SK287523B6

SK287523B6 - Použitie CC chemokínového mutanta, farmaceutický prostriedok s obsahom chemokínového mutanta, skrátený a mutovaný humánny RANTES a spôsob jeho výroby

Info

Publication number: SK287523B6
Application number: SK406-2003A
Authority: SK
Inventors: Marie Kosco-Vilbois; Amanda Proudfoot; Timothy Wells
Original assignee: Laboratoires Serono Sa
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2011-01-04
Also published as: PT1326628E; DE60103078D1; CZ303409B6; JP2004510426A; YU25703A; HUP0302194A3; EP1326628B1; EE05174B1; NO330278B1; BG107685A; BR0114407A; EA006137B1; RS50738B; DE60103078T2; HUP0302194A2; EE200300139A; JP3908165B2; HRP20030215B1; NO20031525L; WO2002028419A2

Abstract

Je opísané použitie CC chemokínového mutanta, ktorý obsahuje aspoň dve mutácie v katiónovom mieste 40's slučky a ktorý má v porovnaní so štandardným typom molekuly zníženú GAG-väzbovú aktivitu, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie sklerózy multiplex a/alebo iných demyelinačných ochorení, pričom CC chemokín je vybraný zo skupiny obsahujúcej RANTES, MIP-1alfa, MIP-1beta, MIP-3, MIP-4, HCC1, I309, I35612 a MCP-2. Ďalej je opísaný farmaceutický prostriedok obsahujúci uvedený chemokínový mutant, skrátený a mutovaný humánny RANTES, jeho kódujúca DNA, expresný vektor obsahujúci túto DNA a hostiteľská bunka.

Description

Predložený vynález sa týka mutantov CC chemokínov, ktoré obsahujú aspoň dve mutácie v 40's slučke, a ktoré majú oproti štandardnému typu molekuly zníženú GAG-viažucu aktivitu. Zistilo sa, že takto mutované chemokíny sú účinné na liečenie sklerózy multiplex a/alebo iných demyelinačných ochorení.

Doterajší stav techniky

Chemokíny tvoria rodinu malých pro-zápalových cytokínov s leukocytovými chemotaktickými a aktivačnými vlastnosťami. V závislosti od polohy prvých konzervatívnych cysteínov sa chemokínová rodina môže rozdeliť na C-C, C-X-X a C-X₃-C chemokíny (Baggiolini M. a ďalší, Adv Immunol. 1994, 55: 97-179; Baggiolini M. a ďalší, Annu Rev Immunol. 1997, 15: 675-705; Taub D. a ďalší, Cytokine Grawth Factor Rev. 1996, 7(4): 355-76).

Mnohé C-X-C chemokíny, ako napríklad interleukín-8 (IL-8), sú chemoktaktické pre neutrofíly, zatiaľ čo C-C chemokíny sú účinné proti rôznym leukocytom vrátane monocytov, lymfocytov, eozinofilov, bazofilov, NK buniek a dendritických buniek.

NH₂-terminálna doména chemokínov sa podieľa na receptorovom viazaní a NH₂-terminálna úprava môže buď aktivovať chemokíny, alebo ich môže úplne inaktivovať.

N-koncové varianty syntetických C-C chemokínov boli testované z hľadiska ich účinku ako inhibítorov a antagonistov prirodzene sa vyskytujúcich foriem. MCP-1, MCP-3 a RANTES, ktorým chýba 8 až 9 NH₂-koncových aminokyselín, sú neúčinné proti monocytom a sú užitočné ako receptorové antagonisty (Gong JH a ďalší, J Exp Med. 1995, 181(2): 631-40 a Gong JH a ďalší, J Biol Chem. 1996, 271(18):10521-7).

Predĺženie RANTES o jeden metionín vedie k takmer úplnej inaktivácii molekuly a Met-RANTES sa správa ako antagonista autentického RANTES (Proudfoot AE a ďalší, J Biol Chem. 1996 Feb 2, 271 (5): 2599-603).

WO 99/16877 sa týka RANTES skrátených na amino-konci, ktorým chýbajú NH₂-koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1, 1-2, 1-3 alebo 1-4 prirodzene sa vyskytujúceho RANTES a majú chemokínovú antagonistickú aktivitu, ako aj ich cDNA kódujúcich sekvencií, ich použitia na liečenie a/alebo diagnostiku ochorení, pri ktorých je potrebná antagonistická aktivita chemokínového účinku. RANTES (3-68) je výhodným skráteným chemokínovým antagonistom.

Aj keď bola chemoatraktívna aktivita RANTES a CC chemokínov vo všeobecnosti študovaná najmä v spojitosti so špecifickými bunkovými membránovými receptormi, RANTES môžu interagovať aj s glykozaminoglykánmi (GAGs), vysoko variabilnými rozvetvenými sacharidovými skupinami, ktoré sa k niekoľkým proteínom pridávajú post-translačne, a vo všeobecnosti sa nazývajú proteoglykány (PGs). Takéto proteíny sa nachádzajú na bunkovej membráne, v extracelulámom matrixe a v krvnom kmeni, kde sa môžu nachádzať aj izolované GAGs.

Interakcie s GAGs je znakom, ktorý je spoločným pre mnohé bunkové signalizačné rozpustné molekuly (interleukíny, rastové faktory). PGs alebo izolované GAGs môžu tvoriť komplex s rozpustnými molekulami, pravdepodobne v rozsahu, v ktorom chránia túto molekulu pred proteolýzou v extracelulámom prostredí. Bolo tiež navrhnuté, že GAGs môžu pomáhať opravovať prezentáciu bunkových signalizačných molekúl ich špecifickému receptoru, a eventuálne aj modulovať aktiváciu cieľových buniek.

V prípade chemokínov sa zdá, že koncentrácia do imobilizovaných gradientov v mieste zápalu a z toho vyplývajúca interakcia s bunkovými receptormi a ich aktivačný stav sú modulované rôznymi formami GAGs (Hoogewerf AJ a ďalší, Biochemistry 1997, 36(44): 13570-8). Preto bolo navrhnuté, že modulácia takýchto interakcií môže predstavovať terapeutický prístup pri zápalovom ochorení (Schwarz MK a Wells TN, Curr Opin Chem Biol. 1999, 96(25): 14499-504).

Štrukturálne požiadavky a funkčné účinky GAG-RANTES interakcie boli študované na rôznych modeloch. RANTES viaže GAGs na endoteliálnych bunkách humánnej pupočníkovej žily (HUVECs) v mikromolámych koncentráciách s afinitou a špecificitou, ktoré sú vyššie ako pri iných chemokínoch, ako MCP-1, IL-8 alebo MIP-lalfa. Takéto interakcie sa javia ako nie jednoducho elektrostatické, ale ako závisiace od iných parametrov, ako je dĺžka a N- a O-sulfácia GAGs (Kuschert GS a ďalší, Biochemistry 1999, 38(39): 1295968). GAG-defektné bunkové línie ešte môžu viazať chemokíny, ale prítomnosť bunkových povrchových GAGs značne zvyšuje ich účinok na receptory, keď sú v nízkych koncentráciách (Ali S. a ďalší, J. Biol Chem 2000, 275(16): 11721-7). Iné experimenty ukázali, že GAGs, najmä heparín sulfát, uľahčujú interakciu RANTES s bunkovým povrchom makrofágov a z toho vyplývajúcu inhibiciu HIV infekcie, čo je výsledok, ktoré je v súlade s dobre známou odolnosťou týchto buniek, ktoré slabo exprimujú heparín sulfát, proti protivírusovým účinkom RANTES (Oravecz T, a ďalší, J Immunol. 1997, 159(9): 4587-92).

Rozpustné GAGs konkurujú bunkovým membránovým GAGs a môžu slúžiť ako špecifické inhibítory RANTES-indukovanej aktivácie povrchu (Appay V a ďalší, Int Immunol 2000, 12(8): 1173-82) alebo ako supresor HIV infekcie (Bums JM a ďalší, Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(25): 14499-504).

