DE60304435T2

DE60304435T2 - Verfahren zur Reinigung von in Bakterien exprimierten Proteinen

Info

Publication number: DE60304435T2
Application number: DE60304435T
Authority: DE
Inventors: Luciano Capponi; Mara Rossi
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2004-01-19
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2023-01-16
Also published as: WO2005068500A1; PT1439191E; DK1439191T3; ATE322506T1; NO20063280L; CA2552790A1; SI1439191T1; ES2257642T3; CY1105285T1; IL176763A0; EP1439191A1; DE60304435D1; JP2007537150A; CA2552790C; IL176763A; AU2004313698B2; AU2004313698A1; EP1439191B1; JP4865569B2

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von in prokaryotischen Zellen exprimierten Proteinen.
Hintergrund der Erfindung
Die DNA-Rekombinationstechnik macht die Herstellung großer Mengen gewünschter Proteine möglich. Bakterien stellen eine besonders günstige Quelle für die Herstellung rekombinanter Proteine für Reinigungszwecke dar. Sie können in sehr großen Mengen unter gut definierten Bedingungen gezüchtet werden, und sie lassen sich für die Extraktion relativ leicht aufbrechen. Vor allem werden durch molekulare Klonierungstechniken hohe Expressionsniveaus in Bakterien von fast jedem Protein aus irgendeinem bakteriellen oder anderen Organismus ermöglicht. Leider lassen sich in Bakterien exprimierte Proteine aufgrund ihrer Neigung zum Ausfällen innerhalb der Zelle oft schwer reinigen. Das ausgefällte Protein bildet Einschlußkörper: dichte, granuläre Strukturen, die in dem gesamten Cytoplasma verteilt sind. Die Einschlußkörperbildung ist besonders bei nicht-bakteriellen Proteinen üblich, obwohl selbst native bakterielle Proteine eine Aggregationsneigung zeigen, wenn sie bei sehr hohen Niveaus exprimiert werden. Es ist nicht genau bekannt, wie sie gebildet werden, aber es wird angenommen, daß das Protein partiell oder inkorrekt gefaltet ist. Der Hauptnachteil von Einschlußkörpern ist, daß die Extraktion des Proteins, das von Interesse ist, im allgemeinen die Verwendung von Denaturierungsmitteln erfordert. Dies kann Probleme verursachen, wenn ein natives gefaltetes Protein erforderlich ist, da die Rückfaltungsverfahren nicht immer eine 100%ige Wirksamkeit aufweisen und Maßstabsvergrößerungen schwierig sein können.
Der Vorteil von Einschlußkörpern ist, daß sie im allgemeinen höhere Expressionsniveaus ermöglichen, und sie können durch Zentrifugieren leicht von einem großen Anteil bakterieller cytoplasmatischer Proteine getrennt werden, wodurch ein wirkungsvoller Reinigungsschritt erhalten wird.
Für die bakterielle E. coli-Lyse stehen Techniken wie mechanische Lyse, Sonifikation, enzymatische Lyse und Detergenslyse zur Verfügung. Jedoch erfordern diese Techniken entweder eine. spezielle Ausrüstung oder weisen gewisse Einschränkungen auf. Vor allem können diese Verfahren weder lösliche rekombinante Proteine vollständig gewinnen noch Einschlußkörper gewinnen. Daher kann die Ausbeute von rekombinanten Proteinen sehr niedrig sein. Es ist nötig, alternative Verfahren zu erforschen, um die Proteinausbeute durch Gewinnen sowohl der löslichen als auch der unlöslichen Fraktion des rekombinanten Proteins zu verbessern.
Musacchino et al. (1996, Vaccine 15:751–758) beschreiben ein Verfahren zum Gewinnen des Opc-Proteins, welches in E. coli als Einschlußkörper exprimiert wird, wobei das rekombinante Protein solubilisiert und auf einer Umkehrphasensäule gereinigt wird. Das eluierte Protein wird schließlich rückgefaltet.
WO 98/14467 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von Chemokinproteinen aus Einschlußkörpern, wobei das Protein unter Verwendung der Umkehrphasenchromatographie nach der Renaturierung gereinigt wird.
Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Umkehrphasenchromatographie-Schritt (RPC-Schritt) zwischen den Extraktions-/Denaturierungsschritt und den anschließenden Rückfaltungsschritt eingeschoben, was eine erhöhte Chemokinausbeute und andere Vorteile, die aus der folgenden Beschreibung ersichtlich werden, zur Folge hat. Es wird angenommen, daß durch Entfernen der meisten Zellverunreinigungen in dem RPC-Schritt das Erhalten einer höheren Ausbeute in dem anschließenden Rückfaltungsschritt gefördert wird, obwohl die Erfindung unabhängig von dieser Hypothese betrachtet werden sollte. Verbindungen haften an den Umkehrphasen-HPLC-Säulen in der hohen wässerigen mobilen Phase und werden aus den RP-HPLC-Säulen mit der hohen organischen mobilen Phase eluiert. Bei der RP-HPLC werden Verbindungen, basierend auf ihrer hydrophoben Eigenschaft, getrennt. Da die Säulen rohrförmig sind, haben die Säulendimensionen gewöhnlich folgendes Format, Innendurchmesser x Länge (beispielsweise 4,6 mm × 250 mm).
Die stationäre Phase besteht gewöhnlich aus hydrophoben Alkylketten (-CH₂-CH₂-CH₂-CH₃), die mit dem Analyt interagieren.
Tatsächlich sind Medien für RPC typischerweise mit hydrophoben Liganden hochsubstituiert, und die Bindung von Substanzen an RPC-Medien ist gewöhnlich sehr stark und erfordert organische Lösungsmittel zur Eluierung.
SOURCE^TM (Amersham) RPC können im gesamten pH-Bereich verwendet werden. SOURCE^TM RPC sind für schnelle, hochleistungsfähige präparative Trennungen von Bio-Molekülen, wie Proteinen, Peptiden und Oligonukleotiden, konzipiert. Die Medien weisen Matrizen auf, die auf starrem Polystyrol/Divinylbenzol mit einheitlich großen Kügelchen mit einem Durchmesser von 15 μm bzw. 30 μm basieren.
Die Porengrößenverteilung ist geregelt und reproduzierbar. Aufgrund der breiten pH-Stabilität und hohen Kapazität sind die SOURCE^TM RPC-Medien eine interessante Alternative zu auf Siliciumdioxid basierenden Medien. Die hohe chemische Stabilität der Matrix sorgt für eine unübertroffene Flexibilität bei der Auswahl der Lauf- und Reinigungsbedingungen.
Die Umkehrphasenlösungsmittel werden traditionell an den HPLC-Kanälen A und B installiert. Das A-Lösungsmittel ist traditionell das wässerige Lösungsmittel (Wasser), und das B-Lösungsmittel ist traditionell das organische Lösungsmittel (Acetonitril, Methanol, Propanol). Es ist wichtig, sich an diese Tradition zu halten, da die Bezeichnungen A und B üblicherweise verwendet werden, um sich auf das wässerige und das organische Lösungsmittel zu beziehen. Das A-Lösungsmittel ist im allgemeinen Wasser mit HPLC-Reinheit mit 0,1% Säure. Das B-Lösungsmittel ist im allgemeinen ein organisches Lösungsmittel mit HPLC-Reinheit wie Acetonitril oder Methanol mit 0,1% Säure. Die Säure wird zum Verbessern der chromatographischen Peakform und zum Bereitstellen einer Protonenquelle in einer Umkehrphasen-Flüssigchromatographie/Massenspektroskopie (Umkehrphasen-LC/MS) verwendet. Die am häufigsten verwendeten Säuren sind Ameisensäure, Trifluoressigsäure und Essigsäure.
Wie bereits erwähnt, stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine Verbesserung dieses Verfahrens dar, die darin besteht, daß ein Umkehrphasenchromatographie-Schritt (RPC-Schritt) zwischen den Extraktions-/Denaturierungsschritt und den anschließenden Rückfaltungsschritt eingeschoben wird. Jedoch werden alle Schritte, die normalerweise in einem klassischen Verfahren zur Reinigung eines in prokaryotischen Wirtszellen rekombinant hergestellten Chemokins unten nur der Vollständigkeit halber angegeben.
Normalerweise schließt ein klassisches Verfahren zur Reinigung eines in prokaryotischen Wirtszellen hergestellten Proteins auch die folgenden Schritte ein:

