DE69115917T2

DE69115917T2 - Humane gammainterferonantagonisten

Info

Publication number: DE69115917T2
Application number: DE69115917T
Authority: DE
Inventors: Gail Seelig
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1990-09-27
Filing date: 1991-09-25
Publication date: 1996-05-23
Anticipated expiration: 2011-09-26
Also published as: HU9300900D0; DE69115917D1; IE913378A1; IL99580A0; HUT67708A; WO1992006115A1; TW272197B; AU8742991A; AU664540B2; JPH05506247A; NZ239954A; CA2092541A1; ATE132162T1; US5451658A; EP0550650B1; ZA917669B; EP0550650A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

γ-Interferon ist ein durch aktivierte Helfer-T-Zellen produziertes Protein, das antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten zeigt. Die antiviralen und antiproliferativen Aktivitäten von γ-Interferon sind vor allem suppresiv, während sich die immunmodulatorische Aktivität hauptsächlich durch Stimulation einer Vielfalt von Immunfunktionen ausdrückt, obschon es bekannt ist, daß auch eine Hemmung einer Immunfunktion auftreten kann.
Obschon der Mechanismus, durch den γ-Interferon seine Wirkungen auf Zellen ausübt, nicht verstanden wird, ist bekannt, daß es an spezielle Zellrezeptoren bindet [Langer et al., Immunology Today 9:393 (1988)). Aguet et al. [Cell 55:273 (1988)] haben ein Gen für einen γ-Interferonrezeptor kloniert und sequenziert. Das aus der Sequenz abgeleitete Molekulargewicht des kodierten Proteins stimmt mit dem Molekulargewicht eines γ-Interferonrezeptors überein, der kürzlich aus menschlicher Plazenta isoliert wurde [Calderon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4837 (1988)].
Von γ-Interferon wird angenommen, daß es an einer Autoimmunkrankheit beteiligt ist. Von erhöhten γ-Interferonwerten wird ferner angenommen, daß sie Makrophagen stimulieren, die im Gehirn und Rückenmark an multipler Sklerose (MS) Leidender fälschlicherweise Myelin verdauen.
Die EP-A-0 122 628 offenbart, daß die Aminosäuren von Position 128-146 von γ-Interferon ein bedeutsames antigenes Potential zu besitzen scheinen; es werden Antikörper gegen Human-γ-Interferon beschrieben, die beim Nachweis, der mengenmäßigen Bestimmung und der Affinitätsreinigung von γ-Interferon nützlich sind.
Chemical Abstracts, Bd. 104, Nr. 25, vom 23. Juni 1986 (Zusammenfassung 220125a) beschreibt die Herstellung synthetischer DNA-Fragmente, die für die Aminosäuren 1-46 und 48-146 von Human-γ-Interferon kodieren. Die Fragmente wurden kloniert und exprimiert, obschon keine Aktivität der erhaltenen Polypeptide beschrieben wird.
Chemical Abstracts, Bd. 107, Nr. 1, vom 6. Juli 1987 (Zusammenfassung 5451k) beschreibt Antikörper gegen Human-γ-Interferon, welche eine neutralisierende Aktivität besitzen und durch Immunisierung von Mäusen mit den Resten 4-21 von Human-γ-Interferon erhalten wurden. Es gibt auch ein Zitat zu einem Antikörper, der gegen die Reste 131-146 von Human-γ-Interferon gerichtet ist, obschon keine weiteren Einzelheiten der Aktivität des letzten Antikörpers angegeben werden.
Da γ-Interferon an speziellen Zellrezeptoren wirkt und an Autoimmunkrankheiten und MS beteiligt ist, wären Mittel, die das Binden eines derartigen Interferons an seine Zellrezeptoren hemmen könnten, therapeutisch brauchbar.
Der Stand der Technik beschreibt jedoch keine Antagonisten von Human-γ-Interferon und beschreibt die Epitope auf dem γ-Interferon, die für seine Aktivität verantwortlich sind, nicht spezifisch.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung stellt neue Polypeptide bereit, die bis zu 50 Aminosäurereste enthalten und eine oder mehr Aminosäureuntersequenzen umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den Untersequenzen besteht, die durch die Aminosäurereste 15-21 und 132-137 der durch SEQ ID NO:1 definierten Sequenz definiert werden. Vorzugsweise enthalten die Polypeptide bis zu 40 und bevorzugter bis zu 35 Aminosäurereste.
In einigen, beide Untersequenzen umfassenden Polypeptiden sind die Untersequenzen durch einen Peptidlinker getrennt, der 1 bis etwa 20 Aminosäurereste enthält. In anderen, beide Untersequenzen umfassenden Polypeptiden liegen die Untersequenzen in zwei getrennten, durch Disulfidbrücken verbundenen Polypeptiden vor.
Diese Erfindung stellt ferner Antikörper gegen Polypeptide bereit, die bis zu 50, vorzugsweise bis zu 40 und bevorzugter bis zu 35 Aminosäurereste enthalten und eine oder mehr Aminosäureuntersequenzen umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den durch die Aminosäurereste 15-21 und 132-137 der durch SEQ ID NO:1 definierten Sequenz definierten Untersequenzen besteht, wobei die Antikörper durch die Fähigkeit zum spezifischen Binden an die Polypeptide und an Human-γ-Interferon und zum Hemmen des Bindens eines derartigen Interferons an Zellrezeptoren gekennzeichnet sind.
Die vorliegende Erfindung stellt noch weiter anti-idiotypische Antikörper gegen die vorgenannten Antikörper bereit. Diese antiidiotypischen Antikörper hemmen auch das Binden von Human-γ- Interferon an Zelirezeptoren.
Alle Antikörper dieser Erfindung können entweder polyklonale Antikörper aus einem Antiserum oder monoklonale Antikörper sein. Aus derartigen Antikörpern hergestellte Bindungsfragmente und humanisierte oder auf andere Weise veränderte Antikörper sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.
Ferner werden Verfahren zum Verwenden der vorstehenden Polypeptide und Antikörper zum Hemmen des Bindens eines derartigen Interferons an Zellrezeptoren bereitgestellt.
Ein Verfahren umfaßt das Zusammenbringen von Zellen, die Rezeptoren für Human-γ-Interferon tragen, mit einer wirksamen Menge eines Polypeptids, das bis zu 50, vorzugsweise bis zu 40 und bevorzugter bis zu 35 Aminosäurereste enthält und eine oder mehr Aminosäureuntersequenzen umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den durch die Aminosäurereste 15-21 und 132-137 der durch SEQ ID NO:1 definierten Sequenz definierten Untersequenzen besteht.
Ein weiteres Verfahren umfaßt das Zusammenbringen von Human-γ- Interferon mit einer wirksamen Menge eines Antikörpers, der spezifisch an Human-γ-Interferon und an Polypeptid bindet, das bis zu 50, vorzugsweise bis zu 40 und bevorzugter bis zu 35 Aminosäurereste enthält und eine oder mehr Aminosäureuntersequenzen umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den durch die Aminosäurereste 15-21 und 132-137 der durch SEQ ID NO:1 definierten Sequenz definierten Untersequenzen besteht.
Noch ein weiteres Verfahren umfaßt das Zusammenbringen von Zellen, die Rezeptoren für Human-γ-Interferon tragen, mit einer wirksamen Menge eines ersten, anti-idiotypischen Antikörpers gegen einen zweiten Antikörper, wobei der zweite Antikörper spezifisch an Human-γ-Interferon und an ein Polypeptid bindet, das bis zu 50, vorzugsweise bis zu 40 und bevorzugter bis zu 35 Aminosäurereste enthält und eine oder mehr Aminosäureuntersequenzen umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den durch die Aminosäurereste 15-21 und 132-137 der durch SEQ ID NO:1 definierten Sequenz definierten Untersequenzen besteht.
Außer ihrer Verwendung als therapeutische Mittel sind die Polypeptide, Antikörper und Verfahren der vorliegenden Erfindung zur in-vitro-Untersuchung des Mechanismus des Bindens von γ-Interferon an verschiedene Zelltypen und zum Durchmustern auf andere γ-Interferon-Antagonisten oder -Agonisten nützlich.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Diese Erfindung ist durch Bezug auf die begleitenden Abbildungen leichter verständlich, in denen:
Fig. 1 eine graphische Darstellung der Hemmung des Bindens von ¹²&sup5;I-markiertem Human-γ-Interferon D an Daudi-Zellen durch Polypeptide mit Aminosäuresequenzen ist, die durch SEQ ID NO:2 (Tafel A) und durch SEQ ID NO:3 (Tafel B) definiert sind. Die Prozent spezifisch gebundener Radioaktivität werden in beiden Tafeln als Funktion der Polypeptidkonzentration dargestellt.
