DE60012506T2

DE60012506T2 - Mischbett-festphase und dessen verwendung zur isolation von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60012506T2
Application number: DE60012506T
Authority: DE
Inventors: E. Craig SMITH; L. Diana HOLMES; J. Daniel SIMPSON; Jehoshua Katzhendler; M. Rex BITNER; C. Josephine GROSCH
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2020-05-13
Also published as: DE60012506D1; EP1179056A1; EP1179056B1; US6376194B2; CA2372521A1; ATE272111T1; WO2000070041A1; US20020001812A1; US6270970B1; AU774810B2; AU4841500A; JP2002543980A; CA2372521C

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Materialien und Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren, wie beispielsweise Plasmid-DNA, chromosomaler DNA, Gesamt-RNA, mRNA, viraler DNA, viraler RNA oder RNA/DNA-Hybride aus Verunreinigungen, wie beispielsweise Proteinen, Lipiden, Zelltrümmern oder anderen Nukleinsäuren. Diese Erfindung betrifft insbesondere Festphasen, die magnetische oder nicht-magnetische Matrices und stationäre Chromatographiephasen einschließen, die eine Ziel-Nukleinsäure bei Einstellung von Lösungsbedingungen binden und die Ziel-Nukleinsäuren bei einer anderen Einstellung von Lösungsbedingungen wieder freisetzen. Genauer gesagt betrifft diese Erfindung Mischbettfestphasen, umfassend mindestens zwei Arten fester Phasen, wobei jede Festphase in dem Gemisch eine Ziel-Nukleinsäure unter verschiedenen Bedingungen bindet und freisetzt.
Hintergrund
Viele molekularbiologische Techniken wie beispielsweise Reverse Transkription, Klonierung, Restriktionsanalyse, Amplifizierung und Sequenzierung machen es notwendig, dass Nukleinsäuren, die in diesen Techniken verwendet werden, im wesentlichen frei von Verunreinigungen sind, die imstande sind, mit solchen Verarbeitungs- oder Analyseverfahren zu interferieren. Solche Verunreinigungen schließen im allgemeinen Substanzen ein, die chemische Reaktionen blockieren oder inhibieren (z.B. Substanzen, die mit Nukleinsäuren hybridisieren oder Substanzen, die enzymatisch katalysierte Reaktionen blockieren oder inhibieren, und andere Arten von Reaktionen, die in molekularbiologischen Techniken verwendet werden), Substanzen, die die Degradierung oder Depolymerisierung einer Nukleinsäure oder eines anderen biologischen Materials von Interesse katalysieren, oder Substanzen, die die Erkennung der Nukleinsäure von Interesse blockieren oder maskieren. Substanzen der letzten Art können blockieren oder maskieren, indem sie einen "Hintergrund" erzeugen, der für das Vorhandensein einer Anzahl von Nukleinsäuren von Interesse (hierin auch als "Ziel-Nukleinsäure" bezeichnet) in einer Probe Indikativ ist, wenn die Nukleinsäure von Interesse in der Tat jedoch nicht in der Probe vorhanden ist. Verunreinigungen schließen auch makromolekulare Substanzen des in vivo oder in vitro Mediums ein, aus dem die Ziel-Nukleinsäure isoliert wird, makromolekulare Substanzen, wie beispielsweise Enzyme, andere Arten von Proteinen, Polysaccharide oder Polynukleotide wie auch niedermolekulargewichtige Substanzen, wie beispielsweise Lipide, niedermolekulargewichtige Enzyminhibitoren, Oligonukleotide oder Nicht-Ziel-Nukleinsäuren. Kontaminanten können in ein biologisches Ziel-Material auch aus Chemikalien oder anderen Materialien eingebracht werden, die verwendet werden, um das Material aus anderen Substanzen zu isolieren. Häufige Kontaminanten dieser letzten Art schließen Spurenmetalle, Farbstoffe oder organische Lösungsmittel ein.
Das Erhalten einer Ziel-Nukleinsäure, die ausreichend frei von Kontaminanten für molekularbiologische Anwendung ist, ist durch die komplexen Systeme kompliziert, in denen die Ziel-Nukleinsäure typischerweise gefunden wird. Solche Systeme (z.B. Zellen aus Geweben, Zellen aus Körperflüssigkeiten, wie Blut, Lymphe, Milch, Urin, Stuhl, Samenflüssigkeit oder Ähnliches, Zellen in Kultur, Agarose oder Polyacrylamidgelen, oder Lösungen, in denen eine Ziel-Nukleinsäure-Amplifizierung durchgeführt worden ist) enthalten typischerweise signifikante Mengen an Verunreinigungen, aus denen die Ziel-Nukleinsäure von Interesse isoliert werden muss, bevor sie in einem molekularbiologischen Verfahren verwendet wird.
Endotoxine sind besonders problematische Verunreinigungen bei Präparationen von Nukleinsäuren, die aus Gram-negativen Bazillen isoliert werden. Allgemein gesagt ist ein Endotoxin ein Lipopolysaccharidmaterial, das in der Zellwand der meisten solcher Bazillen, einschließlich Escherichia coli ("E. coli"), gefunden wird. Während der Lyse der Bakterienzellen, so wie es gemacht wird, um die Plasmid-DNA aus E. coli-Transformanten freizusetzen, werden Endotoxine in das hierdurch hergestellte Lysat, freigesetzt. Die Endotoxin-Verunreinigung in einer Nukleinsäure-Probe kann die Nützlichkeit der Probe nachteilig einschränken, insbesondere bei Anwendungen, die gegenüber solchen Verunreinigungen empfindlich sind. Die Transfektionseffizienz einiger unterschiedlicher kultivierter eukaryontischer Zellinien z.B., einschließlich HeLa, Huh7, COS7 und LMH, wurde nachweislich in Gegenwart von Endotoxinen stark reduziert. M. Weber et al., 1995, BioTechniques 19(6):930–939. Endotoxine wurden auch als toxisch für primäre menschliche Haut-Fibroblasten und primäre menschliche Melanomzellen in Gegenwart von Adenoviruspartikeln, die fähig sind, einzudringen, gefunden. M. Cotten et al. 1994, Gene Therapy 1:239–246. Es wurde auch gezeigt, dass Endotoxine auffällige pathophysiologische Reaktionen auslösen, wenn sie in Tiere eingeschleust werden, einschließlich hohes Fieber, Vasodilation, Diarrhoe und in extremen Fällen ein fataler Schock. David C. Morrison 1987, Ann. Rev. Med. 38:417–32.
Endotoxine werden von Nukleinsäuren nicht einfach abgetrennt, insbesondere nicht aus Plasmid-DNA. Endotoxine neigen dazu, Mizellen zu bilden, die eine ähnliche Dichte, Größe und Ladungsverteilung auf der äußeren Oberfläche der Endotoxin-Mizellen haben, wie Plasmid-DNA. Deswegen werden Endotoxine mit Nukleinsäuren mitgereinigt, insbesondere mit Plasmid-DNA, und in den meisten Nukleinsäure-Isolationsverfahren, die heute verwendet werden. Endotoxine treten z.B. in der gleichen Bande auf wie der DNA-Ethidiumbromidkomplex in den Cäsiumchloridgradienten, die verwendet werden, um Plasmid-DNA von anderen Materialien in einem bakteriellen Lysat abzutrennen. Endotoxine migrieren auch gemeinsam und eluieren gemeinsam mit Plasmid-DNA bei Größenausschluß und aus Anion-Austauschharzen.
WO95/21179 beschreibt ein chromatographisches Verfahren zum Entfernen von Endotoxinen aus Zusammensetzungen, die therapeutisch wirksame Substanzen enthalten, die aus natürlichen Quellen mit Hilfe der rekombinanten Genetik und/oder Biotechnologie extrahiert wurden.
Konventionelle Verfahren zum Isolieren von DNA oder RNA aus verschiedenen Arten von Zellen, einschließlich Bakterien, beginnen mit Schritten zur Zerstörung der Zelle. Siehe z.B. Kapitel 2 (DNA) und Kapitel 4 (RNA) von F. Ausubel et al. Herausgeber, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York (1993). Konventionelle DNA-Isolationsprotokolle beinhalten im allgemeinen das Suspendieren der Zellen in einer Lösung und die Verwendung von Enzymen und/oder Chemikalien, um die Zellen sanft zu lysieren, wodurch die DNA, die in diesen Zellen enthalten ist, in die erhaltene Lysatlösung freigesetzt wird. Für eine RNA-Isolierung schließen konventionelle Lyse und Lösungsverfahren Maßnahmen zur Inhibierung von Ribonukleasen und Verunreinigungen, einschließlich DNA ein, die von der RNA getrennt werden sollen.
Viele konventionelle Verfahren zum Isolieren von Ziel-Nukleinsäuren aus verschiedenen Gemischen der Ziel-Nukleinsäuren und von Verunreinigungen, einschließlich Gemischen, die aus Zellen, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, schließen die Verwendung von schädlichen Chemikalien, wie beispielsweise Phenol, Chloroform und Ethidiumbromid ein. Phenol oder ein organisches Lösungsmittelgemisch, enthaltend Phenol und Chloroform, werden z.B. in vielen solchen konventionellen Verfahren verwendet, um Kontaminanten aus Gemischen aus Ziel-Nukleinsäuren und verschiedenen Kontaminanten zu extrahieren. Alternativ dazu werden Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten anstelle oder zusätzlich zur Phenol- oder Phenolchloroform-Extraktion verwendet.
Geschlossene zirkuläre DNA, wie beispielsweise Plasmid-DNA, interkaliert mit Ethidiumbromid und bildet in einem Cäsiumchlorid-Gradienten eine Bande, der nach einigen Stunden Ultrazentrifugieren gebildet wird. Die DNA/Ethidiumbromidbande wird extrahiert und die Plasmid-DNA wird aus dem Ethidiumbromid unter Verwendung von Butanol oder anderer konventioneller Verfahren isoliert. Siehe z.B. Molecular Cloning, herausgegeben von Sambrook et al. (1989), publiziert von Cold Spring Harbor Press, Seiten 1.42–1.50. Der Phenol/Chloroform-Extraktionsschritt, oder der Cäsiumchlorid-Bindungs- und Ethidiumbromid-Extraktionsschritt wird im allgemeinen gefolgt von einer Präzipitierung des Nukleinsäurematerials, das in der extrahierten wässrigen Phase verbleibt, indem Ethanol zu dieser wässrigen Phase hinzugegeben wird. Das Präzipitat wird typischerweise mit Hilfe einer Zentrifugation entfernt, und das erhaltene Pellet des Präzipitats wird getrocknet, bevor es in Wasser oder einer Pufferlösung für die weitere Verarbeitung oder Analyse resuspendiert wird.
Solche konventionellen Nukleinsäure-Isolationsverfahren haben bedeutende Nachteile. Unter diesen Nachteilen sind die große Menge an Zeit, die für die vielen Arbeits- und Extraktionsschritte benötigt werden, und die Gefahren der Verwendung von Phenol und/oder Chloroform. Phenol verursacht bei Kontakt schwere Verbrennungen. Chloroform ist sehr flüchtig, toxisch und karzinogen. Diese Eigenschaften machen es notwendig, dass Phenol und Phenol/Chloroform-Extraktionen in einem Abzug durchgeführt werden. Andere unerwünschte Eigenschaften von Phenol-Chloroform-Extraktionen liegen darin, dass die Oxidationsprodukte von Phenol Nukleinsäuren beschädigen können. Nur frisch redestillierter Phenol kann wirksam verwendet werden, und Nukleinsäuren können nicht in Gegenwart von Phenol gelassen werden. Im allgemeinen werden auch Mehrschrittverfahren benötigt, um die RNA nach einer Phenol/Chloroform-Extraktion zu isolieren. Ethanol (oder Isopropanol) -Präzipitierung muss verwendet werden, um die DNA aus einer Phenol/Chloroform-extrahierten wässrigen Lösung der DNA zu präzipitieren und das restliche Phenol und Chloroform aus der DNA zu entfernen. Des weiteren wird eine Ethanol- (Isopropanol-) Präzipitierung benötigt, um Nukleosidtriphosphate und kurze (d. h. weniger als ungefähr 30 Basen oder Basenpaare) einzel- oder doppelsträngige Oligonukleotid-Verunreinigungen aus der DNA zu entfernen. Außerdem ergeben solche Verfahren unter den besten Bedingungen relativ niedrige Ausbeuten an isoliertem Nukleinsäurematerial, und das isolierte Nukleinsäurematerial ist mit Verunreinigungen kontaminiert.
Cäsiumchlorid-Gradienten dauern Zeit zur Bildung, was mindestens 4 Stunden an Rotationszeit benötigt, selbst in den schnellsten, modernsten Zentrifugen. Ethidiumbromid, welches zum Herstellen von Banden von Plasmid- oder chromosomaler DNA in solchen Gradienten benötigt wird, ist ein Mutagen. Auch wenn Cäsiumchlorid-Bandenbildung zum Isolieren von Plasmid-DNA aus bakteriellen Lysaten ohne einen vorhergehenden oder folgenden Proteinextraktionsschritt verwendet wird, wie. beispielsweise einer Phenol/Chloroform-Extraktion ist die Plasmid-DNA, die damit isoliert ist, nachweislich mit Endotoxinen stark kontaminiert. Siehe z.B. Cotten et al., Gene Therapy (1994) 1:239–146, 240 [Tabelle 1].
Einige einfachere, schnellere und sicherere Verfahren sind entwickelt worden, die Festphasen wie beispielsweise Chromatographieharze oder auf Kieselgel basierende Materialien verwenden, um Nukleinsäuren aus Zellysaten oder aus anderen Gemischen aus Nukleinsäuren und Verunreinigungen zu isolieren. Jedes solcher Isolationssysteme, das bisher entwickelt worden ist, hat jedoch seine eigenen Nachteile. Genauer gesagt, schaffen es die meisten solcher Festphasen-Extraktionssysteme nicht, unerwünschte Kontaminanten wie beispielsweise Endotoxine zu eliminieren oder sie schleusen unerwünschte Kontaminanten ein, die in einem anfänglichen Nukleinsäuregemisch nicht vorhanden sind, wie beispielsweise Proteasen oder korrodierende Salze. Jede solcher Kontaminanten muss unter Verwendung von zusätzlichen Extraktionsschritten entfernt werden, bevor die Nukleinsäure, die damit isoliert worden ist, in Anwendungen verwendet werden kann, welche gegenüber solchen Verunreinigungen empfindlich ist.
Eine der ersten Festphasen, die zur Verwendung beim Isolieren von Nukleinsäuren entwickelt worden ist, war ein spezialisiertes Harz aus porösen Kieselgelpartikeln, die für die Verwendung in der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) entworfen wurden. Die Oberfläche der porösen Kieselgelpartikel wurde mit Anionenaustauschern funktionalisiert, die unter bestimmten Salz- und pH-Bedingungen mit der Plasmid-DNA in Wechselwirkung treten können. Siehe z.B. US-Patent Nrn: 4,699,717 und 5,057,426. Machrey-Nagel Co. (Düren, Deutschland) ist eine der ersten Firmen, die HPLC-Säulen zur Verfügung gestellt hat, die mit solchen Anionenaustausch-Kieselgelpartikeln gepackt sind. Machrey-Nagel verkauft solche Säulen heute immer noch. Siehe z.B. Informationen über NUCLEOGEN^® 4000-7DEAE in der Produktinformation, die aus der Machrey-Nagel Homepage im Internet am 06.12.1998 unter http://www.machrey-nagel.com heruntergeladen wurde. Jede dieser Säulen wurde so entworfen, dass die Plasmid-DNA, die daran gebunden ist, in eine wässrige Lösung eluiert wird, die eine hohe Konzentration an hoch korrosiven Salzen enthält (z.B. wird Plasmid-DNA aus NUCLEOGEN^® 4000-7-DEAE-Säulen in 6 M Harnstoff eluiert). Jede dieser Säulen musste zwischen allen Isolationsverfahren gut gewaschen werden, um das korrosive Salz und die Verunreinigungen zu entfernen, die an die Säule mit der DNA aus dem System gebunden waren. Die Nukleinsäurelösung, die hiervon eluiert wurde, musste ebenfalls weiterverarbeitet werden, um das korrosive Salz zu entfernen, bevor sie in molekularbiologischen Standard-Techniken wie beispielweise Klonierung, Transformation, Verdau mit Restriktionsenzymen oder Amplifikation verwendet werden konnte.
Zahlreiche auf Kieselgel basierende Festphasen-Separationssysteme sind seit den frühen HPLC-Systemen, die oben beschrieben wurden, entwickelt worden. Moderne, auf Kieselgel basierende Systeme verwenden Glas mit kontrollierten Poren, Filter, die in die Kieselgelpartikel eingebettet sind, Kieselgelpartikel, Harze, die Kieselgel in Form von Diatomeenerde (diatomaceous earth), Glasfasern oder Gemischen aus dem obigen umfassen. Jedes moderne, auf Kieselgel basierende Festphasen-Trennungssystem ist so konfiguriert, dass es die Nukleinsäurematerialien reversibel bindet, wenn es mit einem Medium in Kontakt gebracht wird, das solche Materialien in Gegenwart von chaotropischen Mitteln gebracht wird. Solche Festphasen sind so entworfen, dass sie an das Nukleinsäurematerial gebunden bleiben, während die Festphase einer externen Kraft, wie beispielsweise einer Zentrifugation oder Vakuumfiltration ausgesetzt wird, um die Matrix und das Nukleinsäurematerial, das hieran gebunden ist, aus den restlichen Medienbestandteilen abzutrennen. Das Nukleinsäurematerial wird dann durch das Aussetzen der Festphase gegenüber einer Elutionslösung von der Festphase eluiert, wie beispielsweise Wasser oder einem Elutionspuffer. Zahlreiche kommerzielle Quellen bieten auf Kieselgel basierende Harze an, die für die Verwendung bei Zentrifugations- und/oder Filtrations-Isolierungssystemen angezeigt sind. Siehe z.B. Wizard^TM DNA purification systems Produkte von Promega Corporation (Madison, Wisconsin, USA); oder die QuiaPrep^TM DNA-isolation systems von Quiagen Corp. (Santa Clarita, California, USA).
Magnetisch reagierende Partikel, die zuvor verwendet wurden, um Polypeptidmoleküle, wie beispielsweise Proteine oder Antikörper zu isolieren und zu reinigen, sind ebenfalls als Festphasen beim Isolieren von Nukleinsäuren entwickelt worden. Einige verschiedene Arten magnetisch reagierender Partikel, die zur Isolierung solcher Materialien entworfen wurden, sind in der Literatur beschrieben, und viele dieser Arten von Partikeln sind aus kommerziellen Quellen erhältlich. WO98/31840 und R. Bitner et al., Proceedings of SPIE-Int. Soc. Opt. Eng., Band 3926, Seiten 126–133 beschreiben beispielsweise Verfahren zum Isolieren biologischer Ziel-Materialien, die DNA oder RNA aus anderen Substanzen in einem Medium unter Verwendung von Kieselerdemagnetpartikeln.
Solche Partikel fallen im allgemeinen in eine der zwei Kategorien, entweder die, die so entworfen wurden, dass sie Nukleinsäurematerialien direkt reversibel binden, und solche, die derart gestaltet wurden, dass sie Nukleinsäurematerialien durch ein Zwischenreagenz reversibel binden. Als Beispiel der Partikel des ersten Typs, siehe auf Kieselgel-basierende poröse Partikel, die so entworfen wurden, dass sie direkt reversibel an DNA binden, wie beispielsweise MagneSil^TM- Partikel, die kommerziell erhältlich gemacht wurden von Promega Corporation oder BioMag^® Magnetpartikel, erhältlich von Per-Septive Biosystems. Als Beispiele solcher Partikel und Systeme des zweiten Typs, die so entworfen wurden, dass sie eine bestimmte Art von Nukleinsäure (mRNA) reversibel binden, siehe die PolyAtract^® Serie 9600^TM mRNA Isolation System von Promega Corporation; oder die ProActive^TM line der Streptavidin-beschichteten mikrosphären Partikel von Bangs Laboratories (Carmel, Indiana, USA). Diese beiden. letztgenannten zwei Systeme verwenden magnetisch reaktive Partikel mit Avidin-Untereinheiten, die hieran kovalent gebunden sind, und Streptavidin mit einem Oligo-dT-Rest, der kovalent hieran gebunden ist. Die Streptavidin-Oligo-dT-Moleküle werden als Zwischenprodukte, die an den Poly-A-Rest von mRNA-Molekülen hybridisieren, wenn sie hiermit in Kontakt gebracht werden, die dann durch eine freisetzbare Streptavidin-Avidin-Bindung an die Partikel binden.
Die indirekt bindenden Magnettrennungssysteme für die Nukleinsäureisolierung oder -trennung benötigen alle mindestens drei Komponenten, d.h. Magnetpartikel, ein Zwischenreagenz, und ein Medium, das das Nukleinsäurematerial von Interesse enthält. Die Zwischenprodukt/Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktion und die Zwischenprodukt/Partikelbindungsreaktion benötigt häufig verschiedene Lösungs- und/oder Temperatur-Reaktionsbedingungen. Jede zusätzliche Komponente oder Lösung, die bei der Nukleinsäureisolierungsprozedur verwendet wird, steigert das Risiko der Kontamination der isolierten Endprodukte durch Nukleasen, Metalle oder andere schädliche Substanzen.
Zahlreiche Arten magnetisch reaktiver, auf Kieselgel basierender Partikel sind zur Verwendung als Festphasen in direkten oder indirekten Nukleinsäure-Bindungs-Isolierungsverfahren entwickelt worden. Ein solcher Partikeltyp ist ein magnetisch reaktives Glaskügelchen, bevorzugt mit einer kontrollierten Porengröße. Siehe z.B. Magnetic Porous Glass (MPG)-Partikel von CPG, Inc. (Lincoln Park, New Jersey, USA) oder poröse Magnetglaspartikel, beschrieben in den US-Patenten Nrn. 4,395,271; 4,233,169 oder 4,297,337. Nukleinsäurematerial neigt dazu, sehr fest an Glas zu binden, so dass es jedoch sehr schwer davon zu entfernen ist, sobald es daran gebunden ist. Deswegen neigen die Elutionseffizienzen von glasmagnetischen Glaspartikeln dazu, im Vergleich mit den Elutionseffizienzen von Partikeln, die niedrigere Mengen an Nukleinsäure-bindenden Materialien, wie beispielsweise Kieselerde, enthalten, niedrig zu sein.
Ein weiterer Typ magnetisch reaktiver Partikel, der zur Verwendung als Festphase beim direkten Binden und der Isolierung von Nukleinsäuren entworfen wurde, insbesondere für DNA, ist ein Partikel, das Agarose umfasst und mit kleineren ferromagnetischen Partikeln eingebettet und mit Glas beschichtet ist. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,395,498. Eine dritte Art magnetisch reaktiver Partikel, die für die direkte Bindung und Isolierung von Nukleinsäuren entworfen worden ist, wird durch das Einschließen magnetischer Materialien in eine Matrix von polymerischen Silikondioxidverbindungen hergestellt. Siehe z.B. das deutsche Patent Nr. DE 43 07 262 A1 . Die letztgenannten zwei Arten von Magnetpartikeln, der Agarosepartikel und die polymere Silikondioxidmatrix neigen dazu, Eisen unter den Bedingungen, die zum Binden von Nukleinsäurematerialien in direkter Form an jedes solcher Magnetpartikel auslecken zu lassen. Es ist auch schwierig, solche Partikel mit einer ausreichend uniformen und konzentrierten magnetischen Kapazität herzustellen, um eine schnelle und effiziente Isolierung von Nukleinsäurematerialien zu sichern, die hieran gebunden sind.
Auf Kieselerde basierende Festphasen-Nukleinsäure-Isolierungssysteme, ob magnetisch oder nicht-magnetisch oder für die direkte oder indirekte Bindung ausgerichtet, sind schnell und leicht zu verwenden und benötigen nicht die Verwendung von korrosiven oder gefährlichen Chemikalien. Jedes dieser Systeme ist jedoch ineffizient beim Isolieren von Nukleinsäuren aus Verunreinigungen, wie beispielsweise Endotoxinen, die dazu neigen, an solche festen Träger zu binden und unter den gleichen Bedingungen wie die Nukleinsäuren zu eluieren. Siehe z.B. Cotten, Matt et al., Gene Therapy (1994) 1:239–246.
Einige Nukleinsäure-Isolationssysteme sind entwickelt worden, in denen eine Nukleinsäurelösung, die Protein enthält, mit Proteasen vorbehandelt wird, um mindestens einige der Proteine, die hierin enthalten sind, vor der Isolierung der Nukleinsäure, unter Verwendung eines auf Kieselerde basierenden festen Trägers der oben beschriebenen Art zu verdauen. Siehe z.B. QuiaAmp^TM Blood Kit, zur Verfügung gestellt von QUIAGEN Inc. (Santa Clarita, Californien), welche Protease verwenden; und Wizard^® Plus SV Minipreps DNA Purification System, zur Verfügung gestellt von Promega Corp. (Madison, Wisconsin), welches alkalische Protease verwendet. Solche Vorbehandlungssysteme benötigen jedoch die Einschleusung einer Kontaminante in das Gemisch, um eine andere Kontaminante zu verdauen. Mitgeführte Proteasen können die Verwendung der Nukleinsäuren limitieren, die unter Verwendung solcher modifizierten Kieselerde basierender Systeme isoliert worden sind, zumindest insofern, als Nukleinsäureproben, die mit den Proteinen kontaminiert sind, die die Proteasen zum Verdauen eingesetzt worden sind. Genauer gesagt, unter den geeigneten Lösungsbedingungen werden Proteasen in einer Nukleinsäurelösung alle Proteine verdauen, die in die Lösung eingebracht worden sind, einschließlich Enzyme, die darin eingebracht wurden, um zu modifizieren, zu schneiden oder die Nukleinsäure, die darin enthalten ist, für nachfolgende Verarbeitung oder Analyse zu transkribieren. Die Zugabe von Protease, die Inkubation und die Entfernungsschritte, erhöhen ebenfalls die Kosten der Nukleinsäure-Isolierung, kosten Zeit und Geld im Vergleich mit Isolierungssystemen ohne solche zusätzlichen Schritte.
In allen oben beschriebenen Festphasesystemen hat jede Festphase, die hierin verwendet wird, eine im wesentlichen gleichförmige Oberflächenzusammensetzung, die so gestaltet wurde, dass sie eine Nukleinsäure von Interesse in Form einer Kieselgeloberfläche, oder in Form einer Kieselgel- oder Polymeroberfläche, die mit chemischen Gruppen modifiziert sind, die Anionenaustauscherwirkungen aufweisen, bindet. Bimodus- und Multimodussysteme sind ebenfalls entwickelt worden, in denen mehrere Säulen jeweils eine Festphase enthalten, die mit einer verschiedenen chemischen Gruppe modifiziert worden ist als die anderen Säulen in dem System (siehe z.B. Wheatley J.B., J. Chhromatogr. (1992) 603:273), oder in denen eine einzelne Säule verwendet wird, mit einer einzelnen Festphase mit mindestens zwei verschiedenen chemischen Gruppen (siehe z.B. Patent Nr. '680; E. L. Little et al., Anal. Chem. (1991) 63:33). Jede der chemischen Gruppen auf der Oberfläche der festen Träger in der Einzelsäule oder der Mehrsäulen-multimodulären Systeme ist so konfiguriert, dass sie an verschiedene Materialien, die in das System eingebracht worden sind, in welchem System auch immer, bindet. D.M. Brown et al., Journal of Chromatography 1989, Nr. 1, Seiten 291–300, beschreiben Mischbettionenaustauschsäulen, die Tonerde und Kieselerde für die gleichzeitige Trennung von Anionen- und Kationenanalyten enthalten. Nur einige wenige solcher bimodulären oder multimodulären Säulenchromatographiesysteme sind spezifisch für die Nukleinsäureisolierung entwickelt worden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,316,680). In GB-A-2074892 sind Mischphasen-Chromatographie-Zusammensetzungen für die Trennung von Biopolymeren beschrieben. Oberflächengruppen-Zusammensetzungen, die in solchen Festphasensystemen verwendet werden, schließen Umkehrphasen-, Ionenaustausch-, Größenausschluß-, normale Phase, hydrophobe Interaktion, hydrophile Interaktion und Affinitätschromatographie ein.
Solche Systeme sind so entworfen worden, dass nur eine der Oberflächengruppen eine Ziel-Spezies bindet, wie beispielsweise eine Nukleinsäure, während die andere Oberflächengruppe(n) eine oder mehrere Nicht-Ziel-Spezies in einem Gemisch bindet und entfernt.
Die bimodulären und multimodulären Systeme sind alles andere als einfache, wirksame Alternativen gegenüber konventionellen organischen- oder Harzverfahren zur Nukleinsäure-Isolation, die oben beschrieben wurde. Mehrsäulensysteme sind inhärent komplex zu betreiben, da jede Säule eine einzigartige Zusammensetzung von Bedingungen für die mobile Phase benötigt, um die gewünschte Ziel- oder Nicht-Ziel-Spezies, die an die stationäre Festphase des Systems gebunden ist, zu binden oder/und freizusetzen. Nicht-Ziel-Spezies neigen dazu, benachbarte funktionale Gruppen zu blockieren, die so konfiguriert wurden, dass sie die Ziel-Spezies binden, wodurch die Gesamtausbeute negativ beeinflusst wird. Alle der bimodulären oder multimodulären Systeme werden auch nur so entworfen, dass sie eine Ziel-Spezies von anderen Spezies trennen, für die funktionale Gruppen eine Affinität besitzen.
Materialien und Verfahren werden benötigt, die schnell, sicher und wirksam Ziel-Nukleinsäuren isolieren, die ausreichend frei von Kontaminanten sind, insbesondere von Endotoxinen, welche in molekularbiologischen Verfahren verwendet werden sollen. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Notwendigkeit für Materialien und Verfahren, die ein schnelles und wirksames Verfahren zum Isolieren von Ziel-Nukleinsäuren aus jeder Mischung von Ziel-Nukleinsäuren und Kontaminanten, einschließlich Lysaten aus gramnegativen Bakterien bereitstellen, wodurch gereinigte Nukleinsäuren zur Verfügung gestellt werden können, die in einer Vielzahl biologischer Anwendungen verwendet werden können, einschließlich der Transfektion von kultivierten Zellen und in vivo-Verabreichung von Nukleinsäuren an Organismen.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Kurz gesagt, ist die vorliegende Erfindung in einem Aspekt eine Mischbettfestphase, die zur Verwendung zum Isolieren von Ziel-Nukleinsäuren aus einem Gemisch entworfen ist, welches die Ziel-Nukleinsäure und mindestens eine Kontaminante enthält. In einer bevorzugten praktischen Anwendung sind in dem Gemisch mehrere Kontaminanten enthalten. Die Mischbettfestphase umfasst mindestens zwei verschiedene Festphasen, von denen jede die Fähigkeit besitzt, Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart verschiedener Lösungsbedingungen zu binden und freizusetzen.

die Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugt eine erste Festphase und eine zweite Festphase, wobei
die erste Festphase die Fähigkeit hat, die Ziel-Nukleinsäure zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart einer ersten Lösung kombiniert wird und eine Fähigkeit, die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen;
die zweite Festphase eine Fähigkeit hat, die Ziel-Nukleinsäure zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart einer zweiten Lösung kombiniert wird, und eine Fähigkeit, die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen; und
die erste Festphase und die zweite Festphase jeweils die Fähigkeit haben, die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen.

In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung eine Mischbettfestphase zum Isolieren einer Ziel-Nukleinsäure aus einem Gemisch, das die Ziel-Nukleinsäure und mindestens eine Kontaminante umfasst, wobei die Mischbettfestphase erste Kieselerdemagnetpartikel und zweite Kieselerdemagnetpartikel umfasst, wobei

(a) die ersten Kieselerdemagnetpartikel eine Fähigkeit besitzen, die Ziel-Nukleinsäure zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart einer ersten Lösung kombiniert werden, und eine Fähigkeit, die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen;
(b) die zweiten Kieselerdemagnetpartikel eine Fähigkeit besitzen, die Ziel-Nukleinsäure zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart der zweiten Lösung kombiniert werden, und eine Fähigkeit, die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen; und
(c) die ersten Kieselerdemagnetpartikel und die zweiten Kieselerdemagnetpartikel alle die Fähigkeit besitzen, die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen.

In diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind diese ersten Kieselerdemagnetpartikel und die zweiten Kieselerdemagnetpartikel entweder Kieselerdemagnetpartikel, die jeweils mindestens einen Ionenaustauschrest umfassen, der kovalent daran gebunden ist, oder Kieselerdemagnetpartikel, die eine Siliziumoxidbeschichtung bzw. einen Nicht-Anionaustauschrest umfassen. Der Ionenaustauschrest ist entweder ein Anionaustauschrest, oder ein Ionenaustauschrest, der eine positive Ladung in Gegenwart der ersten Lösung oder zweiten Lösung hat, so dass er mit der Ziel-Nukleinsäure in dieser Lösung interagieren kann.
In einem weiteren Aspekt sind die vorliegende Erfindung Kieselerdemagnetpartikel, umfassend: eine Vielzahl an ersten Kieselerdemagnetpartikeln, von denen jede einen ersten Kieselerdemagnetpartikel umfasst, der kovalent an einen Diethylamino-(DEA)-Anionenaustauschrest gebunden ist. Solche DEA-Ionenaustausch-Kieselerdemagnetpartikel sind besonders geeignet zur Verwendung als eine der Festphasen in der Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung, die oben beschrieben wurde, und in den Verfahren zum Isolieren von Ziel-Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung, die unten beschrieben wird.
Die vorliegende Erfindung ist auch ein Verfahren zum Isolieren von einer Ziel-Nukleinsäure aus einem Gemisch, umfassend die Ziel-Nukleinsäure und mindestens eine Kontaminante, unter Verwendung einer Mischbettfestphase, umfassend eine erste Festphase und eine zweite Festphase. Dieses Verfahren umfasst die Schritte des:

(a) Bereitstellens einer Mischbettfestphase;
(b) Kombinierens der Mischung mit der Mischbettfestphase in Gegenwart einer ersten Lösung und Erlauben der Ziel-Nukleinsäure an die erste Festphase zu binden;
(c) Trennens der Mischbettfestphase aus der ersten Lösung;
(d) Kombinierens der Mischbettfestphase mit einer zweiten Lösung, und Erlauben der Ziel-Nukleinsäure, von der ersten Festphase freigesetzt zu werden, und eine zweite Festphase zu binden;
(e) Trennens der Mischbettfestphase von der zweiten Lösung; und
(f) Kombinierens der Mischbettfestphase mit dem Elutionspuffer, und Ermöglichen, dass die Ziel-Nukleinsäure von der Mischbettfestphase in den Elutionspuffer freigesetzt wird.

Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst bevorzugt zusätzliche Schritte, wobei die Mischbettfestphase der ersten Lösung rekombiniert und von der ersten Lösung und der zweiten Lösung vor dem Kombinieren mit dem Elutionspuffer in Schritt (f) kombiniert, rekombiniert und getrennt wird.
Die Verfahren und Materialien der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Ziel-Nukleinsäuren zu isolieren, die nicht nur begrenzt sind auf Plasmid-DNA, Gesamt-RNA, amplifizierte Nukleinsäuren und genomische DNA aus einer Vielzahl von Kontaminanten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Agarose und Bestandteile von Bakterien, Tiergewebe und Blutzellen, die nicht die Ziel-Nukleinsäure sind.
Die Mischbettfestphase und Verfahren dieser Erfindung ermöglicht eine Vielzahl verschiedener Arten von Ziel-Nukleinsäuren schnell und wirksam aus einer Vielzahl von verschiedenen Substanzen zu isolieren, ohne die Notwendigkeit, gefährliche Chemikalien zu verwenden (z.B. Phenol, Chloroform, Ethidiumbromid oder Cäsiumchlorid). Ohne die Absicht zu haben, den Erfindungsbereich zu begrenzen, wird hier vorgeschlagen, dass die erste Festphase und die zweite Festphase effizienter in Mischbettkonfiguration der vorliegenden Erfindung zusammenarbeiten, als wenn jede Phase alleine verwendet werden würde, um eine Ziel-Nukleinsäure zu isolieren, in Tandemform oder als separate funktionale Gruppen der gleichen Festphase, aus den folgenden Gründen.
Die Mischbettkonfiguration ermöglicht einem die Ziel-Nukleinsäure vor und zurück von der ersten Festphase zur zweiten Festphase zu transferieren, wodurch die Ziel-Nukleinsäure von den Kontaminanten, die hiermit assoziiert sind, in jedem Transferschritt isoliert wird. Wenn nur eine der Festphasen verwendet wird, um die Ziel-Nukleinsäure zu isolieren, werden beträchtlich weniger der Kontaminanten entfernt.
Wenn sie in Tandem verwendet werden, wird die Ziel-Nukleinsäure nur einmal an eine Festphase gebunden und freigesetzt, was mindestens eine Kontaminante, z.B. die Ziel-Nukleinsäure-Mischung zurücklässt. Wenn zwei verschiedene funktionale Gruppen mit verschiedenen Affinitäten für die Ziel-Nukleinsäure auf der gleichen Festphase bereitgestellt werden, wird die Ziel-Nukleinsäure nicht effizient gebunden und hiervon freigesetzt, wenn sie von einer Festphase zu einer anderen transferiert wird, wie wenn die Mischbettfestphase in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird.
Die Mischbettfestphase ruft, verglichen mit bekannten Festphasesystemen oder anderen chromatographischen Trennungstechniken, überraschende und unerwartete Ergebnisse hervor.
Ziel-Nukleinsäuren, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mischbettfestphase oder Verfahren darin isoliert werden, sind ausreichend frei von Kontaminanten, um zur Verwendung in zusätzlichen Verfahren, zur Analyse oder selbst in Verabreichungsschritten an Säuger verwendet zu werden. Anwendungen der vorliegenden Mischbettfestphase, um Nukleinsäuren aus einer Vielzahl verschiedener Medien zu isolieren, wird aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung, die unten folgt, klar. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, dass die detaillierte Beschreibung der Erfindung nur exemplarisch gemeint ist und nicht als Begrenzung des Erfindungsbereichs angesehen werden sollte.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein theoretischer Graph der Bindungsaktivität von zwei verschiedenen Anionenaustauschfestphasen, wobei eine (Dreieck) mit einem pKa, der signifikant niedriger als der pKa des zweiten (Kreise) ist.
2 ist eine Kopie eines Fotos einer Plasmid-DNA, die in einem Agarosegel fraktioniert wurde, und mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, wobei die Zeilen die Punkte zeigen, an denen die Banden der Plasmid-DNA vor der Isolierung der Plasmid-DNA mit Mischbettfestphasepartikeln, wie in Beispiel 11 beschrieben, ausgeschnitten wurden.
3 ist eine Kopie eines Fotos von genomischer DNA und Gesamt-RNA, die aus Mäuseblut unter Verwendung der Mischbettfestphase, wie in den Beispielen 14, 17 und 18 beschrieben, isoliert wurde, auf einem Agarosegel fraktioniert wurde und mit Ethidiumbromid gefärbt wurde.
4 ist eine Kopie eines Fotos von Gesamt-RNA, die aus Maus-Leber unter Verwendung einer Mischbettfestphase oder unter Verwendung von SV Total RNA Isolation System^® (Promega Corp.) isoliert wurde, und auf einem Agarosegel mit verschiedenen Proben einer 100 Bp-Leiter fraktioniert wurde, und mit Ethidiumbromid gefärbt wurde.
5 ist eine Kopie eines Fotos von DNA, die mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert wurde und unter Verwendung von Mischbettfestphase unter verschiedenen Waschbedingungen isoliert wurde, und mit Ethidiumbromid gefärbt wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Begriff "Festphase" wird hier im Sinne der Standard-Chromatographie verwendet, um eine unlösliche, für gewöhnlich feste Matrix oder stationäre Phase zu bezeichnen, die mit einer Lösung interagiert, in diesem Fall einer Ziel-Nukleinsäure in einer Lösungsmischung. Der Begriff Festphase, so wie er hier verwendet wird, schließt spezifisch stationäre Phasen in der Flüssigchromatographie (LC), Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC), partikelförmige Matrizes, die in Filter eingebettet oder daran gebunden sind, und magnetische oder nicht-magnetische, poröse oder nicht-poröse Matrixpartikel ein, die mit Lösungen interagieren, wenn sie direkt zu einer Lösungsmischung hinzugegeben werden.
Die Begriffe "erste Festphase" und "zweite Festphase" so wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf separate und distinkte Festphasenmedien (z.B. separate Harze, Matrix, Partikel oder Filtermedien), von denen jede eine unterschiedliche Affinität für die Ziel-Nukleinsäurelösung in der Lösungsmischung hat.
Der Begriff "Mischbettfestphase", so wie er hier verwendet wird, betrifft mindestens zwei verschiedene Festphasen in einem einzelnen Behälter oder aus einer Säule (z.B. eine erste Festphase und eine zweite Festphase), wobei jede Festphase in dem Mischbett eine unterschiedliche Affinität für die Lösung hat. Die Mischbettfestphase kann in je einer Anzahl verschiedener Formen oder Gemische von Formen sein, einschließlich eines Gemischs aus mindestens zwei verschiedenen Arten von Chromatographiepartikeln (wie beispielsweise ein Gemisch von Umkehrphase oder Ionenaustauschpartikeln, oder einem Gemisch aus Ionenaustauschpartikeln mit verschiedenen Affinitäten für eine besondere Ziel-Nukleinsäure), ein Gemisch aus mindestens zwei verschiedenen Arten von Kieselerdemagnetpartikeln (z.B. ein Gemisch aus Kieselerdemagnetpartikeln, deren Oberfläche von einer Art von Partikel in dem Gemisch entweder Kieselgel oder Glas mit keiner funktionalen Gruppe daran gebunden ist, oder Kieselgel oder Glas mit einer Siliziumoxidbeschichtung, während die andere Spezies des Partikels in dem Gemisch eine Ionenaustauschgruppe hat, hieran kovalent gebunden hat), oder eine Kombination aus mindestens zwei verschiedenen Filtern mit einem verschiedenen Typ von Partikel oder funktionaler Gruppe, die hieran gebunden ist oder darin eingebettet ist. Unabhängig von der Form, in der jede Festphase in der Mischbettfestphase vorliegt, hängt die Affinität jeder Festphase eines gegebenen gelösten Stoffs von der Zusammensetzung der Festphase ab, einschließlich der Zusammensetzung der Oberfläche jedes Festphasepartikels. Die Affinität für Ziel-Nukleinsäuren in der Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung kann durch eine aus einer Vielzahl aus Mitteln sein, die verwendet werden, um einen gelösten Stoff an eine Festphase zu binden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf ionische Interaktion (z.B. Anionenaustauschchromatographie) und hydrophobe Wechselwirkung (z.B. Umkehrphasenchromatographie).
Der Begriff "Kieselgel" so wie er hier verwendet wird, betrifft Kieselgel für Chromatographiegrade, eine Substanz, die kommerziell aus einer Vielzahl an Quellen erhältlich ist. Kieselgel wird meistens durch das Ansäuern einer Lösung, die Silikat enthält, z.B. Natriumsilikat, auf einen pH-Wert von weniger als 10 oder 11 und dann dem Ermöglichen, dass die angesäuerte Lösung geliert, hergestellt. Siehe z.B. Kieselerde-Herstellungsdiskussion in Kurt-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Band 21, Mary Howe-Grant, Herausgeber John Wiley & Sons, veröffentlicht 1997, Seiten 1020–1023.
Der Begriff "Glaspartikel" so wie er hier verwendet wird, bedeutet Partikel kristalliner Kieselerde (z.B. α-Quartz, glasförmige Kieselerde), obwohl kristalline Kieselerden nicht formal "Glase" sind, da sie nicht amorph sind, oder Partikel aus Glas, die hauptsächlich aus Kieselerde bestehen.
So wie er hier verwendet wird, betrifft der Begriff "Kieselmagnetpartikel" auf Kieselerdematrizes, die weiter aus Materialien umfasst sind, die kein Magnetfeld haben, aber die einen magnetischen Dipol bilden, wenn sie einem Magnetfeld ausgesetzt werden, d.h. Materialien, die in der Lage sind, in Gegenwart von einem Magnetfeld magnetisiert zu werden, aber welche selbst in Abwesenheit solch eines Feldes nicht-magnetisch sind. Der Begriff "magnetisch" so wie er in diesem Kontext verwendet wird, schließt Materialien ein, die paramagnetische oder superparamagnetische Materialien sind. Der Begriff "magnetisch", so wie er hier verwendet wird, umfasst auch temporär magnetische Materialien, wie beispielsweise ferromagnetische oder ferrimagnetische Materialien. Außer wenn es unten anders angegeben ist, umfassen die Kieselerdemagnetpartikel, die in dieser Erfindung verwendet werden, bevorzugt einen superparamagnetischen Kern, der mit Siliziumoxid beschichtet ist, und mit einer hydroben Siliziumoxid-adsorbierenden Oberfläche (d.h. eine Oberfläche, die durch die Anwesenheit von Silanolgruppen gekennzeichnet ist).
Der Begriff "chaotropes Mittel" so wie er hier verwendet wird, betrifft Salze von bestimmten Ionen, welche, wenn sie in ausreichend hoher Konzentration in einer wässrigen Lösung vorhanden sind, dazu führen, dass darin vorhandene Proteine sich entfalten und Nukleinsäuren ihre Sekundärstruktur verlieren. Es wird vermutet, dass chaotrope Ionen die Wirkungen haben, das sie die Wasserstoffbindungs-Netzwerke zerstören, die in flüssigem Wasser vorhanden sind, und dadurch denaturierte Proteine und Nukleinsäuren thermodynamisch stabiler machen als ihre korrekt gefalteten oder strukturierten Gegenstücke. Chaotrope Ione schließen Guanidinium, Iodid, Perchlorat und Trichloracetat ein. Chaotrope Mittel schließen Guanidinhydrochlorid, Guanidinthiocyanat (welches manchmal als Guanidinisothiocyanat bezeichnet wird), Natriumiodid, Natriumperchlorat und Natriumtrichloracetat ein.
Die erste Festphase und die zweiten Festphasebestandteile der Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung haben jeweils die Fähigkeit, unter verschiedenen Lösungsbedingungen an Ziel-Nukleinsäuren zu binden und sie freizusetzen. Die erste Festphase hat die Fähigkeit, in Gegenwart einer ersten Lösung an die Ziel-Nukleinsäure zu binden, und die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart der zweiten Lösung freizusetzen, während die zweite Festphase die Fähigkeit hat, die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart der zweiten Lösung zu binden und die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen. Das bedeutet, wenn die Mischbettfestphase mit einer Mischung aus einer Ziel-Nukleinsäure und mindestens einer Kontaminante in Gegenwart der ersten Lösung, die Ziel-Nukleinsäure an die erste Festphase bindet, kombiniert wird. Wenn die Mischbettfestphase dann von der ersten Lösung separiert wird und mit der zweiten Lösung kombiniert wird, dann wird die Ziel-Nukleinsäure aus der ersten Festphase freigesetzt und bindet an die zweite Festphase. Die Mischbettfestphase wird dann von der zweiten Lösung getrennt, und mit einem Elutionspuffer kombiniert, wobei die Ziel-Nukleinsäure in den Elutionspuffer freigesetzt wird. Die Mischbettfestphase wird bevorzugt mit der ersten Lösung kombiniert und davon getrennt, und/oder mindestens ein weiteres Mal, bevor sie mit dem Elutionspuffer kombiniert wird, mit der zweiten Lösung kombiniert und davon getrennt.
Die erste Festphase und die zweite Festphase können aus jedem gewöhnlichen Trägermaterial gemacht werden, einschließlich Weichgelträgern, wie beispielweise Agarose, Polyacrylamid oder Cellulose, oder harten Trägermaterialien, wie beispielsweise Polystyrol, Latex, Methacrylat oder Kieselerde. Wenn das Festphaseträgermaterial Kieselerde ist, ist es bevorzugt in Form von Kieselgel, Siliziumoxid, fester Kieselerde wie beispielsweise Glas oder Kieselgur oder einem Gemisch aus zweien oder mehreren der obigen. Mindestens eine der Festphasen in der Mischbettfestphase umfasst bevorzugt Kieselgelpartikel. Kieselgelpartikel sind bei viel höheren Drucken stabil als Festphasen, was die Kieselgelfestphasen für HPLC wie auch für LC oder Batchtrennungsanwendungen geeignet macht. Kieselerdematerialien, wie beispielsweise Kieselgelpartikel können Ziel-Nukleinsäuren in Gegenwart von chaotropen Mitteln binden. Kieselerdematerialien können auch mindestens eine Kontaminante, wie beispielsweise Endotoxine, in Abwesenheit von solchen Mitteln binden.
Die erfindungsgemäß verwendete Mischbettfestphase liegt bevorzugt in einer Form vor, die aus einer Mischung eines gelösten Stoffs abgetrennt werden kann, die die Ziel-Nukleinsäure umfasst, und mindestens eine Kontaminante, nachdem die Solutmischung hiermit kombiniert wurde, durch die Anwendung einer externen Kraft. Ein Fachmann weiß, dass die Art externer Kraft, die zur Verwendung beim Trennen der Mischbettfestphase-Mischform von der Solutmischung von der Form abhängt, in der die Mischbettfestphasemischung der Solutmischung ausgesetzt wird, und durch die physikalischen Eigenschaften der Mischbettfestphase selbst. Schwerkraft kann beispielsweise verwendet werden, um die Mischbettfestphase von der Solutmischung abzutrennen, wenn die Mischbettfestphase ein Mischbettharz ist, das auf eine LC-Säule geladen wird, wenn die Mischbettfestphase ein Mischbettharz oder eine Mischung aus Partikeln mit kontrollierten Poren (z.B. aus Kieselerde basierenden Partikeln), die batchweise zu einer Solutmischung hinzugegeben werden, und hiervon dann durch Dekantieren oder Filtrieren abgetrennt werden, oder wenn die Mischbettfestphase in einen Filter eingebettet ist oder daran angehängt ist, durch den die Solutmischung durchläuft. Die externe Kraft ist Hochdruckflüssigkeit, wenn die Mischbettfestphase die stationäre Phase einer Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule bildet (HPLC). Andere Formen externer Kraft, die für die Verwendung in dem Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, schließen Vakuumfiltrieren (z.B. wenn die Mischbettfestphase Glaspartikel mit kontrollierten Poren sind, Mischbettfestphasenpartikel sowie einen Mix aus anderen auf Kieselerde basierenden Partikeln, oder sie in einen Filter eingebettet sind oder daran angehängt sind), Zentrifugation (z.B. wenn die Mischbettfestphase partikelförmig ist), oder magnetisch (z.B. wenn die Mischbettfestphase magnetische oder paramagnetische Partikel umfasst).
Kieselerdematerialien, insbesondere Kieselgel, kann für die Verwendung in der Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung konfiguriert werden, wobei jedes oder mehrere der oben erwähnten Mittel verwendet werden kann. Auf Kieselerde basierende Festphasen, die besonders zur Verwendung als erste oder zweite Festphase in der Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden schließen Festphasen ein, die in der PCT-Anmeldungsnummer WO 95/06652, US-Patent Nr. 6,658,548, PCT-Veröffentlichungsnummer WO98/31840 und Festphasen, die von der Promega Corporation zur Verwendung bei der Plasmid-DNA-Isolierung verkauft werden, z.B. Wizard^® Minipreps DNA Purification Harz, von denen alle hierdurch durch Referenz eingeschlossen sind.
Wenn die erste oder zweite Festphase ein Kieselgelpartikel ist, der magnetisch ist, ist er bevorzugt ein Kieselerdemagnetpartikel, mehr bevorzugt ein Siliziumoxidbeschichtetes (SOCM) Kieselerdemagnetpartikel, wie in der PCT-Veröffentlichungsnummer PCT/US98/01149, veröffentlicht als WO98/31461 am 23. Juli 1998 offenbart. Ein Kieselerdemagnetpartikel kann aus einer Lösung unter Verwendung jedes der externen Mittel, die oben zur Verwendung mit anderen Kieselerdematrices beschrieben wurden, abgetrennt werden. Bevorzugt ist die externe Vorrichtung, die verwendet wird, um das Kieselerdemagnetpartikel von einer Lösung abzutrennen aber Magnetkraft. Die erste Festphase und die zweite Festphase sind bevorzugt beide Kieselerdemagnetpartikel.
Wenn irgendeines der ersten oder zweiten Kieselgelmatrices ein Kieselerdemagnetpartikel ist, dann wird die Größe des Partikels bevorzugt wie folgt ausgewählt. Kleinere Kieselerdemagnetpartikel stellen einen größeren Oberflächenbereich zur Absorption zur Verfügung (auf Gewichtseinheitsbasis), aber kleinere Partikel sind hinsichtlich der Menge an Magnetmaterial, das in solche Partikel inkorporiert werden kann, im Vergleich zu größeren Partikeln limitiert. Die mittlere Partikelgröße der Kieselerdemagnetpartikel, die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden, beträgt ungefähr 1 bis 15 μm, mehr bevorzugt ungefähr 3 bis 10 μm, und am meisten bevorzugt ungefähr 4 bis 7 μm. Die Größenverteilung der Partikel kann auch variiert werden. Eine relativ enge Monodal-Partikelgrößenverteilung ist jedoch bevorzugt. Die Monodal-Partikelgrößenverteilung ist bevorzugt so, dass ungefähr 80 Gew.% der Partikel innerhalb eines 10 μm-Bereichs der ungefähren mittleren Partikelgröße sind, mehr bevorzugt innerhalb eines 8 μm-Bereichs, und am meisten bevorzugt innerhalb eines 6 μm-Bereichs.
Die ersten und zweite Festphasen der Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung kann fest oder halbfest, porös oder nicht-porös sein. Die Auswahl solcher Eigenschaften jeder der Festphasen, die in der Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird hauptsächlich durch die Art der Ziel-Nukleinsäure bestimmt, und durch die Art des Materials, aus der sie isoliert werden soll. Wenn Poren in irgendeiner der Festphasen in der Mischbettfestphase vorhanden sind, haben mindestens einige der Poren bevorzugterweise eine Größe, die ausreichend groß ist, um das Ziel-Nukleinsäurematerial in das Innere des Festphasepartikels zu lassen.
Die Kieselerdemagnetpartikel können Substanzen enthalten, wie beispielsweise Transitionsmetalle oder flüchtige organische Stoffe, die die Nützlichkeit der Ziel-Nukleinsäure gegenteilig betreffen können, welche mit solchen Substanzen wesentlich verunreinigt sind. Solche Verunreinigungen können die nachfolgende Verarbeitung, Analyse und/oder Verwendung von Ziel-Nukleinsäure, die hiermit kontaminiert sind, beeinflussen. Solche Kontaminanten können beispielsweise die Ziel-Nukleinsäure aufspalten oder degradieren oder Aktivität von Enzymen inhibieren, die zu den Ziel-Nukleinsäuren gegeben werden. Jede solcher Substanzen, die in den Kieselerdemagnetpartikeln vorhanden ist, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind bevorzugt in einer Form vorhanden, die nicht leicht aus den Partikeln und in das isolierte biologische Zielmaterial ausläuft, das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde. Eisen ist eine solcher unerwünschter Kontaminanten, insbesondere wenn das biologische Zielmaterial eine Ziel-Nukleinsäure ist.
Eisen in Form von Magnetit ist im Kern einer besonders bevorzugten Form der Kieselerdemagnetpartikel der vorliegenden Erfindung vorhanden. Eisen hat einen breiten Absorptionsgipfel zwischen 260 und 270 Nanometern (nm). Ziel-Nukleinsäuren haben eine Peakabsorption bei ungefähr 260 nm, so dass eine Eisenverunreinigung in einer Ziel-Nukleinsäureprobe die Genauigkeit der Ergebnisse quantitativer spektrophotometrischer Analysen solcher Proben nachteilig beeinflussen kann. Jede der eisenhaltigen Kieselerdemagnetpartikel, die verwendet werden, um Ziel-Nukleinsäuren unter Verwendung der vorliegenden Erfindung zu isolieren, erzeugen bevorzugterweise kein isoliertes Ziel-Nukleinsäurematerial, das hinreichend mit Eisen kontaminiert ist, da das Eisen mit der spektrophotometrischen Analyse des Materials bei oder um 260 nm interferiert.
Die am meisten bevorzugten Kieselerdemagnetpartikel, die in den Verfahren und Materialien der vorliegenden Erfindung (d.h. SOCM-Partikel) verwendet werden, lassen nicht mehr als 50 ppm, mehr bevorzugt nicht mehr als 10 ppm und am meisten bevorzugt nicht mehr als 5 ppm an Transisitionsmetallen auslecken, wenn sie in Tests eingesetzt werden. Genauer gesagt, 0,33 g Partikel (ofengetrocknet bei 110°C) in 20 ml 1N wässriger HCl-Lösung (unter Verwendung von deionisiertem Wasser). Das erhaltene Gemisch wird dann nur geschüttelt, um die Partikel zu dispergieren. Nach ungefähr 15 Minuten Gesamtkontaktdauer wird ein Teil der Flüssigkeit aus dem Gemisch dann auf den Metallgehalt analysiert. Es kann jede konventionelle Elementenanalysetechnik verwendet werden, um die Menge an Transistionsmetallen in der erhaltenen Flüssigkeit zu quantifizieren, aber inductively coupled Plasma Spektroskopie (ICP) ist bevorzugt.
Mindestens zwei kommerziell erhältliche Kieselerdemagnetpartikel sind besonders für die Verwendung als erste oder zweite Kieselerdematrices in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, BioMag^® Magnetic Particles von PerSeptiv Biosystems und MagneSil^TM-Partikel, erhältlich von Promega Corporation. Jede Quelle von Magnetkraft, die ausreichend stark ist, um die Kieselerdemagnetpartikel aus einer Lösung zu trennen, wäre zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Die Magnetkraft ist jedoch bevorzugt in Form eines Magnetseparierungsständers bereitgestellt, wie beispielsweise der der MagneSphere^® Technology Magnetic Separation Stands (Katalog Nrn. Z5331^bis 3 oder Z5341 bis 3) von Promega Corporation.
Ziel-Nukleinsäuren sind inhärent bei jedem pH über pH 2 negativ beladen und können daher reversibel an Ionenaustauscher binden, die positiv geladen sind, bei jedem pH-Wert über pH 2. Es ist zu bemerken, dass einige Ionenaustauscher eine insgesamt positive Ladung bei einem pH-Wert haben, wo sie als Anionenaustauscher wirken können, und eine insgesamt neutrale oder negative Ladung bei einem weiteren pH-Wert. Solche Ionenaustauscher sind nur in der Lage, Ionen mit einer Ziel-Nukleinsäure bei einem pH-Wert und anderen Bedingungen, wo der Ionenaustauscher als ein Anionaustauscher wirkt, auszutauschen. Die Fähigkeit zur Interaktion mit einer Ziel-Nukleinsäure variiert von einem Ionenaustauscher zu einem anderen beträchtlich. Mindestens eine der Festphasen in der Mischbettfestphase hat bevorzugt einen Ionenaustauschrest, der in der Lage ist, mit der Ziel-Nukleinsäure kovalent zu interagieren, die kovalent an die Oberfläche des Trägermaterials gebunden ist, entweder in direkter Form oder durch ein Zwischenmittel. Der Begriff "Oberfläche", so wie er hier verwendet wird, betrifft den Teil des Trägermaterials einer Festphase, der mit einer Lösung direkt in Kontakt kommt, wenn die Festphase hiermit kombiniert wird. Geeignete Anionenaustauschfestphasen zur Verwendung in den Mischbettfestphasen der vorliegenden Erfindung sind kommerziell erhältlich.
Die Ionenaustauschfestphase ist bevorzugt ein fester Träger, wie beispielsweise Separose^®, Polystyrol oder ein auf Kieselerde basierendes Material mit einer Ionenaustauschgruppe, die hieran kovalent gebunden ist. Die Ionenaustauschgruppe umfasst mindestens einen Ionenaustauschrest, der in der Lage ist, als Anionenaustauscher zu wirken, wobei der Ionenaustauschrest direkt kovalent an den festen Träger gebunden ist, oder durch einen Kohlenwasserstofflinker. Wenn ein Kohlenwasserstofflinker vorhanden ist, schließt er bevorzugt mindestens einen Rest ein, der als Kationenaustauscher bei einem pH-Wert dienen kann, der nicht innerhalb des pH-Bereichs ist, bei dem der Ionenaustauscherrest positiv geladen ist. Eine Ionenaustauschfestphase mit einem solchen Linker wird hier als "Mischmodus"-Festphase bezeichnet. Siehe US-Patent Anmeldungsnummer 09/312,172 für eine Erfindung, die betitelt ist mit pH DEPENDENT ION EXCHANGE MATRIX AND METHOD OF USE IN THE ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS, die gleichzeitig eingereicht wurde, für weitere Informationen über besonders bevorzugte Mischmodus-Festphasen, die zur Verwendung bei der Nukleinsäureisolierung geeignet sind, und hierdurch mittels Referenz inkorporiert sind.
Unabhängig davon, ob eine Mischmodus- oder Einzelmodus-Ionenaustauschfestphase in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind die bevorzugten Eigenschaften des Ionenaustauschrestes der Ionenaustauschgruppe die gleichen. Der Ionenaustauschrest hat bevorzugt die Fähigkeit, schnell unter Lösungsbedingungen mit der Ziel-Nukleinsäure von Interesse zu interagieren, wobei die Ziel-Nukleinsäure nicht chemisch degradiert wird (z.B. ist es bekannt, dass RNA in Gegenwart stark alkalischer Lösungen degradiert, d.h. Lösungen mit einem pH-Wert von 10 oder höher, während DNA unter solchen Bedingungen stabil ist. Es ist auch bekannt, dass DNA in Gegenwart konzentrierter chaotropischer Mittellösungen degradiert, wie beispielsweise Lösungen, die mindestens 2 M Guanidinthiocyanat enthalten, während RNA bei Guanidinthiocyanat-Konzentrationen zwischen 2 und 5 M stabil ist). Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,346,994.
Die Ionenaustauschgruppe, die an die Ionenaustauschfestphase gebunden ist, wird am meisten bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dimethylamin, Histamin, Ethanolamin, Histidin, Pyridylalanin und Pyridylcystein. Es ist zu bemerken, dass die letzten zwei bevorzugten Ionenaustauschgruppen, die oben aufgelistet wurden, Mischmodus-Ionenaustauschgruppen sind, die unten in einer Konfiguration gezeigt werden, wobei jede kovalent an eine unterschiedliche Festphase gebunden ist. Die wellenförmige Linie in den Figuren unten stellt die Festphase dar, wie beispielsweise ein Kieselerdemagnetpartikel, an den jede der Ionenaustauschgruppen angehängt ist:
Pyridylalanin
Pyridylcystein
Die Fähigkeit der ersten oder zweiten Festphase, an eine Ziel-Nukleinsäure zu binden oder unter jeden gegebenen Lösungsbedingungen zu interagieren, ist eine Funktion der funktionalen Gruppen an der Oberfläche der Festphase, ob an der äußeren Oberfläche oder die äußeren Oberflächen der Poren umrandend, die davon in jeden Partikel der Festphase reichen. Wenn die Festphase einen Anionenaustauschfestphase ist, bindet die Ziel-Nukleinsäure reversibel an die funktionalen Anionenaustauschgruppen an der Oberfläche der Festphase, unter Lösungsbedingungen (insbesondere pH-Wert und Salz), bei dem die Anionenaustauschgruppe ausreichend beladen ist, um Ionen mit der Ziel-Nukleinsäure auszutauschen.
Anionenaustauschfestphasen, die zur Verwendung in den Mischbettfestphasen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind kommerziell erhältlich, insbesondere in Form von nichtmagnetischen Festphasen. Siehe z.B. DEA-Sepharose^TM, Q-Sepharose^TM und DEAE-Sephadex^TM von Pharmacia (Piscataway, New Jersey), Dowex^® I von The Dow Chemical Company (Midland, Michigan), Amberlite^® von Rohm & Haas (Philadelphia, Pennsylvanie), Duolite^® von Duolite International, In. (Cleveland, Ohio), Dialon TI und Dialon TII. Anionenaustauschfestphasen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können auch durch das kovalente Binden jedes geeigneten Anionaustauschrestes an einen der geeigneten Trägermaterialien, die oben beschrieben wurden unter Verwendung von konventioneller synthetischer, organischer Chemie synthetisiert werden. Eine geeignete Anionenaustauschfestphase kann z.B. durch das Umsetzen des auf Kieselerde basierenden Materials, mit mit 3-Diethylaminopropyltrimethoxysilan in Gegenwart von Dichlormethan und Tributylamin durch das kovalente Binden eines Dimethylaminrestes an ein auf Kieselerde basierendes Material, wie beispielsweise ein Kieselerdegelpartikel oder magnetisches Kieselerdepartikel hergestellt werden. W. Jost et al., J. Chromatog. 185 (1979) 403–412. Andere Ionenaustauschreste, wie beispielsweise Histidin, können gleichermaßen an auf Kieselerde basierende Materialien angehängt werden, um geeignete Anionenaustauschfestphasen herzustellen.
Die erste Festphase und die zweite Festphase der Mischbettfestphase dieser Erfindung werden wegen ihrer Fähigkeit ausgewählt, eine Ziel-Nukleinsäure von Interesse unter verschiedenen Lösungsbedingungen zu binden und freizusetzen, so dass die erste Festphase die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart einer ersten Lösung bindet und sie in Gegenwart einer zweiten Lösung freisetzt, während die zweite Festphase die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart der ersten Lösung bindet und die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart der ersten Lösung freisetzt. Die Zusammensetzung der ersten und zweiten Lösung hängt von der Art der funktionalen Gruppen auf der Oberfläche der ersten bzw. zweiten Festphasen ab. Wenn die funktionale Gruppe der ersten Festphase beispielsweise ein Anionenaustauscher ist, dann enthält die erste Lösung eine ausreichend hohe Salzkonzentration, um die Ionen bereitzustellen, die für eine Ionenaustauschreaktion benötigt werden, aber keine ausreichend hohe Salzkonzentration, um mit dem Austausch von Ionen zwischen den Anionenaustauschgruppen der Festphase und der Ziel-Nukleinsäure zu interferieren. Der pH-Wert der ersten Lösung muss also bei oder unter einem pKa-Wert der Anionenaustauschgruppe einer ersten Anionenaustauschfestphase liegen, um zu sichern, dass die Anionenaustauschgruppe eine ausreichend positive Ladung hat, um mit der Ziel-Nukleinsäure in Wechselwirkung zu treten.
Wenn die erste Festphase eine Anionenaustauschfestphase ist und die zweite Festphase ebenfalls eine Anionenaustauschfestphase ist, unterscheidet sich der pKa der Anionenaustauschgruppe der zweiten Festphase bevorzugt von der der ersten Festphase in mindestens 0,5 pKa-Einheiten, mehr bevorzugt mindestens 1 pKa-Einheit, und am meisten bevorzugt mindestens durch 2 pKa-Einheiten. Die erste Anionaustauschfestphase und die zweite Anionenaustauschfestphase können sich außerdem ebenfalls voneinander in der Fähigkeit unterscheiden, die Ziel-Nukleinsäure von Interesse, aufgrund der Unterschiede in der Ladung und/oder der Anionenaustauschgruppendichte auf der Oberfläche jeder solcher Festphasen zu binden.
1 stellt einen theoretischen Festphasemix einer ersten Anionenaustauschfestphase und einer zweiten Anionenaustauschfestphase der vorliegenden Erfindung dar, und die Selektion der ersten Lösung, der zweiten Lösung und die der Elutionslösung zur Verwendung bei der Isolation der Ziel-Nukleinsäure in Übereinstimmung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Spezifischer zeigt 1 die relativen Fähigkeiten von zwei verschiedenen Festphasen, A und B, eine Ziel-Nukleinsäure (RNA oder DNA) unter verschiedenen Salz- und pH-Bedingungen zu binden und freizusetzen. Festphase A hat einen pKa von 7,0, während die Festphase B einen pKa von 8,5 hat. Die Festphase A unterscheidet sich von der Festphase B auch in ihrer Ladungsdichte bei verschiedenen pH-Werten. Spezifischer hat die Festphase A eine höhere positive Ladungsdichte als B in Gegenwart eines pH-Werts der Lösung von weniger als 6,0 und eine niedrigere positive Ladungsdichte als B in Gegenwart einer Lösung mit einem pH-Wert von mehr als 6,0. Die Festphase A bindet an die Ziel-Nukleinsäure A bei einem Lösungs-pH-Wert und bei Salzkonzentrationen, die unter die A-Linie fallen (gepunktet) in 1, und setzt die Ziel-Nukleinsäure, die hieran gebunden ist, bei einem pH-Wert und Salzkonzentrationen über der gleichen Linie frei. Die B-Linie (gepunktet) in der 1 zeigt gleichermaßen den pH-Wert und die Salzkonzentration, bei denen die Festphase B an die Ziel-Nukleinsäure bindet (unterhalb der Linie) oder diese freisetzt (oberhalb der Linie). Solche Bindungs-Kalibrierungskurven können unter Verwendung von Standard-Bindungskapazitätsstudien einfach hergestellt werden.
Festphasen-Kalibrierungskurven, wie die in 1 dargestellten, können verwendet werden, um die optimalen Bedingungen für die erste Lösung, die zweite Lösung und die Elutionslösungen auszuwählen, die in dem Verfahren zum Isolieren von Ziel-Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein Kreis, markiert mit "Lösung #1" in 1 zeigt Lösungsbedingungen, bei denen die Festphase A an die Ziel-Nukleinsäure binden wird, während die Festphase B jede Ziel-Nukleinsäure die hieran gebunden ist, freisetzen wird. Der pH-Wert der Lösung #1 wird ausgewählt, so dass er so nah wie möglich an einem neutralen pH-Wert liegt, wobei die Differenz zwischen den Bindungs- und Freisetzungskapazitäten der Festphasen A und B optimiert werden. Der Kreis, der als Lösung #2 gekennzeichnet ist, wird gleichermaßen auf die Bindung an die Festphase B und die Freisetzung von der Festphase A in einem pH-Bereich hin ausgewählt, der so nah wie möglich am neutralen pH-Wert liegt. Die Zusammensetzung der Elutionslösung kann aus jeder Salzkonzentration und pH-Mischung oberhalb beider Linien A und B in 1 ausgewählt sein. Der pH-Wert ist aber bevorzugt bei ungefähr 7 und die Salzkonzentration liegt bevorzugt so niedrig wie möglich. Man kann die Lösungsbedingungen einer theoretischen Mischung der Festphase A, Festphase B und der Ziel-Nukleinsäure vor und zurück zwischen den Lösungen #1 und #2 mehrere Male wechseln, um Nicht-Ziel-Nukleinsäure-Verunreinigungen zu entfernen aus dem Gemisch, bevor die Ziel-Nukleinsäure hiervon eluiert wird.
Wenn eine der ersten Festphase oder zweiten Festphase keine Anionenaustauschfestphase ist, ist es bevorzugt, dass ein Festphasenmaterial mit funktionalen Gruppen auf der Oberfläche, die in der Lage sind, direkt an die Ziel-Nukleinsäure von Interesse zu binden, Umkehrphaseinteraktion, Nukleinsäurehybridisierung oder Hoogsteen-Basenpaarung sind. In dieser Ausführungsform der Erfindung ist die erste oder zweite Festphase der Mischbettfestphase ein auf Kieselerde basierendes Festphasematerial, mehr bevorzugt ein Kieselerdematerial mit einer Siliziumoxidbeschichtung. Wenn die auf Kieselerde beruhende Festphase ein Kieselerdematerial mit einer Siliziumoxidbeschichtung ist, ist die Festphase dadurch gekennzeichnet, dass sie Silanolgruppen an der Oberfläche des Kieselerdematerials hat. Silanolgruppen sind dafür bekannt, dass Ziel-Nukleinsäuren durch Umkehrphasen-Interaktionen wieder freisetzbar binden können. L. M. McLaughlin, Chem Rev (1989) 89:309–319, bei Seite 309. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Mischbettfestphase, die genau zuvor beschrieben wurde, wobei die Ausführungsform eine Anionenaustauschfestphase und eine auf Kieselerde basierende Festphase umfasst, wird hier als "Kieselerde/IE-Mischbettfestphase bezeichnet.
Die Kieselerde/IE-Mischbettfestphase wird verwendet, um eine Ziel-Nukleinsäure unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zu isolieren, wobei die Mischbettfestphase mit einer ersten Lösung zusammengegeben wird, gefolgt von einer zweiten Lösung, wie oben beschrieben wurde. Eine Lösung fördert die Bindung mit der Kieselerdefestphase, während die andere die Bindung mit der Ionenaustauschfestphase fördert. Jede Lösung kann als erste Lösung verwendet werden, vorausgesetzt, dass die andere Lösung die zweite Lösung ist.
Entweder enthält die erste Lösung oder die zweite Lösung bevorzugt mindestens 100 mmol, mehr bevorzugt mindestens 250 mmol, und noch mehr bevorzugt mindestens 500 mmol Konzentration eines chaotropen Mittels. Das chaotropische Mittel ist bevorzugt ein Guanidinsalz, mehr bevorzugt Guanidinthiocyanat. Die Ziel-Nukleinsäuren binden in Gegenwart der chaotropen Mittel schnell an ein auf Kieselerde basierendes Festphasenmaterial, aber werden in Gegenwart einer Lösung, die im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln ist, leicht wieder davon freigesetzt. Der Begriff "im wesentlichen frei", so wie er hier verwendet wird bedeutet, dass die Konzentration der chaotropen Mittel in einer Lösung in Kontakt mit der auf Kieselerde basierenden Mischbettfestphase ausreichend gering ist, dass die zweite Festphase vorzugsweise einen Komplex mit den Endotoxinen in der Lösung bildet, und jede Ziel-Nukleinsäure, die an die andere Festphase in der Kieselerde/IE-Mischbettfestphase gebunden ist, freisetzt.
Wenn eine Lösung mit den oben beschriebenen Eigenschaften zur Verwendung als erste oder zweite Lösung ausgewählt wird, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, hat die andere (d. h. die zweite oder erste) Lösung die folgenden Eigenschaften. Die Lösung ist im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln. Der pH-Wert und die Salzzusammensetzung der Lösung werden bevorzugt aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, den Austausch von Ionen zwischen der Ziel-Nukleinsäure und der Anionenaustauschgruppe der ersten Festphase zu erleichtern. Die Salzkonzentration ist bevorzugt so niedrig wie möglich, um eine Freisetzung der Ziel-Nukleinsäure von der auf Kieselerde basierenden Festphase zu sichern.
Wenn die Ziel-Nukleinsäure, die gemäß dem vorliegenden Verfahren isoliert wird, RNA ist, ist die Zusammensetzung dieser Lösung bevorzugt eine Zusammensetzung, die der Ziel-RNA, aber nicht der DNA ermöglicht, an die Ionenaustauschfestphase zu binden. Mehr bevorzugt fördert die Zusammensetzung dieser Lösung die Bindung der Ziel-RNA an mindestens eine Festphase der Mischbettfestphase.
Wenn die gemäß dem vorliegenden Verfahren isolierte Ziel-Nukleinsäure DNA ist, ist die Zusammensetzung dieser Lösung bevorzugt eine Zusammensetzung, die ermöglicht, dass die Ziel-DNA, aber nicht die RNA an die Ionenaustauschfestphase bindet. Mehr bevorzugt fördert die Zusammensetzung dieser Lösung die Bindung der Ziel-DNA an die Ionenaustauschfestphase, aber nicht an die Kieselerde basierende Festphasekomponente der Kieselerde/IE- Mischbettfestphase. Noch mehr bevorzugt fördert die Zusammensetzung der Lösung die Bindung von Endotoxin an die Mischbettfestphase, mehr bevorzugt an die auf Kieselerde basierende Festphasekomponente einer Kieselerde/IE-Mischbettfestphase.
Die Kieselerde/IE-Mischbettfestphase der vorliegenden Erfindung, die direkt vorher beschrieben wurde, ist besonders gut geeignet zur Verwendung beim Isolieren einer Ziel-Nukleinsäure aus Endotoxinen in einem Gemisch daraus. Genauer wird die Kombination einer solchen Mischbettfestphase mit einem Gemisch aus Endotoxin und der Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart einer ersten Lösung, die im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln ist, auslösen, dass die Ziel-Nukleinsäure an eine Festphase mittels Anionenaustausch bindet, um die Endotoxine an die andere Festphase zu binden. Endotoxine neigen dazu, an Kieselerde-basierende Festphasen zu binden, in Lösungen, die im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln sind. Die Bindung von Endotoxin an solche Festphasen ist so fest, dass die Zugabe von Lösungen, die chaotrope Mittel enthalten, zu einer solchen Festphasenmischung nicht zu einer Freisetzung der Endotoxine hiervon zu führen scheint. Endotoxine können von den Kieselerdeoberflächen, wie solchen, die auf Siliciumoxid-beschichteten Kieselerdemagnetpartikeln gefunden werden, durch Waschen mit Wasser entfernt werden.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, um Ziel-Nukleinsäure aus einem Gemisch aus der Ziel-Nukleinsäure und mindestens einer Kontaminante zu isolieren, kann entweder die erste oder die zweite Lösung mit der Mischbettfestphase in Gegenwart der Ziel-Nukleinsäuremischung im ersten Schritt zusammengegeben werden. Die Lösung, die zuerst verwendet wird bestimmt, welche Lösung in dem nächsten Schritt verwendet wird. Genauer gesagt, wenn die erste Lösung mit der Mischbettfestphase zuerst kombiniert wird, wird die zweite Lösung damit als nächstes kombiniert, und anders herum. Nach dem anfänglichen Kombinationsschritt wird die Mischbettfestphase von der anfänglichen Lösung abgetrennt und mit der anderen Lösung kombiniert. Die Kombinierung und die Trennungsschritte werden bevorzugterweise wiederholt, bis die Mischbettfestphase mindestens zweimal mit jeder der ersten und zweiten Lösungen kombiniert worden und davon wieder getrennt worden ist. Bei jedem Wechsel von der ersten zur zweiten Lösung bleiben mindestens 90 % der Ziel-Nukleinsäure an die Mischbettfestphase gebunden, während mindestens eine Kontaminante hiervon entfernt wird.
Abhängig von der Zusammensetzung der ersten und zweiten Lösungen wird vorausgesetzt, dass das erfindungsgemäße Verfahren außerdem einen Schritt des Waschens der Mischbettfestphase zwischen den Schritten der Zugabe der Lösung und/oder nach Trennung von der endgültigen Lösung und vor dem Elutionsschritt umfasst. Waschschritte sind besonders bevorzugt, nach dem Kontakt mit einer ersten oder zweiten Lösung, die ein chaotropes Mittel (z.B. GTC) enthält, bevor es mit einer ersten, zweiten oder Elutionslösung in Kontakt kommt, welche im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln ist. Die Zusammensetzung jeder solcher Waschpuffer wird ausgewählt, um zu sichern, dass die Ziel-Nukleinsäure an die Mischbettfestphase gebunden bleibt. Wasser wird bevorzugterweise verwendet, um die Mischbettfestphase einer ersten Anionenaustauschfestphase und einer zweiten auf Kieselerde basierenden Festphase, die oben dargestellt wurden, zu waschen, um eine vollständige Entfernung des chaotropen Mittels nach Zugabe der zweiten Lösung hierzu zu sichern.
Die erste Lösung, zweite Lösung und jede Waschlösung werden alle bevorzugterweise aus destilliertem, deionisiertem oder nanoreinem Wasser hergestellt oder bestehen hieraus. Der Begriff "nanoreines Wasser" so wie er hier verwendet wird, betrifft Wasser, das mit einem Ultrafiltrationssystem gereinigt wurde, welches Wasser herstellt, das von vergleichbarer Qualität wie mit einem Nanopure^® Filtration System ist. Das destillierte, deionisierte oder nanoreine Wasser kann vor der Verwendung in dem Verfahren autoklaviert oder filtriert werden. Während solcher zusätzlicher Arbeitsschritte können jedoch Verunreinigungen in das Wasser eingeschleust werden, wie beispielsweise ein schwacher Puffer, der größer als pH 5,0 ist. Solche Verunreinigungen können den pH-Wert des Wassers in einem solchen Ausmaß steigern, dass es dazu führen kann, dass Ziel-Nukleinsäuren, insbesondere amplifizierte Nukleinsäuren (z.B. PCR amplifizierte DNA) von einem Mischbettharz freigesetzt wird, wenn es hiermit in Kontakt gebracht wird. Wenn die Ziel-Nukleinsäure RNA ist, muss jegliches Wasser, das mit der Mischbettfestphase in direkten Kontakt gebracht wird, im wesentlichen RNA-frei sein.
Die Eluierung der Ziel-Nukleinsäure von der Mischbettfestphase wird in Gegenwart eines Elutionspuffers durchgeführt, der aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt wird, die Freisetzung der Ziel-Nukleinsäure von der Mischbettfestphase zu sichern. Die Ziel-Nukleinsäure, die aus der Mischbettfestphase im letzten Schritt des Verfahrens eluiert wird, ist ausreichend rein, um in Anwendungen verwendet zu werden, die gegenüber einer Kontaminierung mit Endotoxinen empfindlich sind, oder anderen mindestens einer Kontaminante, wobei die Anwendungen die Transfektion von Gewebekulturzellen einschließen.
Die folgenden, nicht begrenzenden Beispiele lehren zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung. In den Beispielen und anderswo in der Beschreibung und den Ansprüchen sind Volumina und Konzentrationen bei Raumtemperatur, sofern es nicht anders angegeben wurde. Nur die Magnetkieselerdepartikel, insbesondere die Siliciumoxid-beschichteten Kieselerdemagnetpartikel, wie die die oben und direkt unten beschrieben werden, wurden in den untenstehenden Beispielen verwendet. Ein Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung wird jedoch in der Lage sein, die Lehren der vorliegenden Offenbarung zu verwenden, um Kieselerdematrices auszuwählen und zu verwenden, die die Nicht-Kieselerdemagnetpartikel sind, und Kieselerdemagnetpartikel, die nicht die spezifischen Arten von Partikeln sind, die in den Darstellungen der Verfahren der vorliegenden Erfindung, die in den folgenden unten beschriebenen Beispielen gezeigt wird, sind. Die Beispiele sollten nicht so verstanden werden, dass sie den vorliegenden Erfindungsbereich begrenzen.
Die Kieselerdemagnetpartikel, die in jedem der untenstehenden Beispiele verwendet wurden, wurden aus einem von zwei Chargen von Partikeln ausgewählt. Beide Chargen der Kieselerdemagnetpartikel ergaben annehmbare Ergebnisse, wenn sie wie unten beschrieben getestet wurden. Eine der zwei Chargen der Partikel, die unten verwendet wurden, hatte die folgenden physikalischen Eigenschaften: Oberflächenbereich von 55 m²/g, Porenvolumen von 0,181 mg/g für Partikel von <600 Å Durchmesser, Porenvolumen von 0,163 ml/g für Partikel von >600 Å Durchmesser, mittlere Partikelgröße von 5,3 μm und Auslecken von Eisen im Ausmaß von 2,8 ppm, wenn sie, wie hier unten beschrieben, unter Verwendung des ICP untersucht wurden. Die andere Charge an Kieselerde und Mikropartikeln, die unten verwendet wurde, hatte die folgenden Eigenschaften: Oberflächenbereich von 49 m²/g, Porenvolumen von 0,160 ml/g (<600 Å Durchmesser), Porenvolumen 0,163 ml/g (>600 Å Durchmesser), mittlere Partikelgröße von 5,5 μm und Auslecken von Eisen bei 2,0 ppm.
Die untenstehenden Beispiele beschreiben Verfahren, die verwendet wurden, um zwei verschiedene Mischbettfestphasen aus Magnetpartikeln herzustellen, Verfahren zur Verwendung des isolierten Plasmids oder genomischer DNA aus zahlreichen Medien unter Verwendung der Mischbettfestphasepartikel und Ergebnisse der zahlreichen Tests, die an den Beispielen der Nukleinsäuren gemacht wurden, die von den Mischbettfestphasepartikeln eluiert wurden.
Beispiel 1 – Gelelektrophoresetests
Proben von Ziel-Nukleinsäuren, die gemäß den Verfahren isoliert wurden, die in den Beispielen unten beschrieben sind, wurden für die Kontamination mit Nicht-Ziel-Nukleinsäuren und für die Größe wie folgt analysiert. Die Proben wurden auf einem Agarosegel von geeigneter Dichte (z.B. ein 0,7%iges Agarosegel wurde verwendet, um Plasmid-DNA zu analysieren, während ein 1,5%iges Agarosegel verwendet wurde, um RNA zu isolieren, fraktioniert. Die fraktionierte Nukleinsäure wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmarkers oder durch das Färben des Gels mit einem DNA-empfindlichen Farbstoff, wie beispielsweise Ethidiumbromid oder einer Silberfärbung sichtbar gemacht. Die erhaltene fraktionierte, sichtbar gemachte Nukleinsäure wurde entweder fotografiert oder unter Verwendung eines Fluorimagers sichtbar gemacht und das erhaltene Bildung wurde unter Verwendung eines Laserdruckers ausgedruckt.
In einigen Fällen wurden Größenstandards auf dem gleichen Gel wie die Ziel-Nukleinsäure aufgetrennt, um verwendet zu werden, um die ungefähr Größe der Ziel-Nukleinsäure zu bestimmen. In jedem Fall, in dem ein Geltest durchgeführt wurde, wurde das Foto oder das Fluorimage der aufgetrennten Nukleinsäure auf eine Kontamination mit Nicht-Ziel-Nukleinsäuren untersucht. Beispielsweise wurden Bilder von fraktionierten Proben der Plasmid-DNA auf RNA untersucht, die beträchtlich schneller als DNA auf dem gleichen Gel läuft, und für chromosomale DNA, die beträchtlich langsamer als Plasmid-DNA auf dem gleichen Gel läuft. Bilder von isolierter Plasmid-DNA wurden auch daraufhin untersucht, um zu bestimmen, ob der größte Teil der Plasmid-DNA, die in dem Bild gezeigt ist, intakt ist, d.h. superhelikale Plasmid-DNA.
Beispiel 2 – Absorptionsspektrophotometrie
Proben der Ziel-Nukleinsäuren, die aus den verschiedenen Medien isoliert wurden, die unten beschrieben werden, wurden auch unter Verwendung von Absorptionsspektrophotometrie analysiert. Die Absorptionsmessungen wurden bei Wellenlängen von 260, 280 und 230 Nanometern (nm) durchgeführt. Die A₂₆₀/A₂₈₀-Absorptionsverhältnisse wurden aus den Messungen berechnet. Ein A₂₆₀/A₂₈₀ von mehr als oder gleich 1,8 wurde dahingehend interpretiert, dass eine darin analysierte Probe relativ frei von einer Proteinkontaminierung war. Die Konzentration der Ziel-Nukleinsäure jeder Probe wurde aus der Absorption, die bei 260 nm gelesen wurde (A₂₆₀) bestimmt.
Beispiel 3 – Endotoxintests
Ein Limulus-Amoebocytenlysat-(LAL)-Gelpräzipitationstest wurde durchgeführt, um die Anzahl an Einheiten an Endtoxin in Bakterienlysatproben durchzuführen, die vor und nachdem die Lysatlösungen in Kontakt mit einer oder mehreren der Kieselerdematrices, die in den Beispielen unten getestet wurden, genommen wurden. E-TOXATE^® von SIGMA^® (St. Louis, MO, cat. Nr. 210-D1) wurde als Amoebocytenlysatstandard für diese Serien LAL-Assays verwendet. E-TOXATE^® wird in dem 1997er SIGMA^®-Katalog (Seite 448) als ("Ameobocytenlysat; Hufeisenkrabbenlysat) aus Limulus polyphemus" beschrieben. In allen Schritten dieses Tests wurde Endotoxin-freies Wasser ("ETF-Wasser") verwendet, einschließlich aller Verdünnungsschritte. Jede Probe oder jedes Probenset wurde gemäß dem folgenden Verfahren untersucht.