Niektoré štúdie štruktúry a funkcie sa pokúšali identifikovať RANTES doménu zodpovednú za interakcie s GAGs, keďže tradičná konsenzus sekvencia (BBXB, kde B je zásaditý zvyšok a X môže byť akýkoľvek zvyšok) je príliš všeobecná. Uskutočnila sa epitop mapovacia štúdia použitím monoklonálnej protilátky vyvolanej proti rekombinantnému humánnemu RANTES, ktorá bola schopná blokovať tak antivírusové účinky, ako aj mobilizáciu vnútrobunkového vápnika, sprostredkované s RANTES (Bums JM a ďalší, J. Exp. Med. 1998, 188(10):1917-27). Tento prístup umožnil definovať zvyšky 55-66 ako nevyhnutné tak pre takéto aktivity, ako aj pre GAG interakciu, argumentujúc tým, že GAGs interakcia môže mať komplementárnu alebo rozličnú funkciu vo vzťahu k funkcii sprostredkovanej kanonickými receptormi, ako sa navrhlo aj v štúdii RANTES variantov so zmenenými agregačnými vlastnosťami (Appay V a ďalší, J Biol Chem 1999, 274(39): 27505-12).

Oblasť 55-66, ktorá znamená C-koncový alfa-závitnicový segment, je homologická s GAG-viažucou doménou iných chemokínov, ako IL-8 (Witt DP a Lander AD, Curr. Biol. 1994, 4(5): 394-400), a obsahuje katiónové miesto obsahujúce lyzín a arginín (KKWVR). Takáto väzobná oblasť sa líši od väzobného miesta pre bunkové receptory, ktoré je lokalizované na N-konci (Pakianathan DR a ďalší, Biochemistry 1997, 36(32): 9642-8), a obsahuje niektoré zvyšky podieľajúce sa na agregácii RANTES monomérov, hoci sa zdá, že takéto disagregačné mutácie neovplyvňujú interakciu s GAGs (Czaplewski LG a ďalší, J. Biol. Chem. 1999, 274(23): 16077-84; WO 98/13495).

RANTES obsahuje iné katiónové miesto (RKNR) zodpovedajúce zvyškom 44-47, ktoré je konzervatívne v GAG viažucej doméne iných chemokínov, ako ΜΙΡ-Ια (Koopmann W a Krangel MS, J. Biol. Chem. 1997, 272(15): 10103-9) a MIP-Ιβ (Koopmann W a ďalší, J Immunol. 1999, 163(4): 2120-7).

Ľudské RANTES varianty obsahujúce jednotlivé mutácie v týchto katiónových miestach boli opísané ako RANTES anatagonisty majúce potenciálne terapeutické aplikácie pri liečení HIV infekcie a zápalových alebo alergických ochorení (WO 99/33989).

Bolo opísané, že len trojitý mutant RANTES, v ktorom boli tri zvyšky v polohách 44, 45 a 47 substituované alanínom, stratil GAG-väzobnú schopnosť (A, Proudfoot a ďalší, Chemokine Gordon Conference, Session I, 24. júl 2000, osobný rozhovor).

Podstata vynálezu

Teraz sa zistilo, že CC chemokíny obsahujúce aspoň dve mutácie v katiónovom mieste takzvanej „40’ slučky“ sú účinné na liečenie sklerózy multiplex a/alebo iných demyelinačných ochorení. Toto miesto predstavuje konzervovaný GAG-viažuci motív v CC chemokínoch (ako RANTES, MIP-lcc a ΜΙΡ-1β, MIP-3, MIP-4, HCC1,1309, MCP-2). Všetky tieto chemokínové mutanty majú zníženú GAG-viažucu aktivitu, keď sa porovnávajú so zodpovedajúcimi štandardnými molekulami.

Podstatou vynálezu je teda použitie CC chemokínového mutantu, ktorý obsahuje aspoň dve mutácie v katiónovom mieste 40’s slučky, ako je znázornené na obrázku 1, a ktorý má v porovnaní so štandardným typom molekuly zníženú GAG-viažucu aktivitu, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie sklerózy multiplex a/alebo iných demyelinačných ochorení, pričom CC chemokín je vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje RANTES, ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β, MIP-3, MIP-4, HCC1,1309,135612 a MCP-2.

Na obrázku 1 je pre určitý počet CC chemokínov znázornená oblasť, v ktorej by mali byť prítomné podľa vynálezu aspoň dve mutácie, takzvaná 40’s slučka. Zistilo sa, že najmä trojitý RANTES mutant, ktorý má tri zásadité zvyšky v polohách 44, 45 a 47 substituované alanínom, je výnimočne účinný na živočíšnom modeli na liečenie sklerózy multiplex. Tento trojitý mutant RANTES vykazuje od dávky závislý účinok na myšacom EAE modeli a porovnateľnú účinnosť s liečením s rekombinantným IFN-β. Analogické výsledky sa získali so skráteným RANTES trojitým mutantom, v ktorom boli tri zvyšky v polohách 44, 45 a 47 substituované alanínom, a ktorému chýbajú prvé dve N-koncové aminokyseliny. Tento skrátený RANTES mutant (majúci aminokyselinovú sekv. č. 2) je nový a predstavuje ďalší predmet predloženého vynálezu.

Podobný experimentálny dôkaz bol generovaný aj v spojitosti s trojitými mutantami ΜΙΡ-lot a ΜΙΡ-1β, ktoré sú už známe a ktoré sa tu označujú ako ΜΙΡ-Ια trojitý mutant RI8A-R46A-R48A (Koopmann W a Krangel MS., J Biol Chem. 1997, 272(15): 10103-9) a MIP-Ιβ trojitý 40’s mutant K45A-R46A-K48A (Laurence JS, Biochemistry 2001, 40: 4990-4999).

Výraz „znížená GAG-väzobná aktivita“ znamená, že mutanty podľa vynálezu majú nižšiu schopnosť viazať sa na GAGs, tzn., že sa na GAGs (ako napríklad heparín sulfát) viaže nižšie percento každého z týchto mutantov oproti zodpovedajúcej štandardnej molekule.

Výhodnejšie sú mutanty humánneho RANTES, v ktorom sú tri zásadité aminokyseliny v polohách 44, 45 a 47 štandardnej molekuly substituované inými aminokyselinami. Takéto zvyšky môžu byť substituované s malými, alifatickými, nepolámymi alebo mierne polárnymi zvyškami, ako napríklad Ala, Ser, Thr, Pro a Gly. Alanín je najvýhodnejší.

SK 287523 Β6

RANTES mutanty, o ktorých sa zistilo, že sú výnimočne účinné pri liečení MS, sú mutanty majúce aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č. 2, respektíve sekv. č. 3.

Iným predmetom vynálezu je použitie chemokínových mutantov, ako sú definované, na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie sklerózy multiplex a/alebo iných demyelinačných ochorení.

Skleróza multiplex (MS) je pomaly postupujúcim ochorením CNS, ktoré je charakteristické roztrúsenými oblasťami demyelinácie v mozgu a v mieche, čo vedie k multiplicitným a rôznym neurologickým symptómom a prejavom, zvyčajne s remisiami a zväčšením bolesti (pozri The Merck Manual, šestnáste vydanie).

Príčina je neznáma, aleje podozrenie, že ide o imunologickú abnormalitu s niekoľkými kľúčovými príčinami, ktoré v súčasnosti indikujú špecifický mechanizmus. Postulované príčiny zahŕňajú infekciu pomalým alebo latentným vírusom a myelinolýzu prostredníctvom enzýmov. IgG je zvyčajne zvýšené v CSF a zvýšené titre boli asociované s rôznymi vírusmi vrátane osýpok. Význam týchto zistení a publikované asociácie s HLA alotypmi a zmeneným počtom T buniek je nejasný, keďže dôkazy sú do určitej miery konfliktné. Zvýšený rodinný výskyt naznačuje genetickú náchylnosť; ženy sú o niečo častejšie postihnuté ako muži. Zdá sa, že sú zahrnuté faktory prostredia. Hoci vo všeobecnosti nastupuje vo veku 20 až 40 rokov, vyskytla sa aj geografická oblasť, kde sú pacienti s MS v rámci prvých 15 rokov. Presťahovanie po 15 roku života nemení riziko.

