksikarbonilamino-5-(2-naftalen-l-il-propiomloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-[(2-okso-pirolidin-l-il)-acetoksi]-pentanojsko kislino;

5-[(acetil-fenil-amino)-acetoksi]-3-benziloksikarbonil-amino-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(hidroksi-naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-[(fenil-amino)-acetoksi]-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(6-hidroksi-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[3-(4-hidroksi-fenil)-2-naftalen-l-il-propioniloksi)-4okso-pentanojsko kislino;

(S)-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-fenilacetoksi-pentanojsko kislino; (S)-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(4-fenil-butiriloksi)-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-[(4-fenil-naftalen-l-il)-acetoksi]-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(4-metil-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-[(4-tiofen-2-il-naftalen-l-il)-acetoksi]pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(4-fluoro-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(2-metil-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(2-fluoiO-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(benzofuran-4-il-acetoksi)-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(benzo[b]tiofen-7-il-acetoksi)-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(benzo[b]tiofen-4-il-acetoksi)-3-beiLzilokstkarbonilamino-4-okso-pentanojsko kislino;

5-[(4-benzil-naftalen-l-il)-acetoksi]-3-benziloksikarbonilarnino-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(3,4-dLhidro-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(5-bromo-lH-indol-3-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-(3,4-difenil-butiriloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(3 -fenil-3 -fenilamino-propioniloksi)-pentanoj sko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-[(l,2,3,4-tetrahidro-naftalen-2-il)-acetoksi]pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilammo-5-[(l-metansulfonil-piperidm-4-il)-acetoksi]-4-oksopentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-[(2₇3,5,6-tetrametil-fenil)-acetoksi]-pentanojsko kislino;

5-(benzotiazol-4-il-acetoksi)-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(benzofuran-3-il-acetoksi)-3-benziloksikarbonilammo-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(benzo[b]tiofen-3-il-acetoksi)-3-benziloksikarbonilamino-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(3-fenil-3-piridin-2-il-propioniloksi)-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(2,3-dikloro-fenil)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(5-metil-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(2-jodo-fenil)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(3-piridin-3-il-propioniloksi)-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(5-metoksi-nafitalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(8-metil-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(9H-fluoren-9-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino; 3-benziloksikarbonilamino-5-[(10_Jll-dihidro-5H-dibenzo[a,d]ciklohepten-5-il)acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

5-okso- l-(toluen-4-sulfonil)-pbolidin-2-karboksibia kislina3-benziloksikarbonilamino-4-karboksi-2-okso-butil ester;

5-okso-pirolidin-l,2-dikarboksilna kislina 1-benzil ester 2-(3benziloksikarbonilamino-4-karboksi-2-okso-butil)-ester;

-benzoil-pirolidin-2-karboksilna kislina 3 -benziloksikarbonilamino-4-karboksi-2okso-butil ester;

pirolidin-l,2-dikarboksilna kislina 1-benzil ester 2-(3-benziloksikarbonilamino-4karboksi-2-okso-butil)ester;

3-benziloksikarbonilamino-5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-5-[(5-ciano-naftalen-l-il)-acetoksi]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(3-fenil-3-pnidin-3-il-propioniloksi)-pentanojsko kislino;

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(3-fenil-3-piridin-4-il-propioniloksi)-pentanojsko kislino; in

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-[(l-okso-3,4-dihidro-lH-izokinolin-2-il)acetoksij-pentanojsko kislino;

3-benzensulfonilainino-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

-metoksikarbonilamino-5-(naftalen-1 -il-acetoksi)-4-okso-pentanoj sko kislino; 5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-(3-fenil-propionilamino)-pentanojsko kislino; 3-metoksikarbonilamino-4-okso-5-fenoksiacetoksi-pentanojsko kislino; in 3-(2-metansulfonil-1 -metil-etilsulfanilamino)-5-(naftalen-1 -il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

[S-(R*,R*)]-3-(2-acetilamino-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-[(tiofen-3-karbonil)-amino]-pentojsko kislino;

- [(furan-3 -karbonil)-amino]-5-(naftalen-1 -il-acetoksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(4-fenil-butirilamino)-propilamino]-pentanojsko kislino;

3-(2-metansulfonilamino-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-[2-(2-acetilamino-4-fenil-butirilamino)-propionilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

3-(2-acetilamino-butirilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino; 3-[2-(4-karbamoil-butirilamino)-propionilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-benziloksikarbonilamino-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5-(naftalen-1 -il-acetoksi)-4-okso-3 -(2-ureido-propionilamino)-pentanoj sko kislino;

3-(2-acetilamino-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-[(l-acetil-pirolidm-2-karbonil)-ammo]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4--oksopentanojsko kislino;

3-(2-metil-3-okso-3-tiofen-2-il-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-acetilamino-acetilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

-(2-acetilamino-propionilamino)-5-(3,3-difenil-propioniloksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-[2-(2-acetilanaino-4-karboksi-butirilamino)“propionilamino]-5-(naftalen-l-ilacetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(3-fenil-propionilamino)-propionilamino]pentanojsko kislino;

3-[2-(3-metil-butirilamino)-propionilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-[(l-acetil-4-benziloksi-pirolidm-2-karbonil)-amino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

3-(4-karbamoil-butirilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino; in 3-[2-(l-metil-lH-imidazol-4-il)-acetilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

(S)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-fenilacetilamino-pentanojsko kislino; (S)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-(2-tiofen-2-il-acetilamino)-pentanojsko kislino; 3-[(2-karbamoil-ciklopentankarbonil)-aniino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-[(3-karbamoil-biciklo[2.2.1]heptan-2-karbonil)-amino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

3-(3-metansulfonil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(3-benzensulfonil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

-butirilammo-5-(naftalen-2-il-acetoksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-acetilamino-5-(naftalen- l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-(3-metansulfonil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(3-metil-butirilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino; 3-(3-karbamoil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino; [S-(R ,R )]-3-(3-acetilsulfanil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen- l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino; in /ra«5-3-[(3-karbamoil-ciklopentankarbonil)-amino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino

3-( 1,2,3,4-tetrahidro-1 -okso-izokinolin-2-il)-acetamino-5-(naftalen- l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

3-(2-metil-3-fenetilkarbamoil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5-(naftalen-2-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(2-okso-6-fenil-piperidin-l-il)-acetilamino]pentanojsko kislino;

5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(2-okso-6-fenil-piperidin-l-il)-acetilamino]pentanojsko kislino;

3-[3-metil-2-(3-fenil-propionilamino)-butirilamino]-4-okso-5-[(l-okso-l, 2,3,4tetrahidro-nafitalen-2-il)-acetoksi]-pentanojsko kislino; 5-(naftalen-2-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(l-okso-3,4-dihidro-lH-izokinolin-2-il)acetilaminoj-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-4-okso-3-[2-(l-okso-3,4-dihidro-lH-izokinolin-2il)-acetilamino]-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-4-okso-3-[2-(2-okso-6-fenil-piperidin-l-il)acetil amin o]-pentanojsko kislino;

5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(l-okso-l,2,3,4-tetrahidro-naftalen-2-il)acetilamino]-pentanojsko kislino;

5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(l-okso-3,4-dihidro-lH-izokinolin-2-il)propiomlaminoj-pentanojsko kislino;

5-(naftalen-2-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-( 1 -okso-3,4-dihidro-1 H-izokinolin-2-il)propionilaminoj-petanojsko kislino;

3- [4-( 1-benzensulfonil- lH-pirol-2-il)-4-okso-butirilamino]-5-(naftalen-1 -il-acetoksi)4- okso-pentanojsko kislino;

5- (2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-4-okso-3-[2-(l-okso-l,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-il)acetilaminoj-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3 -fenil-propioniloksi)-4-okso-3 -[2-( 1 -okso-3,4-dihidro-1 H-izokinolin-2il)-propionilamino]-pentanojsko kislino;

4-okso-3-[2-( 1 -okso-3,4-dihidro-1 H-izokmolin-2-il)-propionilamino]-5-[( 1 -oksol,2,3,4-tetrahidro-naftalen-2-il)-acetoksi]-pentanojsko kislino;

-[4-( 1 -benzensulfonil-1 H-pirol-2-il)-4-okso-butirilamino]-5-(2-benzil-3 -fenilpropioniloksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

4- okso-5-[(l-okso-l, 2,3,4-tetrahidro-naftalen-2-il)-acetoksi]-3-[2-(l-okso-l, 2,3,4tetrahidro-naftalen-2-il)-acetilamino]-pentanojsko kislino;

5- (naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(2-okso-3-fenil-imidazolidin-l-il)propionilamino]-pentanojsko kislino;

5-(naftalen-1 -il-acetoksi)-4-okso-3 - [2-(2-okso-3 -fenil-tetrahidropirimidin-1 -il)propioiiilamino]-pentanojsko kislino;

5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-[2-(2-okso-3-fenil-tetrahidropirimidin-l-il)acetilamino]-pentanojsko kislino;

-(2-acetilamino-3 -metilbutirilamino)-5-(naftalen-1 -il-acetoksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-(2-acetilamino-3-metil-butirilamino)-5-(2-benzil-3-fenilpropioniloksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-acetilammo-3-metilbutirilamino)-5-(3-benzil-4-fenilbutiriloksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-acetilamino-3-metil-butirilaimno)-5-(4-benzil-5-fenil-pentanoiloksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-acetilamino-3-metil-butirilamino)-4-okso-5-[(l-okso-l,2,3,4-tetrahidro-naftalen

2- il)-acetoksi]-pentanoj sko kislino;

5-(3-benzil-4-fenil-butiriloksi)-3-[3-metil-2-(3-fenil-propionilamino)-butirilamino]-4 okso-pentanojsko kislino;

3- [2-(3-acetilamino-2-okso-2H-piridin-l-il)-acetilamino]-5-(3,3-difenilpropioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino; in

3-[2-(3-acetilamino-2-okso-2H-piridin-l-il)-acetilamino]-5-(2-benzil-3-fenilpropioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-4-karboksi-butirilamino)-3-metil-butirilaniino]-5(naftalen- l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilaniino)-propionilamino]-5-(naftalen-l· il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-(2-acetilamino-3-metil-butirilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-propiomlaniino]-5-(3,3-difenil propioniloksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-piOpionilamino]-5-(2-benzil-3· fenil-propioniloksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-propionilamino]-5-(naftalen-lil-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3 -fenil-propioniloksi)-3 - { 2- [4-karboksi-2-(3 -fenil-propionilamino)butirilaniino]-3-metil-butirilamino } -4-okso-pentanoj sko kislino; 3-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-5-(3,3-difenil-propiomloksi)-4okso-pentanojsko kislino;

-(2-acetilamino-3 -hidroksi-butirilamino)-5-(naftalen-1 -il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-acetilamino-3-hidroksi-butirilamino)-5-(3,3-difenil-propioniloksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-{2-[2-acetilamino-3-(lH-indol-3-il)-proponilamino]-4-karboksi-butirilan]ino}-3metil-butirilaniino)-5-(2-benzil-3-feml-piOpioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino; in 5-(3,3-difenil-propioniloksi)-4-okso-3-[2-(4-fenil-butirilamino)-proponilamino]pentanojsko kislino;

3-(2-( 2-[2-acetilamino-3-( 1 H-indol-3 -il)-proponilamino]-4-karboksi-butirilamino }-3metil-butirilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino; in 3-(2-( 2-[2-acetilamino-3 -(4-hidroksi-fenil)-proponilamino]-4-karboksi-butirilamino} 3-metil-butirilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino; 3-[(2-karboksi-cikloheksankarbonil)-amino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-[(2-metoksikarbonil-cikloheksankarbonil)-amino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino; in

3-[(2-karbamoil-cikloheksankarbonil)-amino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(3-benzilsulfanil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-metil-3-fenilmetansulfonil-propionilanimo)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-[3-(2-karboksi-etansulfanil)-2-metil-propionilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3 -fenil-propioniloksi)-3 - [3 -(2-karboksi-etansulfonil)-2-metilpropionilamino]-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-[3-(3-karboksi-propan-l-sulfmil)-2-metilpropionilamino]-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-(2-fenilmetansulfanil-propionilamino)-pentanojsko kislino;

3-(2-metil-3-fenilsulfanil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-(2-metil-3-fenilsulfanil-propionilamino)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-metil-3-fenetilsulfanil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-(2-metil-3-fenetilsulfanil-propionilamino)-4-oksopentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-(3-benzilsulfanil-2-metil-propionilamino)-4-oksopentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-(2-benzilsulfanil-propionilamino)-4-oksopentanojsko kislino;

3-[2-metil-3-(3-fenil-propilsulfanil)-propiomlamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

3-(3-benzensulfonil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(3-benzensulfonil-2-metil-propionilamino)-5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-4okso-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-[2-metil-3-(2-fenil-etansulfbnil)-propionilamino]4- okso-pentanojsko kislino;

3-[2-metil-3-(2-fenil-etansulfonil)-propionilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5- (naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-3-(2-fenilmetansulfonil-propionilamino)-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-(2-metil-3-femlmetansulfonil-propionilamino)-4okso-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-feml-propioniloksi)-4-okso-3-(2-fenilmetansulfonil-propionilamino)pentanojsko kislino;

3-[2-metil-3-(3-fenil-propan-l-sulfonil)-propionilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-[2-metil-3-(3-fenil-propan-l-sulfonil)propionilamino]-4-okso-pentanoj sko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-[3-(2-karboksi-etilsulfanil)-2-metilpropionilamino]-4-okso-pentanojsko kislino;

3-[3-(3-karboksi-propilsulfanil)-2-metil-propionilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-[3-(3-karboksi-propilsufanil)-2-metilpropionilamino]-4-okso-pentanojsko kislino;

3- (3-karboksimetilsulfanil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-(3-karboksimetilsulfanil-2-metil-propionilamino)4- okso-pentanojsko kislino;

3-[3-(2-karboksi-etansulfonil)-2-metil-propionilamino]-5-(nafalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino;

3-[3-(3-karboksi-propan-1-sulfonil)-2-metil-propionilamino]-5-(naftalen-1-ilacetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-(3-karboksrnietansulfonil-2-metil-propionilainino)-5-(nafialen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

5- (2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-3-[3-(3-karboksi-propan-l-sulfonil)-2-metilpropionilamino]-4-okso-pentanojsko kislino;

5-(2-benzil-3-feml-propioniloksi)-3-(3-karboksimetansulfonil-2-metilpropionilamino)-4-okso-pentanojsko kislino;

3- [3-(3-karboksi-propan-l-sulfmil)-2-metil-propionilamino]-5-(nafitalen-l-il-acetoksi)

4- okso-pentanojsko kislino;

3-[2-metil-3-(3-fenil-propan-l-sulfmil)-propionilamino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4okso-pentanojsko kislino; in

5- (2-benzil-3 -fenil-propioniloksi)-3 - [2-metil-3 -(3 -fenil-propan-1 -sulfmil)propionilamino]-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-[3-metil-2-(fenetilkarbamoil-metil)-butirilamino ]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso pentanojsko kislino; in

3-(3-karboksi-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-(2-metil-3-sulfamoil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-(3-karbamoil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

-(2-benziloksikarbonilamino-3 -metil-naftalen-1 -il-acetoksi)-4-okso-pentanoj sko kislino;

3-[(2-karbamoil-ciklopentankarbonil)-amino]-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-[(l-karbamoil-pirolidin-2-karbonil)-aminol-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(2-{2-[2-acetilamino-3-(4-hidroksi-fenil)-propionilamino]-4-karboksibutbilamino}3-metil-butirilamino)-5-(2-benzil-3-fenil-propioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino; 3-(3-karbamoil-2-metil-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

3-(2-karbamoilmetil-3-metil-butirilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-(3-benziloksi-2-ureido-propionilamino)-5-(naftalen-l-il-acetoksi)-4-oksopentanojsko kislino;

3-[2-(2-benziloksikarbomlamino-4-karboksi-butirilammo)-3-metil-butinlamino]-5-(2benzil-3-fenil-propioniloksi)-4-okso-pentanojsko kislino;

- {2-[4-karboksi-2-(3 -fenil-propionilamino)-butirilamino]-3 -metil-butirilamino } -5(naftalen-l-il-acetoksi)-4-okso-pentanojsko kislino; in

3-[2-(2-acetilammo-4-karboksi-butirilamino)-3-metil-butirilamino]-5-(naftalen-l-ilacetoksi)-4-okso-pentanoj sko kislino.