1. Proben wurden für eine serielle Verdünnung hergestellt, mit einem größeren anfänglichen Verdünnungsfaktor, der für Proben verwendet wurde, die mit keinem Endotoxin-Entfernungsmittel in Kontakt gebracht wurden (z.B. 10.000 oder höher), wie beispielsweise Kieselerdegelpartikel, und mit geringeren anfänglichen Verdünnungen von 1:500 bis 1:1.000 für Proben, die mit solchen Mitteln in Kontakt gekommen waren. Entoxodin-freies ("ETF") Wasser wurde für alle Verdünnungen, die hier beschrieben werden, verwendet.
2. Zweifache serielle Verdünnungen wurden aus jeder Probe wie folgt hergestellt: 25 μl jeder Probe, die zu 25 μl ETF-Wasser in dem ersten Set aus Vertiefungen einer 96 well Mikrotiterplatte gegeben wurden, und durch Pipettieren gemischt wurden. 25 μl dieser verdünnten Lösung wurden dann in eine zweite Vertiefung mit weiteren 25 μl ETF-Wasser transferiert, usw. bis eine Serie aus 12 Proben pro Probe hergestellt worden war.
3. Eine Reihe von Verdünnungen eines Endotoxinstandards wurde wie folgt hergestellt. Zuerst wurden die Inhalte einer frischen Flasche Endotoxin-Standard (SIGMA^® Kat. Nr. 210-SE) mit ETF-Wasser in Übereinstimmung mit den Instruktionen des Herstellers auf der Flasche verdünnt. Zweitens wurden die folgenden Volumina ETF-Wasser zu jeder der Serien auf neun (9) 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen wie folgt hinzugegeben: 900 μl zu den Röhrchen 1 bis 3, 1.050 μl zu Röhrchen 4 und 500 μl zu den Röhrchen 5 bis 9. Drittens wurden 100 μl des Endotoxinstandards aus dem Fläschchen, das wie oben verdünnt wurde, in Röhrchen 1 transferiert, gemischt und dann wie folgt seriell verdünnt: 100 μl aus Röhrchen 1 wurde in Röhrchen 2 gegeben und auf 40 Endotoxineinheiten ("EU") je Milliliter (ml) gemischt, 100 μl aus Röhrchen 2 wurden in Röhrchen 3 gegeben und auf 4 EU/ml gemischt, 150 μl aus Röhrchen 3 wurden in Röhrchen 4 gegeben und auf 0,5 EU/ml gemischt, 500 μl aus Röhrchen 4 wurden in Röhrchen 5 gegeben und auf 0,25 EU/ml gemischt, 500 μl aus Röhrchen 5 wurden in Röhrchen 6 gegeben und auf 0,125 EU/ml gemischt, 500 μl aus Röhrchen 6 wurden in Röhrchen 7 gegeben und auf 0,06 EU/ml gemischt, 500 μl aus Röhrchen 7 wurden in Röhrchen 8 gegeben und auf 0,03 EU/ml gemischt, 500 μl aus Röhrchen 8 wurden in Röhrchen 9 gegeben und auf 0,015 EU/ml gemischt.
4. Die wie oben beschrieben, verdünnten Endotoxinstandards und ein Blankostandard wurden dann in eine Mikrotiterplatte wie folgt transferiert: 25 μl ETF-Wasser (blanko) in Reihe 1, 25 μl des Standardröhrchens 4 in Reihe 2, 25 μl des Standardröhrchens 5 in Reihe 3, 25 μl aus dem Standardröhrchen 6 in Reihe 4, 25 μl aus dem Standardröhrchen 7 in die Reihe 5, 25 μl aus dem Standardröhrchen 8 in Reihe 6, und 25 μl des Standardröhrchens 9 in die Reihe 7.
5. Ein frisches Fläschchen E-TOXATE^®, d.h. LAL in lyophilisierter Form, wurde für alle zwei Mikrotiterplatten der Proben oder Standards, die getestet werden sollten, geöffnet. ETF-Wasser wurde zu jedem Fläschchen E-TOXATE^® bis zu einer endgültigen Konzentration hinzugegeben, und eine Menge an ETF-Wasser wurde zu jeder Flasche hinzugegeben, um ungefähr 5 ml ETF-Wasser zu jedem Fläschchen hinzuzugeben. Wenn mehrere Flaschen E-TOXATE^® für eine einzelne Serie an Tests geöffnet wurden, wurden die Flascheninhalte in ETF-Wasser resuspendiert, wie genau zuvor beschrieben wurde, und vor der Verwendung zusammengegeben. 25 μl E-TOXATE^® wurden in jede Vertiefung jeder Mikrotiterplatte, die eine Probe, einen Standard oder ein Blanko enthält, gegeben.
6. Sobald E-TOXATE^® in jede Vertiefung gegeben worden war, wurde die Mikrotiterplatte bedeckt, und die Platte wurde für eine Stunde (+/– 5 Minuten) in einen 37°C-Inkubator gestellt, während der die E-TOXATE-Lösung in Gegenwart einer ausreichend hohen Menge an Endotoxin geliert.
7. Die Mikrotiterplatte wurde dann aus dem Inkubator entfernt, auf Gelierung untersucht, und die letzte Vertiefung jeder Reihe mit Gelierung (d.h. einem positiven Ergebnis) wurde notiert. Die folgende Formel wurde verwendet, um die EU/ml der Originalprobe zu bestimmen, die in jeder Reihe getestet wurde: EU/ml = 1/(höchste Verdünnung der Probe, die positiv getestet wurde) × (höchste Verdünnung des Standards, der positiv getestet wurde)