Plaky a ostrovy demyelinácie s deštrukciou oligodendroglia a peri-vaskulámym zápalom sú roztrúsené v CNS, primáme v bielej hmote s preferenčne v laterálnych a posteriómych stĺpcoch (najmä v cervikálnej a dorzálnej oblasti), očné nervy a periventrikuláme oblasti. Postihnuté sú aj trakty v strednom mozgu, moste a mozočku a postihnutá môže byť aj sivá hmota tak v mozočku, ako aj v mieche.

Bunkové telieska a axóny sú zvyčajne chránené, najmä v skorých léziách. Neskôr sa axóny môžu poškodiť, najmä v dlhých traktoch a v dôsledku fibróznej gliózy nadobudnú trakty svoj „sklerotický“ vzhľad. Skoré aj neskoré lézie sa môžu vyskytovať naraz. V plakoch a okolo nich boli demonštrované chemické zmeny v lipidových a proteínových zložkách myelínu.

Ochorenie sa vyznačuje rôznymi ťažkosťami a zisteniami CNS dysfunkcie s remisiami a perzistente sa opakujúcimi zväčšeniami bolesti.

Zobrazovanie prostredníctvom magnetickej rezonancie (MRI) je najcitlivejšou diagnostickou zobrazovacou technikou. Môže ukázať mnohé plaky. Lézie môžu byť viditeľné na kontrastne zosilnených CT skenoch.

Terapeutické pokroky pri skleróze multiplex (MS) sa objavujú pomaly čiastočne preto, že je neúplne pochopená patogenéza poruchy. Hlavné prekážky postupu empiricky založenej liečby zahŕňajú veľmi variabilný priebeh MS, dlhotrvajúcu povahu najdôležitejších meraných výstupov a chýbanie objektívnych markerov účinku liečby, najmä krátkodobých.

Hoci ostáva patogenéza MS neurčitá, pokračuje štúdium prirodzenej anamnézy. Boli vyvinuté objektívne záverečné merania založené na zobrazovaní prostredníctvom magnetickej rezonancie (MRI) a teraz sú známe mnohé osídla klinických testov, ktoré viedli k zlepšeným testovacím metódam a lepšej interpretácii výsledkov.

Preto je iným predmetom predloženého vynálezu spôsob liečenia MS prostredníctvom podávania účinného množstva chemokínových mutantov podľa vynálezu spolu s farmaceutický prijateľným excipientom.

Výraz „účinné množstvo“ označuje množstvo účinných zložiek, ktoré sú dostatočné na ovplyvnenie priebehu a závažnosti ochorenia, pričom vedú k redukcii alebo remisii takejto patológie. Účinné množstvo bude závisieť od spôsobu podávania a od stavu pacienta.

Ďalším predmetom predloženého vynálezu sú farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú chemokínové mutanty podľa vynálezu v prítomnosti jedného alebo viacerých farmaceutický prijateľných excipientov, na liečenie MS a/alebo iných demyelinačných ochorení.

Výraz „farmaceutický prijateľný“ zahŕňa akýkoľvek nosič, ktorý neinterferuje s účinnosťou biologickej aktivity účinnej zložky, a ktorý nie je toxický voči hostiteľovi, ktorému sa podáva. Napríklad na parenterálne podanie môžu byť uvedené účinné zložky formulované v jednotkovej dávkovej forme pre injekcie vo vehikulu, akým je napríklad fyziologický roztok, dextrózový roztok, sérový albumín a Ringerov roztok.

Okrem farmaceutický prijateľného nosiča môžu prostriedky podľa vynálezu obsahovať aj minoritné množstvá aditív, ako napríklad stabilizátorov, excipientov, tlmivých roztokov a konzervačných látok.

Podávanie takejto aktívnej zložky môže byť intravenózne, intramusklárne alebo subkutánne. Predložený vynález zahŕňa aj iné spôsoby podávania, ktoré zabezpečia požadovanú hladinu príslušných zložiek v krvi.

Optimálnu dávku účinnej zložky je možné vhodne vybrať v súlade so spôsobom podávania, stavom a vlastnosťami pacientov (pohlavie, vek, telesná hmotnosť, zdravotný stav, výška), rozsahom symptómov, súčasnými terapiami, frekvenciou liečby a požadovaným účinkom. Nastavenie a manipulácia stanovených dávkových rozsahov patrí do schopností priemerného odborníka.

Zvyčajná denná dávka účinnej zložky môže byť približne 0,01 až 100 mg na kg telesnej hmotnosti. Obyčajne 1 až 40 mg na kg na deň podávaných v rozdelených dávkach alebo vo forme s nepretržitým uvoľňovaním je účinné na získanie požadovaných výsledkov. Druhé alebo následné podávania sa môžu uskutočniť v dávke, ktorá je rovnaká alebo nižšia alebo vyššia ako počiatočná alebo predchádzajúca dávka podávaná jedincovi.

Predložený vynález bol opísaný s odvolaním sa na konkrétne uskutočnenia, ale obsah opisu zahŕňa všetky modifikácie a substitúcie, ktoré môžu prichádzať do úvahy pre priemerného odborníka v oblasti bez toho, aby prekročil význam a účel nárokov.

Vynález bude teraz opísaný prostredníctvom nasledujúcich príkladov, ktoré žiadnym spôsobom neobmedzujú predložený vynález. Príklady sa budú odvolávať na špecifikované obrázky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje zoradenie niektorých príkladných CC chemokínov, ktoré sú usporiadané v oblasti 40’s slučky. Tento proteínový segment a katiónové miesto, ktoré zodpovedá GAG-viažucemu motívu, sú v rámčekoch.

Obrázok 2 znázorňuje mapu plazmidu použitého na klonovanie štandardného RANTES a jeho mutantov podľa príkladov.

Obrázok 3 znázorňuje výsledky kompetičného väzobného testu [¹²⁵I]-RANTES a mutantov prostredníctvom heparínu v heparínovom guľôčkovom teste.

Obrázok 4 znázorňuje kompetičné rovnovážne väzobné testy RANTES a trojitého 40’s RANTES mutantu.

Obrázok 5 znázorňuje indukciu monocytovej a T bunkovej chemotaxie prostredníctvom RANTES a trojitých 40’s a 50’s RANTES mutantov.

Obrázok 6 znázorňuje inhibíciu zhromažďovania buniek v peritoneu prostredníctvom trojitého 40’s RANTES mutantu.

Obrázok 7 znázorňuje inhibíciu RANTES indukovaného zhromažďovania buniek v peritoneu prostredníctvom skráteného trojitého 40's RANTES (3-68) mutantu produkovaného v Pichia pastoris.

Obrázok 8 znázorňuje inhibíciu MIP-Ιβ indukovaného zhromažďovania buniek v peritoneu prostredníctvom MlP-Ιβ trojitého 40’s mutantu (K45AR46AK48A).

Obrázok 9 znázorňuje inhibíciu ΜΙΡ-Ια indukovaného zhromažďovania buniek v peritoneu prostredníctvom ΜΙΡ-Ια trojitého mutantu (R18A-R46A-R48A).

Obrázok 10 znázorňuje inhibíciu tioglykolátom indukovaného zhromažďovania buniek prostredníctvom trojitého 40’s RANTES mutantu.

Obrázok 11 znázorňuje inhibíciu nástupu experimentálnej autoimunitnej encefalomyelitídy prostredníctvom všetkých 40’s RANTES trojitých mutantov podľa vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Materiály a metódy

a) Generovanie neheparínových väzobných RANTES mutantov

Mutagenéza RANTES sa dosiahla technikou inverznej polymerázovej reťazovej reakcie. Bodové mutácie sa zaviedli do jedného z dvoch primerov používaných na hybridizáciu so sekvenciou kódujúcou humánny RANTES (GenBank príst. č. NM 002985) v opačnej orientácii. Na zlepšenie účinnosti anelovania primeru (najmä, keď sa do primerov zavádzali multiplicitné mutácie) sa DNA alkalický denaturovala. Denaturovaná DNA sa nariedila približne na koncentráciu 10 pg/reakciu, aby sa zabránilo začleneniu nemutovanej DNA do transformačnej reakcie.

