JP2023526218A - 生体高分子標的特異的補体阻害剤及びその製造方法と応用 - Google Patents
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Abstract
本願は生体高分子標的特異的補体阻害剤の融合タンパク質に関し、以下を含む:(i)CRIg細胞外ドメイン、(ii)補体制御ドメインと(iii)増強ドメイン、また前記融合タンパク質の製造方法と使用、及び前記融合タンパク質を含む医薬組成物。本願の融合タンパク質は、著しい標的補体阻害効果を有するだけでなく、補体異常活性化に関連する様々なヒト疾患の治療及び予防のための薬物形成及び/又は生産の増加を促進することができる。
Description
本願は、バイオ医薬品の分野に関するものであり、より具体的には、生体高分子標的特異的補体阻害剤の設計、調製及び臨床応用に関するものである。
補体系は、自然免疫の重要な構成要素であると同時に、獲得免疫の重要な調節因子であり、自然免疫と獲得免疫の両者間における橋渡し役でもある。補体系は、30以上の活性化因子、阻害因子、補体受容体からなる非常に複雑な自己制御カスケードであり、その主な生理的機能は、侵入した病原微生物や宿主細胞の残骸を除去し、免疫及び炎症プロセス全体を調整することであり、免疫監視と自己安定化のための重要なシステムである(Ricklin et al., 2010)。
補体系の活性化は、一般に、IgG及びIgM抗体による古典経路、細菌表面のマンノースによるレクチン経路、病原体の細胞壁/シトゾルの様々な成分やセロトニンなどの補体C3b類似物質による代替経路の3つがあり、さらに、C3が水和することによって自動的に活性化され得る。
そして、補体の活性化は、主に3つの方法でその生理作用を発揮する(Dunkelberger and Song, 2010)。まず、補体成分C3及びC5によってそれぞれ産生されるC3a、特にC5aは、免疫細胞に発現する受容体C3aR又はC5aR1及びC5L2と結合することにより、様々な免疫細胞をリクルートして炎症性サイトカイン(TNF-α, IL-1, IL-6, etc)やケモカイン(MCP-1、MIP-2,KC、CINCなど)を分泌させ(Riedemann et al., 2003)、それによって補体活性化部位に局所的に強い炎症促進効果をもたらす。すなわち、炎症促進効果をもたらす。
第二に、C3活性化のもう一つの産物であるC3bとそのさらなる分解産物であるiC3bは、補体攻撃を受けた標的細胞の表面に挿入され、これらの異物に「タグ」を付け、CR1/CR2/CR3/CR4/CRIgなどの免疫細胞上に発現する複数の受容体に結合し、最終的には免疫細胞によって貪食又は溶解されることが可能となる。そして、これらの異種成分は、免疫細胞によって貪食される、すなわち、貪食作用が媒介される。
第三に、C5活性化のもう一つの産物であるC5bも補体によって攻撃される標的細胞の表面に挿入され、補体C6及びC7に結合して安定な複合体C5b-7を形成し、さらにC8及びC9に結合して最終的にC9が多量化して膜攻撃複合体(MAC)とも呼ばれるC5b-9n複合体ができ、これが最終的に標的細胞の内径に複合体を形成することが可能である。これにより、標的細胞膜に内径5nm、外径20nm、高さ15nmの孔が形成され、細胞内外の浸透圧が変化して細胞が直接溶解する効果、すなわちセルライシス効果を発揮する(Tegla et al., 2011)。
このような正常体細胞への補体活性化の生理的影響を回避するために、生体は10種類以上の補体調節タンパク質を進化させ、これが細胞膜に発現したり血液系に循環したりすることにより、補体活性化の段階ごとに補体活性化を抑制している。例えば、細胞膜に発現している補体抑制タンパク質CR1、CD46、CD55、CD59や、血中を自由に循環しているC1-INH、C4BP、FH、Vitronectin、S proteinなどである。体細胞が補体活性化時に補体による殺傷を避けることができるのは、この補体制御タンパク質によるものである。
補体系は、正常な状態では自己防衛的な免疫機構ではあるが、補体活性化産物の濃度上昇や補体調節タンパク質の濃度低下、あるいは欠損など、体内の特定の異常状態により、補体が過度に活性化し、自己の組織細胞に攻撃を加えてしまうことで、最終的には、発作性夜間血色素尿症(PNH)、ヘモグロビン尿症(PNH)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、全身性重症筋無力症(gMG)、視神経脊髄炎スペクトラム障害(NMOSSD)、加齢黄斑変性症(AMD)、自己溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、再生不良性貧血、全身性エリテマトーデス、強直性リウマチ性関節炎 関節リウマチ、強直性脊椎炎、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病(認知症)、喘息、アレルギー、乾癬、多発性硬化症、クローン病など(Ricklin and Lambris, 2007)の疾患を引き起こすことになる。補体の過剰な活性化は、特に発症初期の自己免疫疾患の発症に強く関連している。したがって、補体系の阻害剤は、これらの疾患の進行の初期に介入することができ、臨床的に大きな利点と需要が考えられる。
数多くの自己免疫疾患や急性・慢性感染症の病態における補体系の重要性に基づき、30近い製薬会社から50近くの補体阻害剤が様々な開発段階にあり、より最適な補体阻害剤の開発が依然として必要であることが間接的に示されている。
本願は融合タンパク質を提供し、以下を含む:(i)CRIg細胞外ドメイン、(ii)補体制御ドメイン、前記補体制御ドメインが因子 H (FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む;及び(iii)増強ドメイン、前記増強ドメインがIgG Fcドメイン及びヒト血清アルブミンからなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。
本願発明者らは、予想外に、他の補体調節タンパク質FH、CD55、CD46、CD59又はCR1と連結し、さらにIgG Fc断片又はHSAと連結したCRIgは、より顕著な補体阻害効果を有するだけでなく、精製及び薬物動態(PK)/薬力学(PD)効果の改善などの薬剤形成特性の向上に資することができることを見出した。
いくつかの実施形態では、本願発明によると、補体成分C3が活性化した後に生じる断片C3b及び/又はiC3bと結合することによって標的作用を発揮するCRIgと、補体阻害効果を有するもう一つの成分、例えばFH、CD55、CD46、CD59又はCR1等の別の成分(CD59を除く全てのCDは、単一のCRIg、FH、CD55、CR1に比べて、C3bおよび/またはiC3bの異なる位置に同時に安定して結合し、それによってC3b/iC3bの作用をより効果的に阻害する)とが、さらにIgG Fc断片又はHSAと連結して、融合タンパク質を生成し(例えば、遺伝子工学の方法によって)、これにより組み換え結合した補体調節タンパク質を局所的な補体活性化部位に送達され、最終的に補体活性化を標的として阻害することができる。この種類の薬剤は、補体の異常な活性化に関連するヒトのさまざまな疾患の治療や予防に用いることができる。
一方、本願は融合タンパク質を提供し、以下を含む:(i)CRIg細胞外ドメイン、(ii)補体制御ドメイン、前記補体制御ドメインが因子 H (FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む;及び(iii)増強ドメイン、前記増強ドメインがIgG Fcドメイン及びヒト血清アルブミンからなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、前記CRIg細胞外ドメインは、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記CRIg細胞外ドメインのC末端は、前記補体制御ドメインのN末端に直接又は間接的に接続されている。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインのC末端は、前記増強ドメインのN末端に直接又は間接的に接続されている。
いくつかの実施形態では、前記CRIg細胞外ドメインのN末端は、前記補体制御ドメインのC末端に直接又は間接的に接続されている。
いくつかの実施形態では、前記CRIg細胞外ドメインのC末端は、前記増強ドメインのN末端に直接又は間接的に連結されている。
いくつかの実施形態では、前記間接連結はリンカーによって連結されている。
いくつかの実施形態では、前記リンカーは、配列番号44、46、48及び50のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、配列番号8、18、20、22、62及び64のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記増強ドメインはヒト血清アルブミンである。
いくつかの実施形態では、前記ヒト血清アルブミンは、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、一本鎖構造である。
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端の順に、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン、及び前記増強ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端の順に、前記補体制御ドメイン、前記CRIg細胞外ドメイン、及び前記増強ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号14に示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記増強タンパク質は、IgG Fcドメインを含む。
いくつかの実施形態では、前記IgGは、ヒトIgG1及びヒトIgG4からなる群より選択されるタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、前記IgGドメインは、配列番号10、30、32及び34のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、第1ポリペプチド鎖及び第2ポリペプチド鎖を含み、前記第1ポリペプチド鎖が、前記CRIg細胞外ドメイン、前記第1補体制御ドメイン及び前記第1IgG Fcドメインを含み、前記第2ポリペプチド鎖が、前記CRIg細胞外ドメイン、前記第2補体制御ドメイン及び前記第2IgG Fcドメインを含む。
ここで、第1前記IgG Fcドメインと第2前記IgG Fcドメインは相互に作用して二量体を形成することができる。
いくつかの実施形態では、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、因子H(FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、前記第1補体制御ドメインが、前記第2補体制御ドメインと同一である。
いくつかの実施形態では、前記第1IgG Fcドメインが、前記第2IgG Fcドメインと同一である。
いくつかの実施形態では、前記第1IgG Fcドメイン及び前記第2IgG Fcドメインは、配列番号10及び30のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第1ポリペプチド鎖は、第2ポリペプチド鎖と同一である。
いくつかの実施形態では、前記第1ポリペプチド鎖及び/又は前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、26、28、58、60、66及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第1補体制御ドメインが、前記第2補体制御ドメインと異なる。
いくつかの実施形態では、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、CD59及びCD55からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、FH及びCD55からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、CD46及びCD59からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、前記第1IgG Fcドメインが、前記第2IgG Fcドメインと同一である。
いくつかの実施形態では、前記第1IgG Fcドメインが、前記第2IgG Fcドメインと異なる。
いくつかの実施形態では、前記第1IgG Fcドメインは、配列番号32及び34のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第2IgG Fcドメインは、配列番号32及び34のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号36、38、40及び42のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号36、38、40及び42のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、
前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号40に示されるアミノ酸配列を含む;あるいは
前記第1ポリペプチド鎖は配列番号36に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む;
前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む。
前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号40に示されるアミノ酸配列を含む;あるいは
前記第1ポリペプチド鎖は配列番号36に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む;
前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む。
一方、本願は、前記融合タンパク質又はその断片をコードする1つ以上の単離核酸分子を提供する。
一方、本願は、前記核酸分子を含む、ベクターを提供する。
一方、本願は、前記ベクターを含む細胞、又は前記融合タンパク質を発現する細胞を提供する。
一方、本願は、前記融合タンパク質を調製する方法であって、前記融合タンパク質又はその断片を合成する工程、及び/又は、前記融合タンパク質又はその断片を発現する条件下で前記細胞を培養する工程を含んでいてもよい。
一方、本願は、前記融合タンパク質、及び任意に薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物を提供する。
一方、本願は、薬剤調製における前記融合タンパク質又は前記医薬組成物の使用を提供し、前記薬剤は、補体活性化の標的阻害に関連する疾患を治療するために用いられる。
いくつかの実施形態では、前記疾患は自己免疫疾患を含む。
いくつかの実施形態では、前記疾患は自己免疫性重症筋無力症を含む。
当業者は、本願の他の態様及び利点について、以下の詳細な説明から容易に洞察することができる。以下の詳細な説明では、本願の例示的な実施形態のみを示し、説明する。当業者が認識するであろうように、本願の内容は、当業者が、本願に係る発明の精神及び範囲を逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることを可能にするものである。したがって、本願の添付図面及び明細書の記載は単なる例示であり、限定的なものではない。
本願に係る発明の具体的な特徴は、特許請求の範囲に記載のとおりである。本願で詳細に説明される例示的な実施形態及び添付図面を参照することによって、本願に係る発明の特徴及び利点をよりよく理解することができる。添付図面の概略説明は以下のとおりである。
以下では、特定の具体的な実施形態を用いて本願発明の実施形態を説明するが、この技術に精通している者は、本願で開示されることにより、本願発明の他の利点及び効果を容易に理解され得る。
用語定義
本願では、「補体制御ドメイン」という用語は、一般に、補体系の活性化を阻害することが可能な物質を意味する。補体系の活性化は、一般に、IgG及びIgM抗体による古典経路、細菌表面のマンノースによるレクチン経路、病原体の細胞壁/シトゾルの様々な成分やセロトニンなどの補体C3b類似物質による代替経路の3つがあり、さらに、C3が水和することによって自動的に活性化され得る。前記補体制御ドメインは、活性化の異なる段階において阻害することができる。本願記載の補体制御ドメインは、補体調節タンパク質又はその機能的断片に由来してもよく、血液循環中に存在する補体阻害剤及び細胞膜表面との補体膜調節タンパク質を包含し、以下を含むが、これらには限定されない。例えばC1-INH(C1インヒビター、C1阻害タンパク質)、C4BP(C4結合タンパク質)、因子I(factor I、FI)、因子H(factor H、FH)、Sタンパク質(S-protein)、クラスタリン(Clusterin)、CD35(CR1とも呼ばれる)、CD46(MCPとも呼ばれる)、CD55(DAFとも称される)及び/又はCD59、さらにはCRIg自体の完全長又は部分配列をも含む。
本願では、「補体制御ドメイン」という用語は、一般に、補体系の活性化を阻害することが可能な物質を意味する。補体系の活性化は、一般に、IgG及びIgM抗体による古典経路、細菌表面のマンノースによるレクチン経路、病原体の細胞壁/シトゾルの様々な成分やセロトニンなどの補体C3b類似物質による代替経路の3つがあり、さらに、C3が水和することによって自動的に活性化され得る。前記補体制御ドメインは、活性化の異なる段階において阻害することができる。本願記載の補体制御ドメインは、補体調節タンパク質又はその機能的断片に由来してもよく、血液循環中に存在する補体阻害剤及び細胞膜表面との補体膜調節タンパク質を包含し、以下を含むが、これらには限定されない。例えばC1-INH(C1インヒビター、C1阻害タンパク質)、C4BP(C4結合タンパク質)、因子I(factor I、FI)、因子H(factor H、FH)、Sタンパク質(S-protein)、クラスタリン(Clusterin)、CD35(CR1とも呼ばれる)、CD46(MCPとも呼ばれる)、CD55(DAFとも称される)及び/又はCD59、さらにはCRIg自体の完全長又は部分配列をも含む。
