DE69534886T2

DE69534886T2 - Verfahren zur Isolierung von Zellkomponenten

Info

Publication number: DE69534886T2
Application number: DE69534886T
Authority: DE
Inventors: Vincent A. West Hempstead Fischetti; Ambrose Hanover Cheung
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1994-04-14
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2015-04-14
Also published as: EP0755401B1; JP3784829B2; DE69528256T2; EP0755401A1; JPH10501685A; DE69534886D1; JP3928973B2; JP2006115862A; EP1219707A2; WO1995028409A1; JP2005224248A; DE69528256D1; EP1219707B1; EP1219707A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolierung von Zellbestandteilen aus natürlichen ZelLquellen, wie zum Beispiel Ribonukleinsäure (RNA).
Beschreibung des Standes der Technik
Zellen enthalten eine große Vielfalt von Zellbestandteilen, die für ihre Funktion geeignet sind. Sie enthalten zum Beispiel DNA, Ribonukleinsäure (RNA) und ihre Expressionsprodukte, einschließlich einem Wirt aus Protein-Materialien. Diese Erfindung ist für die Isolierung derartiger Zellbestandteile brauchbar, aber aus praktischen Gründen wird die Erfindung hauptsächlich in Bezug auf ihre Anwendung zur Isolierung von RNA beschrieben.
Die RNA ist eine wesentliche Komponente für die Abfolge biologischer Reaktionen und die zur Expression unzähliger Proteine, einschließlich Hormonen, Enzymen und strukturellem Gewebe führt, die wesentlich für die Existenz aller Lebensformen sind. Es gibt einen wesentlichen Bedarf für große Mengen an RNA für Forschungszwecke sowie auch für diagnostische und therapeutische Zwecke.
Pflanzenzellen und Mikroorganismen, einschließlich Parasiten, Hefe und Bakterien sind potentielle RNA-Quellen, da aber die Zellwände von RNA-Quellen so stark sind, ist es schwierig, zeitraubend und es kann eine teure Ausrüstung erfordern, um sie als RNA-Quellen zu verwenden.
Die RNA-Isolierung aus Bakterien ist schwierig, weil die Zellwände eine Lysis nicht einfach zulassen. Übliche Protokolle für die RNA-Isolierung aus Bakterien verwenden häufig Enzyme, wie zum Beispiel Lysostaphin oder Lysozym, um die Bakterienzellen zu lysieren, gefolgt von der Zugabe von denaturierenden Mitteln zur Inaktivierung der Ribonukleasen. Diese Verfahren zeigten sich jedoch nicht brauchbar für die Isolierung großer Mengen hochreiner RNA.
U.S. Patent 4,843,155 verwendet ein RNA-Isolierungsverfahren, bei dem biologisches Gewebe, wie zum Beispiel die vorderen Hirnanhangdrüsen von Mäusen, anfänglich in einem „Glas-Teflon Homogenisierer" in einem. wässrigen gepufferten Medium bei einem pH-Wert von 4 homogenisiert werden, das Phenol, ein Guanidiniumsalz, wie zum Beispiel Guanidiniumthiocyanat und falls möglich ein Antioxidans enthält. Das homogenisierte Produkt wird dann mit einem, in dem Puffer unlöslichen organischen Lösungsmittel extrahiert. Chloroform ist ein Beispiel für ein brauchbares Lösungsmittel. Die RNA bleibt in dem wässrigen Puffer gelöst. Die DNA und das Protein des biologischen Gewebes konzentriert sich an der Grenzfläche zwischen den organischen und anorganischen Phasen. Die RNA wird durch Fällung mit einem wasserlöslichen Alkanol, wie zum Beispiel Isopropanol von der wässrigen Phase getrennt. Die RNA kann durch Zentrifugieren und Entfernen des Überschusses zurückgewonnen werden. Der Patentinhaber stellt fest, dass das Isolierungsverfahren in drei Stunden beendet werden kann.
Dieses Verfahren ist unangenehm, weil Guanidinsalze teuer und übelriechend sind. Außerdem ist, wie beschrieben, das Verfahren auf biologische Gewebe (das heißt auf eukaryotische und nicht auf prokaryotische Zellen) als RNA-Quelle beschränkt und erfordert zu seinem vollständigen Ablauf einen langen Zeitraum. Die Zellen in biologischem eukaryotischen Gewebe sind durch eine zerbrechliche Membran umschlossen, die leicht zerreißt.
Außerdem können Glasperlen, obwohl Glasperlen in RNA-Isolierungsverfahren verwendet worden sind, nicht in Verbindung mit einer Homogenisierer-artigen Vorrichtung verwendet werden, um die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zu erhalten, weil die Perlen ein Blockieren des Homogenisierers bewirken würden. Glasperlen wurden in Verbindung mit einer Kugelmühle verwendet, um aus Zellen Nukleinsäuren zu isolieren. Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass das Verfahren die Zellen zerschlägt, deren Inhalt in das Medium freisetzt, worin instabile Zellestandteile, wie zum Beispiel RNA schnell durch freigesetzte Enzyme zersetzt werden.
Im Hinblick auf die vorher erwähnten Mängel, die mit den Verfahren vom Stand der Technik zur Isolierung von Zellbestandteilen, wie zum Beispiel RNA aus Zellen, verbunden sind, sollte es daher offensichtlich sein, dass für dieses technische Gebiet noch ein Bedarf an Verfahren vorhanden ist, die für die effiziente Isolierung von Komponenten sowohl aus eukaryotischen als auch aus prokaryotischen Zellen geeignet sind.
Die DE-A-4243 692 offenbart ein Verfahren zum Zertrümmern von biologischen Zellen, wobei bewegliche mechanische Einheiten verwendet werden, um die Zellwände zu zerreißen. Die Einheiten bestehen aus einem Material, das zusammen mit den biologischen Zellen in zwei sich kreuzenden Magnetfeldern magnetisiert werden kann. Mindestens eines der magnetischen Felder ist ein Wechselfeld.
Die US 4,295,613 offenbart eine Vorrichtung zum Zertrümmern von Bakterienzellen, wobei die Zellen in einem Behälter in Kontakt mit feinen Kügelchen oder gleichwertigem granulösem Material sind. Die Vorrichtung enthält einen Rahmen und mehrere Röhrchenhalter, die an ihrem oberen Ende an dem Rahmen aufgehängt sind, so dass sich das untere Ende des Halters in einem kleinen Bogen um eine horizontale Achse, die neben dem unteren Ende des Halters lokalisiert ist, bewegen kann. Ein Motor ist mit dem unteren Ende des Halters verbunden, damit sich das untere Ende des Halters in einem kleinen Bogen mit etwa 1800 Umläufen pro Minute bewegen kann. Unter dem Halter ist eine Wanne angeordnet, um eine Kühlflüssigkeit bei einer kontrollierten Temperatur aufzunehmen, so dass das untere Ende der Röhrchen in dem Halter in der Flüssigkeit eingetaucht ist.
Die US 4,843,155 offenbart ein Verfahren zur Aufreinigung von RNA aus biologischen Gewebeproben und ein Lösungsmittel, das zur Verwendung für dieses Verfahren geeignet ist. Das Verfahren wendet eine einzelne Extraktion unter Verwendung des Lösungsmittels an, welches Guanidinium und Phenol enthält.
Die Cheung et al. Analytical Biochemistry (1994) 222, 511–514, die zwischen dem Prioritäts- und dem Einreichungsdatum der vorliegenden Anmeldung publiziert wurde, offenbart ein Verfahren zur Aufreinigung von RNA aus grampositiven Bakterien und Mykobakterien. Das Verfahren verwendet eine sich hin und herbewegende Hochgeschwindigkeits-Schüttelvorrichtung zusammen mit 0,1 mm Zirkonium/Kieselerde Kügelchen und ein auf Phenol und Detergenzien basierendes RNA Extraktionsreagenz.
Zusammenfassung und Aufgaben der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Isolierung eines Zellbestandteils, einschließlich des mechanischen Freisetzens eines solchen Bestandteils durch die Anwendung mechanischer Schüttelenergie auf eine Zellsuspension in einem flüssigen Medium in einem Behältnis, das ebenfalls eine Vielzahl von Teilchen im Sub-Mikronbereich enthält, um dabei die Zellwände zu zerbrechen und den Zellbestandteil in das flüssige Medium freizusetzen und den ausgewählten Zellbestandteil aus dem Medium zu isolieren.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur RNA-Isolierung aus einer Zellquelle, die RNA zusammen mit DNA und Protein enthält, welches die Schritte umfasst:

a) mechanisches Freisetzen der RNA aus einer RNA-enthaltenden Zellquelle durch die Anwendung von Schüttelenergie in Gegenwart eines Extraktionslösungsmittels, das eine Vielzahl von Teilchen im Sub-Mikronbereich oder im Mikronbereich enthält und das, ausgedrückt in Gewichtsprozent bezogen auf das Gesamtgewicht, von 40 bis 60% Phenol in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4 bis 4,5, der 2M Guanidiniumthiocyanat oder Guanidiniumchlorid enthält, umfasst;
b) Zugabe eines wasserunlöslichen organischen Lösungsmittels zur Bildung einer zweiphasigen Mischung, die die wässrige Extraktionslösungsmittelphase und eine organische Phase umfasst, wobei die RNA in der wässrigen Phase gelöst ist und die DNA und das Protein in der organischen Phase oder an der Grenzfläche zwischen den Phasen konzentiert sind; und
c) Ausfällen der RNA aus der wässrigen Phase durch die Zugabe eines wasserlöslichen niederen Alkohols.

Die vorliegende Anmeldung beschreibt ein für die RNA-Extraktion aus einer Zellquelle, die RNA zusammen mit DNA und Protein enthält, brauchbares Reagenz, das eine Mischung umfasst, die, ausgedrückt in Gewichtsprozent bezogen auf das Gesamtgewicht, ungefähr von 40 bis 60% Phenol und ungefähr von 0,1 bis 1 % eines Detergens in einem wässrigen Puffer mit einem pH von ungefähr 4 bis 4,5 enthält.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur RNA-Isolierung aus einer Zellquelle, die RNA zusammen mit DNA und Protein enthält, und das die Schritte umfasst:

a) mechanisches Freisetzen der RNA aus einer RNA-enthaltenden Zellquelle in Gegenwart eines Extraktionslösungsmittels, das eine Vielzahl von Teilchen im Sub-Mikronbereich oder im Mikronbereich enthält und das, ausgedrückt in Gewichtsprozent bezogen auf das Gesamtgewicht, von 40 bis 60% Phenol und ungefähr von 0,1 bis 1 % eines Detergens in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4 bis 4,5 umfasst;
b) Zugabe eines wasserunlöslichen organischen Lösungsmittels zur Bildung einer zweiphasigen Mischung, die die wässrige Extraktionslösungsmittelphase und eine organische Phase umfasst, wobei die RNA in der wässrigen Phase gelöst ist, die DNA und das Protein in der organischen Phase oder an der Grenzfläche zwischen den Phasen konzentriert sind; und
c) Ausfällen der RNA aus der wässrigen Phase durch die Zugabe eines wasserlöslichen niederen Alkohols.

Die vorliegende Anmeldung beschreibt ein Behältnis zur Isolierung von Ribonukleinsäure (RNA) aus RNA-enthaltenden Zellen in einem flüssigen Medium zur Verfügung, umfassend:

(i) einen Behälter, der darin ein RNA-Extraktionslösungsmittel, eine Vielzahl von Teilchen von Mikrogröße und mindestens ein größeres Teilchen aufweist;
(ii) eine Abdeckungseinheit, die entfernbar auf dem Behälter angebracht ist und einen Hohlraum darin aufweist, der ein ausreichendes Volumen aufweist, das flüssige Medium und das Extraktionslösungsmittel zu enthalten; und
(iii) eine zerbrechbare Abdichtungsschicht, die ausgelegt ist, durch das größere Teilchen nach Schüttelbewegung des Behältnisses zu brechen, wobei die Abdichtungsschicht ausgelegt ist, das Extraktionslösungsmittel von dem flüssigen Medium zu trennen, bis die Abdichtungsschicht durch das größere Teilchen gebrochen wird.

Außerdem beschreibt die vorliegende Erfindung ein Behältnis, das dazu ausgelegt ist, fest in einem Schüttelapparat gehalten zu werden und das zum extraktiven Aufbrechen von Zellen, die RNA enthalten, brauchbar ist, um die Extraktion und Rückgewinnung der RNA daraus zu ermöglichen, wobei das Behältnis umfasst:

(i) einen Behälter, der ein Extraktionslösungsmittel und eine Vielzahl von Teilchen mit einer Teilchengröße enthält, die zum Aufbrechen der Wände der Zellen, aus denen die RNA extrahiert werden soll, geeignet ist; und
(ii) eine Abdeckungseinheit zum Verschließen des Behältnisses während der Schüttelbewegung, um ein Auslaufen der Inhalte von dem Behältnis zu verhindern, wobei das Volumen des Extraktionslösungsmittels ausreichend ist, um im wesentlichen die gesamte als Ergebnis des Bruchs der Zellwände freigesetzte RNA zu lösen.

Weiterhin beschreibt die vorliegende Erfindung ein Behältnis, das ausgelegt ist, fest in einem Schüttelapparat gehalten zu werden und das zum extraktiven Aufbrechen von Zellen, die RNA enthalten, brauchbar ist, um daraus die Extraktion und Rückgewinnung der RNA zu ermöglichen, wobei das Behältnis umfasst:

(i) einen Behälter, der ein Extraktionslösungsmittel und eine Vielzahl von Teilchen mit einer Teilchengröße enthält, die zum Aufbrechen der Wände der Zellen, aus denen die RNA extrahiert werden soll, geeignet ist, und mindestens ein größeres Teilchen enthält;
(ii) eine Abdeckungseinheit zum Verschließen des Behältnisses, um dabei ein Auslaufen der Inhalte von dem Behältnis während der Schüttelbewegung zu verhindern, wobei die Abdeckungseinheit einen Hohlraum darin aufweist, um die Zellquelle der RNA in einem flüssigen Medium zu enthalten; und
(iii) eine zerbrechbare Abdichtung, die zwischen dem Extraktionslösungsmittel und dem flüssigen Medium angeordnet ist, wobei die Abdichtung ausgelegt ist, während der Schüttelbewegung durch den Stoß des größeren Teilchen zu brechen, wodurch das Mischen der Inhalte des Behältnisses zugelassen wird.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass mehr Zellen in einer sehr kurzen Zeitspanne aufgebrochen werden, so dass mehr RNA in das Extraktionsmittel freigegeben wird. Tatsächlich kann das Verfahren in einem derart kurzen Zeitraum, nur 30 Sekunden bis 5 Minuten, beendet werden, so dass keine Kühlung erforderlich ist und keine speziellen Schritte unternommen werden müssen, um sicher zu sein, dass die verwendeten Reagenzien RNAse-frei sind. RNAse ist ein kontaminierendes Enzym, das einen Zerfall der RNA verursacht.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren, das die Trennung und Isolierung von RNA mit außergewöhnlicher Reinheit und in hohen Ausbeuten ermöglicht. Das Verfahren ist sehr bequem und kann in einem sehr kurzen Zeitraum, typischerweise in weniger als einer halben Stunde durchgeführt werden. Weiterhin ist das Verfahren nicht nur auf biologisches Gewebe anwendbar, sondern auch auf Mikroorganismen, wie zum Beispiel Bakterien und ebenfalls auf Pflanzenzellen als RNA-Quellen. Solche Quellen, insbesondere Bakterien, sind als RNA-Quelle viel praktischer als biologisches Gewebe, weil sie einheitlich sind, leicht in jeder gewünschten Menge erhältlich sind und der Umgang mit ihnen einfacher ist als mit biologischem Gewebe.
In einem weiteren Aspekt beschreibt die Anmeldung neuartige Behältnisse, um Verfahren zur Isolierung von RNA und anderen Zellkomponenten durchzuführen. Die Behältnisse umfassen eine Abdeckungseinheit und ein im Verhältnis zum Behältnis niedrigeres Bauteil zur Aufbewahrung des Extraktionsmittels und anderer Komponenten, das im Nachfolgenden als „Behälter" bezeichnet ist.
Aus dem vorstehenden sowie den anderen Aufgaben werden Vorteile und Merkmale der Erfindung im Nachstehenden deutlich und das Wesen der Erfindung kann klarer unter Bezugnahme auf die nachfolgende genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und auf die beigefügten Ansprüche verstanden werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine seitliche Querschnittansicht einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die ein Behältnis, umfassend einen Behälter und dessen Abdeckung, zeigt.
2-4 stellen die seitlichen Querschnittsansichten anderer Ausführungsformen der Behältnisse der vorliegenden Erfindung dar.
5 zeigt RNA, die aus verschiedenen Mäusegeweben unter Verwendung des FastPrep Systems^TM gereinigt wurde, Lauf auf einem natürlichen 1,2% Agarosegel und Färbung mit EtBr. Spur 1: Leber; Spur 2: Niere; Spur 3: Gehirn; Spur 4: Milz; Spur 5: Muskel. Es werden nur die 18S und die 28S rRNA-Banden gezeigt.
6 zeigt die Ergebnisse einer RT-PCR an Mäuseleber RNA unter Verwendung von B-Actin Primern. Die Proben wurden vor der Amplifizierung mit DNasel behandelt. Spur 1: 123 bp Leiter; Spur 2: Umkehrtranskription und Amplifizierung; Spur 3: Amplifizierung in Abwesenheit der Umkehrtranskription.
7 zeigt die Primerverlängerung des sarA Transkripts von S. aureus. RNA wurde unter Verwendung des FastRNA^TM Reagenz und der FastPrep^TM-Vorrichtung gereinigt. Die RNA wurde zu einem ³²P radioaktiv markierten Oligonukleotidprimer erhitzt und mit Umkehrtranskriptase verlängert, wodurch ein Primerverlängerungsprodukt erhalten wurde. Bei dem Ablauf einer Sequenzierungsreaktion mit einer DNA-Matrize (markiertes GATC) und einem identischen Primer wurde die Transkriptions-Anfangsstelle des sarA Transkripts auf Position 101 in einem sarA Klon (siehe Pfeil) kartiert. Die Proben 1 und 2 stellen zwei unterschiedliche RNA-Präparationen mit demselben Verfahren dar.
8 ist ein Northern Blot des α-Haemolysin Transkripts des Elternstammes ISP479C und car Mutanten 1E3. Die Größe des Transkripts betrug 1,8kb. Der OD₆₅₀ von 1,1 und 1,7 entspricht spätexponentiellen beziehungsweise nach-exponentiellen Phasen.
9 ist ein Northern Blot des Protein A Transkripts in Eltern ISP479C, car Mutanten 1E3 und Transduktanden 1E3-2. Der agr Mutant von ISP479C, Stamm B2 ist als eine positive Kontrolle enthalten. Das Protein A Transkript beträgt 9,9kb. Der Pfeil zeigt auf die 23S ribosomale RNA-Bande, die als eine RNA-Markierung dient.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfinder
Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Anwendung ausreichender mechanischer Energie auf die Zellwände der ausgewählten RNA-Quelle in einem besonderen Extraktionsmittel, um die Zellwände aufzubrechen und die RNA freizusetzen. Das aufbrechende Extraktionsverfahren wird in Gegenwart eines chaotropen Mittels, das heißt einer Substanz ausgeführt, die in der Lage ist, molekulare Strukturen und molekulare Reaktionen innerhalb der Zelle zu stören oder aufzubrechen.
Im Nachfolgenden sind Definitionen von Begriffen, die durchwegs in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden aufgeführt:
Der Begriff „in Gewicht" bedeutet, sofern nicht anders spezifiziert ist, das Gewicht, bezogen auf das Gesamtgewicht.
„Schüttelbewegung", „Schüttelenergie", „mechanische Schüttelenergie", „Schüttelbetätigung", „Schütteln" und „Schüttelbetrieb" werden untereinander austauschbar verwendet. Diese Begriffe beschreiben die Verwendung einer Schüttelbewegung im Gegensatz zu einer Rotationsbewegung, unter Anwesenheit schnell vibrierender inerter Teilchen, die in der Lage sind, Zellwände von prokaryotischen Organismen aufzubrechen. Die Teilchen sind vorzugsweise in einem geschlossenen Behältnis und in einem flüssigen Medium enthalten. Wenn die Teilchen in Gegenwart von Zellen zu „Schüttelbewegung" angeregt werden, drücken zwei entgegengesetzt zusammenstoßende Teilchen die Zellen in der Mitte zusammen und bewirken ein Aufsprengen der Zellwände und setzen die Zellbestandteile, einschließlich der RNA, in das Medium frei.
Der Begriff „flüssiges Medium" kann sich auf eine Anzahl verschiedener Medien, umfassend Wachstumsmedien, Puffer oder andere Flüssigkeiten, beziehen, in denen die Zellen suspendiert sind.
Der Begriff „natürliche Quellen" bedeutet eine Quelle, die eine biologische Probe von Zellen liefert, einschließlich Pflanzenzellen und Geweben, eukaryotischen Zellen und Geweben und prokaryotischen Zellen.
Das aufbrechende Extraktionsverfahren der vorliegenden Anmeldung wird in Gegenwart von, ungefähr von 40 bis 60 Gewichts-% Phenol in einem wässrigen Puffer bei einem pH-Wert von ungefähr 4 bis 4,5 durchgeführt, der als ein chaotropes Mittel eine ausreichende Menge Guanidinium-Verbindung, wie zum Beispiel Guanidiniumthiocyanat oder Guanidiniumchlorid enthält, um eine Zusammensetzung zu liefern, die bezüglich der ausgewählten Verbindung ungefähr 2 bis 5 molar ist. Alternativ dazu kann das Extraktionsmittel 0,1–1 Gewichts-% eines geeigneten grenzflächenaktiven Mittels enthalten. Indem die Zellen direkt in ein Extraktionsmedium hinein aufgebrochen werden, werden instabile Komponenten, wie zum Beispiel RNA, sofort von Proteinen, wie zum Beispiel RNasen, die ansonsten die RNA abbauen würden, getrennt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Zellwände der RNA-Quelle, vorzugsweise Bakterien, aufgebrochen, um die RNA freizugeben. Das Aufbrechen der Zellwände wird in einem Extraktionslösungsmittel durchgeführt. Dann wird die sich daraus ergebende Mischung mit einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel extrahiert. Da die RNA in organischen Lösungsmitteln unlöslich ist, verbleibt sie in der wässrigen Phase. Die DNA, Proteine und andere organische Verunreinigungen lösen sich entweder in der organischen Phase oder sammeln sich an der Grenzfläche zwischen den Schichten. Die separierte RNA bleibt in der wässrigen Phase gelöst, von der sie durch Zugabe eines wasserlöslichen niederen Alkanols, wie zum Beispiel Methanol, Ethanol oder Isopropanol gefällt werden kann. Die auf diese Weise isolierte RNA kann durch Filtrieren, Zentrifugieren oder anderen geeigneten Verfahren zurückgewonnen werden. Die so zurückgewonnene RNA ist von außergewöhnlich hoher Reinheit und im wesentlichen frei von DNA. Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft, da im Vergleich zu anderen bekannten Verfahren hohe Ausbeuten erhalten werden können.
Typische brauchbare Quellen umfassen Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria Meningitidis, Saccharomyces cerevisiae (Hefe) und Chlamydolomonas reinhardtii (Algae).
Falls erwünscht, kann die DNA in hoher Ausbeute und Reinheit durch übliche, dem Fachmann wohl bekannte Mittel zurückgewonnen werden.
Für die vorliegende Erfindung ist besonders die Entdeckung des Verfahrens zum Aufbrechen von Zellen wichtig, bei dem die Zellwände durch eine Kraft aufgebrochen werden, die durch die Schüttelbewegung der lebenden Zellen und durch die Teilchen verursacht wird, die die Zellwände aufbrechen und die in einem geschlossenen Behältnis in einem flüssigen Medium suspendiert sind.
Es wurde nun ein neuartiges Reagenz entdeckt, das als ein Extraktionslösungsmittel für diese Erfindung brauchbar ist und die Trennung und Isolierung von RNA mit außergewöhnlich hoher Reinheit und in hohen Ausbeuten mit einem sehr bequemen Verfahren ermöglicht, und das in einem sehr kurzen Zeitraum, typischerweise in weniger als einer halben Stunde, durchgeführt werden kann.
Die neuartigen Reagenzien sind Mischungen, die ungefähr von 40 bis 60 Gewichts-% Phenol und ungefähr von 0,1 bis 1 Gewichts-% eines grenzflächenaktiven Mittels und einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert von ungefähr 4 bis 4,5 enthalten. Bei diesem pH-Wert ist Phenol in wässrigen Medien unlöslich. Ein Ergebnis davon ist, dass die Mischung eine zweiphasige Mischung ist.
Das vorliegend beschriebene Verfahren ist nicht nur auf biologische Gewebe, sondern auch auf Mikroorganismen, wie zum Beispiel Bakterien und ebenfalls auf Pflanzenzellen als RNA-Quellen anwendbar. Solche Quellen, besonders Bakterien, sind als RNA-Quelle viel praktischer als biologisches Gewebe, weil sie einheitlich und in allen gewünschten Mengen leicht erhältlich sind und der Umgang mit ihnen einfacher ist als mit biologischem Gewebe.
Es gibt eine Anzahl von Vorteilen für das vorliegend beschriebene Verfahren, insbesondere wenn es für die RNA-Isolierung durchgeführt wird. Diese umfassen:

1. Anwendbarkeit auf RNA-Quellen, wie zum Beispiel bakterielle Zellen und Pflanzenzellen, die bislang gegenüber Homogenisierungsverfahren mit anderen Phenol extrahierenden Medien beständig waren.
2. Rückgewinnung von RNA als ein Produkt mit hoher Ausbeute, das im wesentlichen nicht mit DNA verunreinigt ist.
3. Anwendbarkeit zur Herstellung von sowohl kleinen als auch großen mengen an RNA in chargenweisen als auch in kontinuierlichen Verfahren.
4. Durchführung in einem sehr kurzen Zeitraum, der es ermöglicht, das Verfahren ohne Kühlung, ohne RNAse-freie Reagenzien und ohne Verunreinigung durch DNA-Fragmente, die durch zeitlich ausgedehnte Zell-Aufbrechverfahren erzeugt werden würden, durchzuführen.
5. Ultrazentrifugieren ist nicht erforderlich.
6. Die neuartigen Reagenzien der Erfindung sind im wesentlichen geruchfrei und einfach, zu kommerziell attraktiven Preisen erhältlich.

Diese Anmeldung beschreibt neuartige Behältnisse, um Verfahren zur Isolierung von RNA oder anderen Zellkomponenten durchzuführen.
Im Laufe des Zellwachstums wird eine große Vielfalt unterschiedlicher RNA zur Konvertierung und Expression verschiedener Proteine, wie zum Beispiel Hormone, Enzyme und andere Proteine, erzeugt. Im Anschluss an die Expression einer entsprechenden Menge an derartigen Proteinen, würden die Zellen die stetige Proteinerzeugung durch schnellen Abbau der RNA, die für solche Proteine kodiert, beschränken. Dementsprechend wird eine reifende Zelle in verschiedenen Phasen ihres Wachstums oder ihrer Aktivität, unterschiedliche Mengen derselben RNA-Moleküle oder unterschiedliche Mengen an unterschiedlichen RNA-Molekülen enthalten.
Es wird daher wichtig, die RNA aus der lebenden Zelle während verschiedenen Phasen des Zellwachstumszyklus zu extrahieren, um RNA-Spezies, die kurzlebig sein können, zu isolieren und zu identifizieren.
Bestimmte Ausführungsformen der in dieser Anmeldung beschriebenen Behältnisse sind für diese Zwecke besonders nützlich. Daher ist die Abdeckungseinheit dahingehend adaptierbar, dass sie das Wachstumsmedium, einschließlich aller notwendigen Nährstoffe für das Zellwachstum enthält. Wahlweise können die Zellen gesondert kultiviert werden und liquoten des Wachtumsmediums, einschließlich der Zellen, können vor dem Bruch der Abdichtung, das das Mischen des Wachstumsmediums und der Zellen mit der Extraktionsflüssigkeit erlaubt, zur Abdeckungseinheit übertragen werden. Alternativ dazu können die Zellen aus einem separaten Wachstumsmedium isoliert werden und der Abdeckungseinheit in einer Pufferlösung, mit oder ohne einen Zusatzstoff zur Beendigung oder Induzierung der Produktion eines ausgewählten Proteins, zugegeben werden. Wahlweise können die Zellen gesondert wachsen gelassen werden und Aliquoten des Wachstumsmediums, einschließlich Wachstumszellen, können vor dem Bruch der Abdichtung, das das Mischen des Wachstumsmediums und der Extraktionsflüssigkeit bewirkt, zur Abdeckungseinheit übertragen werden.
Eine Ausführungsform der hierin beschriebenen Behältnisse ist besonders nützlich, um das Wachstum der Zellen zu verfolgen, indem verschiedene RNA-Typen, die im Laufe der Zellentwicklung erzeugt wurden, isoliert werden. Im Falle dieser Ausführungsform werden die interessierenden Zellen in einem geeigneten Medium in einem in der Abdeckungseinheit gebildeten Hohlraum kultiviert oder gesondert kultiviert und in den Hohlraum gebracht. Die Abdeckungseinheit oder der Behälter weisen eine zerbrechbare flüssigdichte Abdichtung auf, die das Extraktionsmittel von dem flüssigen Medium, welches die Zellen enthält, trennt. Der Behälter enthält zusätzlich zu dem Extraktionsmittel eine Anzahl von Teilchen in Mikro- oder Submikrogröße und mindestens ein großes Teilchen. Falls die Extraktion der RNA erwünscht ist, wird die Abdeckungseinheit dazu verwendet, den Behälter zu verschließen und das Behältnis wird in einen Schüttelapparat getan. Wird der Schüttelapparat angeschaltet, so bricht die erzeugte Schüttelbewegung des großen Teilchens die Abdichtung und lässt die Mischung von flüssigem Medium und Extraktionsmittel zu. Die Bewegung der mikrogroßen Teilchen bricht die Zellwände auf und gibt die Zellkomponenten einschließlich der der RNA frei.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Behältnis einen Behälter, der das Extraktionsmittel enthält, mikrogroße Perlen und mindestens eine größere Perle in der Extraktionsmittelflüssigkeit, eine zerbrechbare Abdichtung und eine entfernbare Abdeckungseinheit. Die Abdeckungseinheit wird entfernt, die sich in einem flüssigen Medium befindenden Zellen werden auf die zerbrechbare Abdichtung gebracht, beispielsweise durch Schütteln, ausgesetzt, so dass die größere Perle die Abdichtung zerbricht.
Die hierin beschriebenen Behältnisse erlauben durch die Anwendung mechanischer Energie das Aufbrechen von Zellen zur Gewinnung hochreiner RNA aus natürlichen Quellen, die RNA zusammen mit DNA und anderen Verunreinigungen, hauptsächlich Proteinen, enthalten. Ein wichtiger Aspekt der mit dem erfindungsgemäßen Aufbrechen von Zellen verbundenen mechanischen Energie ist ihre Anwendung in Form von Schütteln, bevorzugt in der Gegenwart von Perlen von Mikro- oder Submikrogröße oder gleichwertigen Projektil-ähnlichen Gegenständen, die dazu dienen, die Zellwände in der Art eines zerplatzenden Ballons zu zerreißen. Rotationsenergie, wie sie zum Beispiel mit einer Mischmaschine oder einem anderen Homogenisierer erzeugt wird, ist nicht brauchbar, da die Zellen einfach rotieren und nicht wirkungsvoll miteinander und mit den Perlen zusammenstoßen, um dadurch zu ermöglichen, dass die Zellen zwischen den Perlen zerbrochen werden.
Das verwendete Extraktionslösungsmittel ist die vorstehend beschriebene Flüssigkeit, die das Guanidiniumsalz enthält.
Es kann jeder Puffer aus einer großen Vielfalt an wohl bekannten Puffern verwendet werden, die die Kontrolle des pH-Wertes innerhalb des gewählten Bereichs erlauben. Gegenwärtig sind Puffer, basierend auf Natriumacetat oder Natriumnitrat, bevorzugt, weil sie leicht erhältlich sind und hervorragende Ergebnisse liefern. Es können andere, dem Fachmann bekannte Puffer, verwendet werden.
Das Extraktionsreagenz, das das guanidinartige chaotrope Mittel enthält, kann wahlweise ein Antioxidans enthalten, um die spontane Oxidation von Phenol einzudämmen und die Lagerbeständigkeit des Extraktionsreagenz zu erhöhen. Typische brauchbare Antioxidantien umfassen organische Antioxidantien, bei zum Beispiel 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, 2-Hydroxychinolin und Cystein.
Der erste Schritt bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das mechanische Aufbrechen der Zellwände der zellulären RNA-Quelle, wie zum Beispiel von Bakterien, den eukaryotischen Zellen von biologischem Gewebe oder Pflanzenzellen. Dies kann mit jeder aus einer Vielzahl erhältlicher Vorrichtungen ausgeführt werden, von denen gegenwärtig Kugelmühlen, wie zum Beispiel die Mini Kugelmühle erhältlich von BioSpec Products von Bartlesvill, OK bevorzugt sind. Andere Vorrichtungen sind ebenfalls erhältlich.