Číslované aminokyselín uvedené v príkladoch a v opise berie do úvahy zrelý proteín, tzn. proteín začínajúci so Ser, Čo je aminokyselina v polohe 24 podľa zoznamu sekvencií. Preto, aby bol perfektný súlad medzi číslami aminokyselín v zozname sekvencií a číslami v príklade, treba pripočítať 23 k číslam uvádzaným v príkladoch alebo v opise.

Nižšie sú uvedené sekvencie použitých primerov a mutované bázy sú podčiarknuté.

R44A (sense)
5'-TTTGTCACCGCAAAGAACCGCCAAG-3'	PI
R44A (antisense) 5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3'	P2
K45A (sense) 5'-TTTGTCACCCGAGCGAACCGCCAAG-3'	P3
K45A (antisense) 5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3'	P4

R47A (sense)
5'-CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA-3'	P5
R47A (antisense) 5'-CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA-3'	P6
R44A-K45A-R47A (trojitý 40’ mutant, sense) 5'-TTTGTCACCGCAGCGAACGCCCAAGTGTGTGCCAAC-3' P7
R44A-K45A-R47A (trojitý 40’ mutant, antisense) 5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTGCC-3'	P8
K55A (sense) 5'-GCCAACCCAGAGGCGAAATGGGTTTCGG-3'	P9
K55A (antisense) 5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGAC-3'	P10
K56A (sense) 5'-AACCCAGAGAAGGCATGGGTTCGGGAG-3'	Pil
K56A (antisense) 5'-GGCACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGT-3'	P12
R59A (sense) 5'-AAGAAATGGGTTGCGGAGTACATCAAC-3'	P13
R59A (antisense) 5'-CTCTGGGTTGGCACACACTTGGCG-3'	P14
K55A-K56A-R59A (trojitý 50’s mutant, sense) 5'-GCCAACCCAGAGGCGGCATGGGTTGCGGAGTACATC-3’Pl 5
K55A-K56A-R59A (trojitý 50’s mutant, antisense) 5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGACAAAGAC-3'	P16

Amplifikácia sa uskutočňovala v DNA termálnom cykleri (Perkin-Elmer-Cetus 480) v 35 cykloch použitím pfuturbo® DNA polymerázy (Stratagene). DNA sa ligovala a transformovala sa do Top 10 F’ kompetených E. coli buniek (Invitrogen), Sekvencia mutantov sa overila DNA sekvenovaním.

b) Expresia a purifikácia štandardného (WT) RANTES a RANTES mutantov v E. coli

DNA fragmenty sa získali prostredníctvom PCR, ako bolo vysvetlené, a klonovali sa do plazmidu pET24d (obrázok 2), pričom sa generovala séria vektorov. Sekvencia kódujúca WT alebo mutovaný RANTES sa klonovala na 3’ koniec pT7 promótora, medzi Xbal a NhelIXhol miesta. Plazmid obsahuje dva markerové gény (Km a lacl) a aktívny počiatok replikácie (Ori fl).

Výsledné vektory sa použili na retransformáciu BL21(DE3) kmeňa E. coli, ktorý umožňuje silnú proteínovú expresiu použitím pT7/LacI systému. Proteínová expresia sa indukovala pridaním lmM izopropyl-P-D-tiogalaktopyranozidu (IPTG) do kultúry. Bunky sa zozbierali a resuspendovali v lyzačnom tlmivom roztoku (50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl₂, 5 mM Benzamidín/HCl, lmM DTT, 0,lmM fenylmetyl-sulfonylfluorid (PMSF), DNáza 20 mg/1). Bunky sa rozrušili troma pasážami cez French Pressure Celí jednotku. Suspenzia sa potom centrifugovala pri 10000 ot./min. 30 minút pri 4 °C. Pelet inklúznych teliesok obsahujúci WT RANTES alebo jeden z RANTES mutantov sa solubilizoval v 0,lM Tris/HCl, pH 8,0, obsahujúcej 6M guanidín/HCl a lmM DTT a miešal sa 30 minút pri 60 °C. Roztok sa dialyzoval oproti 3 výmenám 1 % kyseliny octovej. Nerozpustný materiál sa odstránil centrifugáciou pri 10000 ot./min. počas 30 minút. Supematant obsahujúci WT RANTES alebo jeden z RANTES mutantov sa lyofílizoval.

Lyofilizovaný prášok sa rozpustil v 0,lM Tris/HCl, pH 8,0 obsahujúcom 6M guanidín/HCl a lmM DTT, aby sa získala koncentrácia približne 1 mg/ml. Proteíny sa renaturovali postupným (po kvapkách) riedením do desaťnásobného objemu guanidínového roztoku 20mM Tris/HCl, pH 8,0, obsahujúcej 0,0lmM oxidovaný glutatión a 0,lmM redukovaný glutatión. Roztok sa miešal cez noc pri 4 °C. Nerozpustný materiál sa odstránil centrifugáciou pri 10000 ot./min. 30 minút. pH sa nastavilo na 4,5 s kyselinou octovou a vodivosť sa nastavila na 20 ms prostredníctvom riedenia s vodou. Roztok sa naniesol na HiLoad S 26/10 kolónu predtým ekvilibrovanú v lOmM octane sodnom, pH 4,5, a proteín sa eluoval s lineárnym 0-2 M NaCl gradientom v rovnakom tlmivom roztoku. Frakcie obsahujúce WT RANTES alebo jeden z RANTES mutantných proteínov sa spojili, dialyzovali sa oproti 3 výmenám kyseliny octovej a lyofilizovali sa.

Lyofilizované proteíny sa rozpustili v 50mM Tris/HCl tlmivom roztoku, pH 8,0. MKKWPR vedúca sekvencia, ktorá bola výsledkom klonovacieho postupu, sa odštiepila od WT RANTES alebo jedného z RANTES mutantných proteínov prostredníctvom inkubovania s endoproteinázou Arg-C (1 : 600, enzým : : substrát, hmotn.) cez noc pri 37 °C. Poštiepené proteíny sa odseparovali od nepoštiepeného proteínu katiónovou výmennou chromatografiou na HiLoad S 26/10 kolóne predtým ekvilibrovanej s 20 mM octanom sodným, pH 4,5, obsahujúcim 6M močovinu, a proteíny sa eluovali s lineárnym 0-2M NaCl gradientom v rovnakom tlmivom roztoku. Poštiepené frakcie sa spojili a dialyzovali oproti dvom výmenám 1 % kyseliny octovej a nakoniec oproti 0,1 % kyseline trifluóroctovej a potom sa lyofilizovali (Edgerton MD a ďalší, str. 33

40, a Proudfoot AE a ďalší, str. 75-87, v „Chemokine Protocols“, Methods in Molecular Biology 2000, zv. 138, Humana Press).

Autenticita WT a RANTES mutantných proteínov sa overila hmotnostnou spektrometriou. Analogickým postupom sa vyrobil iný mutant, ktorý obsahuje Met ako predĺženie na NH₂-konci, ako aj jedinú alebo trojitú 40’ RNATES mutáciu a jedinú alebo trojitú 50’s mutáciu.

c) Expresia a purifikácia štandardného (WT) RANTES a RANTES mutantov v Pichia pastoris

Zrelý trojitý 40’ RANTES mutant (R44A-K45A-R47A) sa vytvoril použitím megaprimerovej PCR mutagenézy (Datta AK, Nucleic Acid REsearch 1995, 23(21):4530-31). Klonoval sa do Pichia pastoris expresného vektora pPIC9K, v čítacom rámci so S. cerevisiae Mat alfa pro-pro signálnym peptidom.