– Herstellung von Zelllysaten aus den Wirtszellen
– Isolierung von Einschlußkörpern
– Solubilisierung der aggregierten Chemokinproteine in den Einschlußköpern/Dena turationsschritt
– Rückfaltung/Renaturierung der solubilisierten Proteine.

Herstellung von Zelllysaten aus den Wirtszellen
Das in den prokaryotischen Zellen exprimierte Chemokin muß zuerst aus den Wirtszellen, in denen es exprimiert worden ist, extrahiert werden. Es steht eine Veilzahl an Verfahren zur Lyse von Zellen zur Verfügung. Welches dieser Verfahren im speziellen Fall verwendet werden sollte, hängt von dem Typ der Wirtszellen und der Menge der aufzulösenden Zellen ab.
Die zunächst zu treffende Wahl betrifft die Art und den pH des Puffersystems, das verwendet werden soll. Dies hängt ab von:

– der Stabilität des Zielproteins in bezug auf den pH und die Pufferverbindung,
– dem Reinigungsverfahren.

Um einen Zeit- und Proteinverlust aufgrund eines zusätzlichen Pufferaustauschschritts zu vermeiden, ist es ratsam, einen Puffer auszuwählen, der mit dem ersten Chromatographieschritt (siehe Chromatographie) kompatibel ist. Die Puffer und ihre pH-Bereiche sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die am häufigsten verwendeten Puffer sind Phosphate, Tris-HCl und HEPES-NaOH. Sie werden normalerweise bei Konzentrationen von 20 bis 50 mM verwendet. Tabelle 1

Puffer	pH-Bereich
Zitronensäure – NaOH	2,2– 6,5
Natriumcitrat – Zitronensäure	3,0–6,2
Natriumacetat – Essigsäure	3,6–5,6
Kakodylsäurenatriumsalz – HCl	5,0–7,4
MES – NaOH	5,6–6,8
Natriumdihydrogenphophat – Dinatriumhydrogenphosphat	5,8–8,0
Imidazol – HCl	6,2–7,8
MOPS – KOH	6,6–7,8
Triethanolaminhydrochlorid – NaOH	6,8–8,8
Tris – HCl	7,0–9,0
HEPES – NaOH	7,2–8,2
Tricin – NaOH	7,6–8,6
Natriumtetraborat – Borsäure	7,6–9,2
Bicin – NaHO	7,7–8,9
Glycin – NaHO	8,6–10,6

In Abhängigkeit von dem Zielchemokinprotein kann es nötig sein, Verbindungen zu dem Lysepuffer zuzugeben, um die Stabilität des Zielproteins zu verbessern und das Protein in Lösung zu halten. Die am häufigsten verwendeten Zusatzstoffe, ihre wirksamen Konzentrationen und ihr allgemeiner Zweck sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Eine wichtige Zusatzstoffklasse sind die Proteaseinhibitoren. Im allgemeinen führt eine Zellzerstörung zur Freisetzung proteolytischer Enzyme, was zu einer verringerten Gesamtausbeute führen könnte. Um diese unerwünschte Proteolyse zu steuern, kann das Zugeben einer Reagenzienmischung aus Proteaseinhibitoren zu der Zellsuspension notwendig sein. Da viele dieser Verbindungen in wässerigen Lösungen nicht sehr stabil sind, ist es wichtig, daß sie unmittelbar vor ihrer Verwendung zu dem Lysepuffer aus einer Stammlösung in einem organischen Lösungsmittel (Methanol, Ethanol, Isopropanol oder DMSO) zugegeben werden. Obwohl die Gabe eines allgemeinen Lysepuffers nicht möglich ist, wäre ein guter Startpuffer:
50 mM Tris-HCl pH 7,5
100 mM NaCl
1 mM DTT (Dithiothreitol)
5% Glycerol (möglicherweise).
Die meisten Lyseverfahren verursachen die Freisetzung von Nucleinsäuren (DNA und RNA). Diese müssen aufgrund ihrer möglichen Verursachung von Viskositätsproblemen oder ihrer Beeinflussung der anschließenden Chromatographieschritte entfernt werden. Es gibt verschiedene Verfahren:

– Enzymatischer Abbau durch Zugabe von DNase I (1 μg/ml) zu dem Zelllysat. Das Gemisch wird 10 bis 15 min auf Eis inkubiert.
– Mechanischer Abbau durch Scherung unter Sonifikation. Bei Verwendung der French-Presse ist es ratsam, DNase zu der Zellsuspension zuzugeben.
– Ausfällen durch Behandlung mit Polyethylenimin (0,1% (Gewicht/Volumen (G/V))) oder Protaminsulfat (1% (G/V)), gefolgt von Zentrifugieren. Zugabe der Fällungsmittel zu dem Zelllysat und Inkubieren der Lösung für 30 min bei 4 °C.

