BG66458B1

BG66458B1 - Средство за конкурентно инхибиране на ендогенен гама интерферон

Info

Publication number: BG66458B1
Application number: BG109087A
Authority: BG
Inventors: Иван Иванов; Rolf GUNTER; Румен Цанев; Hans-Guenther Grigoleit; Геновева НАЧЕВА
Original assignee: Иван Иванов; Hans-Guenther Grigoleit; Геновева НАЧЕВА; Румен Цанев; Rolf GUNTER
Priority date: 2005-03-21
Filing date: 2005-03-21
Publication date: 2014-10-31
Also published as: US20100158865A1; US20110286966A1; US7973133B2; US20090208452A1; EP1866334A1; EP1866334B1; WO2006099701A1; BG109087A; US20110218325A1

Abstract

Изобретението се отнася до средство за конкурентно инхибиране на ендогенния човешки IFN-гама, по-специално при автоимунни заболявания. По своята същност то представлява неактивни аналози на човешкия IFN-гама със запазен афинитет към гама-интерфероновия рецептор.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до средство за конкурентно инхибиране на ендогенен гама интерферон и по-специално при автоимунни заболявания.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е, че поради съчетание на недостатъчно изяснени генетични фактори и въздействия на окръжаващата среда, при около два процента от хората се развиват различни автоимунни заболявания. Известно е също, че мултиплената склероза (MS) е заболяване на централната нервна система (CNS), характеризиращо се с различни неврологични симптоми, често водещи до прогресивни физични увреждания. Точната етиология и патогенеза на това заболяване е все още неизвестна, но се предполага, че то има автоимунна основа [1,2].

Хистопатологията на MS се характеризира с демиелинизация на CNS, загуба на олигодендроцити и умерена възпалителна реакция. Поразените участъци са инфилтрирани предимно с Тлимфоцити и макрофаги. Тези данни показват, че това са активирани Т-лимфоцити от CD4+ субгип с повишена продукция на Th 1 цитокини (IL2 и IFN-гама) [3]. Като резултат, мононуклеарните клетки са индуцирани за повишена продукция на някои деструктивни субстанции като лимфотоксини (LT) и туморнекротизиращ фактор алфа (ТМРалфа). Редица изследвания [414] показват, че ключова роля в патогенезата на мултиплената склероза (MS) като хронично автоимунно заболяване има абнорменото продуциране или действие на IFN-гама.

Развитието на рекомбинантната ДНК технология дава възможност за разработване на различни подходи за неутрализиране действието на IFN-гама, което би могло да намери приложение за лечение на автоимунните заболявания, в това число и MS. Такъв инхибитор на секрецията на IFN-гама е IFN-бета, който понастоящем се прилага при лечението на болни от MS. На тази база са разработени и описаните, например в патенти US 082138, WO 9530435, СА 2361081, методи за лечение на MS. Нещо повече, съгласно патенти RU 2073522, RU 2187332, RU 02166959, за целта се използва смес от интерферони IFN-алфа, IFN-бета и IFN-гама. Докладвано е, обаче, че високите дневни дози, обикновено от порядъка на 8 000 000 Ш, водят до редица неблагоприятни ефекти, а именно: а) IFNбета блокира пролиферацията на Т-клетките [15]; Ь) IFN-бета неутрализира IL-12, което подсилва ефекта на IFN-гама върху дентритните клетки [16]; с) IFN-бета понижава активността на IFNгама и IL-4 продуциращите Т-клетки, като по този начин понижава нивото на CD4+ (Th 1, Th2) и CD8+ (Tel) клетките без да повлияе съотношението Thl/Th2 [17,18]; d) IFN-бета понижава експресията на проинфламаторните цитокини като IFN-гама и IFN-алфа и повишава експресията на анти-инфламаторните цитокини (IL-4 и IL-10) в пациенти с MS по време на острата фаза след краткотрайно лечение [19].

