ES2251248T3 - Uso de anticuerpos contra il-12 para tratar la psoriasis. - Google Patents

Abstract

Uso de un anticuerpo anti-interleuquina-12 para preparar una formulación farmacéutica para tratar la psoriasis. En la presente invención, se usan agentes que bloquean los efectos de la linfoquina interleuquina 12 (IL-12) para tratar a un paciente con psoriasis. El agente es un anticuerpo, especialmente un anticuerpo monoclonal, que se une a IL-12. El anticuerpo monoclonal puede derivar de cualquier especie conveniente, por ejemplo, ratón, rata, hámster, etc., por procedimientos bien conocidos en la técnica. Preferiblemente, el anticuerpo será quimérico o humanizado, es decir, formado por la unión de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano con una región estructural esencialmente humana y una región constante por técnicas de ADN recombinante. De forma alternativa, el anticuerpo puede ser humano, como se hace, por ejemplo, por la tecnología de trioma o a partir de animales transgénicos o por procedimientos de despliegue en bacteriófagos.

Description

Uso de anticuerpos contra IL-12 para tratar la psoriasis.

Introducción Campo técnico

La invención se refiere a un tratamiento de la psoriasis que comprende la administración de anticuerpos.

Antecedentes

La psoriasis es una enfermedad crónica de la piel, caracterizada por descamación e inflamación. La psoriasis afecta del 1,5 al 2 por ciento de la población de los Estados Unidos, o casi a 5 millones de personas. Se da en todos los grupos de edades y más o menos por igual en hombres y mujeres. Las personas con psoriasis sufren molestias, movimiento reducido de las articulaciones y angustia emocional. Cuando se desarrolla la psoriasis, zonas de la piel se vuelven más gruesas, se enrojecen y se recubren de escamas plateadas, denominadas placas. La psoriasis aparece más frecuentemente en los codos, rodillas, cuero cabelludo, parte baja de la espalda, cara, palmas de las manos y plantas de los pies. La enfermedad también puede afectar a las uñas de los dedos de la mano y del pie y a los tejidos blandos de la boca y los genitales. Aproximadamente el 10 por ciento de las personas con psoriasis tienen inflamación en las articulaciones que producen síntomas de artritis.

Cuando la piel está dañada, se desencadena un programa de cicatrización de la herida, también conocido como maduración regenerativa. La psoriasis lesiva se caracteriza por el crecimiento celular en este programa de crecimiento alternativo. En muchos sentidos, la piel psoriásica es similar a la piel calentada de una herida o a la que reacciona a un estímulo, tal como infección, donde los queratinocitos cambian del programa de crecimiento normal al de maduración regenerativa. Se forman células que son empujadas hacia la superficie en sólo 2-4 días y la piel no puede eliminar las células suficientemente rápido. Las excesivas células de la piel se levantan y forman lesiones escamosas elevadas. La descamación blanca (denominada "placa"), que normalmente recubre la lesión está compuesta de células muertas de la piel y el enrojecimiento de la lesión está causado por un aumento del suministro de sangre en el área de las células de la piel que se dividen rápidamente.

La causa exacta de la psoriaris en humanos es desconocida, aunque generalmente se acepta que tiene un componente genético y un estudio reciente ha establecido que ésta tiene un componente autoinmune. Se plantea la hipótesis de que en realidad, el que una persona desarrolle psoriasis depende de que aparezca algún "desencadenante". Ejemplos de "factores desencadenante" potenciales incluyen infecciones sistémicas, lesiones de la piel (el fenómeno de Koebner), vacunaciones, ciertas medicaciones e inyecciones intramusculares o medicaciones de esteroides orales.

La inflamación crónica de la piel de la psoriasis se asocia con queratinocitos epidérmicos hiperplásicos y células mononucleares infiltrantes, incluyendo células T CD4+ de memoria, neutrófilos y macrófagos. Debido a este cuadro inflamatorio sumamente mezclado y las complejas interrelaciones resultantes entre estas células diferentes, ha sido muy difícil analizar en profundidad los mecanismos que enmarcan la inducción y progresión de la enfermedad.

Bibliografía relevante

Gottlieb y col. (1995) Nat. Med. 1:442-7 trataron pacientes con fragmentos de toxina diftérica unida a interleuquina-2 humana (DAB389IL-2), que selectivamente se dirige a células T activadas pero no a queratinocitos. Mostraron mejora clínica significativa, lo que indica que las células T y no los queratinocitos son el componente patogénico principal en la enfermedad.

El documento WO 98/41232 describe el uso de anticuerpos anti-IL-12 para modular la capacidad de respuesta a corticoesteroides para prevenir complicaciones asociadas con el uso de esteroides.

El documento WO 98/16248 describe el uso de anticuerpos anti-IL-12 para potenciar la tolerancia oral a antígenos. Ambas referencias describen el uso de anticuerpos anti-IL-12 en terapias de combinación como moduladores de la acción del agente terapéutico respectivo, es decir, corticosteroide o un antígeno.

Resumen de la invención

La invención se refiere al uso de un anticuerpo anti-interleuquina-12 para preparar una formulación farmacéutica para tratar la psoriasis. En un aspecto en particular de la invención dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una gráfica que muestra los resultados de tratar ratones psoriásicos con anticuerpo contra IL-12. Cada grupo de barras se corresponde con un experimento. La valoración histológica media representada para cada barra está impresa sobre ella. a-IL-12 significa anti-IL-12.

La figura 2 es una gráfica que muestra la gravedad de la enfermedad de la semana 14 a la 18, según la medida del grosor medio de la oreja de ratones psoriásicos tratados con anticuerpo anti-IL-12 comparado con ratones tratados con un anticuerpo control del mismo isotipo (isotipo).

Descripción de las realizaciones específicas TABLA 1

Terapia	Comentarios
Antibióticos, antimicrobianos	\begin{minipage}[t]{80mm}Las infecciones pueden empeorar (brote) la psoriasis \end{minipage}
Ciclosporina	\begin{minipage}[t]{80mm}Suprime el sistema inmune del organismo; no se recomienda el uso durante más de un año \end{minipage}
Metotrexate	\begin{minipage}[t]{80mm}Efectivo en psoriasis y artritis psoriásica; la dosis acumulada durante la vida de 4,5 gramos se ha asociado con un riesgo de hasta el 25% de fibrosis/cirrosis hepática \end{minipage}
Hidroxiurea, AINES, Sulfasalazina, 6-tioguanina
Retinoides - acitretina, etretinato, isotretinoina	\begin{minipage}[t]{80mm}El etretinato, indicado para la psoriasis, ha sido sustituido por la acitretina. \end{minipage}
Luz ultravioleta
Hospitalización, tratamiento ambulatorio de día	\begin{minipage}[t]{80mm}Para psoriasis grave: terapia administrada de cuidado intensivo de UV durante el día y prescripciones tópicas durante 30 días o más. \end{minipage}
Fototerapia (UVB)	\begin{minipage}[t]{80mm}Mínimo 20-40 tratamientos para el cuidado de la psoriasis; los tratamientos adicionales pueden prolongar el aclaramiento \end{minipage}
Fotoquimioterapia (PUVA)	\begin{minipage}[t]{80mm}Combina la ingestión, impregnación o aplicación con medicación de psoralen antes de la exposición a la luz UVA. Mínimo 20 tratamientos para producir aclaramiento sustancial; adicional para prolongar el aclaración \end{minipage}
Fototerapia a domicilio (UVB)	\begin{minipage}[t]{80mm}Equipo médico duradero para uso en domicilio para prolongar el aclaramiento en pacientes seleccionados por los médicos \end{minipage}
Terapia tópica e intralesional
Antralina	\begin{minipage}[t]{80mm}Mezclado en diversas concentraciones, puede combinarse con la exposición a UV \end{minipage}
Calcipotrieno	\begin{minipage}[t]{80mm}La vitamina D tópica es la primera de esta clase aprobada para la psoriasis \end{minipage}
Alquitrán de hulla	\begin{minipage}[t]{80mm}Combinado en diversas concentraciones, puede combinarse con exposición a UV \end{minipage}
Corticosteroides - baja concentración	Aplicado en la piel
Corticosteroides - de moderado a elevada	\begin{minipage}[t]{80mm}A diversas potencias, aplicados en la piel, inyectados en las lesiones o tomados por vía oral \end{minipage}
Emolientes	Conservan la flexibilidad de la piel
Queratolíticos - ácido salicílico	\begin{minipage}[t]{80mm}Mezclado en diversas concentraciones, usado con alquitrán o emolientes \end{minipage}
Tazaroteno	\begin{minipage}[t]{80mm}Primer derivado tópico de la vitamina A aprobado para el tratamiento de la psoriasis \end{minipage}

Terapia con anticuerpos que neutraliza IL-12

En la presente invención, se usan agentes que bloquean los efectos de la linfoquina interleuquina 12 (IL-12) para tratar a un paciente con psoriasis. El agente es un anticuerpo, especialmente un anticuerpo monoclonal, que se une a
IL-12. El anticuerpo monoclonal puede derivar de cualquier especie conveniente, por ejemplo, ratón, rata, hámster, etc., por procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, en general, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, 1988). Preferiblemente, el anticuerpo será quimérico (véase, por ejemplo, Cabilly y col., patente de EE.UU. Nº 4.816.567) o humanizado, es decir, formado por la unión de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano con una región estructural esencialmente humana y una región constante por técnicas de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Queen y col., Patente de EE.UU. Nº 5.585.089). De forma alternativa, el anticuerpo puede ser humano, como se hace, por ejemplo, por la tecnología de trioma (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.634.664) o a partir de animales transgénicos (véase, por ejemplo, el documento WO 93/12227 de Lonberg y col. y el documento WO 91/10741 de Kucherlapati) o por procedimientos de despliegue en bacteriófagos (véase, por ejemplo, el documento WO 91/17271 de Dower y col., el documento WO 92/01047 de McCafferty y col., y el documento WO 92/20791 de Winter).

Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal tendrá una afinidad de unión (constante de asociación) por su antígeno de al menos 10^{8} M^{-1} o más preferiblemente 10^{9} M^{-1} o superior. Más preferiblemente, el anticuerpo neutralizará a la IL-12 bloqueando una o más de sus funciones biológicas, por ejemplo la capacidad para unirse a su receptor celular. Ejemplos de otras funciones que pueden ser bloqueadas por un anticuerpo neutralizante aparecen para IFN-\gamma en la patente provisional de EE.UU. de cesión común con la presente Nº 60/110.523 y para IL-12 en la patente de EE.UU. Nº 5.780.597 de Gately y col. y en el documento WO 99/37682 de Gately y col., por ejemplo, bloqueando la función de IL-12 inducida por IFN-\gamma. Preferiblemente, una concentración de 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5 ó 10 \mug/ml del anticuerpo bloquearán el 25%, 50%, 90%, 95%, 99% o esencialmente el 100% de la función de la linfoquina respectiva, especialmente cuando la linfoquina también se usa en una de estas concentraciones o en una concentración molar de 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5 ó 1,0 de la concentración del anticuerpo. Ejemplos de anticuerpos neutralizantes de IL-12 son 5F2, 16F2, 16G2 y 20E11 (como se describe en el documento WO 99/37682 de Gately y col.) y sus formas quiméricas y humanizadas. Otros anticuerpos preferidos tienen los mismos epítopes o epítopes que se solapan como los anticuerpos mencionados anteriormente, de modo que compiten (bloqueo cruzado) con estos por la unión al antígeno o en los que se muestra por mutagénesis in vitro que algunos de los mismos aminoácidos del antígeno contribuyen a la unión. Los anticuerpos anti-IL-12 especialmente preferidos se unirán al heterodímero de IL-12 p75, pero no a las subunidades individuales tales como p40.

De forma alternativa, en lugar de un anticuerpo, por tecnología recombinante puede unirse una porción extracelular de un receptor celular (o su subunidad de unión) para IL-12 con la región Fc de una inmunoglobulina humana (por ejemplo, IgG_{1}) para mejorar su semivida u otras propiedades. Véase, por ejemplo, Ashkenazi y col. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-9 y Moosmayer y col. (1995). J. Interferon Cytokine Res. 15:1111-5, para los procedimientos de construcción de estas proteínas de fusión ("inmunoadhesinas"). Los receptores para IL-12 e IFN-\gamma se describen respectivamente en Chua y col. (1994) J. Immunol. 153:128-36, Presky y col. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14002-7 y Aguet y col. (1988), Cell 55:273-80. La proteína de fusión se unirá a IL-12 o IFN-\gamma, respectivamente, los neutraliza y tendrá propiedades similares a un anticuerpo y puede, por tanto, usarse para el tratamiento de la psoriasis. En adelante, se entenderá que el término "anticuerpo" también abarca a proteínas de fusión de
este tipo.

Para la administración a pacientes, el fármaco anticuerpo (o proteína de fusión) típicamente se formulará en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Pueden usarse una diversidad de vehículos adecuados, por ejemplo, agua para inyección (API) o agua tamponada con fosfato, citrato, acetato, etc., a un pH típicamente de 5,0 a 8,0, más a menudo de 6,0 a 7,0 y/o que contenga sales tales como cloruro sódico, cloruro potásico, etc., para hacerla isotónica. El vehículo también puede contener excipientes tales como albúmina de suero humano, polisorbato 80, azúcares o aminoácidos tales como arginina, histidina o glicina para proteger a la proteína activa. La concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente de aproximadamente 0,01 a 100 mg/ml pero más a menudo estará en el intervalo de 1 a 10 mg/ml. El anticuerpo formulado es especialmente adecuado para la administración parenteral y puede administrarse como una infusión intravenosa o por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa y también puede administrarse por inyección en el lugar de la enfermedad, por ejemplo en las lesiones pso-
riásicas.

Las dosis del fármaco típicamente contendrán de 0,01 a 100 mg de anticuerpo (o proteína de fusión) pero más a menudo de 0,1 a 1, ó 1, 2 ó de 5 a 10 mg por kilogramo de peso corporal o como una unidad de dosis, en una cantidad suficiente para mejorar la enfermedad sin causar efectos secundarios inaceptables ("dosis terapéutica eficaz"). El fármaco anticuerpo puede administrarse una o múltiples veces, por ejemplo, 1, 2 ó 3 veces al día, semana o mes de uno a varios días, semanas, meses o años o de forma crónica, dependiendo de la naturaleza y gravedad de la enfermedad. A menudo el anticuerpo se administrará después o en combinación con uno o más fármacos inmunodepresores u otras terapias, por ejemplo, corticosteroides, ciclosporina, metotrexate, fototerapia (con o sin PUVA) u otros enumerados anteriormente en la Tabla 1. El anticuerpo anti-IL-12 también puede usarse junto o en combinación con otros anticuerpos, por ejemplo, para moléculas de adhesión o linfoquinas tales como CD11a, ligando CD40, IL-8 o sus receptores (por ejemplo, receptor de IL-2).

La gravedad de la psoriaris se mide por el Índice de Gravedad y Área afectada de Psoriasis (PASI) (véase, por ejemplo Fleischer y col. (1999) J. Dermatol. 26:210-215 y Tanew y col. (1999) Arch Dermatol. 135:519-524) o diversos valores de evaluación global de psoriasis tales como la Valoración Global por parte del médico (PGA), que son bien conocidos por los expertos en la materia de los ensayos clínicos de psoriasis. El tratamiento con el anticuerpo (por ejemplo, humanizado o humano) para IL-12 reducirá el PASI (o los valores de evaluación global) en al menos el 25% ó 40% pero preferiblemente el 50% o incluso el 60% ó 70% o más en al menos el 50%, pero preferiblemente el 60-70% ó 75% o más de los pacientes tratados. De forma alternativa, este tratamiento causará una reducción mayor en un grupo más pequeño de pacientes, es decir, al menos el 75%, pero preferiblemente el 80-90% o más o incluso fundamentalmente el aclaramiento completo, en al menos el 20% a 25%, pero preferiblemente el 30% a 40% o incluso el 50% o más de los pacientes. Típicamente, esta reducción terminará al menos a los 2 meses, pero preferiblemente a los 3 meses o más o incluso a los 4 a 6 meses o más, pero más preferiblemente un año o más mientras se continúa el tratamiento con el anticuerpo o después de que éste se interrumpa. Típicamente, en un ensayo clínico (por ejemplo, un ensayo de fase II o de fase III), la mejora del PASI o en el valor de los pacientes tratados con el anticuerpo
anti-IL-12, en relación con el grupo control de pacientes que no reciben tratamiento, que reciben placebo u otro agente, serán estadísticamente significativos a nivel, por ejemplo, de p = 0,05 ó 0,01 o incluso 0,001.

De forma alternativa, el anticuerpo para IL-12 puede administrarse después de que se haya inducido ya una remisión con otro fármaco por ejemplo, corticosteroides, ciclosporina, metotrexate, fototerapia (con o sin PUVA) u otros enumerados anteriormente en la Tabla 1. En este caso, el tratamiento con el anticuerpo aumentará el tiempo medio de recidiva (por ejemplo, 50% de empeoramiento del PASI) en al menos el 40% pero preferiblemente el 50% y más preferiblemente el 60-70% o más, o incluso el 100% (doblando) o más. Típicamente, en un ensayo clínico (por ejemplo, un ensayo de fase II o fase III), este aumento del tiempo de recidiva en los pacientes tratados con el anti-IL-12 en relación con el grupo control de pacientes que no reciben tratamiento, que reciben placebo u otro agente, será estadísticamente significativo a nivel, por ejemplo de p = 0,05 ó 0,01 o incluso 0,001.