Zgoraj opisane aspartat estrske ICE inhibitorje lahko naredimo po spodnjih shemah 1 doli:

Stopnja A rco₂h, baza (KF ali K₂CO₃) DMF

3-benziloksikarbonilamino-5-bromo-4-okso-pentozojska kislina terc.butil ester, znan tudi kot Z-Asp(OtBu)-bromometil keton, lahko kupimo na tržišču ali pripravimo po postopku: Dolle et al., J. Med. Chem., 1994:37:563-564. Metilbromo keton obdelamo z ustrezno substituirano karboksilno kislino in bazo, kot npr. s kalijevim fluoridom. Alternativno bi lahko uporabili druge baze, kot npr. kalijev karbonat, cezijev karbonat ali kalijev t-butoksid. Reagente je treba zmešati v dimetil formamidu (DMF), dimetilacetamidu (DMA), dimetil sulfoksidu (DMSO), acetonitrilu ali drugem primernem topilu, nato pa jih mešamo pri sobni temperaturi 8 do 24 ur. t-butil estrsko zaščitno skupino lahko odstranimo v kislem mediju, prednostno trifluoroocetni kislini, da proizvedemo karbobenzoksi aspartil estre, prikazane na shemi 1.

bb

Shema 2

ali

ROCOCI

Zmes ustrezno substituiranega aciloksimetil ketona karbobenzoksi aspartil t-butil estra hidrogeniramo z ekvivalentom klorovodikove ali druge kisline v prisotnosti katalizatorja, kot npr. paladija na aktivnem oglju, da dobimo aminsko sol. Sol lahko aciliramo z ustrezno substituiranim izocianatom, sulfonilkloridom, kloroformiatom ali fenil propionilkloridom, da dobimo N-substituirane derivate. Te izocianate, sulfonil kloride ali kloro formiate lahko kupimo na tržišču ali sintetiziramo z metodami, opisanimi v kemijski literaturi, t-butilestrsko zaščitno skupino lahko odstranimo v končni stopnji z uporabo kislega medija, prednostno trifluoroocetne kisline, da proizvedemo aciloksimetil ketonske derivate, prikazane na shemi 2.

Shema 3

Stopnja A

HCI · H₂N

CO₂ ¹Bu pripojitveni reagent HOBT, baza

Stopnja B cf₃co₂h

R

Sintetiziramo aminsko sol aciloksimetil ketona Z-Asp(Ot-Bu)OH in obdelamo z ustrezno substituirano karboksilno kislino in pripojitvenim reagentom. Pripojitveni reagentni so lahko, vendar neomejujoče, npr.: 1,3-dicikloheksilkarbodiimid (DCC), 1(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorid (EDCI), Ι,Γ-karbonildiimidazol (CDI), l,r-karbonilbis(3-metilimidazolijev)triflat (CBMIT), izobutilkloroformiat, benzotriazol-l-iloksitris(dimetilamino)-fosfonijev heksafluorofosfat (BOP), 2-(3,4dihidro-4-okso- l,2,3-benzotriazin-3-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijev tetrafluoroborat (TDBTU) in 2-(lH-benzotriazol-l-il)-l, 1,3,3-tetrametiluronijev heksafluorofosfat (HBTU). 1-hidroksibenzotriazol hidrat je treba dodati reakcijski zmesi, da izboljšamo dobitek in omejimo izomerizacijo, bazo, prednostno amin, npr. kot trimetilamin ali metil morfolin, pa je treba dodati kot odstranjevalec kisline. Dobljeni amidni produkt obdelamo s kislim medijem, prednostno trifluoroocetno kislino, da odstranimo t-butil ester in proizvedemo končne produkte, kot je prikazano na shemi 3.

Stopnja A

ΖσΟΧ (X=C1,F) — -----—►

Stopnja B cf₃co₉h --—►

Sintetiziramo aminsko sol aciloksimetil ketona Cbz-Asp(OtBu)OH in obdelamo z ustrezno substituiranim kislinskim kloridom ali kislinskim fluoridom, da proizvedemo amidni produkt. Kislinske kloride kupimo na tržišču ali jih pripravimo z obdelovanjem karboksilnih kislin s sredstvi, kot npr. tionil kloridom, fosforjevim tribromidom ali oksalil kloridom/DMF. Kislinske fluoride pripravimo z obdelovanjem karboksilne kisline s fluoridom cianurjeve kisline. Predzadnji amidni produkt obdelamo s kislim medijem, prednostno trifluoroocetno kislino, da odstranimo t-butil ester ter dobimo končne produkte, kot je prikazano na shemi 4.

Shema 5

Stopnja A

1. idcc^H, pripojitveni reagent

------2. NaOH

R

Stopnja B Stopnja C

Hidrokloridno sol H-Asp(OtBu)OMe obdelamo z ustrezno substituirano karboksilno kislino in pripojitvenim reagentom. 1-hidroksibenzotriazolni hidrat je treba dodati reakcijski zmesi, da izboljšamo dobitek in omejimo izomerizacijo, bazo, prednostno amin, kot npr. trimetilamin ali metilmorfolin, pa je treba dodati kot kislinski odstranjevalec. Dobljeni amidni produkt obdelamo z alkalnim reagentom, kot npr. natrijevim hidroksidom, da hidroliziramo metil ester v karboksilno kislino. Dobljeno kislino obdelamo s kloroformiatom, kot npr. izobutilkloroformiatom, nato pa z diazometanom in nato z bromovodikovo kislino, da dobimo metil bromo keton. Z obdelovanjem metilbromo ketona z ustrezno substituirano karboksilno kislino in bazo, kot npr. s kalijevim fluoridom proizvedemo želene aciloksimetil ketone, ki jih deprotektiramo s trifluoroocetno kislino, da dobimo končne spojine, kot je prikazano na shemi 5.

Shema 6

Stopnje A-D Stopnja E

i. pripajanje Cbz-AA li. odstranjevanje Qby.

iii. pripajanje Cbz-AA iv. etc.

tvorba bromo metil ketona '— --►

Stopnja F

RCO₂H, KF. DMF --*

P

Stopnja G odstranitev preostalih estrskih_ zaščitnih skupin = zaščitna skupina

Hidrokloridno sol H-Asp(OtBu)OMe obdelamo z ustrezno zaščiteno amino kislino in pripojitvenim reagentom. 1-hidroksibenzotriazolni hidrat je treba dodati reakcijski zmesi, da izboljšamo dobitek in omejimo izomerizacijo, bazo, prednostno amin, kot npr. trimetilamin ali metil morfolin, pa je treba dodati kot kislinski odstranjevalec. Dobljeni amidni produkt obdelamo z alkalnim reagentom, kot npr. z natrijevim hidroksidom, da hidroliziramo metil ester v karboksilno kislino. Cbz-aminsko zaščitno skupino odstranimo z uporabo standardnih pogojev za katalitično hidrogeniranje, pripajanje druge zaščitene aminske kisline pa lahko izvedemo, kot je opisano zgoraj. Ta postopek ponavljamo, dokler peptid nima želene dolžine. Dobljeni peptidni produkt obdelamo z alkalnim reagentom, kot npr. z natrijevim hidroksidom, da hidroliziramo metil ester v karboksilno kislino. Dobljeno kislino nato obdelamo s kloroformiatom, kot npr. izobutilkloroformiatom, nato pa z diazometanom in nato z bromovodikovo kislino, da dobimo metilbromo keton. Z obdelovanjem metilbromo ketona z ustrezno substituirano karboksilno kislino in bazo, kot npr. s kalijevim fluoridom, proizvedemo želene aciloksimetil ketone, ki je deprotektiramo s trifluoroocetno kislino, da dobimo končne spojine, kot je opisano na shemi 6.

Shema 7

Stopnja A

H₂,20% Pd/C -h₂n-aa

pripojitveni reagent

Stopnja B rco₂h,

Stopnja C cf₃co₂h

Sintetiziramo ustrezno substituiran aciloksimetil keton zaščitene amino kisline. Cbzaminsko zaščitno skupino odstranimo z uporabo standardnih pogojev za katalitično hidrogeniranje, aminski produkt pa obdelamo z ustrezno substituirano karboksilno kislino in pripojitvenim reagetom. 1-hidroksibenzotriazolni hidrat je treba dodati reakcijski zmesi, da izboljšamo dobitek in omejimo izomerizacijo, bazo, prednostno amin, kot npr. trimetilamin ali metil morfolin, pa je treba dodati kot kislinski odstranjevalec. Predzadnji amidni produkt obdelamo s kislim medijem, prednostno trifluoroocetno kislino, da odstranimo t-butil ester in dobimo končne produkte, kot je prikazano na shemi 7.

Shema 8

HCI·

Anhidrid trans- 1,2-cikloheksandikarboksilne kisline obdelamo z aminsko soljo ustrezno substituiranega aciloksimetil ketona aspartil t-butil estra v prisotnosti piridina in 4-dimetilaminopiridina (DMAP), da dobimo amidni produkt. Karboksilno kislino lahko fimkcionaliziramo z ustrezno substituiranimi amini ali alkoholi in standardnimi pripojitvenimi reagenti, da dobimo amidne in estrske produkte. Predzadnji produkt obdelamo s kislim medijem, prednostno s trifluoroocetno kislino, da odstranimo t-butil ester in dobimo končne produkte, kot je prikazano na shemi 8.

Shema 9

Me

2. CF₃CO₇H

I. oksidacija

Metil metakrilat obdelamo z anionom ustrezno substituiranega sulfida, da dobimo Michaelov adukt, ki ga hidroliziramo v bazičnem mediju, kot npr. v natrijevem hidroksidu, da proizvedemo karboksilno kislino. To kislino združimo z aminsko soljo aciloksimetil ketona aspartil t-butil estra in pripojitvenim reagentom, da dobimo amidni produkt. Če je želeni produkt sulfid (kjer je n=0), potem ne uporabimo oksidacijske stopnje in amid t-butil ester deprotektiramo v kislem mediju, prednostno trifluoroocetni kislini, da dobimo končni produkt. Alternativno pa, kadar je končni produkt sulfoksid (n = 1) ali sulfon (n = 2), amidni intermediat obdelamo z oksidacijskim sredstvom, ki je lahko, vendar neomejujoče, m-kloroperbenzojska kislina, kalijev monoperoksisulfat ali natrijev perborat, da dobimo želeni oksidirani produkt, t-butil ester predzadnjega intermediata deprotektiramo v kislem mediju, prednostno trifluoroocetni kislini, da dobimo končne spojine, kot je prikazano na shemi 9.

R.

Shema 10 ₀A_nh i. n-BuLi.-78°C ^Jt^R, .

_R ii. R,CH₂COCl

H ° </,,·Ύ LiOH.H₂O₂. _t

H ’ _R ^X'CO₂ ^tBu ^THF’ ^voda

HCI-H₂N\^X ^ξύ o

‘BuO.

NaN(SiMe₃)₂, -78°C

-—---», ii. BrCH₂CO₂ ^lBu

R,

i. ^lBuO₂C

co₂h pripojitveni reagent O Ji o o v Ό

i.cf₃co₂h

1. PhSiH₃,Pd(PPh₃)₄

2. tvorba bromo metil ketona

3. R₉CO_oH, KF, DMF O fl

Ck ^Ph

2. R₃R₂NH ali

PhCH₂ONH₂.

pripojitveni reagent

1. PhSiH₃,Pd(PPh₃)₄

2. tvorba bromo metil ketona

3. R₂CO₂H, KF, DMF r₃n

O »1 O

O o ^lBuO

CL ^Ph

H, cf₃co₂h

2. tvorba estra

3. H_o, 20% Pd/C

O fl O o o co₂h

4-substituiran-2-oksozolidinonsko kiralno pomožno sredstvo, kot ga opisujejo Evans et al., J.Org. Chem,, 1985;50:1830 zmešamo z bazo, kot je npr., vendar neomejujoče, n-butil litij, nato pa obdelamo z ustrezno substituiranim kislinskim kloridom ali drugo aktivirano karboksilno kislino, da dobimo N-aciliran produkt. Produkt nato obdelamo z bazo, kot npr., vendar neomejujoče, z natrijevim bis(trimetilsilil)amidom in t-butil bromoacetatom, da proizvedemo alkiliran kiralni produkt. Kiralno pomožno sredstvo odstranimo z uporabo litijevega hidroksida in vodikovega peroksida, da dobimo kiralno kislino. Z obdelovanjem kisline z aminsko soljo H-Asp(OBz)O-alila in pripojitvenim reagentom dobimo sukcinil amidni produkt.

V tej stopnji postopka lahko predelujemo produkt na enega od dveh načinov. Po prvem t-butil ester odstranimo v kislem mediju, prednostno trifluoroocetni kislini in dobljeno kislino spojimo z ustrezno substituiranim aminom v prisotnosti pripojitvenega reagenta, da tvorimo nov amidni produkt. Alil ester odstranimo s fenilsilanom in tetrakis(trifenil-fosfm)paladijem ali drugim katalizatorjem Pd(0), da dobimo karboksilno kislino, kislino pa pretvorimo v metilbromo keton in nato aciloksimetil keton. Predzadnji intermediat izpostavimo katalitičnemu hidrogeniranju, da odstranimo benzil ester in dobimo končne amidne produkte, kot je prikazano na shemi 10.

Alternativno pa pri drugem načinu za končne produkte odstranimo alil ester z uporabo fenilsilana in tetrakistetrakis(trifenilfosfm)paladija ali drugega katalizatorja Pd(0), da dobimo karboksilno kislino. To kislino pretvorimo v metilbromo keton in nato aciloksimetil keton. Z odstranitvijo t-butil estra aciloksimetil ketona s trifluorokislo kislino in nato pretvorbo dobljene karboksilne kisline v ester dobimo nov estrski produkt. Esterifikacijo lahko izvedemo z uporabo različnih literatumih tehnik, ki vključujejo, vendar neomejujoče, obdelovanje karboksilne kisline z ustrezno substituiranim alkoholom v prisotnosti pripojitvenega reagenta. Predzadnji intermediat izpostavimo katalitičnemu hidrogeniranju, da odstranimo benzil ester in dobimo končne estrske produkte, kot je prikazano na shemi 10.

Shema 11 > cr

O*_ ,θ

Ri

CO₂CH₂Ph

Rj l.PhCH₂Br,

DBU

Y ^^co₂hO 2. Cl₂ (plin)

EtOH:CCI₄(l:9)

1. SOC1₂ ali fluorid ciuranove kisline ,2. H-Asp^Buj-OMe-HCI NMM, CH₂C1₂

3. NaOH, H₂, EtOH

R.

H

1.. tvorba bromo metil ketona

2. RCO₂H, KF, DMF

N^xC0₂H CO₉ ¹Bu

Ustrezno substituirano S-acetil merkapto karboksilno kislino obdelamo z benzil bromidom in l,8-diazobiciklo[5.4.0]undec-7-enom (DBU), da proizvedemo benzil ester, ki ga nato izpostavimo reakciji s plinastim klorom, da dobimo sulfonil klorid. Sulfonil klorid obdelamo z N,N-bis(p-metoksibenzil)aminom, da dobimo sulfonamid, ki ga izpostavimo katalitičnemu hidrogeniranju, da dobimo intermediatno karboksilno kislino. Kislino aktiviramo z uporabo ciuranovega fluorida, ki ga nato zmešamo z aminsko soljo H-Asp(Ot-Bu)OM, da proizvedemo amidni produt. Metil ester hidroliziramo z natrijevim hidroksidom in karboksilno kislino predelamo v aciloksimetil keton. p-metoksibenzil zaščitne skupine sulfonamida odstranimo pri oksidacijskih razmerah, prednostno, vendar neomejujoče, s cerijevim amonijevim nitratom, t-butil estrsko zaščitno skupino pa odstranimo v kislem mediju, prednostno s trifluoroocetno kislino, da dobimo želene sulfonamidne produkte, kot je prikazano na shemi 11.

