BG107685A

BG107685A - Хемокинови мутанти за лечение на мултиплена склероза

Info

Publication number: BG107685A
Application number: BG107685A
Authority: BG
Inventors: Marie Kosco-Vilbois; Amanda Proudfoot; Timothy Wells
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Priority date: 2000-10-04
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2003-11-28
Also published as: SK4062003A3; HRP20030215B1; HK1062811A1; HUP0302194A3; CN1477969A; PT1326628E; AU1591902A; MXPA03003008A; ES2217199T3; EP1326628B1; NO330278B1; WO2002028419A2; SI1326628T1; PL204231B1; RS50738B; CA2423616C; WO2002028419A3; NO20031525L; SK287523B6; DE60103078D1

Abstract

Изобретението се отнася до мутант на СС хемокини,които съдържат поне две мутации в катионния сайт на 40's бримката и в сравнение с дивия тип молекула имат редуцирана GAG-свързваща активност. Мутантите хемокини са ефективни при лечение на мултипленасклероза и/или други заболявания, свързани с демиелинизация. Тройният мутант на RANTES е съединението, показващо най-добри резултати.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящото изобретение се отнася до мутанти на СС хемокини, които съдържат поне две мутации в луп 40's и които в сравнение с дивия тип молекула имат редуцирана GAGсвързваща активност: открито е, че такива мутирали хемокини са ефективни за лечението на мултитиплена склероза и/или други демиелинизиращи заболявания.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Хемокините представляват семейство от малки цитокини, предшестващи възпалителните процеси със свойства да предизвикват левкоцитен хемотаксис и активиране. В зависимост от позицията на първите консервативни цистеини, семейството на хемокините може да бъде разделено на С-С, СХ-С и С-Хз-С хемокини (Baggiolini М. et al., Adv Immunol. 1994,55: 97-179; Baggiolini M. et al., Annu Rev Immunol. 1997,15: 675-705; Taub D. et al., Cytokine Growth Factor Rev. 1996,7 (4): 355-76).

Много C-X-C хемокини, такива като интерлевкин-8 (IL-8) са хемотаксични за неутрофили, докато С-С хемокините са активни за голяма част от левкоцитите, включващи моноцити, лимфоцити, еозинофили, базофили, NK клетки и дендритни клетки.

ТШ₂-крайният домен на хемокините е включен в рецепторното свързване, а процесингът на ЬШг-края може или да активира хемокините, или да направи хемокините изцяло неактивни.

N-крайните варианти на синтетичните С-С хемокини са анализирани за тяхната активност, като инхибитори или антагонисти на природно съществуващите форми. МСР-1, МСР-3 и RANTES в които липсват от 8 до 9 МН₂-крайни аминокиселини, са неактивни за моноцити и се използват като рецепторни антагонисти. (Gong JH et al., J Exp Med. 1995,181 (2): 631-40 and Gong JH et al., J Biol Chem. 1996,271 (18): 105217)·

Увеличаването на RANTES c един метионин, води до почти пълно инактивиране на молекулата и Met-RANTES има поведение на антагонист за автентичния (Proudfoot АЕ et al., J Biol Chem. 1996 Feb 2; 271 (5): 2599-603).

WO 99/16877 се отнася до амино-краен скъсен RANTES, в който липсват ХН₂-крайните аминокиселини, съответстващи на аминокиселинни остатъци 1, 1-2, 1-3 или 1-4 от естествено срещащия се RANTES и притежаващ активност на хемокинов антагонист, така както и до кДНК секвенции, които ги кодират, тяхното приложение в терапията и/или в диагностиката на заболяванията, при които е необходима антагонистичната активност на хемокиновите ефекти. RANTES (3-68) е предпочитаният скъсен хемокинов антагонист.

Въпреки че хемоатрактантната активност на RANTES и на СС хемокините най-общо се изучава главно във връзка със специфичните клетъчно мембранни рецептори, RANTES може да взаимодейства също така с глюкозаминогликани (GAGs), които варират силно, с разклонени захарни групи, добавени пост-транслационно към няколко белтъка и най-общо наречени протеогликани. (PGs). Такива белтъци присъстват върху клетъчната мембрана, в извънклетъчния матрикс и в кръвния поток, където също могат да присъстват изолирани GAGs.

Взаимодействието с GAGs е отличителна характеристика, обща за много от клетъчно сигналните разтворими молекули (интерлевкини, растежни фактори). PGs, или изолирани GAGs, могат да формират комплекс с разтворими молекули, вероятно за да протектират тези молекули от протеолиза в извънклетъчната среда. Предполага се също така, че GAGs могат да помагат за коректното доставяне на клетъчно сигналните молекули до техният специфичен рецептор, и евентуално също така, за модулиране на прицелната клетъчна активност.

В случай на хемокини, концентрацията в имобилизирани градиенти в мястото на възпаление и в последствие, взаимодействието с клетъчни рецептори, и тяхното активирано състояние, изглежда че се модулира от различни форми на GAGs (Hoogewerf AJ et al., Biochemistry 1997,36 (44): 13570-8). Следователно, беше предположено, че модулирането на такива взаимодействия, може да представлява терапевтичен подход при възпалително заболяване (Schwarz МК and Wells TN, Curr Opin Chem Biol. 1999,3 (4): 407-17) и при HIV инфекция (Bums JM et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999,96 (25): 14499-504). Структурните изисквания и функционалните ефекти на GAGRANTES взаимодействието, са изследвани в различни модели.

RANTES свързва GAGs върху ендотелни клетки от вена на човешка пъпна връв (HUVECs) при микромоларни концентрации, с афинитет и специфичност по-висока от другите хемокини, като МСР-1, 1L-8 или MIP-1 алфа. Изглежда че това взаимодействие не е просто електростатично, но зависи също така от други параметри, като дължина и N- и 0сулфатиране на GAGs (Kuschert GS et al., Biochemistry 1999,38 (39): 12959-68). GAG-дефектни клетъчни линии, все още могат да свързват хемокини, но присъствието на клетъчно повърхностни GAGs до голяма степен увеличават тяхната активност към рецепторите, когато те са в ниски концентрации (Ali S et al., J Biol Chem 2000, 275 (16): 11721-7). Други експерименти показват, че GAGs, по-специално хепарин сулфат, улесняват взаимодействието на RANTES с клетъчната повърхност на макрофаги и в последващото подтискане на HIV инфекцията, резултат, който е в съответствие с добре известната резистентност на тези клетки, слабо експресиращи хепарин сулфат, спрямо анти-вирусните ефекти на RANTES (Oravecz Т, et al., J Immunol. 1997,159 (9): 4587-92).

_w Разтворимите GAGs се конкурират c клетъчно мембранните GAGs и те могат да действат, като специфични инхибитори на RANTES-индуцираната активирана повърхност (Appay V, et al. ; Int Immunol 2000, 12 (8): 1173-82), или като супресори на HIV инфекцията (Bums JM, et al. ; Proc Natl Acad Sci U S A 1999,96 (25): 14499-504).