Kugelmühlen sind vorzugsweise Vorrichtungen zur Behandlung der RNA-Quelle. Typischerweise beträgt die Größe der Kugel ungefähr von 0,1 bis 1,0 mm und variiert mit der Größe der DNA Trägerzellen. Noch bevorzugter ist die Verwendung der FastPrep^TM-Vorrichtung hergestellt von Savant Instruments (Farmingdale, NY) wegen ihrer hohen Geschwindigkeit, die die benötigte Zeit zur Durchführung des Aufbrechens verringert.
Eines der wichtigsten Merkmale des ausgewählten Schüttelapparats besteht darin, dass er in der Lage ist, ausreichend mechanische Energie durch Schüttelbewegung zu erzeugen, um die Zellwände der bakteriellen Zellen aufzubrechen und die RNA freizusetzen. Dies kann durch schnell rüttelnde Glasperlen oder andere inerte Teilchen in dem Extraktionsreagenz in Gegenwart der Bakterien oder anderen RNA-Quellen erreicht werden. Solche Perlen sind handelsüblich in einer Vielfalt an Größen von mehreren Quellen erhältlich. Sie können bei ausgewählten Geschwindigkeiten geschüttelt werden, um genügend mechanische Energie zum Aufbrechen der Zellwände zu liefern.
Das Freisetzen der RNA wird mit den bakteriellen Zellen oder einer anderen RNA-Quelle ausgeführt, die in dem Extraktionslösungsmittel suspendiert ist. Die erforderliche Zeit hängt in erster Linie von der Größe der Quelle ab, aus der die RNA extrahiert wird, da die Zellgröße von verschiedenen RNA-Quellen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefe und Pflanzenzellen merklich unterschiedlich ist. Bei kleinen Mengen an Bakterien oder einer anderen Quelle können 20 Sekunden angemessen sein. Bei größeren Mengen können gelegentlich zwei oder drei Minuten erforderlich sein. Zeit ist ein kritischer Faktor, weil die Halbwertszeit der RNA-Spezies sehr kurz ist (1–2 Minuten).
Am Ende des Aufbrechschrittes, wenn die meiste RNA in das gepufferte Lösungsmittel freigesetzt worden ist, wird das Lösungsmittel mit einem organischen Lösungsmittel, das im wesentlichen wasserunlöslich ist, extrahiert. Das Lösungsmittel wird am Ende des Extraktionsverfahrens zugegeben. Typische brauchbare Lösungsmittel umfassen substituierte und nicht-substituierte niedere Kohlenwasserstoffe, wie zum Beispiel Chloroform.
Während des Extraktionsverfahrens löst sich die DNA in dem organischen Lösungsmittel und kann über dem Fachmann bekannte Standardverfahren zurückgewonnen werden. Die RNA bleibt in dem wässrigen Puffer gelöst und kann mit Isopropanol, wie vorstehend beschrieben und in dem Beispiel erläutert, gefällt werden.
Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich, wenn sie mit dem vorstehend beschriebenen neuartigen Reagenz ausgeführt wird. Das Reagenz ist eine zweiphasige Mischung, die ausgewählte Mengen an Phenol und mindestens einem Detergens in einem wässrigen Puffer bei einem pH-Wert von ungefähr 4 enthält. Dieser pH-Wert wird gewählt, weil wenn die Wasserstoffionenkonzentration diesen Wert erreicht hat, die RNA in Wasser löslich und DNA unlöslich ist. Ein bevorzugtes Reagenz ist das FastRNA^TM-Reagenz, hergestellt von Bio101. Das gewählte Detergens kann jedes beliebige aus einer Vielzahl von üblichen grenzflächenaktiven Mitteln, einschließlich anionischen, kationischen, nicht-ionischen und amphoteren grenzflächenaktiven Mitteln sein.
Typische brauchbare anionische Detergenzien umfassen zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, Natrium-n-decylsulfat und Triethanolamindodecylbenzolsulfonat.
Für die Ausführung der Erfindung brauchbare kationische Detergenzien umfassen beispielsweise Cetyltrimethylammoniumbromid und andere quartäre N-Alkyl Ammoniumhalide, sowie polyethoxyliertes quartäres Ammoniumchlorid.
Die nichtionischen Detergenzien umfassen talgige Fettalkoholethoxylate, ethoxylierter Tridecylalkohol, ethoxyliertes Tridecanol, Nonylphenolethoxylat und Octylphenoxypolyethoxyethanol.
Amphotere Detergenzien umfassen zum Beispiel Cocoamidopropylbetain, Dinatrium-Talkiminodipropionat und Cocoamidobetain.
Das gegenwärtig besonders bevorzugte grenzflächenaktive Mittel ist Cetyltrimethylammoniumbromid, weil es die besten Ausbeuten an DNA-freiem Produkt liefert.
Alle diese Detergenzien und viele weitere gleichwertige grenzflächenaktive Verbindungen sind leicht über kommerziellen Quellen zu beziehen.
Wie bei vorherigen Verfahren können ebenso eine Anzahl von Puffern oder wahlweise Antioxidantien verwendet werden.
Das Verfahren ist bei der Durchführung mit dem neuartigen Extraktionslösungsmittel im wesentlichen ähnlich zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren mit dem Guanidiniumsalz.
Wie in 1 gezeigt ist, umfasst das neuartige Behältnis, das besonders bei der erfindungsgemäßen Verwendung zur Isolierung von RNA oder anderen Zellbestandteilen nützlich ist, einen Behälter 10 und eine Abdeckungseinheit 17, die beide vorzugsweise aus Glas oder einem inerten Kunststoff bestehen. Der Behälter enthält ein, so wie vorstehend beschriebenes flüssiges RNA-Extraktionsmittel 11.
Der Behälter 10 besitzt vorzugsweise eine zylinderförmige Seitenwand, so dass sie in Schnitten, die senkrecht zu 1 sind, rund ist, und, wie alle Ausführungsformen dieser Erfindung, dahingehend ausgelegt ist, dass er fest in einem Schüttelapparat gehalten wird. Eine große Anzahl von Teilchen in Mikrogröße, geeigneterweise Perlen 12, befinden sich in dem flüssigen Extraktionsmittel. Vorzugsweise sind die Perlen aus Glas oder Metall und sie weisen vorzugsweise einen Durchmesser von ungefähr 0,1–1,0 mm auf.
Es kann jede geeignete Anzahl oder Gewicht derartiger Perlen verwendet werden.
Für Forschungszwecke, bei denen normalerweise nur kleine Mengen an RNA erforderlich sind, kann das Behältnis sehr klein sein. Typischerweise beträgt das Gesamtvolumen ungefähr 1,5 bis 2,5 ml. Größere Behältnisse können verwendet werden, um größere Menge an RNA zu erhalten.
Der Behälter wird mit einer zerbrechbaren Abdichtung 14 abgedichtet, die aus demselben Material bestehen kann, wie der Behälter selbst und die typischerweise ungefähr an der Hälfte der Behälterwand entlang angebracht ist. Die Abdichtung 14 ist undurchlässig für Flüssigkeiten und noch leicht genug, so dass sie durch das Gewicht der sich in Schüttelbewegung befindlichen Teilchen in dem Behältnis oder vorzugsweise durch ein größeres Teilchen, wie die Perle 13, gebrochen werden kann. Die größere Perle kann eine beliebige passende Größe und Gewicht zum Brechen der Abdichtung aufweisen.
Die Abdeckungseinheit 17 weisen Schraubgewinde 15 auf, die mit den Schraubenaußengewinden 16 des Behältnisses 10 zusammepassen.
In den in den 2–4 gezeigten zweiten, dritten und vierten Ausführungsformen sind der Behälter 10, die Extraktionsmittelflüssigkeit 11, Perlen von kleiner Größe 12 und eine größere Perle 13 mit ungefähr 3–5 mm Durchmesser gleich wie in der in 1 gezeigten ersten Ausführungsform. Weiterhin sind ebenfalls die Verfahrensschritte dieselben, die für die RNA-Isolierung aus der Extraktionsmittelflüssigkeit angewandt werden.
In der in 2 gezeigten zweiten Ausführungsform dient die Abdeckungseinheit 17A zur Lagerung und Versorgung der Zellen. Die Abdeckungseinheit 17A weist ein ringartiges Seitenwand-Gehäuseteil 20A, eine zerbrechbare für Flüssigkeit undurchlässige Schicht 21A, die als Bodenwand des Hohlraums 30 dient, die interessierenden Zellen in einem geeigneten Medium 22A und eine entfernbare obere Abdeckung 23A auf. Das Behältnis besteht aus dem Behälter 10, mit dessen Perlen und Extraktionsmittelflüssigkeit, und der Abdeckungseinheit 17A, die verschraubt oder andenrweitig auf dem Behältnisgehäuse befestigt ist.
Wenn der Benutzer beim Gebrauch wünscht, RNA aus den Zellen in dem Medium 22A zu isolieren, wird die Abdeckungseinheit 17A auf den Behälter 10 geschraubt und mit der angebrachten oberen Abdeckung das Behältnis während ungefähr 30 Sekunden bis 5 Minuten kräftig geschüttelt, was dazu führt, dass die große Perle 13 die zerbrechbare Schicht 21A bricht und das Kulturmedium 22A oder ein anderes flüssiges Medium, das die Zellen enthält, sich mit der Extraktionsmittelflüssigkeit 11 und den anderen Komponenten in dem Behälter vermischt.
In der Ausführungsform gemäß 3 beinhaltet die Abdeckungseinheit 17B die betreffenden Zellen in einem flüssigen Medium 22B. Die Abdeckungseinheit besitzt eine ringförmige Seitenwand 20B, die betreffenden Zellen in einem Medium 22B, einen festen oberen entfernbaren Deckel 23B und eine feste Bodenwand 24B. Das Behältnis 10 besitzt eine für die Flüssigkeit undurchlässige Schicht 21B, wie in der ersten Ausführungsform.
Während des Betriebs wird der Benutzer die Abdeckungseinheit 17B von dem Behältnis 10 abschrauben, den oberen Deckel 23B abschrauben und das Medium 22B in das Behältnis 10 hineingießen oder es mittels Pipette transferieren, wo es auf der Oberseite der zerbrechbaren Schicht 21B gehalten wird. Die Abdeckungseinheit 17B wird dann wieder auf dem Behälter angebracht und das Behältnis so geschüttelt, dass die Perle 13 die zerbrechbare Schicht 21B bricht, sich alle Komponenten vermischen und die Zellwände durch die Wirkung der Perlen, unter Freigabe der RNA aufgebrochen werden.
In der in 4 gezeigten vierten Ausführungsform hat die Abdeckungsvorrichtung 17C eine ringähnliche Seitenwand 20, die interessierenden Zellen in einer Kultur oder einem anderen Medium 22C, eine feste Bodenwand 24C und einen festen Deckel 23C und einen oberen Rand 25 mit inneren Schraubgewinden 26. Die Haltevorrichtung 10 hat eine lockere wasserdichte Schicht 21C.
Im Betrieb entfernt der Benutzer die Abdeckungsvorrichtung 17C von der Haltevorrichtung 10, schraubt den oberen Deckel 23C ab, und schraubt die Abdeckungsvorrichtung mittels der Schraubgewinde 26 auf die Haltevorrichtung 10. Der Behälter wird dann geschüttelt, so dass das Kügelchen die lockere Schicht 21C zerbricht.
Wie oben gezeigt, sollte das Gesamtvolumen des Behälters ausreichend sein, so dass, wenn er geschlossen ist, er das Extraktionslösungsmittel, das flüssige Medium und die anderen Komponenten unter solchen Bedingungen aufnehmen kann, dass die gesamte Mischung in geeigneter Weise und wirksam geschüttelt werden kann. Eine allgemeine Regel für diesen Zweck ist, dass das Gesamtvolumen der geschlossenen Röhre zu einem Drittel durch die Kügelchen eingenommen wird, zu einem Drittel durch Reagenz/Zellen und zu 1/3 durch luftgefüllten Raum.
Zur Verwendung in Forschungs- oder anderen Laboratorien, wo relativ geringe Mengen von RNA benötigt werden, können die Behälter in Kits gepackt werden, die einen oder eine Vielzahl von Behältern zusammen mit einem Behälter mit organischen Lösungsmitteln und anderen Zubehörmitteln enthalten, welche geeignet sind, das Verfahren durchzuführen. Die Kits können eine Auswahl von Behältern mit kleinen Kügelchen verschiedener Größe enthalten, um sich den verschiedenen Größen der Zellen anzupassen, die als RNA Quellen dienen. Solche Behälter sind besonders nützlich mit Schüttelvorrichtungen, die eine Vielzahl von Behältern aufnehmen können, nämlich bis zu 20 oder mehr. Solche Maschinen und Behälter sind besonders nützlich, wenn mehrere RNA Aufreinigungen gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden sollen.
Die Behaltnisse der vorliegenden Erfindung wurden hauptsächlich in Bezug auf vier spezielle Ausführungsformen und auf RNA-Isolierung beschrieben, wobei ein Extraktionslösungsmittel verwendet wird, das entweder ein Detergens oder ein Guanidiniumsalz als chaotropes Mittel enthält, das zum Aufbrechen der molekularen Struktur und molekularen Wechselwirkungen in der Zelle mit der zu isolierenden RNA, verwendet wird. Es können weitere chaotrope Mittel verwendet werden.
Für den Fachmann ist offensichtlich, dass das Konzept der Behältnisse unter Verwendung anderer Strukturen, die zu den erläuterten und beschriebenen Strukturen äquivalent sind, ausgeführt werden kann. Zum Beispiel könnte die zerbrechbare Abdichtungsschicht derart auf der Oberseite des Behälters angebracht sein, dass sie bricht, wenn die Abdeckungseinheit in die richtige Stellung aufgeschraubt wird und dabei das Erfordernis großer Perlen vermeidet. Das gleiche Ergebnis könnte durch Abdichten eines spitz zulaufenden Bauelements auf der Innenseite der Abdeckungseinheit erreicht werden, das so ausgelegt ist, dass es die Abdichtungsschicht bricht, wenn die Abdeckungseinheit fest in die richtige Stellung aufgeschraubt wird.
Natürlich kann die Abdeckungseinheit auf dem Behälter mit Mitteln angebracht werden, die zu den gezeigten Schraubengewinden äquivalent sind, zum Beispiel durch einen Festsitz.
Da das Aufbrechen der Zellwände die gesamten zellulären Substituenten freisetzt, kann diese Erfindung mit oder ohne chaotrope Mittel und Extraktionslösungsmittel, wie zum Beispiel die vorstehend beschriebenen, verwendet werden, um andere zelluläre Bestandteile unter Verwendung bekannter Isolierungsverfahren zu isolieren. Zum Beispiel können Proteine aus einer aufgebrochenen Mischung, die ein Extraktionslösungsmittel enthält, das einen neutralen Puffer und eine Reagenzienmischung von Protease-Inhibitoren umfasst, isoliert werden.
Als ein weiteres Beispiel kann dass Verfahren der Erfindung dazu verwendet werden, wirkungsvoll und schnell Gewebe, wie zum Beispiel Haut, Darm, Magen, Leber etc. In ihre Bestandteile für die Isolierung bestimmter Komponenten zerreißen. Einzelne Zellkomponenten, wie zum Beispiel Enzyme, können unter Verwendung chromatographischer Standardtechniken isoliert werden. Auf ähnliche Weise können strukturelle Komponenten, zum Beispiel Bindegewebe, Membranen, Zellwandkomponenten, etc. durch differentielle Zentrifugationstechniken getrennt werden.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung und sollten nicht als erfindungsbeschränkend angesehen werden, es sind viele offensichtliche Variationen der Erfindung möglich, ohne den Umfang der Ansprüche zu verlassen.
Beispiele 1–6
RNA und DNA wurden aus den folgenden Mikroorganismen unter Verwendung des nachstehend beschriebenen Protokolls isoliert:

1. Staphylococcus aureus
2. Streptococcus pyogenes
3. Mycobacterium tuberculosis
4. Neisseria meningitidis
5. saccharomyces cerevisiae (Hefe)
6. Chamydolomonas reinhardtii (Algen)

Schritte:

1. Zentrifugiere 10 ml der zu verarbeitenden Zellen ( ≈1–5 × 10⁸ pro ml).
2. 2. Sauge die überstehende Kultur ab und verwerte sie.
3. Resuspendiere ein bakterielles Pellet in 1 ml des Extraktionsreagenz. Stelle 5 ml der Extraktionen her durch Zugabe von:

Phenol 2 ml (40%)

10% CTAB 0,5 ml (1 %)

2 M NaAc pH 4 125 μl (50 mM)

1 M DTT μl (1 mM)

Wasser 2,37, ö

Dies ergibt ein zweiphasiges Reagenz, das kräftig verwirbelt werden muss, bevor 1 ml des Reagenz in das Röhrchen pipettiert werden.

4. Transferiere die Reagenzmischung in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, das 0,5 ml (1,65 gm) an 0,1 mm Glas/Zirkoniumdioxid Perlen (größere Perlen werden für Hefe und Algen verwendet) enthält.
5. Schüttle während 20 Sekunden bei 6000 rpm unter Schüttelbewegungen. Intermittiere die Schüttelbewegung, damit sich die Glas/Zirkoniumdioxid Perlen auf dem Boden des Rohrs absetzen.
6. Füge 200 μl Chloroform hinzu. Lasse während 2 Minuten absetzen.
7. Verwirble während 25 Sekunden.
8. Zentrifugiere während 15 Minuten mit 12000 g bei 4°C.
9. Sauge die obere wässrige Phase ab.
10. Gib 0,5 ml Isopropanol hinzu. Inkubiere während 10 Minuten.
11. Zentrifugiere während 10 Minuten mit 12000 g bei 4°C.
12. Wasche das Pellet mit 70% Ethanol und zentrifugiere während 5 Minuten bei 5000 × g.
13. Verwerfe die 70% Ethanol-Spülung und trockne während 5–10 Minuten an Luft.
14. Resuspendiere RNA zur Lagerung in 100 μl von entweder mit Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser oder 0,5% Natriumdodecylsulfat.
15. Um die DNA zu erhalten, wir die die DNA enthaltende Phasengrenzfläche zweimal mit Phenol/Chloroform (50/50 v) reextrahiert. Die obere wässrige Phase wird gesammelt. Einzehntel Volumen an Natriumacetat (3M pH 5,2) wird zugegeben. Die DNA wird mit 3 Volumina an 100% Ethanol gefällt, zentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen und wiederum zentrifugiert. Das DNA enthaltende Pellet wird in Tris-EDTA-Pufferlösung resuspendiert und zum Restriktionsverdau oder Klonierung verwendet.

Beispiel 7
Frische Stücke Mäuseleber, -niere, -gehirn, -milz und -skelettmuskel (≈50 mg von jedem) werden in 2 ml Röhrchen, die chaotrope RNA stabilisierende Reagenzien und eine lysierende Matrix enthalten, gegeben und sofort im Fast Prep^TM System während 30–60 Sekunden verarbeitet (Prähomogenisierung ist nicht erforderlich). Nach dem Zentrifugieren wird die klare, RNA enthaltende überstehende Lösung mit Ethanol gefällt oder die Matrix gereinigt und mit 100 μl DEPC H₂O eluiert. 10–20 μl werden auf einem natürlichen Agarosegel laufen gelassen (5). 6 zeigt eine RT-PCR Analyse von Leber-RNA.
Tabelle 1
Beispiel 8
Ein Verfahren zur RNA-Isolierung aus gram positiven Bakterien, das schnell, einfach und keine teure Ausrüstung erfordert, verwendet das FastRNA^TM (BIO 101, Vista CA) Kit zusammen mit der FastPrep^TM Vorrichtung (Savant). Das Verfahren wurde für Staphylococcus aureus und Saccharomyces cerevisiae, von denen vorher bekannt war, dass aus ihnen die RNA-Extraktion schwierig ist, verwendet.
Für dieses Verfahren wurden Bakterien über Nacht in einem Wachstumsmedium kultiviert, 1:100 in je 10 ml frischen Medium verdünnt und auf mittel-logarithmische, spät logarithmische und post-exponentielle Phasen anwachsen gelassen, die einem OD_650nm von 0,7, 1,1 beziehungsweise 1,7 entsprechen. Die Bakterien wurden dann zu Pellets geformt (2500 × g während 10 Min bei 4°C) und wieder in 1 ml Reagenz suspendiert. Die Zellen wurden in ei 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen transferiert, in das 500 μl Zirkoniumdioxid/Siliziumdioxid Perlen (0,1 mm Größe) zugegeben wurden.
Das Röhrchen wurde in der Savant-Vorrichtung für 20 Sekunden bei 6500 rpm geschüttelt und dann auf Eis gelegt. 200 μl Chloroform wurden in das Röhrchen gegeben. Nach Aufwirbeln über 15 Sekunden und Inkubieren während 2 Minuten bei RT wurde die Mischung bei 12000 × g während 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die RNA wurde aus der wässrigen Phase gewonnen (obere Schicht), mit 0,5 ml Isopropanol gefällt und Pellets (12000 × g während 10 Minuten bei 4°C) gebildet. Das Pellet wurde mit 75% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und wieder in 100 μl 0,5% SDS in DEPC-behandeltem Wasser suspendiert. Die RNA-Konzentration wurde spektralphotometrisch bestimmt.
Von jeder Probe wurden fünf μg über ein 1,5% Agarose-0,66M Formaldehygel in MOPS Laufpuffer (20 mM MOPS, 10 mM Natriumacetat, 2 mM EDTA, pH 7,0) elektrophoresiert. Mit diesem Verfahren war es uns möglich, eine hohe Ausbeute an RNA mit guter Reinheit zu erhalten, wie durch das A₂₆₀/A₂₈₀ Verhältnis nachgewiesen werden konnte (Tabelle 1). Dieses Extraktionsverfahren ist ebenfalls sehr leistungsfähig, da sich die RNA-Ausbeute ausreichend proportional zu der Anzahl an Bakterienzellen verhält (Tabelle 1). Die Vollständigkeit der RNA-Spezies wurde auch mit Formaldehydgelen bestätigt (7).
Dir Primerverlängerung wurde mit 30 μg RNA durchgeführt, die in DEPC-behandeltem Wasser wieder suspendiert war. Die RNA wurde in der Gegenwart des endmarkierten Primers (5 × 10 cpm) gefällt und dann über Nacht bei 30°C vorhybridisiert. Die Reaktionsmischung wurde dann mit 5 Volumenteilen Ethanol in Gegenwart von 10% Essigsäure vorgefällt, gewaschen und getrocknet. Die Umkehrtranskription wurde durchgeführt und die Reaktion bei 42°C während 90 Minuten inkubiert, bei 65°C während 0 Minuten erhitzt und dann mit 1 μl RNase A während 15 Minuten bei 55°C inkubiert. Die Reaktion wurde mit einem QlAquick Nukleotid-Entfernungskit (Qiagen) gereinigt, mit Ethanol gefällt, getrocknet und in 10 μl TE und 10 μl Sequenase-Stoplösung wieder suspendiert. Die Reaktion wurde auf 95°C während 5 Minuten erhitzt, auf Eis abgeschreckt und auf das Sequenzierungsgel aufgebracht.
Beispiel 9
Staphylococcen-RNA wurde aus einer 10ml Kultur, die bis zur spät logarithmischen oder post-exponentiellen Phase in CYPG gezüchtet wurde, extrahiert, zu Pellets geformt, in 1 ml FastRNA^TM-Reagenz (BIO 101) wieder suspendiert und 0,5 ml an 0,1 mm Zirkoniumdioxid/Siliziumdioxid Perlen zugegeben und bei 6000 rpm in einem Hochgeschwindigkeits-Schüttelhomogenisierer über 20 Sekunden geschüttelt (FastPrep^TM Vorrichtung, Savant Instruments). Nach Zugabe von 200 μl Chloroform wurde die Mischung während 10 Minuten bei 12000 g zentrifugiert. Die RNA in der oberen wässrigen Schicht wurde mit Isopropanol gefällt und in DEPC-behandeltem Wasser wieder suspendiert. Die gesamte zelluläre Ausbeute betrug 0,5–1 mg mit einem A₂₆₀/A₂₈₀ Verhältnis von 2,0. Die Vollständigkeit der RNA-Spezies wurde mit einem Formaldehygel nachgewiesen.
Von jedem Bakterienstamm wurden fünf μg RNA auf ein 1,5% Agarose-0,66 M Formaldehydgel in MOPS Laufpuffer aufgebracht, wie es bei Cheung et al ((1994) J. Bacteriol. 176: 580–585) beschrieben ist. Die RNA wurde auf einer Nytran Nylonmembran unter Verwendung des Turboblotter Systems (Schleicher & Schuell, Keene, NH) transferiert. Die RNA auf der Membran wurde wie bei Cheung et al (1994) beschrieben mit UV Licht vernetzt, mit einem ³²P markierten Gel-gereinigtem Protein A oder einer α-Hämolysin-Sonde in 50% Formamid bei 42°C über Nacht hybridisiert, gewaschen und autoradiographiert.