Kot uporabljamo tukaj, pomeni izraz alkil ogljikovodik z ravno ali razvejeno verigo. Reprezentativni primeri alkilnih skupin so: metil, etil, propil, izopropil, izobutil, butil, terc.butil, sek.butil, pentil in heksil.

Izraz alkoksi pomeni alkilno skupino, vezano na atom kisika. Reprezentativni primeri alkoksi skupin vključujejo: metoksi, etoksi, terc.butoksi, propoksi in izobutoksi.

Izraz halogen vključuje klor, fluor, brom in jod.

Izraz aril pomeni aromatski ogljikovodik. Reprezentativni primeri arilnih skupin vključujejo fenil in naftil.

Izraz heteroatom vključuje kisik, dušik, žveplo in fosfor.

Izraz heteroaril pomeni arilno skupino, kjer je eden ali več atomov ogljika aromatskega ogljikovodika nadomeščenih s heteroatomi. Primeri heteroarilnih skupin vključujejo: furan, tiofen, pirol, tiazol, piridin, pirimidin, pirazin, benzofuran, indol, kumarin, kinolin, izokinolin in naftiridin.

Izraz cikloalkil pomeni ciklično alkilno skupino. Primeri cikloalkilnih skupin vključujejo: ciklopropan, ciklobutan, ciklopentan in cikloheksan.

Izraz heterocikel pomeni cikloalkilno skupino, v kateri je eden ali več atomov ogljika nadomšČenih s heteroatomom. Primeri heterociklov vključujejo piperazin, morfolin in piperidin.

Arilna, heteroarilna ali cikloalkilna skupina je lahko substituirana z enim ali več substituenti, ki so lahko enaki ali različni. Primeri za prikladne substituente vključujejo: alkil, alkoksi, tioalkoksi, hidroksi, halogen, trifluorometil, amino, alkilamino, dialkilamino, -NO₂-, -CN, -CO₂H, -CO₂alkil, -SO₃H, -CHO, -COalkil, CONH₂, -CONH-alkil, -CONHR^q, -CON(alkil)2, -(CH2)n-NH2, -OH, -CF3, -OCrC6alkil, -(CH2)n-NH-alkil, -NHR^q, -NHCOR^q, fenil, -(CH2)_nOH, -(CH₂)_nC(O)NH₂, ali (CH₂)_nCO₂H, kjer je n 1 do 5 in je R^q vodik ali alkil.

Simbolpomeni vez.

Primeri za druge inhibitorje kaspazne družine, ki so potrjeni za uporabo v smislu izuma, vključujejo Ich-1 inhibitorje, kot tiste, opisane v PCT-objavi 97/27220.

Izraz fosfodiesterazni IV inhibitor je namenjen, da se nanaša na sredstva, ki inhibirajo aktivnost encim fosfodiesteraze IV. Primeri fosfodiesteraznih IV inhibitorjev so znani v tehniki in vključujejo: 4-arilpirolidinone, kot npr. rolipram (glej npr. Sekut L. et al. (1995) Ciin. Exp. Immunol. 100:126-132), nitrakvazon (glej npr. Van Wauwe J. et al. (1995) Inflamm. Res. 44:400-405), denbufilin, tibenelast (glej npr. Banner K.H. et al. (1996) Br. J. Pharmacol. 119:1255-1261), CP-80633 (glej npr. Cohan V.L. et al. (1996) J. Pharmacol. Exp. Therap. 278:1356-1361) in kinazolindione, kot npr. CP-77059 (glej npr. Sekut L. et al. (1995) Ciin. Exp. Immunol. 100:126-132),

Izraz beta-2-agonist je namenjen, da se nanaša na sredstva, ki stimulirajo beta-2adrenergični receptor. Primeri za beta-2-agoniste so znani v tehniki in vključujejo salmeterol (glej npr. Sekut L. et al. (1995) Ciin. Exp. Immunol 99:461-466). fenoterol in izoproterenol (glej npr. Severin A. et al. (1992)7. Immunol. 148:3441-3445).

Izraz STAT4 je namenjen, da se nanaša na transkripcijski faktor, vključen v IL-12 odzive (glej npr. Thierfelder W.E. et al. (1996) Nature 382:171-174: Kaplan M.H. et al. (1996) Nature 382:174-177). Izraz STAT4 inhibitor se nanaša na sredstvo, ki inhibira aktivnost STAT4 transkripcijskega faktorja, tako da se inhibirajo odzivi na IL12.

Izraz protitelo, kot ga uporabljamo tukaj, se nanaša na imunoglobulinske molekule in imunološko aktivne determinante imunoglobulinskih molekul, tj. molekule, ki vsebujejo antigensko vezavno mesto, ki specifično veže (imunsko reagira z njim) antigen. Izraz protitelo je nadalje namenjen, da vključuje bispecifične in kimeme molekule, ki imajo vsaj eno antigensko vezavno determinanto, izvedeno iz protitelesne molekule. Čeprav H- in L-verige Fv-ffagmenta kodirajo ločeni geni, pa lahko naredimo sintetični liriker, ki omogoča le-tem, da jih naredimo kot enojno proteinsko verigo (znano kot protitelo z enojno verigo, sAb; Bird et al. 1988 Science 242:423-426 in Huston et al. 1988 PNAS 85:5879-5883) z rekombinantnimi metodami. Taka protitelesa z enojno verigo so prav tako zajeta v izrazu protitelo in jih lahko uporabimo kot vezavne determinante v modelu in pri konstruiranju multispecifične vezavne molekule.

Izraz protitelesih fragment, kot ga uporabljamo tukaj, se nanaša na aktivni fragment protitelesa, ki ohrani sposobnost, da veže (imunsko reagira z njim) antigen. Primeri za protitelesne fragmente vključujejo: Fab-fragment, ki je sestavljen iz V_L-, V_H-, Cl- in Cni-domen, Fd-fragment, ki je sestavljen iz V_H- in Cm-domen, Fv-fragment, ki je sestavljen iz V_L- in Vn-domen enojnega kraka protitelesa, dAb-fragment (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), kije sestavljen iz Vn-domene, izolirana regija, ki določa komplementarnost (CDR), in F(ab')₂-fragment, bivalenten fragment, ki obsega Fab'80 fragmenta, vezana z disulfidnim mostom pri gibljivi regiji. Te protitelesne fragmente dobimo z uporabo konvencionalnih tehnik, dobro znanih strokovnjakom, fragmente pa selekcioniramo za uporabo na enak način kot intaktna protitelesa.

Izraz konstruiran vezavni protein, kot ga uporabljamo tukaj, je namenjen, da vključuje molekule, izvedene iz protitelesa ali drugo vezavno molekulo (npr. receptor ali ligand), ki ohrani želeno vezavno specifičnost, vendar pa je konstruiran z rekombinantnimi DNA-tehnikami in/ali izražen z uporabo rekombinantnih DNAtehnik. Primeri za konstruirane vezavne proteine vključuje topne in skrajšane oblike receptorjev, dimerov receptorjev (npr. p40 IL-12 receptorski dimeri) in modificirane ali mutirane oblike protiteles, ligandov ali receptorjev, izbrane z uporabo kombinatornih knjižnic (npr. tehnike fagne prikazovalne knjižnice).

Izraz NK-celični antagonist kot ga uporabljamo tukaj, je namenjen, da vključuje protitelesa, protitelesne fragmente in konstruirane vezavne proteine, ki so sposobni, da osiromašijo NK-/NK podobne celice, kadar jih damo subjektu. Primeri za NK celične antagoniste vključujejo protitelesa antiasialo-GMl in protitelesa NK1.1.

Izraza steroidno odporna bolezen in steroidno odporen subjekt kot ju uporabljamo tukaj, sta namenjana, da se nanašata na bolezni in subjekte, ki se ne odzivajo znatno na kortikosteroidno terapijo pred zdravljenjem po metodah v smislu izuma. Steroidna odpornost se prav tako nanaša na steroidno neodzivnost.

Izraz imunoinflamatoma bolezen ali motnja je namenjen, da vključuje vnetne bolezni in motnje, pri katerih so imunske celice in/ali citokini vpleteni v patiofiziologijo bolezni ali motnje. Izraz akutna vnetna motnja je namenjen, da vključuje motnje in epizode motenj, označene s hitrim nastankom simptomov, povezanih z vnetnim odzivom in relativno kratkim trajanje simptomov, medtem ko je izraz kronična vnetna motnja namenjen, da vključuje motnje, označene s kontinuimo prisotnostjo simptomov, povezanih z vnetnim odzivom in nadaljevanjem trajanja simptomov.

I. Metode v smislu izuma

V eni izvedbi zagotavlja izum metodo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroid v subjektu, ki obsega dajanja subjektu:

- sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje interferona-γ (IFN-γ) v subjektu, pri čemer sredstvo damo v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira proizvajanje IFN-γ v subjektu, in

- kortikosteroid, tako da je modulirana odzivnost subjekta na kortikosteroid, v primerjavi s tem, ko damo subjektu samo kortikosteroid.

V eni izvedbi vključuje metoda dajanje sredstva, ki je IL-18 antagonist. IL-18 antagonist damo subjektu v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira IL-18aktivnost v subjektu. IL-18 antagonist lahko deluje npr. z inhibiranjem IL-18 sinteze v subjektu, z inhibiranjem IL-18 citokinske aktivnosti v subjektu, z inhibiranjem interakcije IL-18 z IL-18 receptorjem ali z inhibiranjem aktivnosti IL-18 receptorja.

V prednostni izvedbi je IL-18 antagonist inhibitor proteaze kaspazne družine. Proteaze kaspazne družine, posebno ICE, predelajo prekurzorsko obliko IL-18 v zrelo (tj. aktivno) obliko (npr. Primer 4). Za inhibitor proteaze kaspazne družine smatramo, čeprav ni namen, da bi omejevali z mehanizmom, da antagonizira IL-18-aktivnost z inhibiranjem predelovanja IL-18 iz njegove prekurzorske oblike v njegovo zrelo (tj. aktivno) obliko. Prednostni inhibitor proteaze kaspazne družine za uporabo v metodah v smislu izuma je ICE inhibitor. Dodatno ali alternativno so lahko inhibirane tudi druge proteaze kaspazne družine, ki so sposobne cepljenja prekurzorja IL-18 v zreli IL-18 (kot npr. Ich-2 (kaspaza-4) in ICE_reiIII (kaspaza-5)). Kemijska sredstva, ki lahko inhibirajo aktivnost ICE in drugih proteaz kaspazne družine, so znana v tehniki, vključno peptidilni derivati, analogi azaasparaginske kisline in gamapiron-3-ocetna kislina (glej npr. US-patent št. 5,411,985, US-patent št. 5,430,128, US-patent št. 5,434,248, US-patent Št. 5,565,430, US-patent št. 5,416,013, PCT-objavo WO

94/00154, PCT-objavo WO 93/16710, PCT-objavo WO 93/14777, PCT-objavo WO 93/05071, PCT-objavo WO 95/35308, evropsko patentno prijavo EP 547 699 in evropsko patentno prijavo EP 519 748). Dodatni prikladni inhibitorji ICE in drugi inhibitorji kaspazne družine so prikazani v US-prijavi serijska št. 08/700,716 in USprovizoričnih prijavah, serijske št. 60/028,322, 60/028,324, 60/028,313 in 60/028,323. Natančne doze in režim za dajanje inhibitorja ICE ali ICE proteazne družine so nujno odvisni od potreb subjekta, ki ga je treba zdraviti, tipa zdravljenja, učinkovitosti spojine in stopnje resnosti bolezni v subjektu. Vendar pa je neomejujoč primer dozirnega območja za inhibitor ICE in druge proteaze kaspazne družine od približno 0,05 do približno 150 mg/kg telesne mase/dan.

V drugih izvedbah je IL-18 antagonist protitelo, protitelesih fragment ali konstruiran vezavni protein, ki veže IL-18 ali IL-18 receptor. Taka vezavna sredstva lahko pripravimo s standardnimi metodami, znanimi v tehniki za izdelavo poli- in monoklonalnih protiteles in rekombinantnih vezavnih proteinov, in so opisana nadalje npr.v: evropski patentni prijavi 692 536, evropski patentni prijavi 712 931, PCTobjavi WO 97/24441 in PCT-objavi WO 97/44468.

V drugi izvedbi vključuje metoda v smislu izuma dajanje sredstva, ki je IL-12 antagonist. IL-12 antagonist damo subjektu v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira IL-12-aktivnost v subjektu. IL-12 antagonist lahko deluje npr. z inhibiranjem IL-12 sinteze v subjektu, z inhibiranjem IL-12 citokinske aktivnosti v subjektu, z inhibiranjem interakcije IL-12 z IL-12 receptorjem ali z inhibiranjem aktivnosti IL-12 receptorja.

V eni izvedbi je IL-12 antagonist protitelo, protitelesih fragment ali konstruiran vezavni protein, ki veže IL-12 ali IL-12 receptor. Prednostni IL-12 antagonist je anriIL-12 monoklonsko prohtelo. Taka protitelesa so opisana v tehniki (npr.: Chizzonite R. et al. (1991) J. Immunol. 147:1548-1556). Sposobnost anti-IL-2 monoklonskih protiteles, da inhibirajo bolezenske odzive, je prav tako opisana v tehniki (npr.: Leonard J.P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181:381-386; Neurath M.F. et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1281-1290). Drugi hp IL-12 antagonista je p40 homodimer (npr.:

Gillessen S. et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:200-206; Gately M.K. et al. (1996) Ann. NY Acad. Sci. 795:1-12; Ling P. et al. (1995) J. Immunol. 154:116-127). Še nadaljnji tip IL-12 antagonista je nizkoafmitetna oblika IL-12 receptorja, kot je opisano v evropski patentni prijavi EP 638 644 in US-patentu št. 5,536,657.

Neomejujoči primeri IL-12 antagonistov za uporabo v metodah v smislu izuma vključujejo mono- in poliklonalna protitelesa in njihove fragmente, kimema protitelesa in njihove fragmente, topne IL-12 receptorje in njihove fragmente, reaktivne peptide ali njihove fragmente, kemijsko ali genetsko modificirane peptide IL-12, podenote IL12 in njihovih fragmentov, homopolimere IL-12 podenot in njihovih fragmentov in majhne organske molekule, oblikovane, da inhibirajo bioaktivnost IL-12 ali IL-12 receptorjev. Priprava IL-12 antagonistov, vključno: (i) vrsto, ki veže IL-12 ali njihove biološko aktivne fragmente in (ii) vrsto, ki interferira z vezavo IL-12 na receptorje ali druge vezavne proteine, je opisana v tehniki (npr. PCT-objava WO 95/24918, Leonard et al., vsebine le-teh pa so izrecno grajene tukaj z referenco; prav tako tudi Presky D.H. etal. (1995)Res. Immunol. 146:439-445).

V drugi izvedbi je IL-12 antagonist, uporabljen v metodi v smislu izuma, sredstvo, ki stimulira proizvajanje cikličnega AMP (cAMP) v celicah, ki proizvajajo IL-12. Za proizvajanje IL-12 je prikazano, da ga inhibira povečano intracelulamo proizvajanje cAMP (npr.: van der Pouw Kraan et al. (1995) J. Exp. Med. 181:775-779). Primeri za sredstva, ki jih lahko uporabimo za stimuliranje proizvajanja intracelulamega cAMP vključujejo fosfodiesterazne IV inhibitorje in beta-2 agonista. Kot je prikazano v Primeru 3, dajanje fosfodiesteraznega IV inhibitorja v modelu septičnega šoka inhibira produkcijo IL-12, inducirano z LPS. Primeri za prikladne fosfodiesterazne IV inhibitorje za uporabo v metodah v smislu izuma vključujejo rolipram, denbufilin, tibenelast, nitrakvazon in CP-80633. Primeri za beta-2 agoniste za uporabo v metodah v smislu izuma vključujejo salmeterol, fenoterol in izoproterenol. Natančna doza in režim za dajanje fosfodiesteraznega IV inhibitorja ali beta-2 agonista sta nujno odvisna od potrebe subjekta, ki ga je treba zdraviti, tipa zdravljenja, učinkovitosti spojine in stopnje resnosti bolezni v subjektu. Vsekakor pa je neomejujoč primer dozirnega območja za fosfodiesterazne IV inhibitorje ali beta-2 agoniste od približno

0,05 do približno 150 mg/kg telesne mase/dan. V prednostni izvedbi damo sredstvo, ki stimulira proizvajanje cikličnega AMP (cAMP) (npr. fosfodiesterazni IV inhibitor ali beta-2 agonist), sistemsko (npr. oralno ali intravenozno), da inhibiramo proizvajanje IL-12 sistemsko z monociti in makrofagi.