Някои структурно-функционални изследвания се опитват да идентифицират RANTES домена, отговорен за взаимодействието с GAGs, тъй като, традиционната консенсус секвенция (ВВХВ, където В е основен остатък, a X може да бъде който и да е остатък) е твърде обширна. Проведено е изследване за локализиране на епитоп, чрез използване на моноклонално антитяло, създадено срещу рекомбинантен човешки RANTES, способно да блокира, както анти-вирусните ефекти, така и мобилизирането на вътреклетъчния калций, медиирани от RANTES (Bums JM et al., J. Exp. Med. 1998,188 (10): 1917-27). Този подход позволява, да се определят остатъците 55-66, като необходими както за тези активности, така и за GAG взаимодействието, което потвърждава, че GAGs взаимодействието, може да има комплементарна или различна функция от тази, медиирана от приетите рецептори, което е допуснато също така в изследвания върху RANTES варианти, притежаващи променени агрегационни свойства (Appay V et al., J Biol Chem 1999,274 (39): 27505-12).

Областта 55-66, която представлява С-крайният алфаспирален сегмент, е хомоложна на GAG-свързващият домен на други хемокини, като IL-8 (Witt DP and Lander AD, Curr. Biol. 1994,4 (5): 394-400) и съдържа катионно място, съдържащо лизин и аргинин (KKWVR). Тази свързваща област е различна от свързващото място за клетъчните рецептори, което е локализирано в N-края (Pakianathan DR et al., Biochemistry 1997,36 (32): 96428) и което съдържа някои остатъци, включени в агрегирането на RANTES мономерите, въпреки че такива дезагрегиращи мутации, изглежда, че не повлияват взаимодействето с GAGs (Czaplewski LG et al., J. Biol. Chem. 1999,274 (23): 16077-84; WO 98/13495).

RANTES съдържа друго катионно място (RKNR) в остатъци 44-47, което е консервативно в GAG свързващия домен на други хемокини, като MIP-la (Koopmann W and

Krangel MS, J. Biol. Chem. 1997,272 (15): 10103-9) и ΜΙΡ-1β (Koopmann W et al., J Immunol. 1999,163 (4): 2120-7).

Човешките RANTES варианти, съдържащи единични мутации в тези катионни места са описани, като RANTES антагонисти, които имат потенциални терапевтични приложения, при лечението на HIV инфекции и възпалителни или алергични заболявания (WO 99/33989).

Също така е описано, че само един троен мутант на RANTES, в който три остатъка в позиции 44, 45 и 47 са заместени с аланин, са загубили GAG-свързващата способност (A. Proudfoot et al., Chemokine Gordon Conference, Session I, Jury 24^th 2000, personal communication).

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Днес е известно, че СС хемокините, съдържащи поне две мутации в катионното място на така нареченият 40's луп са ефективни за лечението на мултитиплена склероза и/или други заболявания свързани с демиелинизацията. Това място, представлява консервативен GAG-свързващ мотив в СС хемокините (като RANTES, MIP-1 алфа и MIP-1 бета, MIP-3, MIP-4, НСС1, 1309, МСР-2). Всички тези хемокинови мутанти имат редуцирана GAG-свързваща активност, в сравнение с дивият тип съответстващи молекули.

Областта в която трябва присъстват поне две мутации, съгласно изобретението, така нареченият 40's луп е означена за голям брой СС хемокини на Фигура 1. По-специално е намерено, че RANTES е троен мутант, в който три основни остатъка в позиции, 44, 45 и 47 са заместени с Аланин, е активен в животински модел за лечение на мултитиплена склероза. Този троен мутант на RANTES, показва дозо-зависим ефект, в миши ЕАЕ модел и сравнима ефективност с референтното лечение с рекомбинантен IFN-бета. Аналогични резултати са намерени със скъсен RANTES троен мутант, при който три остатъка в позиции 44, 45 и 47 са заместени с Аланин, и в който липсват първите 2 N- крайни аминокиселини. Този скъсен RANTES мутант (притежаващ аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 3) е нов и представлява друг предмет на настоящето изобретение.

Подобно експериментално доказателство, е получено във връзка с тройни мутанти на MIP-1 алфа и MIP-1 бета, които вече са известни, и които са идентифицирани тук като ΜΙΡ-1α троен мутант R18A-R46A-R48A (Koopmann W and Krangel MS., J Biol Chem. 1997,272 (15): 10103-9) и Μ1Ρ-1β троен 40's мутант K45A-R46A-K48A (Laurence JS, Biochemistry 2001,40: 49904999).

Формулировката редуцирана GAG-свързваща активност, означава, че мутантите от изобретението имат пониска свързваща активност към GAGs, т.е. по-нисък процент от всеки от тези мутантни се свързва със GAGs (като хепарин сулфат) по отношение на съответната див тип молекула.

По-предпочитани са мутанти на човешки RANTES, в които трите основни аминокиселини в позиции 44, 45 и 47 от дивия тип молекула са заместени с други аминокиселини. Тези остатъци могат да бъдат заместени с малки, алифатни, неполярни или слабо полярни остатъци, например такива като Ala, Ser, Thr, Pro и Gly. Аланинът е предпочитания.

RANTES мутантите, за които е открито, че са специфично по-ефективни за лечение на MS са тези, които притежават аминокиселинни секвенции, които са съобщени съответно в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.

Друг предмет на настоящото изобретение е използването на хемокинови мутанти, както е определено по-горе, за получаване на фармацевтичен състав, за лечение на мултитиплена склероза и/или други заболявания свързани с демиелинизацията.

Мултитиплената склероза (MS) е слабо-прогресивно заболяване на ЦНС, характеризирано с десиминирани следи на демиелинизация в мозъка и гръгбначния мозък, водещи до множество и разнообразни неврологични симптоми и белези, обикновенно с ремисии и усложнения (виж, The Merck Manual, шестнадесето издание).

Причината не е известна, но се предполага, че е имунологична аномалия, с известни предположения напоследък, които показват специфичен механизъм. Постулираните причини, включват инфекция от слаб или латентен вирус и миелинолиза от ензими. Обикновенно IgG е увеличен в CSF и увеличените титри, са свързани с разнообразни вируси, включващи вируса на морбили. Значимостта на тези открития и съобщените връзки с HLA алотипове и промененият брой на Т клетки, не е ясна, тъй като доказателствата са до известна степен противоречиви. Увеличената семейна заболеваемост, допуска генетчно предразположение; като че ли жените се засягат по-често, отколкото мъжете.

Изглежда, че факторите на околната среда оказват също влияние. Въпреки, че най-общо, податливата възраст от 20 до 40 години, MS е свързана с географската област, където пациентите прекарват първите си 15 години. Преместването в друга област, след петнадесетте години не променя риска.

