JP3379758B2 - イソプロパノール含有水溶液を用いる核酸のトランスフェクション効率の増強 - Google Patents

イソプロパノール含有水溶液を用いる核酸のトランスフェクション効率の増強

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、原核及び真核細胞中の核酸のトランスフェ
クション効率を増強するためのイソプロパノール含有水
溶液の使用に関する。
本出願人のDE 36 39 949 A1は、核酸、特に長鎖核酸
の単離及び精製の方法に関する。この方法は、アニオン
交換マトリックス上に低イオン強度で最初に吸着した核
酸を洗浄するために比較的低いイオン強度の水溶液（緩
衝液）の使用を含む。次いで、核酸は高いイオン強度の
緩衝液を用いてマトリックスから脱着される。なかんず
く、エタノールが核酸、特にDNAの沈殿に使用される。
低級アルコール含有溶液が出願人のP 43 21 904で提案
されている。この低級脂肪族アルコール含有溶液はアニ
オン交換基で修飾されていない無機材料上に核酸を吸着
するために高濃度のカオトロピックイオンとともに使用
される。
次いで、このように単離された核酸は化学的または物
理的方法により原核または真核細胞中に頻繁に導入され
る。トランスフェクションと呼ばれるこの方法は、ある
遺伝子またはそれらの発現産物の宿主細胞ゲノムへの調
節効果の検討のために使用される。そのよう方法は、単
一の実験を行い評価するのに通常10〜14日間必要である
ことから、多くの労力と時間の両方を消耗する。そのた
め、例えば、細胞培養の可能な限り多くの細胞に、検討
すべきプラスミドDNAを導入することを検討すること
に、より多くの興味がある。提供された外来DNAの取り
込み頻度、トランスフェクション効率と呼ばれる、は種
々のファクターに依存する。通常、トランスフェクショ
ン効率は、細胞培養の質とトランスフェクション法に加
えて、使用されるプラスミドDNAの質または純度に依存
する。
Ehlert et al.,Biotechniques 14,1993,546には、DE
36 39 949に記載の方法によりQIAGEN アニオン交換材
料を使用して調製したプラスミドDNAは、塩化セシウム
濃度勾配遠心により精製したDNAの70％以上改良された
トランスフェクション効率を与えることが示され得る。
驚くべきことに、Biotechniques 14,1993,546で知ら
れたトランスフェクション比率は、核酸の単離のために
使用されるイソプロパノール含有水溶液の使用により20
％にまで増強できた。
従って、本発明は、アニオン交換体上の核酸の分離及
び単離のためにイソプロパノール含有水溶液を使用する
ことにより、DE 36 39 949 A1において知られたものよ
り改良されたトランスフェクション比率を有する核酸の
単離方法に関する。
好ましい態様において、イソプロパノールは水溶液中
に１〜50容積％、特に５〜25容積％、特に好ましくは10
〜15容積％の量で存在させる。この水溶液は、アニオン
交換クロマトグラフィーに一般に使用される１価または
２価カチオンの塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム等、またはそれらの組合せ、を含むこともできる。
好ましくは、この水溶液は、TRIS/HCl、MOPS等の分子生
物学で常用されている緩衝剤で緩衝され、かつ６〜９の
pH値を有する。
本発明によるイソプロパノールの使用は、特に、プラ
スミドDNAのようなDNAの単離に適用することができる
が、しかしそのようなタイプのDNAに限定されない。
本発明に従ってイソプロパノールを使用して得た核酸
は、特に、遺伝子療法への使用に適している。
本発明によれば、５〜60容量％のイソプロパノールを
含有することができる溶液をも特許請求している。特に
これらは、DE 36 39 949 A1に従って使用できる洗浄緩
衝液である。これらの緩衝液は0.5〜1.5Mの塩化ナトリ
ウムまたは塩化カリウム及び20〜80mMのMOPS又はTRIS/H
Clを含み、６〜８のpH値である。本発明によれば、５〜
60容量％のイソプロパノールを含有し、さらに1.0〜2.0
Mの塩化ナトリウムまたは塩化カリウム及び20〜80mMのT
RIS/HClを含み、８〜９のpH値である水溶液をも特許請
求している。
DE 39 13 814 A1は、ゲルの電気溶離のために使用で
きる緩衝液中の水性系を一般的用語で記載している。そ
こに記載された緩衝液系は、、例えば、塩化ナトリウ
ム、MOPSのような緩衝塩、及び低級アルコール、特にCi
〜CCアルコール類、を含む。しかし、1.5Mまたはそれ以
上の塩化ナトリウムを明示的に要求していることから、
これらの緩衝剤の塩濃度はより高い。
イソプロパノールを含有する水性系は、好ましくはド
イツ特許出願P 44 31 125.7で提案されているように、
エンドトキシンの減少または除去の方法に使用できる。
この特許出願は、エンドトキシンを治療用に指定された
活性成分を含有する標品から減少または除去する方法を
提案する。これらの標品は遺伝子工学および／またはバ
イオテクノロジーにより天然原料から好ましくは得られ
る。エンドトキシンの減少または除去は、サンプルがク
ロマトグラフィー材料で処理される〔天然原料が溶解さ
れ、得られたフラクションが所望により遠心分離され、
濾過またはアフィニティークロマトグラフィー材料で処
理される〕ことにより行われる。得られるフラクション
は水性塩溶液と洗剤で予備インキュベートし、アニオン
交換材料で処理し、かつ次いで他の塩溶液で洗浄する。
活性成分は、アニオン交換体から溶出され、次いでそれ
自身知られた方法によりさらに精製される。例えば、遺
伝子治療法に使用することができ、P 44 31 125.7に従
ってエンドトキシンの除去または減少に供された、核酸
が単離されると、標品溶液にエタノールが使用された標
品に比べて、50％までのトランスフェクション効率の増
強が観察される。