Für die Herstellung von Zelllysaten aus E. coli-Zellen werden verschiedene Verfahren verwendet.
Sonifikation ist die gebräuchlichste Technik zum Lysieren kleiner Zellmengen (1 bis 6 L der Zellkultur). Die Zellen werden durch Flüssigkeitsscherung und Kavitation lysiert. DNA wird auch während der Sonifikation geschert, was eine Zugabe von DNase zu der Zellsuspension unnötig macht. Das Hauptproblem ist die Temperaturregelung. Diesem Problem wird durch Halten der Suspension auf Eis und Verwenden mehrerer kurzer Impulse (5–10 s) mit Pausen (10–30 s) entgegengewirkt, wodurch eine niedrige Temperatur aufrechterhalten wird. Für Zellmengen größer als 50 g ist der Wert des Verfahrens aufgrund der Schwierigkeit, niedrige Temperaturen aufrechtzuerhalten und aufgrund der langen Sonifikationszeiten, die zum Erreichen einer ausreichenden Lyse erforderlich sind, begrenzt.
Homogenisatoren sind die gebräuchlichsten Geräte zum Lysieren von Bakterien. Die Pressen Lysieren Zellen, indem sie die Zellsuspension unter Druck setzen und den Druck plötzlich aufheben. Dadurch wird eine Flüssigkeitsscherung erzeugt, die in der Lage ist, Zellen zu lysieren. Typische Arbeitsdrücke für den älteren Homogenisatortyp, die French-Presse und den Manton-Gaulin-Homogenisator sind 6000 bis 10.000 psi. Mehrfache (2 – 3) Durchgänge sind im allgemeinen zum Erreichen einer ausreichenden Lyse erforderlich. Die hohen Arbeitsdrücke haben jedoch eine Erhöhung der Arbeitstemperaturen zur Folge.
Daher werden Druckzellen vor der Verwendung abgekühlt (4 °C). Zusätzlich zu der Temperaturregelung sollte darauf geachtet werden, daß eine Proteininaktivierung durch Schäumung vermieden wird.
Moderne Homogenisatoren arbeiten oft kontinuierlich und können bei höheren Drücken betrieben werden. In den Europäischen Molekularbiologischen Laboratorien (EMBL) findet sich eine Avestin Emulsiflex-C5, die effizient E. coli-Zellen in einer Passage bei 15.000 psi (100 MPa) lysiert.
Die enzymatische Lyse basiert auf dem Abbau der Peptidoglykanschicht der Bakterienzellwand durch Lysozym. Gramnegative Bakterien besitzen jedoch eine äußere Membran, die außen an der Zellwand liegt und permeabilisiert werden muß, damit die Peptidoglykanschicht freigelegt werden kann. Tris, das häufig als Puffer in Lyseverfahren verwendet wird, permeabilisiert wirkungsvoll äußere Membranen. Diese Wirkung kann durch Zugabe von EDTA (1 mM) gesteigert werden. EDTA chelatisiert die Magnesiumionen, welche Membranen stabilisieren. Bei der Zelllyse wird oft eine große Menge an DNA freigesetzt, was die Zugabe von DNase (1 mg/ml) erforderlich macht, um die Viskosität des Präparats zu reduzieren. Die enzymatische Zelllyse kann in jedem Maßstab durchgeführt werden, aber für Herstellungen in großem Maßstab können Lysozym und DNase teuer werden. Zum Erhöhen des Grads der Zelllyse kann die Lösung einer Sonifikation unterzogen werden (siehe oben).
Ein alternatives Lyseverfahren ist das Gefrieren der Zellen direkt in flüssigem Stickstoff und Zermahlen der gefrorenen Zellen zu Pulver unter Verwendung von mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser und Stößel. Das Pulver kann bei –80 °C unbegrenzt gelagert werden, und das Zelllysat kann durch Zugabe des Pulvers zu 5 Volumen Puffer hergestellt werden.
Das Ausmaß der Solubilisierung und die Stabilität des solubilisierten Proteins hängen von dem Detergenstyp und der Detergenskonzentration ab. Für keine dieser Variablen ist es möglich, allgemeine Richtlinien zu geben, sondern sie müssen experimentell optimiert werden. Für die Solubilisierung ist das Verhältnis von Detergens zu Protein wichtig. Bei geringen Verhältnissen (1 : 10) werden die Membranen lysiert, und große Membrankomplexe, die Protein, Detergens und Membranlipide enthalten, werden gebildet. Bei zunehmend größeren Verhältnissen werden kleinere Komplexe erhalten. Schließlich werden bei Verhältnissen von 10 : 1 bis 20 : 1 einzelne, membranlipidfreie Detergens-Protein-Komplexe gebildet. Zum Bestimmen der optimalen Bedingungen ist es wichtig, sowohl die Detergens- als auch die Proteinkonzentration zu variieren.
Häufig verwendete Detergenzien und ihre kritischen Mizellkonzentrationen (KMK) sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3
Isolierung der Einschlußkörper
In der Zelle herrscht Konkurrenz zwischen Falten und Aggregationen. In vielen Fällen und in einigen Wirtssystemen akkumulieren rekombinante Proteine intrazellulär in unlöslichen Aggregaten. Die Proteine in diesen sogenannten Einschlußkörpern sind meistens inaktiv und denaturiert. Außerdem können Dimere und Multimere vorliegen. Jedoch kann die Expression von rekombinanten Proteinen in Einschlußkörpern ebenso Vorteile bringen:

– Die in Einschlußkörpern abgelagerten rekombinanten Proteine können 50% oder mehr des gesamten Zellproteins ausmachen.
– Die Einschlußkörper enthalten häufig fast ausschließlich das überexprimierte Protein.
– In den Einschlußkörpern ist das Protein vor proteolytischem Abbau geschützt.
– Die Expression in den Einschlußkörpern wird die Zelle gegen die Toxizität des rekombinanten Proteins schützen.

Das Hauptproblem ist das Gewinnen biologisch aktiver und/oder löslicher Proteine mit hoher Ausbeute. Um dies zu erreichen, muß das Protein in den Einschlußkörpern in vitro solubilisiert und rückgefaltet werden. Dieses Verfahren wird in drei Phasen durchgeführt:
Einschlußkörper weisen eine relativ hohe Dichte auf und können daher durch Zentrifugieren pelletisiert werden. Zellen werden gewöhnlich durch Hochdruckhomogenisierung (gegebenenfalls nach einer Lysozymbehandlung) gespalten. Es ist wichtig, daß die Zelllyse vollständig ist, da intakte Zellen zusammen mit den Einschlußkörpern sedimentieren und somit das Präparat verschmutzen. Nach dem Zentrifugieren wird das Pellet mit Puffer, der entweder niedrige Konzentrationen chaotroper Mittel (z. B. 0,5–1 M Guanidin-HCl oder Harnstoff) oder Detergenzien (z. B. 1% Triton X-100 oder 1 mg/ml Natriumdeoxycholat) enthält, gewaschen. Dieser Waschschritt ist notwendig, um Verschmutzungen, besonders Proteine (Proteasen), die sich während des Verfahrens möglicherweise an den hydrophoben Einschlußkörper absorbiert worden sind.
Solubilisierung der aggregierten Proteine in den Einschlußkörpern
Die gewaschenen Einschlußkörper werden in Puffer, enthaltend ein starkes Denaturierungsmittel und ein Reduktionsmittel (gewöhnlich 20 mM DTT oder b-Mercaptoethanol), resuspendiert und inkubiert. Die Zugabe eines Reduktionsmittels hält alle Cysteine in dem reduzierten Zustand und spaltet bei der Herstellung gebildete Disulfidbindungen auf. Inkubationstemperaturen über 30 °C werden typischerweise zum Erleichtern des Solubilisierungsvorgangs verwendet.
Optimale Bedingungen zur Solubilisierung sind Protein-spezifisch und müssen für jedes Protein bestimmt werden.
Nach der Solubilisierung kann die Lösung zentrifugiert oder filtriert werden, um Restaggregate, die als Nuklei, die eine Aggregation während der Rückfaltung auslösen, agieren könnten, zu entfernen.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung, die nachstehend in den Beispielen erläutert wird, wird dieser Schritt als Schritt 1 des beschriebenen speziellen Vorgangs bezeichnet.
Rückfaltung der solubilisierten Proteine
Die Rückfaltung der solubilisierten Proteine wird durch Entfernen des Denaturierungsmittels initiiert. Der Rückfaltungsgrad hängt von der Konkurrenz zwischen korrektem Falten und Aggregation ab. Zum Verlangsamen des Aggregationsvorgangs wird gewöhnlich eine Rückfaltung bei niedrigen Proteinkonzentrationen, in dem Bereich von 10 bis 100 mg/ml, durchgeführt. Außerdem müssen die Rückfaltungsbedingungen für jedes einzelne Protein optimiert werden. Wichtige Variablen sind die Pufferzusammensetzung (pH, Ionenstärke), die Temperatur und die Zusatzstoffe (oft in Kombination).
Wenn die Proteine Disulfidbindungen enthalten, muß der Rückfaltungspuffer durch ein Redoxsystem ergänzt werden. Die Zugabe eines Gemischs aus reduzierten und oxidierten Formen (1–3 mM reduziertes Thiol und ein Verhältnis von reduziertem zu oxidiertem Thiol von 5 : 1 bis 1 : 1) von Thiolreagens mit niedrigem Molekulargewicht stellt gewöhnlich das geeignete Redoxpotential bereit, um Bildung und Umlagerung von Disulfidbindungen zu ermöglichen. Die am häufigsten verwendete Redoxumlagerungsreaganzien sind reduziertes und oxidiertes Glutathion, aber auch Cystein und Cysteamin werden verwendet.
Für bestimmte Proteine ist dieses Verfahren, wahrscheinlich wegen der geringen Löslichkeit von Faltungsintermediaten, nicht sehr effektiv. Alternativ wird das Protein in Gegenwart eines großen Überschusses an oxidiertem Glutathion vollständig oxidiert, gefolgt von Verdünnen in einem Rückfaltungspuffer, welcher katalytische Mengen an reduziertem Glutathion enthält.
Es sind verschiedene Verfahren zur Rückfaltung von Proteinen beschrieben worden. Das am häufigsten verwendete Verfahren ist das Entfernen des Lösungsvermittlers durch Dialyse. Während der Dialyse verringert sich die Konzentration des Lösungsvermittlers langsam, wodurch sich das Protein optimal rückfalten kann. Das Verhältnis der Volumen der Probe zu dem Dialysepuffer sollte so sein, daß sich das Protein bei der Gleichgewichtskonzentraion des Lösungsvermittlers vollständig rückgefaltet hat.
Die Konzentration des Lösungsvermittlers wird durch Verdünnen verringert, wodurch sich das Protein rückfalten kann. Gewöhnlicherweise wird das Verdünnen langsam durch schrittweises Zugeben von Puffer oder durch kontinuierliches Zugeben mittels einer Pumpe durchgeführt.
Während der Dialyse und dem langsamen Verdünnen wird das Protein über einen längeren Zeitraum einer intermediären Konzentration des Lösungsvermittlers (2–4 M Harnstoff oder Guanidin-HCl) ausgesetzt, wobei es noch nicht rückgefaltet, aber nicht mehr denaturiert ist und somit äußerst aggregationsanfällig ist. Dies könnte durch das rasche Verdünnen der solubilisierten Proteinlösung in den Rückfaltungspuffer verhindert werden. Die Aggregation bei diesem Verfahren kann durch Zugeben milder Lösungsvermittler wie nicht-oberflächenaktiver Sulfobetaine zu dem Rückfaltungspuffer beschränkt werden.
Zum Niedrighalten der Konzentration des ungefalteten Proteins und folglich zum Begrenzen der Aggregation werden Aliquote von denaturiertem Protein zu bestimmten Zeitpunkten zu dem Rückfaltungspuffer gegeben. Die Zeitintervalle zwischen zwei Impulsen müssen für jedes einzelne Protein optimiert werden. Das Verfahren wird beendet, wenn die Denaturierungsmittelkonzentration ein kritisches Niveau in bezug auf die Rückfaltung des speziellen Proteins erreicht.
Gemäß der erfindungsgemäßen speziellen Ausführungsform, die nachstehend in den Beispielen erläutert wird, wird dieser Schritt als Schritt 3 des beschriebenen speziellen Verfahrens bezeichnet.
Der Lösungsvermittler wird mittels eines Chromatographie-Schritts entfernt. Die Anwendung verschiedener Chromatographieverfahren ist beschrieben worden:

– Größenausschlußchromatographie (z. B. Gelfiltration auf einer Superdex 75-Säule)
– Ionenaustauschchromatographie
– Affinitätschromatographie (z. B. IMAC unter Verwendung von Chelating Sepharose oder Ni-NTA-Agarose)

Das Denaturierungsmittel wird entfernt, während das Protein langsam durch die Säule migriert oder an die Matrix gebunden wird. Dadurch wird gewöhnlich eine hohe Ausbeute an aktiven Proteinen erhalten, selbst bei Proteinkonzentrationen im mg/ml-Bereich.
Beispiele
Die Erfindung wird nun in bezug auf die Reinigung eines in E. Coli exprimierten Chemokins ausführlich beschrieben. Chemokine bilden eine Familie kleiner entzündungsfördernder Cy tokine mit Leukozyt-chemotaktischen und -aktivierenden Eigenschaften. In Abhängigkeit von der Position der ersten konservierten Cysteine kann die Chemokinfamilie in C-C-, C-X-C- und C-X₃-C-Chemokine unterteilt werden (Baggiolini M. et al., Adv Immunol. 1994, 55:97–179; Baggiolini M. et al., Annu Rev Immunol. 1997, 15:675–705; Taub D. et al., Cytokine Growth Factor Rev. 1996, 7(4):355–76).
Die folgende ausführliche Beschreibung berichtet insbesondere über die Reinigung einer Tripelmutante des menschlichen RANTES. Dieses Protein in seiner gereiften Form (d. h. nach dem Spalten der Leader-Sequenz MKKKWPR) hat die Sequenz von SEQ ID Nr.: 1 und wird im weiteren Teil der Beschreibung als RANTES-Tripelmutante bezeichnet. Das gesamte Verfahren wird mit dem in 1 dargestellten Fließdiagramm zusammengefaßt, beginnend mit dem Schritt der „Solubilisierung der aggregierten Proteine in den Einschlußkörpern". Die zwei vorhergehenden klassischen Schritte der Herstellung von Zelllysaten und die Isolierung von Einschlußkörpern, werden unter Verwendung der in der Technik bekannten Verfahren und/oder wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Schritt 1 – Solubilisierung der aggregierten Proteine in den Einschlußkörpern
60 bis 90 g Einschlußkörper, enthaltend RANTES-Tripelmutante, werden aufgetaut. Das Pellet wird mittels des Homogenisators Polytron mit 450 bis 800 ml Solubilisierungspuffer (6 M Guanidiniumchlorid, 0,1 M Tris/HCl, 2 mM DTT, pH 7,5 +/– 0,1) aufgelöst, bis keine großen Teilchen mehr sichtbar sind (etwa 5 Minuten). Wenn die Lösung homogenisiert ist, wird sie für 30' auf eine Temperatur von 60 ± 1 °C gebracht.
Danach kann die Lösung Raumtemperatur erreichen und wird mit einer 1,2-μm-Membran filtriert.
Das Material wird gewöhnlich direkt nach seiner Herstellung verarbeitet. Alternativ kann es bei –80 °C gelagert werden.
Schritt 2 – Umkehrphasenchromatographie auf Source 30 RPC
Puffer
Prääquilibrierungspuffer: 0,1 M TRIS/HCl pH 7,5 ± 0,1, 5% (V/V) Acetonitril
12,1 g Tris/Hydroxymethylaminomethan werden zu 800 bis 900 ml gereinigtem Wasser gegeben. Der pH wird mit HCl auf 7,5 eingestellt. 50 ml Acetonitril werden zugegeben, und die Lösung wird mit gereinigtem Wasser auf einen Liter aufgefüllt.
Äquilibrierungspuffer: 0,1 M TRIS/HCl pH 7,5 ± 0,1, 6 M Guanidin und 2 mM DTT, 5% (V/V) Acetonitril
6 M Guanidin und 2 mM DTT werden unter Rühren zu 600 ml Prääquilibrierungspuffer gegeben. Nach Beendigung des Auflösens wird die Lösung mit Prääquilibrierungspuffer auf 1 Liter aufgefüllt.
Waschpuffer: 5% (V/V) Acetonitril, 0,1% TFA in Wasser
50 ml Acetonitril und eine Phiole TFA werden zu 900 ml gereinigtem Wasser zugegeben, und die Lösung wird mit gereinigtem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.
Elutionspuffer: 35% (V/V) Acetonitril, 0,1% TFA in Wasser
350 ml Acetonitril und eine Phiole TFA werden zu 500 bis 600 ml gereinigtem Wasser zugegeben, und die Lösung wird mit gereinigtem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.
Regenerierung-spuffer: NaOH 0,5 M, 60% n-Propanol
20 g NaOH werden zu 600 ml n-Propanol zugegeben, und die Lösung wird mit gereinigtem Wasser auf 1 Liter aufgefüllt.
Lagerungspuffer: NaOH 10 mM
0,4 g NaOH werden zu 1000 ml gereinigtem Wasser gegeben.
Verfahren
Eine mit Source 30 RPC-Harz beschickte Säule wird mit mindestens 1 BV NaOH 0,5 M und anschließend mit gereinigtem Wasser gespült, bis der pH neutrale Werte erreicht. Danach wird die Säule mit 3 BV Prääquilibrierungspuffer äquilibriert, gefolgt von 2 bis 3 BV Äquili brierungspuffer. Der pH wird überprüft, und die Waschung wird fortgesetzt, wenn die Parameter des Säulenabflusses außerhalb der Zielwerte liegen: pH 7,5 ± 0,1.
Das gemäß obiger Beschreibung hergestellte solubilisierte Material wird dann auf das Harz im Bereich von 5 bis 18 mg RANTES-Tripelmutante/ml Harz gegeben. Nach Beendigung des Beschickens der Probe wird die Säule mit 3 bis 4 BV Äquilibrierungspuffer 0,1 M Tris/HCl + 5% Acetonitril, pH 7,5 ± 0,1 gespült. Der Durchfluß und die Waschung werden gemeinsam gesammelt.
Darauf folgt das Spülen der Säule mit dem Waschpuffer: 5% Acetonitril + 0,1% TFA in Wasser, bis der pH des Säulenabflusses sauer ist (Kontrolle mit dem pH-Indikator).
Die Elution wird mit dem Elutionsspuffer gestartet: 35% Acetonitril + 0,1% TFA in Wasser. Die Fraktionen werden, sobald das OD-Signal zu steigen beginnt, gesammelt. Etwa 3 bis 4 BV werden als Elutionsfraktion gesammelt.
Der Proteingehalt der Fraktion wird mit der OD-280-nm-Analyse (ε = 2,1) berechnet. Die Fraktion wird bei +5 ± 3 °C bis zum nächsten Schritt der Rückfaltung gelagert.
Nach Beendigung der Elution wird die Säule mit mindestens 4 BV Regenerierungspuffer gespült, gefolgt von 3 BV gereinigtem Wasser.
Die Säule wird mit mindestens 3 BV NaOH 0,5 M gespült, und dann wird die Säule mit gereinigtem Wasser gespült.
Anschließend wird die Säule mit mindestens 3 BV Lagerungspuffer gespült und bei Raumtemperatur bis zum nächsten Zyklus gelagert.