本願では、「CD55」という用語は、一般に、補体崩壊促進因子又はDAFにもなる補体調節タンパク質を意味する。CD55は、補体成分C4(古典経路又はレクチン経路)又はC3(代替経路)の活性化の際に生じるC4b及びC3b断片を認識し、補体系を制御する。CD55は、古典経路及びレクチン経路の細胞関連C4bと相互作用し、C2のC2bへの転換を妨害し、それによってC4b2b C3転換酵素の生成を防ぐことができる。CD55はまた代替経路のC3bと相互作用し、因子BによるBbの転換を妨害し、それによって代替経路のC3bBc C3転換酵素の生成を防ぐことができる。本願記載のCD55は、完全長CD55タンパク質又はその断片、並びにその種々の変種(例えば、変異体、アイソフォーム)を含み得る。例えば、前記CD55をコードする例示的な核酸分子は、配列番号17に示されるヌクレオチド配列を含んでよく、例示的なCD55タンパク質は、配列番号18に示されるタンパク質配列を含んでいてもよい。
本願では、「CD59」という用語は、一般に、補体調節タンパク質を指し、「膜侵襲複合体(MAC)阻害タンパク質」(MAC-IP)、「反応性溶解の膜阻害剤」(MIRL)、ヒト赤血球膜の Mac 形成阻害因子(MACIF)やプロテクチンとも呼ばれ、LY6/uPAR/α-neurotoxinファミリーに属するタンパク質である。CD59はグリコフォスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して宿主細胞に結合することができる。補体の活性化によって宿主細胞上にC5b678複合体が沈着すると、CD59はC9の重合と補体膜侵襲複合体の形成を阻止することができる。本願記載のCD59は、完全長CD59タンパク質又はその断片、並びにその種々の変種(例えば、変異体、アイソフォーム)を含み得る。例えば、前記CD59をコードする例示的な核酸分子は、配列番号21に示されるヌクレオチド配列を含んでよく、例示的なCD59タンパク質は、配列番号22に示されるタンパク質配列を含んでいてもよい。
本願では、「CD46」という用語は、一般に、補体調節タンパク質を指し、膜補因子タンパク質(MCP)とも呼ばれる。一般にCD46は補因子活性を持ち、血清因子Iを介して補体成分C3bとC4bを不活性化(熱分解)することにより、補体によるダメージから宿主細胞を保護する。本願記載のCD46は、完全長CD46タンパク質又はその断片、並びにその種々の変種(例えば、変異体、アイソフォーム)を含み得る。例えば、前記CD46をコードする例示的な核酸分子は、配列番号19に示されるヌクレオチド配列を含んでよく、例示的なCD59タンパク質は、配列番号20に示されるタンパク質配列を含んでいてもよい。
本願では、「因子H(FH)」という用語は、一般に、補体活性化調節因子ファミリーのメンバーである補体調節タンパク質を意味する。FHの主な機能は、補体系の代替経路を調節し、宿主組織にダメージを与えることなく、病原体やその他の危険な物質に対して機能するようにすることである。FHの配列は通常、ショートコンセンサスリピート(SCR)と呼ばれる高度に保存されたモチーフを多数持っている。各SCRは約60アミノ酸からなり、2つのジスルフィド結合、高置換度ループ、3-8残基の短いSCRリンカーからなる。FHは通常20個のSCRで構成され、FHの機能特性は通常SCRに局在する。本願記載のFHは、完全長FHタンパク質又はその断片(例えば、1つ又は複数のSCR)、並びにその種々の変種(例えば、変異体、アイソフォーム)を含み得る。例えば、前記FHをコードする例示的な核酸分子は、配列番号3に示されるヌクレオチド配列を含んでよく、例示的なFHタンパク質は、配列番号4に示されるタンパク質配列を含んでいてもよい。例えば、本願記載のFHは、SCR1-5ドメインを含んでよく、前記FH SCR1-5ドメインをコードする例示的な核酸分子は、配列番号7に示されるヌクレオチド配列を含んでよく、例示的なFH SCR1-5ドメインは、配列番号8に示されるタンパク質配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記FHは、他のSCR断片を含んでいてもよい。
本願では、「CR1」という用語は、一般に、C3b/C4b受容体又はCD35としても知られる補体制御タンパク質を意味する。CR1は合計30個のSCR又はCCP配列を持ち、そのうちCCP1-3はC4bに、CCP8-11及びCCP15-18はC3bに結合することによって、補体阻害効果を発揮する。本願記載のCR1は、CCP8-11又はCCP15-18、並びにその種々の変種(例えば、変異体、アイソフォーム)を含み得る。例えば、本願記載のCR1は、CCP8-11ドメインを含んでよく、前記CR1タンパク質CCP8-11ドメインをコードする例示的な核酸分子は、配列番号61に示されるヌクレオチド配列を含んでよく、例示的なCR1タンパク質CCP8-11ドメインは、配列番号62に示されるタンパク質配列を含んでいてもよい。例えば、本願記載のCR1は、CCP15-18ドメインを含んでよく、前記CR1タンパク質CCP15-18ドメインをコードする例示的な核酸分子は、配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含んでよく、例示的なCR1タンパク質CCP15-18ドメインは、配列番号64に示されるタンパク質配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記CR1は、他のCCP断片を含んでいてもよい。CR1タンパク質CCP8-11とCCP15-18をコードするドメインは、3つのアミノ酸しか違わず、機能的には同一であるため、本願ではCR1タンパク質CCP8-11ドメインを実施例として使用することにした。
本願では、「一本鎖構造」という用語は、一般に、共有結合(例えば、ペプチド結合)によって連結されたアミノ酸の鎖を意味する。一本鎖構造は、ポリペプチド断片の結合によって生成されてもよく、又はポリペプチド断片をコードする核酸の結合が発現される前に生成されてもよい。例えば、同一又は異なる由来の複数のポリペプチド鎖が、一本鎖構造の融合タンパク質を形成することもある。
本願では、「ヒト血清アルブミン(HSA)」という用語は、一般に、ヒト遺伝子ALBによってコードされる球状タンパク質を意味し、通常、血漿中に存在するものである。天然HSAは、ドメインI、ドメインII、ドメインIIIの3つのドメインを持つ一本のポリペプチドから構成されている。各ドメインは、A及びBの2つのサブ領域からなり、対向する溝を持つ円筒状の構造を形成することができるため、HSAの構造は比較的柔軟である。親水性をも有している。本明細書では、この用語は、天然由来(例えば、血漿由来)HSA、人工合成(例えば、遺伝子組み換え技術により合成された)HSAを含み得る。この用語は、完全長HSA又はその機能的断片を包含する。HSAタンパク質をコードする例示的な核酸分子は、配列番号11に示されるヌクレオチド配列を含んでよく、例示的なHSAタンパク質は、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、「増強ドメイン」という用語は、一般に、補体阻害効果を増強するポリペプチドドメインを意味する。前記補体阻害効果は、補体阻害活性を有する物質(例えば、補体制御ドメイン)の補体抑制活性の強度を高めること、強い補体活性抑制を有する物質(例えば、補体制御ドメイン)の補体抑制期間を長くすること、補体活性抑制を有する物質(例えば、補体制御ドメイン)の分解期間を短くすること、及び/又は補体活性抑制を有する物質(例えば、補体制御ドメイン)の血中濃度半減期を長くすることを含んでいてもよい。前記増強ドメインは、HSA、IgG1、IgG2、IgG3及び/又はIgG4 Fcからなるドメインを含んでいてもよい。本願では、前記増強ドメイン及び補体制御ドメインは、同一のポリペプチド鎖上にある、又は、異なるポリペプチド鎖上に位置していてもよい。
本願では、「IgG Fcドメイン」という用語は、一般に、免疫グロブリンFc領域又はそのドメインを指し、IgG1、IgG2、IgG3及び/又はIgG4からなるFcドメインを含んでいてもよい。
本願では、「CRIg」という用語は、一般に、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する補体膜調節タンパク質を意味する。CRIgは、iC3b(非活性化C3b)を特異的に認識し、C3転換酵素の活性化を阻害することにより、補体カスケード反応の初期に抑制効果をもたらす。前記CRIgは、異なる種由来のCRIg、例えば、ヒト又はマウスのCRIgを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記CRIgは、ヒトCRIgに由来していてもよい。ヒトCRIgは、V末端及びC2末端Igドメインからなる長い形態のCRIgを含んでいてもよい。ヒトCRIgは、V末端Igドメインからなる短い形態のCRIをも含む。CRIgをコードする例示的な核酸配列は、配列番号 1に示される通りであってもよく、例示的なCRIgタンパク質は、配列番号 2に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。一般に、CRIgの機能領域は、その細胞外ドメインに存在する。また「CRIg細胞外ドメイン」という用語は、一般に、CRIg細胞外機能領域を含み、CRIg細胞外ドメインをコードする例示的な核酸配列は、配列番号5に示される通りであってもよく、CRIgの例示的な細胞外ドメインは配列番号6に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、「ベクター」という用語は、一般的に、適切な宿主細胞内で自己複製することができる核酸分子であって、挿入された核酸分子を宿主細胞内及び/又は宿主細胞間に移すものを意味する。前記ベクターは主にDNA又はRNAを細胞に挿入するために使用されるベクター、主にDNA又はRNAを複製するために使用されるベクター、及び主にDNA又はRNAの転写及び/又は翻訳の発現に使用されるベクターが含まれていてもよい。前記ベクターはまた、前記の様々な機能を有するベクターを含む。前記ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたときに、ポリペプチドに転写又は翻訳されるポリヌクレオチドである場合もある。通常、前記ベクターを含む適切な宿主細胞を培養することにより、前記ベクターは、所望の発現産物を産生することができる。
本願では、「細胞」という用語は、一般的に、本願記載の核酸分子からなるプラスミド又はベクターを含むことができる、又は含んだことがある、あるいは本願記載の抗原結合断片を発現することができる個々の細胞、細胞株又は細胞培養物を意味する。前記細胞は、単一の宿主細胞の子孫で構成されていてもよい。自然変異、偶発的変異又は意図的な変異により、娘細胞は必ずしも元の親細胞と形態的又はゲノム的に完全に同一ではない場合があるが、本願記載の抗体又はその抗原結合断片を発現できるものであればよい。前記細胞は、本願記載のベクターを用いて細胞をin vitroでトランスフェクトすることによって得ることができる。前記細胞は、原核細胞(例えば大腸菌)又は真核細胞(例えば酵母細胞、例えばCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞又はミエローマ細胞)であってもよい。いくつかの実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞であってもよい。例えば、前記哺乳類細胞は、CHO-K1細胞であってもよい。
本願では、「組み換え細胞」という用語は、一般に、組み換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。前記組み換え宿主細胞には、特定の細胞だけでなく、これらの細胞の子孫も含まれる。
本願では、「薬学的に許容されるベクター 」という用語は、一般に、採用される用量及び濃度において、それに曝露される細胞又は哺乳動物に対して無毒である薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤又は安定化剤を含む。一般に、生理学的に許容されるベクターは、pH緩衝溶液である。生理学的に許容されるベクターの例としては、以下を含み得るが、これらには限定されない。リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸などの酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性高分子;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノースま又はデキストリンを含むその他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの塩を形成する対イオン;及び/又はTWEEN(登録商標)、ポリエチレングリコール(PEG)及びPLURONICS(登録商標)などの非イオン性界面活性剤。
本願では、「補体活性化の標的阻害に関連する疾患」という用語は、一般に、異常な補体活性化、補体活性化産物のレベル及び/又は活性の上昇、又は補体調節タンパク質(例えば、CD55、CD59及び/又はFH)のレベル及び/又は活性の低下によって引き起こされ得る過剰な補体活性化に起因する障害の阻害を意味する。例えば、正常な状態と比べて、補体調節タンパク質の発現量の減少、補体調節タンパク質遺伝子の複製及び/又は転写レベルの低下、補体調節タンパク質の翻訳過程の異常などにより、補体活性化が調節不可となる。
補体の過剰な活性化は、異常な(例えば、過剰な)炎症反応、オプソニン作用及び/又は細胞溶解作用をもたらす可能性がある。いくつかの実施形態では、身体が正常な自己抗原に対する自己抗体を産生し、これが抗原に結合すると、補体経路を活性化し、補体阻害活性化に関連する物質(例えば、補体調節タンパク質)のレベル及び/又は活性の低下により、自身の組織、器官及び細胞に対する免疫損傷をもたらし、最終的に自己免疫疾患に至る。いくつかの実施形態では、補体活性化の標的阻害に関連する疾患は、自己免疫疾患を含む。いくつかの実施形態では、前記補体活性化の標的阻害に関連する疾患は、急性又は慢性感染症によって引き起こされ得る。
いくつかの実施形態では、前記補体活性化の標的阻害に関連する疾患は、遺伝子変異によって引き起こされ得る。補体活性化の標的阻害に関連する疾患としては、以下からなる群より選択され得る:発作性夜間血色素尿症(PNH)、ヘモグロビン尿症(PNH)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、全身性重症筋無力症(gMG)、視神経脊髄炎スペクトラム障害(NMOSSD)、加齢黄斑変性症(AMD)、自己溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、再生不良性貧血、全身性エリテマトーデス、強直性リウマチ性関節炎 関節リウマチ、強直性脊椎炎、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病(認知症)、喘息、アレルギー、乾癬、多発性硬化症、クローン病。例えば、前記疾患は自己免疫性重症筋無力症である。
本願では、「自己免疫性重症筋無力症」という用語は、一般に、神経-筋肉シグナル伝達が遮断され、それによって骨格筋の強度に影響を及ぼす慢性自己免疫疾患を意味する。補体が過剰に活性化され、神経筋接合部のシナプス後膜のタンパク質であるアセチルコリン受容体や受容体関連タンパク質が免疫反応によって攻撃されることにより発症する。自己免疫性重症筋無力症の症状は、時間の経過とともに、目の筋肉から顔や首の筋肉へと徐々に広がり、脱力感、不明瞭な言語、咀嚼・嚥下困難、及び/又は呼吸困難を引き起こし、頭や首から徐々に全身へと広がり、最終的には全身型の重症筋無力症に至る。
融合タンパク質
一方、本願は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、(i)CRIg細胞外ドメインを含み得る。本願記載のCRIg細胞外ドメインは、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、前記CRIg細胞外ドメインは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
一方、本願は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、(i)CRIg細胞外ドメインを含み得る。本願記載のCRIg細胞外ドメインは、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、前記CRIg細胞外ドメインは、配列番号6に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、(ii)補体制御ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、FH又はその機能的断片に由来するタンパク質を含んでよく、前記FHは、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記FHは、配列番号4に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、FHの1つ又は複数のSCRドメインを含んでいてもよい。例えば、前記補体制御ドメインは、FHのSCR1-5ドメインを含んでもよく、前記FHのSCR1-5ドメインは、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記FHは、配列番号8に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、、CD55又はその機能的断片に由来するタンパク質を含んでよく、前記CD55は、配列番号18に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記CD55は、配列番号18に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、、CD59又はその機能的断片に由来するタンパク質を含んでよく、前記CD59は、配列番号22に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記CD59は、配列番号22に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、、CD46又はその機能的断片に由来するタンパク質を含んでよく、前記CD46は、配列番号20に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記CD46は、配列番号20に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、、CR1又はその機能的断片に由来するタンパク質を含んでよく、前記CR1は、配列番号62に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記CR1は、配列番号62に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。又は、前記CR1は、配列番号64に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記CR1は、配列番号64に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願記載の補体制御ドメインは、因子H(FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1から選択される群に由来するタンパク質又はその機能的断片を含み得る。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、配列番号8、18、20、22、62及び64のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、配列番号8、18、20、22、62及び64のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願記載の補体制御ドメインは、因子H(FH)、CD55、CD59及びCR1から選択される群に由来するタンパク質又はその機能的断片を含み得る。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、配列番号 8、18、20、22、62及び64のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体制御ドメインは、配列番号8、18、20、22、62及び64のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、(iii)増強ドメインを含み得る。