以下の実施例によりさらに詳細に本発明を説明する。
実施例１ 以下において、核酸として大腸菌からのプラスミドDN
AをDE 36 39 949 A1に記載の方法と同様にして分離及び
単離した。この方法は、DE 36 39 949 A1に記載のアニ
オン交換材料（QUIAGEN 、Diagen GmbH,Germany）への
核酸の吸着を含む。洗浄は、1.0M NaCl、50mM MOPS、15
％イソプロパノール、pH7.0の組成の緩衝液で行った。
次いで、プラスミドDNAは1.25M NaCl、50mM TRIS/HCl、
15容量％イソプロパノール、pH8.5の組成のイソプロパ
ノール含有緩衝液で溶出した。
大腸菌からのプラスミドDNAの収率は、エタノールを
使用する知られた標品と比較して約10％増強され得るこ
とが分かる。
次いで、トランスフェクション実験を得られたDNAを
用いて行った。トランスフェクション効率は、NIH 3T3
細胞を用いてlacZ活性を測定することにより決定した。
これらの細胞は、リン酸カルシウム法（Graham,F.L.,an
d A.J.van der Eb（1973）“A New Technique for the
Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA",Vi
rology 52:456−467）により、１μｇのリポーターコン
ストラクションpRSVlacZ（Lucibello,F.C.,and R.Mll
er（1989）“Sensitive Microscale Assay for the Ana
lysis of Promotor Activity in Eukaryotic Cells",Me
thod Mol.Biol.1:18）を用いてトランスフェクトした。
表は幾つかのアルコール、即ち、エタノール（超純粋
及び変性した）、イソプロパノール及びｎ−ブタノール
を用いたトランスフェクション効率を示す。
表中に示す値から、イソプロパノール含有緩衝液で得
られたDNAの高いトランスフェクション効率が明らかに
分かる。
実施例２ 実施例１に従って、プラスミドDNAを単離した。しか
るに、アニオン交換カラムに供給する前に、ドイツ特許
出願P 44 32 654.8に記載のように溶解物（lysate）を
珪藻土の緩い充填物を通過させた。次いで、エンドトキ
シン除去をP 44 31 125.7に従って行った。750mMの塩化
ナトリウム、10％トライトン（Triton）Ｘ−100/50mM M
OPS,pH7.0を含む水溶液を使用した。このように調製し
たDNAをカチオニック・リポソーム（DOTAP,Boehringer
Mannheim）法によりLMH肝細胞にトランスフェクション
した。先行技術DE 36 39 664.9 A1に従ったDNA標品に比
べて50％のトランスフェクション効率の増強が観測され
た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 Ｐ４４３１１２５．７ (32)優先日 平成６年９月１日(1994．9．1) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 Ｐ４４３２６５４．８ (32)優先日 平成６年９月14日(1994．9．14) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (56)参考文献 特開 平５−268963（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−125088（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】単離核酸のトランスフェクション効率を増
    強するための核酸のアニオン交換クロマトグラフィー単
    離用移動相としてのイソプロパノール含有水溶液の使用
    方法。
  2. 【請求項２】上記トランスフェクション効率は、原核及
    び真核細胞中のトランスフェクション効率である請求項
    １に記載の使用方法。
  3. 【請求項３】上記イソプロパノールは、水溶液中に１〜
    50容積％の量で存在させる請求項１に記載の使用方法。
  4. 【請求項４】上記イソプロパノールは、水溶液中に５〜
    25容積％の量で存在させる請求項１に記載の使用方法。
  5. 【請求項５】上記イソプロパノールは、水溶液中に10〜
    15容積％の量で存在させる請求項１に記載の使用方法。
  6. 【請求項６】上記水溶液は、塩化ナトリウム、塩化カル
    シウム、塩化カリウムのようなアニオン交換クロマトグ
    ラフィーに一般に使用される１価または２価カチオンの
    塩を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用
    方法。
  7. 【請求項７】上記水溶液は、緩衝液である請求項１〜６
    のいずれか１項に記載の使用方法。
  8. 【請求項８】上記核酸が、プラスミドDNAである請求項
    １〜７のいずれか１項に記載の使用方法。
  9. 【請求項９】遺伝子治療用核酸の標品への請求項１〜８
    のいずれか１項に記載の使用方法。
  10. 【請求項１０】0.5〜1.5Mの塩化ナトリウムまたは塩化
    カリウム、10〜100mMのMOPSまたはTRIS/HClを含み、か
    つ５〜60容積％のイソプロパノールを含有するpH値６〜
    ８の核酸のアニオン交換クロマトグラフィー単離用水溶
    液。
  11. 【請求項１１】1.0〜2.0Mの塩化ナトリウムまたは塩化
    カリウム、10〜100mMのTRIS/HClを含み、かつ５〜60容
    積％のイソプロパノールを含有するpH8〜９の核酸のア
    ニオン交換クロマトグラフィー単離用水溶液。
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