Se entenderá que esta invención no está limitada a la metodología en particular, protocolos, líneas celulares, especies animales o géneros, construcciones y reactivos descritos, de modo que pueden variar. También se entenderá que la terminología usada en este documento tiene la finalidad sólo de describir realizaciones en particular, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, el cual se determinará por lo expresado en las reivindicaciones.

Ha de apreciarse que, según se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas individuales "un", "y" y "el" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto no dicte claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo la referencia a "un ratón" incluye una variedad de estos ratones o la referencia a "la citoquina" incluye referencias a una o más citoquinas y equivalentes de éstas conocidas por los expertos en la técnica, y así en adelante.

Siempre que no se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el entendido normalmente por los expertos en la materia en la que se incluye esta invención. Aunque pueden usarse cualesquiera procedimientos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la invención, ahora se describen los procedimientos, dispositivos y materiales preferidos.

Las publicaciones descritas anteriormente y a lo largo del texto se proporcionan únicamente para su descripción previa a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como que los inventores admiten no estar autorizados a antedatar esta descripción en virtud de una invención previa.

Los ejemplos siguientes se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una completa divulgación y descripción de cómo hacer y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance que se contempla en la invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud de los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, concentraciones, etc.) pero pueden tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones típicas experimentales. Si no se indica lo contrario, partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular medio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o está próxima a ésta.

Resultados experimentales Ejemplo 1 Materiales y procedimientos

Ratones. Los ratones hembras BALB/cj y machos BALB/cj-IFN\gammal^{-/-} (ratones donantes) se obtuvieron de Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Los ratones scid/scid C.B-17/lcr y scid/beige C.B-17 dobles mutantes (ratones receptores) se obtuvieron de Taconic (Germantown, NY). Todos los ratones se mantuvieron en un ambiente sin patógenos específicos en las instalaciones del animalario de Protein Design Labs y se utilizaron entre las 4-12 semanas de edad. Se usaron ratones centinela para analizar los siguientes patógenos: MHV, sendai, PVM, REO3, TMEV GDVIII, M. pulmonis y parvovirus. También se realizó un análisis aleatorio de la presencia de lombriz intestina en los ratones. En ningún momento se detectó ninguno de los patógenos enumerados anteriormente. Se mantuvieron de 2 a 5 ratones por microaislador. Todos los ratones scid/scid o scid/beige se manejaron con guantes en una campana de clase II, se alimentaron con comida y agua estériles ad libitum y se mantuvieron en una cabina de flujo laminar (Bioclean Maywood, NJ) en microaisladores estériles que se cambiaban cada semana. Los ratones donantes se mantuvieron en jaulas convencionales que se cambiaban cada semana.

Purificación celular e inyección en ratones scid/scid. Se recogieron los bazos de ratones donantes de 6-12 semanas (BALB-cj o IFN\gamma^{-/-}BALB/cj) y se aislaron los esplenocitos por homogeneización mecánica de los bazos enteros. Se seleccionaron las células T CD4+ por selección positiva. Brevemente, se incubó una suspensión celular de los esplenocitos mezclados de 4-5 ratones donantes con perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo anti-CD4 (L3T4) (DYNABEADS: Nº de catálogo 114.05, Dynal, Lake Success, NY) durante 20-30 minutos a 4ºC y se separaron por selección ceU magnética con un Concentrador de Partículas Magnéticas Dynal (MPC). Las células se retiraron de los complejos célula-perla con DETACHaBEAD de Dynal y se aislaron de las perlas usando un MPC de Dynal. La población enriquecida en CD4+ resultante tenía una pureza >90%. Después, la suspensión celular (10 x 10^{6} células/ml) se incubó con Fc bloqueante (anti-CD32, PharMingen, 012412A) (10 \mug/ml)y se marcó con anti-CD4-FITC (PharMingen, 9004D) y anti-CD45RB-PE (PharMingen, 01145A) (ambos a 10 \mug/ml), durante 30 minutos a 4ºC, se lavó y se seleccionó usando un clasificador de células FACSTAR (Becton Dickinson, San José, CA). Se recogieron las células doblemente positivas (CD4^{+}/CD45Rb^{+}) seleccionando las células que expresaban niveles elevados de CD45Rb (más del 45% de brillo). La población celular recogida tenía una pureza y viabilidad >90%. Después, las células se lavaron en solución salina fría tamponada con potasio (PBS Sigma D8662) y se resuspendieron en PBS a 1,5 x 10^{6} células/ml. Ratones C.B-17/lcr scid/scid, de 4-8 semanas, se inyectaron por vía intravenosa con 3 x 10^{5} células cada uno, en un volumen total de 200 \mul en la vena de la cola.

Inducción y tratamiento de las lesiones psoriasiformes en ratones scid . Para estudiar el efecto de los productos microbianos y de la IL-12, los ratones receptores se trataron como sigue: Un grupo control recibió células seleccionadas CD4^{+}CD45Rb^{hi} sin tratamiento adicional. Un segundo grupo recibió 20 \mug de lipopolisacárido (LPS) de Salmonella enteritidis (Sigma L-2012) vía i.p. por ratón el día 1 tras la transferencia celular. Un tercer grupo recibió sólo 10 ng de IL-12 (Pharmingen, CA) por ratón suministrado vía i.p. los días 1 y 3. El grupo final se inyectó vía i.p. con una combinación de LPS y de IL-12. Los estudios de dosificación se realizaron usando dosis de 2, 10 y 100 ng de IL-12 junto con 20 \mug de LPS. La inyección de LPS e IL-12 se dio el día 1 tras la transferencia de células y se administró una dosis adicional de IL-12 el día 3. En estudios adicionales, se administraron LPS (20 \mug) e IL-12 (10 ng) una vez a la semana durante 3 semanas. Algunos grupos experimentales recibieron 10 \mug de proteína enterotoxina B estafilocócica de Staphylococcus aureus (Nº de catálogo de Sigma S4881), vía i.p. por ratón una vez el día 1 tras la transferencia de células T.

Para estudiar el papel del IFN\gamma, se aislaron células T de ratones BALB/c-IFN\gamma (Jackson Labs) por los mismos procedimientos descritos anteriormente. También se inyectaron ratones scid/scid receptores conjuntamente con 20 \mug de LPS y 10 ng de IL-2 el día 1 y 10 ng de IL-12 el día 3. Además, en algunos experimentos se usaron ratones scid/beige (Taconic), que son deficientes en células T, B y NK, como ratones receptores de células T IFN\gamma^{-/-}. Para los estudios intervencionales, a cada ratón se le dio 0,5 mg de anti-IL-12 vía i.p. (donante C17.8, PharMingen, San Diego, CA) los días 7 y 35. Los ratones control recibieron PBS o IgG de rata (Sigma) el mismo día.

Evaluación clínica. Los ratones fueron evaluados por tres investigadores diferentes a intervalos semanales comenzando la semana 4 y terminando la semana 10. Para registrar la progresión de la enfermedad se dieron valores clínicos semicuantitativos del 0 al 4 en función del aspecto físico y al grosor de la oreja. 0 = no hay síntomas en la piel o en la oreja; 1 = eritema de leve a moderado en las orejas o en párpados con engrosamiento moderado de la oreja, (< 2% de la superficie corporal) 2 = eritema de moderado a grave en una localización (principalmente oreja y cara) (2-10% de la superficie corporal), descamación leve; 3 = eritema grave en dos o más sitios (oreja, cara, tronco) (>10% de la superficie corporal), descamación grave; 4 = muy grave, eritema extensivo a todo el cuero (>20% de la superficie corporal) con descamación grave. Las observaciones específicas se anotaron en base a la condición del pelaje, manifestaciones en las orejas, apariencia de los párpados, presencia de inflamación en los miembros y en la cola. El grosor de la oreja se determinó usando un micrómetro de resorte modificado (Oditest; Dyer, Inc.). Se tomaron medidas de la misma parte de la oreja tanto de la oreja derecha como de la izquierda para todos los intervalos de tiempo. Se permitió que el micrómetro estuviera colocado para evitar que el edema del tejido afectase a la medición
final.

Análisis histopatológico e inmunohistológico de muestras de tejido cutáneo. Se realizaron necropsias en los ratones a las semanas 10-12 tras la transferencia de células. Se recogieron muestras de tejido de la oreja, párpado y cola, se fijaron en solución de paraformaldehído y se enviaron a Comparative Bioscience (Sunnyvale, CA) para la preparación y análisis de cortes. Para registrar la gravedad de la enfermedad, se dieron valores histológicos semicuantitativos del 0 al 4 en base a la gravedad de la inflamación. La evaluación inicial histológica fue realizada por un patólogo independiente externo. En estudios posteriores la evaluación se realizó a ciegas por tres investigadores diferentes. Los ratones que tenían un grosor en la oreja de 25 \mum o menos sin signos clínicos adicionales recibieron automáticamente un valor histológico de cero sin análisis de los cortes. 0 = sin signos de inflamación; 1 = áreas de inflamación muy pequeñas, acantosis leve; 2 = bajo nivel de infiltración de células mononucleares, leve engrosamiento de la epidermis, acantosis de leve a moderada; 3 = alto nivel de infiltración de célula mononucleares, alta densidad vascular, engrosamiento de la epidermis (acantosis, papilas epiteliales e hiperplasia de la epidermis y queratinocitos, microabscesos, adelgazamiento de la capa celular granular); 4 = infiltración muy amplia en epidermis y dermis, densidad vascular muy alta, engrosamiento extremo de la epidermis, formación de pústulas y destrucción de las capas celulares
granulares.

Se recogieron muestras de tejidos, se incluyeron en compuesto Tissue Tek OCT y se congelaron con hielo seco para realizar cortes en criostato. Se fijaron los cortes de tejido (5 \mum) en acetona al 100% y se tiñeron con AcM anti-IL-12 (p40/70) conjugado con PE (Pharmingen, clon C17.8). Los tejidos se evaluaron como positivos o negativos en base a la detección microscópica de la fluorescencia visual.

Aislamiento de células linfocíticas infiltradas en la piel. Los linfocitos infiltrados en la piel (SIL) se aislaron por medio de digestión enzimática. Brevemente, se trocearon piel, orejas y párpados con unas tijeras esterilizadas y los trozos se lavaron con HBSS en un tamiz de nailon para células de 100 mm (Falcon) para eliminar los restos superficiales. Las células infiltradas se liberaron incubando los trozos cortados en 25 ml de medio HBSS calentado (37ºC) sin Ca/Mg (BioWhittaker, Walkersville, MD 10-543F) suplementado con tampón HEPES 25 mM (BioWhittaker 17-737E) y FCS al 10% (HyClone Labs Inc., Logan, UT SH30071.03) durante 20 min a 37ºC. Los fragmentos restantes se lavaron sobre una maya de nailon, se resuspendieron en medio RPMI 1640 (BioWhittaker 12-702F) con tampón HPES 25 mM, FCS al 10%, ADNasa a 400 U/ml (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN 104159), colagenasa a 400 U/ml (Boehringer Mannheim 1088874) y se incubaron durante 90 minutos a 37ºC en un agitador de balanceo. La suspensión celular resultante se filtró secuencialmente a través de filtros de malla de nailon de 100 \mum y 40 \mum y después se lavó dos veces con RPMI 1640 suplementado con HEPES 25 mM y
FCS al 10%.

Estimulación in vitro de SIL y detección de citoquinas. Se resuspendieron los SIL a 10^{6}/ml en medio RPMI 1640 completo suplementado con FBS al 10% (HyClone), 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M (Sigma), glutamina 2 mM (Life Technologies), penicilina a 10 U/ml/100 \mug de estreptomicina (Life Technologies) y HEPES 15 mM. Las células T CD4^{+} seleccionadas se resuspendieron a 2,5 x 10^{5}/ml. Después, se pusieron 200 \mul de esta suspensión en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Falcon 3072) y se incubaron durante 48 horas con \alphaCD3 (PDL, clon 145-2C11) y \alphaCD28 (PharMingen), cada uno a 1 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes de pocillos de tres cultivos diferentes y se ensayó la presencia de IFN\gamma e IL-4 por ELISA. El procedimiento de ELISA suponía recubrir una placas de Immulon 4 de 96 pocillos de fondo plano (Dynatech Labs, Inc 011-010-3850) durante una noche a 4ºC con 50 \mul de una solución de anticuerpo anti-IFN\gamma, anti-TNF\alpha o anti-IL-4 a 2 \mug/ml (todos de Pharmingen) en tampón carbonato. Después, las placas se lavaron con PBS/Tween (Tween 20 al 0,05% en PBS) y se bloquearon con 200 \mul de una solución estéril de PBS con BSA al 3% (albúmina bovina de Sigma A7030) durante 1 hora a 37ºC. Entre cada una de las etapas siguientes, las placas se lavaron con PBS/Tween. A continuación se añadieron a los pocillos patrones de IFN\gamma, IL-4 y TNF\alpha así como muestras de los sobrenadantes y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Después, se añadieron a las respectivas placas los anticuerpos secundarios para anti-IFN\gamma, anti-TNF\alpha y anti-IL-4 (todos los anticuerpos de Pharmingen) conjugados con biotina, a 2 \mug/ml en solución BSA al 3%/PBS y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. A continuación se añadió estreptavidina marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch Labs 016-030-084) a una concentración de 1 \mug/ml. Después se usó O-Fenilendiamina (Sigma 4664) como tampón sustrato del protocolo del fabricante. Después, el ensayo se leyó en un Dispositivo Molecular (Sunnyvale, CA) para lectura de placas y los datos se analizaron usando el software SOFTmax^{TM}.

Resultados

El tratamiento de ratones scid/scid reestablecidos con células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} con LPS más dosis baja y media de IL-12 da lugar a una incidencia y gravedad de la psoriasis aumentadas; altas dosis de IL-12 previenen la inducción de la enfermedad. Estudios previos habían demostrado que los ratones scid/scid reconstituidos con células T de Balb/c CD4^{+}/CD45Rb^{hi} con pequeñas diferencias de haplotipo, a veces desarrollan inflamación cutánea crónica que se asemeja a la psoriaris humana. En experimentos iniciales, se encontró que cuando las células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de BALB/c se transferían a ratones scid/scid C.B-17, sólo algunos animales mostraban lesiones psoriasiformes y la expresión de la enfermedad era más bien leve. Este hallazgo estaba de acuerdo con observaciones previas hechas por Schon y col. (1997), supra. Puesto que se ha demostrado que los mitógenos bacterianos o superantígenos bacterianos son potentes moduladores de las respuestas inmunes mediadas por células y se ha demostrado que la IL-12 tiene un papel importante en la inducción de diversas afecciones autoinmunes, inicialmente se ensayó si la administración conjunta de estos agentes podría afectar a la inducción de psoriasis en el modelo de transferencia a scid/scid. Como se muestra en la Tabla 2, cuando los ratones scid/scid C.B-17 se reconstituyen sólo con células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi}de BALB/c, solo el 38% de los ratones desarrollan lesiones de piel psoriasiformes y sólo el 27% de los ratones desarrollan formas graves de la enfermedad. Cuando sólo se administran conjuntamente LPS, observamos un aumento ligero en la incidencia de la enfermedad (50%), pero la gravedad de las lesiones permanecía similar a las lesiones en ratones que sólo habían recibido células. De forma similar, la administración conjunta de solamente una dosis de medio
(10 ng/ratón) de IL-12 los días 1 ó 3 tras la transferencia de células T lleva a un incremento aparente en la incidencia de la enfermedad (67%) sin que se vea afectada la gravedad de la enfermedad.

TABLA 2

\begin{minipage}[t]{160mm} La administración in vivo de IL-12 en combinación con LPS tras la transferencia de células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} lleva a un aumento significativo en la expresión de la enfermedad \end{minipage}
Tratamiento tras la	Incidencia de la	Valoración media^{3}	Histología	Gravedad de la
transferencia de células^{1}	enfermedad^{2}			enfermedad^{4}
PBS	10/28(38%)	1,1\pm1,4		7/26(27%)
IL-12 media	2/3 (87%)	0,75\pm1		0/3(0%)
LPS	2/4 (50%)	0,6\pm0,7		0/4(0%)
LPS + IL-2 baja	6/11 (55%)	1,9 \pm 1,0		4/11(36%)
LPS + IL-2 media	24/33 (73%)	2,25\pm1,1		14/33(42%)
LPS + IL-12 alta	0/4 (0%)	0,0		0/4(0%)
LPS + IL-12 media^{5}	8/10(80%)	2,5\pm1		5/10(50%)
LPS + IL-12 media^{6}	0/8(0%)	ND		0/8(0%)
SEB	3/4(75%)	ND		2/4(50%)
^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Después de que las células CD4^{+}/CD45Rb^{hi} aisladas de los bazos de BALB/cj se transfirieron a ratones scid/scid, los ratones receptores recibieron los siguientes tratamientos. El grupo de PBS recibió células seleccionadas sin tratamiento adicional. El grupo de IL-12 recibió sólo 10 ng de IL-12 por ratón suministrado vía i.p. los días 1 y 3 además de las células el día 0. El grupo LPS recibió 20 \mu g de Lipopolisacárido (LPS) de Salmonella enteritidis (Sigma L-2012) por ratón el día 1 tras la transferencia de células. Los estudios de dosificación se realizaron usando las dosis baja (2 ng), media (10 ng) o alta (100 ng) de IL-12 junto con 20 \mu g de LPS. Las inyecciones de LPS e IL-12 se dieron el día 1 y se administró una dosis adicional de IL-12 el día 3. En una serie diferente de experimentos, se inyectaron LPS (20 \mu g) e IL-12 (10 ng) una vez a la semana durante tres semanas. Otros ratones recibieron 10 \mu g de proteína enterotoxina B estafilocócica de Staphylococcus aureus (N^{o} de catálogo de Sigma S4881) por ratón una vez el día uno. \end{minipage}
^{2} \begin{minipage}[t]{158mm} Se informa de la incidencia de la enfermedad como número de ratones con la enfermedad a las 12 semanas de tiempo: siendo los criterios grosor de la oreja \geq 26 \mu m o valoración clínica \geq 1. Grosor de la oreja de ratones scid/scid normales = 21 \pm 1 \mu m (n = 10).\end{minipage}
^{3} \begin{minipage}[t]{158mm} Se dieron valores histológicos del 1 al 4 a los ratones enfermos en función de la gravedad de la inflamación de la oreja, piel o párpado. Los ratones que tenían un grosor de la oreja de 25 \mu m o menos se clasificaron como sin enfermedad (grosor medio de la oreja de ratones no enfermeros 22 \mu m \pm 1) y se excluyeron automáticamente a partir del análisis de los cortes. 0 = sin signos de inflamación; 1 = nivel muy bajo y 2 = bajo nivel de infiltración de células mononucleares, engrosamiento leve de la epidermis; 3 = alto nivel de infiltración de células mononucleares, alta densidad vascular, engrosamiento de la epidermis (acantosis, papilas epiteliales e hiperplasia de la epidermis y queratinocitos); 4 = infiltración muy amplia de células mononucleares en epidermis y dermis, densidad vascular muy alta, engrosamiento extremo de la epidermis, formación de pústulas y destrucción de las capas celulares granulares. p frente al control de PBS: LPS + IL-2 baja; p < 0,1. LPS + IL-2 media, p < 0,008. El análisis estadístico se realizó usando la prueba t de Student bilateral). \end{minipage}
^{4} \begin{minipage}[t]{158mm} La inducción de enfermedad grave se calculaba como el número de animales que recibieron una valoración histológica media de \geq 2,5 y/o una valoración clínica de \geq 3. \end{minipage}
^{5} \begin{minipage}[t]{158mm} Una vez a la semana durante 3 semanas se dio LPS (20 \mu g) e IL-12 (10 ng). \end{minipage}
^{6} \begin{minipage}[t]{158mm} Se transfirieron 3 x 10^{5} células T CD4^{+} sin seleccionar (CD45Rb^{hi} y CD45Rb^{lo}) en ratones scid/scid. Se dio una vez a la semana durante 3 semanas LPS (20 \mu g) e IL-12 (10 ng). \end{minipage}

\newpage

Por el contrario, los ratones receptores que recibían 1 ó 10 ng de IL-12 el día 1 y el día 3 junto con 20 \mug de LPS el día 1 tras la transferencia de células T, mostraban un aumento en la gravedad e incidencia de la enfermedad. En particular, la administración de una dosis media de IL-12 (10 ng/ratón) junto con LPS mostraban una incidencia de la enfermedad del 73% con una valoración histológica media de los ratones enfermos de 2,25 \pm 1,1, que era significativamente más alta cuando se comparaba con el control de PBS cuando el PBS se administraba conjuntamente (p < 0,008). Además, el porcentaje de animales con enfermedad grave en el grupo de dosis media de IL-12 era también más alto (42%) cuando se comparaba con el grupo de dosis baja de IL-12 (36%) y significativamente más alto cuando se comparaba con el control de PBS (27%). De manera interesante, la administración conjunta de LPS (20 \mug/ratón) y una dosis alta de IL-12 (100 ng/ratón) inhibían por completo el desarrollo de la enfermedad (incidencia del 0%). Cuando se administraban conjuntamente LPS y una dosis media de IL-12
(10 ng) una vez a la semana durante tres semanas, la incidencia de la enfermedad era del 80% (8/10) con una valoración clínica media de 2,5 \pm 1 (Tabla 2). Este protocolo de inducción en particular también se asoció con un inicio acelerado de la enfermedad ya que los animales de este grupo caían enfermos sólo 4 semanas después de que se transfieran las células T. Por el contrario, los animales que habían recibido solamente una dosis de LPS e IL-12 (10 ng) desarrollaban la enfermedad en una media de 6-8 semanas tras la transferencia de células T y los animales que recibían solamente células T, desarrollaban signos de la enfermedad tras una media de 8 a 10 semanas tras la transferencia de células T.

Los animales que recibieron células T CD4^{+} sin seleccionar nunca caían enfermos incluso si se trataban con tres administraciones de LPS (20 \mug) e IL-12 (10 ng) (Tabla 2), lo que indica que la administración de LPS e IL-12 puede actuar sólo en células T vírgenes y los efectos reguladores de las células CD45Rb^{lo} no podían superarse con la administración de factores microbianos e IL-12. Es destacable que los ratones que no recibían células T o sólo recibían éstas, se mantuvieron junto con ratones que recibieron células T más LPS e IL-12 para asegurarse de que otros factores exógenos no jugaban ningún papel en la inducción de la enfermedad.

En un grupo de experimentos diferentes, comprobamos si otros productos microbianos tales como SEB tenían, asimismo, influencia en la expresión de la enfermedad. Como se muestra en la Tabla 2, SEB también era capaz de inducir la enfermedad con una incidencia y gravedad más elevada (valoración clínica media 1,5 \pm 0,9) que las células solas; demostrando de ese modo que la capacidad de los constituyentes bacterianos para modular la expresión de lesiones psoriasiformes no es exclusiva de LPS.

De forma adicional, en estudios independientes de transferencia de células, se encontró que los ratones scid/scid que recibían células aisladas de las lesiones de piel de ratones enfermos no desarrollaban psoriasis sino se administraba conjuntamente LPS e IL-12, lo que indica que solamente la transferencia de células T de inflamaciones psoriásicas no es suficiente para inducir una respuesta inflamatoria crónica de la piel.

Las lesiones psoriásicas de piel de ratones scid/scid tratados con LPS e IL-12 se asemejan bastante a la patología humana. Los animales que recibieron células CD4^{+}/CD45Rb^{hi} junto con LPS e IL-12 desarrollaron los síntomas de la enfermedad antes de las 4-8 semanas tras la transferencia de células. Los ratones que no mostraban signos clínicos de la enfermedad 10 semanas después de la transferencia de células T permanecían sin la enfermedad en una observación adicional a las 4-6 semanas. De ese modo, se hizo un seguimiento de los ratones empezando la semana 4 y se realizaron necropsias en los animales entre las semanas 10-12. Los signos clínicos de la enfermedad de forma consistente incluían enrojecimiento aumentando de la oreja y piel engrosada en orejas y párpados. Algunos animales también mostraron signos significativos de inflamación en la piel de la cola. En los casos más graves, se observó inflamación de la piel a lo largo de todo el cuerpo con aumento de la descamación y caída del pelo (valoración clínica 4). El espesor de la oreja típicamente variaba a partir de una línea basal de 21 \pm 1,1 \mum en animales no enfermos de un intervalo patológico de 26 a 50 \mum. La piel que resultaba gravemente afectada de forma consistente resultaba descamada, ulcerada y típicamente mostraba una elevación similar a la placa. La inflamación de la piel en ratones psoriásicos oscilaba de leve, alrededor de la base de las orejas y alrededores de los párpados (valoración clínica 1-2) a una pérdida de pelo grave que se extendía a aproximadamente el 75% de su cuerpo (valoración clínica 3-4). Puesto que el engrosamiento de la oreja se correlacionaba muy bien con la gravedad de la enfermedad y con los valores clínicos, usamos la medida del engrosamiento de la oreja como un indicador de la inflamación cutánea general en la mayoría de
los experimentos.

Otros modelos similares de psoriasis en ratones se han criticado porque no poseían las características histológicas encontradas en las formas humanas de la enfermedad. Se estimó que las diferencias en las estructuras de la piel del ratón eran responsables de estas discrepancias. Las uniones dermoepiteliales relativamente planas en ratón se atribuyen a una ausencia de papilas epiteliales o alargamiento del reborde en ratones, un rasgo característico principal de la piel humana. Los análisis histológicos de las lesiones inducidas por nuestro protocolo se realizaron tomando biopsias de muestras de piel de varias áreas de los ratones enfermos y se examinaron cortes de 3 \mum teñidos con hematoxilina y eosina. Las muestras tomadas de la oreja, párpado y cola de ratones enfermos que habían recibido células T más LPS (20 \mug/ratón) e IL-12 (10 ng/ratón) se prepararon para la evaluación histológica y se examinaron microscópicamente por un patólogo independiente. Se encontró que la mayoría de las
lesiones tenían signos típicos de paraqueratosis e hiperqueratosis con alguna úlcera o erosión y formación de pústulas. También se observó un engrosamiento de la epidermis (acantosis) con proliferación de los queratinocitos y papilas epiteliales moderadamente profundas en el subcutis; la infiltración celular inflamatoria estaba formada principalmente por células mononucleares compuesta de linfocitos con pocos monocitos, macrófagos y células plasmáticas. También se vio un número variable de neutrófilos con algunos pocos eosinófilos. Eran numerosos los capilares y otros vasos, que contenían un número elevado de neutrófilos marginados y típicamente estaban rodeadas de linfocitos. La combinación de estas características indica que en este modelo, las lesiones psoriasiformes son muy comparables a las encontradas en humanos. Se hicieron cortes de los ratones scid/scid normales que no recibieron células T de la misma edad que los ratones enfermos. La epidermis tiene un grosor de 1 ó 2 células y la dermis casi no contiene linfocitos. Además, la densidad de los vasos es escasa. La unión de la dermis con la epidermis es directa o no contiene
abscesos.