V drugi izvedbi je IL-12 antagonist, uporabljen v metodi v smislu izuma, STAT4 inhibitor. STAT4 je transkripcijski faktor, za katerega je prikazano, da je vključen v IL-12-odzive (npr.: Thierfelder W.E. et al. (1996) Nature 382:171-174). Kaplan M.H. et al. (1996) Nature 382: 174-177). Tako lahko IL-12-odzive v subjektu inhibiramo z dajanjem STAT4 inhibitorja.

Druge inhibitorje IL-12-aktivnosti, ki so znani v tehniki, prav tako lahko uporabimo v metodah v smislu izuma. PCT objava WO 96/40093 prikazuje bifenilne derivate za antagoniziranje imunskih odzivov, induciranih z IL-12. Take bifenilne derivate lahko uporabimo kot IL-12 antagoniste v metodah v smislu izuma.

V drugi izvedbi vključuje metoda v smislu izuma dajanje sredstva, ki je NK-celični antagonist. NK-celični antagonist damo subjektu v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira IFN-γ aktivnost v subjektu. Prednostno je NK-celični antagonist protitelo, protitelesih fragment ali konstruiran vezavni protein, ki specifično veže na NK-/NK podobne celice, tako da so celice osiromašene ali eliminirane v subjektu. Tako prednostni NK-celični antagonisti vežejo na specifične površinske markerje, prisotne na NK-/NK podobnih celicah. Posebno prednostni NK-celični antagonisti so protitelesa antiasialo-GMl in protitelesa NK 1.1, za katera je prikazano, da so efektivna pri siromašenju NK-/NK podobne aktivnosti v subjektu (Primer 10; Axelsson L.G. et al. (1996) Inflamm. Res. 45:181-191; Heremans H. et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:1155-1160).

Druga protitelesa, ki so usmerjena v površinske markerje, ki identificirajo NK-/NK podobne celice, vključujejo tista, ki so reaktivna z Fc-IgG receptorji B73.1 in Leu 11 (CD16) (Lancer L.L. et al. (1983) J. Immunol. 131:1789-1796; Perussia B. et al.

(1983) J. Immunol. 130:2133-2141), Leu 7 (anti-HNKl, ki identificira 40-60 % NK celic, Abo T. in Balch C.M. (1981) J. Immunol. 127:1024-1029) in OKT11 (CD2, ki identificira 50 % ali več NK-celic; Lancer, L.L. et al. supra; Perussia, B. et al., supra). Drugi NK-celični specifični površinski antigeni in protitelesa, ki so opisana, vključujejo DXl-antigen (PCT-objava WO 95/02611), PEN5-alfa in PEN5-beta glikoproteinski par (PCT-objava WO 95/06247) in NKBl-antigen (PCT-objava WO 95/20604).

Točna doza in režim za dajanje NK-celičnega antagonista sta nujno odvisna od potreb subjekta, ki ga je treba zdraviti, tipa zdravljenja, učinkovitosti spojine in stopnje resnosti bolezni pri subjektu. Vsekakor pa je neomejujoč primer dozirnega območja za anti-NK-/NK podobna celična protitelesa od približno 0,01 do približno 150 mg/kg telesne mase/dan. Posamezna doza protitelesa lahko zadostuje, da osiromaši ali eliminira NK-/NK podobno celično aktivnost ali pa lahko alternativno damo multiple doze, kot je treba za osiromašenje ali eliminiranje NK-/NK podobne celične aktivnosti. Prednostno damo NK antagonist na intravenozen ali intraperitonealen način.

Pri metodah v smislu izuma damo sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje interferona-γ (IFN-γ), subjektu v kombinaciji z enim ali več kortikosteroidi. Izraz v kombinaciji z kortikosteroidom je namenjen, da vključuje: simultano dajanje sredstva in kortikosteroida, najprej dajanje sredstva in nato kortikosteroida ter najprej dajanje kortikosteroida in nato sredstva. Pri metodah v smislu izuma lahko uporabimo kateregakoli od terapevtsko uporabnih kortikosteroidov, znanih v tehniki. Kortikosteroidi so značilno klasificiram s trajanjem njihovih tkivnih učinkov: kratko delujoče spojine (npr. beklometazon, flunisolid, hidrokortizon, kortizon), srednje delujoče spojine (npr. prednison, prednizolon, metilprednizolon, triamcinolon, deflazakort) in dolgo delujoče spojine (npr. deksametazon, beta metazon). Subjektu lahko damo enega ali več kortikosteroidov na način in v dozi, ki sta učinkovita, da dosežemo želene terapevtske rezultate. Primeri za prikladne načine dajanja vključujejo intravenozno dajanje, oralno, lokalno, dajanje z inhalacijo (npr. bronhialno dajanje) in lokalne injekcije (npr. v sklep). Točna doza in režim dajanja kortikosteroida subjektu sta nujno odvisna od potreb subjekta, ki ga je treba zdraviti, tipa zdravljenja, učinkovitosti spojine in stopnje resnosti bolezni pri subjektu. Vsekakor pa je neomejujoč primer dozirnega območja za kortikosteroide od približno 0,05 mg/dan do približno 1 g/dan, odvisno od posebnega uporabljenega kortikosteroida. Pri določenih prednostnih dozirnih režimih se uporabi alternativno dnevno dajanje (npr. visokodozna intravenozna pulzna terapija).

Kortikosteroidne formulacije, prikladne za dajanje, so dobro znane v tehniki in so dosegljive na tržišču. Deksametazon acetat, 16 mg/ml vodna suspenzija, je npr. prikladna za intramuskulamo injekcijo pri zdravljenju revmatoidnih, dermatoloških, oftalmičnih, gastrointestinalnih, hematoloških, neoplastičnih, alergijskih stanj in kolagenskih motenj. Neomejujoči primeri doz vključujejo 0,8 mg, 1,6 mg, 4 mg in 16 mg deksametazona na injekcijo.

Hidroksikortizon je na voljo kot sterilna vodna raztopina za intravenozno, intramuskulamo in subkutano injekcijo in je močno protivnetno sredstvo za stanja, kot so osteoartritis, revmatoidni artritis, juvenilni revmatoidni artritis, akutni in kronični bursitis. Prednostne začetne doze so lahko od 15 mg do 250 mg na človeka na dan. Prednostne doze so oralne ali parenteralne in jih lahko damo v polovični dnevni dozi dvakrat na dan, ali kot druge multiple. Hidrokortizonsko injekcijo lahko dodamo k injekciji natrijevega klorida ali injekcije dekstroze in damo z intravenoznim kapljanjem. Hidrokortizon valerat 0,2 mas.% je formuliran kot krema za lokalno uporabo pod imenom Westkort. Prednostne doze obsegajo aplikacijo na poškodovane površine večkrat na dan kot tanka plast.

Bekonaz (beklometazon) je na voljo za vnetja nazalnih pasaž in sinusov, in sicer kot

8,4 mg za 200 odmerjenih pršilnih doz, v 0,042 % vodni suspenziji, za dajanje v odmerjenih dozah po 100 mg, ki vsebujejo 42 pg na odmerjeno dozo, tako da je dnevno nazalno dajanje sestavljeno prednostno iz 42 pg na nosnico, 84 pg na nosnico, 168 pg na nosnico, 336 pg na nosnico, 672 pg na nosnico ali 1344 pg na nosnico. Prednostno damo le-to npr. v vodnem mediju v suspenziji z mikrokristalinično celulozo, natrijevo karboksimetilcelulozo, dekstrozo, benzalkonijevim kloridom, polisorbatom 80 in 0,25 vol./mas. % feniletil alkoholom. V nekatere formulacije so vključeni tudi dodatni propelanti in mediji.

V nekaterih izvedbah, pri katerih dajemo sredstva v smislu izuma skupaj s kortikosteroidom, damo sredstvo sistemsko, da reguliramo proizvajanje IFN-γ sistemsko, medtem ko damo kortikosteroid bodisi lokalno ali sistemsko. V nekaterih izvedbah, npr. kadar damo fosfodiesterazni IV inhibitor ali beta-2 agonist skupaj s kortikosteroidom, damo fosfodiesterazni IV inhibitor ali beta-2 agonist sistemsko, kot npr. intravenozno ali oralno, kortikosteroid pa damo bodisi sistemsko ali lokalno. Poleg tega pa je iz obsega izuma v določenih izvedbah metod v smislu izuma posebno izključena uporaba fosfodiesteraznega IV inhibitorja ali beta-2 agonista v kombinaciji s kortikosteroidom za zdravljenje astme.

Metode v smislu izuma lahko uporabimo pri zdravljenju različnih vnetnih in imunoloških motenj. V prednostni izvedbi, npr. subjekt, ki ga je treba zdraviti, trpi zaradi septičnega šoka (tj. metode v smislu izuma dopuščajo, da se kortikosteroidi uporabijo pri zdravljenju septičnega šoka). V drugi prednostni izvedbi subjekt, ki gaje treba zdraviti, trpi zaradi Crohnove bolezni. V še drugi prednostni izvedbi subjekt, ki ga je treba zdraviti, trpi zaradi astme. V še drugi prednostni izvedbi subjekt, ki ga je treba zdraviti, trpi zaradi bolezni presadek-proti-gostitelj ali zavračanja transplantatov.

V še drugi prednostni izvedbi subjekt, ki ga je treba zdraviti, trpi zaradi avtoimunske bolezni.

V drugi izvedbi subjekt, ki ga je treba zdraviti, trpi zaradi imunoinflamatome bolezni ali motnje. Neomejujoči primeri imunoinflamatomih bolezni in motenj, ki jih lahko zdravimo v skladu z izumom, vključujejo: astmo, sindrom respiratorne stiske odraslega, sistemski lupus erythematosus, vnetno črevesno bolezen (vključno Crohnovo bolezen in ulcerativni kolitis), multiplo sklerozo, diabetes mellitus, odvisen od inzulina, avtoimunski artritis, (vključno revmatoidni artritis, juvenilni revmatoidni artritis, psoriatični artritis), vnetni pulmonami sindrom, pemphigus vulgaris, idiopathic thrombocytopenic purpura, avtoimunski meningitis, myasthenia gravis, avtoimunski thyroiditis, dermatitis (vključno atopični dermatitis in eczematous dermatitis), psoriasis, Sjogrensov sindrom, (vključno keratoconjunctivitis sicca, sekundarno po Sjogrensovem sindromu), alopecia areata, alergične odzive zaradi reakcij na artropodne pike, aphthous ulcer, iritis, conjunctivitis, keratoconjunctivitis, cutaneous lupus erythematosus, scleroderma, vaginitis, proctitis, erupcije zdravil (kot npr. Stevens-Johnsonov sindrom), leprozne reverzne reakcije, erythema nodosum leprosum, avtoimunski uveitis, alergični encefalomielitis, aplastično anemijo, čisto anemijo rdečih celic, idiopathic thrombocytopenia, polychondritis, Wegenerjev granulomatosis, kronični aktivni hepatitis, Gravesovo oftalmopatijo, primarni biliary cirrhosis, posteriomi uveitis in intersticialno fibrozo pljuč.

V drugi izvedbi subjekt, ki ga je treba zdraviti, trpi zaradi akutne vnetne motnje. Primeri akutnih vnetnih motenj vključujejo bolezen presadek-proti-gostitelj, zavračanje transplantatov, septični šok, endotoksemijo, lajmski artritis, infekcijski meningitis (npr. virusni, bakterijski, povezan z lajmsko boleznijo), akutno epizodo astme in akutne epizode avtoimunske bolezni.

Še v drugi izvedbi subjekt, ki ga je treba zdraviti, trpi zaradi kronične vnetne motnje. Neomejujoči primeri kronične vnetne motnje, ki jih lahko zdravimo, so astma, rubella arthritis in kronične avtoimunske bolezni, kot npr. sistemski lupus erythematosus, psoriasis, vnetna črevesna bolezen, vključno Crohnova bolezen in ulcerativni kolitis, multipla skleroza in revmatoidni artritis.

V nekaterih primerih so lahko sredstva, ki antagonizirajo posebno tarčo, ki regulira IFN-γ v subjektu, prednostna za zdravljenje posebne motnje. Tako se npr. motnje, čeprav ni namen, da bi omejevali z mehanizmom, pri katerih je IFN-γ preferenčno ali predominantno proizveden z NK-celicami, prednostno zdravijo z uporabo sredstva, ki antagonizira IL-18 (kot npr. ICE inhibitor) ali direktno antagonizira NK-celice, (t.j. NK-celični antagonist, kot npr. anti-NK-/NK podobno celično protitelo) v kombinaciji s kortikosteroidom. Alternativno pa se motnje, pri katerih je IFN-γ preferenčno ali predominantno proizveden s T-celicami, prednostno zdravijo z uporabo sredstva, ki antagonizira IL-12 (npr. anti-IL-12 protitelo ali sredstvo, ki stimulira intracelulamo proizvajanje cAMP) v kombinaciji s kortikosteroidom. V drugih okoliščinah je lahko ugodno, da uporabimo tako IL-18 antagonist kot tudi IL-12 antagonist (npr. pri zdravljenju motenj, pri katerih prispevajo k proizvajanju IFN-γ tako celice T kot tudi celice NK).

Sredstvo in kortikosteroid damo subjektu, ki potrebuje zdravljenje, v skladu s standardnimi načini za dajanje zdravila, dobro znanimi v tehniki, poseben način in doza za sredstvo in kortikosteroid pa sta izbrana, odvisno od potreb subjekta, ki ga je treba zdraviti, tipa zdravljenja, učinkovitosti spojine in stopnje resnosti bolezni pri subjektu. Sredstvo in kortikosteroid damo v učinkoviti terapevtski dozi, kar pomeni, da količina terapevtskega sestavka, ki v primeru, da ga damo subjektu, proizvede izboljšane motnje v primerjavi s tistimi subjekti, ki niso prejeli zdravila. Strokovnjak lahko določi in predpiše učinkovito količino potrebnih terapevtskih sredstev in kortikosteroida. Sredstva bi kortikosteroide v smislu izuma damo subjektu v biološko kompatibilnih oblikah, prikladnih za farmacevtsko dajanje in vivo, da proizvedemo želeni terapevtski odziv. Z biološko kompatibilno obliko, prikladno za dajanje in vivo je mišljena oblika zdravila, ki ga je treba dati, katere terapevtski učinki premagajo kakršnekoli toksične in stranske učinke sestavka. Poleg tega damo sredstvo v smislu izuma, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje IFN-γ v subjektu, letemu v dozi in na načni, ki zadostujeta, da se inhibira proizvajanje IFN-γ v subjektu. Podobno damo subjektu IL-12 antagonist ali IL-18 antagonist v smislu izuma v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibba IL-12-aktivnost ali IL-18-aktivnost v subjektu. Živalske modele vnetnih in imunoloških motenj, ki so sprejemljivi v tehniki kot modeli za humane bolezni, lahko uporabimo za oceno različnih terapevtskih režimov v smislu izuma. Tako lahko npr. uporabimo P.ncnes/LPS-model septičnega šoka, opisan v Primerih, da ocenimo učinkovitost terapevtskih režimov za zdravljenje septičnega šoka. Številni živalski modeli avtoimunskih bolezni so znani v tehniki in jih lahko uporabimo v metodah predloženega izuma, da ocenimo učinkovitost terapevtskih režimov, neomejujoči primeri le-teh pa vključujejo eksperimentalni kolitis (npr.: Neurath M.F. et al. (1995) J. Exp. Med. 182:1281-1290), eksperimentalni alergični encefalomielitis (npr.: Leonard J.P. et al. (1995) J. Exp. Med. 181:381-386), artritis, induciran s halogenom (Banerjee S. et al. (1989) J. Immunol. 142:2237-2243) in humani TNF-α transgenski model poliartritisa (npr.: Keffer J. et al. EMBO J (1991) 10:4025-4031). Za terapevtske režime, ki vključujejo inhibicijo ICE-aktivnosti, lahko uporabimo ICE deficientne miši kot model za kompletno inhibicijo ICE-aktivnosti. Take ICE-/-miši so opisane v tehniki (npr.: Li P. et al. (1995) Celi 80:401-411 in PCT-objava št. WO 96/12025).