いくつかの実施形態では、前記増強ドメインは、IgG Fcドメイン又はその機能的断片を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記IgG Fcドメインは、IgG Fc4ドメインであってもよく、前記IgG Fc4ドメインは、配列番号10に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記増強ドメインは、配列番号10に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記IgG Fcドメインは、IgG Fc1ドメインであってもよく、前記IgG Fc1ドメインは、その変異体を含んでいてもよい。例えば、IgG Fcドメインは、所望の空間構造を得るために変異してもよく、例えば、二量体をより良好に形成するためにknob-hole構造を形成してもよい。例えば、前記IgG Fc1は、配列番号30、32、34のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記増強ドメインは、配列番号30、32及び34のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記増強ドメインは、ヒト血清アルブミン又はその機能的断片を含んでいてもよく、前記ヒト血清アルブミンは、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記増強ドメインは、配列番号12に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、(i)CRIg細胞外ドメイン、(ii)補体制御ドメイン及び(iii)増強ドメインを含み得る。前記融合タンパク質では、前記CRIg細胞外ドメインのC末端が、前記補体制御ドメインのN末端と直接的又は間接的に連結されていてもよく、あるいは、前記補体制御ドメインのC末端が、前記増強ドメインのN末端と直接的又は間接的に連結されていてもよい。例えば、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン、及び前記増強ドメインを含んでいてもよい。例えば、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記補体制御ドメイン、前記CRIg細胞外ドメイン、及び前記増強ドメインを含んでいてもよい。
本願では、前記間接的な連結は、リンカーを介した連結を含み得る。例えば、前記リンカーは、連結ペプチドを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記CRIg細胞外ドメインのC末端は、リンカーによって前記補体制御ドメインのN末端に連結されてもよく、前記リンカーは、配列番号44、46、48及び50のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記リンカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号43、45、47及び49のいずれか一項に示されるものであってもよい。例えば、前記リンカーは、(Gly4Ser)3であってもよい。
いくつかの実施形態では、前記補体抑制ドメインのC末端は、リンカーによって増強ドメインのN末端に連結されてもよく、前記リンカーは、配列番号44、46、48及び50のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記リンカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号43、45、47及び49のいずれか一項に示されるものであってもよい。例えば、前記リンカーは、(Gly4Ser)3であってもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記リンカー、前記補体制御ドメイン、及び前記増強ドメインを含み得る。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記補体制御ドメイン、前記リンカー、前記CRIg細胞外ドメイン、及び前記増強ドメインを含み得る。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記FH、及び前記IgG FCドメイン(例、IgG1 Fc又はIgG4 Fc)を含み得る。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号14又は40に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記リンカー、前記FH、及び前記IgG FCドメイン(例、IgG1 Fc又はIgG4 Fc)を含み得る。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号60に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、及び前記IgG FCドメイン(例、IgG1 Fc又はIgG4 Fc)を含み得る。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号58に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記FH、及び前記HSAを含み得る。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号16に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記CD59、及び前記IgG FCドメイン(例、IgG1 Fc又はIgG4 Fc)を含み得る。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号28又は42に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記CD55、及び前記IgG FCドメイン(例、IgG1 Fc又はIgG4 Fc)を含み得る。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号24又は38に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記CR1、及び前記IgG FCドメイン(例、IgG1 Fc又はIgG4 Fc)を含み得る。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号66又は68に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、一本鎖構造であり得る。
本願では、前記融合タンパク質は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、前記FH SCR1-5、及び前記ヒト血清アルブミンを含み得る。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号16に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記融合タンパク質は、配列番号16に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、第1ポリペプチド鎖又は第2ポリペプチド鎖であり得る。
いくつかの実施形態では、前記第1ポリペプチド鎖は、前記CRIg細胞外ドメイン、前記第1補体制御ドメイン、及び前記第1IgG Fcドメインを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記第1補体制御ドメインは、因子H(FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第1補体制御ドメインは、因子H(FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第1IgG Fcドメインは、IgG1 Fc及びIgG4 Fcからなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第2ポリペプチド鎖は、前記CRIg細胞外ドメイン、前記第2補体制御ドメイン、及び前記第2IgG Fcドメインを含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第2補体制御ドメインは、因子H(FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第2補体制御ドメインは、因子H(FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第2IgG Fcドメインは、IgG1 Fc及びIgG4 Fcからなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、26、28、38、40、42、58、60、66、及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、26、28、38、40、42、58、60、66及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、28、38、40、42、58、60、66、及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、28、38、40、42、58、60、66及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、26、28、38、40、42、58、60、66、及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、26、28、38、40、42、58、60、66及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、28、38、40、42、58、60、66、及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、28、38、40、42、58、60及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記融合タンパク質は、第1ポリペプチド鎖及び第2のポリペプチド鎖を含むことができ、前記第1ポリペプチド鎖の前記第1IgG Fcドメインと前記第2ポリペプチド鎖の前記第2IgG Fcドメインとは、相互に作用して二量体を形成することができる。
本願では、融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖の前記第1補体制御ドメインは、前記第2ポリペプチド鎖の前記第2補体制御ドメインと同じであってもよい。例えば、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインは、因子H(FH)、CD46、CD55、CD59及びCR1からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含んでいてもよい。例えば、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインは、因子H(FH)、CD55及びCD59からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖の前記第1IgG Fcドメインは、前記第2ポリペプチド鎖の前記第2IgG Fcドメインと同じであってもよい。例えば、第1IgG Fcドメイン及び/又は第2IgG Fcドメインが、配列番号10及び30のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記第1IgG Fcドメイン及び/又は前記第2IgG Fcドメインは、配列番号10及び30のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記融合タンパク質は、第1ポリペプチド鎖及び第2ポリペプチド鎖を含んでよく、前記第1ポリペプチド鎖及び前記第2ポリペプチド鎖は、同一であってもよい。例えば、前記第1ポリペプチド鎖及び/又は前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、26、28、58、及び60のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記第1ポリペプチド鎖及び/又は前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、28のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。例えば、前記第1ポリペプチド鎖及び/又は前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号14、24、26、28、58、及び60のいずれか一項に示されるアミノ酸配列の少なくとも90%に相同なアミノ酸配列、例えば、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%のいずれか一項に相同なアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖の前記第1補体制御ドメインは、前記第2ポリペプチド鎖の前記第2補体制御ドメインと異なっていてもよい。例えば、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、CD59及びCD55からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。例えば、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、FH及びCD55からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。例えば、前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、CD46及びCD59からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖の前記第1IgG Fcドメインは、前記第2ポリペプチド鎖の前記第2IgG Fcドメインと同じであってもよい。
例えば、前記第1IgG Fcドメイン及び/又は前記第2IgG Fcドメインが、配列番号10及び30のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖の前記第1IgG Fcドメインと前記第2ポリペプチド鎖の前記第2IgG Fcドメインと異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖の前記第1IgG Fcドメインと前記第2ポリペプチド鎖の前記第2IgG Fcドメインと異なっていてもよい。
例えば、前記第1IgG Fcドメインは、配列番号32に示される酸配列を含んでよく、前記第2IgG Fcドメインは、配列番号34に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖又は前記第2ポリペプチド鎖は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、CD46、及びIgG1 Fcを含んでいてもよい。
例えば、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号36に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖又は前記第2ポリペプチド鎖は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、CD55、及びIgG1 Fcを含んでいてもよい。
例えば、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号38に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記融合タンパク質の前記第2ポリペプチド鎖又は前記第2ポリペプチド鎖は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、FH、及びIgG1 Fcを含んでいてもよい。
例えば、前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号40に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記融合タンパク質の前記第2ポリペプチド鎖又は前記第2ポリペプチド鎖は、N末端からC末端にかけて、順に前記CRIg細胞外ドメイン、CD59、及びIgG1 Fcを含んでいてもよい。前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号42に示されるアミノ酸配列を含み得る。