Der hier beschriebene Schritt erweist sich bei der Entfernung von Zellverunreinigungen als sehr wirkungsvoll und liefert eine Lösung, die eine halbgereinigte RANTES-Tripelmutante, welche ohne weiteres dem Rückfaltungs-Schritt unterzogen werden kann, enthält.
Schritt 3 – Rückfaltung
In diesem Schritt wird die ungefaltete, aus der RPC-Säule eluierte RANTES-Tripelmutante mittels Verdünnung in einem geeigneten Puffer und Verwendung eines Redoxsystems rückgefaltet.
Rückfaltungspuffer: 0,1 M Tris/HCl pH 7,5 0,2 mM Glutathion reduzierte Form, 0,02 mM Glutathion oxidierte Form; Leitfähigkeit 6,0 ± 1 mSi/cm
12,1 g Tris, 61,5 mg Glutathion, reduziert, und 12,2 mg Glutathion, oxidiert, werden unter Rühren zu 900 ml gereinigtem Wasser gegeben. Der pH wird mit konzentriertem HCl auf 7,5 ± 0,1 gebracht, gefolgt von Auffüllen auf 1 Liter. Die Lösung wird dann nicht länger als zwei Tage bei Kühltemperatur von +5 °C ± 3 °C gelagert.
Verfahren
Dieser Schritt wird bei Kühltemperatur (+5 °C ± 3 °C) durchgeführt. Die RPC-Elutionsfraktion wird verdünnt, indem sie über Nacht tröpfchenweise unter leichtem Rühren in ein geeignetes Volumen des Rückfaltungspuffers gegeben wird, wodurch eine theoretische Endkonzentration (berechnet mittels OD) von 0,2 bis 0,4 mg/ml erreicht wird.
Der zuvor beschriebene Schritt 2 erweist sich bei der Entfernung von Zellverunreinigungen als sehr wirkungsvoll und liefert eine Lösung, die eine halbgereinigte RANTES-Tripelmutante, welche ohne weiteres dem Rückfaltungs-Schritt unterzogen werden kann, enthält.
Schritt 4 – IEC auf SP Sepharose FF
Puffer und Lösungen
Äquilibrierungspuffer: 0,1 M Tris/HCl pH 7,5 ± 0,1, Leitfähigkeit 6,0 ± 1 mS/cm
12,1 g Tris werden unter Rühren zu 900 ml gereinigtem Wasser gegeben. Der pH wird mit 37%igem HCl auf 7,5 ± 0,1 gebracht, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt. Die Leitfähigkeit wird überprüft. Diese Lösung wird nicht länger als zwei Tage bei Raumtemperatur gelagert.
Elutionspuffer: 0,1 M Tris/HCl pH 7,5 ± 0,1, 0,6 M NaCl, Leitfähigkeit 57,0 ± 2,0 mS/cm
12,1 g Tris und 35 g NaCl werden unter Rühren zu 900 ml gereinigtem Wasser gegeben. Der pH wird mit konzentriertem HCl auf 7,5 ± 0,1 gebracht, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt. Die Leitfähigkeit wird überprüft. Diese Lösung wird bei Raumtemperatur von +20 °C ± 5 °C gelagert und innerhalb von zwei Tagen verwendet.
Regenerierungspuffer: 1,5 M NaCl
87,6 g NaCl werden unter Rühren in 900 ml gereinigtem Wasser aufgelöst, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt. Diese Lösung wird bei Raumtemperatur von +20 °C ± 5 °C gelagert und innerhalb von zwei Tagen verwendet.
Sterilisierungslösung: 0,5 M NaOH
20 g NaOH werden unter Rühren in 900 ml gereinigtem Wasser aufgelöst, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt.
Lagerungslösung: 0,01 M NaOH
0,4 g NaOH werden unter Rühren in 900 ml gereinigtem Wasser aufgelöst, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt. Diese Lösung wird bei Raumtemperatur von +20 °C ± 5 °C gelagert und innerhalb von zwei Tagen verwendet.
Verfahren
Die mit SP Sepharose F-Harz beschickte Säule wird mit 3 BV NaOH 0,5 M und anschließend mit gereinigtem Wasser gespült, bis der pH auf neutrale Werte (pH-Indikatorpapier) sinkt. Danach wird die Säule erneut mit 5 oder mehr BV Äquilibrierungspuffer gespült. pH und Leitfähigkeit werden überprüft, und die Waschung wird fortgesetzt, wenn die Parameter des Säulenabflusses außerhalb der Zielwerte liegen: pH 7,5 ± 0,1, Leitfähigkeit 6 ± 1 mS/cm.
Dann wird das gefilterte Post-Rückfaltungsmaterial aufgebracht, und die ungebundene Fraktion wird gesammelt.
Nach Beendigung des Beschickens der Probe wird die Säule mit 1 bis 2 BV Äquilibrierungspuffer gespült, und das Sammeln wird fortgesetzt. An diesem Punkt ist das UV-Signal gewöhnlich auf der Grundlinie.
Darauf folgt das Spülen der Säule mit dem Elutionspuffer. Mit dem Sammeln der Elutionsfraktion wird begonnen, wenn das UV-Signal zu steigen beginnt, gewöhnlich nach den ersten 0,8 BV. 3 BV Eluat werden gesammelt, und diese Fraktion wird bei 2 bis 8 °C bis zum nächsten Schritt der Spaltung gelagert.
Nach Beendigung der Elution wird die Säule mit mindestens 4 BV Regenerierungspuffer gespült.
Die Säule wird mit mindestens 3 BV NaOH 0,5 M und dann mit 3 BV gereinigtem Wasser gespült. Die Säule wird mit mindestens 3 BV Lagerungslösung gespült und bis zum nächsten Zyklus gelagert.
Schritt 5 – Spaltung
Der Spaltungsschritt wird zum Entfernen der -RANTES-Tripelmutanten-Leader-Sequenz (MKKKWPR) aus der korrekten Sequenz verwendet.
Verfahren
Die Spaltung wird bei einer Temperatur von 37 ± 1 °C in einem Thermostatofen durchgeführt.
Die hinzuzugebende Trypsinmenge wird mit einem Verhältnis von 1 : 10000 in bezug auf den durch RP-HPLC-Analyse berechneten Gehalt an RANTES-Tripelmutante berechnetet.
Das Trypsin wird zugegeben, sobald das zu spaltende Material die Zieltemperatur erreicht hat.
Auf den Spaltungsvorgang folgt die RP-HPLC-Analyse, die den ungespaltenen Peak von dem gespaltenen Peak trennen kann. Gewöhnlicherweise ist die Spaltung nach etwa 3 Stunden beendet. Gleich nach Beendigung der Spaltung wird der pH der Lösung mit konzentrierter Phosphorsäure auf 3,2 gebracht, um die Reaktion zu beenden.
Schritt 6 – IEC auf SP Sepharose HP
Puffer und Lösungen
Puffer A – Äquilibrierung-: 50 mM Ammoniumacetat pH 3,2 ± 0,2 Leitfähigkeit 0,4 ± 0,1 mSi/cm
2,8 ml Essigsäure werden unter Rühren zu 900 ml Wasser gegeben. Der pH wird mit 25%igem Ammoniak auf 3,2 ± 0,2 gebracht, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt. Die Leitfähigkeit wird überprüft. Die Lösung wird nicht länger als zwei Tage bei Raumtemperatur von 20 °C ± 5 °C gelagert.