Metode v smislu izuma so uporabne za moduliranje kortikosteroidne odzivnosti v različnih kliničnih določitvah. V eni izvedbi uporabimo npr. metode v smislu izuma zato, da obrnemo steroidno odpornost v subjektu, v primerjavi s tem, kadar damo subjektu samo kortikosteroid. V drugi izvedbi uporabimo metodo v smislu izuma, da povečamo steroidno občutljivost v subjektu v primerjavi s tem, ko damo subjektu samo kortikosteroid. V nadaljnji izvedbi damo kortikosteroid subjektu v skladu s programom, da sčasoma znižamo dozo kortikosteroida, z metodo pa izboljšamo vindikatomi učinek, povezan z dajanjem znižanih doz kortikosteroida. Zmožnost metod v smislu izuma, da povečajo steroidno občutljivost (tj., da imajo steroidni varčevalni učinek) lahko tako dopusti uporabo kortikosteroidne terapije v kliničnih situacijah, pri katerih je bila takšna terapija pred tem kontraindicirana. Uporaba metod v smislu izuma lahko npr. dopusti kortikosteroidno terapijo pri pacientih, ki jih predhodno niso mogli zdraviti zaradi škodljivih stranskih učinkov kortikosteroidne terapije, kot npr. mladih otrok (npr. pri juvenilnem revmatoidnem artritisu), pacientih z nekontroliranim diabetesem in pacientih s hipertenzijo.

Drugi vidik predloženega izuma se nanaša na metodo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroid v subjektu, ki obsega:

- izbiro subjekta, ki potrebuje modulacijo odzivnosti na kortikosteroid in

- dajanje subjektu sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje interferona-γ (IFN-γ) v subjektu, pri čemer damo sredstvo v dozi in na način, ki zadostujeta, da se inhibira proizvajanje IFN-γ v subjektu, tako daje odzivnost subjekta na kortikosteroid modulirana, v primerjavi s tem, kadar damo subjektu samo kortikosteroid.

Subjekt, ki ga izberemo za zdravljenje v skladu z metodo, je lahko npr. subjekt, ki je odporen proti kortikosteroidu pred dajanjem sredstva. Alternativno je lahko subjekt, ki ga izberemo za zdravljenje tisti, ki se odziva na kortikosteroid pred dajanjem sredstva, vendar pa kaže povečano občutljivost na kortikosteroid po dajanju sredstva. En primer takega subjekta so pacienti, ki trpijo zaradi motnje steroidne odvisnosti, pri čemer to motnjo lahko zdravimo z nižjimi dozami kortikosteroidov, če jo zdravimo v skladu z metodami v smislu izuma. Drug primer takega subjekta je pacient, za katerega je steroidna terapija kontraindicirana zaradi stranskih učinkov, kadar damo kortikosteroid sam, vendar pa le-ta lahko tolerira nižjo dozo kortikosteroida, kadar damo v

kortikosteroid v skladu z metodami v smislu izuma. Se nadalje je subjekt, ki ga izberemo za zdravljenje v skladu z metodo, lahko tisti, ki je izpostavljen kortikosteroidni terapiji, vendar pa je pri njem treba kortikosteroidno terapijo ustaviti, tako da dajanje sredstva izboljša vindikatomi učinek steroidov v subjektu. Sredstva za antagoniziranje tarče, ki regulira proizvajanje IFN-γ v subjektu, so opisana pred tem.

II. Farmacevtski sestavki

Drug vidik izuma se nanaša na farmacevtske sestavke za moduliranje odzivnosti na kortikosteroide. V eni izvedbi obsega farmacevtski sestavek v smislu izuma sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje interferona-γ (IFN-γ) v subjektu, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Kot je prikazano zgoraj, je tarča, ki se antagonizira, lahko npr. IL-18, IL-12 ali NK-celice (tj. farmacevtski sestavek lahko obsega IL-18 antagonist, IL-12 antagonist ali NK-celični antagonist, kot je opisano pred tem, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec).

V prednostni izvedbi obsega farmacevtski sestavek v smislu izuma inhibitor proteaze kaspazne družine, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Primeri inhibitorjev proteaz kaspazne družine in neomejujoče eksemplame doze, so opisane pred tem. V prednostni izvedbi je inhibitor proteaze kaspazne družine ICE inhibitor.

V še drugi izvedbi obsega farmacevtski sestavek v smislu izuma IL-12 antagonist, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Primeri takih IL-12 antagonistov so opisani pred tem. V prednostni izvedbi je IL-12 antagonist anti-IL-12 monoklonsko protitelo. V drugi prednostni izvedbi je IL-12 antagonist fosfodiesterazni IV inhibitor.

V še drugi prednostni izvedbi je IL-12 antagonist beta-2 agonist.

V še drugi izvedbi obsega farmacevtski sestavek v smislu izuma NK-celični antagonist, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec. Primeri takih NKceličnih antagonistov so opisani pred tem. V prednostni izvedbi je anti-NK-celični antagonist anti-NK-/NK podobno celično protitelo, prednostno protitelo anti-asialoGM1 ali protitelo NK 1.1.

Kot uporabljamo tukaj, je izraz farmacevtsko sprejemljiv nosilec namenjen, da vključuje katerokoli in vsa topila, disperzijske medije, prevleke, antibakterijska in antifungicidna sredstva, izotonična sredstva in sredstva za zavlačevanje absorpcije ipd., kompatibilna s farmacevtskim dajanjem. Uporaba takih medijev in sredstev za farmacevtsko aktivne substance je dobro znana v tehniki. V primeru, da konvencionalni medij ali sredstvo ni kompatibilno z aktivno spojmo, potem njegova uporaba v sestavkih ni potrjena. V sestavke so prav tako lahko vgrajene tudi dodatne aktivne spojine.

Farmacevtski sestavek v smislu izuma formuliramo tako, da je kompatibilen z namenjenim načinom dajanja le-tega. Npr. raztopine ali suspenzije, uporabljene za parenteralno, intradermalno ali subkutano aplikacijo, lahko vključujejo naslednje komponente: sterilno razredčilo, kot npr. vodo za injekcijo, fiziološko raztopino soli, fiksirana olja, polietilenglikole, glicerol, propilenglikol ali druga sintetična topila; antibakterijska sredstva, kot npr. benzilalkohol ali metil parabene; antioksidante, kot npr. askorbinsko kislino ali natrijev bisulfit; kelima sredstva, kot npr. etilendiamin tetraocetno kislino; pufre, kot npr. acetate, citrate ali fosfate, in sredstva za naravnanje toničnosti, kot npr. natrijev klorid ali dekstrozo. pH lahko naravnamo s kislinami ali bazami, kot npr. s klorovodikovo kislino ali z natrijevim hidroksidom. Parenteralni pripravek je lahko vsebovan v ampuli, injekcijskih iglah za enkratno uporabo ali multiplih dozirnih fiolah, narejenih iz stekla ali umetne snovi.

Farmacevtski sestavki, prikladni za injektabilno uporabo, vključujejo sterilne vodne raztopine (v primeru vodotopnosti) ali disperzije in sterilne praške za improvizirano pripravo sterilnih injektabilnih raztopin ali disperzij. Za intravenozno dajanje vključujejo prikladni nosilci fiziološke raztopine soli, bakteriostatično vodo, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ali fosfatne pufeme fiziološke raztopine soli (PBS). V vseh primerih mora biti sestavek sterilen in naj bi bil tekoč do take mere, da obstaja enostavna možnost injiciranja. Biti mora tako stabilen pri razmerah izdelave in shranjevanja kot tudi zavarovan pred kontaminimim delovanjem mikroorganizmov, kot npr. bakterij in gliv. Nosilec je lahko topilo ali disperzijski medij, ki vsebuje npr. vodo, etanol, poliol (npr. glicerol, propilenglikol in tekoči polietilen glikol ipd.) in njihove prikladne zmesi. Pravilno fluidnost lahko vzdržujemo npr. z uporabo prevlek, kot npr. lecitina, z vzdrževanjem potrebne velikosti delcev v primeru disperzije in z uporabo surfaktantov. Preprečevanje delovanja mikroorganizmov lahko dosežemo z različnimi protibakterijskimi in protiglivičnimi sredstvi, kot so npr. parabeni, klorobutanol, fenol, askorbinska kislina, timerosal ipd. V mnogih primerih je prednostno, da vključimo v sestavek izotonična sredstva, npr. sladkorje, polialkohole, kot npr. manitol, sorbitol, natrijev klorid. Podaljšano absorpcijo injektabilnih sestavkov lahko dosežemo tako, da vključimo vanje sredstva, ki upočasnijo absorpcijo, npr. aluminijev monostearat in želatino.

Sterilne injektabilne raztopine lahko pripravimo z vgradnjo aktivne spojine v potrebni količini v ustrezno topilo z eno sestavino ali kombinacijo sestavin, navedenih zgoraj, kot je potrebno, in nato s filtrirano sterilizacijo. Na splošno pripravimo disperzije z vgradnjo aktivne sestavine v sterilni nosilec, ki vsebuje bazični disperzijski medij in potrebne druge sestavine, izmed tistih, navedenih zgoraj. V primeru sterilnih praškov za pripravo sterilnih injektabilnih raztopin so prednostne pripravljalne metode vakuumsko sušenje in liofilizacija, kjer dobimo prašek aktivne sestavine in katerekoli dodatne želene sestavine iz njene predhodno sterilno filtrirane raztopine.

Oralni sestavki na splošno vključujejo inertno razredčilo ali užitni nosilec. Lahko so obdani z želatinskimi kapsulami ali stisnjeni v tablete. Za namene oralnega terapevtskega dajanja lahko aktivno sestavino vgradimo z ekscipienti in uporabimo v obliki tablet, pastil ali kapsul. Oralne sestavke lahko pripravimo tudi z uporabo tekočega nosilca za uporabo kot ustna voda, pri čemer spojino v tekočem nosilcu apliciramo oralno, z njo splaknemo usta in jo izpljunemo ali pogoltnemo. Farmacevtsko kompatibilna vezivna sredstva in/ali adjuvanse lahko vključimo kot del sestavka. Tablete, pilule, kapsule, pastile ipd. lahko vsebujejo katerokoli od spodaj navedenih sestavin ali spojin, podobnih lastnosti: vezivo, kot npr. mikrokristalinično celulozo, tragakantno gumo ali želatino; ekscipient, kot npr. škrob ali laktozo; dezintegracij sko sredstvo, kot npr. alginsko kislino, Primogel ali koruzni škrob; mazivo, kot npr. magnezijev stearat ali Sterotes; drsno sredstvo, kot npr. koloidni silicijev dioksid; sladilo, kot npr. saharozo ali saharin; aromo, kot npr. pepermint, metilsalicilat ali oranžno aromo.

V eni izvedbi aktivne spojine pripravimo z nosilci, ki zaščitijo spojino pred hitro eliminacijo iz telesa, kot npr. formulacijo za kontrolirano sproščanje, ki vključuje implantate in mikroinkapsulirane sisteme za dajanje. Uporabimo lahko biorazgradljive biokompatibilne polimere, kot npr. etilen vinil acetat, polianhidride, poliglikolno kislino, kolagen, poliortoestre in polimlečno kislino. Metode za pripravo takih formulacij so strokovnjakom jasne. Materiale lahko dobimo tudi na tržišču od Alza Corporation in Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomske suspenzije (vključno liposome, usmerjene na inficirane celice z monoklonskimi protitelesi za virusne antigene) prav tako lahko uporabimo kot farmacevtsko sprejemljive nosilce. Pripravimo jih lahko po postopkih, ki so znani strokovnjakom, kot je npr. opisano v US-patentu št. 4,522,811.

Farmacevtske sestavke v smislu izuma lahko formuliramo za dajanje na poseben način, kot je npr. oralno, intravenozno, oftalmično dajanje ipd.

V prednostni izvedbi farmacevtski sestavek v smislu izuma formuliramo za lokalno dajanje. Sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje interferona-γ (IFN-γ) v subjektu, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljivi nosilec lahko formuliramo kot kremo, pomado, mazilo ipd., prikladno za aplikacijo na kožo.

V drugi prednostni izvedbi farmacevtski sestavek v smislu izuma formuliramo za dajanje z inhalacijo. Sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje interferona-γ (IFN-γ) v subjektu, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec lahko formuliramo v nazalno pršilo ali inhalant, da dopustimo dajanje terapevtskih sredstev v nazalno ali sinusno pasažo ali pljuča (npr. bronhialne pasaže) z inhalacijo.

Predloženi izum je nadalje ponazorjen z naslednjimi Primeri, ki naj ne bi bili konstruirani kot omejujoči. Vsebine vseh referenc, objavljenih patentov in patentnih prijav, navedenih vseskozi v tej prijavi, so tukaj vključene z referencami.

PRIMER 1:

Inhibicija ICE-aktivnosti v modelu septičnega šoka ima za posledico steroidno odzivnost.

V tem Primeru raziskujemo učinek inhibiranja ICE-aktivnosti pri steroidni odzivnosti v septičnem šoku. Model septičnega šoka induciramo v ICE deficientnih (ICE-/-)miših in miših divjega tipa (ICE+/+), kijih nato obdelamo s kortikosteroidom. (ICE-/-)-miši uporabimo kot model za kompletno inhibicijo ICE-aktivnosti (glej Li P. et al. (1995) Celi 80:401-411 za nadaljnji opis ICE deficientnih miši. Odzivnost živali na kortikosteroidno zdravljenje ugotovimo z zapisovanjem ravni inflamatomega citokina TNFa v serumih miši.

ICE deficientne miši in miši divjega tipa najprej senzibiliziramo s celičnim stenskim materialom Propionibacterium acnes (1 mg na miš), da induciramo vnetje nizke stopnje, 6 dni kasneje pa jih izzovemo z lipopolisaharidom (LPS) (1 μg na miš 0,1 ml fiziološke raztopine soli i.v.). 30 minut po dajanju LPS obdelamo miši s kortikosteroid deksametazonom (4 mg/kg na miš v 0,5 ml 95 % fiziološke raztopine soli/0,5 % etanola, i.p.). Kontrolne miši obdelamo samo z vehiklom. Vsem mišim vzamemo kri 90 minut po dajanju LPS in serumske vzorce analiziramo za prisotnost TNFa s standardno ELISO.

Rezultati so prikazani na sl. 1. Miši divjega tipa in ICE deficientne miši, obdelane samo z vehiklom, imajo podobne ravni serumskega TNFa. Obdelovanje miši divjega tipa z deksametazonom ne vpliva znatno na ravni serumskega TNFa, iz česar je razvidna njihova odpornost proti steroidnemu zdravljenju v tem modelu septičnega šoka. V primerjavi s tem pa obdelovanje ICE deficientnih miši z deksametazonom zatre ravni serumskega TNFa za 74 % (p < 0,002). Iz teh podatkov je razvidno, da inhibicija ICE-aktivnosti obme odpornost za steroidno zdravljenje v modelu septičnega šoka.

PRIMER 2:

Inhibicija ICE-aktivnosti v modelu septičnega šoka poveča steroidno občutljivost.