Las células T CD4^{+} de la piel de ratones con psoriasis son CD45Rb^{lo} y producen niveles elevados de IFN\gamma y bajos niveles de IL-4. Para comparar la activación/perfil de citoquina de los linfocitos infiltrados en la piel (SIL), purificamos esta población de las lesiones de piel de ratones enfermos y no enfermos. Los SIL aislados se estimularon in vitro con anti-CD3 y anti-CD28 durante 48 horas y se ensayó la producción de IFN\gamma, TNF\alpha e IL-4 en los sobrenadantes. Los linfocitos aislados de la piel de ratones que recibieron células T pero que no mostraban signos clínicos de la enfermedad no secretaban niveles detectables de IFN\gamma o IL-4. Por el contrario, las células de ratones enfermos expresaban niveles muy altos de IFN\gamma y TNF\alpha y bajos niveles de IL-4 (Tabla 3). Se estimularon de igual forma células de donantes CD4^{+}/CD45Rb^{hi} vírgenes de bazos de ratones BALB/c y no mostraron niveles detectables de ninguna citoquina ensayada. Además, la mayoría de las células CD4+ aisladas de los tejidos inflamados de enfermos eran CD45Rb^{lo}. Los datos sugieren que la mayoría de las células T vírgenes trasferidas a ratones scid/scid se diferencian en el microambiente de la piel en células T de memoria/efectoras simila-
res a Th1.

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TABLA 3

\begin{minipage}[t]{160mm} Las células T CD4^{+} aisladas de lesiones psoriásicas de ratones scid/scid producen niveles elevados de interferón-gamma y bajos niveles de IL-4 \end{minipage}
Fuente de células T	IFN\gamma (pg)	IL-4 (pg)	TNF\alpha (pg)
Piel de ratones scid/scid enfermos^{1}	22987\pm648	468\pm79	4654\pm946
Piel de ratones scid/scid no enfermos^{2}	\leq 20	\leq 15	\leq 35
Células T CD4^{+}/CD45RB^{hi} de bazos de ratones BALB/c^{3}	\leq 20	\leq 15	\leq 35
\begin{minipage}[t]{160mm} La producción de IFN\gamma , IL-4 y TNF\alpha por SIL o SIT CD4^{+} se midió como se describe en Materiales y Procedimientos. Los datos representan la media y DT. \end{minipage}
^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Se cultivaron 2,0 x 10^{5} células de lesiones psoriasiformes de 5-10 ratones scid/scid receptores durante 48 h, que habían desarrollado la enfermedad tras la reconstitución con células CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de ratones BALB/c normales junto con LPS e IL-12. Los datos son valores representativos de 3 experimentos que mostraban valores similares. \end{minipage}
^{2} \begin{minipage}[t]{158mm} Se cultivaron 2,0 x 10^{5} células de la piel de 8-10 ratones scid/scid receptores que no mostraban síntomas de la enfermedad durante 48 h. Los datos son de un experimento representativo de 2 experimentos independientes que mostraban valores similares. \end{minipage}
^{3} \begin{minipage}[t]{158mm} Se cultivaron 2,0 x 10^{5} células CD4^{+}/CD45Hb^{hi} seleccionadas por citometría de flujo de células de bazo de ratones BALB/c durante 48 h. Pureza celular \geq 90%. \end{minipage}

Las células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} deficientes en IFN\gamma son capaces de inducir lesiones psoriasiformes en ratones scid. Para examinar si el IFN\gamma tiene un papel principal en la inducción de lesiones psoriasiformes, primero transferimos células T vírgenes de ratones deficientes en IFN\gamma (IFN\gamma^{-/-}) a ratones C.B-17 scid/scid. De forma interesante, encontramos que a pesar de la carencia de INF\gamma, las células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de donantes IFN\gamma^{-/-} eran capaces de inducir lesiones psoriasiformes en ratones scid/scid. La inducción de la enfermedad tenía lugar con frecuencia similar, pero el engrosamiento de la oreja en ratones scid/scid enfermos con células T IFN\gamma^{-/-} era, de media, menor que en los ratones control y se presentaban lesiones de piel en ojos y cara, pero eran menos pronunciadas. La valoración clínica media de los ratones enfermos era de 0,9 \pm 1,0 y sólo se anotó un caso de psoriasis grave (valoración clínica \geq 3). Además, se retrasó la aparición de la enfermedad (10-12 semanas tras la transferencia de células) cuando se comparaba con los ratones control (media de 6-8 semanas tras la transferencia celular). De acuerdo con estas observaciones, se observó que en particular, la hiperqueratosis en la piel de los ratones scid/scid con células T IFN\gamma^{-/-} era menos
pronunciada.

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La ausencia de producción de IFN\gamma derivado del donante se verificó ensayando los sobrenadantes de linfocitos aislados de la piel de ratones scid/scid reconstituidos con CD4^{+}/CD45Rb^{hi} IFN\gamma^{-/-} tras 48 h de estimulación con anti-CD3 y anti-CD28. No se encontraron niveles detectables de IFN\gamma (\leq 30 pg) en ninguna de las muestras cuando se ensayaron por ELISA (Tabla 3). También se midió la expresión de TNF\alpha y se encontró que estaba elevada, pero significativamente menos que los niveles de TNF\alpha observados en ratones reconstituidos con células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de animales de tipo silvestre (Tablas 3 ó 4).

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TABLA 4

\begin{minipage}[t]{160mm} El tratamiento con anti-IL-12 reduce significativamente las respuestas inflamatorias de células T, las células T inflamatorias IFN\gamma^{-/-} producen TNF-\alpha \end{minipage}
Fuente de células T	IFN\gamma (pg)	IL-4 (pg)	TNF\alpha (pg)
Ratones control^{1}	56380\pm7940	76\pm5	698\pm195
Ratones tratados con anti-IL-12^{2}	300\pm7	46\pm4,1	\leq 35
Ratones reconstituidos con células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de	\leq 20	69\pm7,3	122\pm31
BALB/c IFN\gamma^{-/-} ^{3}
\begin{minipage}[t]{160mm} La producción de IFN\gamma, IL-4 y TNF\alpha por 2,0 x 10^{5} SIL se midió como se ha descrito en Material y Procedimientos. Los datos representan la media y DT. Todos los ratones se sacrificaron la semana 10 después de la transferencia de las células. Los grupos control y de tratamiento comprendían 4-5 ratones. Se mezclaron linfocitos de cada grupo para la estimulación in vitro sin tener en cuenta el estado de la enfermedad. \end{minipage}
^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Se aislaron células de lesiones psoriasiformes de 5-10 ratones scid/scid enfermos tras la reconstitución con CD4^{+}/CD45Rb^{hi} y administración de LPS más IL-12. Los ratones no recibieron ningún tratamiento. Los datos son de un experimento representativo de 3 experimentos independiente que mostraron valores similares. \end{minipage}
^{2} \begin{minipage}[t]{158mm} Los ratones se trataron dos veces vía i.p. con 0,5 mg de AcM anti-IL-12 (IgG_{1} de rata clon C17.8) los días 7 y 35. Los ratones se sacrificaron 10 semanas después de la transferencia de célula T. Los datos son de un experimento representativo de 2 experimentos independientes que mostraban valores similares. \end{minipage}
^{3} \begin{minipage}[t]{158mm} Las células aisladas de piel psoriásica de las orejas y párpados de ratones scid/scid receptores que se reconstituyeron con células CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de ratones BALB/cj IFN\gamma^{-/-}. \end{minipage}

Para descartar además que los niveles mínimos de IFN\gamma secretados por células NK del hospedador sean suficientes para inducir la enfermedad, inyectamos células T IFN\gamma^{-/-} en ratones scid/beige. Estos ratones portan además de la mutación scid, la mutación beige que causa una deficiencia en las células NK además de la deficiencia de células T y B ya presentes en la mutación scid. Los ratones scid/beige que recibieron células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de IFN\gamma^{-/-} también desarrollaron un aumento muy significativo en el engrosamiento de la oreja, sin embargo, el inicio de la enfermedad se retrasó significativamente y se redujo la incidencia de la enfermedad (Tabla 5) cuando se comparaba con ratones que recibieron células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de IFN\gamma^{+/+}. Además, se atenuó la gravedad de la enfermedad medida por el engrosamiento de la oreja y por valoración clínica (Tabla 5). De forma interesante, a pesar de la presencia de infiltración grave de células mononucleares, la acantosis, de acuerdo con los resultados anteriores, era menos pronunciada en estos animales. Estos resultados indican que el IFN\gamma regula la proliferación de queratinocitos, pero no la infiltración/activación de células mononucleares en la psoriasis.