Друг подход, описан в публикацията на международна заявка за патент WO 0145747, както и в редица научни публикации [20-22], е неутрализиране на активността на IFN-гама с помощта на анти-IFN-raMa антитела. Съгласно заявката за патент се използва антитяло, включващо имуноглобулин, който е способен да неутрализира IFN-гама индуциращият фактор. Резултатите от изследванията, свързани с този подход показват, обаче, че продължителното прилагане на анти-IFN-raMa терапия влошава състоянието на пациентите, тъй като лишава организма от неговата естествена защитна система.

В търсене на друг подход за неутрализиране абнормената продукция и действие на IFN-гама, съгласно патенти US 0086534 и СА 2299361 са предложени аналози на интерферони от тип 1, т. нар. консенсусен интерферон (IFNconl, IFN-con2 и IFN-сопЗ), принадлежащи към групата на IFN-алфа и IFN-бета, както и IFNтау. Данните от изследванията показват, обаче, наличие на странични ефекти, в това число и токсичност на препаратите, изготвени на тяхна основа.

Известни са опити за използване на аналози на IFN-гама, притежаващи частична аминокиселинна последователност на човешкия IFNгама като антивирусно, антитуморно, антинео50

66458 Bl пластично или имуномодулиращо средство (US 4832959, WO 02081507, АТ 393690). Твърденията за ефекта им, обаче, са само декларативни, т.к. не са подкрепени с данни в описанието и в примерните изпълнения.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до средство за конкурентно инхибиране на ендогенния човешки IFN-гама при автоимунни заболявания, поспециално мултиплена склероза (MS). По своята същност, средството за конкурентно инхибиране на ендогенния IFN-гама се отнася до неактивни аналози на човешкия IFN-гама със запазен афинитет към гама-интерфероновия рецептор. Тези неактивни аналози от своя страна, представляват генно-модифицирани варианти на IFN-гама, при които С-крайната част на молекулата е заменена с тази, съответстваща на IFN-алфа или рекомбинантният IFN-гама е инактивиран с УВ светлина.

Средството, съгласно изобретението, е конструирано въз основа на пространствената структура на IFN-гама и неговия рецептор и на базата на функционалната карта на IFN-гама. С оглед на това, че местата на свързване с рецептора са локализирани предимно в N-крайните участъци на молекулата на IFN-гама, първичната структура на средството, съгласно изобретението, съвпада с тази част на молекулата.

Хибридният вариант на човешкия IFNгама представлява структура, в която С-крайната част на молекулата е заменена с друг рекомбинантен човешки белтък (напр. IFN-алфа!, IFNбета, IL-2 и др.). Общата дължина на хибридния белтък е 143 аминокиселини и съответства на тази на природния hlFNrawa. Хибридният ген hIFNraMa-алфа! се получава чрез лигиране на две ДНК молекули, едната от които съдържа 116 кодона и съответства на 5'-крайната част на човешкия гама-интерферонов ген, а другата 27 кодона и съответства на 3'-крайната част на човешкия алфа1-интерферонов ген.

Двете ДНК молекули, от своя страна, се получават чрез PCR амплификация на съответните части на гените на човешкия IFN-гама и човешкия IFN-алфа! (в качеството им на матрици) при използване на подходящи ДНК праймери. Правият праймер за човешкия IFN гама (SEQ ID NO: 1) е предназначен да въведе Hindlll място за клониране на хибридния ген в експресионния вектор, а обратният (SEQ ID NO: 2) - да въведе EcoRI място в 3'-края, необходимо за съединяване на получения ДНК фрагмент е 3' крайната част на гена на човешкия IFN-алфа!, както и да елиминира последните 27 кодона от гена на човешкия IFN-гама.

Правият праймер за човешки IFN-алфа! (SEQ ID NO: 3) е синтезиран така, че да въведе EcoRI място в 5'-края на амплифицирания ДНК фрагмент, необходимо както за лигирането му към 3'-края на гама-интерфероновия ген, така и за въвеждане на кодовите на двата гена в обща рамка на четене. Обратният праймер (SEQ ID NO: 4) е предназначен да въведе стоп-кодона ТАА и BamHI място в 3'-края на IFN-алфа генния фрагмент.