例えば、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号36、38、40、42のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号38、40、42のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記第2ポリペプチド鎖は、配列番号36、38、40、42のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記第1ポリペプチド鎖は、配列番号38、40、42のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含んでよく、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含んでよく、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号40に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含んでよく、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
例えば、前記融合タンパク質の前記第1ポリペプチド鎖は配列番号36に示されるアミノ酸配列を含んでよく、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
本願では、前記第1ポリペプチド鎖、前記第2ポリペプチド鎖、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン(例えば、前記因子H(FH)、CD46、CD55及びCD59)、前記増強ドメイン(例えば、前記IgG Fcドメイン及び/又はヒト血清アルブミン及び/又は前記融合タンパク質)は、上記のそれぞれのアミノ酸配列を含むだけでなく、それぞれのアミノ酸配列の変異体をも含むことができる。
本願では、前記アミノ酸配列の変異体は、1)対応するアミノ酸配列と少なくとも90%(例えば、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも100%)の配列相同性を有するアミノ酸配列;及び/又は、
2)対応するアミノ酸配列中の1つ以上(例えば、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12以上)のアミノ酸を置換、削除又は付加して得られるアミノ酸配列を、含むことができる。
2)対応するアミノ酸配列中の1つ以上(例えば、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12以上)のアミノ酸を置換、削除又は付加して得られるアミノ酸配列を、含むことができる。
本願では、「相同性」という用語は、一般に、2つ以上のポリヌクレオチド配列間又は2つ以上のポリペプチド配列間の配列類似性又は交換可能性を意味する。コンピュータプログラム又はソフトウェア(例:Emboss Needle又はBestFit)を使用して、異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性又は相同性を決定する場合、デフォルトのパラメータ設定を使用することができる。同一性、類似性、相同性のスコアを最適化するために、blosum45やblosum80などの適切なスコアリング・マトリックスを選択することもできる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチドは、ストリンジェンシー条件下で対照ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、対照ポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は少なくとも100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。相同ポリペプチドは、最適化された条件下で配列比較を行った場合に、対照ポリペプチド配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも100%の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。
配列の同一性を判断するために、配列比較を行うことができ、これは当業者に知られた様々な手段、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等を用いて行うことができる。当業者であれば、比較対象の全長配列において最適な比較を実現するために必要なアルゴリズムを含め、比較に使用する適切なパラメータを決定することが可能である。
本願では、前記アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってもよく、非保存的アミノ酸置換であってもよい。置換後の前記第1ポリペプチド鎖、前記第2ポリペプチド鎖、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン(例えば、前記因子H(FH)、CD55及びCD59)及び/又は前記増強ドメイン(例えば、前記IgG Fcドメイン及び/又はヒト血清アルブミンは、依然として置換前の前記第1ポリペプチド鎖、前記第2ポリペプチド鎖、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン(例えば、前記因子H(FH)、CD55及びCD59)及び/又は前記増強ドメイン(例えば、前記IgG Fcドメインと/又はヒト血清アルブミン)と、同一又は類似の機能活性を有している。
例えば、前記アミノ酸置換は、非保存的置換であってもよい。前記非保存的置換は、標的タンパク質又はポリペプチド中のアミノ酸残基を非保存的に変更すること、例えば、ある側鎖サイズ又はある特性(例えば、親水性)を有するアミノ酸残基を、異なる側鎖サイズ又は異なる特性(例えば、疎水性)を有するアミノ酸残基に変更することを含んでいてもよい。
また、前記アミノ酸置換は、保存的置換であってもよい。前記非保存的置換は、標的タンパク質又はポリペプチド中のアミノ酸残基を保存的に変更すること、例えば、ある側鎖サイズ又はある特性(例えば、親水性)を有するアミノ酸残基を、同一又は類似の側鎖サイズ又は同一又は類似の特性(例えば、依然として親水性)を有するアミノ酸残基に変更することを含んでいてもよい。このような保存的置換は、通常、得られるタンパク質の構造や機能に大きな影響を与えることはない。本願では、前記第1ポリペプチド鎖、前記第2ポリペプチド鎖、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン(例えば、前記因子H(FH)、CD46、CD55、CD59及びCR1)及び/又は前記増強ドメイン(例えば、IgG Fcドメイン及び/又はヒト血清アルブミンのアミノ酸配列変異体)は、タンパク質の構造又はその機能を有意に変化させない保存アミノ酸置換を含み得る。
例として、以下の各グループ内のアミノ酸間の相互置換は、本願では保存的置換とみなすことができる:非極性側鎖を有するアミノ酸のグループ:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニン。
極性側鎖に無電荷のアミノ酸グループ:グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。
極性側鎖に負電荷を有するアミノ酸グループ:アスパラギン酸、グルタミン酸。
正電荷を帯びた塩基性アミノ酸:リジン、アルギニン、ヒスチジン。
フェニル基を有するアミノ酸:フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。
正電荷を帯びた塩基性アミノ酸:リジン、アルギニン、ヒスチジン。
フェニル基を有するアミノ酸:フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。
核酸分子、ベクターと細胞
一方、本願はまた、単離された1つ又は複数の核酸分子を提供する。前記1つ又は複数の核酸分子は、本願記載の融合タンパク質又はその断片をコードしていてもよい。例えば、前記1つ又は複数の核酸分子の各々は、完全な前記融合タンパク質をコードしてもよく(例えば、前記融合タンパク質が一本鎖である場合)、又は前記融合タンパク質の一部、例えば、前記第1ポリペプチド鎖、前記第2ポリペプチド鎖、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン(例えば、前記因子H(FH)、CD46 CD55、CD59、及びCR1)、及び/又は前記増強ドメイン(例えば、前記IgG Fcドメイン)、及び/又はヒト血清アルブミン、又はこれらのうちの1つ又は複数である。
一方、本願はまた、単離された1つ又は複数の核酸分子を提供する。前記1つ又は複数の核酸分子は、本願記載の融合タンパク質又はその断片をコードしていてもよい。例えば、前記1つ又は複数の核酸分子の各々は、完全な前記融合タンパク質をコードしてもよく(例えば、前記融合タンパク質が一本鎖である場合)、又は前記融合タンパク質の一部、例えば、前記第1ポリペプチド鎖、前記第2ポリペプチド鎖、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン(例えば、前記因子H(FH)、CD46 CD55、CD59、及びCR1)、及び/又は前記増強ドメイン(例えば、前記IgG Fcドメイン)、及び/又はヒト血清アルブミン、又はこれらのうちの1つ又は複数である。
本願では、前記核酸分子は、配列番号13、15、23、25、27、35、37、39、41、57、59、65及び67のいずれか一項に示される塩基配列を含み得る。
本願記載の核酸分子は、単離されたものであってもよい。例えば、(i)in vitro、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって、(ii)クローン組み換えによって、(iii)精製、例えば酵素消化及びゲル電気泳動による段階的分離によって、又は(iv)合成、例えば化学合成によって生成又は合成されてもよい。いくつかの実施形態では、前記単離された核酸は、組み換えDNA技術によって調製された核酸分子である。
本願では、融合タンパク質又はその断片をコードする核酸は、限定されるものではないが、制限断片操作又は合成オリゴヌクレオチドを用いた重複伸長PCRを含む、当技術分野において公知の様々な方法によって調製することができる。詳細は、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;及びAusubeら、Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y.,1993を参照されたい。
一方、本願は、本願記載の核酸分子の1つ又は複数を含む、1つ又は複数のベクターを提供する。各ベクターは、前記核酸分子を1つ又は複数を含んでいてもよい。また、前記ベクターは適切な宿主細胞において、適切な条件下で当該ベクターを選ぶマーカー遺伝子などの他の遺伝子を含み得る。また、前記ベクターはコード領域が適切な宿主において正しく発現されることを可能にする発現制御要素を含み得る。そのような制御要素は本分野の技術者に周知であり、例えば、それらは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子転写又はmRNA翻訳を調節する他の制御要素を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記発現制御配列は、調整可能な要素である。前記発現制御配列の特定の構造は、種又は細胞タイプの機能によって異なり得るが、通常、TATA、キャッピング配列、CAAT配列などの転写及び翻訳開始に関与する5’非転写配列と5’及び3’非翻訳配列を含む。例えば、5’非転写発現制御配列はプロモータ領域を含んでよく、プロモータ領域は転写制御のための核酸に機能的に連結するプロモータ配列を含んでいてもよい。また、前記発現制御配列は、エンハンサー配列又は上流アクチベーター配列を含んでいてもよい。本願における適切なプロモーターは、例えば、SP6、T3及びT7ポリメラーゼのプロモーター、ヒトU6RNAプロモーター、CMVプロモーター及びその人工異種プロモーター(例えばCMV)であって、プロモーターの一部が他の細胞タンパク質(例えばヒトGAPDH、グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素)遺伝子のプロモーターの一部と融合してもよく、さらにイントロンを含む場合もあれば含まない場合もある。本願記載の1つ又は複数の核酸分子は、発現制御要素に作動可能に連結することができる。前記ベクターは、例えば、プラスミド、粘菌、ウイルス、ファージ、又は、例えば、遺伝子工学において通常使用される他のベクターから構成され得る。例えば、前記ベクターは、発現ベクターである。 一方、本願は宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本願記載の1つ又は複数の核酸分子及び/又は本願記載の1つ又は複数のベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、各種又は各細胞は本願記載の1種又は1つの核酸分子又はベクターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、各細胞は、本願にのベクターの複数(例えば、2つ以上)又は、複数種類(例えば、2種類以上)の核酸分子又はベクターを含んでいてもよい。例えば、本願記載のベクターを、前記宿主細胞、例えば、植物、菌類又は酵母の細胞等の真核生物細胞に導入してもよい。本願記載の担体は、エレクトロポレーション、Lipofectamineによるトランスフェクション等の当技術分野で公知の方法によって前記宿主細胞に導入することができる。
医薬組成物
一方、本願は、前記融合タンパク質、及び任意に薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容されるベクターとは、通常、医薬組成物又は製剤の調製に使用することができ、通常、安全で、毒性がなく、生物学的にもその他の点でも好ましくないベクターでないものを意味する。使用されるベクターは、通常、ヒトなどの哺乳類への投与に適したものが用いられる。組成物の調製では、通常、有効成分はベクターと混合され、ベクターによって希釈又は封入される。担体を希釈剤として使用する場合、固体、半固体、液体のいずれであってもよく、抗体の有効成分の媒介物、ベクター、媒体として機能するものであればよい。前記薬学的に許容されるベクターは、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子ペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、糖類、キレート剤、対イオン、金属錯体及び/又は非イオン性界面活性剤などを含んでいてもよい。
一方、本願は、前記融合タンパク質、及び任意に薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容されるベクターとは、通常、医薬組成物又は製剤の調製に使用することができ、通常、安全で、毒性がなく、生物学的にもその他の点でも好ましくないベクターでないものを意味する。使用されるベクターは、通常、ヒトなどの哺乳類への投与に適したものが用いられる。組成物の調製では、通常、有効成分はベクターと混合され、ベクターによって希釈又は封入される。担体を希釈剤として使用する場合、固体、半固体、液体のいずれであってもよく、抗体の有効成分の媒介物、ベクター、媒体として機能するものであればよい。前記薬学的に許容されるベクターは、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子ペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、糖類、キレート剤、対イオン、金属錯体及び/又は非イオン性界面活性剤などを含んでいてもよい。
本願では、前記医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位でのin situ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与、又は皮下リザーバーを介した投与のために製剤化され得る。経皮投与又は皮下リザーバー経由の投与のための溶液ま又は懸濁液は、以下の成分を含んでいてもよい:注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌希釈剤;ベンジルアルコール、メチルパラベン等の抗菌剤、アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム等の酸化防止剤、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等のキレート剤等;酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などの緩衝剤;及び塩化ナトリウムやブドウ糖などの張力調整物質。pHは、塩酸や水酸化ナトリウムなどの酸や 塩基によって調整することができる。
方法と用途
一方、本願は、前記融合タンパク質又はその断片を調製するための方法を提供する。前記方法は、前記融合タンパク質又はその断片を合成する工程、及び/又は、前記融合タンパク質又はその断片を発現する条件下で前記細胞を培養する工程を含んでいてもよい。例えば、適切な培地、適切な温度、培養時間など、当業者に公知の方法を用いることにより行うことができる。
一方、本願は、前記融合タンパク質又はその断片を調製するための方法を提供する。前記方法は、前記融合タンパク質又はその断片を合成する工程、及び/又は、前記融合タンパク質又はその断片を発現する条件下で前記細胞を培養する工程を含んでいてもよい。例えば、適切な培地、適切な温度、培養時間など、当業者に公知の方法を用いることにより行うことができる。
本願は、遺伝子工学技術を使用して、本願記載の融合タンパク質又はその断片、例えば、前記第1ポリペプチド連結、前記第2ポリペプチド鎖、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン(例えば、前記因子H(FH)、CD46、CD55、CD59及びCR1)及び/又は前記増強ドメイン(例えば、前記IgG Fcドメイン及び/又はヒト血清アルブミン)、あるいは、アミノ酸残基はタンパク質の配列に従って順に連結されていてもよい。
また、本願は、遺伝子工学技術を使用して、本願記載の融合タンパク質又はその断片のコード配列、例えば、前記第1ポリペプチド連結、前記第2ポリペプチド鎖、前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン(例えば、前記因子H(FH)、CD46、CD55、CD59及びCR1)及び/又は前記増強ドメイン(例えば、前記IgG Fcドメイン及び/又はヒト血清アルブミン)のコード配列;又は核酸配列に従って塩基が順に連結されていてもよい。
一方、本願は、薬剤調製における前記融合タンパク質又は前記医薬組成物の使用を提供し、前記薬剤は、補体活性化の標的阻害に関連する疾患を治療するために用いられる。前記補体活性化の標的阻害に関連する疾患としては、以下からなる群より選択され得る:発作性夜間血色素尿症(PNH)、ヘモグロビン尿症(PNH)、非定型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、全身性重症筋無力症(gMG)、視神経脊髄炎スペクトラム障害(NMOSSD)、加齢黄斑変性症(AMD)、自己溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、再生不良性貧血、全身性エリテマトーデス、強直性リウマチ性関節炎 関節リウマチ、強直性脊椎炎、動脈硬化、パーキンソン病、アルツハイマー病(認知症)、喘息、アレルギー、乾癬、多発性硬化症、クローン病。本願記載の薬剤は、補体活性化を抑制し、及び/又は補体の攻撃から細胞を保護することができる。いくつかの実施形態では、前記疾患は、自己免疫疾患を含んでいてもよい。例えば、前記疾患は、自己免疫性重症筋無力症を含んでいてもよい。
以下の実施例は、理論に限定されることを意図するものではなく、本出願の融合タンパク質、調製方法、用途等を説明するためにのみ使用され、本出願の範囲を限定するために使用されるものではない。ns: no significance, *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001で処理した。
実施例1 増強ドメイン断片の添加による補体阻害剤の血中濃度半減期の延長
目的:CRIg-FH補体阻害剤にヒトIgG FcあるいはHSAを導入し、2種類の組み換えタンパク質(CRIg-FH-IgG 4 Fc)×2とHis×6-CRIg-FH-HSAの発現ベクターを構築し、真核生物の発現と精製を行い、補体阻害活性及びin vivo半減期の測定を通じて、CRIg-FHの補体阻害効果に影響を与えることなく、半減期を延長できるタンパク質をスクリーニングし、それを同定すること。
目的:CRIg-FH補体阻害剤にヒトIgG FcあるいはHSAを導入し、2種類の組み換えタンパク質(CRIg-FH-IgG 4 Fc)×2とHis×6-CRIg-FH-HSAの発現ベクターを構築し、真核生物の発現と精製を行い、補体阻害活性及びin vivo半減期の測定を通じて、CRIg-FHの補体阻害効果に影響を与えることなく、半減期を延長できるタンパク質をスクリーニングし、それを同定すること。
1.装置と材料:
電気サーモスタット(DK-8D、上海精宏実験設備有限公司)、PCR装置(Mastercycler pro-Eppendorf、エッペンドルフ、ドイツ)、RNA/DNA濃度/純度計(NANODROP 2000c、Thermo Scientific、アメリカ)、ゲルイメージャー(Tanon 1600,上海天能科技有限公司)、CO2インキュベーター(240i、Thermo Scientific、アメリカ)、BioRAD Mini protein Tera system (BioRAD、米国)、低温水平遠心機(Allegra X-15R Centrifuge、Beckman Coulter、アメリカ)。
電気サーモスタット(DK-8D、上海精宏実験設備有限公司)、PCR装置(Mastercycler pro-Eppendorf、エッペンドルフ、ドイツ)、RNA/DNA濃度/純度計(NANODROP 2000c、Thermo Scientific、アメリカ)、ゲルイメージャー(Tanon 1600,上海天能科技有限公司)、CO2インキュベーター(240i、Thermo Scientific、アメリカ)、BioRAD Mini protein Tera system (BioRAD、米国)、低温水平遠心機(Allegra X-15R Centrifuge、Beckman Coulter、アメリカ)。
2.方法:
2.1 遺伝子クローニングとベクター構築
NucleoZOL(Macherey-Nagel、ドイツ)を用いて、ヒト肝細胞株Hep3BからTotal RNAを抽出し、逆転写酵素(PrimeScript:商標) RT Master Mix、タカラ、日本)を用いてcDNAに逆転写させた。上記cDNAを、FH補体抑制の機能断片をコードするSCR1-5ドメイン(E19-K323)とヒト血清アルブミンHSAの遺伝子配列に適したプライマーを用いてPCRで増幅させた。また、リンパ腫細胞U937細胞から同様の方法でtotal RNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、PCRで増幅し、CRIg遺伝子の細胞外構造ドメイン(G19-K137)の遺伝子配列をコード化した。
2.1 遺伝子クローニングとベクター構築
NucleoZOL(Macherey-Nagel、ドイツ)を用いて、ヒト肝細胞株Hep3BからTotal RNAを抽出し、逆転写酵素(PrimeScript:商標) RT Master Mix、タカラ、日本)を用いてcDNAに逆転写させた。上記cDNAを、FH補体抑制の機能断片をコードするSCR1-5ドメイン(E19-K323)とヒト血清アルブミンHSAの遺伝子配列に適したプライマーを用いてPCRで増幅させた。また、リンパ腫細胞U937細胞から同様の方法でtotal RNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、PCRで増幅し、CRIg遺伝子の細胞外構造ドメイン(G19-K137)の遺伝子配列をコード化した。
FHタンパク質をコードする核酸配列を配列番号3に、FHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号4に、FHのSCR1-5ドメインをコードする核酸配列を配列番号7に、FHのSCR1-5ドメインのアミノ酸配列を配列番号8に、それぞれ示した。
HSAタンパク質をコードする核酸配列を配列番号11に、HSAタンパク質のアミノ酸配列を配列番号12に、それぞれ示した。
CRIgタンパク質をコードする核酸配列を配列番号1に、CRIgタンパク質のアミノ酸配列を配列番号2に、それぞれ示した。CRIg細胞外ドメインをコードする核酸配列を配列番号5に、CRIg細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号6に、それぞれ示した。
CRIg細胞外ドメインとFH SCR1-5ドメインの両方の配列を含むプライマーを設計し、オーバーラッピングPCR(Overlapping PCR)を用いてpFUSE-hIgG4-Fc1真核生物発現ベクター(InvivoGen)に挿入し、CRIg細胞外ドメイン遺伝子とFH SCR1-5遺伝子を結合させた。ここで、hIgG4-Fcをコードする核酸配列を配列番号9に、hIgG4-Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号10に、それぞれ示した。さらに、上記CRIg細胞外ドメイン遺伝子をFH SCR1-5にライゲーションし、HSA遺伝子とのオーバーラップPCRによりpcDNA3.1/His A (Invitrogen)発現ベクターに挿入した。上記ベクターは、その後の試験の前に正しい挿入配列が確認されるよう双方向の塩基配列を決定し、それぞれpFUSE-CRIg-FH-hIgG4Fc1、pCDNA/His-CRIg-FH-HSAと命名した。
2.2 タンパク質の発現
293FT細胞を直径15cmのシャーレに2.0×107個/シャーレの密度で均一に広げ、対数期まで増殖させ、Lipofectamine2000(Invitrogen、アメリカ)試薬を利用してそれぞれ上述構築したPFUSE-CRIg-FH-hIgG4-Fc1又はpCDNA/His-CRIg-FH-HSA抽出プラスミドをトランスフェクションした。5%CO2インキュベーター内で37℃、6時間培養後、293タンパク質発現用無血清培地(Gibco,アメリカ)に交換し、3日間培養した後に上清を回収し、遠心分離して細胞や細胞の破片を取り除き、限外ろ過チューブを使って濃縮してから精製を行った。
293FT細胞を直径15cmのシャーレに2.0×107個/シャーレの密度で均一に広げ、対数期まで増殖させ、Lipofectamine2000(Invitrogen、アメリカ)試薬を利用してそれぞれ上述構築したPFUSE-CRIg-FH-hIgG4-Fc1又はpCDNA/His-CRIg-FH-HSA抽出プラスミドをトランスフェクションした。5%CO2インキュベーター内で37℃、6時間培養後、293タンパク質発現用無血清培地(Gibco,アメリカ)に交換し、3日間培養した後に上清を回収し、遠心分離して細胞や細胞の破片を取り除き、限外ろ過チューブを使って濃縮してから精製を行った。
2.3 タンパク質アフィニティ精製、緩衝液交換、濃縮
Protein A抗体精製磁気ビーズキット(BeaverNano、中国(蘇州)を用いて、細胞上清中の(CRIg-FH-IgG4Fc)×2組み換えタンパク質を精製して溶出緩衝液に溶かし、限外ろ過チューブ(Millipore、アメリカ)に移して低温遠心でPBSに置換し、濃縮した。又は、His-Bind affinity Purification Kit(Novagen/MerckMillipore)を用いて、製造方法に従って発現したHis×6-CRIg-FH-HSA融合タンパク質を精製し、同様に緩衝液をPBSに置換して濃縮保存した。得られた組み換えタンパク質をそれぞれ(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、CRIg-FH-HSAと命名した(図1)。
Protein A抗体精製磁気ビーズキット(BeaverNano、中国(蘇州)を用いて、細胞上清中の(CRIg-FH-IgG4Fc)×2組み換えタンパク質を精製して溶出緩衝液に溶かし、限外ろ過チューブ(Millipore、アメリカ)に移して低温遠心でPBSに置換し、濃縮した。又は、His-Bind affinity Purification Kit(Novagen/MerckMillipore)を用いて、製造方法に従って発現したHis×6-CRIg-FH-HSA融合タンパク質を精製し、同様に緩衝液をPBSに置換して濃縮保存した。得られた組み換えタンパク質をそれぞれ(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、CRIg-FH-HSAと命名した(図1)。
2.4 補体阻害活性の測定
市販のキットであるWIESLAB(商標)Complement System Classical Pathway (COMPLCP310)及びWIESLAB(商標)Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)をそれぞれ用いて、上記2つの組み換えタンパク質による補体の古典経路及び代替経路の阻害をそれぞれ検出した。
市販のキットであるWIESLAB(商標)Complement System Classical Pathway (COMPLCP310)及びWIESLAB(商標)Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)をそれぞれ用いて、上記2つの組み換えタンパク質による補体の古典経路及び代替経路の阻害をそれぞれ検出した。
2.5 組み換えタンパク質のin vivo血中濃度の半減期測定
SDラット(雌雄半分ずつ)に(CRIg-FH-IgG4Fc)×2を静脈内注射し、投与前(初日)、投与開始(初日)5分後(すなわち投与終了2分後)、30分後、4時間後、24時間後、2日目、3日目、5日目、7日目、10日目、14日目、21日目及び28日目に異なる時点で、それぞれ採血し、血清を分離した。各サンプル中の組み換えタンパク質の濃度は、ELISA法により分析した。又はCRIg-FH-HSA、1mg/kgを静脈内注射し、投与前、投与開始5分、30分後、1時間後、3時間後、6時間後、12時間後、24時間後、2日目、3日目、5日目、7日目、10日目、14日目、21日目及び28日目の血清をそれぞれ分離した。CRIg-FH、20 mg/Kgを静脈内注射し(調製方法は発明者の発表による、Qiao Q., et al., A novel CRIg-targeted complement inhibitor protects cells from complement damage, FASEB J.2014 Nov;28 (11) :4986-99.)、投与前、5分後、30分後、1時間後、3時間後、6時間後、12時間後、18時間後、24時間後、36時間後、48時間後、72時間後、120時間後にそれぞれ血清を単離した。
SDラット(雌雄半分ずつ)に(CRIg-FH-IgG4Fc)×2を静脈内注射し、投与前(初日)、投与開始(初日)5分後(すなわち投与終了2分後)、30分後、4時間後、24時間後、2日目、3日目、5日目、7日目、10日目、14日目、21日目及び28日目に異なる時点で、それぞれ採血し、血清を分離した。各サンプル中の組み換えタンパク質の濃度は、ELISA法により分析した。又はCRIg-FH-HSA、1mg/kgを静脈内注射し、投与前、投与開始5分、30分後、1時間後、3時間後、6時間後、12時間後、24時間後、2日目、3日目、5日目、7日目、10日目、14日目、21日目及び28日目の血清をそれぞれ分離した。CRIg-FH、20 mg/Kgを静脈内注射し(調製方法は発明者の発表による、Qiao Q., et al., A novel CRIg-targeted complement inhibitor protects cells from complement damage, FASEB J.2014 Nov;28 (11) :4986-99.)、投与前、5分後、30分後、1時間後、3時間後、6時間後、12時間後、18時間後、24時間後、36時間後、48時間後、72時間後、120時間後にそれぞれ血清を単離した。
以下の手段にてELISA法を実施した:カプセル化されたウサギ抗ヒトCRIgモノクロナル抗体(クローン202、sino biological、カタログ12163-H08H)は、標準品で組み換えタンパク質又は血清中の組み換えタンパク質と結合し、マウス抗ヒトIgG 4 fragment Secondary (5 c 7) [HRP](NOVUS、カタログNB 110-7081 H)、酵素標識二次抗体により(CRIg-FH-IgG 4 Fc)×2を検出し、又はヒト血清アルブミンポリクローナル抗体,HRP(ThermoFisher,カタログ#PA 1-72058)酵素標識二次抗体により、CRIg-FH-HSAをあるいは、HRPで標識したウサギ抗ヒトFH抗体EPR 6225(カタログ#ab133536)によりCRIg-FHを検出した。血清中の組み換えタンパク質の血中濃度を標準曲線から算出し、時間-薬物血清濃度曲線をプロットし、半減期を算出した。
3.結果:
3.1
上記の真核生物誘導発現・精製を適用して得られた2種類の組み換えタンパク質、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2とHis×6-CRIg-FH-HSAは、電気泳動(PAGE)により95%以上の純度で検出され、理論分子量はそれぞれ146kDaと114kDaで、実際のサイズは理論値と一致した(図2)。CRIg-FH-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号13に、CRIg-FH-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号14に、それぞれ示した。CRIg-FH-HSAをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号15に、CRIg-FH-HSAタンパク質のアミノ酸配列を配列番号16に、それぞれ示した。CRIg-FHをコードする核酸配列を配列番号51に、CRIg-FHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号52に、それぞれ示した。
3.1
上記の真核生物誘導発現・精製を適用して得られた2種類の組み換えタンパク質、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2とHis×6-CRIg-FH-HSAは、電気泳動(PAGE)により95%以上の純度で検出され、理論分子量はそれぞれ146kDaと114kDaで、実際のサイズは理論値と一致した(図2)。CRIg-FH-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号13に、CRIg-FH-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号14に、それぞれ示した。CRIg-FH-HSAをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号15に、CRIg-FH-HSAタンパク質のアミノ酸配列を配列番号16に、それぞれ示した。CRIg-FHをコードする核酸配列を配列番号51に、CRIg-FHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号52に、それぞれ示した。
3.1
(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2及びCRIg-FH-HSAのヒト血清補体の古典経路及び代替経路に対する阻害活性を検討した。その結果、(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2、CRIg-FH-HSAともに補体の抑制効果があることがわかった。前者の補体古典経路を抑制するIC50は91.38 nM(図3)、補体代替経路を抑制するIC50は1.04 nM(図4)、後者の補体古典経路を抑制するIC50は1355 nM(図5)、補体代替経路を抑制するIC50は10.39 nM(図6)であった。
(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2及びCRIg-FH-HSAのヒト血清補体の古典経路及び代替経路に対する阻害活性を検討した。その結果、(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2、CRIg-FH-HSAともに補体の抑制効果があることがわかった。前者の補体古典経路を抑制するIC50は91.38 nM(図3)、補体代替経路を抑制するIC50は1.04 nM(図4)、後者の補体古典経路を抑制するIC50は1355 nM(図5)、補体代替経路を抑制するIC50は10.39 nM(図6)であった。