V tem Primeru raziskujemo učinek inhibiranja ICE-aktivnosti na steroidno občutljivost pri septičnem šoku. Uporabimo enak LPS/P. iz<?«es-model septičnega šoka, kot je opisan v Primeru 1, razen da ICE deficientne miši in miši divjega tipa predhodno obdelamo z vehiklom ali kortikosteroidom 15 minut pred izzivom z LPS. Odzivnost živali na kortikosteroidno zdravljenje ponovno ugotavljamo z zapisovanjem ravni inflamatomega citokina TNFa v serumih miši.

ICE deficientne miši in miši divjega tipa najprej senzibiliziramo s celičnim stenskim materialom Propiombacterium acnes (1 mg na miš), da induciramo vnetje nizke stopnje, 6 dni kasneje pa jih izzovemo z lipopolisaharidom (LPS) (1 pg na miš v 0,1 ml fiziološke raztopine soli, i.v.). 15 minut pred izzivom z LPS živali obdelamo s padajočimi količinami kortikosteroid deksametazona (0,5, 0,005 ali 0,0005 mg/kg na miš v 0,5 ml 95 % fiziološke raztopine soli/0,5 % etanola, i.p.). Kontrolne miši obdelamo samo z vehiklom. Vsem mišim odvzamemo kri 90 minut po dajanju LPS in analiziramo serumske vzorce za prisotnost TNFa s standardno ELISO.

Rezultati so prikazani na sl. 2. Tako miši divjega tipa kot tudi ICE deficientne miši kažejo odzivnost na predobdelovanje z 0,05 mg/kg deksametazona. V nasprotju s tem pa ICE deficientne miši, predhodno obdelane samo z 0,005 ali 0,0005 mg/kg deksametazona, kažejo 76 % in 78 % (p < 0,005) nižje ravni serumskega TNFa, v primerjavi s pomankanjem TNFa-supresije v podobno obdelanih živalih divjega tipa. Iz teh podatkov je razvidno, da ima inhibicija ICE-aktivnosti za posledico povečano steroidno občutljivost v modelu septičnega šoka, ker so 10- do 100-krat nižje doze deksametazona terapevtsko učinkovite pri ICE-deficientnih živalih v primerjavi z živahni divjega tipa.

PRIMER 3:

Fosfodiesterazni IV inhibitor zniža proizvajanje IL-12.

V tem primeru raziskujemo učinek fosfodiesteraznega IV inhibitorja roliprama na proizvajanje IL-12, induciranega z LPS. Miši B6 predhodno obdelamo z vehiklom ali rolipramom (30 mg/kg v 0,5 ml 0,1 % metil celuloze, i.p.) 15 minut pred izzivom z LPS (10 pg/miš, i.v.). 90 minut po dajanju LPS mišim odvzamemo kri in ugotovimo serumske ravni IL-12 s standardno ELISO.

Rezultati so prikazani na sl. 3. Miši, predhodno obdelane z rolipramom, imajo 70 % nižje ravni serumskega IL-12 kot miši, predhodno obdelane samo z vehiklom. Iz teh podatkov je razvidno, da so fosfodiesterazni IV inhibitorji učinkoviti za inhibiranje proizvajanja IL-12, induciranega z LPS.

PRIMER 4:

Cepitev IL-18 s proteazami kaspazne družine.

Sposobnost različnih rekombinantnih proteaz kaspazne družine (tj. izraženo v E. coli), da cepijo prekurzorski IL-18 (proIL-18) v zreli IL-18 preizkusimo s proteoliznim preizkusom in vitro. Cepitev poli(ADP-riboza) polimeraze (PARP) uporabimo kot pozitivno kontrolo. Rezultati so zbrani spodaj v tabeli 1.

Tabela 1. Proteoliza proIL-18 z rekombinantnimi kaspazami % cepitve kaspaza* koncentracija (ug/ml) proIL-18 PARP

ICE	(1)	1,25	100	99
ICH-2	(4)	5,00	82	93
ICErelIII	(5)	20,00	55	90
CPP32	(3)	5,00	0a	100
Mch2	(6)	10,00	2	96
Mch3	(7)	5,00	32b	97
ICH-1	(2)	75,00	5	98

Kaspaze so oštevilčene v oklepajih kot predlagajo: Alnemri et al. (1996) Celi 87:171.

^a s CPP32 (5 μg/Inl) cepljen proIL-18, ki proizvede 12 kDa in 10 kDa fragment namesto pričakovanega 18 kDa-ffagmenta.

L drugače od drugih kaspaz Mch3 prekurzor, izražen v E. coli, ni izpostavljen avtokatalizi za proizvajanje aktivne proteaze. Dodatek ICE je potreben za iniciranje avtokatalize Mch3 in proizvajanje aktivne Mch3-proteaze. Delna cepitev proIL-18 z Mch3 je posredovana s prisotnostjo ICE pri pripravi Mch3.

PRIMER 5:

Zdravljenje septičnega šoka.

Paciente, ki kažejo v kliničnih okvirih septični šok (npr. v povezavi z inficiranimi abrazijami, projektilnimi poškodbami ali sistemskimi bakterimijami iz drugih virov) damo sredstvo, izbrano izmed ICE inhibitorja, fosfodiesteraznega IV inhibitorja (npr. rolipram, 30 mg/kg) in anti-IL-12-monoklonskega protitelesa, skupaj s kortikosteroidom (npr. visoka doza metilprednizolona, 1 g/dan, i.v.). Kortikosteroid in

100 sredstvo lahko damo simultano ali pa alternativno, lahko damo sredstvo pred dajanjem kortikosteroida ali po njem. Paciente obdelamo tudi z ustrezno antibiotično terapijo.

PRIMER 6:

Zdravljenje zavračanje transplantatov.

Pacientom, ki bodo prejeli transplantat ledvico, damo sredstvo, izbrano izmed ICE inhibitorja, fosfodiesteraznega IV inhibitorja (npr. rolipram, 30 mg/kg) in anti-IL-12 monoklonskega protitelesa, skupaj s kortikosteroidom (npr. oralni prednizon, 25-75 mg/dan). Prednostno začnemo zdravljenje pred prejemom ledvice od donatorja (npr. dajanje zdravila se lahko začne 24 ur pred prejemom ledvice od donatorja) z dozami, ki jih je treba ponoviti, če je potrebno (npr. vsakih 12 ur). Kortikosteroid in sredstvo lahko damo simultano ali alternativno, lahko damo sredstvo pred dajanjem kortikosteroida ali po njem. Paciente obdelamo tudi z dodatno imunosupresivno terapijo (kot je npr. zdravljenje s ciklosporinom A ali zdravljenje z OKT3protitelesom), tako da sta imunsko zavračanje in vnetni odziv simultano zatrta.

PRIMER 7:

Izboljšanje učinka povratnega delovanja steroida.

Paciente z astmo, alergijskim rinitisnim vnetjem ali revmatoidnim artritisom, ki bodo izpostavljeni zdravljenju s kortikosteroidnim inhalantom ali sistemskimi kortikosteroidi in ki bodo začeli programirano ukinitev steroidnega zdravljenja, damo sredstvo, izbrano izmed ICE inhibitorja, fosfodiesteraznega IV inhibitorja (npr. rolipram, 30 mg/kg) in anti-IL-12 monoklonskega protitelesa. Paciente prednostno obdelamo pred pojemanjem ali prekinitvijo steroidnega zdravljenja, da izboljšamo vindikatomi učinek steroidov, ki je lahko posledica prekinitve steroidne terapije. Če je treba, paciente lahko obdelamo z dodatnimi nesteroidnimi in protivnetnimi sredstvi.

101

PRIMER 8:

Zdravljenje akutne epizode avtoimunske bolezni.

Pacientom, ki trpijo zaradi akutne vzplamtitve avtoimunske bolezni, kot npr. vnetne Črevesne bolezni (npr. ulcerativni kolitis ali Crohnova bolezen), damo sredstvo, izbrano izmed ICE inhibitorja, fosfodiesteraznega IV inhibitorja (npr. rolipram, 30 mg/kg) in anti-IL-12 monoklonskega protitelesa skupaj s kortikosteroidom (npr. oralni prednizon, 25-75 mg/dan). Kortikosteroid in sredstvo lahko damo simultano ali alternativno, lahko sredstvo damo pred dajanjem kortikosteroida ali po njem. Paciente lahko obdelamo tudi z dodatno imunosupresivno terapijo za nadzor akutne vzplamtitve avtoimunske bolezni.

PRIMER 9;

Zdravljenje kronične avtoimunske bolezni.

Pacientom, ki trpijo zaradi kronične avtoimunske bolezni, kot je npr. Crohnova bolezen, damo sredstvo, izbrano izmed ICE inhibitorja, fosfodiesteraznega IV inhibitorja (npr. rolipram, 30 mg/kg) in anti-IL-12 monoklonskega protitelesa skupaj s kortikosteroidom (npr. oralni prednizon, 25-75 mg/dan). Kortikosteroid in sredstvo lahko damo simultano ali alternativno, lahko damo sredstvo pred dajanjem kortikosteroida ali po njem. Paciente prav tako lahko obdelamo z dodatno imunosupresivno terapijo, da kontroliramo avtoimunsko bolezen.

PRIMER 10;

Inhibicija proizvajanje IFN-γ z eliminiranjem NK-celic.

V tem primeru induciramo šok v miših z obdelovanjem z visoko dozo LPS (40 mg/kg LPS, ki ga damo intravenozno). Učinek osiromašenja NK-celic na proizvajanje različnih citokinov v miših in na smrtnost raziskujemo z dajanjem protitelesa antiasialo-GMl (anti-ASGMl) intravenozno 10 minut pred dajanjem LPS. Kontrolne živali prejmejo zajčji IgG. Učinek obdelovanja z ASGM1 na proizvajanje IL-Ιβ,

TNFa in IFN-γ, kot tudi na smrtnost, je prikazan spodaj v tabeli 2.

Tabela 2

102

Obdelovanje	# miši	proizvajanje citokinov (pg/ml)	smrtnost (30 h) % preživetih
IL-Ιβ	TNFa	IFN-γ
LPS + zajčji IgG (kontrola)	6	19461483	585711071	16631811	0 (n=10)*
LPS + ASGM1 protitelesa	6	16471482	545311103	3631108	90 (n=10)

* Vse živali poginejo v 15 urah.

Iz teh rezultatov je razvidno, da eliminacija NK-celic z obdelovanjem s protitelesom anti-asialo-GMl zmanjša proizvajanje IFN-γ in podaljša preživetje po dajanju LPS pri šoku z visoko dozo LPS.

PRIMERU:

Učinek ICE inhibitorja in kortikosteroida v modelu septičnega šoka.

V tem Primeru uporabimo LPS/P. acnes model septičnega šoka, opisan v Primerih 1 in 2, za raziskovanje učinka ICE inhibitorja v kombinaciji s kortikosteroidom. Mišim B6 implantiramo za 24 ur osmotično črpalko, ki vsebuje ICE inhibitor acetil-tirozinvalin-alanin-asparaginska kislina-CHO (Ac-YVAD-CHO) (100 mg/kg), ali kontrolni vehikel, subkutano 18 ur pred injiciranjem LPS. LPS injiciramo intravenozno (0,01 μg/miš ali 10 μg/miš) v času nič. Vsem mišim injiciramo 5 mg/kg deksametazona intraperitonealno 30 minut po injiciranju LPS. Odzivnost živali na kortikosteroidno obdelovanje ugotavljamo z zapisovanjem ravni inflamatomega citokina TNFa, kot

103 tudi interlevkina-6 (IL-6) in interlevkina-ΐβ (IL-Ιβ) v serumih miši. Vsem mišim vzamemo kri 90 minut po dajanju LPS in serumske vzorce analiziramo za prisotnost TNFa, IL-6 in IL-1 β s standardnimi metodami.

Rezultati so prikazani na sl. 4, 5 in 6 za TNFa, IL-6 oz. IL-Ιβ. Iz podatkov je razvidno, da imajo miši, obdelane z obema, tako z ICE inhibitorjem Ac-YVAD-CHO kot tudi deksametazonom, znatno nižje serumske ravni TNFa, IL-6 in IL-Ιβ, kadar uporabimo bodisi 0,01 pg oz. 10 pg LPS, da induciramo septični šok. Kot je bilo pred tem prikazano v Primeru 1, obdelovanje miši samo z deksametazonom ne vpliva znatno na ravni serumskega TNFa, kar kaže na odpornost miši proti obdelovanju samo s steroidom v tem modelu septičnega šoka. V nasprotju s tem pa obdelovanje miši tako z deksametazonom kot tudi ICE inhibitorjem zatre ravni serumskega TNFa za 96 % (p < 0,005) pri miših, obdelanih z 0,01 pg LPS, in za 86 % (p < 0,005) pri miših, obdelanih z 10 pg LPS. Poleg tega so serumske ravni IL-6 zmanjšane 95 % (p < 0,00005) oz. 91 % (p < 0,00005), ravni serumskega IL-Ιβ pa so zmanjšane 94 % (p < 0,001) oz. 92 % (p < 0,0002). Ti podatki kažejo, da inhibicija ICE-aktivnosti z uporabo ICE inhibitorja obme odpornost pri obdelovanju s steroidom v modelu septičnega šoka.

PRIMER 12:

Sinteza hidroksamatnih ICE inhibitorjev.

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-fenilacetilaminooksi-pentanoiska kislina

Stopnja A

N-(fenilmetoksi)-benzenacetamid [(0,760 g, 3,15 mmol), pripravljen po postopku Heama M.T.W. in Warda A.D. (Aust. J. Chem., 1969:22:1731)] prevzamemo v 10 ml CH₃CN in obdelamo z dimetilamino-piridinom (DMAP) (50 mg) in diterc.butildikarbonatom (0,824 g, 3,78 mmol). Reakcijsko zmes pustimo, da se meša pod argonom 12 ur, nato jo razredčimo z etilacetatom (EtOAc) in speremo s 3M K2S2O5 (1 x 10 ml), NaHCO₃ (1 x 10 ml). Organsko plast posušimo nad Na₂SO4,

104 filtriramo in koncentriramo. S čiščenjem s kromatografijo (SiO₂, 9:1 heksan-EtOAc) dobimo 0,910 g (84 %) l,l-dimetiletil(fenilacetil)fenil-metoksi)karbamata kot bistro viskozno olje.

‘H NMR (400 MHz, DMSO-do): a 7,41 [m, 5Η], 7,32 [m, 2Η], 7,24 [m, 3Η], 4,90 [s, 2Η], 4,09 [s, 2Η], 1,48 [s, 9Η], IR (tanek film), 3063, 3032, 2979, 2935, 2886, 1777, 1736, 1497, 1455, 1370, 1302 cm'¹. Masni spekter (MS) (kemijska ionizacija [Cl] NH₃) 342 (M⁺ + H).

Elementna analiza:

Izrač. za C₂₀H₂₃NO₄.0,051 CH₂C1₂: C 69,66; H 6,74; N 4,05.

Ugot.: C 69,66; H 6,83; N 3,99.

Stopnja B

1,1-dimetiletil (fenilacetil)(fenil-metoksi)karbamat (810 mg, 2,37 mmol) raztopimo v 75 ml suhega THF in dodamo 90 mg 5 % Pd/BaSO₄. Reakcijsko zmes obdelujemo s H₂(l,3.10⁵ Pa) 20 ur. Reakcijsko zmes filtriramo skozi Celite in koncentriramo, da dobimo 588 mg (99 %) l,l-dimetil-etilhidroksi(fenilacetil)karbamata kot olje. Nadaljnjega čiščenja nismo izvajali.