PCR реакцията с двата гена (човешки IFNгама и човешки IFN-алфа!) се провежда по описаната по-горе методика. В края на реакцията получените ДНК фрагменти се хидролизират съответно с Hindlll и EcoRI за гена IFN-гама и EcoRI и BamHI за IFN-алфа!, пречистват се чрез агарозна електрофореза и се лигират както един към друг (по EcoRI), така и към клониращия вектор (по Hindlll/BamHI).

Конструираният експресионен плазмид, съдържащ хибридния човешки ген IFNraMaалфа1 се трансформира в клетки на Е. coli LE392. Трансформацията, култивирането на бактериите и пречистването на рекомбинантния хибриден белтък е проведено така, както е описано по-горе за скъсения ген на човешкия IFN-гама. Изследването на антивирусната активност на хибридния белтък hIFNraMa-алфа! върху стандартни амниотични Whish клетки показва, че той не е активен.

Вторият вариант неактивни аналози на човешкия IFN-гама със запазен афинитет към гама-интерфероновия рецептор, съгласно изобретението, представлява инактивиран рекомбинантен IFN-гама. В този вариант единственият триптофанов остатък в молекулата, за който е известно, че има решаващо значение за биологичната активност на гама-интерферона, е разрушен. За получаването му се процедира по следния начин: Рекомбинантен IFN-гама с концентрация около 108 Ш/mg се облъчва с ултравиолетова светлина при дължина на вълната 290 нанометра (nm) в

66458 Bl продължение на 15 min, което води до фотолиза на триптофановия остатък и до инактивиране на IFN-гама. Резултатите от изпитването показват, че при смесване на инактивиран с активен IFNгама в съотношение 5:1, противовирусната активност на активния IFN-гама се понижава до 20 пъти.

Резултатите от изпитването и на двата варианта на човешкия гама-интерферон, съгласно изобретението, които са биологично неактивни, показват, че те съхраняват афинитета си към гамаинтерфероновия рецептор. По този начин, конкурирайки се за рецептора на човешкия IFNгама, неактивните варианти на гама-интерферона потискат неговата активност. Тъй като този ефект е зависим от дозата, действието на ендогенния гама-интерферон може да бъде регулирано чрез количеството и концентрацията на неактивния продукт, включен в подходящи фармацевтични препарати. Това е особено важно в случаите на свръхпродукция на ендогенен интерферон и тогава, когато гама-интерферонът е утежняващ фактор върху протичането на автоимунни заболявания, в това число множествена склероза.

Пояснение на приложената фигура

Фигура 1 представя структурата на експресионния вектор pJPlR3-IFNraMa, където:

Р1 представлява синтетичен аналог на фаговия промотор Т5Р25;

R3 е синтетичното място за свързване с рибозомите (аналог на консенсусната SD последователност).

Изобретението се пояснява със следните примери, без да го ограничават.

Пример 1. Конструиране на хибриден белтък hIFNraMa-алфа!

Хибридният белтък hIFNraMa-алфа!, с обща дължина 143 аминокиселини е съставен от две части: първата представлява N-крайната част на човешкия IFN-гама (116 аминокиселини), а втората - С-крайната част на човешкия IFN-алфа! (27 аминокиселини). Той се получава чрез експресия на хибриден ген hIFNraMa-алфа! в клетки на Е. coli LE392.

Хибридният ген hIFNraMa-алфа! се получава чрез лигиране на две ДНК молекули, едната от които съдържа 116 кодона и съответства на 5'крайната част на човешкия гама-интерферонов ген, а другата - 27 кодона и съответства на 3'крайната част на човешкия алфа 1 -интерферонов ген. Двете ДНК молекули са получени чрез PCR амплификация на съответните части на гените на hIFN-гама и hIFN-алфа! (в качеството им на матрици) при използване на подходящи ДНК праймери (SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 4).