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TABLA 5

Incidencia y valoración clínica de ratones scid CD4^{+}/CD45Rb^{hi}
Célula T / receptor^{1}	Incidencia^{5}	Valor clínico medio^{6}	Gravedad de la enfermedad^{7}
IFN\gamma^{+/+} / scid/scid ^{2}	9/10(90%)	2,4\pm0,7	5/10(50%)
IFN\gamma^{+/+} / scid/scid \alpha-IL-12^{3}	1/10(10%)	0,1\pm0,3	0/10(0%)
IFN\gamma^{-/-} / scid/scid ^{4}	5/9(58%)	0,9\pm1,0	119(11%)
IFN\gamma^{-/-} / scid/beige ^{4}	3/7(43%)	1,0\pm1,3	2/7(29%)
^{1} Todos los ratones se reconstituyeron con células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de IFN\gamma^{-/-} o IFN\gamma^{+/+} y LPS más IL-12.
^{2} Los ratones recibieron PBS o Ac control (IgG_{1} de rata).
^{3} El tratamiento con anticuerpo se describe en material y procedimientos y en la Tabla 3.
^{4} Ratones scid/scid y scid/beige que se reconstituyeron con células CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de ratones BALB/cj IFN\gamma^{-/-}.
^{5} \begin{minipage}[t]{159mm} Se informa de la incidencia de la enfermedad como el número de ratones con la enfermedad durante 10 semanas de tiempo: siendo los criterios engrosamiento de la oreja \geq 26 \mu m o valor clínico \geq 1. \end{minipage}
^{6} \begin{minipage}[t]{159mm} Se calculó el valor clínico medio \pm DT de todos los ratones en el grupo como se describe en materiales y procedimientos, p frente a scid/scid IFN\gamma^{+/+}, anti-IL-12: p < 0,0000001. scid/scid IFN\gamma^{-/-}: p < 0,003, scid/beige IFN\gamma^{-/-}, p < 0,01. El análisis estadístico se realizó usando la prueba t de Student bilateral. \end{minipage}
^{7} \begin{minipage}[t]{159mm} Inducción de enfermedad grave calculada como el número de animales que recibieron un valor histológico medio \geq 2,5 y/o un valor clínico \geq 3. \end{minipage}

La IL-12 se expresa de forma elevada en lesiones psoriasiformes y la neutralización in vivo de IL-12 regula negativamente TNF\alpha e IFN\gamma, e inhibe el desarrollo de la enfermedad. A continuación nos centramos en la IL-12, ya que esta citoquina proinflamatoria juega un papel principal en la inducción de IFN\gamma. Realizamos estudios inmunohistoquímicos para detectar la presencia de IL-12 heterodimérica en tejido inflamado. Hay una cantidad muy significativa de heterodímero de IL-12 (p35/p40, (p70)) expresada en el tejido de ratones tratados con CD4^{+}/CD45Rb^{hi} enfermos. Por el contrario, puede observase una tinción significativamente menor en los animales tratados con CD4^{+}/CD45Rb^{hi} que se inyectaron con AcM anti-IL-12 (0,5 mg/ratón) los días 7 y 35.

Para evaluar adicionalmente el papel de la IL-12 en la inducción de lesiones psoriasiformes, administramos AcM anti-IL-12 (0,5 mg) los días 7 y 35 tras la transferencia de células T a ratones scid/scid que habían recibido células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} de tipo silvestre. Se dieron dos dosis de AcM anti-IL-12 para mantener un valor de Ac suficientemente elevado durante el periodo completo de la inducción de la enfermedad tras la transferencia de células CD4^{+}/CD45Rb^{hi}. En dos experimentos independientes, los ratones (grupos de 5) que se trataron con AcM anti-IL-12 estaban completamente protegidos del desarrollo de la enfermedad. Sólo un ratón entre 10 desarrolló psoriasis leve visible en forma de pérdida ligera de pelo y eritema alrededor de los párpados (valor clínico 1), sin embargo, este ratón y otros ratones tratados con AcM anti-IL-12 no desarrollaron ningún incremento del espesor de las orejas. Por el contrario, los ratones controles que se trataron con anticuerpos IgG de rata como control o con PBS mostraron una incidencia del 90% (9 entre 10 ratones desarrollaron la enfermedad) con un valor clínico medio de 2,4 \pm 0,7. La incidencia más elevada y grave de la enfermedad en este grupo también se asoció con un aumento significativamente elevado en el engrosamiento de la oreja a lo largo del tiempo.

Se examinó la producción de citoquina por los linfocitos infiltrados en las orejas y en la piel de ratones que recibieron anti-IL-12. Aunque había muy pocos linfocitos presentes en la piel de animales tratados con IL-12, estos se aislaron y se probó la producción de IFN\gamma, IL-4 y TNF\alpha. Sólo se detectaron bajos niveles de IFN\gamma, IL-4 y TNF\alpha en los sobrenadantes de las células aisladas a partir de animales tratados, cuando se compararon con la producción de citoquina en los sobrenadantes obtenidos a partir de animales control (Tabla 4).

Los resultados anteriores se corroboraron por el análisis de los cortes histopatológicos obtenidos a partir de los animales que se trataron con AcM anti-IL-12. Los ratones que se habían tratado con 0,5 mg de AcM anti-IL-12 los días 7 y 35 carecían de cualquier signo de inflamación significativa, acantosis o hiperqueratosis. De este modo, parece que la administración de anti-IL-12 previene el desarrollo de lesiones psoriasiformes inhibiendo la hiperproliferación de queratinocitos y la infiltración de células mononucleares lo más probablemente por regulación negativa de la producción tanto de IFN\gamma como de TNF\alpha.

Discusión

Los datos anteriores demuestran cómo estímulos inmunomoduladores, en este caso antígenos microbianos y la linfoquina antiinflamatoria IL-12 afectan a la capacidad de las células T para inducir psoriaris en este modelo de transferencia de células T CD4^{+}/CD45Rb^{hi} recién desarrollado. Se demuestra que la administración conjunta de LPS e IL-12 (1 y 10 ng) llevan a un inicio más rápido y a un aumento de la incidencia de la psoriaris en ratones scid
C.B-17. Además, las lesiones observadas en los ratones tratados también eran más graves. En experimentos adicionales, se demostró que la administración conjunta de SEB también lleva a un aumento significativo en la incidencia y expresión de la enfermedad. Estos hallazgos sugieren la importancia de las infecciones bacterianas o virales antes de la aparición de lesiones psoriasiformes. De forma más notable, las lesiones de la piel que se desarrollaron con este procedimiento de inducción eran características y extraordinariamente similares a la lesiones psoriásicas humanas, mostrando la mayoría de los rasgos clínicos e histológicos. La descamación y el engrosamiento de la piel, evidentes de forma macroscópica, eran debidos a marcadas hiperqueratinosis, paraqueratinosis y acantosis. Adicionalmente, se ha documentado microscópicamente la aparición de papilas epiteliales, úlceras y formación de pústulas y la hiperplasia epidérmica a menudo grave. La infiltración de células inflamatorias era principalmente mononuclear y estaba compuesta de linfocitos con pocos monocitos, macrófagos y células plasmáticas. Además, la mayoría de las células T CD4^{+} aisladas a partir de lesiones psoriasiformes expresa bajos niveles de CD45Rb, lo que está de acuerdo con el hecho de que estudios recientes en humanos encuentran que las células T aisladas de placas psoriásicas muestran un fenotipo de memoria. Además de la similitud con la histología humana observada en este estudio, también hay algunas diferencias. Lo más destacable es la ausencia de células T CD8^{+} en la epidermis de las placas psoriásicas, las cuales pueden encontrarse en psoriasis humana. Hasta ahora, sin embargo, no se ha definido un papel principal de las células T CD8^{+} en la patofisiología de la psoriasis y las terapias iniciales con éxito se dirigen a las células T CD4^{+} más que a las células T CD8^{+}, señalando a las células T CD4^{+} como principal responsable de la
enfermedad.

Diversos mecanismos pueden ser responsables de los efectos de LPS, IL-12 y SEB para promover la enfermedad. En primer lugar, estos inmunomoduladores pueden estimular la proliferación y diferenciación de células Th0 vírgenes a Th1. Estudios recientes han mostrado que productos microbianos tales como LPS puede estimular directamente la producción de TNF\alpha, IL-6 y, en menor medida, de IL-12 por las células dendríticas derivadas de la piel murina y, de este modo, pueden ser responsables de ajustar la condición proinflamatoria de células T autorreactivas. Las células T CD45Rb^{hi} tras la transferencia a ratones SCID requieren señales adicionales dependientes de IL-12 para convertirse en células efectoras autoinmunes.

Además de sus efectos inmunoestimuladores sobre macrófagos y sus efectos en el desarrollo de células efectoras Th1, LPS, IL-12 y SEB también pueden modular el tráfico de leucocitos en los ratones receptores dando lugar a la localización cutánea de células efectoras Th1. LPS promueve el reclutamiento de leucocitos estimulando la expresión en células endoteliales de moléculas de adhesión E-selectina, ICAM-1 y VCAM-1 tanto directamente como a través de su capacidad para inducir la producción de IL-1, TNF-\alpha e IFN-\gamma. También son bien conocidos los efectos proinflamatorios de estas citoquinas en la adhesión y migración de leucocitos.

IFN\gamma e IL-12 son dos citoquinas inmunorreguladoras muy importantes, que han mostrado tener un papel importante en el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Principalmente, la IL-12 activa células NK y T, mientras que el IFN\gamma principalmente activa macrófagos e induce la regulación positiva de moléculas de clase II en células de tejidos. Podría esperarse que el IFN\gamma fuese crucial para la inducción de células efectoras autoinmunes en psoriasis. Los datos anteriores, sin embargo, indican que el IFN\gamma sólo puede participar en el proceso de la enfermedad potenciando la gravedad de la enfermedad, más probablemente promoviendo la proliferación de queratinocitos, pero claramente sin inducir ni mantener a las células T inflamatorias patogénicas en la piel psoriásica. Esto está apoyado por el hecho de que la histología observada en lesiones de ratones que recibieron células T de donantes IFN\gamma^{-/-} mostraban signos ligeramente inferiores o igual de inflamación pero la hiperqueratosis o acantosis disminuían claramente en ratones scid/scid o scid/beige. Además, aunque se atenuó la gravedad clínica de la enfermedad, medida por el engrosamiento de la oreja y la observación macroscópica, cuando se comparaba con animales control, la penetrancia de la enfermedad fue muy similar. También se encontró que esto era cierto cuando las células T de IFN\gamma^{-/-} se transferían a ratones scid/beige deficientes en células T, B y NK.

Estos resultados indican que el IFN\gamma es un cofactor importante en la inducción de la proliferación de queratinocitos aberrantes.

La ausencia de IFN\gamma derivado del hospedador se verificó por la medida del IFN\gamma de células completas estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28, aisladas de las lesiones inflamatorias de animales que recibieron células T de IFN\gamma^{-/-}. Como era de esperar, no fuimos capaces detectar ningún nivel mensurable de IFN\gamma, de este modo además se descartaba la posibilidad de que las células no T de la piel pudieran secretar IFN\gamma, incluyendo las célu-
las NK.

Al contrario que el IFN\gamma, por diversas observaciones hechas en estos estudios, se demostró un requerimiento absoluto de IL-12 en el desarrollo de las lesiones psoriasiformes crónicas en ratones scid/scid. Primero, las dosis media y baja de IL-12 (1 y 10 ng/ratón) administradas tras la transferencia de células T del donante daba lugar a una incidencia y gravedad más elevada de la enfermedad. Además, la tinción in situ de los tejidos inflamados mostraba una presencia significativa de IL-12 heterodimérica (p70), mientras que no había tinción de IL-12 en ningún tejido control no inflamado. Más importante, la neutralización in vivo de IL-12 con un AcM que reacciona contra el heterodímero p70 de IL-12 7 días después de la transferencia de células T era capaz de eliminar completamente la inducción de la enfermedad. Un aspecto interesante de estos estudios era que las dosis más elevadas de IL-12 (100 ng/ratón) inhibían la inducción de la enfermedad en lugar de promover el desarrollo de la enfermedad.

En resumen, el trastorno crónico de piel descrito en este estudio incluye características que normalmente sólo se observaban en la psoriasis humana, tales como papilas epiteliales, acantosis grave e infiltración de células Th1 en la dermis. Las anomalías clínicas e histológicas se potenciaban enormemente con la administración in vivo de LPS e
IL-12, lo que demostraba un papel importante de un agente o agentes infecciosos en la patogénesis de la enfermedad. Además, se ha demostrado por primera vez que la inducción de lesiones psoriasiformes dependía de IL-12, pero era independiente de IFN\gamma. Estos resultados proporcionan una introducción en los requerimientos patogénicos específicos de citoquinas que promueven Th1 y células para el desarrollo de lesiones psoriasiformes y la prevención y tratamiento de psoriasis en humanos.

Ejemplo 2

Se ensayó el efecto del tratamiento con anticuerpos IL-12 en el proceso y en la fase tardía de la enfermedad psoriásica en los animales. La enfermedad se indujo por los procedimientos descritos en el Ejemplo 1, es decir, usando 3 x 10^{5} células CD4^{+} cD45Rb^{hi} transferidas en ratones scid/scid seguido de la inyección de LPS y de IL-12. El tratamiento con el anticuerpo anti-IL-12 fue siempre de 1 mg/ratón/dosis. Los resultados de cuatro experimentos separados se muestran en la Figura 1. En el experimento inicial (n = 5 sin tratar, n =2 tratados), los ratones recibieron inyecciones de anti-IL-12 en las semanas 9 y 10 (es decir, aproximadamente 5 semanas tras la aparición de síntomas psoriásicas) y se sacrificaron para análisis histológico a la semana 14. Mientras que los ratones sin tratar tenían un valor histológico medio de 2,5, lo que indicaba síntomas de moderados a altos, los ratones tratados tenían un valor histológico de sólo 0,25, lo que indicaba que casi no había síntomas. Por tanto, dos inyecciones del anticuerpo anti-IL-12 eran altamente eficaces para aliviar los síntomas establecidos de psoriasis.

En un segundo experimento, 3 grupos de ratones se dejaron sin tratar, se trataron con un anticuerpo control con el mismo isotipo que no se une a IL-12 o se trataron con el anticuerpo anti-IL-12 (n = 4 para cada grupo). Los tratamientos se hicieron en las semanas 9 y 10, y se tomaron muestras histológicas la semana 12. Una vez más, los ratones sin tratar o los controles tratados tenían niveles sustanciales de síntomas psoriásicos y los ratones tratados con anti-IL-12 tenían niveles mucha más bajos. En un tercer experimento, los ratones se dejaron sin tratar (n = 5) o se trataron con anti-IL-12 las semanas 9 y 10 (n = 6), pero la mitad de los ratones tratados se sacrificaron la semana 12 para el estudio histológico como se indicó anteriormente, y la otra mitad la semana 17. Una vez más, los ratones tratados mostraron una reducción espectacular del valor histológico, que se mantenía en gran medida la semana 17, siete semanas después de que se hubiera terminado el tratamiento.

Finalmente, en un cuarto experimento (n = 4 para grupos tratados con anti-IL-12 y anticuerpo control con el mismo isotipo) el tratamiento no se inició hasta la semana 14, aproximadamente 10 semanas después de que aparecieran los síntomas psoriásicos, de modo que los síntomas estaban muy bien establecidos (grosor de la oreja > 40 \mum). El tratamiento fue semanal de la semana 14 a la 17. A pesar de la enfermedad bien definida, el tratamiento con
anti-IL-12 fue espectacularmente eficaz para reducir los síntomas (a un valor histológico medio de 0,25). Este resultado se confirmó con la medida semanal del grosor de la oreja, una medida independiente de la gravedad de la enfermedad, como se muestra en la Figura 2.

Combinando todos estos experimentos, el valor histológico medio de los ratones sin tratar o del control tratado cuando se sacrificaron era de 2,53, mientras que el valor histológico medio de los ratones tratados con anticuerpo anti-IL-12 era sólo de 0,65, un resultado estadístico altamente significativo (p = 1,7 x 10^{-9}por la prueba de la t de Student bilateral).

Claims (11)

1. Uso de un anticuerpo anti-interleuquina-12 para preparar una formulación farmacéutica para tratar la psoriasis.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo anti-interleuquina-12 es un anticuerpo monoclonal.

3. El uso según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo monoclonal es capaz de unirse a la interleu-
quina-12 con una afinidad de unión de al menos 10^{8} M^{-1}.

4. El uso según la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo anti-interleuquina-12 es capaz de neutralizar la interleuquina 12.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal quimérico o un anticuerpo monoclonal humanizado.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo monoclonal es 5F2, 16F2, 16G2 ó 20E11 en forma quimérica o humanizada.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal humano.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha formulación farmacéutica es adecuada para ser administrada a un paciente por vía oral, tópica, subcutánea, intramuscular o intravascular.

9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha formulación farmacéutica es adecuada para administrar anticuerpo anti-interleuquina-12 en una dosis de 0,01-100 mg/kg de peso corporal.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que dicho anticuerpo anti-interleuquina-12 está en una dosis de
0,1-10 mg/kg de peso corporal.

11. El uso según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho tratamiento es adecuado para reducir el PASI en al menos el 50%.