Fig. 2 eine graphische Darstellung der Hemmung des Bindens von ¹²&sup5;I-markiertem Human-γ-Interferon D an Daudi-Zellen durch Antiserum gegen das in der Legende zu Tafel A von Fig. 2 angeführte Polypeptid ist, welche die Prozent spezifisch gebundener Radioaktivität als Funktion der Antiserummenge darstellt.
Fig. 3 eine graphische Darstellung der Hemmung durch ein Polypeptid mit einer durch SEQ ID NO:10 definierten Aminosäuresequenz der Induktion von Klasse II-Hauptgewebeverträglichkeitsantigenen auf COLO-205-Zellen durch rekombinantes Human-γ-Interferon D ist. Die Prozent Hemmung werden als Funktion der Polypeptidkonzentration in Anwesenheit einer konstanten Interferonkonzentration von 150 pM dargestellt.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Alle hierin zitierten Literaturstellen sind hierdurch in ihrer Gänze durch Verweis inbegriffen. Alle offenbarten Aminosäuresequenzen folgen der normalen Konvention mit dem Amino-Terminus links und dem Carboxyl-Terminus rechts. Standardabkürzungen mit drei Buchstaben werden für die Aminosäurereste in den Sequenzen verwendet (37 C.F.R. § 1.822). Hierin verwendet stellt "Aib" entweder 2- oder 3-Aminoisobuttersäure dar.
Im Laufe einer Suche nach spezifischen Hemmern von Human-γ- Interferon ist überraschenderweise gefunden worden, daß gewisse Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die den Sequenzen von Resten in speziellen Regionen unversehrten reifen Human-γ-Interferons entsprechen, wirksame Hemmer des Bindens von Human-γ- Interferon an seine Zellrezeptoren sind. Die antagonistischen Wirkungen dieser Polypeptide sind in einem Radioligand-Rezeptor- Testsystem gezeigt worden, das die Polypeptide, ¹²&sup5;I-markiertes Human-γ-Interferon und Zellen einsetzt, die für ein derartiges Interferon spezifische Rezeptoren tragen. Diese Erfindung stellt derartige Polypeptide bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Antikörper bereit, die das Binden von Human-γ-Interferon an Zellrezeptoren durch (a)
Kombinieren mit einer Region(en) in einem derartigen Interferon, das offensichtlich an Wechselwirkungen mit den Rezeptoren beteiligt ist, oder durch (b) Nachahmen von γ-Interferon selbst bereit, wodurch sie mit ihm um das Binden an die Rezeptoren wettstreiten. Als Ergebnis hemmen sie auch die biologische Aktivität des Interferons.
Hierin verwendet bedeutet Human-"γ-Interferon" ein Protein, das (a) eine Aminosäuresequenz besitzt, die im wesentlichen mit der in der Sequenzliste durch SEQ ID NO:1 definierten Sequenz reifen Human-γ-Interferons A identisch ist und (b) eine biologische Aktivität besitzt, die natürlichem γ-Interferon eigen ist.
Aus Zweckmäßigkeitsgründen können die Aminosäuresequenzen nachstehend angeführter Polypeptide als entsprechende Sequenzen von Resten in der durch SEQ ID NO:1 definierten Aminosäuresequenz reifen Human-γ-Interferons beschrieben werden, wobei 1 der aminoterminale Cysteinrest ist und 146 der carboxylterminale Glutaminrest ist, usw.
Eine wesentliche Identität von Aminosäuresequenzen bedeutet, daß die Sequenz eines anderen γ-Interferons verglichen mit der durch SEQ ID NO:1 definierten Sequenz identisch ist oder sich um eine oder mehr Aminosäureänderungen (Deletionen, Additionen, Substitutionen) unterscheidet, welche die biologische Aktivität nicht wesentlich verschlechtern. Zum Beispiel ist γ-Interferon D, welchem die ersten drei aminoterminalen Reste (Cys-Tyr-Cys) des durch SEQ ID NO:1 definierten Interferons fehlen, im Zusammenhang mit dieser Erfindung im wesentlichen identisch. So sind es auch natürliche Human-γ-Interferone, denen derartige aminoterminale Reste fehlen und außerdem am Carboxylterminus eine Mikroheterogenität zeigen [Seelig et al., Biochemistry 27:1981 (1988)].
Wie vorstehend erklärt umfassen die Polypeptide der Erfindung eine oder mehr Aminosäureuntersequenzen, die aus der Gruppe von Untersequenzen ausgewählt sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den durch die Aminosäurereste 15-21 und 132-137 der durch SEQ ID NO:1 definierten Sequenz definierten Untersequenzen besteht. Bevorzugte Polypeptide umfassen beide. Diese beiden Untersequenzen umfassen wichtige "Kernregionen" des Human-γ-Interferons, von denen angenommen wird, daß sie am Rezeptorbinden und/oder der biologischen Aktivität eines derartigen Interferons irgendwie beteiligt sind. Die Polypeptide können außer diesen Kernregionen zusätzliche flankierende Sequenzen enthalten, die Aminosäurereste mit Sequenzen umfassen, die den Sequenzen von Resten entsprechen, welche die Kernregionen in Human-γ-Interferon flankieren.
Zum Beispiel umfaßt ein bevorzugtes Polypeptid mit einer durch SEQ ID NO:10 definierten Aminosäuresequenz zwei Untersequenzen, von denen eine durch die Sequenz der Aminosäurereste 15-29 der SEQ ID NO:1 definiert ist. Die andere Untersequenz in diesem Polypeptid wird durch die Sequenz der Aminosäurereste 130-138 der SEQ ID NO:1 definiert.
Wenn die Polypeptide der Erfindung beide Kernregionen enthalten (mit oder ohne zusätzliche flankierende Sequenzen), werden die Regionen einander auf einem von zwei Wegen angenähert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie durch ein dazwischenliegendes Linkerpeptid kovalent in einer Peptidbindung gebunden. Dieses Linkerpeptid kann 1 bis etwa 20 Aminosäurereste, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 8 Reste, enthalten. Die als Linkerpeptid ausgewhlten Aminosäurereste können aus jeder der 22 gemeinhin bekannten Aminosäuren ausgewählt sein, obschon aus der Gruppe, die aus Gly, Ala, Aib, Leu und Ile besteht, ausgewählte Aminosäurereste zur Verwendung in Zufallssequenzlinkern bevorzugt sind.
Anstatt zufällig ausgewählter Aminosäurereste kann das Linkerpeptid 1 bis etwa 20, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 8 Reste mit einer Sequenz enthalten, die der Sequenz einer Untersequenz von Resten entspricht, die in Human-γ-Interferon zwischen den beiden Kemregionen vorliegen. In der durch SEQ ID NO:10 definierten bevorzugten Ausführungsform sind die beiden Regionen zum Beispiel durch einen Peptidlinker mit einer Sequenz verbunden, die der Sequenz der Reste 111-118 von SEQ ID NO:1 entspricht.
Das Linkerpeptid ist dazu vorgesehen, dem Molekül Flexibilität zu verleihen, so daß die die Interferonsequenzen betreffenden Regionen eine räumliche Beziehung besitzen, welche der räumlichen Beziehung der entsprechenden Sequenzen in unversehrtem Human-γ-Interferon nahekommt. Von den Fachleuten wird selbstverständlich eingesehen, daß dieses Vorhaben auch mit Linkem durchgeführt werden kann, die andere Einheiten als Aminosäurereste umfassen. Zum Beispiel können stattdessen viele wohlbekannte Linker verwendet werden, die gemeinhin in der Affinitätschromatographie eingesetzt werden, so lange die Flexibilität und Länge der Linker derjenigen der Polypeptidlinker ähnlich ist. Derartige funktionell aquivalente, alternative Linker können durch bekannte Verfahren an den Polypeptidsegmenten der Moleküle befestigt werden.
Die Reihenfolge der Kernregionen (mit oder ohne zusätzliche flankierende Sequenzen) in den vorstehenden Polypeptiden ist nicht wesentlich. Die in der aminoterminalen Region von Human-γ- Interferon gelegene Region kann sich am Amino-Terminus des Polypeptids befinden oder umgekehrt, obschon die erste Anordnung bevorzugt ist.
Einige bevorzugte, eine oder beide Kernregionen enthaltende Polypeptide besitzen in der Sequenzliste durch SEQ ID NO 2, 3 und 10 definierte Aminosäuresequenzen.
In einer alternativen Ausführungsform können die beiden Kernregionen (mit oder ohne zusätzliche flankierende Sequenzen) durch Verwenden zweier Polypeptide einander nahegebracht werden, von denen jedes eine der Kernregionen enthält. Dies wird durch Einbauen von Cysteinresten in jedes Polypeptid in Regionen außerhalb der Kernregionen und Verbinden der Polypeptide durch Disulfidbrücken bewerkstelligt.