Wenn die Probe beispielsweise bei einer Verdünnung von 1:4.000 positiv war (d.h. dass ein Gel gefunden wurde), aber bei einer Verdünnung von 1:8.000 negativ war (d.h. kein Gel gefunden wurde) und der Standard war bei einer 0,06-Verdünnung positiv und bei einer 0,03-Verdünnung negativ, dann wird die EU/ml wie folgt bestimmt: EU/ml = 1/(1/4.000)×0,06 = 240 EU/ml.
Beispiel 4 – Transfektionsansatz
DNA, die gemäß Verfahren, die, wie unten beschrieben, isoliert wurde, wurde ebenfalls zum Transfizieren von HeLa-Zellen, einer menschlichen Ovar-Krebszellinie verwendet. Die Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) plus 10 % fötalem Rinderserum – 10 % CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden in 24 well Platten in einem geeigneten Medium platziert, und das folgende Verfahren wurde befolgt:

1. Die Zellen wurden in 24 well Platten platziert, zu ungefähr 50.000 Zellen pro Vertiefung, ungefähr 24 Stunden bevor mit der Transfektion begonnen wurde.
2. Am Tag der Transfektion wurde das Medium aus jeder Vertiefung entfernt und innerhalb von einer bis drei Stunden vor dem Beginn der Transfektion durch frisches Wachstumsmedium (+ Serum) ersetzt.
3. Ein Gemisch aus jeweils den vier Proben der DNA (Proben 1 bis 4) wurde wie folgt hergestellt. Genügend Mischung einer jeden DNA-Probe wurde hergestellt, um sechs Vertiefungen der Zellkultur wie folgt zu transfizieren. 6 μl (ungefähr 6 μg) DNA, 23,8 μl Calciumchlorid und 160 μl steriles Wasser wurden in einem sterilen Polystyrolröhrchen zusammengegeben. Die oben hergestellte DNA/CaCl₂-Mischung wurde hinzugegeben, tröpfchenweise zu 190,2 μl Hank's Buffered Saline (HBS), wobei die HBS vorsichtig gevortext wurde.
4. Die HBS/DNA/CaCl₂-Mischung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor 64,6 μl des Gemischs zu jeder Vertiefung der Zellen hinzugegeben wurde. Das Gemisch wurde direkt zu dem Medium hinzugegeben, das Serum enthält.
5. Die Platten der behandelten Zellen wurden dann in den Inkubator zurückgegeben. Die Zellen wurden am nächsten Tag mit frischem Medium gefüttert unter Verwendung der gleichen Serumzusammensetzung, die in Schritt 2 oben verwendet wurde.
6. Nach 48 Stunden wurden die Zellen durch Entfernen des Wachstumsmediums geerntet, und durch das Hinzugeben von 100 μl eines Zellkultur-Lysereagenz pro Vertiefung.

Die wie oben beschrieben transfizierten und geernteten Zellen wurden dann untersucht, um zu sehen, ob das Reportergen, in diesem Fall das Luciferasegen der pGL3-Plasmid-DNA, in den Zellen exprimiert wurde. Ein Standard-Luciferase-Test, das Luciferase Assay System, das kommerziell von der Promega Corporation erhältlich ist, wurde verwendet, um die Luciferase-Expression in den Zellen nachzuweisen und zu quantifizieren.
Die im Schritt 6 oben geernteten Zellen wurden für weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie hinsichtlich der Luciferase-Expression untersucht wurden. Ein Aliquot aus jeder Vertiefung der Zellen wurde dann in eine andere Vertiefung eines Mikrotiterplattenträgers gegeben. Die Lumineszenzmenge, die aus jeder Vertiefung hervorging, wurde nachgewiesen und unter Verwendung eines Luminometers quantifiziert.
Beispiel 5 – Synthese von Anionaustausch-Magnetkieselerdepartikeln
Ein Diethylamino-(DEA)-Anionenaustauschrest wurde durch eine Propyldimethoxysilanbindung gemäß dem folgenden Syntheseverfahren kovalent an MagneSil^TM-Partikel gebunden:

1. MagneSil^TM-Partikel wurden durch Trocknen bei 120°C in einem Vakuumofen über Nacht aktiviert.
2. 4,25 g der aktivierten MagneSil^TM-Partikel wurden mit 2,5 ml [3-(Diethylamino)propyl]trimethoxysilan (96 % von Aldrich^®) und 17,5 ml Dichlormethan (Aldrich^®) kombiniert. 3 bis 4 Tropfen Tributylamin (Aldrich^®) wurden dann zu den erhaltenen Gemischen zugegeben.
3. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage geschüttelt. Am Ende der Inkubationszeit wurde die Lösung von den Partikeln durch Filtrieren abgetrennt.
4. Die Partikel/Filtrate wurden fünfmal mit 75 ml Dichlormethan gewaschen, gefolgt von zwei Waschschritten mit 100 ml Wasser.
5. Ein Aliquot der gewaschenen Partikel zur Verwendung in den Ziel-Nukleinsäure-Bindungsstudien, die in Beispiel 5 unten dargestellt sind, wurde in einem Ofen getrocknet.

Die DEA-Magnetkieselerdepartikel-Synthesereaktion, die in diesem Beispiel verwendet wurde, wird weiter durch das Reaktionsschema, das unten angegeben wird, dargestellt:
Beispiel 6 – Herstellung eines gereinigten Lysats bakterieller Zellen, die mit Plasmid-DNA transformiert sind
E. coli Bakterienzellen, DH5α-Stamm, wurden mit pGL3-Kontrollvektor (Promega) Plasmid-DNA transformiert, und in einer Übernachtkultur in Luria Broth ("LB") Medium bei 37°C gezüchtet, und dann durch Zentrifugieren geerntet. Die folgenden Lösungen wurden verwendet, um ein Lysat der geernteten Zellen, wie unten beschrieben, herzustellen:
Zellsuspensionslösung:

50 mM Tris-HCl, pH 7,5
10 mM EDTA
100 μg/ml DNase-freie Ribonuklease A (RNase A)

Wizard^® Neutralisationslösung:

1,32 M KOAc (Kaliumacetat), pH 4,8

#5 Neutralisationslösung

1,69 M K⁺/2,26 M GTC/6,5 Acetat, pH 4,18

Zellyselösung:

0,2 M NaOH
1 % SDS (Natriumdodecylsulfat)

Ein geklärtes Lysat aus den transformierten Zellen wurde wie folgt hergestellt:

1. Die Zellen aus 10 ml Bakterienkultur wurden durch Zentrifugieren der Kultur für 1 bis 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge geerntet. Die geernteten Zellen wurden in 250 μl Zellresuspensionslösung resuspendiert, und in eine Mikrozentrifugenröhre transferiert. Die erhaltene Lösung resuspendierter Zellen war trüb.
2. 250 μl der Zellyselösung wurden dann zu der Lösung der resuspendierten Zellen hinzugegeben, und durch Umschütteln gemischt, bis die Lösung relativ klar wurde, was darauf hindeutete, dass die resuspendierten Zellen lysiert waren.
3. 350 μl einer Neutralisierungslösung (Wizard^® oder #5, wie unten beschrieben) wurden zu der Lysatlösung hinzugegeben, und durch Umschütteln gemischt. Das Lysat wurde trüb, nachdem die Neutralisierungslösung hinzugegeben wurde.
4. Die Lösung wurde dann in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 5 Minuten zentrifugiert, um das Lysat zu klären.
5. Der erhaltene überstand des gereinigten Lysats wurde in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen transferiert.

Die gereinigten Lysatlösungen aus Schritt 5 wurden zusammengegeben, und dann entweder zwei Magnetkieselerdefestphasen oder einem Gemisch aus den zwei Festphasen unter verschiedenen Lösungsbedingungen exponiert, die so ausgerichtet worden waren, dass die Adhäsion der Plasmid-DNA an eine der beiden Festphasen, wie in den Beispielen 4 bis 6 unten beschrieben wird, gefördert wird. Die Mischbettfestphase wurde gewaschen, und die Plasmid-DNA wurde davon, wie unten beschrieben, eluiert. Jedes Elutionsmittel wurde auf Endotoxine gemäß dem Beispiel 3 getestet, und für die Ausbeute und Qualität der Plasmid-DNA, die hierin enthalten ist gemäß den Verfahren, die in Beispiel 1 und 2 beschrieben sind.
Beispiel 7 – Isolierung von Plasmid-DNA aus einem geklärten Lysat unter Verwendung von Kieselerde/IE-DEA-Mischbettfestphase, Kieselerdemagnetpartikeln oder IE-DEA-Kieselerdemagnetpartikeln
a. Ausgangsmaterialien und Lösungszusammensetzungen
Plasmid-DNA wurde aus einem bakteriellen Lysat, das in Beispiel 6 beschrieben wurde, durch das Binden an und das Eluieren der Plasmid-DNA, die hierin enthalten ist, von jedem der Kieselerdemagnetpartikel, der DEA-Kieselerdemagnetpartikel, die in Beispiel 4 beschrieben wurden, oder einem Gemisch aus den zwei Arten von Partikeln, wie folgt hergestellt. Das Gemisch aus Kieselerdemagnetpartikeln und DEA-Kieselerdemagnetpartikeln, das in diesem Beispiel verwendet wurde, wird hier als "Kieselerde/DEA-Mischbett"partikel bezeichnet. Die Einzelpartikel-Bindungs- und Elutionsverfahren wurden als Kontrollen eingeschlossen.
Die folgenden Lösungen, die unten beschrieben werden, wurden verwendet:
Waschlösung A:

0,74 M K⁺/0,29 M Acetat, pH 4,0
1,0 M Guanidinthiocyanat (GTC)

Waschlösung B:

0,37 M K⁺/0,12 M Acetat, pH 4,0
0,43 M Guanidinthiocyanat

Elutionspuffer:

2,0 M NaCl
200 mM Tris-HCl, pH 7,3

b. Kontrolle 1: Plasmid-DNA, isoliert aus dem Lysat mit GTC, unter Verwendung von Kieselerdemagnetpartikeln
Die erste Kontrollprobe der Plasmid-DNA wurde aus einer Lysatlösung alleine unter Verwendung von Kieselerdemagnetpartikeln wie folgt isoliert. Das Lysat wurde gemäß Beispiel 4 unter Verwendung von Neutralisierungslösung Nr. 5 (d.h. Neutralisierungslösung mit 2,26 M GTC) hergestellt. 150 μl MagneSil^®-Partikel, die in Wasser auf eine endgültige Konzentration von 100 mg Partikel pro ml suspendiert waren, wurden zu 250 μl des Lysats hinzugegeben und dann unter Verwendung von Magnetkraft aus dem Lysat entfernt. Die Partikel wurden dann in 1,0 ml 0,85 M GTC suspendiert und durch Magnetkraft zweimal entfernt. Nach dem zweiten Entfernungsschritt wurden die Partikel aus 1,0 ml Waschlösung A dreimal suspendiert und wieder entfernt. Die gewaschenen Partikel wurden dann in einer Vakuumzentrifuge (einer SpeedVac) getrocknet. Am Schluss wurden die getrockneten Partikel für 5 Minuten in 80 μl Wasser suspendiert und aus dem erhaltenen Eluat durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 12.000 g in einer Mikrozentrifuge entfernt.
c. Kontrolle 2: Plasmid-DNA, isoliert aus einem Lysat ohne GTC, unter Verwendung von DEA-Kieselerdemagnetpartikeln
Als eine weitere Kontrolle wurde Plasmid-DNA von DEA-Magnetkieselerdepartikeln, die wie in Beispiel 4 beschrieben, synthetisiert wurden, gemäß dem folgenden Verfahren isoliert. Das Lysat wurde gemäß Beispiel 1 hergestellt, unter Verwendung von Wizard^®-Neutralisierungslösung (d.h. Neutralisierungslösung ohne GTC). 150 μl DEA-Kieselerdemagnetpartikel (suspendiert in Wasser für 100 mg/ml Konzentration) wurden zu 250 μl des Lysats hinzugegeben und dann unter Verwendung von Magnetkraft hieraus entfernt. Die Partikel wurden dann einmal in 1,0 ml Waschlösung B resuspendiert, gefolgt von drei Resuspendierungen in 1,0 ml Wasser, wobei Magnetkraft verwendet wurde, um die Partikel nach jedem Resuspendierungsschritt aus der Waschlösung zu entfernen. Schließlich wurden die getrockneten Partikel in 300 μl Elutionspuffer für 5 Minuten suspendiert, und aus dem erhaltenen Eluat mittels Zentrifugieren für 10 Minuten bei 12.000 g in einer Mikrozentrifuge entfernt.
d. WIZ-Proben: Plasmid-DNA isoliert aus Lysat mit GTC, unter Verwendung von Kieselerde/IE-DEA-Mischbettfestphase
Plasmid-DNA wurde aus dem Lysat, das wie in Beispiel 6 beschrieben, hergestellt wurde, unter Verwendung von Wizard^® Neutralization Solution (kein GTC) und unter Verwendung einer Mischbettfestphase aus 15 mg der Kieselerdemagnetpartikel und 30 mg der DEA-Kieselerdemagnetpartikel (Wasser wurde vor der Lysatzugabe von den Mischbettfestphasepartikeln entfernt), wie folgt isoliert:

1. Das Lysat wurde mit 15 mg MagneSil^TM und 30 mg DEA-Magnetkieselerdepartikeln kombiniert, gemischt und durch Magnetkraft hiervon getrennt. Das Lysat wurde verworfen.
2. Die Partikel wurden in 950 μl Waschlösung B resuspendiert, gemischt, und durch Magnetkraft hiervon abgetrennt. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt, wobei die Waschlösung nach jedem Trennungsschritt verworfen wurde.
3. Die Partikel wurden in 950 μl 2 M GTC resuspendiert und hiervon durch Magnetkraft getrennt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt, und die GTC-Lösung wurde nach jedem Trennungsschritt verworfen.
4. Die Partikel wurden in 950 μl 0,85 M GTC resuspendiert und hiervon mittels Magnetkraft getrennt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt und die GTC-Lösung wurde nach jedem Trennungsschritt verworfen.
5. Die Partikel wurden in 950 μl Wasser resuspendiert und hiervon durch Magnetkraft abgetrennt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt und das Wasser wurde nach jedem Trennungsschritt verworfen.
6. Schritte 2 bis 5 wurden einmal wiederholt.
7. Die Partikel wurden in 300 μl Elutionspuffer für 5 Minuten resuspendiert und aus dem erhaltenen Eluat durch Magnetkraft entfernt.

e. #5-Proben: Plasmid-DNA, isoliert aus dem Lysat ohne GTC, unter Verwendung von Kieselerde/IE-DEA-Mischbettfestphase
Plasmid-DNA wurde aus dem Lysat, das in Beispiel 6 beschrieben wurde, unter Verwendung von #5- Neutralisierungslösung isoliert, indem die Kieselerde/IE-DEA-Mischbettfestphase wie folgt verwendet wurde, hergestellt:

1. Das Lysat wurde mit 15 mg Kieselerdemagnetpartikeln und 30 mg DEA-Kieselerdemagnetpartikeln kombiniert, gemischt und hiervon mittels Magnetkraft getrennt, das Lysat wurde verworfen.
2. Die Partikel wurden in 950 μl Wasser resuspendiert, gemischt und hiervon mittels Magnetkraft getrennt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt, wobei die wässrige Waschlösung nach jedem Abtrennungsschritt verworfen wurde.
3. Die Partikel wurden in 950 μl Waschlösung B resuspendiert und hiervon mittels Magnetkraft abgetrennt. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt, und die GTC-Lösung wurde nach jedem Abtrennungschritt verworfen.
4. Die Partikel wurden in 950 μl 2 M GTC resuspendiert und hiervon mittels Magnetkraft abgetrennt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt und die GTC-Lösung wurde nach jedem Abtrennungsschritt verworfen.
5. Die Partikel wurden in 950 μl 0,85 M GTC resuspendiert und hiervon mittels Magnetkraft abgetrennt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt und die GTC-Lösung wurde nach jedem Abtrennungsschritt verworfen.
6. Die Partikel wurden in 950 μl Wasser resuspendiert und hiervon durch Magnetkraft abgetrennt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt und das Wasser wurde nach jedem Abtrennungsschritt verworfen.
7. Schritte 2 bis 6 wurden einmal wiederholt.
8. Die Partikel wurden in 300 μl Elutionspuffer für 5 Minuten resuspendiert und aus dem erhaltenen Eluat durch Magnetkraft entfernt.

f. Präzipitierung von Plasmid-DNA in Test- und Kontrollproben
Plasmid-DNA wurde aus jeder Kontroll- und Testprobe des Elutionsmittels, das wie oben beschrieben, hergestellt wurde, wie folgt präzipitiert. 800 μl 95%iger Ethanol wurden mit jeweils 300 μl Probe des Elutionsmittels zusammengegeben, und für 60 Stunden in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei –20°C aufbewahrt. Das erhaltene DNA-Präzipitat wurde dann mittels Zentrifugieren für 10 Minuten bei 12.000 g in einer Mikrozentrifuge aus der Lösung zentrifugiert. Der Ethanolüberstand wurde verworfen und das Pellet wurde mit 500 μl 70%igem Ethanol gewaschen. Die zweite Ethanol-Waschlösung wurde ebenfalls durch Zentrifugieren entfernt und das Pellet wurde getrocknet. Das erhaltene Pellet aus DNA wurde dann in 80 μl ETF-Wasser resuspendiert.
Beispiel 8 – Ergebnisse aus der spektrophotometrischen Untersuchung von Plasmid-DNA, die aus dem Lysat unter Verwendung von Kieselerdemagnetpartikeln isoliert wurde, DEA-Kieselerdemagnetpartikel oder Kieselerde/IE-DEA-Mischbettfestphase isoliert wurde
Jede der Proben, die aus den einzelnen Partikelartenkontrollen oder aus der Mischbettfestphase, die in Beispiel 7 oben beschrieben wurde eluiert wurden, wurde unter Verwendung von spektrophotometrischen Untersuchungsverfahren, die in Beispiel 2 oben beschrieben wurden, analysiert. Die Untersuchungsergebnisse werden in Tabelle 1 unten gezeigt:
Tabelle 1
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass eine größere Menge an DNA aus dem Lysat in der Wizard^® Neutralization Lösung ("WIZ", oben) oder Lysat in der #5 Neutralisierungslösung ("#5", oben) unter Verwendung von Mischbettharz isoliert wurde, als hieraus unter Verwendung von entweder MagneSil^TM-Partikeln oder DEA-MagneSil^TM-Partikeln alleine isoliert wurde (Kontrollen 1 bzw. 2 oben). Alle Eluate, die getestet wurden, waren ziemlich rein (d.h. mit einem Absorptionsverhältnis bei A₂₆₀/A₂₈₀ von ungefähr 1,8). Eluate aus Kontrolle 1 (d.h. Eluate aus den MagneSil^TM-Partikeln alleine) und WIZ-1 bis 3 (d.h. Eluate aus Mischbettpartikeln aus Lysatlösungen in WIZ) waren hochrein, mit A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnissen von mehr als 1,80. Die höchste Ausbeute an DNA wurde in den WIZ-2-Proben erhalten, wobei die getesteten Proben aus den Kieselerde/DEA-Mischbettpartikeln nach Exposition der Partikel gegenüber einem Lysat in WIZ, gefolgt von Waschen in jeder der zwei verschiedenen Lösungen (Waschlösung B und 2 M GTC) eluiert wurden.
Beispiel 9 – Ergebnisse einer Untersuchung auf Endotoxine und die Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA, die aus dem Lysat in Beispiel 7 isoliert wurde
Die gleichen Kontroll- und Testproben, die in Beispiel 8 untersucht wurden, wurden ebenfalls auf die Entotoxin-Kontaminierung gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren oben und für die Transfektionseffizienz gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 4 beschrieben wurde, untersucht. Beide Serien der Testergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt:
Tabelle 2
Die Ergebnisse in Tabelle 2 oben zeigen, dass jedes Kontroll-1-Eluat mit Endotoxinen hoch kontaminiert war. Alle WIZ-Proben zeigten sehr niedrige Endotoxin-Aktivitäts-Einheitswerte (EU/ml von weniger als 1.000), und angemessen hohe Transfektionseffizienten (% Transfektion von mindestens 50 %). Alle der #5-Proben oben hatten leicht höhere Endotoxinniveaus. Aber die Transfektionseffizienten für alle #5-Proben überschritten 100 %.
Beispiel 10 – Herstellung von Kieselerde/IE-Histidin-Mischbettfestphase
Eine zweite Kieselerde/Ionenaustausch-Mischbettfestphase wurde zur Verwendung in den zusätzlichen Nukleinsäure-Isolierungsbeispielen unten (d.h. Beispiele 11 bis 12) wie folgt hergestellt. Das zweite Kieselerde/Ionenaustausch-Mischbett wurde durch das Kombinieren gleicher Mengen der gleichen Art von Kieselerdemagnetpartikeln, die oben verwendet wurden, mit Ionenaustausch-Kieselerdemagnetpartikeln hergestellt, wobei die Ionenaustauschpartikel Kieselerdemagnetpartikel mit Histidinresten sind, die hieran kovalent gebunden sind (nachfolgend als "IE-His-Partikel" bezeichnet). Für die Beispiele unten wurden 50 μl einer 100 mg/ml-Lösung von Kieselerdemagnetpartikeln mit 50 μl einer 100 mg/ml-Lösung von IE-His-Partikeln kombiniert. Das erhaltene Gemisch wird hier als "Kieselerde/His-Mischbett"-Festphase bezeichnet.
Die IE-His-Partikel, die verwendet wurden, um die Kieselerde/His-Mischbettfestphase herzustellen, wurden unter Verwendung von Kieselerdeaktivierung und Liganden-Anheftungsverfahren hergestellt, die im wesentlichen ähnlich dem Verfahren sind, das verwendet wurde, um die IE-DEA-Kieselerdemagnetpartikel in Beispiel 5 oben herzustellen. Histidin wurde als Ligand aufgrund seiner bekannten Eigenschaften als ein herausragender Anionenaustauscher in neutralem bis basischem pH-Bereich ausgewählt.
Beispiel 11 – Isolierung von Plasmid-DNA aus Agarose unter Verwendung von Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase
Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase, die wie in Beispiel 10 beschrieben, hergestellt wurde, wurde verwendet, um Plasmid-DNA aus Banden der DNA, die aus einem Agarosegel, wie unten beschrieben, extrahiert und isoliert wurde. Als Kontrolle wurde Plasmid-DNA auch aus Banden der gleichen DNA, die aus dem gleichen Agarosegel extrahiert wurde, unter Verwendung von Magnetpartikeln, wie unten beschrieben wird.
Plasmid-DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt und hieraus ausgeschnitten, wie folgt. 20 μg pGL3-Plasmid-DNA wurden in jeweils fünf verschiedene Vertiefungen eines 1%igen Agarosegels aliquotiert und für einen ausreichenden Zeitraum elektrophoretisch aufgetrennt, um die Plasmid-DNA von chromosomaler oder RNA-Kontaminanten in jeder Bande klar zu trennen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, und die Banden wurden unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. Die Banden wurden einzeln aus dem Gel ausgeschnitten (Bandengewicht reichte von 0,51 g bis 0,56 g je Scheibe). 2 zeigt das Agarosegel und die Schnittstellen, von denen die DNA-Banden aus dem Gel ausgeschnitten wurden.
Sobald sie aus dem Gel ausgeschnitten waren, wurde jede Bande in 550 μl eines GTC-Puffers (4,0 M GTC, 1,7 M Na⁺ und 2,6 M Acetat, pH 5,35) über 30 Minuten und einer Inkubation bei 65°C gelöst. Sobald die Gelscheiben komplett gelöst waren, wurden 500 μl der erhaltenen Flüssigkeit jeder gelösten Bande in ein Röhrchen transferiert, das entweder 50 μl Magnetkieselerdepartikel enthält, oder 100 μl Kieselerde-IE-His-Mischbettfestphase, und die Plasmid-DNA wurde hieraus, wie unten beschrieben, extrahiert.
Das Kontrollprobenröhrchen gelöster Gelscheibenmischung und Kieselerdemagnetpartikel, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde wie folgt verarbeitet:

1. Die Kontrollprobe wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Kieselerdemagnetpartikel in dem Gemisch zweimal zwischendurch während der Inkubationsdauer resuspendiert wurden.
2. Die Kieselerdemagnetpartikel wurden dann aus der gesamten Flüssigkeit in dem Inkubationsgemisch mittels Magnetkraft entfernt.
3. Die Kieselerdemagnetpartikel wurden dann dreimal mit 500 μl 70 % Ethanol gewaschen, der zu den Partikeln in jedem Waschschritt hinzugegeben wurde. Magnetkraft wurde verwendet, um die Waschlösung von den Kieselerdemagnetpartikeln nach jeder Zugabe von Ethanol-Waschlösung zu entfernen.
4. Die Kieselerdemagnetpartikel wurden für mindestens 15 Minuten nach dem letzten Waschen und Magnetauftrennungsschritt trocknen gelassen.
5. DNA wurde mit 100 μl 10 mM Tris-Puffer (pH 8,7) von den Kieselerdemagnetpartikeln eluiert. Das erhaltene Eluat wurde von den Partikeln mittels Zentrifugieren abgetrennt.

Das Testprobenröhrchen des gelösten Gelscheibengemischs und der Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphasepartikel, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde wie folgt verarbeitet:

1. Das Röhrchen der Kontrollprobe wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Mischbettpartikel in dem Gemisch zweimal zwischendurch während der Inkubationsdauer resuspendiert wurden.
2. Die Kieselerdemagnetpartikel wurden dann aus aller Flüssigkeit in dem Inkubationsgemisch mittels Magnetkraft entfernt.
3. Die Kieselerdemagnetpartikel wurden dann dreimal mit 500 μl nanoreinem Wasser, welches zu jedem Röhrchen hinzugegeben wurde, gewaschen. Magnetkraft wurde nach jedem Waschschritt verwendet, um die Waschlösung von den Kieselerdemagnetpartikeln zu entfernen.
4. DNA wurde von den Mischbettpartikeln mit 1 μl 10 mM Tris-Puffer (pH 8,7) eluiert. Das erhaltene Eluat wurde von den Partikeln mittels Zentrifugieren abgetrennt.

Die Kontroll- und Testprobeneluate, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden dann unter Verwendung der spektrophotometrischen Analyseverfahren, die in Beispiel 2 oben ausgeführt sind, auf Ausbeute und Reinheit getestet. Sowohl die Ausbeute und die Reinheit von Plasmid-DNA waren in der Testprobe höher, wobei das Eluat aus der Mischbettfestphase stammt. Genauer gesagt wurde der A₂₆₀-Wert für die Kontrollprobe (d.h. das Eluat aus den Kieselerdemagnetpartikeln alleine) bei 0,0104 gemessen, während der A₂₆₀-Wert der Testprobe (d.h. das Eluat des Kieselerde/IE-His-Mischbett) bei 0,0166 gemessen wurde. Das bedeutet, dass die A₂₆₀-Ergebnisse darauf hinwiesen, dass im Vergleich mit der Kontrolle eine signifikant höhere Ausbeute an Plasmid-DNA aus den Agaroseproben gewonnen wurde. Die Kontrollprobe A₂₆₀/A₂₈₀ wurde bei 1,54 gemessen, während die Testprobe A₂₆₀/A₂₈₀ 1,89 war. Das bedeutet, dass die Absorptionsverhältnisergebnisse darauf hinwiesen, dass die Plasmid-DNA, die unter Verwendung der Mischbettfestphase aus der Agarose isoliert wurde, außerdem von größerer Reinheit war als Plasmid-DNA, die unter Verwendung von Kieselerdemagnetpartikeln alleine aus Agarose isoliert wurde.
Beispiel 12 – Isolierung eines Lambda-DNA-Fragments aus Agarose, unter Verwendung von Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase gegenüber der Verwendung von Kieselerdemagnetpartikeln alleine
Zwei Aliquots gleicher Mengen an lambda-DNA/Hind III-Marker (Promega Cat. Nr. G1711), die auf das gleiche 1%ige Agarosegel geladen wurden, und elektrophoretisch aufgetrennt wurden, bis alle verschiedenen Größenfragmente an DNA in den Markern vollständig aufgetrennt waren. Die Bande in jeder der beiden Markerspuren, die einem Molekulargewicht von 4.361 entspricht, wurde dann ausgeschnitten. Die Ausgangsmenge an lambda-DNA-Fragment in der ausgeschnittenen Bande betrug ungefähr 206 mg. 306 μl eines GTC-Puffers (4,0 M GTC/0,34 M Na⁺/0,52 M Acetat, pH 5,3) wurden mit jeder ausgeschnittenen Bande in einem separaten Röhrchen zusammengegeben und für 30 Minuten bei 65°C inkubiert, um das Gel aufzulösen. Sobald die Gelscheiben vollständig aufgelöst waren, wurden 250 μl der Flüssigkeit aus einer Probe in ein Röhrchen, das 50 μl 100 mg/ml Kieselerdemagnetpartikel enthält, transferiert – die Kontrollprobe. Eine Mischbettharztestprobe wurde durch das Transferieren von 250 μl der Flüssigkeit aus der anderen Probe in ein Röhrchen hergestellt, das 100 μl 100 mg/ml Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase enthält.
Lambda-DNA-Proben aus der ausgeschnittenen Bande wurden aus den Test- und Kontrollproben extrahiert, welche wie oben beschrieben hergestellt wurden, indem die gleichen Protokolle verwendet wurden, die zum Isolieren von Plasmid-DNA aus den Test- und Kontrollproben in Beispiel 10 oben verwendet wurden. Die erhaltenen lambda-DNA-Proben, die mit den zwei verschiedenen Arten an Harzen eluierten, waren von vergleichbarer Ausbeute und Reinheit, wenn sie mittels spektrophotometrischer Analyse gemäß Beispiel 2 und durch Gelelektrophorese gemäß Beispiel 1 getestet wurden.
Beispiel 13 – Isolierung amplifizierter DNA aus einem Agarosegel unter Verwendung einer Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase
Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase, die wie in Beispiel 10 beschrieben hergestellt wurde, wurde verwendet, um ein 1,8 Kb- DNA-Fragment aus einem Agarosegel zu isolieren, das unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wurde. Das folgende Verfahren wurde verwendet, um das Fragment von Interesse aus dem Gel zu isolieren:

1. Ein Reaktionsgemisch der Amplifizierung einer 1,8 Kb Sequenz eines Adenometous polyposis coli (APC)-Gens wurde aus einem Agarosegel aufgetrennt, und eine Bande, die einem Fragment von 1,8 Kb Größe entspricht, wurde hieraus ausgeschnitten. Die ausgeschnittene Bande betrug 725 mg.
2. 725 μl eines GTC-Puffers (4,0 M GTC, 1,7 M N⁺ und 2,1 M Acetat, pH 5,35) wurden zu der ausgeschnittenen Bande hinzugegeben und bei 65°C inkubiert, bis das Agarosegel gelöst war.
3. 400 μl Aliquote der erhaltenen Lösung wurden in drei verschiedene Röhrchen transferiert, die 10 mg Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphasepartikel enthalten, die wie in Beispiel 10 oben beschrieben hergestellt wurden.
4. Das erhaltene Gemisch aus Partikeln und Lösung wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, um sicherzustellen, dass die DNA in dem Gemisch an die Partikel bindet. Am Ende dieser Periode wurde die Lösung von den Partikeln unter Verwendung von Magnetkraft entfernt.
5. Jede Partikelprobe wurde dann dreimal mit einer der folgenden Waschlösungen gewaschen: (1) nanoreines Wasser (nicht gepuffertes, gereinigtes Wasser mit einem pH-Wert von weniger als 5,0); (2) 0,2 mM KOAc, pH 4,8, hergestellt mit nanoreinem Wasser; oder (3) 1,3 mM KOAc, pH 4,8, hergestellt mit nanoreinem Wasser. Magnetkraft wurde verwendet, um die Partikel aus der Waschlösung nach jedem Waschschritt abzutrennen.
6. 50 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, wurden zu jeder Probe der Partikel hinzugegeben, um die DNA hiervon zu eluieren, und von den Partikeln mittels Magnetkraft abzutrennen. 20 μl des Eluats aus jeder Probe der Partikel wurden auf ein Agarosegel geladen zusammen mit zwei Aliquots des Reaktionsgemischs aus Schritt 1 oben und mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. 5 ist ein Foto des Gels, nachdem es mit Ethidiumbromid gefärbt wurde und unter ultraviolettem Licht illuminiert wurde. Die Spuren des Gels, die in 5 gezeigt sind, wurden wie folgt geladen: 1. PCR-Reaktionsgemisch 2. Nanoreine Wasserwaschung von Kieselerde-IE-His-Mischbettpartikeln 3. PCR-Reaktionsgemisch 4. 0,2 mM KOAc, pH 4,8, Waschung für Kieselerde/IE-His-Mischbettpartikeln 5. 1,3 mM KOAc, pH 4,8, Waschung von Kieselerde/IE-His-Mischbettpartikeln.

5 zeigt, dass die Proben in Spuren 1 bis 3 und 5 alle die erwartete Bande bei ungefähr 1,8 KB zeigten. Die Bande in Spur 5 war jedoch beträchtlich weniger intensiv als die in Spur 2 und keine Bande wurde in Spur 4 sichtbar gemacht. Es scheint, dass das nanoreine Wasser am besten beim Waschen der Partikel ohne das Eluieren der DNA hieraus in Schritt 5 oben arbeitete.
Beispiel 14 – Präliminäre Isolierung von Gesamt-RNA und genomischer DNA aus Mausblut
Genomische DNA und Gesamt-RNA wurden teilweise aus Mausblut aus Lampire Biological Laboratories (Pipersville, PA) unter Verwendung von Reagenzien aus einem SV Total RNA Isolation System (Promega, cat. Nr. Z3100) wie folgt isoliert. Das erhaltene Gemisch aus genomischer DNA und Gesamt-RNA wurde dann weiter verarbeitet, um genomische DNA hieraus zu isolieren, indem drei verschiedene Substrate und Protokolle gemäß den Verfahren der Beispiele 15 bis 17 unten verwendet wurden. Gesamt-RNA konnte ebenfalls aus dem Gemisch aus genomischer DNA und Gesamt-RNA, das wie hierin beschrieben hergestellt wurde, isoliert werden, gemäß dem Verfahren des theoretischen Beispiels 19 unten.
Die folgenden Lösungen wurden in dem vorliegenden präliminären Isolierungsverfahren verwendet:

SV-RNA-Lyselösung für rote Blutzellen
5 mM MgCl₂
10 mM NaCl
10 mM Tris-HCl (pH 7,0)
SV-RNA-Lysepuffer
4 M GTC
0,01 M Tris (pH 7,5)
0,97 % β-Mercaptoethanol
SV-RNA-Waschlösung
60 mM Kaliumacetat
10 mM Tris-HCl (pH 7,5 bei 25°C)
60 % Ethanol (Vol.%)
SV-RNA-Verdünnungspuffer
17,5 % NaCl
8,8 % Kaliumcitrat, pH 7,0
10 % SDS (gesättigt)
10 % F, D&C Blau #1

Ein Gemisch aus teilweise isolierter Gesamt-RNA und genomischer DNA wurde aus Proben der Mausblutzellen wie folgt hergestellt:

1. 1,0 ml Vollblutzellen der Maus wurden in je 12 Mikrozentrifugenröhrchen aliquottiert.
2. Die Zellen in jeder Röhre wurden durch Zentrifugieren bei 4.000 Upm für 2 Minuten pelletiert. Der Plasmaüberstand wurde mit einer Pipette abgenommen und verworfen.
3. 1 ml SV-RNA-Lyselösung für rote Blutzellen wurde zu den geernteten Zellen hinzugegeben, und die Zellen wurden in der Lyselösung durch Pipettieren oder durch leichtes Vortexen resuspendiert.
4. Die Mischung aus resuspendierten Zellen/Lyselösung wurde bei 4.000 Upm für 2 Minuten zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde mit einer Pipette entfernt und verworfen, wobei das Zellpellet aus weißen Blutkörperchen und ein Pellet aus Erythrocytentrümmern über den weißen Zellen zurückbehalten wurde. Die Flüssigkeit wurde aus den Mikrozentrifugenröhrchendeckeln während dieses Schrittes und allen verbleibenden Schritten dieses Verfahrens entfernt.
5. Schritte 3 und 4 wurden zweimal, d.h. für insgesamt dreimal wiederholt. Für Blutvolumina von mehr als 600 μl wurden 200 μl des Erythrocytenbruchs entfernt, was mehrere hundert μl der Erythrocytentrümmer in dem Röhrchen zurückließ.
6. Das Zellpellet wurde für 5 Sekunden bei einer Hochgeschwindigkeitseinstellung vortext, um die weißen Zellen und den Erythrocytenbruch zu resuspendieren.
7. 175 μl SV-RNA-Lysepuffer wurden zu den Zellen hinzugegeben und die Zellen wurden wiederum bei Hochgeschwindigkeit für 5 Sekunden gevortext.
8. 350 μl SV-RNA-Verdünnungspuffer wurden zu jeder Röhre lysierter Zellen hinzugegeben und wiederum bei Hochgeschwindigkeit für 5 Sekunden gevortext.
9. Die Röhrchen lysierter und verdünnter Zellen wurden dann bei 12.000 bis 14.000 Upm für 10 Minuten bei 20 bis 25°C zentrifugiert.
10. Der Überstand wurde in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, enthaltend 150 μl 95%igen bis 100%igen Ethanol, transferiert, worauf die DNA in dem erhaltenen Gemisch ein Präzipitat bildete. Das Gemisch wurde dann mittels Umschütten gemischt, bis die gesamte präzipitierte DNA wieder in Lösung war.