Po overení sekvencie sa plazmid preniesol do Pichiapastoris hostiteľského kmeňa GS1 \5{his4) prostredníctvom elektroporácie. His* klony sa skrínovali na expresiu RANTES mutantu. Malorozsahové štúdie expresie sa uskutočňovali použitím štandardných postupov, ako sú opísané v Pichia Expression Kit od Invitrogen (Life TEchnologies). V stručnosti, kultúra sa expandovala v obohatenom médiu použitím glycerolu ako zdroja uhlíka, a potom sa peletovala a resuspendovala v médiu obsahujúcom metanol na indukciu expresie RANTES mutantného proteínu. Vylučovanie RANTES mutantu do média sa detegovalo na SDS-PAGE farbenej s Coomassie Blue.

Klony vylučujúce vysoké hladiny RANTES mutantu (približne 500 až 750 mg/1) sa použili na zväčšenie rozsahu vo veľkých pretrepávacích fľašiach. Fermentované médium sa centrifugovalo pri 5000 ot./min. a supematant sa použil na purifíkáciu.

Proteín sa purifíkoval zo supematantu v jedinom chromatografíckom kroku na Heparin Sepharose kolóne ekvilibrovanej v 0,lM TRIS-HC1 a eluoval sa s lineárnym gradientom 0-2M NaCl v rovnakom tlmivom roztoku použitím 20-násobného objemu kolóny. Autenticita proteínu sa overila hmotnostnou spektrometriou a zistilo sa, že takýmto systémom produkovaný RANTES mutant (R44A-K45A-R47A) je skrátený aj na N-konci v porovnaní so štandardnou molekulou, tzn. chýbajú mu prvé dve aminokyseliny. Takto získaný mutant bol preto označený ako trojitý 40’s RANTES (3-68) mutant (R44A, K45A, R47A) a jeho aminokyselinovou sekvenciou je sekv. č. 2.

d) Heparínové väzobné testy

Uskutočnila sa heparin sepharose chromatografia použitím 50 pg ET alebo mutovaných RANTES proteínov, ktoré sa naniesli na Heparin Sepharose kolónu ekvilibrovanú v 25 mM Tris/HCl, pH 8,0 a 50 mM NaCl a eluovala sa s lineárnym gradientom 0-2M NaCl v 25mM Tris/HCl, pH 8,0.

Uskutočnila sa heparin sepharose chromatografia použitím 50 pg WT alebo mutovaných RANTES proteínov, ktoré sa naniesli na MonoS katiónovú výmennú kolónu ekvilibrovanú v 50 mM octane sodnom, pH 4,5. Proteín sa eluoval s 0-2M NaCl gradientom.

Uskutočňoval sa kompetičný väzobný test použitím WT RANTES, trojitého 50’s RANTES mutantu a trojitého 40’s RANTES mutantu (sekv. č. 3 - tu označovaná aj ako „R44A-R45A-R47ARANTES“), ktoré sa s Amersham rádioaktívne označili s ¹²⁵I na špecifickú aktivitu 2200 mCi/mol. Filtračné platne s 96 jamkami sa nasiakli s väzobným tlmivým roztokom (50 mM HEPES, pH 7,2 obsahujúcim 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,15M NaCl a 0,5 % BSA). Uskutočnili sa seriálne riedenia heparínu vo väzobnom tlmivom roztoku, aby sa pokryl koncentračný rozsah od 20 mg/ml do 1 pg/ml. Test sa uskutočňoval v celkovom objeme 100 pl pridaním 25 pl heparínových riedení, 25 pl 0,4 nM [¹²⁵I]-chemokínu, 25 pl heparínových guľôčok (0,2 pg/ml vo vode) a 25 pl väzobného tlmivého roztoku do každej jamky. Test sa uskutočňoval trojmo. Platne sa inkubovali pri laboratórnej teplote s pretrepávaním 4 hodiny. Filtračné platne sa premyli trikrát s 200 pl premývacieho tlmivého roztoku použitím vákuovej pumpy na odstránenie nenaviazaného značeného chemokínu. Potom sa do každej jamky pridalo 50 pl scintilačného činidla a odčítala sa rádioaktivita (1 min./jamku). Údaje sa analyzovali použitím GraFit Softwaru.

e) Ekvilibračné kompetičné receptorové väzobné testy

Testy sa uskutočňovali na membránach z CHO transfektantov exprimujúcich CCR1 alebo CCR5 použitím scintilačného proximitného testu (SPA) použitím [¹²⁵I]-MIP-la ako stopovacieho činidla. Kompetítory sa pripravili seriálnymi riedeniami neznačených chemokínov vo väzobnom tlmivom roztoku, aby sa pokryl rozsah 10'⁶ až 10’¹² M. Použitým väzobným tlmivým roztokom bol 50mM HEPES, pH 7,2 obsahujúci lmM CaCl₂, 5mM MgCl₂, 0,15M NaCl a 0,5 % BSA. Wheatgerm SPA guľôčky (Amersham) sa rozpustili v PBS na 50 mg/ml a nariedili sa vo väzobnom roztoku na 10 mg/ml a finálna koncentrácia v teste bola 0,25 mg/jamku. Membrány pripravené z CHO buniek exprimujúcich CCR1 alebo CCR5 sa uskladňovali pri -80 °C a nariedili sa vo väzobnom tlmivom roztoku na 80 pg/ml. Na redukciu pozadia sa pred uskutočnením testu zmiešali rovnaké objemy membrány a zásob guličiek. Finálna membránová koncentrácia bola 2 pg/ml a finálna koncentrácia [^l25I]-MIP-lct bola 0,1 nM. Platne sa inkubovali pri laboratórnej teplote s pretrepávaním 4 hodiny. Rádioaktivita sa merala a údaje sa analyzovali rovnako, ako je opísané pre heparínový väzobný test.

Ί

f) Chemotaktické testy

Monocytová chemotaxia sa uskutočňovala použitím micro-Boyden komorového testu. Monocyty sa purifikovali zo zrazených leukocytov použitím nasledujúceho izolačného postupu: 100 ml roztoku zrazených leukocytov sa nariedilo so 100 ml PBS, navrstvili sa na Ficoll a centrifugovali sa pri 600 ot./min. 20 minút pri laboratórnej teplote. Bunky tvoriace rozhranie sa zozbierali a dvakrát sa premyli s PBS a resuspendovali sa v koncentrácii 40 až 100 x 10⁶/ml v RPMI 1640 médiu obsahujúcom 5 % inaktivované fetálne hovädzie sérum (FCS), 2mM glutamin a 25 mM HEPES, pH 7,2. Ďalej sa purifíkovali z lymfocytovej frakcie pridaním ovčích červených krviniek v množstve 10⁶ buniek/ml, rozetovaných cez noc pri 4 °C a separovali sa prostredníctvom druhej Ficoll gradientovej centrifugácie pri 900 ot./min. počas 20 minút pri laboratórnej teplote. Monocyty sa nachádzali na rozhraní medzi Ficollom a tlmivým roztokom a T bunky boli v pelete. Monocyty sa premyli v PBS a resuspendovali sa na 2,5 x 10⁶/ml v RPMI 1640 médiu. Čistota sa merala priamym a bočným rozptylom prostredníctvom FACS analýzy a zistilo sa, že je 40 až 80 % v závislosti od darcu. Chemokín sa nariedil na konečný objem 30 μΐ, pokrývajúc koncentračný rozsah 10'⁶-l O'¹² M v RPMI médiu a preniesol sa do spodných jamiek. Na spodné jamky sa umiestnil filter s veľkosťou pórov 5 pm (Neuroprobe) pre monocyty a s veľkosťou pórov 8 pm pre T bunky, pričom sa zaistilo, by sa tam nevyskytovali vzduchové bubliny, a systém sa nepriepustné uzavrel. Do horných jamiek sa umiestnilo päťdesiat mikrolitrov bunkovej suspenzie (2,5 x 10⁶ buniek/ml) v RPMI médiu. Komôrka sa inkubovala 30 minút pri monocytoch a 1,5 hodiny pri T bunkách, pri 37 °C pod O₂. Bunky sa potom odstránili, z hornej plochy membrány sa zoškrabali bunky a membrána sa potom premyla s PBS. Membrána sa fixovala ponorením do MeOH na jednu minútu, vysušila sa na vzduchu a farbila sa s roztokmi Field A a B. Migrované bunky sa spočítali prostredníctvom výberu náhodných polí pre každú jamu s 20x objektívom na štandardnom mikroskope, ktorý je kompatibilný s IBAS zobrazovacím analyzačným softvérom. Údaje sa skoordinovali použitím GraFit softwaru.