Puffer B – Elution-: 50 mM Ammoniumacetat pH 3 2 ± 0 2 1 M NaCl Leitfähigkeit 83 ± 2 mSi/cm
2,8 ml Essigsäure und 58,4 g NaCl werden unter Rühren zu 900 ml Wasser gegeben. Der pH wird mit 25%igem Ammoniak auf 3,2 ± 0,2 gebracht, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt. pH und Leitfähigkeit werden überprüft.
Die Lösung wird nicht länger als zwei Tage bei Raumtemperatur von 20 °C ± 5 °C gelagert.
Sterilisierungslösung: 0,5 M NaOH
20 g NaOH werden unter Rühren in 900 ml gereinigtem Wasser aufgelöst, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt.
Lagerungslösung: 0,01 M NaOH
0,4 g NaOH werden unter Rühren in 900 ml gereinigtem Wasser aufgelöst, und die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt. Diese Lösung wird bei Raumtemperatur von +20 °C ± 5 °C gelagert und innerhalb von fünf Tagen verwendet.
Verfahren
Post-Spaltungsmaterial wird 1 : 2 mit gereinigtem Wasser verdünnt, wodurch eine Leitfähigkeit der Lösung von etwa 30 mSi/cm erhalten wird.
Dieser Chromatographie-Schritt erfordert die Verwendung eines Systems, das Gradienten zwischen dem Äquilibrierungs- und dem Elutionspuffer bereitstellen kann.
Die Säule wird mit mindestens 3 BV NaOH 0,5 M und mit gereinigtem Wasser gespült, bis der pH neutral ist. Dann wird die Säule mit 4 bis 5 oder mehr BV Äquilibrierungspuffer gespült. pH und Leitfähigkeit werden überprüft, und die Waschung wird fortgesetzt, wenn die Parameter des Säulenabflusses außerhalb der Zielwerte liegen:
pH 3,2 ± 0,2 und Leitfähigkeit 6,4 ± 0,1 mS/cm
Das gemäß obiger Beschreibung hergestellte Ausgangsmaterial wird auf die Säule gegeben. Sobald das Beschicken beendet ist, wird die Säule mit 2 bis 3 BV Äquilibrierungspuffer gespült, bis das UV-Signal die Grundlinie erreicht, und danach wird die Säule mit einem Puffer aus 60% Äquilibrierungspuffer und 40% Elutionspuffer gespült. Etwa 5 bis 6 BV dieser Waschfraktion werden gesammelt.
Die Elution wird mit einem Gradient zwischen 40% und 100% Puffer B in 20 BV durchgeführt. Die Elution wird in Fraktionen (1 min. jede) gesammelt, die später vereinigt werden, dem Chromatogramm-Muster folgend, welches gewöhnlich die Peaks aus der Peptidsequenz, das gespaltene (und korrekte) und das ungespaltene Molekül zeigt. Basierend auf dem Chromatogramm werden die Fraktionen, die den interessierenden Peak bilden, gesammelt, um die Elutionsfraktion zu bilden.
Dann wird die Säule mit mindestens 3 bis 4 BV NaOH und danach mit 3 bis 4 BV gereinigtem Wasser gespült.
Die Säule wird mit mindestens 3 BV Lagerungslösung gespült und bis zum nächsten Zyklus gelagert.
Schritt 7 – Mengen-Ultrafiltration
Puffer und Lösungen
Puffer: 50 mM Ammoniumacetat pH 4,0 ± 0,1, Leitfähigkeit 1,0 ± 0,2 mS/cm 2,8 ml Essigsäure werden unter Rühren zu 900 ml Wasser gegeben. Die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt. Der pH wird mit 25%igem Ammoniak auf 4,0 ± 0,1 gebracht, und die Leit fähigkeit wird überprüft. Die Lösung wird bei Raumtemperatur von +20 ± 5 °C gelagert und innerhalb von 1 Tag verwendet.
Sterilisierungslösung: 0,5 M NaOH
20 g Natriumhydroxid werden unter Rühren in 900 ml gereinigtem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt und bei Raumtemperatur gelagert.
Lagerungslösung: 0,05 M NaOH
2 g Natriumhydroxid werden unter Rühren in 900 ml gereinigtem Wasser aufgelöst, die Lösung wird auf 1 Liter aufgefüllt, bei Raumtemperatur von +20 ± 5 °C gelagert und innerhalb von 3 Tagen verwendet.
Verfahren
Das Ultrafiltrationssystem wird mit einer regenerierten Cellulosemembran bei einem Cut-off von 3 KD (Millipore) ausgerüstet.
Die Ultrafilter werden mit 200 ml NaOH 0,5 M durch Kreislaufführung der alkalischen Lösung für nicht weniger als 30 Minuten sterilisiert und dann mit gereinigtem Wasser gespült, bis der Permeat-pH unter 7,5 liegt.
Die SP-HP-Sammel-Elutionslösung wird auf dem System bei konstantem Druck von etwas weniger als 0,5 Bar rezirkuliert, und gereinigtes Wasser wird unter dem Bemühen, das Volumen konstant zu halten, zugegeben. Die Leitfähigkeit wird überprüft, und die Waschung wird fortgesetzt, bis Werte von weniger als 1 mSi/cm erreicht werden.
Dann wird die Säule mit dem Mengenpuffer gewaschen: 50 mM Ammoniumacetat pH 4,0 ± 0,1, Leitfähigkeit 1,0 ± 0,2 mSi/cm, bis das Permeat die gleichen Werte erreicht.
Die Filterrückstands-Fraktion wird gesammelt, und das System wird unter Rezirkulieren mit demselben Puffer gewaschen, bis kein Schaum mehr sichtbar ist.
Die Ultrafilter werden gewaschen und sterilisiert durch Rezirkulieren von etwa 200 ml 0,5 M NaOH über mindestens 30 Minuten. Dann werden die Ultrafilter mit gereinigtem Wasser ge spült, bis der Permeat-pH unter 7,5 liegt. Die Ultrafilter werden daraufhin in 0,05 M NaOH bei +20 ± 5 °C bis zum nächsten Zyklus gelagert.
Analyse
Die Voranalyse für die Mengenbestimmung der RANTES-Tripelmutante ist auf das Messen der Molekülkonzentration in den Verfahrensproben zum Überwachen der Ausbeute des Verfahrens und zum Überwachen sowohl des Rückfaltungs- als auch des Spaltungsschritts ausgerichtet worden. Im folgenden werden die Analysen beschrieben.
Die mit RP-HPLC bestimmte Gesamtrückgewinnung des Reinigungsverfahrens betrug über 30%, was im Vergleich zu den Daten in der Literatur ein sehr gutes Ergebnis ist; die Reinheit mit RP-HPLC ist > 90%, mit SE-HPLC > 95%, und der HCP-Gehalt, analysiert mit einem kommerziell erhältlichen ELISA-Kit, ist < 100 ppm.
Eine Reihe anderer derartiger Analysen wie SDS, IEF und Maldi TOF der verschiedenen Chargen an hergestellten Arzneimittelsubstanzen bestätigten die Konsistenz des Verfahrens sowohl hinsichtlich der Reinheit als auch der Qualität des Moleküls.
SEQUENZ-LISTE

Claims

Verfahren zur Gewinnung eines in prokaryotischen Wirtszellen als Einschlußkörper exprimierten Chemokins und seine anschließende Reinigung, dadurch gekennzeichnet, daß ein Umkehrphasenchromatographie-Schritt zwischen den Schritt der Solubilisierung der aggregierten Proteine in den Einschlußkörpern/Denaturierung und den Renaturierungs-/Rückfaltungsschritt eingeschoben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Schritte durchgeführt werden: • Solubilisieren der aggregierten Chemokinproteine in den Einschlußkörpern; • Unterziehen der solubilisierten Chemokinproteine einer Umkehrphasenchromatographie; • Unterziehen des erhaltenen Produkts einem Renaturierungs-/Rückfaltungsschritt; • Unterziehen des erhaltenen Produkts einem Chromatographieschritt, ausgewählt aus Größenausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Schritte durchgeführt werden: • Solubilisieren der aggregierten Chemokinproteine in den Einschlußkörpern; • Unterziehen des solubilisierten Chemokinproteins einer Umkehrphasenchromatographie; • Unterziehen des erhaltenen Produkts einem Renaturierungs-/Rückfaltungsschritt; • Unterziehen des erhaltenen Produkts zwei Ionenaustauschchromatographieschritten.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach dem Solubilisierungs- und/oder Rückfaltungsschritt ein Filtrationsschritt durchgeführt wird.
Verfahren gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die prokaryotischen Zellen Bakterienzellen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Bakterienzellen E. coli-Zellen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Chemokin die Chemokinmutante der SEQ ID Nr: 1 ist.