KR20110101143A - 굴곡 유리 표면 상에서의 핵산 추출 - Google Patents

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KR20110101143A
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마이클 더블유 리드
올리버 제트 나나시
폴 브이 헤이덕
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Abstract

생체 시료로부터의 핵산의 추출 방법 및 관련된 조립체 및 키트가 개시되어 있다. 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하는 장치를 제공하는 단계로서, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 단계; (b) 핵산 함유 시료를 제 1 포트를 통해 장치의 내강 내로 도입하는 단계; (c) 시료 중 핵산이 미개질 평활 유리 표면에 결합되는 것을 허용하는 단계; 및 (d) 결합된 핵산을 세척하는 단계.

Description

굴곡 유리 표면 상에서의 핵산 추출{NUCLEIC ACID EXTRACTION ON CURVED GLASS SURFACES}
본 발명은 액체 시료로부터 핵산 예컨대 DNA 및 RNA 를 추출하는데 유용한 방법, 장치, 조립체 (assembly) 및 키트를 제공한다.
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2008 년 11 월 4 일에 출원된 미국 가 출원 번호 61/111,079 에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
발명의 배경
생체 시료로부터의 핵산의 고속 분석은 세포 용해물 및 다른 공급원으로부터 핵산을 추출할 수 있는 미세유체 기술의 발달에 의해 진전되었다. 고속 추출 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 과 같은 증식 기술과 조합되어 혈액, 조직, 배양된 세포 또는 다른 생체 물질의 극미한 시료로부터 유용한 양의 핵산을 제공할 수 있다. 이러한 미세유체 기술은 생의학 연구 실험실에서 널리 사용되어 왔으며, 예를 들어 배양된 세균 또는 다른 숙주 세포로부터 클로닝된 DNA "라이브러리" 의 초고속 스크리닝을 허용한다.
이렇게 작은 규모로 DNA 를 추출하는데 통상적으로 사용되는 방법은 DNA 가 실리카 겔, 실리카 막, 다공성 유리 또는 규조토와 같은 물질에 결합하는 경향을 이용한다. 하나의 이러한 시스템은 DNA-결합 매질을 함유하는 마이크로원심분리 튜브 ("스핀 칼럼" 으로 알려짐) 를 제공한다. 시료가 튜브 내로 적재되고 원심분리기에서 회전됨에 따라, DNA 는 포획되고 오염물질을 함유하는 액체 상은 튜브의 바닥으로 이동한다. 이러한 절차가 예를 들어 Sauer 등의 미국 특허 번호 6,821,757 에 개시되어 있다. 스핀 칼럼 기술이 연구 집단에 의해 널리 이용되어 왔지만, 오염물질의 제거가 비효율적이고, 수득된 DNA 는 종종 PCR 과 같은 후속 적용에 사용하기에는 품질이 낮다. 더욱이, 개방 튜브 내로 복수의 시약을 피펫팅해야 하는 것은 시료 오염이라는 상당한 위험을 초래한다. 상기 방법은 수동으로 실시하는 경우 시간 소모적이고 자동화하는 경우 비용이 매우 많이 든다.
연구시 고속 DNA 추출 기술의 성공적인 사용은 혈액 성분의 현장 (point-of-care) 진단 및 시험과 같은 의학적 적용에 이 기술을 사용할 수 있게 하는 장치 및 방법의 개발에 대한 관심을 초래했다. 최근의 더 단순하고 작은 장치로의 진전이 [Malic 등, Recent Patents on Engineering 1:71-88, 2007] 에 의해 검토되었다. 이러한 최근의 진전에도 불구하고, 생체 시료로부터 고품질 DNA 및 RNA 가 신속하고 경제적으로 추출될 수 있게 하는 장치 및 방법에 대한 필요가 당업계에 여전히 존재한다.
본 발명은 액체 시료로부터 핵산 예컨대, DNA 및 RNA 를 추출하는데 유용한 방법, 장치, 조립체 및 키트를 제공한다.
본 발명의 하나의 양상은 생체 시료로부터의 핵산 추출 방법을 제공한다. 이 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하는 장치를 제공하는 단계로서, 내부 표면은 미개질 평활 (smooth) 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강 (lumen) 을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 단계; (b) 제 1 포트 및 제 2 포트 중 하나를 통해 장치의 내강 내로 핵산 함유 시료를 도입하는 단계; (c) 시료 중 핵산이 미개질 평활 유리 표면에 결합되는 것을 허용하는 단계; 및 (d) 결합된 핵산을 세척하여 오염물질을 용출시키는 단계. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 세척 단계 이후 미개질 평활 유리 표면으로부터 결합된 핵산을 용출시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 구현예에서, 내강은 세로 축으로 선형 내강이다. 관련된 구현예에서, 내강 중 적어도 일부는 세로 축을 따라 테이퍼형 (taperd) 이다. 또다른 구현예에서, 내강은 사행형 (serpentine) 이다. 관련된 구현예에서, 내강은 나선형이다. 또다른 구현예에서, 외부 표면은 세로 이랑을 포함한다. 부가적 구현예에서, 장치는 내강 내에 내부 요소를 포함하고, 내부 요소는 단면이 볼록한 미개질 평활 유리 표면을 포함한다. 추가의 구현예에서, 방법은 세포 시료를 용해하여 핵산 함유 시료를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 또다른 구현예에서, 핵산 함유 시료는 무질서유발 염을 포함한다. 부가적 구현예에서, 핵산 함유 시료는 동물 핵산, 인간 핵산 또는 미생물 핵산을 함유한다. 또다른 구현예에서, 핵산은 DNA 이다. 부가적 구현예에서, 핵산은 도입 단계 전에 파쇄된다. 또다른 구현예에서, 결합된 핵산은 핵산의 존재시 형광 강도의 변화를 나타내는 형광 화합물을 함유하는 완충액으로 용출된다. 추가의 구현예에서, 내강 중 적어도 일부를 통한 액체의 흐름은 난류이다. 부가적 구현예에서, 방법은 용출된 핵산을 증폭시키는 부가적 단계를 포함한다. 증폭 단계는 등온 증폭을 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 세척 단계는 상기 제 1 포트 및 제 2 포트 중 하나를 통해 장치의 내강 내로 세척 시약을 도입하는 단계, 결합된 핵산과 세척 시약이 접촉되는 것을 허용하는 단계, 및 상기 제 1 포트 및 제 2 포트 중 하나를 통해 내강으로부터 세척 시약을 제거하는 단계를 포함한다. 추가의 구현예에서, 동일한 포트를 통해 시료가 내강 내로 도입되고, 용출되는 핵산이 내강으로부터 제거된다.
본 발명의 두번째 양상에서, 하기를 포함하는 조립체가 제공된다: (a) 내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하는 장치로서, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 장치; 및 (b) 장치의 내강과 유체 소통하는 펌프. 하나의 구현예에서, 펌프는 장치의 제 2 포트에 연결된다. 관련된 구현예에서, 펌프는 다기관 (manifold) 을 통해 장치의 제 2 포트에 연결된다. 추가의 구현예에서, 조립체는 펌프와 유체 소통하는 유체 분포 제어 수단을 포함한다.
본 발명의 세번째 양상에서, 하기를 포함하는 조립체가 제공된다: (a) 복수의 장치로서, 각각의 장치는 내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하고, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 장치; (b) 복수의 연결기를 포함하는 다기관으로서, 각각의 연결기가 장치 중 하나를 수용하고 포트 중 하나를 통해 내강 내로의 유체 경로를 제공하도록 조정된 다기관; 및 (c) 다기관과 유체 소통하는 펌프, 이 경우 상기 복수의 장치 각각은 다기관의 연결기에 결합됨.
본 발명의 네번째 양상에서, 하기를 포함하는 키트가 제공된다: (a) 내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하는 장치로서, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 장치; 및 (b) 밀봉된 용기 내의 완충액. 완충액은 용해 완충액, 세척 완충액 또는 용출 완충액일 수 있다. 하나의 구현예에서, 완충액은 용출 완충액이다. 관련된 구현예에서, 완충액은 핵산의 존재시 형광 강도의 변화를 나타내는 형광 화합물, 예컨대 비스-벤즈이미딘 화합물을 포함하는 용출 완충액이다.
본 발명의 상기 및 다른 양상은 하기 발명의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 명백해질 것이다.
본원에서 언급된 모든 참조는 그 전문이 참조로 포함된다. 본원에서 언급된 수치 범위는 종점을 포함한다.
도 1 은 핵산 추출 장치 및 펌프를 포함하는 배열을 나타낸다.
도 2 는 복수의 핵산 추출 장치, 다기관 및 펌프를 포함하는 배열을 나타낸다.
도 3 은 아르키메데스 나선을 나타낸다.
도 4 는 페르마의 나선을 나타낸다.
도 5 는 굴곡 유리 표면으로부터 회수된 DNA 의 증폭 결과를 나타낸다.
도 6a 및 6b 는 핵산 추출 장치의 일부를 나타낸다.
도 7a 및 7b 는 핵산 추출 장치의 일부를 나타낸다.
도 8a 및 8b 는 단부 캡을 포함하는 핵산 추출 장치를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 생체 시료로부터의 핵산 예컨대, 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA) 의 추출을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "생체 시료" 는 세포 또는 세포 구성요소를 함유하는 시료를 의미하고, 그 예에는 핵산을 함유하는 액체 또는 고체인 임의의 시료가 포함된다. 본 발명에 사용될 수 있는 적합한 생체 시료의 예에는 세포 배양물, 배양 브로쓰, 세포 현탁액, 조직 시료, 세포 용해물, 투명 세포 용해물, 전혈, 혈청, 연막, 소변, 대변, 뇌척수액, 정액, 타액, 상처 심출물, 바이러스, 미토콘드리아 및 엽록체가 제한없이 포함된다. 하나의 구현예에서, 시료는 혈액 또는 혈액 생산물 (예를 들어, 혈소판) 이고, 추출되는 핵산은 혈액 또는 혈액 생산물 중 오염물질 세균 병원체로부터의 핵산이다.
본 발명을 통해 생산된 DNA 는 후속 적용 (예를 들어, 증폭) 에 대해 고품질인 것으로 밝혀졌다. 다공성 유리 표면에 비해, 본 발명에 사용되는 평활 유리 표면은 효소, 금속 (예를 들어, 헴), 및 PCR-기반 분석을 간섭할 수 있는 기타 단백질 오염물질을 세척 제거하는 것이 용이하다. PCR 수율이 개선되었고, 가변성이 감소되었다. 본 발명의 장치는 또한 추출된 핵산이 농축되는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 0.5 ㎖ 시료로부터 포획된 DNA 는 장치의 내강을 통해 완충액을 흘려보냄으로써 0.1 ㎖ 의 용출 완충액 중에 농축될 수 있다. 이러한 농축 효과는 향상된 감수성으로 병원체의 탐지 또는 희석 시료에 유용하다.
현재 널리 사용되는 스핀 칼럼과는 대조적으로, 본 발명은 외부 환경으로부터 차단될 수 있는 핵산 추출 장치를 포함한다. 즉 본 발명은 추출 장치의 내용물이 환경으로부터 본질적으로 단리되는 시스템을 제공하지만, 이러한 시스템은 시료 및 시약의 도입, 및 생성물, 세척물 및 추출된 핵산의 제거를 가능하게 하는 설비 (예를 들어, 밀봉가능한 포트 또는 부속품) 를 포함한다. 사수의 적용에 대해 상기 차단된 시스템이 바람직한데 이는 그것이 오염물질에 대해 본래 저항성이기 때문이다.