*H NMR (400 MHz, CDC1₃): a 8,22 [s, 1Η], 7,31 [m, 5Η], 4,24 [s, 2Η], 1,55 [s, 9Η],

Stopnja C (S)-5-bromo-4-okso-3-[[(fenilmetoksi)-karbonil]amino]-pentanojska kislina 1,1dimetiletil ester [(297 mg, 0,742 mmol), pripravljen po postopku Dolle R.E. et al., (J. Med, Chem., 1994; 37:563-4)], l,l-dimetiletilhidroksi(fenilacetil)karbamat (187 mg, 0,742 mmol) in KF (104 mg, 1,85 mmol) združimo v 5 ml dimetilformamida (DMF) in pustimo, da se meša pod argonom 12 ur. Reakcijsko zmes razredčimo z EtOAc (15 ml) in speremo z vodo (3 x 15 ml) in slanico (1 x 15 ml). Organsko plast posušimo nad Na₂SO₃ in koncentriramo. S čiščenjem s kromatografijo (SiO₂, 4:1 heksan-EtOAc) dobimo 168 mg (40 %) [[[(l,l-dimetiletoksi)-karbonil](fenilacetil)amino]oksi]-4okso-3-[[((fenilmetoksi)karbonil]amino]-pentanojska kislina 1,1-dimetiletil estra kot bistro olje.

‘H NMR (300 MHz, CDC1₃): a 7,35 [m, 5Η], 5,84 [d, J = 9,0 Hz, 1Η], 4,79, [A od AB, J = 15,3 Hz, 1Η], 4,70 [m, 1Η], 4,57 [B od AB, J = 15,3 Hz, 1Η], 4,10 [s, 2Η],

105

3,09 [dd, J = 16,8, 4,6 Hz, 1Η], 2,79 [dd, J = 16,8, 4,9 Hz, 1Η], 1,52 [s, 9Η], 1,39 [s, 9Η], IR (tanek film) 3374, 2980, 2935, 1726 (br), 1499, 1370, 1298, 1150 cm'¹. MS (APCI, metanol (MeOH)) 571,5 (M⁺ + H).

Elementna analiza:

izrač. za C₃oH₃₈N₂0₉: C 63,15; H 6,71; N 4,91.

ugot.: C 62,76; H 6,70; N 4,69.

Stopnja D

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-fenilacetilaminooksi-pentanojska kislina, 1,1dimetiletil ester (208 mg, 0,365 mmol) prevzamemo v 3 ml 1:1 trifluoroocetne kisline (TFA)/CH₂Cl2 in pustimo, da se meša 2 uri. Reakcijsko zmes razredčimo z acetonitrilom (MeCN) (10 ml) in koncentriramo. Ostanek ločimo od MeCN petkrat. S čiščenjem s kromatografijo (SiO₂, 90:9:1 CH₂Cl₂-aceton-mravljinčna kislina) dobimo 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-fenilacetilaminooksi-pentanojsko kislino (51 mg, 34 %) kot belo peno.

‘H NMR (300 MHz, CDC1₃): a 8,63 [s, 1Η], 7,34 [širok (br), s, 10Η], 5,48 [br, d, J = 4 Hz, 1Η], 5,08 [br dd, J = 16, 12 Hz, 2Η], 4,23 [m, 1Η], 3,97 [m, 2Η], 3,58 [br, s, 2Η], 2,80 [m, 1Η], 2,64 [m, IH].

IR (KBr) 3305 (br), 2928, 1791, 1772, 1717, 1699, 1685, 1674, 1654, 1521,

1455 cm'¹.

MS (APCI, MeOH) 415 (M⁺ + H).

Elementna analiza:

izrač.: za C₂₁H₂₂N₂O₇.0,106 CF₃CO₂H: C 59,73; H 5,22; N 6,57.

ugot.: C 59,73; H 5,46; N 6,28.

Spodaj navedene spojine pripravimo iz (S)-5-bromo-4okso-3-[[(fenibnetoksi)karbonil]amino]-pentanojska kislina 1,1-dimetiletil estra na način, opisan zgoraj v stopnji C in stopnji D.

106

3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-pirolidin-l-iloksi)-pentanoiska kislina

Stopnja A

Pripravljeno iz l-hidroksi-2-pirolidinona [Biswas A. in Miller M.J. (Heterocvcles, 1987; 26:2849)] na način, opisan zgoraj v stopnji C, da dobimo 3benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-pirolidin-l-iloksi)-pentanojska kislina 1,1dimetiletil ester (74 %).

’H NMR (400 MHz, CDC1₃): a 7,37 [m, 5H]; 5,88 [br, d, J = 8,9 Hz] 5,16 [A od AB, J = 12,2 Hz, IH]; 5,11 [B od AB, J = 12,2 Hz, IH]; 4,95 [A od AB, J = 17,1 Hz, 1Η], 4,81 [B od AB, J = 17,1 Hz, 1Η], 4,60 [m, 1Η], 3,62 [m, 2Η], 3,01 [dd, J = 17,1, 4,6 Hz, 1Η], 2,75 [dd, J = 17,1, 4,8 Hz, 1Η], 2,30 [t, J = 7,95 Hz, 2Η], 1,99 [kvinta, J =

7,5 Hz, 2Η], 1,41 [s, 9Η], IR (KBr) 3328 (br), 2976, 2932, 1717, 1701, 1522, 1256 cm'¹.

MS (APCI, MeOH) 421 (M⁺ + H).

Elementna analiza:

izrač. za C₂iH₂₈N₂O7.0,096 DMF: C 59,81; H 6,76; N 6,87.

ugot.: C 59,56; H 7,00; N 6,52.

Stopnja B:

Pripravljeno iz 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-pirolidin- 1-iloksi)pentanojska kislina 1,1-dimetiletil estra na način, opisan zgoraj v stopnji D, da dobimo 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-pirolidin-l-iloksi)-pentanojsko kislino (72 %).

’H NMR (400 MHz, CDC1₃): a 8,55 [br s, 1Η], 7,36 [m, 5Η], 5,46 [br d, J = 9,4 Hz, 1Η], 5,14 [A od AB, J = 5,2 Hz, 1Η], 5,11 [B od AB, J = 5,2 Hz, 1Η], 4,23 [m, 1Η],

4,19 [A od AB, J = 13,3 Hz, 1Η], 3,96 [B od AB, J = 13,3 Hz, 1Η], 3,67 [m, 1Η], 3,52 [dd, J = 15,1, 7,9 Hz, 1Η], 2,84 [dd, J = 16,9, 8,2 Hz, 1Η], 2,61 [dd, J = 16,9, 10,9 Hz, 1Η], 2,42 [m, 2Η], 2,11 [m, 2H]. IR (KBr) 3408 (br), 2926, 1791, 1717, 1700, 1540, 1268, 1054 cm'¹. MS (APCI, MeOH) 365 (M⁺ + H).

Analiza: izrač. za Ci₇H₂oN₂0₇.0,32 C₃H₇OC₃H₇: C 57,27; H 6,24; N 7,04.

107

Ugot.: C 57,27; Η 6,24; N 6,74.

-benziloksikarbonilamino-5-( 3, 5-diokso-10-oksa-4-aza-triciklo [5.2.1.0^2,6ldec-8-en-4iloksi)-4-okso-pentanojska kislina

Stopnja A

Pripravlj eno iz 3 a,4,7,7a-tetrahidro-2-hidroksi-4,7-epoksi-1 H-izoindol-1,3 (2H)-diona [Narita M., Teramoto T, Okawara M (Buli. Chem. Soc. Jap., 1971; 44:1084)] na način, opisan zgoraj v stopnji C, da dobimo 3-benziloksikarbonilamino-5-(3,5-diokso10-oksa-4-aza-triciklo[5.2.1.0^2,6]dec-8-en-4-iloksi)-4-okso-pentanojska kislina 1,1dimetiletil ester (64 %).

^!H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): a 7,84 [d, J = 8,2 Hz, 1Η], 7,34 [m, 5Η], 6,54 [s, 2Η], 5,16 [s, 2H]; 5,07 [A od AB, J = 12,5 Hz, 1Η], 5,03 [B od AB, J = 12,5 Hz, 1Η],

4,93 [A od AB, J = 16,2 Hz, 1Η], 4,87 [B od AB, J = 16,2 Hz, 1Η], 4,52 [m, 1Η], 2,87 [s, 2Η], 2,73 [dd, J = 16,2, 5,8 Hz, 1Η], 2,50 [zasenčen z dimetil-sulfoksid (DMSO) resonanco], 1,37 [s, 9Η], IR (KBr) 3421, 2979, 2930, 1790, 1726, 1520, 1368 cm'¹. MS (APCI, MeOH) 445 (M⁺ -C₄H₈).

Analiza: izrač. za C25H28N2O9; C 59,65; H 5,70; N 5,35.

Ugot.: C 59,99; H 5,64; N 5,60.

Stopnja B

Pripravljeno iz 3-benziloksikarbonilamino-5-(3,5-diokso-10oksa-4-azatriciklo[5.2.1.0^2,6]dek-8-en-4-iloksi)-4-okso-pentanojska kislina 1,1dimetiletil estra na način, opisan zgoraj v stopnji C, da dobimo 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-fenilacetilaminooksi-pentanojsko kislino (78 %). IR (tanek film) 3360, 1789, 1723, 1530, 1220 cm'¹. MS (APCI, MeOH) 445 (M⁺ + H). Elementna analiza:

Izrač. za C₂iH₂₀N₂O9.0,194 CF₃CO₂H: C 55,06; H 4,36; N 5,96.

Ugot.: C 55,06; H 4,58; N 5,99.

3-benziloksikarbonilamino-5-(2-okso-2,3-dihidro-indol-l-iloksi)-4-okso-pentanoiska kislina

108

Pripravljeno iz 1-hidroksioksiindola [Kende A.S. in Thurston J. (Svnthetic Communications, 1990; 20:2133-8)], da dobimo 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5(2-okso-2,3-dihidro-indol-l-iloksi)-pentanojsko kislino (24 %), tal.: 58-70 °C (razpad).

Elementna analiza:

Izrač. za C2iH₂oN₂0₇: C 61,16; H 4,89; N 6,79.

Ugot.: C 60,84; H 4,72; N 6,46.

3-benziloksl·karbonilamino-5-(7-metoksikarbonilmetil-2-okso-oktab^dro-indol-liloksi)-4-okso-pentanoiska kislina

Stopnja A

Hidroksilamin hidroklorid (200 mmol, 13,8 g) raztopimo v piridinu (200 mmol, 16 ml) in metanolu (10 ml) in to raztopino dodamo zmesi cis-2-okso-l,3-cikloheksandiocetna kislina, dimetil estra [(35 mmol, 8,5 g), pripravljeno po postopku, ki ga opisujejo: Grieco P.A., Noguez J.A., Masaki Y., Hiroi K., Nishizawa M.,Rosowsky A., Oppenheim S,, Lazarus H. J. Med. Chem,, 1977; 20:71] v 200 ml MeOH. V to raztopino dodamo po deležih NaCNBH₄ (30 mmol, 1,9 g) v približno 1 uri in dobljeno raztopino mešamo pri sobni temperaturi 4 dni. Reakcijsko zmes nato koncentriramo do suhega, ponovno raztopimo v 500 ml etil acetata in speremo s 3 x 50 ml nasičenega NaCl, posušimo z Na₂SO₄, filtriramo in koncentriramo, da dobimo surovo trdno snov, kije večinoma želeni produkt in piridin. Surovi oktahidro-l-hidroksi-2-okso-lH-indol7-ocetna kislina metil ester prekristaliziramo iz EtOAc, da dobimo 4,05 g (51 %) bele trdne snovi.

‘H-NMR: 9,26 [IH, s], 3,64 [IH, dd], 3,59 [3H, s], 2,65 [IH, dd], 2,49 [IH, dd], 2,34 [IH, dd], 2,18 [IH, m], 2,04 [IH, m], 1,79 [IH, d], 1,62 [IH, m], 1,60 [IH, s-br], 1,42 [IH, m], 1,25 [2H, m], 1,06 [IH, m]. MS (CI, NH₃) 228 (M⁺ + H).

109

Stopnja B

Pripravljeno iz oktahidro-l-hidroksi-2-okso-lH-indol-7-ocetna kislina metil estra na način, opisan zgoraj v stopnji C, da dobimo 3-benziloksikarbonilamino-5-(7metoksikarbonilmetil-2-okso-oktahidro-indol-l-iloksi)-4-okso-pentanojska kislina 1,1trimetiletil ester kot steklasto olje (45 %).

'H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 1:1 zmes diastereomerov): a 7,85 [d, J = 5,8 Hz, 0,5 Η], 7,83 [d, J = 5,8 Hz, 0,5 Η], 7,35 [m, 5Η], 5,06 [s, 2Η], 4,94 [A od AB, J = 16,9 Hz, 0,25 Η], 4,87 [A od AB, J = 17,6 Hz, 0,25 Η], 4,82 [B od AB, J = 17,6 Hz, 0,25 Η], 4,74 [B od AB, J = 16,9 Hz, 0,25 Η], 4,23 [m, 1Η], 3,82 [m, 0,5 Η], 3,79 [m, 0,5 Η], 3,57 [s, 1,5 H]; 3,57 [s, 1,5 Η], 2,72 [m, 0,5 Η], 2,70 [m, 0,5 Η], 2,52 [m, zasenčen z DMSO], 2,39 [m, 2Η], 2,22 [br m, 1Η], 2,10 [br m, 1Η], 1,88 [br s, 0,5 Η], 1,84 [br s, 0,5 Η], 1,61 [m, 2Η], 1,42 [m, 1Η], 1,36 [s, 9 Η], 1,25 [m, 2 Η], 1,06 [m, IH]. IR (tanek film) 3418, 3344, 3017, 2979, 2934, 2860, 1725, 1506 cm’¹. MS (APCI, MeOH) 547,6 (M⁺ + H).

Stopnja C

Pripravljeno iz 3-benziloksikarbonilamino-5-(7-metoksikarbonilmetil-2-oksooktahidro-indol-l-iloksi)-4-okso-pentanojska kislina 1,1-trimetiletil estra na način, opisan zgoraj v stopnji D, da dobimo 3-benziloksi-karbonilamino-5-(7metoksikarbonilmetil-2-okso-oktahidro-indol- l-iloksi)-4-okso-pentanojsko kislino (45 %), tal.: 55-58 °C.

^!H NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 1:1 zmes diastereomerov): a 12,4 [s, 1Η], 7,84 [m, 1Η], 7,35 [m, 5Η], 5,05 [s, 2Η], 4,86 [m, 2Η], 4,45 [m, 1Η], 3,83 [m, 0,5H], 2,79 [m, 0,5H], 3,59 [s, 1,5H], 3,58 [s, 0,5H], 2,57 [m, zasenčen z DMSO], 2,41 [kompleks m, 4Η], 2,20 [m, 2Η], 1,88 [m, 1Η], 1,62 [m, 2Η], 1,43 [m, 2Η], 1,23 [m, 2Η], 1,05 [m, IH]. IR (KBr) 3337, 2931, 1790, 1726, 15384 cm*¹. MS (ES, NH4OH) 489,5 (M⁺ -H). Elementna analiza:

Izrač. za C24H30N2O9: C 58,77; H 6,16; N 5,71.

Ugot. :C 59,19; H 6,40; N 5,34.

110

-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-oktahidro-indol-1 -iloksij-pentanoj ska kislina

Stopnja A

Etil 2-cikloheksanonacetat (4,28 g, 23,3 mmol) in O-benzil hidroksilamin hidroklorid združimo v 100 ml etanola (EtOH) in dodamo 2,59 g (25,6 mmol, 3,55 ml) trietil amina (Et₃N). Reakcijsko zmes mešamo pri sobni temperaturi 12 ur in jo po tem času koncentriramo v vakuumu. Ostanek prevzamemo v EtOAc in speremo z IN HCI (2 x 20 ml), nasičenim NaHCO₃ (1 x 20 ml), posušimo nad Na2SO4, filtriramo in koncentriramo. S čiščenjem s kromatografijo (SiO₂, 90:1 heksani EtOAc) dobimo (2benziloksiimino-cikloheksil)-ocetna kislina etil ester (4,76 g, 72 %) kot zmes oksimskih izomerov.