Hierin verwendet ist der Ausdruck "Polypeptid" so definiert, daß er sowohl Ausführungsformen, in denen die Kernregionen einander über ein Linkerpeptid nahegebracht werden, als auch diejenigen bedeutet, bei denen zwei Polypeptidketten durch Disulfidbrücken verbunden werden.
Obschon die Polypeptide der Erfindung nur eine verhältnismäßig kleine Zahl Aminosäurereste enthalten, verglichen mit der Gesamtzahl von Resten in reifem Human-γ-Interferon, sind sie nichtsdestotrotz spezifische konkurrierende Hemmer des Bindens des unversehrten Interferons an Zellrezeptoren. Wie nachstehend gezeigt können bis zu 80% des spezifischen Bindens von ¹²&sup5;I- markiertem Human-γ-Interferon D an Daudi-Zellen durch derartige Polypeptide aufgehoben werden.
Es muß betont werden, daß die Polypeptide der Erfindung an alle Zellen binden, die γ-Interferonrezeptoren besitzen, wie etwa B- Zellen, T-Zellen, Eosinophile, Glattmuskelzellen, Promyelozyten, Makrophagen, erythroide Zellen, Monozyten und Granulozyten. Daudi-Zellen, eine gut charakterisierte B-Lymphoblastenzellinie, die aus einem Burkitt-Lymphompatienten stammt, welche von der American Type Culture Collection unter der Zugangsnr. CCL 213 erhältlich ist, werden nachstehend nur als gangbarer Weg zum Aufzeigen der Hemmung des Bindens von 1251-markiertem γ-Interferon an Zellrezeptoren verwendet. Andere Zellinien können ebenfalls zu diesem Zweck verwendet werden, wie etwa die menschliche histiozytische Lymphomlinie U-937 (ATCC CRL 1593).
Die Polypeptide werden durch ein geeignetes Verfahren wie etwa durch ausschließliche Festphasensynthese, teilweise Festphasenverfahren, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese synthetisiert. Die Polypeptide werden vorzugsweise durch von Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), beschriebene Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Die Synthese wird mit Aminosäuren durchgeführt, die am α-Amino-Terminus geschützt sind.
Trifunktionale Aminosäuren mit labilen Seitenketten werden eben falls mit geeigneten Gruppen geschützt, um das Auftreten unerwünschter chemischer Reaktionen während des Aufbaus der Polypeptide zu verhindern. Die α-Aminoschutzgruppe wird selektiv entfernt, um die nachfolgende Reaktion am Amino-Terminus stattfinden zu lassen. Unter den Bedingungen zur Entfernung der α- Aminoschutzgruppe werden die Seitenketten-Schutzgruppen nicht entfernt.
Die α-Aminoschutzgruppen sind diejenigen, von denen bekannt ist, daß sie auf dem Gebiet der schrittweisen Polypeptidsynthese brauchbar sind. Eingeschlossen sind Schutzgruppen vom Acyltyp (z.B. Formyl, Trifluoracetyl, Acetyl), Schutzgruppen vom Typ des aromatischen Urethans [z.B. Benzyloxycarbonyl (Cbz), substituiertes Benzyloxycarbonyl und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)], aliphatische Urethan-Schutzgruppen (z . B. t-Butyloxycarbonyl (Boc), Isopropyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl) und Schutzgruppen vom Alkyltyp (z.B. Benzyl, Triphenylmethyl). Die bevorzugte Schutzgruppe ist Boc. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Tyr schließen Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, Benzyl, Cbz, 4-Br-Cbz und 2,6-Dichlorbenzyl ein. Die bevorzugte Seitenketten-Schutzgruppe für Tyr ist 2,6-Dichlorbenzyl. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Asp schließen Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Methyl, Ethyl und Cyclohexyl ein. Die bevorzugte Seitenketten-Schutzgruppe für Asp ist Cyclohexyl. Die Seitenketten- Schutzgruppen für Thr und Ser schließen Acetyl, Benzoyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Cbz ein. Die bevorzugte Schutzgruppe für Thr und Ser ist Benzyl. Die Seitenketten-Schutzgruppen für Arg schließen Nitro, Tos, Cbz, Adamantyloxycarbonyl und Boc ein. Die bevorzugte Schutzgruppe für Arg ist Tos. Die Seitenketten-Aminogruppe von Lys kann durch Cbz, 2- Cl-Cbz, Tos oder Boc geschützt sein. Die 2-Cl-Cbz-Gruppe ist die bevorzugte Schutzgruppe für Lys.
Die gewählten Seitenketten-Schutzgruppen müssen während des Kuppelns unversehrt bleiben und dürfen während des Entschützens der Amino-Terminus-Schutzgruppe oder unter Kupplungsbedingungen nicht entfernt werden. Die Seitenketten-Schutzgruppen müssen auch nach Abschluß der Synthese unter Anwenden von Reaktionsbedingungen entfembar sein, die das fertige Polypeptid nicht verändern.
Die Festphasensynthese wird üblicherweise vom Carboxy-Terminus aus durch Kuppeln der α-amino-geschützten (Seitenketten-geschützten) Aminosäure an einen geeigneten festen Träger durchgeführt. Eine Esterbindung wird gebildet, wenn das Anbringen an ein Chlormethyl- oder Hydroxymethylharz durchgeführt wird, und das sich daraus ergebende Polypeptid besitzt eine freie Carboxylgruppe am C-Terminus. Wahlweise wird eine Amidbindung gebildet, wenn ein Benzhydrylamin- oder p-Methylbenzhydrylaminharz verwendet wird, und das sich daraus ergebende Polypeptid besitzt eine Carboxamidgruppe am C-Terminus. Diese Harze sind im Handel erhältlich und ihre Herstellung ist durch Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2. Ausg.), Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1984, beschrieben worden.
Die C-terminale Aminosäure, die nötigenfalls in der Seitenkette und an der α-Aminogruppe geschützt ist, wird mittels verschiedener Aktivierungsmittel einschließlich Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid und Carbonyldiimidazol an das Benzhydrylaminharz gebunden. Auf das Anbringen an den Harzträger folgend wird die α-Aminoschutzgruppe mittels Trifluoressigsäure (TFA) oder HCL in Dioxan bei einer Temperatur zwischen 0 und 25 ºC entfernt. Dimethylsulfoxid wird der TFA nach der Einführung von Methionin (Met) zum Unterdrücken einer möglichen S-Alkylierung zugesetzt. Nach Entfernen der α-Aminoschutzgruppe werden die restlichen geschützten Aminosäuren schrittweise in der erforderlichen Reihenfolge unter Erhalten der gewünschten Sequenz gekuppelt.
Verschiedene Aktivierungsmittel einschließlich DCC, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, Benzotriazol-1-yl-oxγ-tris-(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat (BOP) und DCC-Hydroxybenzotriazol (HOBT) können zu den Kupplungsreaktionen verwendet werden. Jede geschützte Aminosäure wird im Überschuß (> 2,0 Äquivalente) verwendet und die Kupplungen werden üblicherweise in N-Methylpyrrolidon (NMP) oder in DMF, CH&sub2;Cl&sub2; oder deren Gemischen durchgeführt. Das Ausmaß der Vollständigkeit der Kupplungsreaktion wird bei jedem Schritt zum Beispiel durch die von Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595 (1970) beschriebene Ninhydrinreaktion überwacht. In Fällen, wo eine unvollständige Kupplung gefunden wird, wird die Kupplungsreaktion wiederholt. Die Kupplungsreaktionen können mit im Handel erhältlichen Instrumenten automatisch durchgeführt werden.
Nach dem gesamten Aufbau des gewünschten Polypeptids wird das Polypeptidharz mit einem Reagenz wie etwa flüssiger HF 1-2 Stunden bei 0 ºC gespalten, was das Polypeptid vom Harz abspaltet und alle Seitenketten-Schutzgruppen entfernt. Ein Fänger wie etwa Anisol wird üblicherweise mit dem flüssigen HF verwendet, um zu verhindern, daß sich während der Spaltung durch Alkylieren der im Polypeptid vorliegenden Aminosäurereste Kationen bilden. Das Polypeptidharz kann gewünschtenfalls mit THF/Dithioethan vor der Spaltung entschützt werden.