본 발명에 사용되는 장치는 다공성 실리카 기질을 사용하는 공지된 장치보다 표면적:부피 비가 상당히 더 낮지만, 액체 시료로부터 DNA 를 효과적으로 추출한다. 스핀 칼럼과 같은 원통형 장치에서 다공성 실리카 기질은 공간부피 1 ㎕ 당 수백 ㎟ 의 유리 표면적을 갖는다. 예를 들어, 10 ㎛ 다공성 실리카 비드로 채워진 0.6 ㎜ × 5 ㎜ 직경의 원통은 유리 면적이 약 3684 ㎟, 공간 부피가 5.641 ㎕ 이므로, 표면적:공간부피 비가 653 ㎟/㎕ 일 것이다. 대조적으로, 본 발명의 장치는 표면적:공간부피 비가 0.1 ㎟/㎕ 내지 20 ㎟/㎕, 더욱 통상적으로는 0.25 ㎟/㎕ 내지 10 ㎟/㎕, 보통 0.5 ㎟/㎕ 내지 5 ㎟/㎕ 이다. 본 발명에 사용될 수 있는 전형적인 파스퇴르 피펫은 표면적:부피 비가 대단부에서 약 0.57 ㎟/㎕, 소단부에서 4 ㎟/㎕ 이다.
본 발명에 사용되는 핵산 추출 장치는 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하며, 이를 통해 핵산 함유 시료가 도입될 수 있고, 오염물질 및 추출된 핵산이 제거될 수 있다. 상기 장치는 장치의 내부 표면에 의해 한정되는 관형 내강을 추가로 포함하고, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어진다. 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 핵산-특이적 결합 자리를 본질적으로 포함하지 않고, 2 개의 포트와 유체 소통한다. 본 발명의 실시에서, 핵산은 장치의 내부 표면에 결합된다. 또한, 액체 덩어리가 장치를 통과할 때 공기 방울이 전연 (leading edge) 을 침투하여 액체 덩어리에 연행되지 않을 수 있도록 장치가 디자인된다. 장치는 상이한 유형의 시료에 따라 성능을 최적화하도록 크기가 달라질 수 있다. 성능을 최적화하는데 있어서 고려되는 파라미터에는 내강의 직경 및 길이가 포함된다. 예를 들어, 내강의 부피는 시료의 부피에 기초하여 선택될 수 있다. 더 큰 직경의 내강은 점성이 더 높은 시료의 흐름 속도를 향상시킬 수 있다.
당업자는, 사용되는 제작 방법의 면에서, 장치의 내부 표면이 형상의 불규칙성을 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 불규칙성은 예를 들어 제작 과정의 인공산물 (예를 들어, 치수 차이) 로서 발생할 수 있다. 일반적으로 이러한 불규칙성을 실행가능한 정도까지 최소화하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 내강은 선형 내강이다. 이 구현예에서, 장치는 통상적으로 중심 내강을 갖는 직선형 관을 포함할 것이다. 내강의 직경은 내강의 길이에 따라 본질적으로 일정할 수 있다. 대안적으로는, 내강은 내강의 세로 축을 따라 테이퍼형일 수 있다. 전체 내강이 테이퍼형이거나, 내강의 작은 부분에만 테이퍼형이 제한될 수 있다. 후자의 배열을 예시하는 장치는 파스퇴르 피펫이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 내강은 중심 축을 따라 굴곡형이다. 다양한 굴곡형 구조가 고려된다. 대표적인 굴곡형 내강의 예에는 C 또는 S 형상을 갖는 것, 및 복수의 굴곡, 나선 및 나선형 코일을 포함하는 더욱 사행형인 내강이 제한없이 포함된다. 내강 부피 대 전체 장치 부피의 높은 비는 내강을 3 차원적으로 굴곡시킴으로써 수득될 수 있다. 즉 본 발명은 예를 들어 평행 면에 배열된 복수의 사행형인 채널 또는 복수의 동축 나선 채널을 포함하는 내강을 포함한다. 이러한 유형의 장치는 편리하게는 용이하게 이용가능한 형태의 유리 배관, 예컨대 모세관, 기체 크로마토그래피 칼럼, 콘덴서 관 등으로부터 구성된다.
기초적 구현예에서, 장치는 내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트로 이루어지고, 내부 표면은 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 내강을 한정한다. 다른 구현예에서, 장치는 내강 내에, 단면이 볼록한 미개질 평활 유리 표면을 포함하는 내부 요소를 포함한다. 이러한 장치는 복수의 본질적으로 동심인 결합 요소, 예컨대 관 또는 막대기를 포함할 수 있고, 이로써 장치의 내강 내 복수의 미개질 평활 유리 결합 표면을 제공한다. 도 6a 및 6b 는 동심 유리 관 (130) 및 (140) 이 2 개의 내강 (150) 을 한정하는 상기 장치의 예를 나타낸다. 외부 내강은 오목한 벽 및 볼록한 벽을 모두 갖는 한편, 내부 내강은 오목한 벽을 갖는다. 도 7a 및 7b 는 동심 관 (130) 및 (140) 에 더하여, 중심 유리 막대 (160) 을 포함하는 또다른 구현예를 나타낸다. 이 구현예에서, 내부 및 외부 내강 (150) 은 모두 오목한 벽 및 볼록한 벽을 모두 갖는다. 관 및/또는 막대의 상기 구조는 하기 기술된 바와 같은 유지 요소의 사용에 의해 안정화될 수 있다. 도 8a 및 8b 에 나타난 바와 같이, 이러한 배열은 유지 요소의 말단에 단부 캡 (170) 을 제공함으로써 추가로 안정화될 수 있다. 유지 요소 및 단부 캡은 그것을 통해 장치 내 모든 유리 표면으로의 유체 흐름을 허용하도록 구성될 수 있다.
본 발명에 유리 관이 사용되는 경우, 관의 단부는 내강을 한정하는 중간 부분을 갖는 입구 및 출구 포트를 제공할 수 있다. 관의 단부 (입구 및 출구 포트) 에는 하기에서 상세히 기술된 바와 같이 그것을 통해 시약이 첨가되고 회수될 수 있는 단부캡 또는 기타 부속품이 설치될 수 있다. 이러한 부속품은 또한 장치를 밀봉할 수 있다. 이러한 장치는 취급을 용이하게 하고 관을 파손으로부터 보호하기 위한 보호용 하우징, 방호물, 손잡이 등을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 요소는 편리하게는 중합체성 물질로부터 구성된다. 당업자는 유리 관이 하우징에 적합하게 조정됨으로써 입구 및 출구 포트가 하우징의 표면을 관통하는 개구부로서 형성되어 유리 관으로의 유체 접근을 제공할 수 있음을 이해할 것이다.
하나의 구현예에서, 내강의 적어도 일부의 형상 및 비율은 그것을 통해 액체의 난류가 통과하도록 선택된다. 난류는 내강을 통과하는 액체의 혼합을 촉진할 수 있다. 흐름이 난류 또는 층류인지 여부는 그것의 레이놀즈 수 (Re) 에 의해 특징지어질 수 있다. 레이놀즈 수는 점성력에 대한 관성력의 비로 설명될 수 있고, 이 경우 점성력은 속도에 대한 저항으로서 여겨질 수 있고, 관성력은 속도 변화에 대한 저항으로서 여겨질 수 있다.
Re = (p × Vs × L) / (u)
[식 중, p = 유체 밀도 (㎏/㎥),
Vs= 평균 유체 속도 (m/s),
L = 특성 길이 (m) {이는 파이프의 경우 Dh = 수력학적 직경 (m)
Dh = (4 × 면적) / (주변길이), 즉 파이프 단면의 면적 및 주변길이임},
u = 절대 점도 (sN/㎡)].
Re 가 2300 미만인 경우, 흐름은 층류로 여겨지고, Re 가 4000 초과인 경우 흐름은 난류로 여겨진다. 이 두 값 사이는 모두 전이 영역으로 여겨진다.
전형적인 파스퇴르 피펫은 직경이 일정하지 않고, 테이퍼형 부분에 의해 연결된 각 단부에서 2 개의 동일한 직경의 단면들을 갖는다. 간단히, 2 개의 동일한 직경의 단면들의 레이놀즈 수는 하기와 같이 계산된다. 좁은 단면은 직경이 0.9 ㎜ 이고, 넓은 단면은 직경이 5 ㎜ 이다. 흐름 속도는 일반적으로는 600 ㎕/초를 초과하지 않을 것이고, 전형적으로는 약 60 ㎕/초일 것이다. 상기 방정식 및 하기 값들을 사용할 때:
L = 0.0009 m (좁은 단면) 또는 0.005 m (넓은 단면),
Vs = 0.94 m/s (좁은 단면, 고 유량); 0.094 m/s (좁은 단면, 저 유량); 0.03 m/s (넓은 단면, 고 유량); 및 0.003 m/s (넓은 단면, 저 유량),
p(물) = 1000 ㎏/㎥,
u(물) = 1/1000 sN/㎡,
좁은 단면의 경우 흐름 속도 60 ㎕/초에서 Re = 1000 × 0.094 × 0.0009 × 1000 = 84.9 이고; 넓은 단면의 경우 흐름 속도 60 ㎕/초에서 Re = 1000 × 0.003 × 0.005 × 1000 = 15.3 이다. 흐름 속도 600 ㎕/초에서, 좁은 단면의 경우 Re = 849 이고, 넓은 단면의 경우 Re = 153 이다. 따라서, 상기 기술된 치수를 갖는 장치는 Re 가 전이 영역에 접근하기 전에 1625 ㎕/초를 초과하는 흐름 속도를 수용할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 내강은 형상이 사행형이다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "사행형" 내강의 예는 2 차원적으로 굴곡된 평판형 내강 뿐만 아니라 나선 형태의 3 차원적 통로 및 그의 변형체를 포함한다. 상기 3 차원적 구조는 하나 이상의 면을 따라 원주가 편평화되어 전체 장치 부피가 감소될 수 있다. 사행형 형상은 유리의 넓은 표면적에 시료를 노출시킬 수 있게 하는 한편, 전체 장치 및 내강의 단면을 작게 유지한다. 내강 단면 치수를 제한하는 것은 내강 내에서 기체 방울이 액체 덩어리의 전연을 미끄러져 지나가는 것을 방지하는데 기여한다. 사행형 디자인은 또한 상기 넓은 표면적 (유리-액체 경계면) 및 좁은 단면의 조합이 작은 공간 내에 존재할 수 있게 한다. 상기 기술된 바와 같이, 사행형 (예를 들어 나선형) 내강의 예에는 원형 단면을 갖는 것 및 기타 구성이 포함된다.
본 발명의 장치는 미개질 평활 유리로 이루어진 내부 표면을 포함한다. 이러한 표면은 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA 의 결합에 효과적이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "미개질 평활 유리 표면" 은, 표면적을 증가시키기 위해 표면이 식각되거나 다르게 변형되지 않고, 하기 기술된 바와 같이 핵산에 특이적으로 결합하도록 개질되지 않은, 평활도가 표준 현미경 슬라이드, 파스퇴르 피펫, 유리 모세관 등의 평활도와 같은 유리 표면을 의미한다. 구체적으로는 "평활 유리" 에 속하지 않는 것은, 통상적으로는 비드, 백옥유 (frit) 또는 막 형태인, 핵산을 포획하는 것으로 당업계에 공지되어 있는 다공성 유리이다. 이러한 다공성 유리는 통상적으로는 세공 크기가 0.1 ㎛ 내지 300 ㎛ 범위 내이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 유리 물질의 예에는 소다 라임 유리 (예를 들어, Erie Electroverre Glass; Erie Scientific Company, Portsmouth, New Hampshire), 보로실리케이트 유리 (예를 들어, Corning 0211, PYREX 7740; Corning Incorporated, Corning, New York), 아연 티타니아 유리 (Corning), 및 실리카 유리 (예를 들어, VYCOR 7913; Corning Incorporated) 가 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 것은 유리 배관으로서, 이는 다양한 크기로 쉽게 구할 수 있다. 특별히 관심있는 것은 파스퇴르 피펫으로서, 이는 비싸지 않고, 양호한 표면:부피 비를 제공하고, 시약의 혼합을 촉진시키는 큰 직경의 영역을 내강 내에 포함한다. 상기 기술된 바와 같은, 평활 유리 표면을 갖는 유리 모세관, 크로마토그래피 칼럼, 콘덴서 관, 흡입기, 막대 등이 또한 사용될 수 있다. 내강에는 핵산-특이적 결합 자리, 예컨대 고정화된 올리고뉴클레오티드, 작은 홈 결합제, 중격제 등에 의해 제공되는 결합 자리 또는 대전된 표면이 본질적으로 부존재한다. "핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는" 내강은 핵산 결합이 유리에 비해 통계적으로 유의하게 증가하기에 충분한 양으로 상기 자리를 함유하지 않는 내강이다.
본 발명에 사용되는 가장 단순한 형태의 장치는 각 단부에 포트가 있는 유리 관이다. 당업자는 다른 구성이 사용될 수 있고, 다양한 형상의 유리 관이 더 크고 더 복잡한 장치 안에 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 다른 장치는 예를 들어 자동화된 취급을 용이하게 하고, 취약한 유리 요소를 보호함으로써 내구성을 증가시키고, 또는 시료의 전반 또는 후속 취급에 사용되는 다른 장치에 연결되도록 구성될 수 있다. 이러한 장치의 몸체 중 나머지는 바람직하게는 낮은 자가형광 및 매우 적은 핵산 결합을 나타내는 물질로부터 만들어진다. 상기 물질은 또한 사용 중에 접촉될 수 있는 시약 (예를 들어, 에탄올) 에 영향을 받지 않아야 한다. 경성 또는 반경성, 유기 중합체성 물질이 바람직하다. 대표적인 상기 물질의 예에는 아크릴계 (고분자량 경성 물질), 폴리카보네이트, 폴리프로필렌 (낮은 표면 에너지 박막), 셀룰로스 아세테이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리비닐클로리드 및 고밀도 폴리에틸렌 (HDPE) 이 포함되나, 폴리스티렌은 포함되지 않는다. 중합체성 물질의 결합에 적합한 접착제 물질의 예에는 300LSE 접착제 필름 (3M); 467 아크릴계 접착제 필름 (3M Company, St. Paul, MN.); 8141 아크릴계 접착제 필름 (3M Company); 및 Transil 실리콘 접착제 필름이 제한없이 포함된다. 장치 제조 후 특정 접착제의 탈기는 DNA 수율을 감소시킬 수 있다; 이러한 문제를 해소하기 위해 진공 탈기가 사용될 수 있다.
상기 장치는 포트를 추가로 포함하며, 그것을 통해 액체가 내강 내로 도입되고 내강으로부터 제거될 수 있다. 즉, 포트는 장치의 표면을 관통하는 개구부를 제공하고, 내강과 유체 소통한다. 가장 단순한 구성의 입구 및 출구 포트는 장치 내 개구부, 예컨대 관 단부에서의 개구부로서 제공된다. 이러한 개구부는 형상이 편리하게는 원형이지만, 형상은 일상적인 디자인 선택의 문제이다. 유리 배관의 단부에 의해 포트가 제공되는 장치는 이하에서 더욱 상세히 기술된 바와 같은 다른 유지 요소 또는 다기관 내로 직접 삽입될 수 있다. 입구 및 출구 포트는 다양한 수단에 의해 시료 및 다른 시약이 장치 내로 도입될 수 있게 하는 부가적 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 수동 투입을 가능하게 하는 피이크 배관 스터브 (Peek stubing stub) 가 장치에 부착될 수 있다. 수동 첨가는 다양한 완충액이 부피, 인큐베이션 시간 및 흐름 속도에 대해 최적화될 수 있게 한다. 대안적으로는, 표준 1 ㎖ 폴리프로필렌 흡입기 또는 프로그램가능한 연동 펌프가 배관 및 루어-락 어댑터 (Luer-lock adaptor) 와 함께 사용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 구멍 내로 바늘 (예를 들어, 몽툭한 끝, 22G 바늘) 이 삽입될 수 있도록 크기가 조정된 작은 직경의 구멍에 의해 입구 및 출구 포트가 제공된다. 바늘로의 연결은 루어-락 부속품을 사용하여 이루어진다. 또다른 구현예에서, 각각의 입구 및 출구 포트는 바늘 또는 캐뉼라로 뚫을 수 있는 탄성중합체성 중격 또는 캡을 포함함으로써, 사용 전까지 밀봉되는 장치를 제공한다. 포트는 O-고리, 개스켓 (gasket) 등의 포함함으로써 유출에 대항해 추가로 밀봉될 수 있다.
도 1 은 장치 (100) 및 펌프 (300) 을 포함하는 본 발명의 조립체를 나타낸다. 장치 (100) 의 제 2 포트 (120) 은 유지 요소 (200) 내로 삽입된다. 유지 요소 (200) 은 공지된 방법, 예컨대 사출 성형에 의해 구성된다. 유지 요소 (200) 은 펌프 (300) 에 연결되고, 장치 (100) 의 내강과의 유체 소통을 제공한다. 이러한 배열에서, 펌프 (300) 은 흡입을 적용하여, 제 1 포트 (110) 을 통해 장치 (100) 내로 액체를 빨아들일 수 있다. 대안적으로는, 액체는 제 2 포트 (120) 을 통해 장치 (100) 의 내강 내로 전달될 수 있다. 도시된 구현예에서, 유지 요소 (200) 은 펌프 (300) 에 대해 안정적 위치에서 장치 (100) 을 보유하도록 디자인된다. 당업자는 유지 요소 (200) 이 다양한 대안적 방식으로 구성될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 유지 요소 (200) 은 연성 또는 경성 배관으로부터 구성될 수 있고, 장치 (100) 은 클램프 등을 사용하여 고정된 위치에서 유지될 수 있다. 대안적 예에서, 0.25" 내경의 폴리우레탄 (예를 들어, TYGON) 배관은 0.27" 외경의 대단부를 갖는 통상적인 파스퇴르 피펫으로 강한 밀봉을 형성한다. 이러한 크기의 배관은 또한 1 ㎖ 흡입기 또는 소형 피펫의 끝과 강하게 짝지어진다. 이러한 유지 요소는 3/8 인치 길이로 절단된 박막 (예를 들어, 1/32 인치) 배관을 사용하여 용이하게 제조된다.
도 1 의 배열은 도 2a 및 2b 에 나타난 바와 같이 용이하게 변형되어 복수의 장치 (100) 의 동시 사용을 제공한다. 조립체 (600) 으로 나타나 있는 도 2b 의 배열에서, 장치 (100) 은 박막 폴리우레탄 배관으로부터 구성되는 유지 요소 (200) 을 통해 다기관 (210) 으로 연결된다. 다기관 (210) 은 결국 펌프 (300) 에 연결되어, 펌프 (300) 과 장치 (100) 사이의 유체 소통을 제공한다. 이러한 다중-장치 조립체는 복수의 장치 (100) 이 표준 다중-웰 플레이트, 예컨대 96-웰 플레이트의 웰에 상응하게 위치하도록 구성될 수 있다. 도시된 조립체에서, 8 개의 장치 (100) 은 정렬 플레이트 (400) 에 의해 96-웰 플레이트 내 8 개의 웰의 열과 나란히 정렬된 위치에서 유지된다. 이러한 배열에서, 조립체는 하나 또는 일련의 상기 플레이트로부터 유체를 빨아들이거나 그 안으로 액체를 방출할 수 있다. 시료 및 시약 (예를 들어, 세척 및 용출 완충액) 은 단일 플레이트의 상이한 열에 배열될 수 있고, 장치의 단부를 적당한 웰 내로 삽입하도록 플레이트 또는 조립체 중 하나가 이동된다. 이 과정은 수동으로 또는 자동으로 수행될 수 있다. 다중-웰 플레이트는 연성 시스템을 제공하고 희석 시료로부터 핵산의 농축을 용이하게 하는 다양한 범위의 웰 부피 (예를 들어, 200 ㎕, 0.5 ㎖, 1.O ㎖, 2.O ㎖) 로 입수가능하다. 당업자에게 이해될 바와 같이, 다른 용기, 예컨대 관 (예를 들어, 마이크로원심분리 튜브), 플레이트 또는 접시가 또한 사용될 수 있다. 관은 다중-웰 플레이트 형식으로 배열될 수 있다. 유리 관이 사용되는 경우, 관의 내부는 핵산 포획에 사용될 수 있는 추가의 평활 유리 표면을 제공한다. 이러한 배열에서, 장치 및 관의 유리 표면으로부터 용출된 핵산은 장치 내에서 수집되어 또다른 용기로 전송될 수 있거나, 관 내에서 수집될 수 있다. 이러한 다중-장치 조립체의 경우, 조립체 내의 각각의 장치가 개별적으로 작동될 수 있거나, 조립체 내의 모든 장치가 동시에 작동될 수 있다.
도 2b 는 조립체의 나머지가 고정되어 있는 취급 플레이트 (500) 을 추가로 포함하는 조립체를 나타낸다. 취급 플레이트 (500) 은 조립체 (600) 의 구성요소를 추가로 안정화시키고 전체 조립체의 3 차원적 회전을 가능하게 한다. 전형적인 핵산 추출 절차에서, 결합/용해 완충액 중 핵산 함유 시료는 펌프 (300) 에 의해 장치 (100) 내로 빨아들여지고, 핵산이 장치의 내부 벽에 결합되도록 허용된다. 장치 내에 액체가 있는 경우, 장치 (100) 의 상부 (넓은) 구역에서 시료과 유리 사이의 접촉을 최대화하도록 조립체 (600) 은 임의로 옆으로 기울어지고 회전된다. 그 후 액체가 방출되고, 제 1 세척 완충액이 장치 내로 빨아들여진다. 완충액은 펌프 (300) 의 작용에 의해 장치의 내강 내에서 상하로 펌핑된다. 그 후 완충액이 방출되고, 세척이 필요한 만큼 반복된다. 최종 세척 이후, 공기의 흐름이 장치 (100) 을 통과하여 결합된 핵산을 건조시킨다. 펌프 (300) 의 유형에 따라, 장치 (100) 과 펌프 (300) (다기관 (210) 이 있거나 없는) 의 연결을 끊고 장치 (100) 을 다른 수단에 의해 제공되는 공기 흐름에 연결시킴으로써 공기 건조가 촉진될 수 있다. 마지막으로, 핵산이 장치 (100) 으로부터 용출되어 96-웰 플레이트, 한 세트의 관 등 내로 전송된다. 펌프 (300) 은 또한 장치 (100) 의 내부 표면을 사전 세척 또는 사전 처리하는데 사용될 수 있다.
하기에서 더욱 상세히 기술된 바와 같은, 마이크로프로세서로 제어되는, 다중-채널 펌프 및 유체 분포 제어 수단에 연결된 밸브 장치에 상기 조립체를 연결시킴으로써 부가적 자동화가 제공될 수 있다. 이러한 조립체는 표준 실험실 로봇 시스템과 조합되어 완전히 자동화된 시료 취급을 제공할 수 있다.
상기 장치는 통상적으로는 외부 단면의 형상이 내강의 단면과 동일한 배관 한 토막의 형태를 취할 것이다. 이러한 형태의 장치는 비싸지 않고, 저장 및 취급이 용이하고, 사용시 상당한 유연성을 제공한다.
하나의 구현예에서, 장치의 외부 표면은 하나 이상의 세로 이랑을 포함한다. 이랑이 있는 장치는 시료 수집 동안 조직을 파괴하고/거나 장치의 내강 내로 도입하기 전에 시료를 혼합하는데 사용될 수 있다. 전형적인 적용에서, 핵산 함유 물질이 완충액이 있는 관 내에 배치되고, 이랑이 있는 장치가 관 내로 삽입되고 회전되어 시료를 혼합하고, 시료가 장치 내로 빨아들여진다.
또다른 구현예에서, 상기 기술된 바와 같은 관형 장치가 상기 간략히 기술된 바와 같은 더 큰 구조 내에 포함된다. 이러한 배열은 유리를 파손으로부터 보호하고 취급을 용이하게 하기 위해 사행형 내강을 갖는 장치를 사용하는 경우에 특히 유리하다. 예를 들어, 나선형 모세관은 접착제, 수지, 에폭시 등으로부터 제조된 카드형 또는 블록형 몸체 내에 포함될 수 있다. 용어 "나선" 은 본원에서 그것의 통상적인 의미로 사용되며, 중심 점 주위에서 연속적이고 점차적으로 넓어지는 형태로 구부러지는 판형 굴곡을 의미한다. 적합한 나선의 예에는 아르키메데스 나선 (도 3) 및 페르마의 나선 (도 4) 이 포함되나, 다른 형상이 사용될 수 있다. 예를 들어, Wikipedia (en.wikipedia.org/wiki/Spiral) 참조. 유리 배관 (예를 들어, 모세관) 은 직선형 유리 모세관을 그것의 연화점까지 가열하고, 이를 관을 정렬된 상태로 유지하도록 디자인된 측벽을 갖는 감개 (reel) 위에 감음으로써 원하는 나선으로 구부러질 수 있다. 나선은 단일 평면 구조로서 또는 다중 평면 (즉, 2 이상의 나선이 서로의 상부에 편평하게 위치함) 내에 구성될 수 있다. 나선의 단부는 마주보고 나선의 평면으로부터 약간 위로 돌출되도록 구부려저서 제 1 포트 및 제 2 포트를 제공한다. 그 후 단부가 덮히고, 몸체 물질 (예를 들어, 접착제, 수지 또는 에폭시) 이 나선 위로 부어지거나 분무되어 강도 및 취급 용이성을 제공한다. 원하는 형상을 만들기 위해 몰드가 사용될 수 있고, 몰드는 장치를 홀더 또는 다기관에 짝짓는 것을 용이하게 하는 정렬 구멍, 슬롯 또는 돌출부를 포함할 수 있다. 물질이 경화된 후, 관 단부 (포트) 가 노출된다. 전형적인 구현예에서, 수득되는 구조는 상부 표면 상에 제 1 포트 및 제 2 포트를 갖는 편평한 원반 형상이다. 포트에는 상기 더욱 상세히 기술된 바와 같은 부가적 구성요소가 제공될 수 있다. 몸체 물질 내에 구멍을 냄으로써 관찰 창이 제공될 수 있다.
대안적인 구성 방법이 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, Reed 등, 미국 특허 출원 공개 번호 20090215125 A1 에 의해 개시된 바와 같이 적층 플라스틱 구성이 본질적으로 사용될 수 있다. 간략히, 레이저 절단, CNC 드래그 칼 절단 (CNC drag knife cutting) 및 다이 절단과 같은 공지된 방법을 사용하여 개별 중합체성 층이 절단되어 형상을 만든다. 접착제 층이 건조 플라스틱의 층들 사이에 위치하도록 제조된다. 통상적으로 접착제 층은 플라스틱에 사용되는 것과 동일한 방법을 사용하여 절단될 수 있는 박막으로 입수가능한 압력-감수성 접착제일 것이다. 접착제는 접착제-담체-접착제 (ACA) 형식으로 사용될 수 있고, 이 경우 담체는 바람직하게는 장치의 다른 층에 사용된 것과 동일한 물질이다. 액체 접착제를 적용하는 다른 방법, 예컨대 스크린 프린팅이 또한 사용될 수 있다. 여러 층이 서로 합치되고 함께 압착된다. 유리하게는 합치를 보조하는 특징, 예컨대 정렬 구멍이 최종 디자인에 포함된다. 경화 주기 동안 압력 및 온도는 접착제-종속적이고; 적합한 조건의 선택은 당업자의 수준에 속한다. 대안적으로는, 장치는 20090215125 A1 에 기술된 바와 같은 압축 밀봉 (compression seal) 을 사용하여 조립될 수 있다. 적층은 상기 기술된 바와 같은 성형된 요소를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 기술된 바와 같은 장치 및, 장치의 내강과 유체 소통하는 펌프를 포함하는 조립체를 제공한다. 용어 "펌프" 는 본원에서 수동으로 조작되고 (예를 들어, 흡입기 및 다중-채널 피펫) 동력이 공급되는 (예를 들어, 전기적) 장치를 포함하는 것으로 사용된다. 조립체는 펌프가 포트 중 하나 또는 둘 다를 통해 유체를 내강 내로 전달하고 내강으로부터 제거할 수 있도록 구성된다. 펌프는 하기 기준을 충족시키는 능력에 의해 선택된다: (1) 부피를 20 ㎕ 내지 1000 ㎕ 이상, 바람직하게는 2.5 ㎖ 이하의 범위에서 정확하게 분배하는 능력; (2) 공기 뿐만 아니라 액체를 효과적으로 펌핑하는 능력; 및 (3) 역으로 작동하는 능력. 흡입기-유형 또는 풀무-유형 펌프가 상기 기준을 만족시키고 장치가 종래의 피펫의 방식으로 작동될 수 있게 하며, 이 경우 제 1 포트 및 제 2 포트 중 하나가 모든 시약의 도입 및 제거에 사용된다. 액체가 포트 둘 다를 통해 이동되는 경우, 작은 부피 또는 제로 무효 부피를 제공하여 시약의 교차 오염을 최소화하고, 사용되는 다양한 시약 (예를 들어, 무질서유발 염 및 에탄올) 과 상용성인 물질로 이루어진 습윤화된 표면을 갖는 포트를 사용하는 것이 유리하다. 연동 펌프는 상기 특성들 모두의 양호한 작동 조합을 제공하나, 모든 펌프 선택의 가장 정확한 부피 분배를 제공하지는 않는다. 연동 펌프는 더 큰 부피의 액체가 취급되는 경우에 유리하게 사용된다. 컴퓨터로 제어되는 다중-채널 연동 펌프 (예를 들어, ISMATEC 12-패널 펌프; Ismatec SA, Glattbrugg, Switzerland) 는 동시에 복수의 장치를 수용할 것이고, 흐름 속도를 시작/정지/변화시키거나 흐름의 방향을 역전시키도록 프로그램될 수 있다. 다른 펌프 방식을 사용하는 경우, 특정 기능을 위해 복수의 펌프가 필요할 것이지만, 이러한 배열은 전반적인 유체 관리 시스템을 복잡하게 만들 것이다.
본 발명의 조립체는 펌프와 유체 소통하는 유체 분포 제어 수단을 추가로 포함할 수 있다. 유체 분포 제어 수단은 전형적으로는 밸브-다기관 블록 형태인, 복수의 유체가 장치를 통해 순차적으로 펌핑될 수 있게 하는 하나 이상의 밸브를 포함한다. 밸브-다기관 조립체를 오염으로부터 보호하기 위해 다기관 투입구 및 배출구가 멸균 필터를 통과하고, 펌프 배관으로부터 다기관 내로의 역류를 방지하기 위해 배출구 선이 체크 밸브를 갖는 것이 바람직하다. 예시적인 유체 분포 제어 수단은 Upchurch Scientific (Oak Harbor, Washington) 에 의해 제조된 모델 V-1241-DC 6-위치, 7-포트 회전식 선택 밸브이다. 이 선택 밸브는 시약들 사이에 공기 간격의 도입을 가능하게 한다. 유체 분포 제어 수단은 밸브 장치의 외부에 있거나 밸브 장치에 완전히 통합된 프로그램가능한 컴퓨터를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 프로그램가능한 컴퓨터는 데스크탑 또는 랩탑 개인용 컴퓨터이다. 다른 구현예에서, 프로그램가능한 컴퓨터는 전용 마이크로프로세서 장치이다. 예시적인 시스템에서, 유체 분포의 제어는 Microsoft Excel 용 Visual Basic 으로 작성되고 개인용 컴퓨터에서 실행되는 어플리케이션을 사용하는 다중-채널 연동 펌프와 조합된 상기 기술된 선택 밸브를 사용하여 달성된다. 밸브 장치 및 펌프 특징 RS232 모두가 인터페이스를 제어한다. 이들 구성요소는 컴퓨터의 USB 포트 및 USB-대-시리얼 컨버터를 통해 Excel 을 사용하여 접근된다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 기존 펌웨어 소프트웨어가 또한 사용될 수 있다.
액체 시약은 편리하게는 멸균 필터 배출구 (vent) 가 구비된 중격-밀봉된 소병 내에 저장된다. 소병은, 중격을 통해 삽입되고 소구경 배관을 통해 다기관 투입구에 연결되는 표준 루어 유형 바늘을 사용하여 유체 분포 제어 수단으로 연결될 수 있다.
조립 후, 장치는 병원체를 제거하기 위해 바람직하게는 에틸렌 산화물 또는 감마 멸균으로 처리된다. 장치와 함께 사용되는 시약은 오염물질을 제거하기 위해 진입시 바람직하게는 2-마이크론 셀룰로스 필터를 통과한다. 핵산 증폭을 간섭할 수 있는 오염물질을 비롯한 오염물질을 제거하는 다른 방법은 Reed 등, WO 2008002882 에 의해 개시되어 있다. 장치 상의 시약 포트는 노란색 및 푸른색 피펫 끝에 대한 경계면을 제공할 수 있다. 바늘-중격 경계면이 제공될 수 있다.
액체 시료는 상기 기술된 바와 같이 약 0.1 ㎖/분 내지 약 5.0 ㎖/분의 흐름 속도로 장치 내로 도입되지만, 상당히 더 빠른 흐름 속도가 사용될 수 있다. 실제 흐름 속도는 디자인-종속적이고, 유체 경로의 총 부피 및 내강의 구조를 고려한다.
희석 또는 농축 시료가 장치 내로의 투입을 위해 제조될 수 있다. 완전한 세포의 용해 및 소화는 잔류 단백질 (예를 들어 히스톤) 로부터 DNA 또는 RNA 를 방출시킨다. 대안적으로는, 고체 시료 (예를 들어, 피륙 상의 건조된 혈액 또는 세균 포자) 또는 반고체 시료 (예를 들어, 마우스 꼬리 또는 가래/대변) 가 장치로의 투입 전에 균질화되고 용해되어 동종 및 비점성 시료를 제공할 수 있으며, 이는 장치의 내강을 통해 흐를 것이다. 점성이 더 큰 시료, 예컨대 혈액이 또한 사용될 수 있다.
핵산은 용해도에 따라 0.5 M 이상 내지 약 2 M 이상의 농도의 염 (예를 들어, KCl), 또는 1 M 이상 내지 약 6 M 또는 용해도 한계의 농도의 무질서유발체 (예를 들어, 구아니딘 HCl 또는 구아니딘 티오시아네이트) 의 존재 하에 장치의 유리 표면(들)에 결합된다. 핵산의 결합은 보통 약 5 내지 8, 바람직하게는 약 6 의 pH 에서 이루어진다. 그 후 감소하는 염 농도의 완충액을 사용하여 내강이 세척된다. 염 농도가 감소함에 따라, 에탄올이 세척 용액에 첨가되어 핵산을 유리 상에 유지시키고, 핵산 증폭과 같은 후속 공정을 간섭할 수 있는 오염물질을 제거한다. 세척은 pH 6-9, 통상적으로는 pH 6-8 에서 수행된다. 핵산은 염기성 pH, 통상적으로는 pH 8-9 의 저 염 용액에 의해 장치로부터 용출된다.
일반적으로, 생체 시료 내에 세포가 존재하는 경우 세포가 용해되어 세포 용해물을 제공하며 이로부터 핵산이 추출된다. 다양한 세포 용해 방법이 당업계에 공지되어 있고 본 발명에 사용하기에 적합하다. 세포 용해 방법의 예에는 효소적 처리 (예를 들어, 프로테이나제 K, 프로나제 또는 서브틸리신을 사용함), 기계적 파열 (예를 들어, 음파처리, 고압의 적용, 피에조부저 장치의 사용 또는 비드 비팅에 의함) 또는 화학적 처리가 포함된다. 기계적 파열에 사용되는 비드는 파열 조건 하에 핵산에 결합되지 않는 성분으로 이루어져야 한다. 적절한 성분의 예에는 아크릴계, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 셀룰로스 아세테이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리비닐클로리드 및 고밀도 폴리에틸렌이 포함된다. 시료 중 세포를 무질서유발 염 용액으로 처리함으로써 용해시키는 것이 특히 유리하다. 무질서유발 염을 사용하여 세포를 용해하기 위한 방법 및 시약은 상업적 공급자로부터 구매할 수 있다. 구체적 시약 조성 및 반응 조건은 부분적으로는 용해될 세포의 유형에 의해 결정될 것이고, 이러한 결정은 당업자의 수준에 속한다. 적합한 무질서유발 염의 예에는 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니딘 히드로클로리드, 요오드화 나트륨 및 과염소산 나트륨이 포함된다. 혈액 세포를 용해하는데 바람직한, 구아니딘 히드로클로리드는 1 M 내지 1O M, 통상적으로는 1 M 내지 5 M, 보통 1 M 내지 3 M 의 농도로 사용된다. 염의 포화점 (12 M) 에 접근하는 더 높은 농도의 요오드화 나트륨이 필요하다. 과염소산 나트륨은 중간 농도, 통상적으로는 약 5 M 로 사용될 수 있다. 중성 염 예컨대 염화 칼륨 및 나트륨 아세테이트가 또한 핵산의 유리 표면에 대한 결합을 수득하기 위해 사용될 수 있고, 세포 용해가 필요하지 않거나 다른 수단에 의해 달성되는 경우에 (예를 들어, 세균 세포 용해의 경우에) 무질서유발 염 대신 사용될 수 있다. 중성 염을 사용하는 경우, 완충액의 이온 강도는 0.25 M 이상이어야 한다. 예시적인 용해 완충액은 pH 6.4 인 구아니디늄 티오시아네이트 (GuSCN) 완충액의 2 M 용액이다. 무질서유발 염 용액 중 용해는 또한 게놈 DNA 로부터 히스톤 단백질을 제거하고 뉴클레아제를 비활성화시킨다. 용해 완충액은 일반적으로 거의 중성 내지 약간 산성 pH 를 유지하기 위해 하나 이상의 완충제를 또한 함유할 것이다. 적합한 완충제는 나트륨 시트레이트이다. 하나 이상의 세제가 또한 포함될 수 있다. 적합한 세제의 예에는 예를 들어 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트 (TWEEN 20), t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (TRITON X-100), 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), NP-40, CTAB, CHAPS 및 사르코실이 포함된다. 알코올, 통상적으로는 에탄올이 용해 및 세척 용액 중에 포함되고, 실제 농도는 세척 중 낮아지는 염 농도를 보상하도록 선택된다. 염의 부존재 하에, 알코올은 50 % 이상의 농도로 포함되고, 최종 세척물 중 70 % 알코올이 바람직하다. 염이 시약 중에 포함되는 경우, 알코올 농도는 보통 10 % 내지 80 %, 종종 10 % 내지 60 %, 통상 20 % 내지 50 % 의 범위일 것이다. 완충액의 최적화는 당업자의 수준에 속한다. 용해는 일반적으로 세포 유형에 따라 실온 내지 약 95 ℃ 에서 수행된다. 혈액 세포는 편리하게는 실온에서 용해된다. 일반적으로 세포 용해에서 실리카 입자의 사용이 회피되는 것이 바람직한데, 이는 실리카 입자가 핵산에 결합하여 추출 공정의 효율을 감소시킬 수 있기 때문이다. 필수적이지는 않지만, 용해물을 추출 장치 내로 적재하기에 앞서 DNA 가 전단될 수 있다. DNA 의 전단 방법은 당업계에 공지되어 있다.
핵산 함유 시료는 포트 중 하나를 통해 장치 내로 도입된다. 핵산은 상기 기술된 바와 같은 염 또는 무질서유발 염의 존재 하에 유리 표면(들) 상에 포획된다. 핵산의 유리에 대한 충분한 결합은 실온 (15 ℃-30 ℃, 통상적으로는 약 20 ℃) 에서 달성되지만, 더 높은 온도가 핵산의 회수를 감소시킬 수 있음에도 불구하고 추출 공정은 더 높은 온도, 예컨대 37-42 ℃ 이하 또는 56 ℃ 이하에서 실행될 수 있다. 시료는 일정 시간 동안 장치 내에 위치해 있는 것이 허용될 수 있고, 시료 용액은 내강을 통해 전후로 펌핑될 수 있다. 그 후 세척 완충액이 연동 펌프, 흡입기 또는 피펫의 사용에 의해 하나의 포트 내로 펌핑된다. 세척 완충액의 선택은 부분적으로 시료 적재 용액의 조성에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 염 농도는 세척 공정 동안 감소될 것이고, pH 는 약간 증가될 것이다. 용해 완충액이 무질서유발 염을 함유하는 경우, 초기 세척물은 통상적으로는 또한 그 염을 동일 또는 약간 더 낮은 농도로 함유할 것이다 (예를 들어, 1-3 M GuSCN). 후속 공정에서 핵산 증폭의 억제를 최소화하기 위해, 최종 세척은 에탄올 농도를 50 % 미만으로, 바람직하게는 약 10 %-20 % 로 감소시켜야 한다. 세척 용액의 알코올 함량은 보통 20 % 내지 80 % 의 범위일 것이다. 50 % 이상의 에탄올, 바람직하게는 약 70 % 에탄올을 함유하는 세척 용액은 핵산 포획을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 특정 구현예에서 장치의 내강으로부터 최종 세척물의 완전한 제거가 또한 필요하다. 이러한 최종 세척물의 제거 방법은 1 내지 3 분 동안 공기 펌프를 사용하여 내강의 표면 위로 공기를 통과시킴으로써 건조시키는 단계를 포함한다. 세척 후, 최종 세척물보다 더 높은 pH 에서 핵산이 장치로부터 용출된다. 용출 완충액은 전형적으로는 이온 강도가 낮은 pH ≥ 8.0 인 완충액이지만, 핵산은 물에 의해 장치로부터 용출될 수 있다. 용출은 약 56 ℃ 이하의 주위 온도에서 수행될 수 있다.
장치의 디자인은 액체 및 기체를 비롯한 유체가 장치를 통해 하나의 포트로부터 다른 포트로 통과하는 것을 허용한다. 이러한 방식으로 완충액은 내강을 통해 전후로 펌핑되어 세척 및 용출 효율을 높힐 수 있고, 공기가 세척 사이에 펌핑되어 잔류 완충액을 제거할 수 있다. 시약의 도입 및 제거와 관련하여 장치는 다양한 방식으로 구성될 수 있다. 하나의 배열에서, 시약은 장치의 내강 내로 하나의 포트를 통해 도입되고, 다른 포트를 통해 제거된다. 두번째 배열에서, 하나의 포트는 시약의 입구 및 출구로서의 역할을 모두 하고, 제 2 포트는 흡입 및 압력을 제공하는 펌프에 연결된다. 이러한 두번째 배열은 펌프 및 유체 분포 제어 수단이 시약와 접촉되는 것을 방지하며, 부식성 또는 강한 용매인 시약을 사용하는 경우에 특히 유리하다. 세번째 배열은 첫번째 및 두번째 배열을 조합하여 일부 유체는 장치를 통해 하나의 포트로부터 다른 포트로 완전히 통과하고 다른 유체는 동일한 포트를 통해 도입되고 제거되도록 한다. 예를 들어, 시료를 함유하는 핵산은 제 1 포트를 통해 내강 내로 도입되고 제 2 포트를 통해 제거되고, 세척 및 용출 시약은 제 1 포트를 통해 적용된 공기 압력 및 흡입을 사용하여 제 2 포트를 통해 도입되고 제거된다. 당업자는 이러한 기초적 배열에 대한 많은 변형이 가능함을 이해할 것이다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 실제 작업 부피는 내강 부피를 비롯한 장치의 크기 뿐만 아니라, 일상적인 실험 디자인에 의해 결정될 것이다. 파스퇴르 피펫과 비슷하게 부피가 작은 장치의 경우, 부피는 보통 약 20 ㎕ 내지 약 500 ㎕ 의 범위일 것이지만, 1 ㎖ 이하 또는 2.5 ㎖ 정도의 더 큰 부피가 사용될 수 있다. 용출 완충액의 부피를 감소시킴으로써 시료가 농축될 수 있다.
추출된 핵산의 정량은 용출 완충액 내에 형광 화합물을 포함시킴으로써, 추출된 핵산이 아직 장치 내에 있는 동안 추출 공정에서 고속 질 체크를 제공함으로써 촉진된다. 즉, 본 발명의 하나의 구현예에서, 핵산은 형광 강도가 핵산의 농도에 종속적인 형광 화합물과 접촉되고, 형광 화합물의 형광이 측정된다. 형광 강도가 핵산의 농도에 종속적인 형광 화합물은 핵산의 존재시 형광 강도의 구조-종속적 변화를 나타내는 형광 화합물이다. 유용한 형광 화합물의 예에는 핵산의 존재시 강도가 증가하는 형광 화합물이 포함된다. 대표적인 형광 화합물의 예에는 형광발생 작은 홈 결합제 예컨대 비스-벤즈이미드 화합물 및 중격 형광발생 물질 예컨대 에티듐 브로미드, 및 시판 중인 형광 염료 (예를 들어, SYBR Green; Invitrogen Corp.) 가 포함된다. 형광 화합물은 용출 완충액 중 장치 내로 도입되거나 내강 내에 고정화될 수 있다. 내강 내 형광 화합물의 고정화 방법 및 유용한 형광 화합물이 [Reed 등, 미국 출원 공개 번호 20060166223 A1] 에 기술되어 있다. 내강 내 형광 화합물에 여기 에너지를 전달하고, 내강 내 화합물로부터 형광 방출 강도를 전달하기에 적합한 내강의 적어도 일부를 가짐으로써, 본 발명의 장치는 형광에 의한 내강의 검사를 허용한다.
본 발명에서 원칙적으로는 임의의 형광발생 DNA-결합 염료가 사용될 수 있음에도 불구하고, PCR 과 같은 후속 공정과 상용성인 염료를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 염료는 [Reed 등, 미국 특허 출원 공개 번호 20060166223 A1] 에 의해 개시된 비스-벤즈이미딘 (BB) 염료이며, 이는 360 nm (40 nm 슬릿 너비) 에서 여기되었을 때 강한 형광 신호를 나타낸다 (460 nm, 40 nm 필터 슬릿 너비에서 탐지). BB 염료는 dsDNA 에 대해 선택적이지만 RNA 도 탐지할 수 있다. 널리 보급된 녹색 형광 염료, SYBR 그린 (Invitrogen Corp.) 이 소위 "실시간" PCR 또는 정량적 PCR 에 종종 사용된다. BB 염료와 매우 유사하게, SYBR 그린은 추출된 DNA 를 증폭 전에 정량화하고 PCR 동안 유전자-특이적 증가를 모니터링하는데 모두 사용될 수 있다. NASBA 와 같은 등온 핵산 시험에 있어서의 형광발생 DNA 염료 또는 DNA 탐침의 사용이 또한 공지되어 있다.
바람직한 비스-벤즈이미딘 염료는 일부 DNA-결합 염료만큼 민감하지는 않지만, DNA-풍부 전혈로부터의 추출 이후 시료의 게놈 DNA 함량을 측정하는데 매우 적합한 것으로 밝혀졌다. 작은 홈-결합 BB 염료는 이중 가닥 DNA 의 존재시 청색 형광을 방출하고, PCR 증폭 완충액에 직접 첨가될 수 있다. 대조적으로, PICOGREEN (Invitrogen) 과 같은 강한 결합 DNA 염료는 PCR 을 억제할 수 있다.
예비 증거는 더 높은 어닐링 온도 (61.5 ℃ 대 60 ℃) 에서 PCR 프라이머 연장이 수행되는 경우 기존의 PCR 분석에 BB 염료가 사용될 수 있음을 시사한다. 그러므로 용출 완충액 중 BB 염료를 직접적으로 포함시킴으로써 유전자-특이적 증폭 이전, 동안 및 이후 DNA 를 측정할 수 있다. BB 염료의 첨가와 함께 요구되는 더 높은 프라이머 연장 온도는 PCR 분석에서 유리할 수 있다 (PCR 인핸서로서 작용함). MGB TaqMan 시스템 (미국 특허 번호 6,727,356) 과 매우 유사하게, A/T 풍부 프라이머/표적 상호작용은 PCR 믹스 중 BB 에 의해 안정화되고, 증가된 이중 안정성은 더 짧은 (더욱 특이적인) DNA 탐침이 사용될 수 있게 한다. 청색 방출 MGB 염료는 아마도 2-색 형광발생 DNA 탐침과 함께 널리 사용되는 녹색 내지 적색 형광 파장을 간섭하지 않을 것이다.
Ribogreen (Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 9th edition, Chapter 8 참조) 과 같은 RNA-선택성 염료가 또한 장치 또는 용출 완충액에 사용될 수 있다. RNA-선택성 염료는 NASBA 와 같은 실시간 RNA 분석에 유리할 수 있다. 유전자-특이적 DNA 또는 RNA 시험의 억제에 대해 상기 기술된 경고는 RNA 탐지 형광발생 염료에도 적용된다.
원하는 경우, 장치는 세척에 의해 잔류 핵산 및/또는 시약을 제거한 후 재사용될 수 있다. 많은 경우에, 여러 (전형적으로는 5-10) 채널 부피의 증류된 멸균수를 내강을 통해 흘려보냄으로써 충분한 세척이 달성될 수 있다. 바람직한 방법에서, 장치는 먼저 5-10 채널 부피의 증류된 멸균수로, 그 후 2-3 채널 부피의 70 % EtOH 로 세척되고, 그 뒤에 또다른 2-3 채널 부피의 증류된 멸균수로 세척된다. 세척 용액은 펌프 (예를 들어, 연동 펌프), 흡입기 등을 사용하여 장치를 통해 펌핑될 수 있다. 세척 프로토콜은 자동화된 펌프를 사용하여 다기관을 통해 수행될 수 있다.
결합된 핵산은 장치 내에 저장되어, 시험 결과의 확인을 비롯한 후속 시험에 사용될 수 있다. 장치는 에탄올-풍부 린스로 헹구어지고 건조된다. 저장은 실온에서 수일 동안 또는 냉동기에서 더 긴 기간 동안 이루어진다.
본 발명은 밀봉된 용기 중 완충액 및 상기 기술된 바와 같은 핵산 추출 장치를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 완충액은 본원에서 일반적으로 기술된 바와 같은 용출 완충액, 세척 완충액 또는 용해 완충액일 수 있다. 보통, 장치는 생체 시료로부터 핵산을 추출하기 위한 하나 이상의 완충액, 통상적으로는 완전한 세트의 완충액과 함께 포장될 것이다. 일부 적용의 경우, 용출 완충액은 핵산의 존재시 형광 강도의 변화를 나타내는 형광 화합물을 포함할 것이다. 전형적인 키트는 상기 구성요소들을 단일한 포장 내에, 한 세트의 인쇄된 사용 지침과 함께 포함한다.
본 발명은 실험실 연구, 인간의학 및 수의학, 공중 보건 및 위생, 법의학, 인류학 연구, 환경 감시 및 산업에서 다양하게 적용된다. 이러한 적용의 예에는 세균 및 바이러스 탐지 및 분류, 미생물 약물 내성 스크리닝, 바이러스 농도 분석, 유전자형 검사, 감염 통제 및 병원체 스크리닝 (예를 들어, 혈액, 조직, 음식, 화장품, 물, 토양 및 공기의), 게놈약학, 혈장 중 무세포 DNA 의 탐지, 백혈구 계수, 및 생체 시료로부터의 DNA 의 분석 및 제조가 관심의 대상이 되는 다른 분야가 제한없이 포함된다. 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 추출된 핵산은 증폭, 혼성화, 블롯팅 및 그의 조합을 비롯한 다양한 후속 공정에서 용이하게 사용된다. 본 발명의 장치 및 방법은 현장 진단 분석시 질병 병원체를 식별하는데 사용될 수 있고, 유전자 스크리닝에 사용될 수 있다. 이러한 장치 및 방법은 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 돼지 등과 같은 가축 및 반려 동물을 비롯한 동물의 진단 및 치료를 위한 수의학에서 또한 사용될 수 있다.
핵산은 광범위하게 다양한 공급원으로부터 추출될 수 있다. 연구 및 의학적 적용의 경우, 적합한 공급원의 예에는 가래, 타액, 인후 면봉채취물, 구강 세정물, 비강인두 면봉채취물, 비강인두 흡입물, 코 면봉채취물, 코 세정물, 점액, 기관지 흡입물, 세기관지 세척액, 흉수, 기관내 흡입물, 뇌척수액, 대변, 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 제대 혈액, 혈액 구성요소 (예를 들어, 혈소판 농축물), 혈액 배양물, 말초혈액 단핵 세포, 말초혈액 백혈구, 혈장 용해물, 백혈구 용해물, 연막 백혈구, 항문 면봉채취물, 직장 면봉채취물, 질 면봉채취물, 자궁경내막 면봉채취물, 정액, 생검 시료, 림프 조직 (예를 들어, 편도, 림프절), 골수, 다른 조직 시료, 세균 단리물, 유리체액, 양수, 모유 및 세포 배앙 상청액이 제한없이 포함된다. 핵산의 추출을 위한 다른 시작 물질의 예에는 물 시료, 공기 시료, 점토 시료, 화장품, 음식 및 음식 성분, 의약 용품 및 장비 등이 포함된다.
본 발명의 방법 및 조립체는 조각 DNA 의 추출 및 분석을 위해 사용될 수 있다. DNA 는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대 뉴클레아제 소화 (예컨대 제한 엔도뉴클레아제 및 DNases 에 의한 소화), 음파처리, 열, 기계적 파열 (예컨대 전단 또는 볼텍싱 (vortexing) 에 의함) 및 화학적 처리에 의해 파쇄될 수 있다. 적용가능한 화학적 처리에는 예를 들어 금속 이온 예컨대 철 (Zhang 등, Nucl. Acids Res. 29(13):e66, 2001), 산화제 예컨대 비설파이트 (Ehrich 등, Nucl. Acids Res. 35(5):e29, 2007), 및 항생제 및 약물 예컨대 블레오마이신 (Chen 등, Nucl. Acids Res. 36(11):3781-3790, 2008) 의 사용이 포함된다. 조각 DNA 의 제제는 다양한 크기의 조각을 함유할 수 있거나 크기 범위가 비교적 제한될 수 있다. 당업자는 선택된 파쇄 방법 및 사용된 조건 (예를 들어, 처리 시간) 과 같은 인자에 의해 조각의 실제 크기가 결정될 것임을 이해할 것이다.
본 발명에 따라 제조된 핵산은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (예를 들어, Mullis, 미국 특허 번호 4,683,202 참조) 및 등온 증폭 방법을 비롯한 당업계에 공지된 방법에 의해 증폭될 수 있다. 실시간 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 이 통상적으로 사용된다. 예를 들어, [Cockerill, Arch. Pathol. Lab. Med. 127:1112-1120, 2002]; 및 [Cockerill and Uhl, "Applications and challenges of real-time PCR for the clinical microbiology laboratory," pp. 3-27 in Reischl et al, eds., Rapid cycle real-time PCR methods and applications, Springer-Verlag, Berlin, 2002] 참조. 임상 미생물학에 있어서 RT-PCR 사용의 검토에 대해 [Espy 등, Clin. Microbiol. Rev. 19:165-256, 2006] 참조. PCR 을 수행하기 위한 기구 및 화학물질이 시판 중이다. 기구의 예에는 열 순환기 (예를 들어, ABI7000, 7300, 7500, 7700 및 7900, Applied Biosystems, Foster City, CA; LIGHTCYCLER, Roche Applied Science, Indianapolis, IN; SMARTCYCLER, Cepheid, Sunnyvale, CA; ICYCLER, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA; ROBOCYCLER and MX3000P, Stratagene, La Jolla, CA), 형광 탐침과 함께 사용하는 탐지 시스템 (예를 들어, MYIQ 및 CHROMO4, Bio-Rad Laboratories, Inc.), 핵산 분석기 (예를 들어, Rotor-Gene 6000, Corbett Life Science, Concorde, NSW, Australia), 및 증폭 및 탐지 시스템 (예를 들어, BD PROBETEC ET, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 이 포함된다. 다른 PCR 기술의 예에는 정량적 PCR 용 형광 염료 (예를 들어, SYBR, Invitrogen Corp.) 및 형광발생 탐침, 예컨대 FRET (fluorescent resonance energy transfer, 형광 공명 에너지 전달) 혼성화 탐침 (Walker, Science 296:551-559, 2002), TAQMAN 탐침 (Applied Biosystems, Foster City, CA; Kutyavin 등, Nucl. Acids. Res. 28:655-661, 2000 참조), ECLIPSE 탐침 (Nanogen, Bothell WA) 및 분자 비콘 (미국 특허 번호 5,925,517 및 6,150,097) 이 포함된다. 당업계에 공지된 등온 증폭 방법의 예에는 핵산 서열-기재 증폭 (NASBA) (Malek 등, 미국 특허 번호 5,130,238; Compton, Nature 350:91-92, 1991; Deiman 등, Mol. Biotechnol. 20:163-179, 2002), 분지형 DNA (Alter 등, J. Viral Hepat. 2:121-132, 1995; Erice 등, J. Clin. Microbiol. 38:2837-2845, 2000), 전사 매개 증폭 (Hill, Expert. Rev. Mol. Diagn. 1:445-455, 2001), 가닥 배치 증폭 (Walker, PCR Methods and Applications 3:1-6, 1993; Spargo 등, Mol. Cell Probes 10:241-256, 1996), 헬리카제-종속적 증폭 (Vincent 등, EMBO Rep. 5:795-800, 2004), 루프-매개 등온 증폭 (Notomi 등, Nucl. Acids Res. 28:E63, 2000), INVADER 분석 (Olivier 등, Nucl. Acids Res. 30:e53, 2002; Ledford 등, J. Mol. Diagn. 2:97-104, 2000), 순환 탐침 기술 (Duck 등, BioTechniques 9:142-148, 1990; Cloney 등, Mol. Cell Probes 13:191-197, 1999), 회전 고리 증폭 (Fire and Xu, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92:4641-4645, 1995; Liu 등, J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594, 1996), 및 Q-beta 레플리카제 (Shah 등, J. Clin. Microbiol. 32:2718-2724, 1994; Shah 등, J. Clin. Microbiol. 33:1435-1441, 1995) 가 포함된다. 등온 증폭 방법의 검토에 대해, [Gill 및 Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 27:224-243, 2008] 참조.
NASBA 는 표적 핵산 서열을 증폭하기 위해 3 가지 핵산의 협동 작용에 의존한다. NASBA 는 이중 가닥 DNA 를 증폭할 수 있지만, RNA 의 증폭에 특히 적합하다. 표적 RNA 는 제 1 프라이머에 대한 결합에 의해 사이클에 진입한 후, 역전사효소에 의해 연장되어 DNA/RNA 하이브리드를 형성한다. RNase H 의 작용에 의해 RNA 가닥이 제거되어 단일 가닥 cDNA 를 산출한다. 이 cDNA 는 제 2 프라이머 (T7 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함함) 에 결합한 후 역전사효소 활성의 작용에 의해 이중 가닥 중간체를 형성할 수 있다. 그 후 중간체가 T7 RNA 중합효소의 작용에 의해 복수의 단일 가닥 RNA 카피 (주형 1 카피 당 10-1000 카피) 로 복사된다. 그 후 이러한 RNA 카피가 사이클에 진입하여 자립 방식으로 더 많은 카피를 계속 생성할 수 있다. NASBA 메카니즘에 기초하여, 하기 2 개의 산물이 탐지될 수 있다: 이중 가닥 DNA 중간체 및 단일 가닥 RNA 산물.
NASBA 는 등온성이므로 (즉, 온도 순환이 필요하지 않으므로) 본 발명의 장치와 함께 편리하게 사용된다. DNA 표적이 선택되는 경우를 제외하고는 변성 단계가 필요하지 않다. 본 발명의 장치에서 NASBA 를 수행하는 경우에 2 가지 고려사항은 열 전달 및 단백질 흡착이다. 반응 온도는 30 ℃ 내지 50 ℃ 범위 내, 보통 37 ℃ 이상, 프라이머 결합이 더욱 특이적인 경우 바람직하게는 42 ℃ 이어야 한다. 실온은 NASBA 를 지지하지 않으므로, 채널 온도는 효율적으로 상승되어야 하며, 그렇지 않은 경우 반응이 이루어지지 않을 것이다. 또한, NASBA 효소와 같은 단백질은 유리 및 일부 유기 중합체성 물질에 쉽게 들러붙어서, 이들을 비활성화시키고 NASBA 사이클을 중단시킬 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위한 2 가지 방법은 하기와 같다: (1) 혈청 알부민과 같은 담체로 유리를 미리 흡착시킴, 또는 (2) 충분한 혈청 알부민을 NASBA 반응 혼합물에 첨가하여 효소의 손실을 최소화함.
부가적인 핵산 증폭 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에 따라 제조된 DNA 에 적용될 수 있다. 이러한 방법의 예에는 리가제 연쇄 반응 (Wu 및 Wallace, Genomics 4:560-569, 1989; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193, 1991), 중합효소 리가제 연쇄 반응 (Garany, PCR Methods and Applic. 1:5-16, 1991), 갭 리가제 연쇄 반응 (Segev, WO 90/01069), 복구 연쇄 반응 (Backman 등, 미국 특허 번호 5,792,607) 및 회전 고리 증폭 (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12:75-99, 1999) 이 포함된다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 핵산은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 증폭 없이 탐지 및/또는 분석될 수도 있다. 적합한 방법의 예에는 형광 또는 면역분석과 결합될 수 있는 혼성화, 예컨대 올리고뉴클레오티드-나노입자 접합체로의 혼성화 (Park 등, 미국 특허 번호 7,169,556) 및 DNA 바코드 (Mirkin 등, 미국 출원 공개 번호 20060040286 A1); 혼성화, 진단, 유전자 식별, 다형 분석 및 핵산 서열분석에 의한 발현 프로파일링에 사용될 수 있는 마이크로어레이 기술; 혼성화 보호 분석 (Arnold 등, Clin. Chem. 35:1588-1594, 1989); 이중 역동 분석 (예를 들어, APTIMA COMBO 2 분석, Gen-Probe Incorporated); 및 서열분석, 예컨대 마이크로서열분석 (예를 들어, MICROSEQ 500 16s rDNA 세균 식별 키트, Applied Biosystems) 이 제한없이 포함된다. 다형 탐지 방법의 예에는 고도 병렬 샷건 서열분석 (Nature 437:326-321, 2005) 이 포함되며, 이는 무세포 핵산의 이전에 알려지지 않은 특성 예컨대 혈장 mRNA 분포 및/또는 혈장 DNA 의 메틸화 및 히스톤 변형을 탐지할 수 있다 (Fan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:16266-16271, 2005). 당업자는 상기 및 다른 방법이 핵산 증폭과 조합되어 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
상기 기술된 바와 같이, 추출된 핵산은 세균, 진균 및 기생충을 비롯한 병원체를 탐지하는 방법에 사용될 수 있다. 또한, 추출된 핵산이 분석되어 감염성 물질의 약물 내성 및 약물 감수성 (예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylocccus aureus) 의 메티실린 또는 다른 항생제 내성) 을 특징지울 수 있다. 많은 그러한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 다수의 그러한 시험이 미국 식품 의약 안전청에 의해 인간 진단용으로 승인되었고 시판 중이다. 예를 들어, 하기 표 1 은 클라미디아 (Chlamydia) 에 대해 FDA 승인된 시험의 목록이다. 부가적인 시험이 하기 표 2 에 열거되어 있다. 그에 대한 핵산-기재 시험이 공지되어 있는 다른 병원체의 예에는 혈액매개 병원체, 코치디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis), 크립토코쿠스 (Cryptococcus), 가르드네렐라 바기날리스 (Gardnerella vaginalis), 해모필루스 에스피피.(Haemophilus spp.), 히스토플라스마 캅술라툼 (Histoplasma capsulatum), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 마이코플라스마 spp. (Mycoplasma spp.), 살모넬라 spp. (Salmonella spp.), 시겔라 spp. (Shigella spp.) 및 트리코모나스 바길나리스 (Trichomonas vaginalis) 가 포함된다. 음식 및 다른 제품의 시료 중 세균, 바이러스, 진균 및 기생충을 비롯한 미생물 오염체의 PCR 에 의한 탐지 방법은 예를 들어 [Romick 등, 미국 특허 번호 6,468,743 B1] 에 의해 개시되어 있다. 엔테로코쿠스 (Enterococcus) 종에 대한 물 시료의 시험에 있어서의 PCR 의 사용이 [Frahm 및 Obst, J. Microbiol. Methods 52:123-131, 2003] 에 의해 개시되어 있다.
표 1
Figure pct00001
표 2
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
바이러스의 탐지 및 진단을 위한 시험이 또한 당업계에 공지되어 있다. 이러한 시험의 예가 하기 표 3 에 나타나 있다.
표 3
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
진균 병원체의 탐지 및 진단을 위한 시험의 예가 하기 표 4 에 나타나 있다.
표 4
Figure pct00008
기생충의 탐지 및 진단을 위한 공지된 시험의 예가 하기 표 5 에 나타나 있다.
표 5
Figure pct00009
본 발명에 따라 제조된 DNA 는 또한 유전형분석, 예컨대 출생전 분석, 질병 소인의 예측 (예를 들어, 고혈압, 골다공증, 조기 발병 알츠하이머병, 유형 I 당뇨병 및 심혈관 질환), 독성학, 약물 효능 연구 및 대사 연구에 사용될 수 있다. 예에는 복강 질환, 낭성 섬유증, HLA-B27, 기면증 및 타이-삭스 질환 (Kimball Genetics Inc., Denver, CO) 에 대한 시험이 포함된다. 약물 효능 또는 투여량을 예측하기 위한 시험에는 예를 들어, ACE 억제제 반응자 분석, 약물 대사의 속도에 영향을 미치는 CYP2D6 & CYP2C19 유전자의 DNA 다형에 대한 스크니링, 타목시펜 대사에 영향을 미치는 유전자에 대한 스크리닝, 및 이리노테칸 투여량에 대한 유전적 스크리닝이 포함된다. 단일 뉴클레오티드 다형 (SNP) 의 유전형분석은 PCR-기반 분석을 사용하는 [Hsu 등, Clin. Chem. 47:1373-1377, 2001] 및 마이크로어레이 플랫폼을 사용하는 [Bao 등, Nucl. Acids Res. 33(2):el5, 2005] 에 의해 개시되어 있다. SNP 는 복합 유전 장애, 약물 반응 및 기타 유전 형질을 진단할 수 있다. 암 치료를 안내하는데 사용되는 시험의 예에는 그것의 발현 수준을 포함하는, BRCA-1, BRC A-2 및 Her-2/Neu 에 대한 시험이 포함된다. Min 등 (Cancer Research 58:4581-4584, 1998) 은 종양 마커의 발현에 대한 전초 림프절의 RT-PCR 에 의한 스크리닝 방법을 개시한다. 핵산 기술을 사용하는 다른 암 마커의 식별이 연구 중에 있다. 부가적인 유전적 시험이 하기 표 6 에 나타나 있다.
표 6
Figure pct00010
Figure pct00011
본 발명은 또한 혈장 중 무세포 DNA 를 탐지하는데 사용될 수 있다. 무세포 게놈 DNA 의 증가된 농도는 전신 홍반 루푸스, 폐색전증 및 암의 징후일 수 있다. 모체 혈장 또는 혈청 중 태아 DNA 는 성별 및 레서스 상태의 확인, 특정 혈색소병증의 탐지, 및 잠재적 제대혈 기증을 위한 태아 HLA 상태의 확인에 사용될 수 있다. 예를 들어, [Reed 등, Bone Marrow Transplantation 29:527-529, 2002] 참조. 순환성 태아 DNA 의 비정상적인 고농도는 태아의 21번 삼염색체증 (Lo 등, Clin. Chem. 45:1747-1751, 1999) 및 자간전증 (Levine 등, Am. J. Obstet. Gynecol. 190:707-713, 2004) 과 관련되었다. 모체 혈장 및 혈청 중 태아 DNA 의 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, [Lo 등, Lancet 350:485-487, 1997] 및 [Lo 등, Am. J. Hum. Genet. 62:768-775, 1998] 참조. 특히 유용한 적용은 태아 레서스 D 상태를 확인하기 위해 모체 혈장을 사용하는 태아 DNA 유전형분석의 이용이다 (Muller 등, Transfusion 48: 2292-2301, 2008).
본 발명에 따라 제조된 DNA 는 또한 혈소판 농축물 중 잔류 백혈구 세포 또는 WBC 조각의 RT-PCR 에 의한 정량에 사용될 수 있다. 예를 들어, [Lee 등, Transfusion 42:87-93, 2002]; [Mohammadi 등, Transfusion 44:1314-1318, 2004]; 및 [Dijkstra-Tiekstra 등, Vox Sanguinis 87:250-256, 2004] 참조.
본 발명은 또한 질환 스크리닝 및 진단을 비롯한 수의학에 적용될 수 있다. 예를 들어, 호주에 수입된 말은 PCR 에 의해 에퀸 인플루엔자 (equine influenza) 에 대해 시험되어야 한다. 에퀸 인플루엔자는 개에게 전염될 수 있다 (Crawford 등, Science 310:482-485, 2005).
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1
DNA 의 정제를 위해 평활, 굴곡 유리 표면을 사용하는 것의 실행가능성을 파스퇴르 피펫의 내부 표면을 사용하여 시험했다. 10 ㎕ 프로테이나제 K (10 ㎎/㎖), 200 ㎕ 전혈, 및 200 ㎕ 의 용해 완충액 (6 M 구아니딘 HCl, 2O mM EDTA, 5O mM 시트르산 pH 6.0, 10 % Tween-20, 3 % Triton X-100) 을 혼합하여 혈액 용해물을 제조했다. 15 분 후, 200 ㎕ 의 100 % 에탄올을 첨가했다. 그 후 용해물을 파스퇴르 피펫 내로 빨아들이고 약 15 분 동안 놔뒀다. 그 후 용해물을 배출시켰다. 그 후 피펫을 세척 1 (2 M 구아니딘 HCl, 7 mM EDTA, 17 mM 시트르산 pH 6.0, 33 % 에탄올) 로 3 회, 세척 2 (2O mM Tris pH 7.0, 70 % 에탄올) 로 4 회 세척했다. 과량의 에탄올을 진공 하에 30 분 동안 건조 제거했다. 200 ㎕ TE (1O mM Tris 1 mM EDTA pH 8.0) 를 각각 사용하여 3 회 연속적 용출로 결합된 DNA 를 유리 표면으로부터 용출시켰다. 2 ㎕ 의 각각의 용출물을 시판중인 분석 (PICOGREEN 분석; Invitrogen) 을 사용하여 정량했다.
정제를 3 회 수행하고, 편평한 유리 핵산 포획 표면 (S-채널 카드 B0023; Reed 등, 미국 출원 공개 번호 20090215125 A1 참조) 을 포함하는 장치와 또한 3 회 비교했다. 정량의 결과가 표 7 에 나타나 있다.
표 7
Figure pct00012
이 실험에서, 첫번째 용출시 S-채널 카드는 200 ㎕ 의 혈액으로부터 오직 약 9 ng 의 DNA 를 회수했다. 대조적으로, 피펫은 더 많은 DNA (샘플 1 및 3) 를 단리했다. 시료 2 는 정량에서 제외했다. 이에 대한 이유는 밝혀지지 않았다. 피펫 및 S-채널 카드의 총 표면적이 측정되지 않았지만, 피펫이 DNA 를 정제하는데 더 효과적인 것으로 보인다.
단리된 DNA 의 기능을 시험하기 위해, PCR 을 인간 GAPDH 에 대한 프라이머를 사용하여 수행했다. PCR 반응 (50-㎕ 부피) 을 1O mM Tris pH 8.0, 5O mM KCl, 3 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 1 μM 의 각각의 프라이머, 0.2 유닛 Taq 중합효소 (New England Biolabs), 및 5 ㎕ 미희석 시료를 함유하는 혼합물에서 수행했다. 프라이머는 G3001 (GAGATCCCTCCAAAATCAAG; SEQ ID NO:1) 및 G3002 (CAAAGTTGTCATGGATGACC; SEQ ID NO:2) 였다. 열순환 프로파일은 총 35 사이클에 대해 94 ℃ 에서 1 분, 54 ℃ 에서 1 분, 및 72 ℃ 에서 1 분이었다. 7.5 ㎕ 의 각각의 반응물을 2 ㎕ 의 시료 완충액 (New England Biolabs) 과 혼합하고 1×TAE (4O mM Tris-아세테이트 pH 8.3, 1 ㎜ EDTA) 및 2 ㎍/㎖ 에티듐 브로미드 중 2 % 아가로스 겔 상에서 영동시켰다. 밴드를 단파 UV 광 하에서 시각화하고 촬영했다.
PCR 산물의 겔 분석이 도 5 에 나타나 있다. "M" 으로 표시된 레인은 전기영동 이동도 마커를 함유한다. "(-)" 및 "(+)" 레인은 각각 주형 미첨가 대조군 및 10 ng 의 인간 DNA (Sigma-Aldrich) 를 첨가한 양성 대조군을 나타내는 PCR 대조군이다. B0023 은 S-채널 정제된 DNA 를 나타낸다. 다음 9 개의 레인들은 첫번째, 두번째 및 세번째 용출물로부터 피펫-단리된 DNA 이다. 파스퇴르 피펫으로부터 단리된 모든 DNA 를 매우 효율적으로 증폭시켰다.
상기 결과는 평활, 굴곡 유리 표면이 복합 생체 시료 (혈액) 로부터의 DNA 에 적합한 단리 매체임을 증명한다. DNA 는 양호한 수율로 단리될 수 있고, PCR 에서 매우 효과적으로 증폭될 수 있다.
실시예 2
유리 파스퇴르 피펫 및 유리 슬라이드 (1" × 3" 및 2" × 3") 를 DNA 에 결합하는 능력에 대해 비교했다. 사용된 완충액은 실시예 1 에서 기술되 바와 같았다. 모든 경우에 시료는 0.6 ㎖ 결합 완충액 (0.2 ㎖ 용해 완충액 + 0.2 ㎖ 물 + 0.2 ㎖ 알코올 + DNA) 중 DNA (500 ng 또는 1000 ng) 였다. DNA 시료를 유리 슬라이드 위에 놓고, 30 분 동안 놔뒀다. 그 후 슬라이드를 세척 1 로 3 회 세척 2 로 6 회 세척했다. 세척한 슬라이드를 밤새 공기 건조시켰다. 결합된 DNA 를 TE 완충액의 3 개의 0.2-㎖ 분취물로 용출시켰다.
피펫의 경우, 0.6 ㎖ 의 시료를 피펫 내로 빨아들이고, 피펫의 상부를 밀봉하여 시료를 제자리에 유지시켰다. 피펫의 넓은 부분을 내강의 넓은 부분 안으로, 내강의 테이퍼형 부분 위로 약 1.8 ㎝ 까지 넣었다. 또한 액체를 내강의 좁은 부분 안으로 6 ㎝ 에 위치시켰다. 30 분 후, 결합 혼합물을 배출시키고, 피펫 안으로 세척 1 을 3 회, 세척 2 를 6 회 빨아들임으로써 피펫을 세척했다. 피펫을 밤새 공기 건조시켰다. 결합된 DNA 를 용출하기 위해, 0.2 ㎖ TE 를 피펫 안으로 빨아들여서 내부 표면을 헹군 후, 배출시켰다. 잠시 동안 피펫으로부터 액체를 배출시켜, 내부 표면 위에 형성된 TE 의 막을 수집했다. 용출을 2 회 더 반복했다.
피펫의 표면적을 대단부의 외경 0.696 ㎝ 및 소단부의 외경 0.123 ㎝ 를 사용하여 추정했다. 표면적을 하기 식으로부터 계산했다: 표면적 = 2 × Pi × 반경 × 높이 (또는 Pi × 직경 × 높이). 계산을 목적으로, 테이퍼의 절반은 넓은 직경의 단면에, 절반은 좁은 직경의 단면에 포함시켰다. 피펫의 대단부 및 소단부 중 액체로 덮힌 면적을 계산하고, 더하여 액체 (결합 믹스) 로 덮힌 총 면적을 계산했다. 계산된 면적은 6.2 ㎠ 였지만, 실제 내부 표면적은 다소 좁을 것으로 예상될 것이다.
DNA 수율을 슬라이드 또는 피펫의 표면적에 대해 표준화했다. 결과가 표 8 에 나타나 있다.
표 8
Figure pct00013
결과는 표면적에 대해 표준화된 경우 피펫이 유리 슬라이드보다 DNA 를 단리하는데 있어서 약 2 배 더 효과적이었음을 시사했다. 상기 기술된 바와 같이, 피펫의 내부 표면적은 과대추정되었던 것으로 여겨지며, 따라서 실제 결합 용량은 더 컸을 것이다. 피펫이 백분 수율은 더 낮았으나, 더 좁은 표면적으로 인해 효율은 더 높았다.
실시예 3
20 ㎕ 프로테이나제 K 를 200 ㎕ 전혈과 혼합했다. 200 ㎕ 용해 시약 (28.7 g 구아니딘 히드로클로리드, 25 ㎖ 0.1 M 나트륨 시트레이트 pH 6.5, 2.5 ㎖ 0.2 M EDTA, 1 ㎖ TRITON X-100, 3 ㎖ TWEEN-20) 을 첨가했다. 용액을 잘 혼합하고 56 ℃ 에서 15 분 동안 인큐베이션했다. 그 후 용액을 냉각시키고, 200 ㎕ 에탄올을 첨가했다. 관의 내용물을 혼합하고, 관을 원심분리하여 응축물을 스핀 다운시켰다.
하나의 포트에 연결된 흡입기를 사용하여, 전체 시료를 서서히 추출 장치 내로 적재했다. 시료를 장치를 통해 흐르게 한 후, 내강을 세척 완충액 1 (동등 부피의 물 및 100 % 에탄올로 희석된 세제 없는 용해 완충액) 로 채웠다. 완충액을 제거하고, 세척을 반복했다. 그 후 내강을 세척 완충액 2 (50 부 세척 2 농축물 (5N HCl 에 의해 pH 7.4 로 조정된, 10 ㎖ 1 M Tris, 5 ㎖ 0.5 M EDTA 및 2.93 g NaCl) 을 30 부 물 및 20 부 100 % 에탄올과 혼합하여 제조함) 로 채우고, 완충액을 30 초 내지 12 분 동안 가만히 놔둔 후, 완전히 제거했다. 이러한 세척을 2 회 반복했다. 그 후 장치를 약간 전후로 요동시켜 세척 2 의 임의의 흡착 방울을 수집하고, 이를 흡입기로 제거했다.
결합된 DNA 를 용출하기 위해, 75 - 100 ㎕ 의 TE (1O mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA) 를 장치 내로 적재하고, 내강을 통해 내강의 먼 단부로, 그 후 뒤로 서서히 흐르게 했다. 이 용출액을 정량을 위해 수집했다.
실시예 4
혈액으로부터 RNA 를 정제하기 위해, 시판 중인 완충액 (Qiagen, Inc.) 을 사용했다. 5 부피의 적혈구 용해 용액 (Buffer EL) 을 전혈의 시료에 첨가했다. 이 용액은 적혈구는 용해하고 RNA-함유 백혈구는 온전하게 놔뒀다. 그 후 백혈구를 원심분리하여 펠렛이 되게 했다. 1 회의 부가적 세척으로 적혈구 오염물을 제거하고, 백혈구를 완충액 RLT (구아니딘 티오시아네이트를 함유함) 에서 용해했다. 순수한 에탄올을 용해물에 첨가한 후, 이를 관형 추출 장치 내로 주입했다. 장치를 20 분 동안 그대로 두어서 RNA 가 유리에 흡착되게 했다. 흡착 후, 내강을 완충액 RW1 및 완충액 RPE (에탄올을 함유함) 로 헹궜다. RNA 를 내강으로부터 멸균수로 용출시켰다.
상기로부터, 본 발명의 구체적 구현예가 본원에서 설명을 목적으로 기술되었지만, 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 만들어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항에 의한 경우를 제외하고는 제한되지 않는다.
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Claims (29)

  1. 하기 단계를 포함하는, 생체 시료로부터의 핵산의 추출 방법:
    내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하는 장치를 제공하는 단계로서, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 단계;
    핵산 함유 시료를 제 1 포트 및 제 2 포트 중 하나를 통해 장치의 내강 내로 도입하는 단계;
    시료 중 핵산이 미개질 평활 유리 표면에 결합되는 것을 허용하여 결합된 핵산을 생성하는 단계; 및
    결합된 핵산을 세척하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 세척 단계 후, 미개질 평활 유리 표면으로부터 결합된 핵산을 용출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 용출된 핵산을 증폭시키는 부가적 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 증폭 단계가 등온 증폭을 포함하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 용출된 핵산이 상기 제 1 포트 및 제 2 포트 중 하나를 통해 내강으로부터 제거되는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 결합된 핵산이 핵산의 존재시 형광 강도의 변화를 나타내는 형광 화합물을 함유하는 완충액으로 용출되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 내강이 세로 축으로 선형 내강인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 내강의 적어도 일부가 세로 축을 따라 테이퍼형인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 내강이 사행형인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 내강이 나선형인 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 외부 표면이 세로 이랑을 포함하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 장치가 내강 내에 내부 요소를 포함하고, 내부 요소가 단면이 볼록한 미개질 평활 유리 표면을 포함하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 세포 시료를 용해하여 핵산 함유 시료를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 핵산 함유 시료가 무질서유발 염을 포함하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 핵산 함유 시료가 동물 핵산을 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 동물 핵산이 인간 핵산인 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 핵산이 미생물 핵산인 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 핵산이 DNA 인 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 핵산이 도입 단계 전에 파쇄되는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 내강의 적어도 일부를 통한 액체의 흐름이 난류인 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 세척 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    세척 시약을 상기 제 1 포트 및 제 2 포트 중 하나를 통해 장치의 내강 내로 도입하는 단계;
    결합된 핵산과 세척 시약이 접촉되는 것을 허용하는 단계; 및
    세척 시약을 상기 제 1 포트 및 제 2 포트 중 하나를 통해 내강으로부터 제거하는 단계.
  22. 하기를 포함하는 조립체:
    내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하는 장치로서, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 장치; 및
    장치의 내강과 유체 소통하는 펌프.
  23. 제 22 항에 있어서, 펌프가 장치의 제 2 포트에 연결되어 있는 조립체.
  24. 제 23 항에 있어서, 펌프가 다기관을 통해 장치의 제 2 포트에 연결되어 있는 조립체.
  25. 제 22 항에 있어서, 펌프와 유체 소통하는 유체 분포 제어 수단을 추가로 포함하는 조립체.
  26. 하기를 포함하는 조립체:
    복수의 장치로서, 각각의 장치는 내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하고, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 장치;
    복수의 연결기를 포함하는 다기관으로서, 각각의 연결기가 장치 중 하나를 수용하고 포트 중 하나를 통해 내강 내로의 유체 경로를 제공하도록 조정된 다기관; 및
    다기관과 유체 소통하는 펌프, 이 경우 상기 복수의 장치 각각은 다기관의 연결기에 결합됨.
  27. 하기를 포함하는 키트:
    내부 표면, 외부 표면, 제 1 포트 및 제 2 포트를 포함하는 장치로서, 내부 표면은 미개질 평활 유리로 이루어지며, 제 1 포트와 제 2 포트 사이의 유체 소통을 제공하는 관형 내강을 한정하고, 내강은 단면이 원형, 달걀형 또는 타원형이고, 내강에는 핵산-특이적 결합 자리가 본질적으로 부존재하는 장치; 및
    밀봉된 용기 내의 완충액으로서, 용해 완충액, 세척 완충액 또는 용출 완충액인 완충액.
  28. 제 27 항에 있어서, 완충액이 핵산의 존재시 형광 강도의 변화를 나타내는 형광 화합물을 포함하는 용출 완충액인 키트.
  29. 제 28 항에 있어서, 화합물이 비스-벤즈이미딘 화합물인 키트.


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