3.2
(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2とCRIg-FH-HSA
異なる時点で採取した血清中の(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2又はCRIg-FH-HSA又はCRIg-FHの濃度を測定して時間-濃度薬物動態曲線をプロットしたところ、(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2の曲線は図7に示される通り、半減期が142.2時間;CRIg-FH-HSAの曲線は図8に示される通り、半減期が32.8時間;CRIg-FHの曲線は図28に示される通り、半減期が0.56時間であった。結果より、増強ドメイン(例えば、抗体のFc断片やHSA1本鎖)を加えることで、CRIg-FHの半減期がそれぞれ250倍、58倍以上と大幅に延長されることが示された。
(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2とCRIg-FH-HSA
異なる時点で採取した血清中の(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2又はCRIg-FH-HSA又はCRIg-FHの濃度を測定して時間-濃度薬物動態曲線をプロットしたところ、(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2の曲線は図7に示される通り、半減期が142.2時間;CRIg-FH-HSAの曲線は図8に示される通り、半減期が32.8時間;CRIg-FHの曲線は図28に示される通り、半減期が0.56時間であった。結果より、増強ドメイン(例えば、抗体のFc断片やHSA1本鎖)を加えることで、CRIg-FHの半減期がそれぞれ250倍、58倍以上と大幅に延長されることが示された。
実施例2 CRIgと補体制御ドメインとの連結による、優れた補体抑制効果
目的:(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2、(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2、(CRIg-IgG4Fc)x2、(FH-IgG4Fc)×2、(FH-CRIg-IgG4Fc)×2及び(CRIg-L-FH-IgG4Fc)×2の9種類の組み換えタンパク質の発現ベクターを構築し、真核生物の発現と精製を行い、及びその補体活性を検査・測定することによって、FH、CD55、CD46、CD59、CR1の5種類の重要な補体抑制タンパク質のうち、どれがCRIgと連結したときに優れた補体阻害効果を示すか、また補体活性制御と増強ドメインの連結が補体阻害活性に及ぼす影響を明らかにすること。
目的:(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2、(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2、(CRIg-IgG4Fc)x2、(FH-IgG4Fc)×2、(FH-CRIg-IgG4Fc)×2及び(CRIg-L-FH-IgG4Fc)×2の9種類の組み換えタンパク質の発現ベクターを構築し、真核生物の発現と精製を行い、及びその補体活性を検査・測定することによって、FH、CD55、CD46、CD59、CR1の5種類の重要な補体抑制タンパク質のうち、どれがCRIgと連結したときに優れた補体阻害効果を示すか、また補体活性制御と増強ドメインの連結が補体阻害活性に及ぼす影響を明らかにすること。
1.装置と材料:
電気サーモスタット(DK-8D、上海精宏実験設備有限公司)、PCR装置(Mastercycler pro-Eppendorf、エッペンドルフ、ドイツ)、RNA/DNA濃度/純度計(NANODROP 2000c、Thermo Scientific、アメリカ)、ゲルイメージャー(Tanon 1600,上海天能科技有限公司)、CO2インキュベーター(240i、Thermo Scientific、アメリカ)、BioRAD Mini protein Tera system (BioRAD、米国)、低温水平遠心機(Allegra X-15R Centrifuge、Beckman Coulter、アメリカ)
電気サーモスタット(DK-8D、上海精宏実験設備有限公司)、PCR装置(Mastercycler pro-Eppendorf、エッペンドルフ、ドイツ)、RNA/DNA濃度/純度計(NANODROP 2000c、Thermo Scientific、アメリカ)、ゲルイメージャー(Tanon 1600,上海天能科技有限公司)、CO2インキュベーター(240i、Thermo Scientific、アメリカ)、BioRAD Mini protein Tera system (BioRAD、米国)、低温水平遠心機(Allegra X-15R Centrifuge、Beckman Coulter、アメリカ)
2.方法:
2.1 遺伝子クローニングとベクター構築
NucleoZOL(Macherey-Nagel、ドイツ)を用いて、ヒト正常膵管上皮細胞HPDE6-C7からTotal RNAを抽出し、逆転写酵素(PrimeScript(商標)RT Master Mix、タカラ、日本)を用いてcDNAに逆転写させた。上記のcDNAを、CD55、CD46、CD59をコードするDNA配列(いずれもシグナルペプチドをコードするDNA配列を含まない)を増幅するのに適したプライマーを用いてPCRにより増幅した。同様の方法でヒト肝癌細胞系Hep3B細胞からNucleoZOLを用いてTotal RNAを抽出、cDNAに逆転写した後、PCR法によりFH補体阻害能断片をコードするSCR1-5ドメイン(E19-K323)を増幅した。リンパ腫細胞U937細胞からTotal RNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、PCR法によりCRIg遺伝子の細胞外ドメイン(G19-K137)及びCR1 CCP8-11とCCP15-18ドメインをコードする遺伝子配列を増幅した。ここで、CD55をコードする核酸配列を配列番号17に、CD55タンパク質のアミノ酸配列を配列番号18に、それぞれ示した。CD46をコードする核酸配列を配列番号19に、CD46タンパク質のアミノ酸配列を配列番号20に、それぞれ示した。CD59をコードする核酸配列を配列番号21に、CD59タンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に、それぞれ示した。CR1 CCP8-11及びCCP15-18をコードする核酸配列を配列番号61と63に、それぞれ示し、CR1 CCP8-11及びCCP15-18ドメインのタンパク質配列を配列番号62と64に、それぞれ示した。
2.1 遺伝子クローニングとベクター構築
NucleoZOL(Macherey-Nagel、ドイツ)を用いて、ヒト正常膵管上皮細胞HPDE6-C7からTotal RNAを抽出し、逆転写酵素(PrimeScript(商標)RT Master Mix、タカラ、日本)を用いてcDNAに逆転写させた。上記のcDNAを、CD55、CD46、CD59をコードするDNA配列(いずれもシグナルペプチドをコードするDNA配列を含まない)を増幅するのに適したプライマーを用いてPCRにより増幅した。同様の方法でヒト肝癌細胞系Hep3B細胞からNucleoZOLを用いてTotal RNAを抽出、cDNAに逆転写した後、PCR法によりFH補体阻害能断片をコードするSCR1-5ドメイン(E19-K323)を増幅した。リンパ腫細胞U937細胞からTotal RNAを抽出し、cDNAに逆転写した後、PCR法によりCRIg遺伝子の細胞外ドメイン(G19-K137)及びCR1 CCP8-11とCCP15-18ドメインをコードする遺伝子配列を増幅した。ここで、CD55をコードする核酸配列を配列番号17に、CD55タンパク質のアミノ酸配列を配列番号18に、それぞれ示した。CD46をコードする核酸配列を配列番号19に、CD46タンパク質のアミノ酸配列を配列番号20に、それぞれ示した。CD59をコードする核酸配列を配列番号21に、CD59タンパク質のアミノ酸配列を配列番号22に、それぞれ示した。CR1 CCP8-11及びCCP15-18をコードする核酸配列を配列番号61と63に、それぞれ示し、CR1 CCP8-11及びCCP15-18ドメインのタンパク質配列を配列番号62と64に、それぞれ示した。
CRIg細胞外ドメイン、フレキシブルリンカーペプチド(Gly4Ser)3、CRIg細胞外ドメインおよび/またはFH SCR1-5ドメインのコード配列を含むプライマー(具体的には、以下の4つの形態で発現するもの:CRIg細胞外ドメイン単独、FH SCR1-5単独、N末端がCRIg細胞外ドメインでC末端がFH SCR1-5、N末端がFH SCR1-5でCRIg細胞外ドメイン)、CD55、CD46、CD59又はCR1(CCP15-18ドメイン)を同時に設計した。単独のCRIg細胞外ドメイン、単独のFH SCR1-5、CRIg細胞外ドメイン遺伝子とFH SCR1-5にフレキシブルリンカーペプチドが付着したもの、付着していないもの、CD46、CD55、CD59またはCR1 CCP15-18 遺伝子をオーバーラップPCRにより連結し、pFUSE-hIgG4-Fc1真核生物発現ベクター(InvivoGen)に挿入した。上記ベクターは、その後の実験のために正しい挿入配列が特定されていることを確認する為に両方向の塩基配列を決定し、これらのベクターを、pFUSE-CRIg-L-FH-IgG4Fc,pFUSE-CRIg-IgG4Fc,pFUSE-FH-IgG4Fc,pFUSE-FH-CRIg-IgG4Fc,pFUSE-CRIg-FH-,pFUSE-FH-IgG4Fc とすることにした。IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD55-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD46-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD59-IgG4Fc及びpFUSE-CRIg-CR1-IgG4Fcとそれぞれ命名した。
2.2 タンパク質の発現
293FT細胞を直径15cmのシャーレに2.0×107個/シャーレの密度で均一に広げ、対数期まで増殖させ、Lipofectamine2000(Invitrogen、アメリカ)試薬を利用してそれぞれ上述構築したpFUSE-CRIg-L-FH-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-IgG4Fc、pFUSE-FH-IgG4Fc、pFUSE-FH-CRIg-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-FH-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD55-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD46-IgG4Fc、 pFUSE-CRIg-CD59-IgG4Fc又はpFUSE-CRIg-CR1-IgG4Fc抽出プラスミドをトランスフェクションした。5%CO2インキュベーター内で37℃、6時間培養後、293タンパク質発現用無血清培地(Gibco,アメリカ)に交換し、3日間培養した後に上清を回収し、遠心分離して細胞や細胞の破片を取り除き、限外ろ過チューブを使って濃縮してから精製を行った。
293FT細胞を直径15cmのシャーレに2.0×107個/シャーレの密度で均一に広げ、対数期まで増殖させ、Lipofectamine2000(Invitrogen、アメリカ)試薬を利用してそれぞれ上述構築したpFUSE-CRIg-L-FH-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-IgG4Fc、pFUSE-FH-IgG4Fc、pFUSE-FH-CRIg-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-FH-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD55-IgG4Fc、pFUSE-CRIg-CD46-IgG4Fc、 pFUSE-CRIg-CD59-IgG4Fc又はpFUSE-CRIg-CR1-IgG4Fc抽出プラスミドをトランスフェクションした。5%CO2インキュベーター内で37℃、6時間培養後、293タンパク質発現用無血清培地(Gibco,アメリカ)に交換し、3日間培養した後に上清を回収し、遠心分離して細胞や細胞の破片を取り除き、限外ろ過チューブを使って濃縮してから精製を行った。
2.3 タンパク質アフィニティ精製、緩衝液交換、濃縮
Protein A抗体精製磁気ビーズキット(BeaverNano、中国(蘇州)を用いて、細胞上清中の(CRIg-L-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-IgG4Fc)x2、(FH-IgG4Fc)×2、(FH-CRIg-IgG4Fc)×2、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2又は(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2、組み換えタンパク質を精製して溶出緩衝液に溶かし、限外ろ過チューブ(Millipore、アメリカ)に移して低温遠心でPBSに置換し、タンパク質を濃縮して保存した。
Protein A抗体精製磁気ビーズキット(BeaverNano、中国(蘇州)を用いて、細胞上清中の(CRIg-L-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-IgG4Fc)x2、(FH-IgG4Fc)×2、(FH-CRIg-IgG4Fc)×2、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2又は(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2、組み換えタンパク質を精製して溶出緩衝液に溶かし、限外ろ過チューブ(Millipore、アメリカ)に移して低温遠心でPBSに置換し、タンパク質を濃縮して保存した。
2.4 補体阻害活性の測定
市販のキットであるWIESLAB(商標)Complement System Classical Pathway (COMPLCP310)及びWIESLAB(商標) Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)を用いて、上記組み換えタンパク質による補体の古典経路及び代替経路の阻害をそれぞれ検出した。
市販のキットであるWIESLAB(商標)Complement System Classical Pathway (COMPLCP310)及びWIESLAB(商標) Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)を用いて、上記組み換えタンパク質による補体の古典経路及び代替経路の阻害をそれぞれ検出した。
3.結果:
3.1 上記の真核生物誘導発現・精製を適用して得られた9種類の組み換えタンパク質(構造については図9、図29、図32を参照されたい)、(CRIg-IgG4Fc)×2、(FH-IgG4Fc)×2、(FH-CRIg-IgG4Fc)×2、(CRIg-L-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2,(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2,(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2は、電気泳動(PAGE)により95%以上の純度で検出され、理論分子量はそれぞれ77、119、146、146と148 kDa(図30)、146、153、157と101 kDa(図10)と134 kDa(図33)で、実際のサイズは理論値と一致した。
3.1 上記の真核生物誘導発現・精製を適用して得られた9種類の組み換えタンパク質(構造については図9、図29、図32を参照されたい)、(CRIg-IgG4Fc)×2、(FH-IgG4Fc)×2、(FH-CRIg-IgG4Fc)×2、(CRIg-L-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2,(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2,(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2は、電気泳動(PAGE)により95%以上の純度で検出され、理論分子量はそれぞれ77、119、146、146と148 kDa(図30)、146、153、157と101 kDa(図10)と134 kDa(図33)で、実際のサイズは理論値と一致した。
CRIg-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号53に、CRIg-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号54に、それぞれ示した。FH-hIgG4 Fcをコードする核酸配列を配列番号55に、FH-hIgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号56に、それぞれ示した。FH-CRIg-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号57に、FH-CRIg-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号58に、それぞれ示した。CRIg-L-FH-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号59に、CRIg-L-FH-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号60に、それぞれ示した。CRIg-CD55-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号23に、CRIg-CD55-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号24に、それぞれ示した。CRIg-CD46-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号25に、CRIg-CD46-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号26に、それぞれ示した。CRIg-CD59-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号27に、CRIg-CD59-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号28に、それぞれ示した。CRIg-CR1(CCP15-18)-IgG4 Fcをコードするタンパク質の核酸配列を配列番号67に、CRIg-CR1(CCP15-18)-IgG4 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号68に、それぞれ示した。