Плаките или островите на демиелинизация, с деструкция на олигодендроглия и периваскуларното възпаление, се разпространяват, чрез ЦНС, предимно в бялото мозъчно вещество със склонност, към латералните или постериорните стволове (по-специално в цервикалните и дорзални области), очните нерви и перивентрикуларните области. Засегнати са също така участъците в средният мозък, моста и церебелума, а може да бъде също така засегнато и сивото вещество, както в главния мозък, така и в гръбначния.

Обикновенно са предпазени клетъчните тела и аксоните, особено при ранните лезии. По-късно, аксоните могат да бъдат разрушени, особено в дългите участъци, а фиброзните глиози водят до участъци, които изглеждат “склерозирали”. Както ранните, така и късните лезии, могат да се откриват едновременно. Паказано е, че химичните промени в липидните и белтъчните сътавки на миелина, са в или около плаките.

Заболяването се характеризира с различни оплаквания и откриване на дисфункция в ЦНС с ремисии и постоянни повтарящи се усложнения.

Най-чуствителната диагностична образна техника е техниката за получаване на образ, чрез магнитен резонанс (MRI); тя може да покаже наличието на много плаки. Лезии могат да се наблюдават също така, чрез повишаващи контраста СТ сканирания.

Разбираемо е, че терапевтичните предимства при мултитиплена склероза (MS), не могат да се изяснят, отчасти, поради не-пълното разбиране на патогенезата на нарушението. При емпирично базираното лечение, основните пречки за напредъка на лечението, включват голямото разнообразие от курсове за лечение на MS, дълготрайните по природа много важни оценки за изхода от забляването и липсата на обективни маркери за лечебен ефект, по-специално в кратки срокове.

Въпреки че, патогенезата на MS остава не-изяснена, продължава да се изследва естествената история на заболяването. Продължава развитието на обективният анализ за изхода, базиращ се на образа от магнитния резонанс (MRI) и сега са известни много от премеждията, които са преодолени чрез клиничните опити, водещи до подобряване на експерименталните методи и по-добра интерпретация на резултатите.

Следователно, друг предмет от настоящето изобретение е методът за лечение на MS, чрез прилагане на ефективно количество от хемокинови мутанти от изобретението, заедно с фармацевтично приемлив ексципиент.

Терминът ефективно количество, се отнася до количество от активни съставки, което е достатъчно за да въздейства върху развитието и степента на заболяването, което води до намаляване или ремисия на това патологично състояние. Ефективното количество, ще зависи от начина на прилагане и състоянието на пациента.

Друг обект от настоящето изобретение са фармацевтични състави, съдържащи хемокинови мутанти от изобретението, в присъствието на един или повече фармацевтично-приемливи ексципиента, за лечение на MS и/или други заболявания, свързани с демиелинизацията.

Фармацевтично приемлив означава че включва всеки носител, който не повлиява ефективността на биологичната активност на активната съставка и който не е токсичен за гостоприемника, на който се прилага. Например, за парентерално пролижоние по-горните активни съставки могат да се формулират като единично дозирана форма за инжекции в разтворители, такива като, солеви разтвор, разтвор от декстроза, серумен албумин и Рингеров разтвор.

Освен фармацевтично приемливия носител, съставите от изобретението могат да включват също така малки количества от допълнителни компоненти, такива като стабилизатори, ексципиенти, буфери и консерванти.

Прилагането на такава активна съставка може да се извърши по интравенозен, интрамускулен път или подкожно. Други начини на приложение чрез които могат да се установят желаните нива в кръвта от съответните съставки са включени в настоящото изобретение.

Оптималната доза от активната съставка може да се избере подходящо съгласно начина на приложение, болестното състояние и характеристиките на пациента (пол, възраст, телесно тегло, здравословно състояние, размер), степента на симптомите, конкурентни лечения, честота на лечение и желаният ефект. Възможностите за регулиране и манипулиране на обхвата от установените дози са добре известни на специалистите в областта.

Обикновено дневната доза от активната съставка може да е около 0.01 до 100 милиграма на килограм телесно тегло.

Обикновено е от 1 до 40 милиграма на килограм от телесното тегло за ден, която се дава разделена на две дози или форма задържаща освобождването е ефективна за получаване на желаните резултати. Вторият тип или по-следващите прилагания, могат да се извършат с доза, която е същата, помалка от или по-голяма от първоначалната или предварителната доза, приложена на индивида.

Настоящото изобретение е описано с цитирана литература за специфичните варианти, но съдържанието на описанието г включва всички модификации и замествания, които могат да ’Ще»' бъдат дадени от специалистите в областта, без да излиза от обхвата, значението и целите на патентните претенции.

Сега изобретението ще бъде описано, чрез следните примери, които нямат за цел по никакъв начин да ограничават настоящето изобретение. Примерите се отнасят до фигурите, които са специфицирани, тук по-долу.

ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1: тя показва съпоставяне на някои примерни СС хемокини, подредени по отношение на нивото на 40's лупа. Този белтъчен сегмент и катионното място, което съответства на GAG-свързващият мотив са ограничени в рамка.

Фигура 2: тя показва картата на плазмида, използван за клониране на див тип RANTES и неговите мутанти, съгласно Примерите.

Фигура 3: тя показва резултатите от конкурентният свързващ анализ на [¹²⁵I]-RANTES и мутантите чрез хепарин в анализа с хепаринови гранули.

Фигура 4: тя показва анализ на конкурентно-равновесено свързване на RANTES и тройният 40’s RANTES мутант.

Фигура 5: тя показва индукцията на моноцитен и на Т клетъчен хемотаксис, чрез RANTES и тройните 40's и 50's RANTES мутанти.

Фигура 6: тя показва инхибирането на перитонеално клетъчно възстановяване, чрез тройният 40's RANTES мутант.

Фигура 7: тя показва инхибирането на RANTES индуцирано перитонеално клетъчно възстановяване, чрез скъсен троен 40's RANTES (3-68) мутант, получен в Pichia pastoris.

Фигура 8: тя показва инхибирането на MIP-Ιβ индуцирано перитонеално клетъчно възстановяване, чрез ΜΙΡΙβ тройният 40's мутант (K45AR46AK48A).

Фигура 9: тя показва инхибирането на ΜΙΡ-ία индуцираното перитонеално клетъчно възстановяване, чрез тройният ΜΙΡ-ία мутант (R18A-R46A-R48A).

Фигура 10: тя показва инхибирането на тиогликолат индуцирано клетъчно възстановяване, чрез тройният 40's RANTES мутант.