Beispiel 15 – Isolierung genomischer DNA unter Verwendung von SV-RNA-SPINBASKET
Drei Proben des Überstand/Ethanolgemischs aus Schritt 10 des Beispiels 14 wurden in separate sterile SV-RNA-Spin Baskets transferiert, von denen jedes in ein frisches Sammelröhrchen getan wurde. Die erhaltenen Vorrichtungen wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Das folgende Verfahren wurde dann befolgt, um die genomische DNA aus dem Gemisch zu isolieren, indem die Spin Basket-Vorrichtung verwendet wurde:

1. Die Spin Basket-Vorrichtung wurde in einer Mikrozentrifuge bei 12.000 bis 14.000 für 10 Sekunden zentrifugiert. Die Inhalte des Sammelröhrchens wurden verworfen, das Spin Basket in die Sammelröhre reinseriert und wiederum für weitere 10 Sekunden zentrifugiert. Die Inhalte des Sammelröhrchens wurden wieder verworfen.
2. 700 μl 70 % Ethanol in Wasser wurden in das Spin Basket gegeben und die Spin Basket/Sammelröhrchen-Vorrichtung wurde für 12 bis 14 K für 10 Sekunden zentrifugiert. Der resultierende Durchfluss wurde verworfen.
3. Das leere Spin Basket wurde wiederum für 12 bis 14 K für 20 Sekunden zentrifugiert, um restliche Waschlösung aus dem Basket zu entfernen.
4. Zum Schluss wurde das Spin Basket in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und 100 μl eines 50 mM Tris-HCl-Puffers, pH 9,5, wurden zu dem Spin Basket hinzugegeben, um jegliche daran gebundene genomische DNA zu eluieren. Das Spin Basket wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann in einer Mikrozentrifuge bei 12 bis 14 K für 10 Sekunden zentrifugiert. Das Spin Basket wurde dann aus der Mikrozentrifugenröhre des Eluats entfernt, und das Eluat wurde zum Testen wie in Beispiel 18 unten beschrieben zusammen mit den Proben der genomischen DNA, die gemäß den Isolationsverfahren, die in den nächsten zwei Beispielen unten beschrieben sind, aufbewahrt.

Beispiel 16 – Isolierung genomischer DNA unter Verwendung von Kieselerdemagnetpartikeln
Drei Proben des Überstand/Ethanolgemischs aus Schritt 10 des Beispiels 14 wurden in getrennte Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, von denen jede 50 μl 100 mg/ml Kieselerdemagnetpartikel alleine enthält (d.h. nicht in Mischbettkonfiguration). Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert, die Partikel in dem Gemisch zweimal ungefähr zur Halbzeit der Inkubationsperiode resuspendiert. Das folgende Verfahren wurde dann befolgt, um genomische DNA von anderen Materialien in dem Gemisch zu isolieren:

1. Magnetkraft wurde verwendet, um die Kieselerdemagnetpartikel von dem Flüssigteil des Gemischs abzutrennen, nachdem die Inkubationsdauer vorbei war. Die Flüssigkeit wurde verworfen.
2. Die Kieselerdemagnetpartikel wurden dann viermal mit 1 ml 70 % Ethanol gewaschen. Die Ethanolwaschlösung wurde von den Kieselerdemagnetpartikeln mittels Magnetkraft abgetrennt. Die Waschlösung wurde nach jedem Waschschritt verworfen.
3. Die Kieselerdemagnetpartikel wurden in den Mikrozentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur trocknen gelassen, bis der Ethanol hieraus verdampft war.
4. Schließlich wurden nach dem letzten Waschschritt 100 μl eines 50 mM Tris-HCl-Puffers, pH 9,5, zu den Kieselerdemagnetpartikeln hinzugegeben, und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Puffer/Partikelgemisch wurde dann in einer Mikrozentrifuge bei 12 bis 14 K für 10 Sekunden zentrifugiert. Das Eluat wurde aus dem erhaltenen Pellet der Kieselerdemagnetpartikel entfernt und zum Testen mit den anderen Proben, die in Beispiel 17 unten beschrieben werden, zur Seite gegeben.

Beispiel 17 – Isolierung von genomischer DNA aus Mausblut unter verwendung von Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase
Sechs Proben des Ethanol/Mausblutlysatgemischs aus Schritt 10 des Beispiels 14 wurden in getrennte Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, von denen jede 50 μl 100 mg/ml Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphasepartikel enthält. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert, wobei die Partikel in der Mischung zweimal ungefähr in der Mitte der Inkubationsdauer resuspendiert wurden. Das folgende Verfahren wurde dann befolgt, um genomische DNA aus den anderen Materialien in dem Gemisch zu isolieren:

1. Magnetkraft wurde verwendet, um die Mischbettfestphasepartikel von dem Flüssigteil des Gemischs abzutrennen, nachdem die Inkubationsdauer vorbei war. Die Flüssigkeit wurde verworfen.
2. Drei der Proben der Mischbettfestphasepartikel, die aus dem Überstand/Ethanolgemisch in Schritt 1 oben abgetrennt worden waren, wurden einmal mit 1,0 ml Waschlösung A (66 mM KOAc, pH 4,8; 500 mM NaCl) gewaschen, während die verbliebenen drei Proben einmal mit 1,0 ml Waschlösung B (66 mM KOAc, pH 5,8 ohne zugegebenes NaCl) gewaschen wurden. Magnetkraft wurde verwendet, um die Mischbettfestphasepartikel von der Waschlösung abzutrennen. Die Waschlösung wurde verworfen.
3. die Mischbettfestphasepartikel wurden dann viermal mit 1,0 ml jeweils nanoreinem Wassers gewaschen, wobei das Wasser von den Mischbettfestphasepartikeln nach jedem Waschschritt mittels Magnetkraft abgetrennt wurde. Die Waschlösung wurde nach jedem Waschschritt verworfen.
4. Schließlich wurden 100 μl eines 50 mM Tris-HCl-Puffers, pH 9,5 zu den Mischbettfestphasepartikeln nach dem letzten Waschschritt hinzugegeben und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Puffer/Partikelgemisch wurde dann in einer Mikrozentrifuge bei 12 bis 14 K für 10 Sekunden heruntergeschleudert. Das Eluat wurde aus dem erhaltenen Pellet der Kieselerdemagnetpartikel entfernt und zum Testen mit den anderen Proben, die in Beispiel 18 unten beschrieben sind, zur Seite gegeben.

Beispiel 18 – Untersuchung genomischer DNA, die aus SV-RNA-Spin-Basket, Kieselerdemagnetpartikeln und Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase eluiert wurden
Genomische DNA, die aus jeder der Isolierungsmittel, die in den Beispielen 15 bis 17 verwendet wurde, wurde getestet, indem Spektrophotometrie, wie in Beispiel 2 beschrieben, verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung werden in Tabelle 3 unten beschrieben:
Tabelle 3
Die Ergebnisse in Tabelle 3 oben zeigen, dass genomische Maus-DNA von vergleichbar hoher Reinheit und Ausbeute unter Verwendung jedes Verfahrens, das in den Beispielen 15 bis 17 beschrieben wurde, erhalten wurde, um die DNA aus der gleichen Mischung aus DNA und RNA zu isolieren, die aus der gleichen Menge (1 ml) Mäuseblut hergestellt wurde, gemäß den Lyse- und präliminären Isolationsverfahren des Beispiels 14.
Genauer fielen die A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnisse für jede der getesteten Proben in einen Bereich zwischen 1,70 und 1,90, dem erwarteten Bereich für genomische DNA, die relativ frei von Proteinkontaminierungen ist.
Die Ablesungen der Absorption wurden ebenfalls bei jeder Probe bei 230 nm genommen, um in jeder Endprobe der genomischen DNA, die damit isoliert wurde, übertragenes Guanidin zu detektieren, das in jedem Isolationsverfahren verwendet wurde. Die A₂₃₀-Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben gezeigt. Man kann sehen, dass die niedrigsten A₂₃₀-Ablesungen mit den Proben der genomischen DNA erhalten wurden, die unter Verwendung des SV-RNAs Spin Baskets isoliert wurden, und dass solche, die unter Verwendung der Mischbettfestphase und Waschlösung B (kein Salz) isoliert wurden, die niedrigsten Mengen an Guanidin-Transfer in diesen beiden Probensets anzeigten. Alle A₂₃₀-Ablesungen, die in Tabelle 3 ausgeführt sind, sind jedoch niedrig genug, um darauf hinzuweisen, dass alle Proben, die oben isoliert wurden, im wesentlichen rein sind. Anders gesagt, zeigen die A₂₃₀-Ergebnisse, die hier erhalten wurden, dass alle Mittel zum Entfernen von Guanidin von dem festen Träger, der verwendet wurde, um genomische DNA vor der Elution der DNA hiervon zu isolieren, ungefähr gleichermaßen wirksam waren. Zwei der Isolierverfahren, die verwendet wurden, um die hier getesteten Proben zu erhalten, benötigten jedoch zeitaufwendige Verdampfungs- oder zusätzliche Zentrifugationsschritte vor der DNA-Eluierung, um eine Entfernung des Guanidins von dem festen Träger zu sichern, der in jedem dieser Verfahren verwendet wurde. Siehe z.B. die Verdampfung während des Zentrifugationsschritts 3 mit dem leeren Spin Basket in Beispiel 15 und die Verdampfung der Waschlösung von den Partikeln in Schritt 3 des Beispiels 16. Im Gegensatz dazu waren keine solchen Verdampfungsschritte verwendet worden, bevor die genomische DNA von der Mischbettfestphase eluiert wurde, in Übereinstimmung mit dem Isolationsverfahren, das in Beispiel 16 oben beschrieben wurde. Genauer gesagt, lösten und entfernten die wässrigen Waschlösungen, die mit der Mischbettfestphase vor dem Elutionsschritt kombiniert und wieder entfernt wurden, restliches Guanidin hiervon.
Beispiel 19 – Herstellung eines Gemischs aus Ethanol und gereinigtem Lysat aus Lebergewebe der Maus zur Verwendung als Substrat bei der Isolierung von Gesamt-RNA mit verschiedenen Isolationsverfahren
Ein Gemisch aus Ethanol und gereinigtem Lysat aus Lebergewebe der Maus wurde gemäß dem Gewebelysat-Herstellungsverfahren durchgeführt, das in SV-Total RNA Isolation System Technical Manual (Promega, TM #48) wie folgt ausgeführt ist:

1. Drei Mäuselebern wurden in Gegenwart von SV-RNA-Lysepuffer homogenisiert, wobei 171 mg Lebergewebe mit jedem Millimeter Lysepuffer zusammengegeben wurde. Die Homogenisierung wurde fortgesetzt, bis die Lyse vollständig war (d.h. bis keine sichtbaren Gewebefragmente in der Lösung blieben).
2. 175 μl des Lysats wurden in jede der sechs 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen transferiert. 350 μl SV-RNA-Verdünnungspuffer (blau) (siehe Beispiel 14) wurden zu jedem Röhrchen hinzugegeben. Die Inhalte jedes Mikrozentrifugenröhrchens wurden durch Umschütten gemischt. Das verdünnte Lysat wurde dann in ein Wasserbad gegeben oder in einen Heizblock bei 70°C, und für 3 Minuten inkubiert.
3. Alle Proben des verdünnten Lysats wurden dann bei ungefähr 12.000 bis 14.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, was einen geklärten Lysatüberstand ergab.
4. Jeder Überstand des gereinigten Lysats (ungefähr 500 μl) wurde durch Pipettieren in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen transferiert und 200 μl 95%iger Ethanol wurde zu jeder Probe des gereinigten Lysats hinzugegeben. Das erhaltene Ethanol/Lysatgemisch wurde durch Pipettieren gemischt.

Beispiel 20 – Isolierung von Gesamt-RNA aus Ethanol/Lysat aus Lebern von Mäusen, unter Verwendung einer porösen und nichtporösen Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase
Gesamt-Maus-RNA wurde dann aus vier Proben des Ethanollysatgemischs, das wie in Beispiel 19 oben aus den Lebern der Maus hergestellt wurde, wurde unter Verwendung von zwei verschiedenen Mischbettfestphasen isoliert. Eine der zwei Mischbettfestphasen war eine Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase poröser Kieselerdemagnetpartikel, welche wie in Beispiel 10 oben beschrieben, hergestellt wurde. Die andere hier verwendete Mischbettfestphase wurde auf die gleiche Weise wie die poröse Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase hergestellt, außer dass nicht-poröse Kieselerdemagnetpartikel anstelle von porösen Partikeln verwendet wurden. Das gleiche Verfahren wurde verwendet, um Gesamt-RNA aus jeder Probe unter Verwendung beider Arten von Mischbettfestphasen zu isolieren.
Jede Probe des Ethanollysatgemischs wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert, das entweder 50 μl 100 mg/ml poröse oder nicht-poröse Kiselerde/IE-His-Mischbettfestphasepartikel enthält. Das Gemisch und die Partikel wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert, wobei die Mischbettfestphasepartikel in dem Gemisch zweimal auf ungefähr halbem Wege während der Inkubationszeit resuspendiert wurden. Die RNA wurde dann aus der Mischbettfestphase gemäß dem folgenden Verfahren isoliert:

1. Magnetkraft wurde verwendet, um die Mischbettfestphasepartikel aus dem Überstand/Ethanolgemisch abzutrennen. Die hiervon abgetrennte Flüssigkeit wurde verworfen.
2. 50 μl eines Gemischs aus DNAase I Enzym in DNase-Puffer (0,0225 M Tris (pH 7,5), 1,125 M NaCl und 0,09 M MnCl₂) wurden direkt zu den Mischbettfestphasepartikeln hinzugegeben und für 15 Minuten bei 20 bis 25°C inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurden 200 μl SV DNAse Stoplösung (60 mM Kaliumacetat, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 bei 25°C und 60 % Ethanol) zu jeder Probe hinzugegeben.
3. Die Partikel wurden von der DNAse Inkubationslösung durch Magnetkraft abgetrennt und die Lösung wurde verworfen.
4. 1,0 ml Waschlösung B (66 mM KOAc, pH 5,8) wurde zu jeder Probe hinzugegeben und Magnetkraft wurde verwendet, um die Mischbettfestphasepartikel von der Waschlösung abzutrennen. Die Waschlösung, die hiervon abgetrennt wurde, wurde verworfen.
5. Die Mischbettfestphasepartikel wurden viermal mit jeweils 1,0 ml nanoreinem Wasser gewaschen, wobei das Wasser von den Mischbettfestphasepartikeln nach jedem Waschschritt durch Magnetkraft abgetrennt wurde. Die Waschlösung, die hiervon abgetrennt wurde, wurde nach jedem Waschschritt verworfen.
6. Schließlich wurden 100 μl Nuklease-freies Wasser nach dem letzten Waschschritt zu den Mischbettfestphasepartikeln hinzugegeben, und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Wasser/Partikelgemisch wurde in einer Mikrozentrifuge bei 12 bis 14 K für 10 Sekunden heruntergeschleudert. Das erhaltene Eluat wurde aus dem erhaltenen Pellet der Kieselerdemagnetpartikel entfernt und, wie in Beispiel 22 unten beschrieben, getestet.

Beispiel 21 – Isolierung von Gesamt-RNA aus Ethanol/Lysat aus Mauslebern unter Verwendung einer SV RNA Spin Basketvorrichtung
Gesamt -RNA der -Maus wurde dann wie folgt aus den verbliebenen zwei Proben des Ethanol/Lysatgemischs isoliert, das, wie in Beispiel 19 oben beschrieben, aus Mauslebern hergestellt wurde, indem ein Isolationsverfahren verwendet wurde, das in dem SV Total RNA Isolation System Technical Manual (TM #48, Promega Corp.) beschrieben ist:

1. Jede der zwei Proben des Überstands/Ethanolgemischs wurde in ein SV RNA Spin Basket übertragen und mit einem Sammelröhrchen bei 12.000 bis 14.000 x g für ungefähr eine Minute zentrifugiert. Die gesammelte Lösung in dem Sammelröhrchen wurde verworfen.
2. 50 μl eines Gemisches aus DNAase I Enzym in DNAse-Puffer (0,0225 M Tris (pH 7,5), 1,125 M NaCl und 0,09 M MnCl₂) wurde direkt zu jedem Spin Basket nach dem Abtrennungsschritt, der oben beschrieben wurde, hinzugegeben. Die erhaltenen Gemische wurden für 15 Minuten bei 20 bis 25°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 200 μl SV DNAse Stoplösung (60 mM Kaliumacetat, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 bis 25°C und 60 % Ethanol) zu jeder Probe hinzugegeben.
3. 600 μl SV RNA Waschlösung mit hinzugegebenem Ethanol wurden zu der Probe in jedem Spin Basket hinzugegeben. Der Spin Basket wurde mit einer Sammelröhre wiederum bei 12.000 bis 14.000 × g für ungefähr eine Minute zentrifugiert und die Inhalte der Sammelröhrchen verworfen.
4. Waschschritt 3 oben wurde unter Verwendung von 250 μl SV RNA Waschlösung und einer Hochgeschwindigkeits-Zentrifugation für 2 Minuten wiederholt.
5. Schließlich wurden 100 μl nanoreinen nukleasefreien Wassers zu jeder Isolationsvorrichtung zugegeben, um die RNA davon zu eluieren. Das Eluat wurde von jedem der Isolationsmittel mittels Zentrifugieren abgetrennt.

Beispiel 22 – Vergleich der DNA und Gesamt-RNA, die aus Mausblut unter Verwendung von Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase isoliert wurde
20 μl jeder Probe genomischer DNA und Gesamt-RNA, die aus Mausblut mit Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase wie in Beispielen 17 und 21 beschrieben, isoliert wurde, wurden in einem Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt.

Ein Foto des Gels ist in 3 reproduziert. Die Spuren des Gels wurden wie folgt beladen:

Spuren A, B und C	wurden mit der isolierten Gesamt-RNA beladen.
Spuren 1 bis 3	wurden mit DNA beladen, die mittels Waschlösung A isoliert wurde.
Spuren 4 bis 6	wurden mit DNA beladen, die mittels Waschlösung B isoliert wurde.

Aus den Ergebnissen der Geluntersuchung scheint, dass intakte RNA und DNA aus Mausblut isoliert wurden, obwohl die isolierte RNA-Menge im Vergleich mit der DNA-Menge klein war.
Es scheint auch, dass die DNA, die mit irgendeiner der Waschlösungen, die in Schritt 2 verwendet wurde, isoliert wurde, im wesentlichen intakt war und von Kontamination mit RNA frei zu sein schien.
Beispiel 23 – Untersuchung auf Gesamt-Maus-RNA, die aus poröser Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase, nicht poröser Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase und SV RNA Spin Basket-Vorrichtung eluiert wurde
Gesamt-Maus-RNA, die aus jeder der Isolationsvorrichtungen eluiert wurde, die in den Beispielen 19 bis 21 oben verwendet wurden, wurde unter Verwendung von Gelelektrophorese wie folgt untersucht. 10 μl jeder Proben wurden in eine separate Vertiefung eines 1,5%igen Agarosegels geladen, mit Proben, die mit den gleichen Isolationsvorrichtungen eluiert wurden, die in Paaren beladen wurden, mit einer 100 BP DNA-Leiter (Promega Cat. Nr. G2101) wurde in eine leere Vertiefung zwischen jedem Probenpaar geladen. Das 1,5%ige Agarosegel wurde dann für eine ausreichende Zeit elektrophoretisch aufgetrennt, um eine klare Auftrennung zwischen den Strängen der 100 Basenpaarleiter zu geben. Schließlich wurde das Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt und unter ultraviolettem Licht fotografiert.

4 ist eine Kopie des Fotos des 1,5%igen Agarosegels der Proben und Leitern, die wie oben beschrieben beladen und fraktioniert wurden. Die folgenden Proben wurden in jede Spur des in 4 gezeigten Gels geladen:

Spur 1:	Promega 100 BP DNA-ladder
Spuren 2 & 3:	Eluat aus der porösen Kieselerde/IE-His-Mischung mit Festphase
Spur 4:	100 BP DNA-ladder
Spuren 5 & 6:	Eluat aus SV RNA Spin Basket
Spur 7:	100 BP DNA-ladder
Spuren 8 & 9:	Eluat aus nicht-poröser Kieselerde/IE-His-Mischbettfestphase
Spur 10:	100 BP DNA-ladder

Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, dass alle drei Isolationsmittel und -verfahren, die in den Beispielen 19 bis 21 oben verwendet wurden, etwas hervorbrachten, was intakte RNA zu sein schien. 4 zeigt auch an, dass mindestens eins der zwei Eluate aus einer der SV RNA Spin Baskets mit hochmolekulargewichtiger Nukleinsäure, wahrscheinlich genomischer Maus-DNA, kontaminiert war. Siehe die Bande direkt unter der Vertiefung in Spur 4. Keine der Proben der Gesamt-RNA, die mit poröser oder nicht-poröser Mischbettfestphasepartikeln isoliert wurden, scheinen solche Kontaminanten zu enthalten.
4 zeigt, dass magnetische Auftrennungen und die Mischbettisolationsverfahren der vorliegenden Methode verwendet werden können, um Gesamt-RNA zu isolieren, die mindestens frei von Kontaminanten wie denen ist, die durch das Verwenden von SV RNA Spin Baskets hervorgerufen werden. Anders als die SV RNA Isolationsverfahren, die in Beispiel 21 verwendet wurden, benötigt das vorliegende Verfahren (siehe z.B. Beispiel 20 oben) keine Zentrifugierungen in einer Zentrifuge und keine Ethanolwaschungen (sondern nur Wasserwaschungen).
Natürlich können viele Modifizierungen und Variationen der hier zuvor beschriebenen Erfindung durchgeführt werden, ohne von deren Gedanken und Bereich abzuweichen. Deswegen sollten nur solche Beschränkungen angewendet werden, die in den untenstehenden Ansprüchen angegeben sind.

Claims

Mischbettfestphase zum Isolieren einer Ziel-Nukleinsäure aus einem Gemisch, umfassend die Ziel-Nukleinsäure und mindestens eine Kontaminante, wobei die Mischbettfestphase umfaßt: eine erste Ionenaustauschfestphase mit der Fähigkeit die Ziel-Nukleinsäure zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart einer ersten Lösung zusammengegeben wird, die einen ersten pH-Wert hat, und einer Fähigkeit die Ziel-Nukleinsäure, die hieran gebunden ist, in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen, die einen zweiten pH-Wert hat, wobei der erste pH-Wert mindestens 0,5 pH-Einheiten verschieden vom zweiten pH-Wert ist; und eine zweite Ionenaustauschfestphase mit der Fähigkeit die Ziel-Nukleinsäure zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart der zweiten Lösung zusammengegeben wird, und einer Fähigkeit die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen, wobei die erste Ionenaustauschfestphase und die zweite Ionenaustauschfestphase miteinander in einem einzelnen Behälter gemischt werden, wodurch eine Mischbettfestphase gebildet wird, wobei die erste Ionenaustauschfestphase und die zweite Ionenaustauschfestphase der Mischbettfestphase jeweils die Fähigkeit haben, die hieran gebundene Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 1, wobei der erste pH-Wert mindestens 4 und bis zu 9 ist und die erste Lösung im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln ist.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 1, wobei die erste Ionenaustauschfestphase ein erstes Kieselerdematerial mit mindestens einem ersten Ionenaustauschrest, der hieran kovalent gebunden ist, umfaßt und die zweite Ionenaustauschfestphase ein zweites Kieselerdematerial mit mindestens einem zweiten Ionenaustauschrest, der hieran kovalent gebunden ist, umfaßt.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 3, wobei das erste Kieselerdematerial ein erster Kieselerdemagnetpartikel ist und das zweite Kieselerdematerial ein zweiter Kieselerdemagnetpartikel ist.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 3, wobei der erste Ionenaustauschrest aus der Gruppe an Resten ausgewählt ist, die aus einem Amin, einem Dimethylamin, einem Histamin, einem Histidin, einem Pyridylalanin und Pyridylcystein bestehen.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 1, wobei die erste Lösung eine Salzkonzentration hat, die mindestens 20 verschieden von der zweiten Lösung ist.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 1, wobei der Elutionspuffer eine Salzkonzentration von nicht mehr als 3 M hat und einen pH-Wert von mindestens 4 bis zu 9,5.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 1, wobei die Ziel-Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, genomischer DNA, Gesamt-RNA und Nukleinsäuren, die durch enzymatische Amplifizierung erzeugt wurden.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 1, wobei die erste Festphase, die zweite Festphase, die erste Lösung, die zweite Lösung und der Elutionspuffer so gestaltet sind, daß gesichert wird, daß mindestens eine Endotoxinkontaminante in Gegenwart der ersten Lösung oder der zweiten Lösung an die Mischbettfestphase bindet und hiervon in Gegenwart der ersten Lösung oder der zweiten Lösung, die im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln sind, oder des Elutionspuffers nicht eluiert wird, und wobei die Mischbettfestphase auf Kieselerde basiert.
Mischbettfestphase zum Isolieren von Plasmid-DNA aus einem Gemisch, umfassend Plasmid-DNA und mindestens eine Kontaminante, wobei die Mischbettfestphase umfaßt: einen ersten magnetischen Kieselerdepartikel umfassend mindestens einen Anionenaustauschrest, der hieran kovalent gebunden ist, wobei der erste magnetische Kieselerdepartikel eine Fähigkeit hat die Plasmid-DNA zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart einer ersten Lösung kombiniert wird, und die Fähigkeit hat die Plasmid-DNA, die hieran gebunden ist, in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen; und einen zweiten magnetischen Kieselerdepartikel mit einer Fähigkeit die Plasmid-DNA zu binden, wenn er mit dem Gemisch in Gegenwart der zweiten Lösung kombiniert wird, und einer Fähigkeit die Plasmid-DNA, die hieran gebunden ist, in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen; wobei der erste magnetische Kieselerdepartikel und der zweite magnetische Kieselerdepartikel in einem einzelnen Behälter zusammengemischt werden, wodurch eine Mischbettfestphase gebildet wird, wobei der erste magnetische Kieselerdepartikel und der zweite magnetische Kieselerdepartikel der Mischbettfestphase jeweils die Fähigkeit haben, Plasmid-DNA, die hieran gebunden ist, in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 10, wobei der Anionenaustauschrest, der kovalent an den ersten magnetischen Kieselerdepartikel gebunden ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Amin, einem Dimethylamin, einem Histamin, einem Diethanolamin, Histidin, Pyridylalanin und Pyridylcystein.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 10, wobei die mindestens eine Kontaminante ein Endotoxin ist und der zweite Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, das Endotoxin in Gegenwart einer ersten Lösung oder einer zweiten Lösung zu binden, die im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln ist.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 10, wobei die erste Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM und bis zu 3 M hat.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 10, wobei die zweite Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Konzentration eines chaotropen Mittels von mindestens 0,5 M hat.
Mischbettfestphase gemäß Anspruch 10, wobei die Elutionslösung eine Salzkonzentration von nicht mehr als 5 M und einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 hat.
Verfahren zum Isolieren einer Ziel-Nukleinsäure aus einem Gemisch umfassend die Ziel-Nukleinsäure und mindestens eine Kontaminante, umfassend: a) Bereitstellen einer Mischbettfestphase umfassend eine erste Festphase und eine zweite Festphase, wobei die erste Festphase die Fähigkeit hat, die Ziel-Nukleinsäure in einer ersten Lösung zu binden, und die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen, die zweite Festphase die Fähigkeit hat, die Ziel-Nukleinsäure in der zweiten Lösung zu binden, und die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen, und die erste Festphase und die zweite Festphase jeweils die Fähigkeit haben, die hieran gebundene Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen; b) Kombinieren des Gemischs mit der Mischbettfestphase in Gegenwart der ersten Lösung und Ermöglichen, daß die Ziel-Nukleinsäure an die erste Festphase bindet; c) Trennen der Mischbettfestphase von der ersten Lösung; d) Kombinieren der Mischbettfestphase mit der zweiten Lösung und Erlauben, daß die Ziel-Nukleinsäure von der ersten Festphase freigesetzt wird und an die zweite Festphase bindet; e) Trennen der Mischbettfestphase von der zweiten Lösung; und f) Kombinieren der Mischbettfestphase mit dem Elutionspuffer und Ermöglichen, daß die Ziel-Nukleinsäure aus der Mischbettfestphase in den Elutionspuffer freigesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Mischbettfestphase, die in Schritt (a) bereitgestellt wird, mit einem Äquilibrierungspuffer, der im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln ist, äquilibriert wird bevor die äquilibrierte Mischbettfestphase mit dem Gemisch in Schritt (b) zusammengegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei mindestens ein Entfernungsschritt, ausgewählt aus den Schritten (d) und (f), unter Verwendung einer Flüssigkeitsentfernungsvorrichtung durchgeführt wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Dekantieren, direkter Entfernung unter Vakuum, Zentrifugation, Filtrieren, Schwerkraftfluß durch eine Säule und Hochdruckfluß durch eine Säule besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die erste Festphase und die zweite Festphase beide magnetische Partikel sind und die Magnetkraft verwendet wird, um die Mischbettfestphase mindestens während des Entfernungsschritts, welcher aus den Schritten (d) und (f) ausgewählt ist, in einem Behälter zurückzuhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die erste Festphase ein Kieselerdemagnetpartikel ist und die zweite Festphase einen Kieselerdepartikel mit einer Anionenaustauschgruppe umfaßt, die hieran kovalent gebunden ist, wobei die Anionenaustauschgruppe fähig dazu ist, sich mit der Ziel-Nukleinsäure auszutauschen.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Anionenaustauschgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Amin, einem Dimethylamin, einem Histamin, einem Diethanolamin, einem Histidin, einem Pyridylalanin und einem Pyridylcastein.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die erste Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM und bis zu 3 M hat, und wobei die zweite Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 0,5 M bis zu 4,0 M hat.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die erste Festphase und die zweite Festphase der Mischbettfestphase, die in Schritt (a) bereitgestellt werden, Anionenaustauschfestphasen sind, wobei die erste Festphase und die zweite Festphase jeweils einen unterschiedlichen pKa haben, der sich voneinander durch mindestens 0,5 pKa-Einheiten unterscheidet.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Ziel-Nukleinsäure aus der Gruppe bestehend aus Plasmid-DNA, genomischer DNA, Gesamt-RNA und Nukleinsäuren, die durch enzymatische Amplifizierung erzeugt wurden, ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Gemisch, das mit der Mischbettfestphase in Schritt (b) zusammengegeben wird, ein Gemisch ist, das die Ziel-Nukleinsäure und Agarose umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Lösung der Ziel-Nukleinsäure von der Mischbettfestphase in Schritt (g) eluiert wird, nachdem jeder der Schritte (b), (d), (e) und (f) mindestens einmal durchgeführt wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei mindestens eine der Kontaminanten ein Endotoxin ist und wobei mindestens 90 % des Endotoxins, das in dem Gemisch enthalten ist, nicht in der Lösung enthalten ist, die in Schritt (g) von der Mischbettfestphase eluiert wurde.
Verfahren zum Isolieren von Plasmid-DNA aus einem Gemisch, umfassend die Plasmid-DNA und mindestens eine Kontaminante, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Bereitstellen einer Mischbettfestphase umfassend einen erste Kieselerdemagnetpartikel und einen zweiten Kieselerdemagnetpartikel, wobei: der erste Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, die Plasmid-DNA in Gegenwart einer ersten Lösung zu binden und die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen, der zweite Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, die Plasmid-DNA in Gegenwart der zweiten Lösung zu binden und die Plasmid-DNA in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen, und der erste Kieselerdemagnetpartikel und der zweite Kieselerdemagnetpartikel jeweils die Fähigkeit haben, die hieran gebundene Plasmid-DNA in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen; b) Kombinieren des Gemischs mit der Mischbettfestphase in Gegenwart der ersten Lösung und Erlauben, daß die Plasmid-DNA an die erste Festphase bindet; c) Trennen der Mischbettfestphase von der ersten Lösung; d) Kombinieren der Mischbettfestphase mit der zweiten Lösung und Erlauben, daß die Plasmid-DNA von der ersten Festphase freisetzt wird und an die zweite Festphase bindet; e) Trennen der Mischbettfestphase von der zweiten Lösung; und f) Kombinieren der Mischbettfestphase mit dem Elutionspuffer und Ermöglichen, daß die Plasmid-DNA von der Mischbettfestphase in den Elutionspuffer freigesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Mischbettfestphase, die in Schritt (a) bereitgestellt wird, mit einem Äquilibrierungspuffer, der im wesentlichen frei ist von chaotropen Mitteln ist, äquilibriert wird bevor die äquilibrierte Mischbettfestphase mit dem Gemisch in Schritt (b) kombiniert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Magnetkraft verwendet wird, um die Mischbettfestphase mindestens während eines Entfernungsschritts, ausgewählt aus den Schritten (d) und (f), in einem Behälter zurückzuhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei der erste Kieselerdemagnetpartikel mindestens eine Anionenaustauschgruppe umfaßt, die hieran kovalent gebunden ist, und der zweite Kieselerdemagnetpartikel eine Kieselerdeoxidbeschichtung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die erste Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM bis zu 3 M hat, und wobei die zweite Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 0,5 M und bis zu 4,0 M hat.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei der zweite Kieselerdemagnetpartikel mindestens eine Anionenaustauschgruppe umfaßt, die hieran kovalent gebunden ist, und der erste Kieselerdemagnetpartikel eine Kieselerdeoxidbeschichtung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei die zweite Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM bis zu 3 M hat, und wobei die erste Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 0,5 M und bis zu 4,0 M hat.
Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Mischbettfestphase mit dem Elutionspuffer in Schritt (f) nicht kombiniert wird, bis jeder der Schritte (b), (d), (e) und (f) mindestens zweimal durchgeführt wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei mindestens eine Kontaminante ein Endotoxin ist und wobei mindestens 90 % des Endotoxins nicht in der Lösung vorhanden ist, die in Schritt (g) aus der Mischbettfestphase eluiert wurde.
Verfahren zum Isolieren genomischer DNA aus einem Gemisch, umfassend die genomische DNA und mindestens eine Kontaminante, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt a) Bereitstellen einer Mischbettfestphase umfassend einen ersten Kieselerdemagnetpartikel und einen zweiten Kieselerdemagnetpartikel, wobei: der erste Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, die genomische DNA in Gegenwart einer ersten Lösung zu binden und die Ziel-Nukleinsäure in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen, der zweite Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, die genomische DNA in Gegenwart der zweiten Lösung zu binden und die genomische DNA in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen, und der erste Kieselerdemagnetpartikel und der zweite Kieselerdemagnetpartikel jeweils eine Fähigkeit haben, die hieran gebundene genomische DNA in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen; b) Kombinieren des Gemischs mit der Mischbettfestphase in Gegenwart der ersten Lösung und Erlauben, daß die genomische DNA an die erste Festphase bindet; c) Trennen der Mischbettfestphase von der ersten Lösung; d) Kombinieren der Mischbettfestphase mit der zweiten Lösung und Erlauben, daß die genomische DNA von der ersten Festphase freigesetzt wird und an die zweite Festphase bindet; e) Trennen der Mischbettfestphase von der zweiten Lösung; und f) Kombinieren der Mischbettfestphase mit einem Elutionspuffer und Erlauben, daß die genomische DNA von der Mischbettfestphase in den Elutionspuffer freigesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei die Mischbettfestphase, die in Schritt (a) bereitgestellt wird, mit einem Äquilibrierungspuffer, der im wesentlichen frei von chaotropen Mitteln ist, äquilibriert ist bevor die äquilibrierte Mischbettfestphase in Schritt (b) mit dem Gemisch kombiniert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei die Magnetkraft verwendet wird, um die Mischbettfestphase während mindestens eines Entfernungsschritts, welcher aus den Schritten (d) und (f) ausgewählt ist, in einem Behälter zurückzuhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei der erste Kieselerdemagnetpartikel mindestens eine Anionenaustauschgruppe umfaßt, die kovalent daran gebunden ist, und der zweite Kieselerdemagnetpartikel eine Kieselerdeoxidbeschichtung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei die erste Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM und bis zu 3 M hat, und wobei die zweite Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 0,5 M und bis zu 4,0 M hat.
Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei der zweite Kieselerdemagnetpartikel mindestens eine Anionenaustauschgruppe umfaßt, die kovalent daran gebunden ist, und der erste Kieselerdemagnetpartikel eine Kieselerdeoxidbeschichtung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei die zweite Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM und bis zu 3 M hat, und wobei die erste Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 0,5 M und bis zu 4,0 M hat.
Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei die Mischbettfestphase nicht mit dem Elutionspuffer in Schritt (f) kombiniert wird, bis jeder der Schritte (b), (d), (e) und (f) mindestens zweimal durchgeführt wurde.
Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren, die durch enzymatische Amplifizierung aus einem Gemisch erzeugt wurden, das die Nukleinsäuren und mindestens eine Kontaminante umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Bereitstellen einer Mischbettfestphase umfassend einen ersten Kieselerdemagnetpartikel und einen zweiten Kieselerdemagnetpartikel, wobei: der erste Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, die Nukleinsäuren in Gegenwart einer ersten Lösung zu binden und die Ziel-Nukleinsäuren in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen, der zweite Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, die Nukleinsäuren in Gegenwart der zweiten Lösung zu binden und die Nukleinsäuren in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen, und der erste Kieselerdemagnetpartikel und der zweite Kieselerdemagnetpartikel jeweils eine Fähigkeit haben, die Nukleinsäuren, die daran gebunden sind, in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen; b) Kombinieren des Gemischs mit der Mischbettfestphase in Gegenwart der ersten Lösung und Erlauben, daß die Nukleinsäuren an die erste Festphase binden; c) Trennen der Mischbettfestphase von der ersten Lösung; d) Kombinieren der Mischbettfestphase mit der zweiten Lösung und Erlauben, daß die Nukleinsäuren von der ersten Festphase freigesetzt werden und an die zweite Festphase binden; e) Trennen der Mischbettfestphase von der zweiten Lösung; und f) Kombinieren der Mischbettfestphase mit einem Elutionspuffer und Ermöglichen, daß die Nukleinsäuren von der Mischbettfestphase in den Elutionspuffer freigesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei Magnetkraft verwendet wird, um die Mischbettfestphase mindestens während eines Entfernungsschritts, ausgewählt aus den Schritten (d) und (f), in einem Behälter zurückzuhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei der erste Kieselerdemagnetpartikel mindestens eine Anionenaustauschgruppe umfaßt, die hieran kovalent gebunden ist, und der zweite Kieselerdemagnetpartikel eine Kieselerdeoxidbeschichtung umfaßt.
Verfahren zum Isolieren einer Ziel-RNA aus einem Gemisch, umfassend die Ziel-RNA und DNA, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: a) Bereitstellen einer Mischbettfestphase umfassend einen ersten Kieselerdemagnetpartikel und einen zweiten Kieselerdemagnetpartikel, wobei: der erste Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, die Ziel-RNA in Gegenwart einer ersten Lösung zu binden und die Ziel-RNA in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen, der zweite Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat, die Ziel-RNA in Gegenwart der zweiten Lösung zu binden und die Ziel-RNA in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen, und der erste Kieselerdemagnetpartikel und der zweite Kieselerdemagnetpartikel jeweils eine Fähigkeit haben, die Ziel-RNA, die daran gebunden ist, in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen; b) Kombinieren des Gemischs mit der Mischbettfestphase in Gegenwart der ersten Lösung und Erlauben, daß die Ziel-RNA an die erste Festphase bindet; c) Trennen der Mischbettfestphase von der ersten Lösung; d) Kombinieren der Mischbettfestphase mit der zweiten Lösung und Erlauben, daß die Ziel-RNA von der ersten Festphase freigesetzt wird und an die zweite Festphase bindet; e) Trennen der Mischbettfestphase von der zweiten Lösung; und f) Kombinieren der Mischbettfestphase mit einem Elutionspuffer und Erlauben, daß die Ziel-RNA von der Mischbettfestphase in den Elutionspuffer freigesetzt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 48, wobei die Magnetkraft verwendet wird, um die Mischbettfestphase mindestens während eines Entfernungsschritts, ausgewählt aus den Schritten (d) und (f), in einem Behälter zurückzuhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 48, wobei der erste Kieselerdemagnetpartikel mindestens eine Anionenaustauschgruppe umfaßt, die hieran kovalent gebunden ist, und der zweite Kieselerdemagnetpartikel eine Kieselerdeoxidbeschichtung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 48, wobei die erste Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM bis zu 3 M hat, und wobei die zweite Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 0,5 M und bis zu 4,0 M hat.
Verfahren gemäß Anspruch 48, wobei der zweite Kieselerdemagnetpartikel mindestens eine Anionenaustauschgruppe umfaßt, die hieran kovalent gebunden ist, und der erste Kieselerdemagnetpartikel eine Kieselerdeoxidbeschichtung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 48, wobei die zweite Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 100 mM bis zu 3 M hat, und wobei die erste Lösung einen pH-Wert von mindestens 4 und bis zu 9 und eine Salzkonzentration von mindestens 0,5 M und bis zu 4,0 M hat.
Kieselerdemagnetpartikel zum Isolieren einer Ziel-Nukleinsäure aus einem Gemisch, umfassend die Ziel-Nukleinsäure und mindestens eine Kontaminante, umfassend: eine Vielzahl erster Kieselerdemagnetpartikel, die jeweils einen ersten Kieselerdemagnetpartikel umfassen, der kovalent an einen Diethylamino-(DEA)-Anionenaustauschrest gebunden ist.
Kieselerdemagnetpartikel gemäß Anspruch 54, wobei der Diethylamino-(DEA)-Anionenaustauschrest kovalent durch einen Propyldimethoxysilan-Liganden an den ersten Kieselerdemagnetpartikel gebunden ist.
Kieselerdemagnetpartikel gemäß Anspruch 54, die weiter eine Vielzahl an zweiten Kieselerdemagnetpartikeln umfassen, wobei die Vielzahl an ersten Kieselerdemagnetpartikeln und die Vielzahl an zweiten Kieselerdemagnetpartikeln miteinander in Form einer Mischbettfestphase gemischt sind; wobei die Vielzahl erster Kieselerdemagnetpartikel die Fähigkeit hat die Ziel-Nukleinsäure zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart einer ersten Lösung zusammengegeben wird, und eine Fähigkeit die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart einer zweiten Lösung freizusetzen; wobei die Vielzahl an zweiten Kieselerdemagnetpartikeln die Fähigkeit hat die Ziel-Nukleinsäure zu binden, wenn sie mit dem Gemisch in Gegenwart der zweiten Lösung zusammengegeben wird, und eine Fähigkeit hat die Ziel-Nukleinsäure, die hieran gebunden ist, in Gegenwart der ersten Lösung freizusetzen; und wobei die Vielzahl erster Kieselerdemagnetpartikel und die Vielzahl zweiter Kieselerdemagnetpartikel jeweils die Fähigkeit haben die Ziel-Nukleinsäure, die daran gebunden ist, in Gegenwart eines Elutionspuffers freizusetzen.