Die Seitenkette-an-Seitenkette-Cyclisierung auf dem festen Träger erfordert die Verwendung eines orthogonalen Schutzschemas, welches die selektive Spaltung der Seitenketten-Funktionen saurer Aminosäuren (Z.B. Asp) und der basischen Aminosäuren (z.B. Lys) erlaubt. Die 9-Fluorenylmethyl-Schutzgruppe (Fm) für die Seitenkette von Asp und die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc) für die Seitenkette von Lys kann zu diesem Zweck verwendet werden. In diesen Fällen werden die Seitenketten- Schutzgruppen des Boc-geschützten Polypeptidharzes mit Piperidin in DMF selektiv entfernt. Die Cyclisierung wird auf dem festen Träger mittels verschiedener Aktivierungsmittel einschließlich DCC, DCC/HOBT oder BOP erreicht. Die HF-Reaktion wird an dem cyclisierten Polypeptidharz wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Die Methodik der rekombinanten DNA kann ebenfalls zum Herstellen der Polypeptide verwendet werden. Der bekannte genetische Kode, der gewünschtenfalls auf eine wirksamere Expression in einem vorgegebenen Wirtsorganismus zugeschnitten ist, kann zum Synthetisieren von Oligonukleotiden verwendet werden, welche die gewünschten Aminosäuresequenzen kodieren. Das Phosphoramiditfester Träger-Verfahren von Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)], das Verfahren von Yoo et al. [J. Biol. Chem. 764:17078 (1989)) oder andere wohlbekannte Verfahren können zu einer derartigen Synthese verwendet werden. Die sich daraus ergebenden Oligonukleotide können in einen geeigneten Vektor insertiert und in einem verträglichen Wirtsorganismus exprimiert werden.
Die Polypeptide der Erfindung können mittels HPLC, Gelfiltration, Ionenaustausch und Verteilungschromatographie, Gegenstromverteilung oder anderen bekannten Verfahren gereinigt werden.
Antikörper können gegen die Polypeptide der Erfindung mittels Standardverfahren hergestellt werden. Hierin verwendet bezieht sich das Wort "Antikörper" sowohl auf polyklonale als auch monoklonale Antikörper.
Die polyklonalen Antikörper können durch Immunisieren eines Wirtstieres, wie etwa ein Kaninchen, Ratte, Ziege, Schaf, Maus usw., mit einem der Polypeptide hergestellt werden. Vorzugsweise werden nach der ersten Injektion zum Erhöhen des Antikörpertiters eine oder mehr Verstärkungsinjektionen gegeben. Blut wird dem Tier anschließend entnommen und Serum wird durch Standardverfahren wie etwa enzymverknüpfter Immunsorbenstest (ELISA) unter Verwenden des Polypeptids als Antigen hergestellt und durchmustert.
Vorzugsweise wird die Immunogenität der Polypeptide durch Kombination mit einem Adjuvans und/oder durch Überführung in eine größere Form vor der Immunisierung erhöht.
Geeignete Adjuvantien für die Impfung von Tieren schließen Adjuvant 65 (das Erdnußöl, Mannidmonooleat und Aluminiummonostearat enthält), Freundsches komplettes oder inkomplettes Adjuvans, mineralische Gele wie etwa Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und Alaun, Tenside wie etwa Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N', N'-bis(2-hydroxymethyl)-propandiamin, Methoxyhexadecylglycerin und Pluronic-Polyole, Polyanionen wie etwa Pyran, Dextransulfat, Poly-IC, Polyacrylsäure und Carbopol, Peptide wie etwa Muramyldipeptid, Dimethylglycin und Tuftsin und Ölemulsionen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Polypeptide können auch auf den Einbau in Liposomen oder andere Mikroträger folgend verabreicht werden.
Die Immunogenität der Polypeptide kann auch durch Vernetzen oder durch Kuppeln an ein immunogenes Trägermolekül (d.h. ein Makromolekül mit der Eigenschaft des unabhängigen Auslösens einer immunologischen Antwort in einem Wirtstier, an welches die Polypeptide der Erfindung kovalent gebunden werden können) verstärkt werden. Das Vernetzen oder die Konjugation mit einem Trägermolekül kann erforderlich sein, da kleine Polypeptide manchmal als Haptene wirken (Moleküle, die an einen Antikörper spezifisch binden können, aber keine Antikörperproduktion auslösen können, d.h. sie sind nicht immunogen). Die Konjugation derartiger Polypeptide an ein immunogenes Trägermolekül macht die Fragmente durch das, was gemeinhin als "Trägereffekt" bekannt ist, immunogen.
Geeignete Trägermoleküle schließen z.B. Proteine und natürliche oder synthetische polymere Verbindungen, wie etwa Polypeptide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide usw. ein. Ein nützlicher Träger ist ein Quil A. genanntes Glykosid, das von Morein et al., Nature 308:457 (1984) beschrieben worden ist. Proteinträgermoleküle sind besonders bevorzugt, welche Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Säugerserumproteine, wie etwa Humanoder Rindergammaglobulin, Human-, Rinder- oder Kaninchenserumalbumin oder methylierte oder andere Derivate derartiger Proteine einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Andere Proteinträger sind für den Fachmann offensichtlich. Vorzugsweise aber nicht notwendigerweise ist der Proteinträger gegenüber dem Wirtstier, in dem Antikörper gegen die Polypeptide ausgelöst werden sollen, fremd.
Das kovalente Kuppeln an das Trägermolekül kann durch Verwenden in der Technik wohlbekannter Verfahren, deren genaue Wahl durch die Natur des verwendeten Trägermoleküls bestimmt wird, durchgeführt werden. Wenn das immunogene Trägermolekül ein Protein ist, können die Polypeptide der Erfindung z.B. mittels wasserlöslicher Carbodiimide wie etwa Dicyclohexylcarbodiimid oder Glutaraldehyd gekuppelt werden.
Kupplungsmittel wie diese können auch zum Vernetzen der Polypeptide mit sich selbst ohne die Verwendung eines getrennten Trägermoleküls verwendet werden. Ein derartiges Vernetzen zu Aggregaten kann auch die Immunogenität erhöhen.
Aus auf diese Weise immunisierten Tieren hergestelltes Serum kann direkt verwendet werden. Wahlweise kann die IgG-Fraktion vom Serum durch Standardverfahren wie etwa Plasmaphorese oder Adsorptionschromatographie mittels IgG-spezifischer Adsorbentien wie etwa immobilisiertem Protein A abgetrennt werden.
Monoklonale Antikörper können mittels z.B. durch Kohler et al. [Nature 256:495 (1975); Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)] beschriebener Standardverfahren hergestellt werden. Im wesentlichen wird ein Tier wie vorstehend beschrieben unter Erzeugen Antikörper-ausscheidender somatischer Zellen immunisiert. Diese Zellen werden anschließend dem immunisierten Tier zur Fusion mit Myelomzellen entnommen.
Somatische Zellen mit der Fähigkeit zum Erzeugen von Antikörpern, insbesondere B-Zellen, sind zur Fusion mit einer Myelomzellinie geeignet. Diese somatischen Zellen können aus den Lymphknoten, Milzen und dem peripheren Blut sensibilisierter Tiere stammen.
Spezialisierte Myelomzellinien sind aus Lymphozytentumoren zur Verwendung in Hybridom-erzeugenden Fusionsverfahren entwickelt worden [Kohler und Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Shulman et al., Nature 276:269 (1978); Volk et al., J. Virol. 42:220 (1982)]. Diese Zellinien sind aus wenigstens drei Gründen entwickelt worden. Der erste ist das Erleichtern der Selektion fusionierter Hybridome aus unfusionierten und sich in ähnlicher Weise unbestimmt selbstvermehrenden Myelomzellen. Üblicherweise wird dies durch Verwendung von Myelomen mit Enzymmängeln bewerkstelligt, welche sie zum Wachsen in gewissen selektiven Medien, welche das Wachstum von Hybridomen unterstützen, unfähig machen. Der zweite Grund rührt aus der lymphozytischen Tumorzellen innewohnenden Fähigkeit her, ihre eigenen Antikörper zu produzieren. Der Zweck des Verwendens monoklonaler Techniken ist, fusionierte Hybridzellinien mit unbegrenzter Lebensdauer zu erhalten, die den gewünschten einzelnen Antikörper unter der genetischen Steuerung des somatischen Zellbestandteils des Hybridoms produzieren. Zum Ausschalten der Produktion von Tumorzellenantikörpern durch die Hybridome werden Myelomzellinien verwendet, die keine leichten oder schweren Immunglobulinketten produzieren können oder deren Antikörperausscheidungsmechanismus mangelhaft ist. Ein dritter Grund zur Auswahl dieser Zellinien ist ihre Eignung zur und Wirksamkeit bei der Fusion.
Viele Myelomzellinien können zur Herstellung fusionierter Zellhybride verwendet werden, einschließlich z.B. P3X63-Ag8, P3/NS1- Ag4-1 (NS-1), Sp2/0-Ag14 und S194/5.XXO.Bu.1. Die P3X63-Ag8 und NS-1-Zellinien sind durch Kohler und Milstein [Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)] beschrieben worden. Shulman et al. [Nature 276:269 (1978)] entwickelten die Sp2/0-Ag14-Myelomlinie. Die S194/5. XXO.Bu.1-Linie wurde von Trowbridge [J. Exp. Med. 148:313 (1979)] mitgeteilt.
Verfahren zum Erzeugen von Hybriden Antikörper-produzierender Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen üblicherweise das Mischen somatischer Zellen mit Myelomzellen im Verhältnis 10:1 (obschon das Verhältnis von etwa 20:1 bis etwa 1:1 schwanken kann) in Anwesenheit eines Mittels oder von Mitteln (chemisch, viral oder elektrisch), welche die Fusion von Zellmembranen fördern. Fusionsverfahren sind durch Kohler und Milstein, oben, Gefter et al. [Somatic Cell Genet. 3:231 (1977)] und Volk et al. [J. Virol. 42:220 (1982)] beschrieben worden. Die von diesen Forschern verwendeten fusionsfördernden Mittel waren das Sendai-Virus und Polyethylenglykol (PEG).
Da Fusionsverfahren lebensfähige Hybride mit sehr geringer Häufigkeit erzeugen (wenn z.B. Milzzellen als Quelle somatischer Zellen verwendet werden, wird nur ein Hybrid auf ungefähr 1 x 10&sup5; Milzzellen erhalten), ist es wesentlich, ein Mittel zum Selektieren der fusionierten Zellhybride von den restlichen unfusionierten Zellen, insbesondere den unfusionierten Myelomzellen zu besitzen. Ein Mittel zum Nachweisen der gewünschten Antikörperproduzierenden Hybridome unter anderen sich daraus ergebenden fusionierten Zellhybriden ist ebenfalls notwendig.
Im allgemeinen wird die Selektion fusionierter Zellhybride durch Kultivieren der Zellen in Medien bewerkstelligt, die das Wachstum von Hybridomen unterstützen, aber das Wachstum der unfusionierten Myelomzellen verhindern, die sich normalerweise unbegrenzt weiter teilen würden. Die bei der Fusion verwendeten somatischen Zellen behalten bei der in-vitro-Kultur keine Langzeit-Lebensfähigkeit und stellen demzufolge kein Problem dar. In dem Beispiel der vorliegenden Erfindung wurden Myelomzellen verwendet, denen Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase fehlt (HPRT-negativ). Die Selektion gegen diese Zellen wird in Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin-Medium (HAT) durchgeführt, einem Medium, in dem die fusionierten Zellhybride aufgrund des HPRT- positiven Genotyps der Milzzellen überleben. Die Verwendung von Myelomzellen mit unterschiedlichen genetischen Mängeln (Wirkstoffempfindlichkeiten usw.), gegen die in Medien selektiert werden kann, die das Wachstum genotypisch kompetenter Hybride unterstützen, ist ebenfalls möglich.
Mehrere Wochen sind zum selektiven Kultivieren der fusionierten Zellhybride erforderlich. Früh in diesem Zeitraum ist es nötig, diejenigen Hybride zu bestimmen, die den gewünschten Antikörper erzeugen, so daß sie darauffolgend kloniert und vermehrt werden können. Im allgemeinen produzieren etwa 10% der erhaltenen Hybride den gewünschten Antikörper, obschon ein Bereich von etwa 1 bis etwa 30% nicht ungewöhnlich ist. Der Nachweis Antikörperproduzierender Hybride kann durch irgendeines von mehreren Standardtestverfahren einschließlich eines enzymverknüpften Immuntests und Radioimmuntesttechniken erreicht werden, welche in der Literatur beschrieben worden sind [siehe z.B. Kennet et al. (Herausgeber), Monodonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, 5. 376-384, Plenum Press, New York (1980)].
Sobald die gewünschten fusionierten Zellhybride selektiert worden und in einzelne Antikörper-produzierende Zellinien kloniert worden sind, kann jede Zellinie auf eine von zwei Standardweisen vermehrt werden. Eine Suspension der Hybridomzellen kann in ein gewebeverträgliches Tier injiziert werden. Das Tier mit der Injektion entwickelt darauf Tumore, die den spezifischen monoklonalen Antikörper ausscheiden, der durch das fusionierte Zellhybrid erzeugt wurde. Körperflüssigkeiten des Tieres, wie etwa Serum oder Aszitesflüssigkeit, können zum Liefern monoklonaler Antikörper in hoher Konzentration punktiert werden. Wahlweise können die einzelnen Zellinien in vitro in Laboratoriumskulturgefäßen vermehrt werden. Das hohe Konzentrationen eines einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörpers enthaltende Kulturmedium kann durch Dekantieren, Filtration oder Zentrifugieren abgeerntet werden.
Die anti-idiotypischen Antikörper der Erfindung sind gegen Antikörper gerichtet, die für die in einigen Polypeptiden der Erfindung vorliegenden antigenen γ-Interferon-Determinanten spezifisch sind. Derartige anti-idiotypische Antikörper ahmen die ursprünglichen antigenen Determinanten nach oder wirken wie sie (siehe z.B. US-Patent Nr. 4 731 237 an Reagan et al.). Wie von γ-Interferon selbst wird vermutet, daß diese Antikörper spezifisch und direkt an γ-Interferonrezeptoren binden.
Derartige anti-idiotypische Antikörper werden durch Impfen eines Tieres mit einem Antikörper (polyklonal oder monoklonal) gegen ein Polypeptid der Erfindung hergestellt. Sie können als ganzes polyklonales Antiserum oder als eine IgG- oder andere Fraktion davon oder als durch klonierte Hybridome erzeugte monoklonale Antikörper wie vorstehend beschrieben isoliert werden.
Die antagonistischen Wirkungen der Polypeptide und Antikörper dieser Erfindung können leicht durch Routineversuche mittels des nachstehend beschriebenen Daudi-Zellen-Radioligandenrezeptor- Testsystems gezeigt werden.
Rekombinantes Human-γ-Interferon, das in diesem System verwendet werden kann, kann durch rekombinante Standardverfahren hergestellt werden und ist auch im Handel erhältlich, z.B. von Genzyme Corp., Boston, MA. Ein derartiges Interferon kann leicht mit Iod-125 mittels z.B. dem Lactoperoxidaseverfahren [David et al., Biochemistry 13:1014 (1974)] oder dem Verfahren von Bolton et al. [Biochem. J. 133:529 (1973)] markiert werden.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch das Binden von Fragmenten der vorgenannten polyklonalen und monoklonalen Antikörper, wie etwa Fab, F(ab')2' Fv-Fragmente usw. Derartige Fragmente werden durch herkömmliche Techniken erhalten, welche die Papain- oder Pepsinverdauung der unversehrten Antikörper einschließen, darauf aber nicht beschränkt sind. Selbstverständlich kann DNA, die aus Hybridomen hergestellt wurde, welche die monoklonalen Antikörper der Erfindung ausscheiden, mittels bekannter Techniken rekombinanter DNA unter Erzeugen chimärer Antikörper oder Fragmenten davon verändert werden. Die Antikörper können auch, wie von Verhoeyen et al. [Science 239:1534 (1988)], Reichmann et al. [Nature 332:323 (1988)] und Jones et al. [Nature 321:522 (1986)] beschrieben, "humanisiert" werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können hergestellt werden, die wirksame Mengen eines oder mehrerer Polypeptide oder Antikörper der Erfindung und einen physiologisch annehmbaren Träger enthalten. Derartige Träger sind dem Fachmann wohlbekannt. Die Polypeptide und Proteine können direkt oder in Form einer Zusammensetzung einem z.B. von einer Autoimmunkrankheit, MS oder einer anderen, durch γ-Interferon vermittelten Erkrankung befallenen menschlichen Patienten verabreicht werden.
Die Bestimmung der richtigen Dosierung eines Polypeptids oder Antikörpers der Erfindung für eine besondere Situation fällt unter das Fachwissen. Im allgemeinen wird die Behandlung mit kleineren Dosierungen begonnen, die geringer als das Optimum sind. Danach wird die Dosierung in kleinen Schritten erhöht, bis die unter den Umständen optimale Wirkung erreicht worden ist. Aus Zweckmäßigkeitsgründen kann die tägliche Gesamtdosierung gewünschtenfalls aufgeteilt und während des Tages in Portionen verabreicht werden.
Die Menge und Häufigkeit der Verabreichung der Polypeptide und Proteine der Erfindung und deren pharmazeutisch annehmbarer Salze wird entsprechend der Beurteilung des beauf sichtigenden Arztes geregelt, wobei solche Faktoren wie Alter, Zustand und Größe des Patienten und die Schwere des (der) zu behandelnden Symptoms (Symptome) in Betracht gezogen werden.

BEISPIELE

So lange nicht anders angegeben beruhen die für Feststoffe in festen Gemischen, Flüssigkeiten in Flüssigkeiten und Feststoffe in Flüssigkeiten angegebenen Prozentwerte auf Gew./Gew., Vol./- Vol. beziehungsweise Gew./Vol.

Proteinanalyse

Proteinbestimmungen wurden durch das Verfahren von Lowry et al. [J. Biol. Chem. 193:265 (1951)] mittels Rinderserumalbumin als Standard durchgeführt.
Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die verschiedenen Regionen reifen Human-γ-Interferons A entsprechen, wurden mittels des Festphasenverfahrens von Merrifield [J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)] synthetisiert. Die t-Butyloxycarbonylamino-Schutzgruppe, symmetrische Anhydride und ein Applied Biosystems Modell 430A Festphasen-Peptidsynthetisierer wurden eingesetzt. Auf das Entfernen der Schutzgruppen folgend wurden die Polypeptide vom Harz mit Fluorwasserstoff abgespalten. Die rohen, nach der Spaltung vom Harz isolierten Polypeptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC in einer Rainin Dynamax C-8-Säule (12 u Teilchengröße, 300 Å Porengröße, 4,6 x 250 mm) analysiert.
Auf diese Weise wurden die folgenden Polypeptide hergestellt:
Die Sequenz jedes vorstehend dargestellten Polypeptids wird in Klammern von den entsprechenden Human-γ-Interferon A-Resten (siehe SEQ ID NO:1), auf welchen die Sequenzen beruht, und der entsprechenden SEQ ID NO gefolgt, die dem Polypetid in der Sequenzliste zugeordnet ist. Es ist anzumerken, daß die Sequenzen in einigen Fällen zusätzliche Aminosäurereste wie angegeben enthalten.
Die rekombinanten Human-γ-Interferone A und D wurden aus transformierter E. coli, im wesentlichen wie im US-Patent Nr. 4 751 078 beschrieben, hergestellt und gereinigt.

Herstellung von Antiseren

Anti-Polvpeptid-Antikörper

Volumina von fünfhundert ul wäßriger Lösungen, pH 7,1, die 0,5 bis 1,0 mg der verschiedenen Polypeptide enthielten, wurden mit gleichen Volumina Freundschem komplettem Adjuvans emulgiert und intradermal (0,1 ml je Injektionsstelle) New Zealand White- Kaninchen (Hazelton Labs.) injiziert. Verstärkungsinjektionen, die etwa 0,25 bis 0,5 mg Polypeptid in Freundschem inkomplettem Adjuvans enthielten, wurden in Abständen von ungefähr 4 Wochen nach dem durch ELISA-Analysen von Serumproben mittels der Polypeptide und γ-Interferon als Antigene beurteilten Bedarf verabreicht.
Antikörper gegen das diskontinuierliche Polypeptid wurden gewerblich durch Adsorption an eine Protein A-Sepharose -Säule gereinigt, die mit 1,5 M Glycinpuffer, pH 8,9, äquilibriert war. Die Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese [Laemmli, Nature 227:680 (1970)] zeigte, daß die dadurch erhaltene Antikörperzubereitung 95% reines IgG war.

Anti-idiotypische Antikörper

Die gereinigten Kaninchen-IgG-Antikörper gegen das diskontinuierliche Polypeptid wurden zum Immunisieren von Balb/c-Mäusen (Charles River Labs.) verwendet. Die Mäuse wurden mit 0,5 ml Pristan (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 6 Tage vor der Immunisierung auf demselben Weg mit 87 ug IgG-Protein in 125 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 125 ul Freundschem kompletten Adjuvans intraperitoneal anfangsimmunisiert. Verstärkungen mit ungefähr 50 ug Protein in 50% Freundschem inkomplettem Adjuvans wurden in Abständen von ungefähr 2-3 Wochen nach auf dem auf ELISA-Analysen beruhenden Bedarf gegeben.
Die ELISA-Analyse der Kaninchen-Antiseren wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Eine 96-Näpfchen-Mikrotiterplatte (Nunc) wurde mit 0,25 ug Antigen in 100 ul je Näpfchen 1 Stunde bei Raumtemperatur überzogen. Die Platte wurde 5 mal mit trisgepufferter Kochsalzlösung (TBS), ph 7,5, gewaschen, die 0,05% Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) enthielt. Die Platte wurde 1 Stunde mit 1% Rinderserumalbumin blockiert, 5 mal mit TBS gewaschen und erneut 5 Mal mit TBS gewaschen.
Die Näpfchen der gewaschenen Platte wurden mit den zu testenden Antiseren 1 Stunde überzogen, 5 mal mit TBS gewaschen und mit 2,5 mg Meerrettichperoxidase-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG überzogen. Auf 1 Stunde Inkubation folgend wurde die Platte 5 mal mit TBS gewaschen und durch Zusetzen von entweder 2,2'- Azino-bis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) oder 3,3', 5,5' -Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid zu jedem Näpfchen entwickelt. Die Farbentwicklung wurde nach 10 Minuten durch Zusetzen einer Schwefelsäure (für TMB) oder Natriumdodecylsulfat (für ABTS) enthaltenden Lösung abgebrochen und die Proben wurden bei 405 und 450 nm ABTS beziehungsweise TMB mittels eines Molecular Devices ELISA-Lesegeräts abgelesen.
Die ELISA-Analyse von Mausserum wurde auf im wesentlichen dieselbe Weise ausgeführt, außer daß Peroxidase-markiertes Ziegeanti-Maus-IgG als Nachweisreagenz verwendet wurde.

Markieren von rekombinantem Human-γ-Interferon

Rekombinantes Human-γ-Interferon D wurde aus einem E. coli-Lysat, im wesentlichen wie im US-Patent Nr. 4 751 078 beschrieben bis zur Homogenität gereinigt, obschon ähnliches Interferon aus Quellen wie etwa der Genzyme Corp., Boston, MA, im Handel erhältlich ist.
Das Interferon wurde mit Iod-125 im wesentlichen wie durch Bolton et al. [Biochem. J. 133:529 (1973)] mittels ¹²&sup5;I, Bolton- Hunter-Reagenz von New England Nuclear, Boston, MA, markiert. Kurz gesagt, wurden 2 mCi (2200 Ci/mMol) Bolton-Hunter-Reagenz (New England Nudear, Boston, MA) in wasserfreiem Benzol durch einen gelinden Stickstoffstrom getrocknet. Fünf Mikrogramm in 50 ul 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gelöstes γ-Interferon wurden dem Reaktionsgefäß zugesetzt. Man ließ die Reaktion 2 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen, wonach unumgesetztes Bolton-Hunter-Reagenz mit 50 ul 1 M Glycin in 50 mM Natriumphosphat, ph 8,0, unwirksam gemacht wurde.
Das radioiodierte Protein wurde von unumgesetztem Markierungsmittel durch Gelfiltration in einer 10 ml-PD-10-Sephadex G-25 - Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) abgetrennt, die mit 0,05 M 0,5% Gelatine enthaltendem Natriumphosphatpuffer, ph 7,2, äquilibriert war. Derselbe Puffer wurde zum Entwickeln der Säule verwendet. Ein-ml-Fraktionen wurden gesammelt und aliquote Mengen wurden in einem Gammazähler gezählt. Markiertes Protein eluierte in dem Säulentotvolumen (3-4 ml), während unumgesetztes Reagenz später eluierte (6-8 ml).
Das markierte Interferon besaß eine spezifische Radioaktivität von 50 bis 200 uC/ug. Die Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von der Autoradiographie zeigte, daß das markierte Protein als einzelne Bande mit einer Mobilität wanderte, die im wesentlichen mit derjenigen von unmarkiertem γ-Interferon vergleichbar war. Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem

Human-γ-Interferon D an Daudi-Zellen

Daudi-Zellen-Vorratskulturen wurden in RPMI 1640-Medium gezüchtet, das 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 2 mM Glutamin und 20% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum enthielt. Die Zellen wurden in T-75-Kolben (50 ml/Kolben) kultiviert, die zu 4 x 10&sup5; Zellen/ml eingesät waren und in 2- Tagesintervallen geteilt wurden (oder zu 2,5 x 10&sup5; Zellen/ml für ein 3-Tageswachstum über Wochenenden eingesät wurden). Die Kulturen wurden während des Wachstums bei 4ºC gehalten.
Die Zellen wurden für den Test durch 3 Minuten Zentrifugieren bei 4ºC und 300 x g geerntet. Das verbrauchte Kulturmedium wurde verworfen und die Zellpellets wurden in eiskaltem Bindungspuffer (RPMI 1640, 10% hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum, 15 mM HEPES, 0,02% Natriumazid) suspendiert. Die Zellen wurden durch ein Hämozytometer gezählt, die Lebensfähigkeit wurde durch den prozentualen Trypanblau-Ausschluß [Animal Cell Culture: A Practical Approach, 1986, R.I. Freshney (Hrsg.), IRL Press, LTD, S. 76-77] bestätigt und die Zellen wurden zu 2 x 106 Zellen/ml in dem kalten Bindungspuffer suspendiert.
Bindungstests wurden an Polypeptiden und Kaninchen-Antiseren in 1 ml-Volumina mittels konischer Sarstedt-Schraubdeckelröhrchen von 1,5 ml ausgeführt. Alle Bestandteile wurden in dem kalten Bindungspuffer verdünnt und in der folgenden Reihenfolge zugesetzt:
450 ul unbekannte Probe (oder nur Kontrollbindungspuffer)
50 ul ¹²&sup5;I-markiertes γ-Interferon D (10&sup5; cpm)
500 ul Zellsuspension (10&sup6; lebensfähige Zellen)
Außerdem wurden einigen Kontrollröhrchen 10 ul einer unmarkierten, 1 ug Protein enthaltenden γ-Interferon-A-Lösung zum Bestimmen des Wertes für das nicht-spezifische Binden durch das markierte Interferon zugesetzt. Diese Radioaktivitätsmenge wurde von allen Radioaktivitätsmessungen abgezogen.
Nachdem alle Bestandteile jedem Röhrchen zugesetzt worden waren, wurden die Röhrchen verschlossen, zum Befeuchten der gesamten inneren Oberflächen kurz umgedreht und 2 Stunden in einem kalten Raum auf einem Adams Nutator -Schütteltisch inkubiert. Auf diese Inkubation folgend wurde die überstehende Flüssigkeit aus jedem Röhrchen abgesaugt, wobei man Vorsicht walten ließ, keine Zellen zu entnehmen.
Einhundert ul eiskalter Bindungspuffer wurden jedem Röhrchen zugesetzt und die Pellets wurden mittels eines 200 ul-Gilson Pipetman suspendiert und sorgfältig oben auf 400 ul eiskalte 5%ige Sucrose in PBS in konischen Sarstedt-Röhren von 600 ul geschichtet, welche in Aluminiumzentrifugiergestellen gehalten wurden. Die Proben wurden 5 Minuten bei 4ºC und 1000 x g zentrifugiert.
Die überstehenden Flüssigkeiten wurden sorgfältig abgesaugt, um einen Zellverlust zu vermeiden, und die Röhrchen wurden in 12 x 75 mm-Röhrchen zur Verwendung im Gammazähler überführt.

Bindungshemmung durch Polypeptide

Die Polypeptide mit durch SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 definierten Aminosäuresequenzen wurden in dem Rezeptorbindungstest wie vorstehend beschrieben mit den in Fig. 1 dargestellten Ergebnissen getestet.
Daraus ist zu ersehen, daß sowohl das durch SEQ ID NO:2 definierte Polypeptid (Tafel A) als auch das andere Polypeptid (Tafel B) das Binden von ¹²&sup5;I-markiertem Human-γ-Interferon D an Rezeptoren auf Daudi-Zellen hemmten. Das erste Polypeptid war der stärkere kompetitive Hemmer, indem es Bindungshemmungen von etwa 15 und 35% bei Konzentrationen von 0,145 beziehungsweise 1,45 uM zeigte.

Bindungshemmung durch Antikörper

Polyklonale Kaninchen-Antiseren, die gegen alle vorstehend angeführten Polypeptide hergestellt wurden, wurden auf die Fähigkeit zum Binden an die Polypeptide und an Human-γ-Interferon A und zum Hemmen des spezifischen Bindens von Human-γ-Interferon D an Daudi-Zellen mit den in Tabelle I dargestellten Ergebnissen getestet. Tabelle I Charakterisierung der Antiseren Polypeptid SEQ ID NO. % ¹²&sup5;I-Interferon-Bindungshemmung a spezifisches Binden b an Polypeptid γ-Interferon A a Die prozentualen Bindungshemmungen sind als Prozentwerte der durch ¹²&sup5;I-markiertes Human-γ-Interferon D in Abwesenheit irgendeines Hemmers gezeigten spezifischen Bindung ausgedrückt. b Positive Bindungsantworten (+) wurden als ELISA-Ergebnisse definiert, bei denen Antworten um mehr als 0,15 optischen Dichteeinheiten (O.D.) über dem Hintergrund lagen. Die Bezeichnung ± bezeichnet Antworten, die zwischen 0,0 und 0,15 O.D.-Einheiten über dem Hintergrund lagen.
Die Daten von Tabelle I zeigen, daß Antikörper gegen Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die den Sequenzen der Reste 7-19 (mit einem angefügten N-terminalen Asparaginatrest), 123-137 und 5- 21/132-138 (mit 3 verbrückenden Glycinresten) von reifem Human- γ-Interferon A (Polypeptid SEQ ID NO. 5, 7 beziehungsweise 2) entsprechen, alle Antagonisten des spezifischen Bindens des markierten Interferons an Daudi-Zellrezeptoren waren. Alle drei dieser Antiseren enthielten Antikörper, die, wie durch ELISA gezeigt wurde, spezifisch an beide Polypeptide, gegen die sie hergestellt wurden, und an γ-Interferon A banden. Keine Antikörper wurden gegen das 132-137-Polypeptid (Polypeptid SEQ ID NO:3) produziert; möglicherweise war es zu klein, um unkonjugiert zu einem Trägermolekül immunogen zu sein.
Kaninchen-Präimmunserum war in allen Tests vollständig unreaktiv. Wie in Fig. 2 gezeigt, hob Antiserum gegen das durch SEQ ID NO:2 definierte Polypeptid das spezifische Binden von markiertem γ-Interferon D an Daudi-Zellen in Konzentrationen über etwa 25 ul Serum je ml Inkubationsgemisch nahezu vollständig auf. Etwa 50% Bindungshemmung wurden bei einer Konzentration dieses Antiserums von nur 1 ul/ml beobachtet.
Wie in Tabelle II dargestellt, zeigte das mittels der IgG-Antikörperfraktion gegen das durch SEQ ID NO:2 definierte Polypeptid hergestellte anti-idiotypische Antiserum ebenfalls eine bedeutende Rezeptorbindungshemmung. Tabelle II Hemmung des Bindens von ¹²&sup5;I-markiertem Human-γ-Interferon an Daudi-Zellen durch anti-idiotypisches Antiserum Blutung a % Hemmung des spezifischen Bindens b erste zweite a Die Daten zeigen die Ergebnisse, die mittels Antiserum erhalten wurden, das wie vorstehend beschrieben immunisierten Mäusen 16 Wochen nach der ersten Injektion (erste Blutung) und 17 Wochen danach (zweite Blutung) erhalten wurden. Die zweiten Blutungen der drei Mäuse wurden unter Ergeben der gezeigten Ergebnisse zusammengefaßt. b Die Ergebnisse wurden unter Verwenden von Kontroll-Präimmunserum normalisiert
Die in Tabelle II dargestellten Daten sind das Ergebnis des im wesentlichen vorstehend beschriebenen Inkubierens von 50-100 ul Mausserum mit 10&sup5; cpm ¹²&sup5;I-markiertem γ-Interferon und 1,5 x 10&sup6; lebensfähigen Daudi-Zellen. Die Daten zeigen, daß sich die Hemmfähigkeit des anti-idiotypischen Antiserums erhöhte, als der Verlauf der Immunisierung voranschritt (d.h. die zweite Blutung war stärker als die erste).

Hemmung der biologischen

Wirkungen von γ-Interferon

Um zu zeigen, daß die Polypeptide der Erfindung auch biologische Wirkungen erzeugen, wurde die Wirkung eines repräsentativen Polypeptids in einem auf Interferon ansprechenden biologischen System beobachtet.

Reagenzien und Zellen

Rekombinantes Human-γ-Interferon D mit einer spezifischen Aktivität von etwa 5 x 10&sup6; Einheiten/mg wurde aus transformierter E. coli mittels Standardverfahren hergestellt.
Aus einem menschlichen Adenokarzinom stammende COLO-205-Zellen (ATCC CLL 222) wurden zum Messen der Induktion durch das Interferon der Klasse-II-Hauptgewebeverträglichkeitsantigene (HLA-DR) verwendet. Die Anwesenheit der Antigene auf den Zellen wurde durch einen enzymverknüpften Immunsorbenstest (ELISA) mittels eines monoklonalen anti-HLA-DR-Antikörpers (Becton-Dickinson Katalognr. 7360) in Verbindung mit einem Peroxid-markierten Ziege-anti-Maus-IgG nachgewiesen. Die mittels 2,2'-Azino-bis(3ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS; Kirkegaard & Perry Labs., Inc., Gaithersburg, MD) erzeugte Färbung wurde spektrophotometrisch bei 405 nm gemessen.

Hemmung der HLA-DR-Induktion

Der Bio-ELISA-Test auf die HLA-DR-Induktion durch γ-Interferon wurde im wesentlichen wie von Gibson et al. [J. Immunol. Meth. 125:103 (1989) beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden COLO-205-Zellen in T-75-Kolben in RPMI 1640-Medium, das 10% fetales Kälberserum (Kulturmedium) enthielt, bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt und in 96- Näpfchen-Gewebekulturplatten in einer Dichte von wenigstens 10&sup5; Zellen je Näpfchen in 0,1 ml Kulturmedium eingesät. Man ließ die Zellen durch Inkubation über Nacht bei 37 ºC in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; an die Näpfchen anhaften.
Kontrollkulturmedium und verschiedene Verdünnungen in Kulturmedium des durch SEQ ID NO:10 definierten Polypeptids in Anwesenheit einer festen Konzentration von 150 pM des Interferons wurden in einem Volumen von 0,1 ml den Näpfchen zugesetzt und eine Stunde bei 37 ºC inkubiert.
Auf diese Inkubation folgend wurde das Medium aus jedem Näpfchen entfernt und die Näpfchen wurden dreimal mit Kulturmedium gewaschen. Aliquote Mengen (0,1 ml) Kulturmedium wurden den Näpfchen zugesetzt und die Platten wurden 48 Stunden bei 37 ºC inkubiert, um die Induktion der HLA-DR-Antigenexpression durch an die Zellen gebundenes Interferon zu erlauben.
Die Näpfchen wurden mit 0,2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 0,02 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,4) gewaschen und anschließend zwei Minuten mit eiskalten wasserfreiem Ethylalkohol gewaschen. Der Alkohol wurde entfernt und die Zellen wurden einmal mit 0,2 ml PBS gewaschen. Fünfzig Mikrohter einer 1:50-Verdünnung des monoklonalen Maus-anti-HLA-DR- Antikörpers in 0,5% Rinderserumalbumin enthaltendem PBS wurden anschließend jedem Näpfchen zugesetzt und die Platten wurden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Überschüssiges Reagenz wurde durch dreimal Waschen der Näpfchen mit 0,2 ml PBS entfernt, wonach 0,1 ml einer 1:5.000-Verdünnung von Peroxidase-markiertem Ziege-anti-Maus-IgG jedem Näpfchen zugesetzt wurden. Die Platten wurden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimal Waschen jeden Näpfchens mit PBS wie zuvor, entwickelte sich durch den Zusatz von ABTS über 5-10 Minuten bei Raumtemperatur eine Farbe. Die Absorption wurde mittels eines ELISA-Plattenlesegeräts bei 405 nm gemessen.
Die Ergebnisse eines Tests zum Messen der Hemmung der γ-Interferon-induzierten HLA-DR-Expression in COLO-205-Zellen durch das durch SEQ ID NO:10 definierte Polypeptid werden in Fig. 3 gezeigt. Dort ist zu erkennen, daß zunehmende Polypeptidkonzentrationen von 7 bis 100 uM eine zunehmend stärkere Hemmung der Antigeninduktion durch die konstante Interferonkonzentration von 150 pM erzeugte.
Wie für den Fachmann offensichtlich, können viele Änderungen und Variationen dieser Erfindung durchgeführt werden, ohne von ihrem Geist und Umfang abzuweichen. Die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen werden nur als Beispiel dargeboten und die Erfindung soll nur durch den Wortlaut der angefügten Ansprüche begrenzt werden.

Claims

1. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch

definiert ist.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:

(a) einen Antagonisten von Human-γ-Interferon, der ein Polypeptid umfaßt, das bis zu 50 Aminosäurereste enthält und eines oder mehrere der Polypeptide gemäß Anspruch 1 umfaßt, und

(b) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

3. Verwendung eines Polypeptids, das bis zu 50 Aminosäurereste enthält und eines oder mehrere der Polypeptide gemäß Anspruch 1 umfaßt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die durch γ-Interferon vermittelt werden.

4. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die γ-Interferon neutralisieren, umfassend:

Immunisieren eines Wirtstieres mit einem Polypeptid, das bis zu 50 Aminosäurereste enthält und eines oder mehrere der Polypeptide gemäß Anspruch 1 umfaßt, unter Bedingungen, bei denen somatische Zellen des Tieres Antikörper gegen das Polypeptid produzieren, sowie

Isolieren der Antikörper.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die isolierten Antikörper polyklonale Antikörper sind.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper sind.

7. Verfahren zur Herstellung anti-idiotypischer Antikörper gegen Antikörper, die γ-Interferon neutralisieren, umfassend:

Immunisieren eines Wirtstieres mit einem Antikörper, der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 4, 5 oder 6 hergestellt wurde, unter Bedingungen, bei denen somatische Zellen des Tieres anti-idiotypische Antikörper gegen den Antikörper produzieren, sowie

Isolieren der anti-idiotypischen Antikörper.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die anti-idiotypischen Antikörper polyklonale Antikörper sind.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die anti-idiotypischen Antikörper monoklonale Antikörper sind.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend:

(a) Antikörper, die nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4-9 hergestellt wurden, und

(b) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

11. Verwendung eines Antikörpers, der gemäß einem der Ansprüche 4-9 hergestellt wurde, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, die durch γ-Interferon vermittelt werden.