g) Testy zhromažďovania buniek v peritoneu

V prvom teste sa zhromažďovanie buniek indukovalo intraperitoneálnou injekciou 10 pg chemokínu nariedeného v 0,2 ml sterilného fyziologického roztoku (LPS bez NaCl) samičiek BALB/c myší vo veku 8 až 12 týždňov. Chemokínové mutanty (10 pg chemokínu nariedeného v 0,2 ml sterilného fyziologického roztoku) sa podávali 30 minút pred podaním agonistu. 0 16 hodín neskôr sa myši usmrtili prostredníctvom aerosólového CO₂. Peritoneálna laváž sa uskutočnila troma premývaniami s 5 ml PBS a laváže sa spojili. Bunky sa centrifugovali pri 600 ot./min. 10 minút, resuspendovali sa v konečnom objeme 1 ml a s hemacytometrom sa spočítali celkové vyvolané leukocyty.

V druhom teste sa zhromažďovanie buniek indukovalo intraperitoneálnou injekciou 200 pl 3 % roztoku tioglykolátu v destilovanej vode samičkám BALB/c myší vo veku 8 až 12 týždňov (na 1. deň). 30 minút pred podaním tioglykolátu sa podal chemokínový mutant (10 pg chemokínu nariedených v 0,2 ml sterilného fyziologického roztoku). Chemokínový mutant sa potom podával denne ďalšie tri dni (deň 2, 3 a 4). Myši sa usmrtili na 5. deň aerosolizovaným CO₂. Peritoneálna laváž sa uskutočnila troma premývaniami s 5 ml PBS a laváže sa spojili. Bunky sa centrifugovali pri 600 ot./min. 10 minút, resuspendovali sa v konečnom objeme 1 ml a s hemacytometrom sa spočítali celkové vyvolané leukocyty.

h) Experimentálna autoimunitná encefalomyelitída (EAE)

Imunizačný postup

8-týždňové samičky C57 BL/6NCrlBR myší s hmotnosťou 18 až 22 gramov sa imunizovali (deň 0) prostredníctvom s.c. injekcie do zadnej časti krku, ktorá obsahovala 0,1 ml emulzie obsahujúcej 200 pg MOG₃₅. 55 peptidu (Neosystem, Strasbourg, Francúzsko) v kompletnom Freundovom adjuvans (CFA s Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, USA) obsahujúcom 0,25 mg Mycobacterium tuberculosis. Pred s.c. injekciou obdržali 200 pl i.v. injekciou 300 ng pertussis toxínu (List Biological Lab., Campbell, CA, USA) rozpusteného v PBS do chvostovej žili. Na druhý deň sa zvieratám podala druhá i.p. injekcia 300 ng pertussis toxínu.

Tento postup viedol, začínajúc približne na 8 až 10 deň, k objaveniu sa progresívnej paralýzy, začínajúcej na chvoste a pokračujúcej po predné končatiny.

Návrh štúdie

Štúdia zahŕňala skupiny obsahujúce po desať zvierat. Všetky skupiny boli imunizované s MOG₃₅.₅₅ peptidom v CFA a petussis toxínom v súlade s imunizačným protokolom.

Skupina 1: pozitívna kontrolná skupina, ktorej sa i.p. spôsobom podávalo len samotné vehikulum (PBS). Skupina 2: pozitívna kontrolná skupina, ktorej sa s.c. spôsobom podávalo len samotné vehikulum (PBS). Skupina 3: i.p. spôsobom podávaný trojitý 40’s RANTES mutant v množstve 10 /tg/myš.

Skupina 4: i.p. spôsobom podávaný trojitý 40’s RANTES mutant v množstve 1 Mg/myš.

Skupina 5: i.p. spôsobom podávaný trojitý 40’s Met-RANTES mutant v množstve 10 /tg/myš.

Skupina 6: i.p. spôsobom podávaný trojitý 40’s Met-RANTES mutant v množstve 1 gg/myš.

Skupina 7: s.c. spôsobom podávaný myšací rekombinantný interferón beta (m-IFN-β) v množstve 10000 jednotiek/myš.

Skupina 8: s.c. spôsobom podávaný m-IFN-β v množstve 20000 jednotiek/myš.

Vehikulum

PBS sa použilo na riedenie všetkých trojitých 40’s RANTES mutantov, všetkých trojitých 40’s MetRANTES mutantov a mIFN-β na vhodnú koncentráciu.

Spôsob podávania

Trojitý 40’s RANTES mutant, trojitý 40’s Met-RANTES mutant a m-IFN-β sa podávali denne i.p. spôsobom v objeme na podávanie 200 μΐ/myš. Skupinám 1 a 2 sa i.p. spôsobom podávalo PBS v množstve 200 μΐ/myš.

Trvanie liečenia

Liečenie začalo u každého zvieraťa na 4. experimentálny deň (približne 3 až 5 dní pred zvyčajným výskytom ochorenia) a potom pokračovalo 14 po sebe idúcich dni (zvieratá sa usmrtili na 18. experimentálny deň).

Klinické pozorovania

Od piateho dňa sa zvieratá jednotlivo vyšetrovali vyšetrovateľom na prítomnosť paralýzy prostredníctvom klinického skóre nasledovne:

= žiadna známka ochorenia

0,5 = čiastočná paralýza chvosta = paralýza chvosta

1.5 = paralýza chvosta + čiastočná unilaterálna paralýza zadnej končatiny = paralýza chvosta + slabosť zadných končatín alebo čiastočná paralýza zadných končatín

2.5 = paralýza chvosta + čiastočná paralýza zadných končatín (spustená panva) = paralýza chvosta + kompletná paralýza zadných končatín

3.5 = paralýza chvosta + kompletná paralýza zadných končatín + inkontinencia = paralýza chvosta + paralýza zadných končatín + slabosť alebo čiastočná paralýza predných končatín = umieranie alebo smrť

Výsledky

a) Heparínové väzobné testy

Purifikované RANTES proteíny mutované v jednej alebo v troch polohách sa analyzovali heparínovou chromatografiou a porovnávala sa koncentrácia NaCl potrebná na ich eluovanie s elučným profilom WT RANTES. Keďže interakcia s heparínom je elektrostatická, mutanty sa podrobili aj katiónovej výmennej chromatografii na MonoS kolóne. To vedie k poklesu NaCl koncentrácie potrebnej na ich eluovanie, keďže mutagenéza odstránila zásadité zvyšky. Rozdiel v NaCl koncentrácii získanej pri katiónovej výmennej chromatografii sa odčíta od rozdielu získaného pri heparínovej chromatografii. Ak je táto hodnota pozitívna, je identifikovaná špecifická interakcia s heparínom (tabuľka 1).