3.2 著者らは(CRIg-IgG4 Fc)×2、(FH-IgG4 Fc)×2、(FH-CRIg-IgG4Fc)×2、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2と(CRIg-L-FH-IgG4Fc)×2の5種類の組み換えタンパク質のヒト血清補体代替経路に対する阻害活性、及び(CRIg-FH-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2、(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2と(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2の5種類の組み換えタンパク質のヒト血清補体古典経路と代替経路に対する阻害活性を測定した。(CRIg-IgG4 Fc)×2、(FH-IgG4 Fc)×2、(FH-CRIg-IgG4Fc)×2、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2と(CRIg-L-FH-IgG4Fc)×2の5種類の組み換えタンパク質のヒト血清補体代替経路に対する阻害効果は図31を参照されたい。詳細なIC50はそれぞれ248.4 nM、138.8 nM、1.48 nM、0.75 nMと0.69 nMであった(表1)。この結果は(1)単独CRIg又はFHは補体に対する阻害効果が両者が連結した後の補体に対する阻害効果よりも低く、かつCRIgがFHのN端又はC端に連結すると補体の阻害効果を増強できることが示された。次に、両者が連結する時、CRIgがFHのN端に位置し、補体に対する阻害効果がFHのC端に位置する時よりもやや優れることが示された。最後に、CRIgとFHとの間が、柔軟なペプチド(Gly4Ser)3などのリンカーを介して、又は直接連結されることによって、補体に対する阻害効果を増強することができることも判明された。
また、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2の補体に対する古典経路及び代替経路の阻害効果をそれぞれ図3及び図4に、(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2の補体に対する古典経路及び代替経路の阻害効果をそれぞれ図11及び図12に、(CRIg-CD46-IgG4Fc)×2の補体に対する古典経路及び代替経路の阻害効果を図13と図14に、(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2の補体に対する古典経路及び代替経路の阻害効果をそれぞれ図15と図16に、(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2の補体に対する古典経路及び代替経路の阻害効果をそれぞれ図34と図35に示した。補体に対する古典経路を抑制するIC50の詳細を表2に示した。具体的には、(CRIg-FH-IgG4 Fc)×2が補体を阻害する古典と代替経路IC50は、それぞれ91.38nMと1.04nM(ここで、代替経路に対する阻害活性2回の測定結果、即ち0.75 nMと1.04 nMについて、一定の差異が見られたが、検査ロットに起因するものとも考えられる);(CRIg-CD55-IgG4Fc)×2が補体を阻害する古典と代替経路IC50は、それぞれ23.25 nMと19.66nM;(CRIg-CD46-IgG4Fc)x2が補体を阻害する古典経路IC50は44.06 nM;(CRIg-CD59-IgG4Fc)×2が補体を阻害する古典経路IC50は44.84 nM;(CRIg-CR1-IgG4Fc)×2が補体を阻害する古典及び代替経路IC50はそれぞれ35.75 nMと30.26nMであった。5種類の融合タンパク質は、いずれも古典経路及び代替経路を阻害することがわかった。
実施例3 二重特異性標的指向性補体阻害剤の開発
目的:(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1Fc)、(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)と(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)の3種類の二重特異性標的指向性組み換えタンパク質mp発現ベクターを構築し、これらの融合タンパク質の真核生物の発現と精製、及び補体阻害活性を測定し、より強力な補体阻害剤のスクリーニングを可能にすること。
目的:(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1Fc)、(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)と(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)の3種類の二重特異性標的指向性組み換えタンパク質mp発現ベクターを構築し、これらの融合タンパク質の真核生物の発現と精製、及び補体阻害活性を測定し、より強力な補体阻害剤のスクリーニングを可能にすること。
1.装置と材料:
電気サーモスタット(DK-8D、上海精宏実験設備有限公司)、PCR装置(Mastercycler pro-Eppendorf、エッペンドルフ、ドイツ)、RNA/DNA濃度/純度計(NANODROP 2000c、Thermo Scientific、アメリカ)、ゲルイメージャー(Tanon 1600,上海天能科技有限公司)、CO2インキュベーター(240i、Thermo Scientific、アメリカ)、BioRAD Mini protein Tera system (BioRAD、米国)、低温水平遠心機 (Allegra X-15R Centrifuge、Beckman Coulter、アメリカ)
電気サーモスタット(DK-8D、上海精宏実験設備有限公司)、PCR装置(Mastercycler pro-Eppendorf、エッペンドルフ、ドイツ)、RNA/DNA濃度/純度計(NANODROP 2000c、Thermo Scientific、アメリカ)、ゲルイメージャー(Tanon 1600,上海天能科技有限公司)、CO2インキュベーター(240i、Thermo Scientific、アメリカ)、BioRAD Mini protein Tera system (BioRAD、米国)、低温水平遠心機 (Allegra X-15R Centrifuge、Beckman Coulter、アメリカ)
2.方法:
2.1 遺伝子クローニングとベクター構築
変異誘発プライマーを設計し、点変異導入キット(東洋紡、日本)を用いて、pFUSE-hIgG1-Fc1真核生物発現ベクターのプライマー部位を変異させ(Alegre et al., 1992; Carter, 2001; Merchant et al., 1998; Ridgway et al., 1996; Xu et al., 2000)、pFUSE-hIgG1-Fc1 knob変異体、pFUSE-hIgG1-Fc1 hole変異体という2つの変異ベクターを作成し、トランスフェクトした。
2.1 遺伝子クローニングとベクター構築
変異誘発プライマーを設計し、点変異導入キット(東洋紡、日本)を用いて、pFUSE-hIgG1-Fc1真核生物発現ベクターのプライマー部位を変異させ(Alegre et al., 1992; Carter, 2001; Merchant et al., 1998; Ridgway et al., 1996; Xu et al., 2000)、pFUSE-hIgG1-Fc1 knob変異体、pFUSE-hIgG1-Fc1 hole変異体という2つの変異ベクターを作成し、トランスフェクトした。
ここで、IgG1 Fcをコードする核酸配列を配列番号29に、IgG1 Fcタンパク質のアミノ酸配列を配列番号30に、それぞれ示した。Knob mutantをコードする核酸配列を配列番号31に、Knob mutantタンパク質のアミノ酸配列を配列番号32に、それぞれ示した。Hole mutantをコードする核酸配列を配列番号33に、Hole mutantタンパク質のアミノ酸配列を配列番号34に、それぞれ示した。
実施例1及び2で構築したCRIg-FH、CRIg-CD46、CRIg-CD55及びCRIg-CD59遺伝子配列を、ワンステップ迅速クローニングキット(上海翌聖生物科技有限公司)を用いて、pFUSE-hIgG1-Fc knob及びhIgG1-Fc mutantベクターに挿入し、同プラスミドをそれぞれpFUSE-CRIg-CD46-hIgG1 Fc knob、pFUSE-CRIg-CD55-hIgG1 Fc knobと命名した。さらに、前記キットで融合断片CRIg-FHとCRIg-CD59をpFUSE-IgG1-FC holeに挿入し、同プラスミドをそれぞれpFUSE-CRIg-FH-IgG1 Fc hole、pFUSE-CRIg-CD59-IgG1 Fc holeと命名した。
ここで、CRIg-CD46-IgG1 Fc knobをコードする核酸配列を配列番号35に、CRIg-CD46-IgG1 Fc knobタンパク質のアミノ酸配列を配列番号36に、それぞれ示した。CRIg-CD55-IgG1 Fc knobをコードする核酸配列を配列番号37にCRIg-CD55-IgG1 Fc knobタンパク質のアミノ酸配列を配列番号38に、それぞれ示した。CRIg-FH-IgG1 Fc holeをコードする核酸配列を配列番号39に、CRIg-FH-IgG1 Fc holeタンパク質のアミノ酸配列を配列番号40に、それぞれ示した。CRIg-CD59-IgG1 Fc holeをコードする核酸配列を配列番号41に、CRIg-CD59-IgG1 Fc holeタンパク質のアミノ酸配列を配列番号42に、それぞれ示した。
2.2 タンパク質の発現
293FT細胞を直径15cmのシャーレに2.0×107個/シャーレの密度で均一に広げ、対数期まで増殖させ、Lipofectamine2000(Invitrogen、アメリカ)試薬を利用してそれぞれpFUSE-CRIg-CD46-hIgG1 Fc knob、pFUSE-CRIg-CD59-hIgG1 Fc holeプラスミド、pFUSE-CRIg-CD55-hIgG1 Fc knob、pFUSE-CRIg-CD59-hIgG1 Fc hole、pFUSE-CRIg-CD55-hIgG1 Fc knobとpFUSE-CRIg-FH-hIgG1 Fc holeをトランスフェクションした。5%CO2インキュベーター内で37℃、6時間培養後、293タンパク質発現用無血清培地(Gibco, アメリカ)に交換し、3日間培養した後に上清を回収し、遠心分離して細胞や細胞の破片を取り除き、限外ろ過チューブを使って濃縮してから精製を行った。
293FT細胞を直径15cmのシャーレに2.0×107個/シャーレの密度で均一に広げ、対数期まで増殖させ、Lipofectamine2000(Invitrogen、アメリカ)試薬を利用してそれぞれpFUSE-CRIg-CD46-hIgG1 Fc knob、pFUSE-CRIg-CD59-hIgG1 Fc holeプラスミド、pFUSE-CRIg-CD55-hIgG1 Fc knob、pFUSE-CRIg-CD59-hIgG1 Fc hole、pFUSE-CRIg-CD55-hIgG1 Fc knobとpFUSE-CRIg-FH-hIgG1 Fc holeをトランスフェクションした。5%CO2インキュベーター内で37℃、6時間培養後、293タンパク質発現用無血清培地(Gibco, アメリカ)に交換し、3日間培養した後に上清を回収し、遠心分離して細胞や細胞の破片を取り除き、限外ろ過チューブを使って濃縮してから精製を行った。
2.3 タンパク質アフィニティ精製、緩衝液交換、タンパク質の濃縮
Protein A抗体精製磁気ビーズキット(BeaverNano、中国(蘇州)を用いて、細胞上清中の(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)、(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)和(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)の組み換えタンパク質を精製して溶出緩衝液に溶かし、限外ろ過チューブ(Millipore、アメリカ)に移して低温遠心でPBSに置換し、タンパク質を濃縮して保存した。
Protein A抗体精製磁気ビーズキット(BeaverNano、中国(蘇州)を用いて、細胞上清中の(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)、(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)和(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)の組み換えタンパク質を精製して溶出緩衝液に溶かし、限外ろ過チューブ(Millipore、アメリカ)に移して低温遠心でPBSに置換し、タンパク質を濃縮して保存した。
2.4 補体阻害活性の測定
市販のキットであるWIESLAB(商標)Complement System Classical Pathway (COMPLCP310)とWIESLAB(商標) Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)を用いて、上記2つの組み換えタンパク質による補体の古典経路及び代替経路に対する阻害作用の観点からそれぞれ検出した。データはGraphpad Prism 7.0ソフトウェアで解析した。
市販のキットであるWIESLAB(商標)Complement System Classical Pathway (COMPLCP310)とWIESLAB(商標) Complement Alternative Pathway(COMPLAP330)を用いて、上記2つの組み換えタンパク質による補体の古典経路及び代替経路に対する阻害作用の観点からそれぞれ検出した。データはGraphpad Prism 7.0ソフトウェアで解析した。
3.結果:
3.1 上記の真核生物誘導発現・精製を適用して得られた3種類の組み換えタンパク質、(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)、(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)と(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)は(図17)、電気泳動(PAGE)により95%以上の純度で検出され、理論分子量はそれぞれ151、130及び128 kDaで、実際のサイズは理論値と一致した(図18)。
3.1 上記の真核生物誘導発現・精製を適用して得られた3種類の組み換えタンパク質、(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)、(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)と(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)は(図17)、電気泳動(PAGE)により95%以上の純度で検出され、理論分子量はそれぞれ151、130及び128 kDaで、実際のサイズは理論値と一致した(図18)。
3.2 3種類の二重特異性標的指向性補体阻害剤の補体古典と代替経路に対するIC50阻害活性を表2に示した。(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-FH-IgG1 Fc)補体古典経路及び補体代替経路の阻害効果をそれぞれ図19及び図20に示した。(CRIg-CD46-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)補体古典経路及び代替経路の阻害効果をそれぞれ図21及び図22に示した。(CRIg-CD55-IgG1 Fc)(CRIg-CD59-IgG1 Fc)補体古典経路及び代替経路の阻害効果をそれぞれ図23及び図24に示した。3種類の二重特異性標的性補体阻害剤はいずれも補体古典経路又は代替経路を阻害できる。
実施例4 ラット重症筋無力症モデルに対する(CRIg-FH-IgG4Fc)×2 の治療効果
目的:上記の融合タンパク質のうち、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2の補体阻害剤を選択し、in vivoでの補体高活性化(過度な活性化)疾患に対する有効性を検証すること。
目的:上記の融合タンパク質のうち、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2の補体阻害剤を選択し、in vivoでの補体高活性化(過度な活性化)疾患に対する有効性を検証すること。
アセチルコリン受容体(AChR)に対する自己抗体が神経筋接合部のAChRに結合し、AChRの発現量を直接的に低下させるか、補体活性化の古典経路を通じて間接的にAChRの機能障害や発現量低下を引き起こし、いずれも神経筋伝導障害、ひいては筋力低下といったMGの臨床症状を引き起こす(Gomez et al., 2010; Phillips and Vincent, 2016)。著者らは、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2補体阻害剤の治療効果を、重症筋無力症モデルラット、実験的自己免疫性重症筋無力症(EAMG)で検証し、その後の臨床応用への可能性の基礎を築いた。
1.装置と材料:
動物用はかり(上海精密科学儀機有限公司、YP2001N)、Lewisラット(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd)、InVivo MAb抗ヒト/ラット/魚AChR(Bio X Cell、West Lebanon、NH)。