Фигура 11: тя показва инхибирането на началото на експерименталните автоимунни енцефаломиелити, чрез целия 40's RANTES троен мутант от изобретението.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Материали и методи

а) Получаване на RANTES мутанти, не-свързващи се с хепарин

Мутагенезиса на RANTES се постига, чрез техниката на обратната полимеразна верижна реакция. Въвеждат се точкови мутации в един от двата праймера, използвани за хибридизиране на човешка RANTES кодираща секвенция (GenBank acc. No. NM 002985) в обратна ориентация. За да се подобри ефективността на праймерната хибридизация (особено, когато в праймерите се въвеждат много мутации) ДНК се подлага на алкална денатурация. Денатурираната ДНК се разрежда до концентрация приблизително от 10 pg/за реакция, за да се избегне включването на не-мутирала ДНК в реакцията

Чина трансформацията.

Аминокиселините означения, дадени в Примерите и в Описанието, се отнасят до зряла форма на белтък, т.е. като се започва със Ser, който е аминокиселина в позиция 24, съгласно списъка на секвенциите. Следователно, за да има перфектно съответствие между означените аминокиселини в списъка на секвенциите и този в Примерите, трябва да се добави 23 към означението, което се среща в Примерите или в Описанието.

Използваните секвенции на мутагенните праймери, са както следва и мутиралите бази са подчертани:

R44A (сенс)

5'-TTTGTCACCGCAAAGAACCGCCAAG-3':Pl

R44A (анти-сенс)

5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3':Р2

К45А (сенс)

5'-TTTGTCACCCGAGCGAACCGCCAAG-3':РЗ

К45А (анти-сенс)

5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTG-3':Р4

R47A (сенс)

5-CGAAAGAACGCCCAAGTGTGTGCCA-3':Р5

R47A (анти-сенс) 5'-GGTGACAAAGACGACTGCTGGGTTG-3':Р6

R44A-K45A-R47A (троен 40's мутант, сенс) 5'-TTTGTCACCGCAGCGAACGCCCAAGTGTGTGCCAAC-3':Р7

R44A-K45A-R47A (троен 40's мутант, анти-сенс) 5'-GACGACTGCTGGGTTGGAGCACTTGCC-3':Р8

К55А (сенс) 5'-GCCAACCCAGAGGCGAAATGGGTTCGG-3':Р9

К55А (анти-сенс) 5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGAC-3':Р10

К56А (сенс) 5'-AACCCAGAGAAGGCATGGGTTCGGGAG-3':Pl 1

К56А (анти-сенс) 5'-GGCACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGT-3':Р12

R59A (сенс) 5'-AAGAAATGGGTTGCGGAGTACATCAAC-3':Р13

R59A (анти-сенс) 5'-CTCTGGGTTGGCACACACTTGGCG-3’:Р14

K55A-K56A-R59A (троен 50's мутант, сенс) 5'-GCCAACCCAGAGGCGGCATGGGTTGCGGAGTACATC-3': Р15 K55A-K56A-R59A (троен 50’s мутант, анти-сенс) 5'-ACACACTTGGCGGTTCTTTCGGGTGACAAAGAC-3': Р16

Амплификацията се извършва в ДНК термичен циклизатор (Perkin-Elmer-Cetus 480) за 35 цикъла, като се използва pfuturbo® ДНК полимераза (Stratagene). ДНК се лигира и трансформира в Тор 10 F' компетентни Е coli клетки (Invitrogen). Секвенцията на мутантите се проверява, чрез ДНК секвениране

б) Експресия и пречистване на див тип (WT) RANTES и RANTES мутанти в Е coli.

ДНК фрагментите, получени, чрез PCR обяснен по-горе и клонирани в плазмид pET24d (Фигура 2), водят до получаването на серия от вектори. WT или мутиралата RANTES кодираща секвенция е клонирана в 3' края на рТ7 промотора, между местата, разпознавани от рестриктарзните ензими Xbal и Nhel/Xhol. Плазмидът съдържа два маркерни гена (Km и lacl) и активно начало на репликация (Ori fl).

Получените вектори се използват за повторна трансформация на BL21 (DE3) Е. coli щамът, който се характеризира с висока степен на белтъчна експресия, като се използва системата рТ7 I Lacl. Белтъчната експресия се индуцира, чрез добавяне на 1 тМ изопропил-Р-Лтиогалактопиранозид (IPTG) към културата. Клетките се събират и се ресуспендират в буфер за лизиране (50 тМ ТрисHCI pH 8, 10 mM MgCI₂, 5 тМ Бензамидин/HCI, 1 тМ DTT, 0.1 тМ фенилметилсулфонил флуорид (PMSF), ДНК-аза 20 mg/L). Клетките се разрушават, като се прекарват на 3 пасажа през French Pressure Cell unit. След това суспензията се центрофугира при 10,000 х g в продължение на 30 минути на 4 ⁰ С. Утайката, съдържаща WT RANTES или единият от RANTES мутантите се разтваря в 0.1 М Трис/HCI, pH 8.0, съдържащ 6М гуанидин/HCI и 1 mM DTT и се разбърква в продължение на 30 минути при 60 ⁰ С. Разтворът се диализира 3 пъти срещу 1 % оцетна киселина. Неразтвореният материал се отстранява чрез центрофугиране при 10,000 х g в продължение на 30 минути. Супернатантата, съдържаща WT RANTES или един от RANTES мутантите се лиофилизира.

Лиофилизираният прах се разтваря в 0.1 М Трис/HCI, pH 8.0, съдържащ 6М гуанидин/HCI и 1 mM DTT за да се получи концентрация приблизително 1 mg/ml. Белтъците се ренатурират, чрез падащо разреждане в обем 10 х от гуанидиновият разтвор от 20 тМ Трис/HCI, pH 8.0, съдържащ 0.01 тМ окислен глутатион и 0.1 тМ редуциран глутатион. Разтворът се разбърква в продължение на една нощ на 4°С. Неразтвореният материал се отсранява, чрез центрофугиране при 10,000 х g в продължение на 30 минути. pH се коригира до

4.5 с оцетна киселина и проводимостта се коригира до 20 mS, чрез разреждане с вода. Разтворът се прилага към HiLoad S 26/10 колона, предварително еквилибрирана с 20 тМ натриев ацетат pH 4.5 и белтъкът се елюира с линеен 0-2 М NaCI градиент в същия буфер. Фракциите съдържащи WT RANTES или един от RANTES мутантните белтъци, се събират, диализират се 3 пъти срещу оцетна киселина и се лиофилизират.

Лиофилизираните белтъци се разтварят в 50 тМ Трис/HCI буфер, pH 8.0. MKKKWPR лидерната секвенция, получена чрез методът за клониране, се изрязва от WT RANTES или от един от RANTES мутантните белтъци, чрез инкубиране с ендопротеиназа Arg-C (1 : 600 ензим: субстрат, w/w) в продължение на една нощ при 37 ⁰ С. Изрязаните белтъци се отделят от белтъка, който не е скъсен, чрез катионно обменна хроматография върху HiLoad S 26/10 колона, която предварително е еквилибрирана в 20 тМ натриев ацетат, pH

4.5, съдържащ 6 М уреа и белтъците се елюират с линеен 0-2М NaCI градиент в същия буфер. Фракциите от скъсения белтък се събират и диализират два пъти срещу 1 % оцетна киселина и накрая срещу 0.1% трифлуорооцетна киселина и след това се лиоилизират (Edgerton MD et al., pg. 33-40, and and Proudfoot AE et al., pg. 75-87, inChemokine Protocols, Methods in Molecular Biology 2000, vol. 138, Humana Press).

