-
Gebiet der Erfindung
-
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer nucleinsäurehaltigen Probe und auf eine Ausstattung dafür.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Verfahrensweisen, die Nucleinsäuren wie z. B. DNA und RNA einbeziehen, spielen in der Biotechnologie weiterhin eine entscheidende Rolle. Die Nucleinsäuredetektion und -manipulation, einschließlich Hybridisierung, Amplifikation, Sequenzierung und anderer Verfahren, erfordern im Allgemeinen die Isolierung von Nucleinsäure aus verunreinigendem Material. Wo eine nucleinsäurehaltige Probe eine biologische Probe ist, kann das verunreinigende Material Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und Polyphenole umfassen. Demgemäß kam bei der Isolierung von DNA oder RNA bisher eine Vielzahl von Ansätzen zur Anwendung.
-
Frühe Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure umfassten eine Reihe von Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, welche eine Ethanolfällung und eine Dialyse der Nucleinsäuren zur Folge hatten. Diese frühen Verfahren sind relativ aufwendig und zeitraubend und können zu einer geringen Ausbeute führen. Bei der Fällung der Nucleinsäure kann auch Isopropanol verwendet werden.
-
Die
US 5234809 beschreibt eine Verfahrensweise zum Isolieren von DNA aus biologischen Proben, wobei ein chaotropes Mittel zusammen mit einer nucleinsäurebindenden festen Phase auf Siliciumdioxidbasis verwendet wird. Als chaotropes Mittel wird Guanidinhydrochlorid bei einem pH-Wert von 3 bis 5 oder Guanidinthiocyanat bei einem höheren pH-Wert, kombiniert mit anderen Salzen, verwendet. Nach dem Binden der DNA an die feste Oberfläche kann die feste Phase mit dem chaotropen Mittel gewaschen werden, um jegliche biologische Verunreinigung zu entfernen, gefolgt von einer Behandlung mit 70%-igem Ethanol zur Entfernung des Chaotropen. Die DNA wird unter Verwendung von Wasser eluiert.
-
Eine Variante dieser Methodik ist in der
US 6027945 beschrieben. Hier ist ein Verfahren beschrieben, bei dem ebenfalls eine nucleinsäurebindende feste Phase auf Siliciumdioxidbasis in Gegenwart eines Chaotropen zum Isolieren von Nucleinsäure verwendet wird. Gemäß diesem Verfahren ist die feste Phase auf Siliciumdioxidbasis magnetisch, wodurch die Trennung der festen Phase, welche die Zielnucleinsäure enthält, von der flüssigen Phase, welche Verunreinigungsstoffe enthält, bei Anlegen eines Magnetfeldes erleichtert wird.
-
Bei der
WO 96/18731 werden ebenfalls magnetische Partikel zum Binden von Nucleinsäure verwendet. In dieser Offenbarung basieren die magnetischen Partikel auf Polystyrol und sind mit Polyurethan beschichtet, und anstelle eines Chaotropen wird ein Detergens verwendet.
-
Die
EP-A-0969090 beschreibt ein Verfahren zum Abtrennen und/oder Isolieren ringförmiger Nucleinsäuren von bzw. aus einer Mischung. Die Mischung wird unter im Wesentlichen alkalischen Bedingungen in Gegenwart von zumindest einer chaotropen Substanz mit einer fasten Matrix, die im Wesentlichen aus einem Siliciumdioxidmaterial besteht, behandelt, Die alkalischen Bedingungen können angepasst werden, indem eine wässrige Lösung einer amphoteren Substanz, wie z. B. einer ω-Aminosäure, hinzugefügt wird. Die ω-Aminosäure kann Glycin sein, und auch andere basische Aminosäuren, wie z. B. Lysin, Arginin und Histidin, können verwendet werden.
-
Trotz der Fortschritte, die bei Verwendung von nucleinsäurebindenden festen Phasen erzielt wurden, kann die Ausbeute an Zielmaterial mitunter unerwünscht gering sein. Die vorliegende Erfindung geht an diesen Nachteil des Stands der Technik heran.
-
Kurzfassung der Erfindung
-
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer nucleinsäurehaltigen Probe bereit, welches Folgendes umfasst:
- (a) das Bereitstellen eines Chaotropen;
- (b) das Bereitstellen einer nucleinsäurebindenden festen Phase, die in der Lage ist, in Gegenwart des Chaotropen Nucleinsäure zu binden;
- (c) das Bereitstellen einer Quelle für NH4 + oder NH3;
- (d) das Kontaktieren der Probe mit der nucleinsäurebindenden festen Phase in Gegenwart einer flüssigen Phase, umfassend den Chaotropen und das NH4 + oder NH3; und
- (e) gegebenenfalls das Abtrennen der festen Phase, an welche die Nucleinsäure gebunden ist, von der flüssigen Phase.
-
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Ausstattung zum Isolieren von Nucleinsäure aus einer nucleinsäurehaltigen Probe bereit, welche Ausstattung Folgendes umfasst:
-
- (a) einen Chaotropen;
- (b) eine nucleinsäurebindende feste Phase, die in der Lage ist, in Gegenwart des Chaotropen Nucleinsäure zu binden; und
- (c) eine Quelle für NH4 + oder NH3; wobei die Quelle von NH4 + oder NH3 und die chaotrope Substanz zusammen als eine Lösung bereitgestellt werden.
-
Es wurde überraschenderweise herausgefunden, dass das Vorhandensein von NH4 + oder NH3 im Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure eine Ausbeute an Nucleinsäure ermöglicht, die im Vergleich zu Fällen, in denen NH4 + oder NH3 fehlt, erhöht ist.
-
Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass das Hinzufügen von Ammoniak oder Ammonium z. B. zur chaotropen Bindungslösung ein Ansteigen des pH-Werts um eine Einheit (d. h. von 7,5 auf 8,5) bewirkt. Es wird jedoch nicht angenommen, dass die resultierende erhöhte Ausbeute an isolierter Nucleinsäure ein reiner pH-Effekt ist. Wenn der pH-Wert der chaotropen Lösung einfach durch das Hinzufügen von Alkali auf 8,5 erhöht wird, so beeinflusst dies nicht die Ausbeute an isolierter Nucleinsäure. Der pH-Wert der Lösung hat in Gegenwart von Ammoniak oder Ammonium jedoch eine Auswirkung auf die erhöhte Ausbeute an isolierter Nucleinsäure. Wenn z. B. die chaotrope Lösung, die Ammoniak oder Ammonium enthält, mit Säure erneut auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt wird, besteht die Tendenz zu einer Verringerung der Ausbeute an isolierter Nucleinsäure. Überschreitet der pH-Wert 9,5, so besteht überdies die Tendenz zu einer Abnahme der Ausbeute an isolierter Nucleinsäure. Demgemäß wird bevorzugt, dass der Schritt des Kontaktierens der Probe mit der nucleinsäurebindenden festen Phase in Gegenwart des NH4 + oder des NH3 bei einem pH-Wert im Bereich von 8,5 bis 9,5 durchgeführt wird.
-
Die nucleinsäurehaltige Probe umfasst typischerweise eine biologische Probe wie z. B. eine Zellprobe. Eine Vorbehandlung der biologischen Probe kann abhängig von ihrer Struktur nötig sein oder auch nicht. Im Falle von Pflanzen- oder Pilzzellen oder von festem tierischem Gewebe wäre eine Vorbehandlung, wie sie im Stand der Technik bekannt ist, beispielsweise erforderlich. Proben, die in Form einer festen Phase, wie z. B. eines Paraffinschnitts, gelagert werden, könnten ebenfalls eine Vorbehandlung benötigen. Die Proben können von Nahrungsmitteln, Umweltproben oder klinischen Proben stammen und können prokaryotische oder eukaryotische Zellen oder andere Komponenten wie z. B. Mycoplasmen, Protoplasmen oder Viren enthalten. Blutprodukte sind ein wichtiger Bereich für die Nucleinsäureisolierung, und die vorliegende Erfindung ist insbesondere für Vollblutprodukte und andere Blutprodukte, wie z. B. Plasma, Serum und Leukozytenfilm, anwendbar.
-
Die zu isolierende Nucleinsäure kann DNA, RNA oder eine modifizierte Form davon sein. Wo die Nucleinsäure DNA ist, kann diese ds- oder ss-DNA sein. Wo die Nucleinsäure RNA ist, kann diese rRNA, mRNA oder Gesamt-RNA sein.
-
Der Chaotrop umfasst im Allgemeinen ein chaotropes Ion in einer Konzentration, welche ausreichend hoch ist, um zu bewirken, dass die Nucleinsäure ihre Sekundärstruktur verliert und, im Fall von doppelsträngigen Nucleinsäuren, schmilzt. Es wird angenommen, dass Chaotropen die Wasserstoffbindung in Wasser zerstören, um denaturierte Nucleinsäure stabiler als ihr nicht denaturiertes Gegenstück zu machen. Der Chaotrop umfasst typischerweise ein Guanidiniumsalz; Harnstoff oder ein Iodid, Chlorat, Perchlorat oder (Iso)thiocyanat. Bevorzugte Chaotropen umfassen Guanidiniumthiocyanat und Guanidiniumhydrochlorid.
-
Die beim Kontaktieren mit der Probe typischerweise vorhandene Konzentration des Chaotropen liegt im Bereich von 2 M bis 8 M.
-
Die nucleinsäurebindende feste Phase muss in der Lage sein, in Gegenwart des Chaotropen Nucleinsäure zu binden, ist jedoch nicht auf irgendein spezielles Material beschränkt. Verschiedene Materialien sind nun als nucleinsäurebindende feste Phasen bekannt, und diese umfassen Materialien auf Siliciumdioxidbasis, wie z. B. jene, die in der
US 5234809 beschrieben sind, Polymermaterialien, einschließlich Materialien auf Latex- und Polystyrolbasis, wie z. B. jene, die in der
WO 98/18731 beschrieben sind, und andere Materialien wie z. B. Glasarten.
-
Die Form der festen Phase umfasst Sheets, Siebe, Sinter, Gewebe und Fasern. Partikel sind besonders nützlich, da sie in eine Säule gepackt oder in einer Suspension verwendet werden können und eine hohe Bindefähigkeit aufweisen. Magnetische Partikel werden aufgrund der Leichtigkeit, mit der sie sich von einer dazugehörigen flüssigen Phase in einem Magnetfeld einfach abtrennten, besonders bevorzugt. Typische Materialien zur Verwendung bei magnetischen Partikeln umfassen magnetische Metalloxide, insbesondere die Eisenoxide. Nützliche magnetische Oxide umfassen Eisenoxide, bei denen gegebenenfalls das gesamte zweiwertige Eisen oder ein Teil davon durch ein zweiwertiges Übergangsmetall wie z. B. Cadmium, Chrom, Cobalt, Kupfer, Magnesium, Mangan, Nickel, Vanadium und/oder Zink ersetzt ist. Magnetische Partikel auf Siliciumdioxidbasis, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen jene, die in
US 6027945 und
US 5945525 beschrieben sind.
-
Die Quelle für NH4 + oder NH3 ist typischerweise eine Ammoniaklösung, obwohl andere mögliche Quellen solche umfassen, die in der Lage sind, durch eine chemische Reaktion oder Umwandlung Ammoniak zu erzeugen. Damit das NH4 + oder NH3 vorhanden ist, wenn die Probe mit der nucleinsäurebindenden festen Phase kontaktiert wird, besteht keine besondere Einschränkung hinsichtlich dessen, wie das NH4 + oder NH3 bereitgestellt werden sollte. Zweckmäßigerweise kann das NH4 + oder NH3 mit dem Chaotropen bereitgestellt werden, obwohl die durch die Erfindung geschaffene technische Wirkung ebenfalls ein Bereitstellen des NH4 + oder des NH3 mit der festen Phase oder sogar mit der Probe ermöglicht. Ein potentieller Vorteil entsteht Jedoch, wenn der Chaotrop und NH4 + oder NH3 zusammen bereitgestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiters einen Lyseschritt umfassen, der das Aussetzen der biologischen Probe an Bedingungen zum Lysieren der Probe umfasst. Dies wird typischerweise durchgeführt, um Zellen aufzubrechen und ihre Nucleinsäure freizusetzen. Die Lysebedingungen umfassen zweckmäßigerweise das Vorhandensein eines Detergens. Es wird als potentiell vorteilhaft erachtet, wenn das NH4 + oder NH3 während des Lyseschritts vorhanden ist, da dies die günstige Wirkung einer Erhöhung der Ausbeute an Nucleinsäure während dieses Schritts haben könnte. Es ist auch zweckmäßig, wenn der Chaotrop zur selben Zeit vorhanden ist, da dies den Lyseschritt unterstützen kann. Wenn der Chaotrop und das NH4 + oder NH3 zusammen als Lösung bereitgestellt werden, kann diese Lösung demgemäß zur Behandlung der biologischen Probe während des Lyseschritts verwendet werden.
-
Der Schritt des Abtrennens der festen Phase, an welche die Nucleinsäure gebunden ist, von der flüssigen Phase ist im Allgemeinen erforderlich, um Verunreinigungsstoffe in der flüssigen Phase zu entfernen. An diesem Punkt können weitere Waschschritte an der festen Phase durchgeführt werden. Jeder herkömmliche Trennschritt zum Abtrennen einer festen Phase von einer flüssigen Phase ist anwendbar, einschließlich des Zentrifugierens und Dekantierens der flüssigen Phase aus der pelletierten festen Phase oder des Verwendens einer Säule, in welche die feste Phase gepackt wird und durch welche die flüssige Phase geleitet wird. Wo die magnetische feste Phase verwendet wird, erleichert dies die Abtrennung, welche in Gegenwart eines Magnetfeldes durchgeführt werden kann.
-
Abhängig von der Form, in welcher die isolierte Nucleinsäure benötigt wird, kann ein weiterer Elutionsschritt vorgesehen sein. In manchen Fällen kann es zufriedenstellend sein, wenn die Nucleinsäure an die feste Phase gebunden bleibt. Dies kann der Fall sein, wenn weitere Manipulationen der Nucleinsäure an einer festen Phase erforderlich sind, wie z. B. ein Amplifikationsschritt. Ebenso kann die Nucleinsäure durch Verwendung einer Elutionslösung, die einfach Wasser oder ein Puffer sein kann, aus der festen Phase eluiert werden.
-
Kurze Beschreibung der Zeichungen
-
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr rein beispielhaft detaillierter beschrieben, und zwar unter Bezugnahme auf das nachfolgende Beispiel und die angeschlossene Figur.
-
1 zeigt einen Graph der DNA-Ausbeute, welche gegen die Menge von Ammoniak in einer chaotropen Lyse- und Bindungslösung aufgetragen ist.
-
Detaillierte Beschreibung
-
Beispiel
-
Die magnetischen Partikel. Magnetische Siliciumdioxidpartikel wurden gemäß der am 4. Juli 2001 eingereichten
britischen Patentanmeldung Nr. 0116359.1 erhalten.
-
Die chaotrope Lyse- und Bindungslösung. 95 ml 0,1 M TRIS-HCl pH 7 (Sigma) + 8 ml 0,5 M EDTA (Invitrogen) und 2,5 g Tween-20 (Sigma) wurden zu 130 g Guanidinthiocyanat (Sigma) hinzugefügt. Die Lösung wurde auf einem Wasserbad bei 30°C 1 h lang erhitzt. Der pH-Wert der Lösung betrug 7,5. Diese Lösung wurde als Vergleichsprobe verwendet, zu der kein Ammoniak oder Ammonium hinzugefügt wurde. Zu dieser Lösung wurden 16 μl 5%-iges NH3 (Merck)/ml chaotrope Lösung hinzugefügt, um den pH-Wert bei 8,5 zu belassen, so wie die chaotrope Ammoniak- oder Ammoniumlösung beschrieben wurde.
-
Die chaotrope Wäsche I-Lösung. Wasser in einer Gesamtmenge von 160 ml (7,5 M) wurde zu 120 g Guanidinhydrochlorid (Sigma) hinzugefügt.
-
Die Wäsche II-Lösung auf Ethanolbasis. 100 μl 96%-iges EtOH wurden zu 10 ml 4 M NaCl (Sigma) hinzugefügt. 100 μl Wasser wurden zu 800 μl dieser Lösung hinzugefügt.
-
Das DNA-Bindungsverfahren. 50, 100 und 150 μl Vollblut (WBC 7,7) wurden zu 720 μl der chaotropen Lyse- und Bindungslösung hinzugefügt.
-
Nach 1 Minute wurden magnetische Siliciumdioxidperlen hinzugefügt (ca. 15 mg), und die Lösung wurde 10 Minuten lang inkubieren gelassen, wonach die magnetischen Perlen auf einem Magneten gesammelt wurden. Die Perlen wurden in Waschlösung I resuspendiert und wiederum auf einem Magneten gesammelt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt. Die Perlen wurden resuspendiert, in Waschlösung II gewaschen und auf einem Magneten gesammelt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt. Schließlich wurden 100 μl Wasser zu den Perlen hinzugefügt, und diese wurden bei Umgebungstemperatur ca. 2 Minuten lang resuspendiert. Die Perlen wurden auf einem Magneten gesammelt, und der Überstand wurde in ein neues Röhrchen übertragen. Die Ausbeute an isolierter DNA wurde mit einem Spektralphotometer (Perkin Elmer, Lambda EZ 201) gemessen.
-
Die Ergebnisse werden in 1, gezeigt, wobei die DNA-Ausbeute (y-Achse) in willkürlichen Einheiten gegen μl von 5%-igem Ammoniak in der chaotropen Lyse- und Bindungslösung aufgetragen ist. Das Lysevolumen ist auf 760 μl festgelegt, und die feste Phase ist auf 15 mg festgelegt.