*H NMR (400 MHz, CDC1₃ 7:1 zmes oksimskih izomerov): a 7,32 [kompleks m, 5Η], 5,05 [s, 0,25 Η], 5,02 [s, 1Η], 4,05 [q, J = 7,2 Hz, 2Η], 3,20 [m, 1Η], 2,73 [kompleks m, 2Η], 2,46 [d, J = 8,0 Hz, 0,125 Η], 2,21 [dd, J = 15,4, 6,3 Hz, 0,875H], 1,92 [m, 1Η], 1,79 [kompleks m, 3Η], 1,43 [m, 1Η], 1,38 [kompleks m, 2Η], 1,22 [t, J = 7,2 Hz, 3H]. IR (tanek film) 2931, 1735, 1638, 1451 cm’¹. MS (CI, NH3) 290 (M⁺ + H). Izrač. za Ci7H₂₃NiO₃: C 70,56; H 8,01; N 4,84.

Ugot.: C 70,47; H 7,92; N 4,78.

Stopnja B (2-benziloksiimino-cikloheksil)-ocetna kislina etil ester (4,66 g, 16,1 mmol) prevzamemo v 15 ml ocetne kisline (AcOH) in NaBH₃CN in mešamo 72 ur. Reakcijsko zmes zlijemo v NaHCO₃ in ekstrahiramo v EtOAc (3x30 ml). Združene organske plasti speremo enkrat s slanico, posušimo nad Na₂SO4, filtriramo in koncentriramo. Bistro olje raztopimo v 50 ml MeOH in dodamo K₂CO₃ (5,55 g, 40,2 mmol) in reakcijsko zmes mešamo 12 ur. Reakcijsko zmes koncentriramo, ostanek prevzamemo v CHC1₃, filtriramo in koncentriramo. S čiščenjem s kromatografijo (SiO₂, 4:1 heksani/EtOAc) dobimo 1,72 g (43 %) cis-(2-benziloksiamino-cikloheksil)ocetna kislina etil estra in 0,441 g (11 %) trans-(2-benziloksiamino-cikloheksil)-ocetna kislina etil estra.

Podatki za cis izomer:

111 ^JH NMR (400 MHz, CDCI3): a 7,44 [kompleks m, 2Η], 7,37 [kompleks m, 3Η], 5,05 [A od AB, J = 10,4 Hz, 1Η], 4,94 [B od AB, J = 10,4 Hz, IH), 3,47 [dd, J = 10,6, 5,3 Hz, 1Η], 2,33 [dd, J = 16,4 Hz, 1Η], 2,20 [m, 1Η], 2,08 [dd, J = 16,4, 4,6 Hz, 1Η], 1,74 [kompleks m, 2Η], 1,60 [m, 1Η], 1,32 [kompleks m, 5Η], IR (raztopina, CHC13) 3031, 2932, 2856, 1717, 1453 cm'¹. MS (CI, NH3) 246 (M⁺ + H).

Podatki za trans izomer: tal.: 79-82 °C.

Elementna analiza:

Izrač. za Ci₅Hi₉NiO₂: C 73,44; H 7,81; N 5,71.

Ugot.: C 73,38; H 7,89; N 5,63.

Stopnja C

Pripravljeno iz cis-(2-benziloksiamino-cikloheksil)-ocetna kislina etil estra na način, opisan zgoraj v stopnji B, da dobimo cis-l-hidroksi-oktahidro-indol-2-on (85 %), tal.: 85-86 °C.

'H NMR (400 MHz, CDC1₃); a 9,86 [br s, IH), 3,75 [dd, J = 10,4, 4,8 Hz, 1Η], 2,41 [dd, J = 16,1, 7,7 Hz, 1Η], 2,33 [m, 1Η], 1,97 [m, 1Η], 1,71 [kompleks m, 2Η], 1,54 [m, 1Η], 1,44 [kompleks m, 2Η], 1,31 [kompleks m, 2Η], IR (KBr) 3037, 2936, 2856, 2710, 1690, 1659, 1548 cm’¹. MS (CI, NH₃) 156 (M⁺ + H).

Elementna analiza:

Izrač. za C₈Hi₃NiO₂: C 61,91; H 8,44; N 9,03.

Ugot.: C 61,94; H 8,49; N 8,96.

Stopnja D

Pripravljeno iz cis-l-hidroksi-oktahidro-indol-2-ona na način, opisan zgoraj v stopnji C, da dobimo 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-oktahidro-indol-liloksi)pentanojska kislina 1,1-dimetiletil ester (41 %). IR (tanek film) 2933, 1723, 1516, 1367 cm’¹.

Elementna analiza:

Izrač. za C₂₅Hi34N₂O₇: C 63,28; H 7,22; N 5,90.

Ugot.: C 63,03; H 7,36; N 5,65.

112

Stopnja E

Pripravljeno iz 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-oktahidro-indol- 1-iloksi)pentanojska kislina 1,1-dimetiletil estra na način, opisan zgoraj v stopnji D, da dobimo 3-benziloksikarbonilamino-4-okso-5-(2-okso-oktahidro-indol-l-iloksi)-pentanojsko kislino (72 %). IR (KBr) 3352 (br), 2935, 2869, 1789, 1704, 1535 cm'¹. MS (APCI, MeOH) 419,5 (M⁺ + H).

Elementna analiza:

Izrač. za C₂iH26N₂O7.0,12 H₂O.0,322 CH₂C1₂:

C 57,17; H 6,05; N 6,26.

Ugot.: C 57,17; H 6,05; N 5,89.

Spodaj navedene spojine pripravimo iz 5-bromo-3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3metil-butirilamino)-propionilamino]-)-4-okso-pentanojska kislina 1,1-dimetil estra [Dolle R.E. et al. (J. Med. Chem. 1994; 37:563-4)] na način, opisan zgoraj v stopnji C in stopnji D.

3“[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-propionilaminol-5-(7-metoksi^^01111126^12220^8020^^11^0411401214)^51)24:^80^621311018^3^1811113

Pripravljeno iz oktahidro-l-hidroksi-2-okso-lH-indol-7-ocetna kislina metil estra (65 %), tal.: 162-167 °C, razpad. Elementna analiza:

Izrač. za C₂₉H34N₄O₉.0,75 H₂O (596,127): C 58,43; H 6,00; N 9,40.

Ugot.: C 58,40; H 5,68; N 9,19.

3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3-metil-butirilamino)-propionilaminol-4-okso-5-f2okso-2,3 -dihidro-indol-1 -iloksri-pentanoj ska kislina

Pripravljeno iz 1-hidroksioksiindola [Kende A.S. in Thurston J. (Svnthetic Communications, 1990; 20:2133-8], da dobimo 3-[2-(2-benziloksikarbonilamino-3metil-butirilamino)-propionilamino]-4-okso-5-(2-okso-2,3-dihidro-indol-l-iloksi)pentanojsko kislino (67 %), tal.: 162-167 °C, razpad.

113

Elementna analiza:

Izrač.: za C29H34N4O9.O75 H₂0 (596,127):

C 58,43; H 6,00; N 9,40.

Ugot.: C 58,40; H 5,68; N 9,19.

Druge spojine pripravimo z uporabo avtomatizirane paralelne sinteze takole:

V 7-ml stekleno fiolo z navojem, ki vsebuje 17 mg (0,3 mmol, 3 ekv.) kalijevega fluorida damo 500 μΐ (0,1 mmol, 1 ekv.) 0,2 M raztopine ustreznega hidroksamata v DMF. Reakcijsko fiolo mešamo nekaj minut in pri tem se kalijev fluorid ne raztopi popolnoma. V tej točki, 500 μΐ (0,1 mmol, 1 ekv.) 0,2 M raztopine (S)-5-bromo-4okso-3-[[(fenilmetoksi)karbonil]amino]-pentanojska kislina 1,1-dimetiletil estra v DMF. Fiole pokrijemo in stojalo s 30 do 40 fiolami postavimo na vrh krožnega mešalnika za 12 ur.

Reakcijske zmesi razredčimo z 2 ml etil acetata, nato pa z 2 ml deionizirane vode. Dva mililitra tekočine odvzamemo iz sredine fiole in hitro injiciramo dvakrat nazaj. Fiole pustimo posedati 30 minut in odvzamemo organsko plast iz zgornje polovice fiole. Še dvakrat dodamo po 2 ml etil acetata, mešamo in ločimo. Združene organske plasti uparjamo pod konstantnim tokom dušika preko noči.

Surovi ostanek iz reakcijskih zmesi raztopimo v 3 do 4 ml 40 % TFA v metilen kloridu. Fiole mešamo, da zagotovimo popolno raztopitev, v digestoriju brez pokrovov. Po 2 urah fiole ponovno postavimo pod konstantni tok dušika preko noči.

Surovo reakcijsko zmes prevzamemo v 1 ml kloroforma (včasih dodamo MeOH zaradi popolne raztopitve). Raztopine nanesemo na 500-pm preparativne silikagelne TLCplošče in nato eluiramo z acetonom (20%) v metilen kloridu z 1 % do 2 % ocetno kislino. Pasove produktov vizualiziramo z UV absorpcijo, postrgamo s plošč in silikagel speremo z metanolom v tarirano fiolo. Fiole damo preko noči pod tok dušika. Stehtane očiščene produkte nato razredčimo na 10 mM v 25 % metanolu v kloroformu

114 in alikvote nanesemo na plošče, tako za analitično analizo kot tudi za biološko ocenjevanje. Raztopine pustimo uparevati v digestoriju 72 ur.

Ekvivalenti

Za strokovnjake bo jasno ali pa bodo sposobni določiti že z uporabo rutinskega eksperimentiranja mnoge ekvivalente za specifične izvedbe izuma, opisanega tukaj. Za te ekvivalente je prav tako namenjeno, da so zajeti v priloženih zahtevkih.

Claims (25)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu, označen s tem, da obsega:

   a) sredstvo, ki antagonizira tarčo, ki regulira proizvajanje interferona-γ (IFN-γ) v subjektu, m

   b) kortikosteroid.
2. 2. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 1, označen s tem, daje sredstvo IL-18 antagonist.
3. 3. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 2, označen s tem, da je sredstvo inhibitor proteaze kaspazne družine, npr. ICE inhibitor.
4. 4. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 2 ali 3, označen s tem, da je sredstvo protitelo, protitelesm fragment ali konstruiran vezavni protein, ki veže IL-18 ali IL-18 receptor.
5. 5. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 1, označen s tem, daje sredstvo interlevkin-12 (IL-12) antagonist.
6. 6. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 5, označen s tem, da je sredstvo protitelo, protitelesni fragment ah konstruiran vezavni protein, ki veže IL-12 ali IL-12 receptor.

   116
7. 7. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 5 ali 6, označen s tem, da sredstvo stimulira proizvajanje ciklične AMP v celicah, ki proizvajajo IL-12.
8. 8. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 7, označen s tem, daje sredstvo fosfodiesterazm IV inhibitor, npr. izbran iz skupme, ki jo sestavljajo 4-arilpirolidinoni, rolipram, denbufilin, tibenelast, mtrakvazon, CP-80633, kmazolindioni in CP-77059.
9. 9. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 7, označen s tem, daje sredstvo beta-2 agonist, npr. izbran iz skupine, ki jo sestavljajo salmeterol, fenoterol in izoproterenol.
10. 10. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 5, označen s tem, daje sredstvo STAT4 inhibitor.
11. 11. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 1, označen s tem, daje sredstvo NK-celični antagonist.
12. 12. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 11, označen s tem, daje sredstvo anti-NK-/NK podobno celično protitelo, npr. protitelo anti-asialo-GMl ali protitelo NK1.1.
13. 13. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po kateremkoli prejšnjem zahtevku, označen s tem, da je kortikosteroid izbran iz skupine, ki jo sestavljajo: kortizon, hidrokortizon, beklometazon, flunizolid, prednizon, prednizolon, metilprednizolon, triamcinolon, deflazakort, betametazon in deksametazon.

    117
14. 14. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po kateremkoli prejšnjem zahtevku, označen s tem, da subjekt trpi zaradi septičnega šoka, Crohnove bolezni, astme, bolezni presadek-proti-gostitelj ali zavračanja transplantatov ali avtoimunske bolezni ali motnje.
15. 15. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po kateremkoli od zahtevkov 1-13, označen s tem, da subjekt trpi zaradi imunoinflamatome bolezni ali motnje, izbrane iz skupine, ki vključuje: astmo, sindrom respiratorne stiske odraslega, sistemski lupus erythematosus, vnetno črevesno bolezen, Crohnovo bolezen, ulcerativni kolitis, multiplo sklerozo, diabetes mellitus, odvisen od inzulina, avtoimunski artritis, revmatoidni artritis, juvenilni revmatoidni artritis, psonatični artritis, vnetni pulmonami sindrom, pemphigus vulgaris, idiopathic thrombocytopenic purpura, avtoimunski meningitis, myasthenia gravis, avtoimunski thyroiditis, dermatitis, atopični dermatitis, eczematous dermatitis, psoriasis, Sjogrensov sindrom, keratoconjunctivitis sicca, sekundarno po Sjogrensovem sindromu, alopecia areata, alergične odzive zaradi reakcij na artropodne pike, aphthous ulcer, iritis, conjunctivitis, keratoconjunctivitis, cutaneous lupus erythematosus, scleroderma, vagimtis, proctitis, erupcije zdravil, Stevens-Johnsonov sindrom, leprozne reverzne reakcije, erythema nodosum leprosum, avtoimunski uveitis, alergični encefalomielitis, aplastično anemijo, čisto anemijo rdečih celic, idiopathic thrombocytopenia, polychondritis, Wegenerjev granulomatosis, kronični aktivni hepatitis, Gravesovo oftalmopatijo, primarni biliary cirrhosis, posteriomi uveitis in intersticialno fibrozo pljuč.
16. 16. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po kateremkoli od zahtevkov 1-13, označen s tem, da subjekt trpi zaradi akutne ali kronične vnetne motnje.
17. 17. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po kateremkoli od zahtevkov l do 13, označen

    118 s tem, daje steroidna odpornost v subjektu obrnjena ali povečana, v primerjavi s tem, ko damo subjektu samo kortikosteroid.
18. 18. Kombiniran pripravek za simultano, ločeno ali zaporedno uporabo pri moduliranju odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po kateremkoli od zahtevkov 1 do 13, označen s tem, da damo subjektu kortikosteroid v skladu s programom, ki znižuje dozo kortikosteroida v časovni periodi, metoda pa ameliorira steroidni vindikatomi učinek, povezan z dajanjem znižanih doz kortikosteroida.
19. 19. Sredstvo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroid v subjektu, označeno s tem, da sredstvo antagomzira tarčo, ki regulira proizvajanje interferona-γ (IFN-γ) v subjektu.
20. 20. Sredstvo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 19, označeno s tem, daje

    a) subjekt odporen na kortikosteroid pred dajanjem sredstva

    b) da se subjekt odziva na kortikosteroid pred dajanjem sredstva, vendar kaže povečano občutljivost za kortikosteroid po dajanju sredstva, ali je

    c) zdravljenje subjekta s kortikosteroidom potrebno ustaviti in dajanje sredstva ameliorira steroidni vindikatomi učink v subjektu.
21. 21. Sredstvo za moduliranje odzivnosti na kortikosteroid v subjektu po zahtevku 19, označeno s tem, daje sredstvo IL-18 antagonist ali interlevkin-12 (IL-12) antagonist.
22. 22. Farmacevtski sestavek, označen s tem, da obsega sredstvo, kot je opisano v kateremkoli od zahtevkov 1 do 12 ali 19 do 21, kortikosteroid in farmacevtsko sprejemljiv nosilec.

    119
23. 23. Farmacevtski sestavek po zahtevku 22, označen s tem, daje formuliran za lokalno dajanje ali za dajanje z inhalacijo.
24. 24. Uporaba sredstva, kot je opisano v kateremkoli od zahtevkov 1 do 12 ali 19 do 21 (po izbiri, kadar je kombinirano s kortikosteroidom), pri izdelavi zdravila za moduliranje odzivnosti na kortikosteroid v subjektu.
25. 25. Uporaba sredstva, kot je opisano v kateremkoli od zahtevkov 1 do 12 ali 19 do 21 (po izbiri, kadar je kombinirano s kortikosteroidom), pri izdelavi zdravila za zdravljenje ene ali več motenj, opisanih v kateremkoli od zahtevov 14 do 16.