Автентичността на WT и RANTES мутантните белтъци, се доказва чрез мас спектрометрия. С аналогичен метод, е получен друг мутант, който съдържа Met, за увеличаване на NH₂-Kpaa, така както и единичния или тройните 40's RANTES мутанти и единичния или троен 50's мутанти.

в) Експресия и пречистване на див тип (WT) RANTES и RANTES мутанти в Pichia pastoris

Зрелият троен 40’s RANTES мутант (R44A-K45A-R47A) се получава, като се използва мегапраймер, на базата на PCR мутагенезис (Datta АК, Nucleic Acid Research 1995,23 (21): 453031). Той се клонира в Pichia pastoris експресионен вектор рР1С9К, в рамка със S. cerevisiae Mat алфа пре-про сигнален пептид.

След потвърждаване на секвенцията, плазмидът се пренася в Pichia pastoris щам-гостоприемник GS115 (his4) чрез електропорация. His⁺ клоновете се скринират за експресия на RANTES мутант. Проведени са изследвания за експресия в лабораторни условия, като се използват стандартни методи, които са описани в Pichia Expression Kit от Invitrogen (Life Technologies). Накратко, културата се размножава в обогатена среда, в която се използва глицерол като източник на въглерод, след което тя се утаява и се ресуспендира в среда, съдържаща метанол, за да се индуцира експресията на RANTES мутантния белтък. Секрецията на RANTES мутанта в средата се доказва, чрез SDS-PAGE, оцветена с Coomassie Blue.

Клонът, секретиращ високи нива на RANTES мутант (около 500-750 mg/1), се използва за увеличаване на количеството му при разклащане в колби с голям обем. Ферметационната среда се центрофугира при 5,000 грш и супернатантата се използва за пречистване.

Белтъкът се пречиства от супернатантата, чрез едностъпална хроматография през Хепарин Сефарозна колона, еквилибрирана в 0.1 М Трис-HCI, и се елюира с линеен градиент от 0-2 М NaCI в същия буфер, като се използва колона с 20 обема. Автентичността на белтъка се доказва, чрез мас спектрометрия и е открито, че в такава система RANTES мутанта (R44A-K45A-R47A), получен по този начин, също е скъсен в N-края, в сравнение с дивия тип молекула, т.е. в него липсват първите 2 аминокиселини. Следователно, полученият по този начин мутант е идентифициран, като троен 40's RANTES (3-68) мутант (R44A, К45А, R47A) и неговата аминокиселинна секвенция е тази, от SEQ ID NO: 3.

г) Хепарин свързващи анализи

Хепарин севарозната хроматография се провежда, като се използват 50 μ g WT или мутантни RANTES белтъци, които се нанасят върху Хепарин Сефарозна колона, еквилибрирана в 25 тМ Трис/HCI, pH 8.0 и 50 тМ NaCI и се елюират с линеен градиент от 0-2 М NaCI в 25 тМ Трис/HCI, pH 8.0.

Провежда се хепарин сефарозна хроматография, като се използват 50 pg WT или мутантни RANTES белтъци, които се нанасят върху MonoS катионно обменна колона, еквилибрирана в 50тМ натриев ацетат, pH 4.5. След това белтъкът се елюира с градиент от 0-2 М NaCl.

Провежда се конкурентен свързващ анализ, чрез използване на WT RANTES, троен 50’s RANTES мутант и троен 40's RANTES мутант (SEQ ID NO: 2 - определена тук, като R44A-K45A-R47ARANTES), които са белязани радиоактивно с 1 от Amersham до специфична активност от 2200 mCi/mole. Филтърни 96 ямкови плаки се потапят в свързащ буфер (50 тМ HEPES, pH 7.2 съдържащ 1 тМ СаС1₂, 5 тМ MgCI₂, 0.15 М NaCl and 0.5% BSA). Правят се серийни разреждания на хепарин в свързващия буфер, за да се покрие концентрационния обхват от 20 mg/ml до 1 pg/ml. Анализът се провежда в общ обем от 100 μΐ, чрез добавяне на 25 μΐ от разрежданията на хепарина, 25 μΐ от 0.4 пМ [ 1]-хемокин, 25 μΐ от хепаринови гранули (0.2 pg/ml във вода) и 25 μΐ от свързващ буфер във всяка ямка. Анализът се провежда трикратно. Плаките се инкубират на стайна температура при разклащане в продължение на 4 часа. Филтърните плаки се измиват три пъти с 200 μΐ буфер за измиване, като се използва вакуумна помпа, за да се отстрани не-свързаният, белязан хемокин. След това, към всяка ямка се добавят 50 μΐ от сцинтилационната течност и се отчита радиоактивността (1 минута/ямка). Данните се анализират, чрез използване на GraFit Софтуер.

д) Равновесни анализи за конкурентно рецепторно свързване

Анализите се провеждат върху мембрани от СНО трансфектирани клетки, експресиращи CCR1 или CCR5, като се използва Scintillation Proximity Анализ (SPA), чрез използване [¹²⁵1]-ΜΙΡ-1α като рдиоактивен изотоп.

Съединенията - конкуренти се приготвят, чрез серийни разреждания на не-белязани хемокини в свързващ буфер, за да се покрие обхватът 10' -10’ М. Използваният свързващ буфер е 50 тМ HEPES, pH 7.2, съдържащ 1 тМ CaCI₂, 5 тМ MgCI₂, 0.15 М NaCI и 0.5% BSA. Пшеничени SPA зърна (Amersham) се разтварят в PBS до 50 mg/ml и се разреждат в свързващ буфер до 10 mg/ml и крайната концентрация при анализа е 0.25 mg/ямка. Мембраните, приготвени от СНО клетки, експресиращи CCR1 или CCR5 се съхраняват при -80 ⁰ С и се разреждат в свързващ буфер до 80pg/ml. Преди да се проведе анализа, се смесват равни обеми от стоковете от мембрани и зърна, за да се снижи фона. Крайната мембранна концентрация е 2 pg/ml, а тази на [¹²⁵1]-ΜΙΡ-1α е 0.1 пМ. Плаките се инкубират на стайна температура при разклащане в продължение на 4 часа. Измерва се радиоактивността и данните се анализират, както е описано за хепарин-свързващия анализ.