Claims

Verfahren zur Isolierung einer zellulären Komponente, umfassend eine mechanische Freisetzung der Komponente durch Anwendung von gegenseitiger mechanischer Kraft auf eine Zellsuspension in einem flüssigen Medium in einem Behälter, welcher außerdem eine Vielzahl von submikrometer- oder mikrometergroßen Partikeln enthält, um dadurch die Zellwände zu zerbrechen und die Zellkomponente in das flüssige Medium freizusetzen und die selektierte Zellkomponente aus dem Medium zu isolieren.
Verfahren aus dem Punkt 1, worin das flüssige Medium zusätzlich eine chaotrope Substanz enthält.
Verfahren zur Isolierung von RNA aus einer zellulären Quelle, die diese zusammen mit DNA und Protein enthält, umfassend die folgenden Schritte: a. mechanische Freisetzung der RNA aus einer diese enthaltenen zellulären Quelle durch Anwendung von gegenseitiger mechanischer Kraft in Anwesenheit eines Extraktionslösungsmittels, welches eine Vielzahl von submikrometer- oder mikrometergroßen Partikeln enthält und welches, bezogen auf das Gewicht vom Gesamtgewicht, 40 bis 60% Phenol in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4 bis 4,5 aufweist, mit 2M Guanidiniumthiocyanat oder Guanidiniumchlorid; b. Zugabe eines wasserunlöslichen organischen Lösungsmittels, um eine Zwei-Phasen-Mischung herzustellen, die eine wässrige Extraktionslösungsmittel-Phase und eine organische Phase aufweist, wobei die RNA in der wässrigen Phase gelöst und die DNA und das Protein in der organischen Phase oder in der Grenzschicht zwischen den beiden Phasen konzentriert ist; und c. Ausfällung der RNA aus der wässrigen Phase durch Zugabe eines wasserlöslichen niederen Alkanols.
Das Verfahren nach Anspruch 3, einschließlich des weiteren Schrittes der Rückgewinnung der RNA durch deren Trennung von der wässrigen Phase, aus welcher sie präzipitiert wurde, durch Filtrierung oder durch Zentrifugation und Entfernung der überstehenden wässrigen Phase.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Extraktion in Anwesenheit von Detergenz oder Gemischen davon durchgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Partikel mikrometergroße Partikel mit einer Partikelgröße von 0,1 bis 1,0 mm im Durchmesser sind.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Partikel mikrometergroße Partikel mit einer Partikelgröße von 0,1 bis 1,0 μm im Durchmesser sind.
Verfahren zur Isolierung von RNA aus einer zellulären Quelle, die diese zusammen mit DNA und Protein enthält, umfassend die folgenden Schritte: a) mechanische Freisetzung der RNA aus einer diese enthaltenen zellulären Quelle in Anwesenheit eines Extraktionslösungsmittels, welches eine Vielzahl von submikrometer- oder mikrometergroßen Partikeln enthält und welches, bezogen auf das Gewicht vom Gesamtgewicht, 40 bis 60% Phenol und etwa 0,1 bis 1 % Detergenz in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4 bis 4,5 aufweist; b) Zugabe eines wasserunlöslichen organischen Lösungsmittels, um eine Zwei-Phasen-Mischung herzustellen, die eine wässrige Extraktionslösungsmittel-Phase und eine organische Phase aufweist, wobei die RNA in der wässrigen Phase gelöst und die DNA und das Protein in der organischen Phase oder in der Grenzschicht zwischen den beiden Phasen konzentriert ist; und c) Ausfällung der RNA aus der wässrigen Phase durch Zugabe eines wasserlöslichen niederen Alkanols.
Das Verfahren nach Anspruch 8, einschließlich des weiteren Schrittes der Rückgewinnung der RNA durch deren Trennung von der wässrigen Phase, aus welcher sie präzipitiert wurde, durch Filtrierung oder durch Zentrifugation und Entfernung der überstehenden wässrigen Phase.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Detergenz kationisch ist.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Detergenz Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) ist.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Extraktion in Anwesenheit von Detergenzien oder Gemischen davon durchgeführt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Partikel mikrometergroße Partikel mit einer Partikelgröße von 0,1 bis 1,0 mm im Durchmesser sind.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Partikel mikrometergroße Partikel mit einer Partikelgröße von 0,1 bis 1,0 μm im Durchmesser sind.
Verfahren zur Isolierung von RNA aus einer zellulären Quelle, die diese zusammen mit DNA und Protein enthält, umfassend die folgenden Schritte: a. mechanische Freisetzung der RNA aus einer diese enthaltenen zellulären Quelle durch Anwendung von gegenseitiger mechanischer Kraft in Anwesenheit eines Extraktionslösungsmittels, welches eine Vielzahl von submikrometer- oder mikrometergroßen Partikeln enthält und welches, bezogen auf das Gewicht vom Gesamtgewicht, 40 bis 60% Phenol in einem wässrigen Puffer mit einem pH-Wert von 4 bis 4,5 aufweist, mit 2M Guanidiniumthiocyanat oder Guanidiniumchlorid; b. Zugabe eines wasserunlöslichen organischen Lösungsmittels, um eine Zwei-Phasen-Mischung herzustellen, die eine wässrige Extraktionslösungsmittel-Phase und eine organische Phase aufweist, wobei die RNA in der wässrigen Phase gelöst und die DNA und das Protein in der organischen Phase oder in der Grenzschicht zwischen den beiden Phasen konzentriert ist; c. Extraktion der Zwischenphase mit Phenol und Chloroform; und d. Ausfällung der DNA mit Ethanol.