Правият праймер за човешки IFN-гама (SEQ ID NO: 1) е предназначен да въведе Hindlll място за клониране на хибридния ген в експресионния вектор, а обратният (SEQ ID NO:2) - да въведе EcoRI място в 3'-края необходимо за лигиране на получения ДНК фрагмент към гена на човешкия IFN-алфа!, както и да елиминира 27 кодона от гена на човешкия IFNraMa.

Правият праймер за hIFN-алфа! (SEQ ID NO:3) е синтезиран така, че да въведе EcoRI място в 5'-края на амплифицирания ДНК фрагмент, необходимо както за лигирането му към 3'-края на гама-интерфероновия ген, така и за въвеждане на кодоните на двата гена в обща рамка на четене. Обратният праймер (SEQ ID NO: 6) е предназначен да въведе стоп-кодона ТАА и BamHI място за клониране на хибридния ген в експресионния вектор.

PCR реакцията с двата гена (hIFN-гама и hIFN-алфа!) е проведена така, както е описано в Таблица 1 и Таблица 2. В края на реакцията получените ДНК фрагменти са хидролизирани съответно с Hindlll и EcoRI за hIFN-гама и EcoRI и BamHI за hIFN-алфа! гена, пречистени са чрез агарозна електрофореза и са лигирани както един към друг (по EcoRI), така и към клониращия вектор (по Hindlll/BamHI).

Конструираният експресионен плазмид, съдържащ хибридния ген hIFNraMa-алфа! е трансформиран в клетки на Е. coli LE392. Експресията на хибридния вариант на гамаинтерфероновия ген е контролирана чрез ELISA, използвайки моноклонални антитела срещу рекомбинантен човешки гама интерферон.

Хибридният интерферонов белтък е пречистен чрез двустъпална (хидрофобно-катионообменна) хроматография така, както е описано в ЕР 0446582 В1. Антивирусната активност на hlFNraMa (изразена в международни единици) е определяна количествено по протективното действие на hlFNraMa върху Wish клетки, спрямо цитопатичното действие на вируса на везикуларния стоматит (VSV), както е описано от Forti

66458 Bl и сътрудници [23]. Изследването на антивирусната активност на хибридния белтък Ь№№ама-алфа1 показа, че той не е активен.

Таблица 1. Условия на провеждане на полимеразно-верижната реакция

Програма	Брой цикли	Време	Температура
\|	1	5 min	92^UC
II	5	1min	92°C
		1min	60^uC
		1min	72^UC
III	35	1mln	92^UC
		1min	65^UC
		1min	72C
IV	1	10 min	72°C

Съставът на реакционната смес, използвана при PCR е представен на Таблица 2 по-долу.

Таблица 2

Съставка ।	Количество
Матрица ДНК (бОрд/μΙ)	1μΙ
Обратен праймер (20ριηοΙ/μΙ)	1μΙ
Прав праймер (20ρηΊθΙ/μΙ)	1μΙ
Taq-полимераза (3 U/μΙ)	ΐμΐ
10 х PCR буфер	2μΙ
2 тМ dNTP's	2μΙ
dH2O	12μΙ
общо	2θμΐ

Пример 2. Инактивиране на рекомбинантен човешки гама-интерферон чрез УВ светлина,

Рекомбинантен човешки IFN-гама със степен на чистота >99%, разтворен в 0.14 М NaCl, 10 mM Tris, pH 7.4, се облъчва в кварцов съд в продължение на 3 h е УВ светлина при дължина на вълната 290 nm. Облъчването води до понижаване на активността на интерферона до повече от 100 пъти.