е) Анализ за хемотаксис

Провежда се моноцитен хемотаксис като се използва микро-Boyden анализ в камера. Моноцитите се пречистват от левкоцитни утайки, като се използва следния метод за изолиране: 100 ml разтвор от левкоцитна утайка се разрежда със 100 ml PBS, нанася се върху Ficoll и се центрофугира при 600 х g в продължение на 20 минути на стайна температура. Клетките формиращи интерфазата се събират, промиват се два пъти с PBS и се ресуспендират в концентрация от 40-100 х 10⁶/ml в RPMI 1640 среда, съдържаща 5% инактивиран фетален телешки серум (FCS), 2 шМ глутамин и 25 mM HEPES, pH 7.2. По-нататък те се пречистват от лимфоцитната фракция чрез добавяне на 10⁶ овчи кръвни клетки/ml, оставят се да образуват розетки при 4⁰ С в продължение на една нощ и се разделят чрез втори Ficoll градиент, при центрофугиране на 900 х g в продължение на 20 минути на стайна температура. Моноцитите се откриват в интерфазата между Ficoll и буфера, а Т клетките в _г утайката.

Моноцитите се промиват в PBS и се ресуспендират в 2.5 х 10⁶/ml в RPMI 1640 среда. Степента на пречистване се измерва, чрез FACS анализ с право и странично разпръскване и е намерено, че тя е 40-80% зависима от донора. Хемокините се разреждат до краен обем от 30 pl, покриващ концентрационният обхват от 10'⁶-10'¹² М в RPMI среда, поставена в по-долните ямки. Филтър с размер на порите 5 pm (Neuroprobe) за моноцити и 8 pm за Т клетки, се поставя върху по-долните ямки, като сме сигурни, че там няма мехурчета от въздух и системата се запечатва. В по-горните ямки се поставят 50 pl от клетъчната суспензия (2.5 х 10⁶ клетки/ml) в RPMI среда. Камерата се инкубира в продължение на 30 минути за моноцити и в продължение на 1.5 часа за Т клетки при 37 ⁰ С под 0₂. След това клетките се отстраняват, горната повърхност от мембраната се пречиства, чрез остъргване от клетките и мембраната след това се промива с PBS. Мембраната се фиксира, чрез потапяне в МеОН в продължение на 1 минута, изсушава се на въздух и се оцветява с Fields А и В разтвори. Клетките, които мигрират се преброяват, чрез избиране на случайни полета за всяка ямка с 20х обектив под стандартен микроскоп, снабден с IBAS образен анализиращ софтуер. Данните се се обработват, като се използва GraFit софтуер.

ж) Анализ за перитонеално клетъчно възстановяване

В първи анализ, клетъчното възстановяване се индуцира от интраперитонеална инжекция от 10 pg хемокин, разреден в 0.2 ml стерилен солеви разтвор (NaCl, не-съдържащ LPS) в женски BALB/c мишки на възраст от 8 до 12 седмици. _f Хемокиновите мутанти (10 pg от хемокинът, разреден в 0.2 ml стерилен солеви разтвор) се прилагат 30 минути преди да се приложи агониста. Шестнадесет часа по-късно, мишките се обиват чрез аерозолен С0₂. Перитонеалният лаваж се получава с 3 промивки с 5 ml PBS и лаважите се събират. Клетките се центрофугират при 600 х g в продължение на 10 минути, ресуспендират се в краен обем от 1 ml и общият получен брой левкоцити се преброява с хемоцитометър.

Във втори анализ, клетъчното възстановяване се индуцира, чрез интраперитонеална инжекция от 200 μΐ 3% разтвор на тиогликолат в дестилирана вода, в женски BALB/c мишки на възраст от 8 до 12 седмици (Ден 1). Хемокиновият мутант (10 pg от хемокинът, разреден в 0.2 ml стерилен солеви разтвор) се прилагат 30 минути преди да се приложи тиогликолата. Хемокиновият мутант се прилага дневно, в продължение на три дни (Ден 2, 3 и 4). Мишките се убиват на 5 ден, чрез аерозолен СО₂. Перитонеалният лаваж се получава с 3 промивки с 5 ml PBS и лаважите се събират. Клетките се центрофугират при 600 х g в продължение на 10 минути, ресуспендират се в краен обем от 1 ml и общият получен брой левкоцити се преброява с хемоцитометър.

з) Експериментални автоимунни енцефаломиелити (ЕАЕ)

Методи за имунизиране

Женски мишки на възраст 8 седмици С57 BU6NCrIBR с тегло 18-22 грама, се имунизират (ден = 0) чрез подкожна инжекция в задната част на врата с 0.1 ml емулсия, съдържаща 200 pg MOG35-55 пептид (Neosystem, Strasbourg, France) в пълен адювант на Freund (CFA с Mycobacterium butyricum, Difco, Detroit, U. S. А.), съдържащ 0.25 mg Mycobacterium tuberculosis. Преди подкожната инжекция те получават 200 μΐ интравенозна инжекция от 300 ng пертузис токсин (List Biological Lab., Campbell, СА, U. S. А.), разтворен в PBS, в опашната вена. На 2 ден на животните се дава втора интраперитонеална инжекция от 300 ng пертузис токсин.

Тази процедура води до, като се започне приблизително от 8-10 ден, до появата на прогресивна парализа, която започва от опашката и напредва прогресивно до предните крайници.

План на изследването

Изследването включва групи, като всяка е от 10 животни. Всички групи са имунизирани с MOG35.55 пептид в CFA и пертузис токсин, съгласно протокола за имунизиране.

Група 1: положителна контролна група, на която се дава дозира само от разтворител (PBS) интраперитонеално.

Група 2: положителна контролна група, на която се дава доза само от разтворител (PBS) подкожно.

Група 3: дава се доза от 10 pg/мишка интраперитонеално от троен 40’s RANTES мутант.

Група 4: дава се доза от 1 pg/мишка интраперитонеално от троен 40's RANTES мутант.

Група 5: дава доза от 10 pg/мишка интраперитонеално от троен 40's Met-RANTES мутант.

Група 6: дава се доза от 1 pg/мишка интраперитонеално от троен 40's Met-RANTES мутант.

Група 7: дава се доза от 10,000 U/мишка подкожно от миши рекомбинантен интерферон бета (m-IFN-β).

Група 8: дава се доза от 20,000 U/мишка подкожно от шIFN-β

Разтворител

Използва се PBS за разреждане на целия RANTES 40's троен мутант, на целия Met-RANTES 40's троен мутант и mIFN-β до подходящата концентрация.

Начин на прилагане

Тройният 40's RANTES мутант, тройният 40's MetRANTES мутант и m-IFN-β се прилагат дневно интраперитонеално, като обема на приложената доза е 200 μΐ/мишка. На Групите 1, 2 се прилага доза интраперитонеално от 200 μΐ/мишка PBS.

Продължителност на третирането

За всяко животно третирането започва на 4 експериментален ден (приблизително 3-5 дена преди обикновената поява на заболяването) и след това продължава 14 последователни дни (животните се убиват на 18 ден).