動物用はかり(上海精密科学儀機有限公司、YP2001N)、Lewisラット(Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd)、InVivo MAb抗ヒト/ラット/魚AChR(Bio X Cell、West Lebanon、NH)。
2.方法:
2.1 EAMGの誘導
抗 AChR 抗体mAb35(1~3 mg/kg)を雌ラットに 4 週間前後で腹腔内投与することは、全身型重症筋無力症様実験的自己免疫性筋無力症(EAMG)モデルの誘導法として国際的に一般的な方法である。(Hepburn et al., 2007; Liu et al., 2007; Papanastasiou et al., 2000; Poulas et al., 2000)ラットは、抗AChR抗体を注射しない通常群、抗AChR抗体(1.5 mg/kg)腹腔内注射及びPBS注射群、抗AChR抗体腹腔内注射及び(CRIg-FH-IgG4Fc)×2薬剤処理の5種類の用量(0.5、1、2、5、10 mg/kg)、前記7群に分け、2回の実験で完了させた。1回目の実験では40匹、2回目の実験では50匹のラットを使用した。群(グループ分け)については、表3に示した。
2.1 EAMGの誘導
抗 AChR 抗体mAb35(1~3 mg/kg)を雌ラットに 4 週間前後で腹腔内投与することは、全身型重症筋無力症様実験的自己免疫性筋無力症(EAMG)モデルの誘導法として国際的に一般的な方法である。(Hepburn et al., 2007; Liu et al., 2007; Papanastasiou et al., 2000; Poulas et al., 2000)ラットは、抗AChR抗体を注射しない通常群、抗AChR抗体(1.5 mg/kg)腹腔内注射及びPBS注射群、抗AChR抗体腹腔内注射及び(CRIg-FH-IgG4Fc)×2薬剤処理の5種類の用量(0.5、1、2、5、10 mg/kg)、前記7群に分け、2回の実験で完了させた。1回目の実験では40匹、2回目の実験では50匹のラットを使用した。群(グループ分け)については、表3に示した。
2.2 EAMG表現型のモニタリング
ラットは少なくとも5~7日の適応期間後に実験し、各実験の前と24時間後に体重を測定し、臨床スコアを実施。具体的な採点基準は、把持可能でケージの蓋を持ち上げられる場合を0点、把持可能だが蓋を持ち上げられない場合を1点、把持できない場合を2点、把持できず後肢麻痺の場合を3点、死亡又は死亡状態の場合を4点とした。(Piddlesden et al., 1996; Soltys et al., 2009)その結果、モデル群のPBS対照群では48時間でほとんどのラットが死亡又は死に直面したため、倫理に従いこの群は48時間の時点で観察を終了した。一方、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2薬剤投与群は96時間で臨床得点がほぼ回復したので、この群は96時間の時点で観察を終え、24時間と48時間の死亡率について動物を計数した。
ラットは少なくとも5~7日の適応期間後に実験し、各実験の前と24時間後に体重を測定し、臨床スコアを実施。具体的な採点基準は、把持可能でケージの蓋を持ち上げられる場合を0点、把持可能だが蓋を持ち上げられない場合を1点、把持できない場合を2点、把持できず後肢麻痺の場合を3点、死亡又は死亡状態の場合を4点とした。(Piddlesden et al., 1996; Soltys et al., 2009)その結果、モデル群のPBS対照群では48時間でほとんどのラットが死亡又は死に直面したため、倫理に従いこの群は48時間の時点で観察を終了した。一方、(CRIg-FH-IgG4Fc)×2薬剤投与群は96時間で臨床得点がほぼ回復したので、この群は96時間の時点で観察を終え、24時間と48時間の死亡率について動物を計数した。
2.3 統計処理
実験データは平均値±標準誤差(Mean±SEM)を適用して表し、体重は.two-tailed t-testで、臨床スコアは二元配置分散分析(Two-way ANOVA)で、死亡率はカイ二乗検定(Chi-Square and Fisher’s Exact Test)で、ns:no significance, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001で処理した。
実験データは平均値±標準誤差(Mean±SEM)を適用して表し、体重は.two-tailed t-testで、臨床スコアは二元配置分散分析(Two-way ANOVA)で、死亡率はカイ二乗検定(Chi-Square and Fisher’s Exact Test)で、ns:no significance, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001で処理した。
3.結果:
抗AChR抗体及び(CRIg-FH-IgG4Fc)×2薬剤を投与しない正常ラットは徐々に体重が増加したが、薬剤を投与しない抗AChR抗体注入ラットは24時間で11.2%、48時間で15.5%の体重が減少し、24時間の臨床スコアが3~4で82%(14/17)、48時間の3~4で88%(15/17)を占めた。17匹のうち、24時間後に瀕死又は死亡したラットが2匹、48時間後に死亡したラットが9匹となり、死亡率は52.9%(9/17)、残りの生存した8匹中6匹も瀕死であり、EAMGラットモデルの構築に成功したことが示された(図25~図27参照)。
抗AChR抗体及び(CRIg-FH-IgG4Fc)×2薬剤を投与しない正常ラットは徐々に体重が増加したが、薬剤を投与しない抗AChR抗体注入ラットは24時間で11.2%、48時間で15.5%の体重が減少し、24時間の臨床スコアが3~4で82%(14/17)、48時間の3~4で88%(15/17)を占めた。17匹のうち、24時間後に瀕死又は死亡したラットが2匹、48時間後に死亡したラットが9匹となり、死亡率は52.9%(9/17)、残りの生存した8匹中6匹も瀕死であり、EAMGラットモデルの構築に成功したことが示された(図25~図27参照)。
(CRIg-FH-IgG4Fc)×2による前処置はEAMGの症状が有意に改善され、最小薬量0.5mg/kg投与後24時間で体重減少はわずか1.6%、臨床スコア1.1、48時間で体重減少はわずか2.3%、臨床スコア1.3、動物の死亡率は14.3%(1/7)であり、有意な有効性が示された。高用量の薬剤を投与した24時間後の体重は有意な減少を認めず、臨床スコアは用量依存的な関係で徐々に減少し、48時間後には体重は徐々に回復し、臨床スコアは徐々に減少し、用量との量的効果関係、すなわち高用量ほど体重増加が大きく、臨床スコアは減少した(図25~図27)。また、薬剤投与群のすべての動物を96時間まで観察したところ、48時間後には生存ラットの体重が徐々に増加し、臨床スコアが正常値まで徐々に減少しており、EAMG症状が徐々に正常に戻っていることが確認された。
4.考察:
EAMGの表現型は、雌ラットに抗AChR抗体mAb35(1.5 mg/kg)を腹腔内注射することにより、約4週間で誘導され、著しい体重減少、急速な運動量の低下、前肢の握力の低下、48時間以内の動物の死亡が認められ、モデル化に成功した。体重モニタリング、臨床スコアリング及び動物の死亡率モニタリングの結果、LM007は0.5 mg/kgの用量でEAMGに有効であり、用量の増加に伴い有効性と用量に依存関係があり、5 mg/kg以上の用量で疾患過程がほぼ完全に阻止されることが確認された。抗AChR抗体によるEAMGモデルラットでは、補体の過剰活性化は主要な作用を発揮したが、ごく一部のラットは補体の活性化に依存せず、病原性を発揮する可能性がある。
EAMGの表現型は、雌ラットに抗AChR抗体mAb35(1.5 mg/kg)を腹腔内注射することにより、約4週間で誘導され、著しい体重減少、急速な運動量の低下、前肢の握力の低下、48時間以内の動物の死亡が認められ、モデル化に成功した。体重モニタリング、臨床スコアリング及び動物の死亡率モニタリングの結果、LM007は0.5 mg/kgの用量でEAMGに有効であり、用量の増加に伴い有効性と用量に依存関係があり、5 mg/kg以上の用量で疾患過程がほぼ完全に阻止されることが確認された。抗AChR抗体によるEAMGモデルラットでは、補体の過剰活性化は主要な作用を発揮したが、ごく一部のラットは補体の活性化に依存せず、病原性を発揮する可能性がある。
Claims (41)
- 下記(i)~(iii)を含む融合タンパク質:
(i)CRIg細胞外ドメイン;
(ii)因子H (FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む補体制御ドメイン;
及び、
(iii)IgG Fcドメイン及びヒト血清アルブミンからなる群から選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む相乗的ドメインを含む。 - 前記CRIg細胞外ドメインが、配列番号6に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記CRIg細胞外ドメインC末端が、前記補体制御ドメインのN末端に直接又は間接的に連結されているか、あるいは、前記CRIg細胞外ドメインN末端が、前記補体制御ドメインのC末端に直接又は間接的に連結されている、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
- 前記補体制御ドメインのC末端が、前記増強ドメインのN末端に直接又は間接的に連結されている、又は、前記CRIg細胞外ドメインのC末端が、前記増強ドメインのN末端に直接又は間接的に連結されている、請求項1~3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記間接的な連結が、リンカーによる連結を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記リンカーが、配列番号44、46、48及び50のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 前記補体制御ドメインが、配列番号8、18、20、22、62及び64のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記増強ドメインがヒト血清アルブミンである、請求項1~7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記ヒト血清アルブミンが、配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 一本鎖構造である、請求項1~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記CRIg細胞外ドメイン、前記補体制御ドメイン及び前記増強ドメインをN末端からC末端の順に含む、又は、前記補体制御ドメイン、前記CRIg細胞外ドメイン及び前記増強ドメインをN末端からC末端の順に含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号14に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記増強ドメインが、IgG Fcドメインを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgGが、ヒトIgG1及びヒトIgG4からなる群より選択されるタンパク質を含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記IgG Fcドメインが配列番号10、30、32及び34のいずれか一項に記載のタンパクを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 第1ポリペプチド鎖及び第2ポリペプチド鎖を含み、前記第1ポリペプチド鎖が、前記CRIg細胞外ドメイン、前記第1補体制御ドメイン及び前記第1IgG Fcドメインを含み、前記第2ポリペプチド鎖が、前記CRIg細胞外ドメイン、前記第2補体制御ドメイン及び前記第2IgG Fcドメインを含む、請求項13~14のいずれか一項に記載の融合タンパク質。ここで、前記第1IgG Fcドメインと前記第2IgG Fcドメインは相互に作用して二量体を形成することができる。
- 前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、因子H(FH)、CD55、CD46、CD59及びCR1からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む、請求項16に記載の融合タンパク質。
- 前記第1補体制御ドメインが、前記第2補体制御ドメインと同一である、請求項16又は17に記載の融合タンパク質。
- 前記第1IgG Fcドメインが、前記第2IgG Fc構造ドメインと同一である、請求項18に記載の融合タンパク質。
- 前記第1IgG Fcドメイン及び前記第2IgG Fcドメインが、配列番号10及び30のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項18又は19に記載の融合タンパク質。
- 前記第1ポリペプチド鎖が、前記第2ポリペプチド鎖と同一である、請求項18~20のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第1ポリペプチド鎖及び/又は前記第2ポリペプチド鎖が、配列番号14、24、26、28、58、60、66及び68のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項18~21のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第1補体制御ドメインが、前記第2補体制御ドメインと異なる、請求項16又は17に記載の融合タンパク質。
- 前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、CD59及びCD55からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む、請求項23に記載の融合タンパク質。
- 前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、FH及びCD55からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む、請求項23又は24に記載の融合タンパク質。
- 前記第1補体制御ドメイン及び前記第2補体制御ドメインの各々が、独立して、CD46及びCD59からなる群より選択されるタンパク質又はその機能的断片を含む、請求項23~25のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第1IgG Fcドメインが、前記第2IgG Fcドメインが同一である、請求項23~26のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第1IgG Fcドメインが、前記第2IgG Fcドメインと異なる、請求項23~26のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第1IgG Fcドメインが、配列番号32及び34のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の融合タンパク質。
- 前記第2IgG Fcドメインが、配列番号32及び34のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項28又は29に記載の融合タンパク質。
- 前記第1ポリペプチド鎖が、配列番号36、38、40及び42のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項28~30のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 前記第2ポリペプチド鎖が、配列番号36、38、40及び42のいずれか一項に示されるアミノ酸配列を含む、請求項28~31のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
- 請求項23~32のいずれか一項に記載の融合タンパク質であって、
(1)前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号40に示されるアミノ酸配列を含む;
(2)前記第1ポリペプチド鎖は配列番号36に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む;あるいは
(3)前記第1ポリペプチド鎖は配列番号38に示されるアミノ酸配列を含み、前記第2ポリペプチド鎖は配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。 - 請求項1~33のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はその断片をコードする1つ以上の単離核酸分子。
- 請求項34に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項35に記載のベクターを含むか、又は請求項1~33のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する細胞。
- 請求項1~33のいずれか一項に記載の融合タンパク質を調製する方法であって、以下の工程を含む:請求項1~33のいずれか一項に記載の融合タンパク質の合成すること、及び/又は、請求項1~33のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する条件下で、請求項36に記載の細胞を培養すること。
- 請求項1~33のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び任意に薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物。
- 請求項1~33のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項37に記載の薬剤調製における医薬組成物の使用であって、前記薬剤は、補体活性化の標的阻害に関連する疾患を治療するために用いられる。
- 前記疾患が自己免疫疾患を含む、請求項39に記載の使用。
- 前記疾患が自己免疫性重症筋無力症を含む、請求項39~40のいずれか一項に記載の使用。
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