Пример 3. Изпитване на инхибиращо

66458 Bl действие на неактивни варианти на човешкия гама-интерферон върху биологичното действие на активния hlFNraMa.

Ефектът на неактивните форми на гамаинтерферона върху биологичното действие на 5 активния човешки IFN-гама се изследва върху богатата на рецептори амниотична клетъчна линия Wish. За тази цел клетките се преинкубират с неактивните интерферонови белтъци (за насищане на гама-интерфероновите рецептори), след което 10 последните се отмиват. След това клетките се третират с активен човешки IFN-гама с различна концентрация и заразяват с VSV [23]. Резултатите показват, че най-силен инхибиращ ефект върху активността на hlFNraMa има скъсеният вариант на гама-интерферона (съставен от 116 аминокиселини), следван от хибридния белтък hlFNraMa-алфа!. Най-слаб (но значителен) инхибиращ ефект има УВ инактивираният hlFNraMa-алфа!. Резултатите показват също, че инактивираните форми на гама-интерферона запазват своя афинитет към рецептора, благодарение на което могат да служат като конкурентни инхибитори на интакгния hlFNraMa.

Claims

Патентни претенции

1. Средство за конкурентно инхибиране на ендогенен hlFNraMa, основано на неактивни аналози на рекомбинантен hlFNraMa, характеризиращо се с това, че представлява hlFNraMa хибриден протеин, където С-крайната част на hlFNraMa съответства на тази на hlFNалфа или е рекомбинантен hlFNraMa, облъчен с УВ светлина при 290 nm.
2. Приложение на средство за конкурентно инхибиране на ендогенен hlFNraMa съгласно претенция 1 за производство на медикамент за лечение на автоимунни заболявания.
3. Приложение на средство за конкурентно инхибиране на ендогенен hlFNraMa съгласно претенции 1 и 2 за производство на медикамент за лечение на мултиплена склероза.

Приложение: 1 фигура

Литература

1. Waksman, В.Н. and Reynolds W.E. (1984) Multiple sclerosis as a disease of immune regulation. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 175, 282294.

2. Hailer, D.A., Weiner H.L. (1987) T cells in multiple sclerosis and inflammatory central nervous system diseases. Immunol. Rev., 100,307-332.

3. Oto, A.S., Guarion, T.J., Driver, R., Steinman, L., Umetsu, D.T. (1996) Regulation of 30 disease susceptibility: decreased prevalence of IgEmediated allergic disease in patients with multiple sclerosis. J. Allergy Clin. Immunol. 97, 1402-8.
4. Johnson, K.P. (1988) Treatment of multiple sclerosis with various interferons: The cons. Neurology, 38 (suppl. 2) 52-64.
5. Ulvestad, E., Williams, K., Bo, L., Trapp, B., Antel, J., Mork, 8. (1994) HLA class II molecules (HLA-DR, -DP, DQ) on cells in the human CNS studied in situ and in vitro. Immunology 82, 535-41.
6. Martino, G., Moiola, L., Brambilla, E., Clementi, E., Comi, G., Grimaldi, L.M. (1995). Interferon gamma induces T lymphocyte proliferation in multiple sclerosis via a Ca2+-dependent mechanism. J. Neuroimmunol. 62, 169-76.
7. Martino, G., Filippi, M., Martinelli, V., Brambilla, E., Comi, G., Grimaldi, L.M. (1996) Clinical and radiological correlates of a novel T lymphocyte gamma-interferon-activated Ca2+ influx in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. Neurology 46, 1416-21.
8. Vartanian, V., Li, Y., Zhao, M., Stefansson, K. (1995) Interferon-gamma-induced oligodendrocyte cell death: implications for the pathogenesis of multiple sclerosis. Mol. Med. 1, 732-43.
9. Misko, T.P., Trotter, J.L., Cross, A.H. (1995) Mediation of inflammation by encephalito10 genic cells: interferon gamma induction of nitric oxide synthase and cyclooxygenase 2. J. Neuroimmunol. 61, 195-204.
10. Panitch, H.L., Hirsch, R.L., Schindler, J., Johnson, K.P. (1987) Treatment of multiple scle15 rosis with gamma interferon: Exacerbations associated with activation of the immune system. Neurology 37, 1097-1102.
11. Navikas, V., He, B., Link, J., Haglund, M., Soderstrom, M., Fredrikson, S., Ljungdahl, A., 20 Hojeberg, J., Qiao, L., Olsson, T., Link, H. (1996) Augmented expression of tumor necrosis factor-alpha and lymphotoxin in mononuclear cells in multiple sclerosis and optic neuritis. Brain 119,213-23.
12. Beck, J., Rondot, P., Catinot, L., Falcoff, 25 E., Kirchner, H., Wietzerbin, J. (1988) Increased production of interferon gamma and tumor necrosis factor precedes clinical manifestation in multiple sclerosis: do cytokines trigger off exacerbations? Acta Neurol. Scand. 78, 318-323.
13. Lu, C.-Z., Jensen, M. Arnason, B.G.W, (1993) Interferon gamma and interleukin-4 secreting cells in multiple sclerosis (quoted by [17]).
14. Corbin, J.G., Kelly, D., Rath, E.M., Baerwald, K.D., Suzuki, K., Popko, B., (1996) Tar35 geted CNS expression of interferon-gamma in transgenic mice leads to hypomyelination, reactive gliosis and abnormal cerebellar development. Mol. Cell. Neurosci. 7, 354-357.
15. Rep, M.H., Hintzen, R.Q., Polman, C.H., 40 van-Lier, R.A. (1996) Recombinant interferon-beta blocks proliferation but enhances interleukin-10 secretion by activated human T-cells. J. Neuroimmunol. 67, 111-8.
16. Heystek, H.C., den Drijver, B., 45 Kapsenberg, M.L., van Lier, R.A., de Jong, E.G. (2003) Type I IFNs differentially modulate IL-12p70 production by human dendritic cells depending on the maturation status of the cells and counteract IFN-gamma-mediated signaling. Clin. Immunol. 50 107, 170-177.