Клинични наблюдения

Като се започва от 5 ден, животните се изследват поотделно за присъствие на парализа, чрез клинична оценка както следва:

= липсва симптом на заболяване

0.5 = частична парализа в опашката = парализа в опашката

1.5 = парализа в опашката + частична едностранна парализа в задния крайник = парализа в опашката + слабост в задния крайник или частична парализа в задния крайник

2.5 = парализа в опашката + частична парализа в задния крайник (по-долния таз) = парализа в опашката + пълна парализа в задния крайник

3.5 = парализа в опашката + пълна парализа в задния крайник + инконтиненция

- парализа в опашката + парализа в задния крайник + слабост или частична парализа на предните крайници = умиране или смърт

2. РЕЗУЛТАТИ

а) Хепарин свързващи анализи

Пречистените RANTES белтъци, мутирали в едно или три места се анализират чрез хепарин хроматография и концентрацията на NaCI необходима за да се елюират се сравнява с профила на елюиране на WT RANTES. Тъй като взаимодействието с хепарин е електростатично, мутантите се подлагат също така на катионно обменна хроматография, върху MonoS колона. Това води до падане на концентрацията на NaCI, която е необходима, за тяхното елюиране, тъй като мутагенезиса отстранява основните остатъци. Разликата в концентрацията на NaCI, получена от катионно обменната хроматография се изважда от тази, получена от хроматографията с хепарин. Ако тази стойност е положителна, това означава специфично взаимодействие с хепарина. (Таблица 1).

Провежда се директно измерване за свързване на хепарина с тройните 40's и 50's RANTES мутанти в конкурентен анализ за свързване. WT RANTES и мутантите се бележат с йод от Amersham и всичките имат една и съща специфична радиоактивност от 2,200 mCi/мол. Обаче, приблизително само 20% от тройният 40's мутант се свързва с хепариновите гранули, с максимален брой срт от 4,000 в сравнение с 22,000 срт за WT RANTES и 50’s мутанта (Фигура 3). Това показва че тези остатъци в 40's лупа, които са мутирали допринасят до голяма степен за хепарин свързващия капацитет на RANTES. От друга страна това показва също така, че предполагаемият GAG-свързващ мотив в 50's лупа не е истинското GAGсвързващо място.

б) Равновесни конкурентни рецепторно свързващи анализи

Способността на тройният 40's и тройният 50's RANTES

IOC мутанти да се конкурират с [ I] ΜΙΡ-Ια за свързване с рекомбинантния CCR1 и CCR5 в мембраните, се получава от СНО стабилни трансфектанти. Не се наблюдава значителна разлика в която и да е от единичните мутации и в двата рецептора (резултатите не са показани). Нито един от тройните мутанти не показва разлика в свързването с CCR5, в сравнение с WT RANTES белтъка. Обаче, по отношение на CCR1, тройният 40's мутант има 100-кратна редукция в афинитета, докато тройният 50's мутант показва само малка (3-кратна) загуба на афинитет (Фигура 4).

в) Хемотаксични анализи

И двата тройният 40's и тройният 50's мутанти са способни да индуцират моноцитен хемотаксис с активности сравними с WT RANTES, с изключение на тройният 40's мутант, който е способен само да индуцира значителен хемотаксис при 1 μΜ. Обаче, тройните 40's и 50's мутанти са с еднаква възможност за способността им да индуцират Т клетъчен хемотаксис (Фигура 5). Получените резултати от анализа за моноцитния хемотаксис отговарят точно на тези получени при анализите за рецепторно свързване.

Получените резултати от анализа за моноцитния хемотаксис отговарят точно на тези получени при анализите за рецепторно свързване. Загубата на активност на тройният 40's RANTES мутант върху моноцитния хемотаксис отговаря на загубата на афинитет за CCR1.

г) Анализи за перитонеално клетъчно възстановяване.

Тройният 40's RANTES мутант не е способен да индуцира клетъчно възстановяване в перитонеума при доза (10 pg/MHiiiKa), при която RANTES причинява съществено възстановяване (Фигура 6).

Освен това, ако 10 pg от мутанта се приложат 30 минути, преди прилагането на RANTES, клетъчното възстановяване индуцирано от RANTES се инхибира. Следователно, избягването на GAG-свързването, води до получаване на инхибитор на хемокин-индуцирано клеъчно възстановяване in vivo.

Аналогични резултати са показани на Фигура 7 със скъсен RANTES (3-68) троен 40's мутант (получен в Pichia pastoris), на Фигура 8, чрез MlP-Ιβ троен 40's мутант (K45A-R46A-K48A) и на Фигура 9, мрез ΜΙΡ-1α троен 40's мутант (R18A-R46AR48A). Клетъчното възстановяване, стимулирано от тиогликолат се инхибира, също чрез тройния 40's RANTES мутант, както е показано на Фигура 10.

д) Експериментални автоимунни енцефалопатии (ЕАЕ)

Тройният 40's RANTES мутант показва дозо-зависим ефект в миши ЕАЕ модел. Белтъкът, както при 1 μg, така и при 10 pg/мишка, приложен дневно, интраперитонеално, като се започва от ден 10 след първата имунизация с MOG, показва сравнителна ефикасност по отношение на референтното лечение, рекомбинантен m-IFN-β (Фигура 11). Началото на болестта се забавя значително, а също така значително се редуцира степента на заболяването (което се оценява от площта под кривата). Освен това се намалява също така средната стойност от максималния клиничен резултат достигната по време на експеримента. Другият мутант (тройният 40's Met

RANTES мутант) не може да покаже какъвто и да е благоприятен ефект в същия експеримент.

Нашите резултати показват много ясно благоприятният ефект от лечението с целия 40's RANTES троен мутант, който редуцира клиничните симптоми на хроничен ЕАЕ в мишки след имунизация с MOG. Следователно, тройният 40's RANTES мутант има благоприятен терапевтичен ефект и може да се използва за лечение на хронинични болестни състояния, свързани с демиелинизация, такива като MS.

Таблица 1. Моларност на NaCI за елюиране от Хепарин и Mono-S (катионно обменни) колони

RANTES Мутация	Хепарин	MonoS	Δ NaCr^e(”^s	Δ NaCI^M’^s	Δ Δ NaCI
Без (WT)	0.80	0.91
R44A	0.61	0.82	0.19	0.09	0.10
К45А	0.65	0.97	0.15	0.04	0.11
R47A	0.65	0.84	0.15	0.07	0.08
.R44A-K45A-R47A	0.47	0.70	0.33	0.21	0.11
К55А	0.70	0.86	0.10	0.05	-0.05
К56А	0.90	0.94	-0.10	0.07	-0.17
R59A	0.79	0.85	0.01	0.06	-0.05
K55A-K56A-R59A	0.70	0.75	0.10	0.16	-0.06

Следващата Таблица ще изясни идентичността на секвенциите, съобщени в списъка на секвенциите и в целия текст.

Таблица 2

SEQ ID NO:	Описание на секвенцията
1	Див тип (WT) RANTES
2	Троен 40’s RANTES мутант
3	Троен 40’s RANTES(3-68) мутант
4	Троен MIP-1- алфа мутант (R18A-R46A-R48A)
5	Троен MIP-1- бета мутант (K45A-R46A-K48A)
6	Троен 50’s RANTES мутант
7	Троен 40’s Met-RANTES мутант
8	R44A- RANTES мутант
9	K45A-RANTES мутант
10	R47A- RANTES мутант
11	K55A-RANTES мутант
12	K56A-RANTES мутант
13	R59A- RANTES мутант
14	Праймер Р1
15	Праймер Р2
16	Праймер РЗ
17	Праймер Р4
18	Праймер Р5
19	Праймер Р6
20	Праймер Р7
21	Праймер Р8
22	Праймер Р9
23	Праймер Р10
24	Праймер Pl 1
25	Праймер Р112
26	Праймер Р13

27	Праймер Pl 4
28	Праймер Pl 5
29	Праймер Pl 6
30	WT-I309
31	WT-MIP-1-алфа
32	WT-MIP-1-бета
33	WT-MIP-4
34	WT-MIP-5
35	WT-HCC1
36	WT-I36512
37	WT-MCP-2

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНПИИ

1. Скъсен и мутантен човешки RANTES, който има аминокиселинна секвенция SEQ ID NO : 3.
2. Използване на СС хемокинов мутант, който съдържа най-малко две мутации в катионното място на 40's лупа и който, в сравнение с дивия тип молекула има редуцирана GAG свързваща активност, за приготвяне на фармацевтичен състав, за фармацевтичен състав за лечение на мултитиплена склероза и/или други заболявания, свързани с демиелинизация.
3. Използване, съгласно претенция 2, в която хемокиновият мутант е RANTES мутант.
4. Използване, съгласно претенция 3, където хемокиновият мутант е RANTES троен мутант, в който трите основни аминокиселини в катионното място на 40's лупа са заместени с други аминокиселини.
5. Използване, съгласно претенция 4, където трите основни аминокиселини в катионното място на 40's лупа са заместени от Аланин, Серин, Треонин, Пролин или Глицин.
6. Използване, съгласно претенция 2, където хемокиновият мутант е скъсеният или мутантен RANTES, съгласно претенция 1.
7. Използване, съгласно претенция 2, където хемокиновият мутант е RANTES мутантът от SEQ ID NO: 2.
8. Използване, съгласно претенция 2, където хемокиновият мутант е MIP-1-алфа мутантът от SEQ ID NO : 4.
9. Използване, съгласно претенция 2, където хемокиновият мутант е MIP-1-бета мутантът от SEQ ID NO : 5.

9. Фармацевтичен състав за лечение на мултитиплена склероза и/или други заболявания, свързани с демиелинизация, характеризиращ се с това, че включва като активна съставка хемокинов мутант както е определено, съгласно претенции от 1 до 8, заедно с фармацевтично приемлив ексципиент.
10. Скъсен и мутантен човешки RANTES, който има аминокиселинна секвенция SEQ ID NO : 2.
11. ДНК молекула, включваща ДНК секвенции, кодиращи скъсения и мутантен RANTES, съгласно претенция 10.

г 12. Експресионен вектор, който включва ДНК молекулата, 'Ши* съгласно претенция 10.

13. Клетка-гостоприемник, включваща експресионния вектор, съгласно претенция 12.

14. Рекомбинантен метод за получаване на полипептида, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва култивиране на клетки в подходяща културална среда, съгласно претенция 13.

ПРОМЕНЕНИ ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Използване на СС хемокинов мутант, който съдържа най-малко две мутации в катионното място на 40’s лупа и който, както е показано на Фигура 1 и който, в сравнение с дивия тип молекула има редуцирана GAG свързваща активност, за приготвяне на фармацевтичен състав, за фармацевтичен състав за лечение на мултитиплена склероза и/или други заболявания, свързани с демиелинизация, където СС хемокинът е избран между RANTES, MIP-1 алфа, MIP-1 бета, MIP-3, MIP-4, НСС1, 1309,135612 и МСР-2.

2. Използване, съгласно претенция 1, в която хемокиновият мутант е RANTES мутант.

3. Използване, съгласно претенция 2, където хемокиновият мутант е RANTES троен мутант, в който трите основни аминокиселини в катионното място на 40's лупа са заместени с други аминокиселини.

4. Използване, съгласно претенция 3, където трите основни аминокиселини в катионното място на 40's лупа са заместени от Аланин, Серин, Треонин, Пролин или Глицин.

5. Използване, съгласно претенция 1, където хемокиновият мутант е мутантният RANTES от SEQ ID N0:3.

6. Използване, съгласно претенция 1, където хемокиновият мутант е RANTES мутантът от SEQ ID N0: 2.

7. Използване, съгласно претенция 1, където хемокиновият мутант е MIP-1-алфа мутантът от SEQ ID N0 : 4.

8. Използване, съгласно претенция 1, където хемокиновият мутант е MIP-1-бета мутантът от SEQ ID N0 : 5.

10. Фармацевтичен състав за лечение на мултитиплена склероза и/или други заболявания, свързани с демиелинизация, характеризиращ се с това, че включва като активна съставка хемокинов мутант както е определено, съгласно претенции от 1 до 9 заедно с фармацевтично приемлив ексципиент.

11. ДНК молекула, включваща ДНК секвенции, кодиращи скъсения и мутантен RANTES, съгласно претенция 1.
12. Експресионен вектор, който включва ДНК молекулата, съгласно претенция 11.
13. Клетка-гостоприемник, включваща експресионния вектор, съгласно претенция 12.

14. Рекомбинантен метод за получаване на полипептида, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че включва култивиране на клетки в подходяща културална среда, съгласно претенция 13.

СПИСЪК НА СЕКВЕНЦИИТЕ <110> APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

<120> ХЕМОКИНОВИ МУТАНТИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НАМУЛТИТИПЛЕНА СКЛЕРОЗА <130> WO4 65 <160> 37

<170> Patentin version 3.0 <210> 1 <211> 91 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> СИГНАЛ <222> (1)..(23) <400> 1

Met Lys 1 Vai Ser Ala 5 Ala Ala Leu Ala Val He Leu He Ala Thr Ala 10 15 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro 20 25 30 Cys Cys Phe Ala Tyr He Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His He Lys 35 40 45 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 50 55 60 Vai Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 65 70 75 80 Vai Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 85 90 <210> : 2 <211> 66 <212> PRT <213> Pichia Pastoris <400> 2 Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr He Ala Arg Pro 1 5 10 15 Leu Pro Arg Ala His lie Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr 'Ser Gly Lys Cys 20 25 30 Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Ala Ala Asn Ala Gin Val Cys 35 40 45 Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu 50 55 60 Met Ser