Priame meranie viazania sa na heparín sa uskutočňovalo s trojitými 40’s a 50’s RANTES mutantmi v kompetičnom väzobnom teste. WT RANTES a mutanty sa jodidovali s Amersham a všetky mali rovnakú špecifickú rádioaktivitu 2200 mCi/mol. Ale len približne 20 % trojitého 40’s mutantu sa naviazalo na heparínové guľôčky, s maximálnou hodnotou cpm 4000 v porovnaní s 22000 cpm pre WT RANTES a 50’s mutant (obrázok 3). To demonštruje, že tie zvyšky v 40’s slučke, ktoré boli mutované, sa podieľajú na väčšine heparínovej väzobnej schopnosti RANTES. Na druhej strane to tiež demonštruje to, že pravdepodobný GAGväzobný motív v 50’s slučke nie je „pravým“ GAG-väzobným miestom.

b) Rovnovážne kompetičné receptorové väzobné testy

Schopnosť trojitého 40’s a trojitého 50’s RANTES mutantu konkurovať [¹²⁵I]MIP-la pri viazaní na rekombinantné CCR1 a CCR5 v membránach pripravených z CHO stabilných transfektantov. Neexistuje žiadny významný rozdiel v žiadnej z jednotlivých mutácií na žiadnom z receptorov (údaje nie sú znázornené). Žiadny z trojitých mutantov nevykazoval rozdiel vo viazaní sa na CCR5 v porovnaní s WT RANTES proteínom. Ale pri CCR1 mal trojitý 40’s mutant stonásobne zníženú afinitu, pričom trojitý 50’s mutant vykazoval len malú stratu afinity (trojnásobnú) (obrázok 4).

c) Chemotaktické testy

Trojité 40’s a 50’s mutanty boli všetky schopné indukovať monocytovú chemotaxiu s aktivitou porovnateľnou s WT RANTES, s výnimkou trojitého 40’s mutantu, ktorý bol schopný indukovať významnú chemotaxiu v koncentrácii 1 μΜ. Ale trojité 40’s a 50’s mutanty mali rovnakú schopnosť indukovať chemotaxiu T buniek (obrázok 5). Výsledky získané v monocytových chemotaktických testoch dobre zodpovedajú výsledkom získaným v receptorových väzobných testoch.

Výsledky získané v monocytových chemotaktických testoch dobre korešpondujú s výsledkami získaným v receptorových väzobných testoch. Strata aktivity trojitého 40’s RANTES mutantu pri monocytovej chemotaxii zodpovedá strate afinity proti CCR1.

d) Testy zhromažďovania buniek v peritoneu

Trojitý 40’s RANTES mutant nebol schopný indukovať zhromažďovanie buniek v peritoneu v dávke (10 gg/myš), pri ktorej RANTES spôsobuje podstatné zhromažďovanie (obrázok 6).

Okrem toho, ak sa podá 10 gg mutanta 30 minút pred podaním RANTES je inhibované bunkové zhrnmažďovanie indukované prostredníctvom RANTES. Preto zničenie GAG-viazania spôsobuje inhibíciu chemokínom indukovaného zhromažďovania buniek in vivo.

Analogické výsledky sú znázornené na obrázku 7 so skráteným RANTES (3-68) trojitým 40’s mutantom (produkovaným v Pichia pastoris), na obrázku 8 prostredníctvom MIP-Ιβ trojitého 40’s mutanta (K45A-R46A-K48A) a na obrázku 9 prostredníctvom ΜΙΡ-Ια trojitého 40’s mutanta (R18A-R46A-R48A). Trojitým 40’s RANTES mutantom sa inhibovalo aj zhromažďovanie buniek stimulované tioglykolátom, ako je znázornené na obrázku 10.

e) Experimentálna autoimunitná encefalomyelitída (EAE)

Trojitý 40’s RANTES mutant vykazoval od dávky závislý účinok na myšacom EAE modeli. Proteín, tak v dávke 1 gg, ako aj v dávke 10 gg/myš, sa podával denne i.p. začínajúc na 10. deň po primárnej imunizácii s MOG, pričom demonštroval porovnateľnú účinnosť ako referenčná liečba s rekombinantným m-IFN-β (obrázok 11). Nástup ochorenia bol významne oddialený a závažnosť ochorenia (hodnotená prostredníctvom oblasti pod krivkou) bola tiež významne redukovaná. Okrem toho bolo znížené aj priemerné maximálne klinické skóre dosiahnuté počas experimentu. Iný mutant (trojitý 40’s Met-RANTES mutant) nevykazoval žiadny užitočný účinok v rovnakom experimente.

Naše výsledky dokazujú jasný užitočný účinok liečenia so 40’s RANTES trojitým mutantom, ktorý redukuje klinické známky chronickej EAE u myší po imunizácii s MOG. Preto má trojitý 40’s RANTES mutant užitočný terapeutický účinok a môže byť použitý ako terapia pri chronických demyelinačných ochoreniach, ako napríklad MS.

Tabuľka 1

Molarita NaCl na eluovanie z Heparínovej a Mono-S (katiónovej výmennej) kolóny

RANTES mutácia	Heparín	MonoS	ANaCl^Hep'^s	ANaCl^Mon°-^s	ΔΔ NaCl
žiadna (WT)	0,80	0,91	-	-	-
R44A	0,61	0,82	0,19	0,09	0,10
K45A	0,65	0,97	0,15	0,04	0,11
R47A	0,65	0,84	0,15	0,07	0,08
R44A-K45A-R47A	0,47	0,70	0,33	0,21	0,11
K55A	0,70	0,86	0,10	0,05	-0,05
K56A	0,90	0,94	-0,10	0,07	-0,17
R59A	0,79	0,85	0,01	0,06	-0,05
K55A-K56A-R59A	0,70	0,75	0,10	0,16	-0,06

Nasledujúca tabuľka 2 vyjasni identitu sekvencií uvádzaných v zozname sekvencií a v texte.

Tabuľka 2

Sekv. č.	Opis sekvencie
1	štandardný typ (WT) RANTES
2	trojitý 40’s RANTES(3-68) mutant
3	trojitý 40’s RANTES mutant
4	trojitý ΜΙΡ-Ια mutant (R18A-R46A-R48A)
5	trojitý MIP-Ιβ mutant (K45A-R46A-K48A)
6	trojitý 50’s RANTES mutant
7	trojitý 40’s Met-RANTES mutant
8	R44A-RANTES mutant
9	K45A-RANTES mutant

10	R47A-RANTES mutant
11	K55A-RANTES mutant
12	K56A-RANTES mutant
13	R59A-RANTES mutant
14	primér PI
15	primér P2
16	primér P3
17	primér P4
18	primér P5
19	primér P6
20	primér P7
21	primér P8
22	primér P9
23	primér P10
24	primér Pil
25	primér P12
26	primér P13
27	primér P14
28	primér P15
29	primér P16
30	WT-I309
31	WT-MIP-la
32	WT-ΜΙΡ-Ιβ
33	WT-MIP-4
35	WT-HCC1
36	WT-I36512
37	WT-MCP-2

Zoznam sekvencií <110> Applied Research Systems ARS Holding N. V.

<120> Chemokínové mutanty na liečenie sklerózy multiplex <130> WO465 <160>37 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 1

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys 35 4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

90 <210>2 <211> 66 <212> PRT <213> Pichia pastoris <400> 2

Tyr Ser Ser Asp Thr thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro 15 1015

Leu Pro Arg Ala His íle Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys 20 2530

Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Ala Ala ASn Ala Gin Val Cys 35 4045

Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu 50 5560

Met Ser <210>3 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 3

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro

2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys

4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Ala Ala Asn Ala Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 7580

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

8590 <210> 4 <211> 70 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4

Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 15 1015

Ser Ala Gin íle Pro Gin Asn Phe íle Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser

2530

Ser Gin Cys Ser Lys Pro Gly Val íle Phe Leu Thr Lys Ala Ser Ala

4045

Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gin Lys Tyr Val Ser 50 5560

Asp Leu Glu Leu Ser Ala

70 <210> 5 <211> 69 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 5

Ala Pro Met Gly SEr Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 15 1015

Ala Arg Lys Leu Pro Arg ASn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser 20 2530

Ser Leu Cys SEr Gin Pro Ala VA1 Val Phe Gin Thr Ala Ala Ser Ala 35 4045

Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gin Glu Tyr Val Tyr 50 5560

Asp Leu Glu Leu Asn <210>6 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 6

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys

4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Ala Ala Trp 65 70 7580

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

8590 <210>7 <211> 92 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Met Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr 20 2530

Pro Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle

4045

Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val 50 5560

Phe Val Thr Ala Ala Asn Ala Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys 65 70 7580

Trp Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

90 <210> 8 <211>91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 8

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys

4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Ala Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 7580

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

8590 <210> 9 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 9

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys

4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Arg Ala Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 7580

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

8590 <210> 10 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 10

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro

2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys

4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Arg Lys Asn Ala Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 7580

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

8590 <210> 11 <211> 91 <212>PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 11

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro

2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys

4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Arg Lys Asn Ala Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 7580

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

8590 <210> 12 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 12

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys

4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Ala Trp 65 70 7580

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

8590

SK 287523 Β6 <210> 13 <21I> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220>

<221> signál <222> (1)...(23) <400> 13

Met Lys Val Ser Ala Ala Ala Leu Ala Val íle Leu íle Ala Thr Ala 15 1015

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 2530

Cys Cys Phe Ala Tyr íle Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His íle Lys

4045

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 5560

Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 7580

Val Arg Glu Tyr íle Asn Ser Leu Glu Met Ser

8590 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 14 tttgtcaccg caaagaaccg ccaag 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 gacgactgct gggttggagc acttg 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 16 tttgtcaccc gagcgaaccg ccaag 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 17 gacgactgct gggttggagc acttg 25 <210> 18 <211> 25 <212>DNA <213> Escherichia coli <400> 18 cgaaagaacg cccaagtgtg tgcca <210> 19 <211> 25 <212>DNA <213> Escherichia coli <400> 19 ggtgacaaag acgactgctg ggttg <210> 20 <211> 36 <212>DNA <213> Escherichia coli <400> 20 tttgtcaccg cagcgaacgc ccaagtgtgt gccaac <210>21 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400>21 gacgactgct gggttggagc acttgcc <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 22 gccaacccag aggcgaaatg ggttcgg <210>23 <211> 27 <212>DNA <213> Escherichia coli <400> 23 acacacttgg cggttctttc gggtgac <210> 24 <211> 27 <212>DNA <213> Escherichia coli <400> 24 aacccagaga aggcatgggt tcgggag <210> 25 <211> 27 <212>DNA <213> Escherichia coli

<400> 25 ggcacacact tggcggttct ttcgggt 27 <210>26 <211> 27 <212>DNA <213> Escherichia coli <400> 26 aagaaatggg ttgcggagta catcaac 27 <210> 27 <211> 24 <212>DNA <213> Escherichia coli <400> 27 ctctgggttg gcacacactt ggcg 24 <210>28 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 28 gccaacccag aggcggcatg ggttgcggag tacatc 36 <210> 29 <211> 33 <212>DNA <213> Escherichia coli <400> 29 acacacttgg cggttctttc gggtgacaaa gac 33 <210> 30 <211> 74 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 30

Ser Lys Ser Met Gin Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala 15 1015

Glu Gin Glu íle Pro Leu Arg Ala íle Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser 20 2530

Ser íle Cys Ser Asn Glu Gly Leu íle Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys 35 4045

Glu Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gin Arg His Arg Lys 50 5560

Met Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys

6570 <210> 31 <211> 70 <212> PRT <213> Escherichia coli <400>31

Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 15 1015

Ser ARg Gin íle Pro Gin Asn Phe íle Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser 20 2530

Ser Gin Cys Ser Lys Pro Gly Val íle Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg 35 4045

Gin Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gin Lys Tyr Val Ser 50 5560

Asp Leu Glu Leu Ser Ala

6570 <210> 32 <211> 68 <212>PRT <213> Escherichia coli <400> 32

Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr íle Ser Gin Ser 15 1015 íle Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys 20 2530

Ser Lys Pro Gly Val íle Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gin Val Cys 35 4045

Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val Gin Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys 50 5560

Pro Tyr Ser íle <210>33 <211> 68 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 33

Gin Val Gly Thr Asn Lys Glu Leu Cys Cys Leu Val Tyr Thr Ser Trp 15 1015

Gin íle Pro Gin Lys Phe íle Val Asp Tyr Ser Glu Thr Ser Pro Gin

2530

Cys Pro Lys Leu Gly Val íle Leu Leu Thr Lys Arg Gly Arg Gin íle 35 4045

Cys Ala Asp Pro Asn Lys Lys Trp Val Gin Lys Tyr íle Ser Asp Leu 50 5560

Lys Leu Asn Ala <210> 34 <211> 76 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 34

Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp Cys Cys íle Ser Tyr Thr Pro 15 1015

Arg Ser íle Pro Cys Ser Leu Leu Glu Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser

2530

Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val íle Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg 35 4045

Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gin Val Gin Val Cys Met Arg Met 50 55 60

Leu Lys Leu Asp Thr Arg íle Lys Thr Arg Lys Asn

70 75 <210> 35 <211> 74 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 35

Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys

5 1015

Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys íle Pro Arg Gin Arg íle Met Asp 20 2530

Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gin Cys Ser Lys Pro Gly íle Val Phe íle

4045

Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val 50 5560

Gin Asp Tyr íle Lys Asp Met Lys Glu Asn

6570 <210>36 <211>96 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 36

Pro Lys Val Pro Glu Trp Val Asn Thr Pro Ser Thr Cys Cys Leu Lys 15 1015

Tyr Tyr Glu Lys Val Leu Pro Arg Arg Leu Val Val Gly Tyr Arg Lys

2530

Ala Leu Asn Cys His Leu Pro Ala íle íle Phe Val Thr Lys Arg Asn

4045

Arg Glu Val Cys Thr Asn Pro Asn Asp Asp Trp Val Gin Glu Tyr íle 50 5560

Lys Asp Pro Asn Leu Pro Leu Leu Pro Thr Arg Asn Leu Ser Thr Val 65 70 7580

Lys íle íle Thr Ala Lys Asn Gly Gin Pro Gin Leu Leu Asn Ser Gin

9095 <210>37 <211> 76 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 37

Gin Pro Asp Ser Val Ser íle Pro íle Thr Cys Cys Phe Asn Val íle

5 1015

Asn Arg Lys íle Pro íle Gin Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg íle Thr

2530

Asn íle Gin Cys Pro Lys Glu Ala Val íle Phe Lys Thr Lys Arg Gly

4045

Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met 50 5560

Lys His Leu Asp Gin íle Phe Gin Asn Leu Lys Pro

7075

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použitie CC chemokínového mutanta, ktorý obsahuje aspoň dve mutácie v katiónovom mieste 40’s slučky a ktorý má v porovnaní so štandardným typom molekuly zníženú GAG-viažucu aktivitu, na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie sklerózy multiplex a/alebo iných demyelinačných ochorení, pričom CC chemokín je vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje RANTES, ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β, MIP-3, MIP-4, HCC1, 1309,135612 a MCP-2.

2. Použitie podľa nároku 1, kde chemokínovým mutantomje RANTES mutant.

3. Použitie podľa nároku 2, kde CC chemokínovým mutantomje RANTES trojitý mutant, v ktorom sú tri zásadité aminokyseliny v katiónovom mieste 40’s slučky substituované inými aminokyselinami.

4. Použitie podľa nároku 3, kde sú tri zásadité aminokyseliny v katiónovom mieste 40’s slučky substituované alanínom, serínom, treonínom, prolínom alebo glycínom.

5. Použitie podľa nároku 4, kde CC chemokínovým mutantomje RANTES mutant so sekvenciou č. 2.

6. Použitie podľa nároku 4, kde CC chemokínovým mutantomje RANTES mutant so sekvenciou č. 3.

7. Použitie podľa nároku 1, kde CC chemokínovým mutantomje ΜΙΡ-Ια mutant so sekvenciou č. 4.

8. Použitie podľa nároku 1, kde CC chemokínovým mutantomje MIP-Ιβ mutant so sekvenciou č. 5.

9. Farmaceutický prostriedok na liečenie sklerózy multiplex a/alebo iných demyelinačných ochorení, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako účinnú zložku chemokínový mutant podľa nárokov 1 až 8 spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

10. Skrátený a mutovaný humánny RANTES, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu uvedenú ako sekv. č.

2.

11. DNA molekula zahŕňajúca DNA sekvencie kódujúce skrátený a mutovaný RANTES podľa nároku

10.

12. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA molekulu podľa nároku 11.

13. Hostiteľská bunka obsahujúca expresný vektor podľa nároku 12.

14. Rekombinantný spôsob prípravy polypeptidu podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultivovanie buniek podľa nároku 13 v príslušnom kultivačnom médiu.