66458 Bl
17. Franciotta, D., Zardini, E., Bergamaschi, R., Andreoni, L., Cosi, V. (2003) Interferon gamma and interleukin 4 producing T cells in peripheral blood of multiple sclerosis patients undergoing immunomodulatory treatment. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 74, 123-126.
18. Furlan, R., Bergamim A., Lang, R., Brambilla, E., Franciotta, D., Martinelli, V., Comi, G., Paninam P., Martino. G. (2000) Interferon-beta treatment in multiple sclerosis patients decreases the number of circulating T cells producing interferon-gamma and interleukin-4. J. Neuroimmunol. Ill, 86-92.
19. Khademi, M., Wallstrom, E., Andersson, M., Piehl, F., Di Marco, R., Olsson, T. (2000) Reduction of both pro- and anti-inflammatory cytokines after 6 months of interferon beta-1 a treatment of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 103, 202-210.
20. Skurkovich, S., Boiko, A., Beliaeva, 1., Buglak, A., Alekseeva, T., Smirnova, N., Kulakova, 0., Tchechonin, V., Gurova, 0., Deomina, T., Favorova, O.O., Skurkovic, B., Gusev, E. (2001)

Randomized study of antibodies to IFN-gamma and TNF-alpha in secondary progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 7, 277-284.
21. Skurkovich, B., Skurkovich, S. (2003) Anti-interferon-gamma antibodies in the treatment of autoimmune diseases. Curr. Opin. Mol. Ther. 5, 52-57.
22. Espejo, C., Penkowa, M., Saez-Torres, 1., Xaus, J., Celada, A., Montalban, X., MartinezCaceres, E.M. (2001) Treatment with anti-interferon-gamma monoclonal antibodies modifies experimental autoimmune encephalomyelitis in interferon-gamma receptor knockout mice. Exp. Neurol. 172, 460-468.
23. Forti, R. L., Schuffman, S. S., Davies, H. A. and Mitchell, W. M. (1986) Objective antiviral assay of the interferons by computer assisted data collection and analysis. Methods in Enzymol. 119, 533-540.
24. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition.