DE69839133T2 - Isolierung von Nukleinsäuren - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus biologischem Material, insbesondere Blut.
  • Es besteht eine sehr große Nachfrage nach DNA-Analysen für eine Reihe von Zwecken, und das hat zu einem Bedarf an schnellen, sicheren Verfahren mit hohem Durchsatz zur Isolierung und Reinigung von DNA und anderen Nukleinsäuren geführt.
  • Proben zur Verwendung für die DNA-Identifikation oder -Analyse können aus einem breiten Spektrum von Quellen, wie biologischem Material wie Tier- und Pflanzenzellen, Kot, Gewebe usw., genommen werden, und es können auch Proben von Böden, Nahrungsmitteln, Wasser usw. genommen werden.
  • Bestehende Verfahren zur Extraktion von DNA schließen die Verwendung von Phenol/Chloroform, Aussalzen, die Verwendung von chaotropen Salzen und Silicaharzen, die Verwendung von Affinitätsharzen, Ionenaustauschchromatographie und die Verwendung von magnetischen Kügelchen ein. Verfahren sind in den US-Patentschriften 5057426 , 4923978 , den EP-Patentschriften 0512767 A1 und EP 0515484B sowie WO 95/13368 , WO 97/10331 und WO 96/18731 beschrieben. Diese Patente und Patentanmeldungen offenbaren Verfahren zum Adsorbieren von Nuldeinsäuren an ein festes Trägermaterial und anschließendem Isolieren der Nukleinsäuren. Die früher verwendeten Verfahren verwenden irgendeine Art von Lösungsmittel zum Isolieren der Nukleinsäuren, und diese Lösungsmittel sind entzündbar, brennbar oder toxisch.
  • EP 0 707077 A beschreibt das Einfangen und selektive Freisetzen von Nukleinsäure aus einem Lysat durch Verwendung eines wasserlöslichen, schwach basischen Polymers unter Bildung eines Präzipitats mit dem Polymer. Dann wird das Präzipitat abgetrennt und die Nukleinsäure aus dem Polymer unter Verwendung extrem salzhaltiger Bedingungen, einer starken Base oder Erwärmung freigesetzt.
  • Blut ist eine der am reichlichsten vorhandenen Quellen von Proben für die DNA-Analyse, da Blutproben routinemäßig aus einem breiten Spektrum von Gründen entnommen werden. Allerdings hat sich aufgrund der viskosen und proteinösen Beschaffenheit von Blut bei Verwendung bekannter DNA-Extraktionsverfahren eine Automatisierungsanwendung aufgrund von Schwierigkeiten bei der Handhabung großer Volumina, die relativ geringe Mengen an DNA enthalten, als schwierig erwiesen. Bisher erfolgte die Nukleinsäureextraktion nur zum Teil automatisch unter Verwendung gefährlicher Reagenzien und langsamer Verarbeitungszeiten.
  • Ich habe nunmehr ein verbessertes Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen aus Blut und anderen biologischen Materialien ausgearbeitet.
  • Demnach stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäure aus einem Zelllysat, wie in den Ansprüchen dargelegt, bereit.
  • Das Verfahren ist besonders nützlich, wenn das biologische Material Blut ist, doch kann das Verfahren für einen Bereich von Anwendungssubstanzen, wie Plasmid- und Vektorisolierung und Pflanzen-DNA-Extraktion verwendet werden.
  • Vorzugsweise werden die Zellen im Blut unter Freisetzung von Nukleinsäuren lysiert und es können bekannte Lysiermittel und Verfahren verwendet werden, wie das Inkontaktbringen mit ionischen und nicht-ionischen Detergenzien, hypotonen Salzlösungen, Proteasen, chaotropischen Mitteln, Lösungsmitteln, unter Anwendung von Veränderungen des pH-Werts oder Wärme. Ein Verfahren zum Lysieren von Zellen zur Isolierung von Nukleinsäure ist in WO 96/00228 beschrieben.
  • Besteht das biologische Material aus Blut, so können die Proben wahlweise mit Wasser oder einem anderen Verdünnungsmittel verdünnt werden, um die Handhabung und Verarbeitung zu erleichtern.
  • Bis zu zehnfache Verdünnungen können verwendet werden, und im Allgemeinen kann eine stärkere Verdünnung besser sein, und es ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass sie eine geringe Verdünnung des Blutes erlaubt.
  • Die Festphase, mit der das Blut in Kontakt gebracht wird, kann aus einem Material gebildet sein, das eine natürliche Affinität für Nukleinsäuren aufweist, oder es kann aus einem Material gebildet sein, dessen Oberfläche mit einem Mittel behandelt ist, das bewirkt, dass die Nukleinsäuren an dieses binden, oder das deren Affinität für Nukleinsäuren erhöht. Geeignete Materialien schließen poröses Glas (Controlled Pore Glass), ein Polysaccharid (Agarose oder Cellulose), andere Arten von Silica/Glas, keramische Materialien, poröse Kunststoffmaterialien, wie porige Kunststoffzapfen, die ein einzelnes Formteil oder einen Einsatz für ein Standardrohr darstellen, Polystyrolkügelchen, paramagnetische Kügelchen etc., ein. Größe und Porosität sind nicht kritisch und können variieren und für bestimmte Anwendungen ausgewählt werden.
  • Geeignete Mittel zum Behandeln der Oberfläche der Festphase oder zu deren Derivatisierung schließen deren Behandlung mit einer Substanz, die eine Ladung, z. B. eine positive Ladung, auf die Oberfläche oder eine hydrophile oder hydrophobe Oberfläche auf die Festphase aufbringen kann, z. B. Hydroxygruppen, Nitratgruppen, autoreaktive Gruppen, Farbstoffe und andere aromatische Verbindungen, ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bewirkt die Festphase, dass die DNA bei einem bestimmten pH-Wert eher an sie bindet als an Kontaminanten in der Blutprobe und ermöglicht die Freisetzung der gebundenen Nukleinsäure, wenn sie mit einem Eluanten mit einem anderen pH-Wert in Kontakt gebracht wird. Dieses System kann mit einer Festphase verwendet werden, die Histidin oder ein Polyhistidin enthält, welches die Nukleinsäuren tendenziell bei einem niedrigen pH-Wert, z. B. weniger als 6, bindet und die gebundenen Nukleinsäuren dann freisetzt, wenn der pH-Wert erhöht wird, z. B. auf mehr als 8. Alternativ dazu werden Nukleinsäuren bei einem im Wesentlichen neutralen pH-Wert an eine aminierte Oberfläche gebunden und bei einem sehr hohen pH-Wert freigesetzt.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann in ein Kunststoffformteil ein Bindemittel, z. B. in einer Mulde in einer Platte etc., eingebracht werden, sodass das Bindemittel in die Oberfläche eingebracht wird, wobei die Blutprobe dann mit der Oberfläche in Kontakt gebracht wird, was bewirkt, dass die Nukleinsäuren an die Oberfläche binden. Dann wird die Blutprobe entfernt und die Oberfläche mit einem Eluiermittel behandelt, um die gebundenen Nukleinsäuren freizusetzen. Ist die Oberfläche Teil einer Mulde in einer Multiwell-Platte, lässt sich das ganze System leicht für schnelle Sampling- und Extraktionstechniken in großem Umfang.
  • Bindemittel, die verwendet werden können, schließen ladungsumschaltbare Ionenaustauscherharze unter Verwendung einer positiv geladenen Festphase, die durch Verändern des pH-Werts über ihren pKa-Wert umgepolt oder neutralisiert werden kann, wie z. B. Nukleotide, Polyamine, Imidazolgruppen und andere ähnliche Reagenzien mit einem geeigneten pKa-Wert, ein.
  • Auch können Nukleinsäuren durch Interkalation unter Verwendung einer Vielfalt an Interkalationsverbindungen in die Festphase eingebracht werden, z. B. Actinomycin D, Ethidiumbromid etc.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine Kunststoffoberfläche derart modifiziert werden, dass sie funktionelle Gruppen einschließt. Der Kunststoff kann ein beliebiger Kunststoff sein, der zur Aufnahme von Proben verwendet wird, z. B. Polypropylen. Die funktionellen Gruppen können positiv oder negativ geladen sein, um die Nukleinsäuren in der richtigen Pufferlösung zu binden.
  • Alternativ dazu können die funktionellen Gruppen chemische Gruppen sein, die zur kovalenten Kopplung an andere Liganden oder Polymere fähig sind.
  • Wird der Kunststoff in einem Kunststoffformteil, z. B. in einer Mulde in einer Platte, oder als Polymerasekettenreaktions-(PCR)-Röhrchen, verwendet, lassen sich die Oberflächeneigenschaften des Kunststoffs für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise modifizieren, indem die entsprechenden Chemikalien in die Pressmasse, z. B. eine Spritzgussmasse, eingeschlossen oder dieser zugesetzt werden.
  • Bei Verwendung in einem PCR-Röhrchen oder in einer Multititerplatte mit tiefen Mulden können die Röhrchen oder Mulden dazu verwendet werden, geringe Mengen an DNA oder RNA zu isolieren und zu immobilisieren, unter Bildung einer reinen Matrize für die nachfolgende PCR oder andere genetische Analyse- und Manipulationsverfahren.
  • Handelt es sich bei dem Kunststoff um Polypropylen, z. B. in Form eines dünnwandigen PCR-Röhrchens, kann die Polypropylenoberfläche durch Oxidieren der Oberfläche mit einem Oxidationsmittel, wie Kaliumpermanganat und Schwefelsäure, unter Bildung einer carboxylierten Oberfläche (COOH-Gruppen) modifiziert werden. Dieses Röhrchen kann dann verwendet werden, um die Isolierung von DNA aus Lösungen oder Rohproben, z. B. Blut, zu verbessern. Durch Einstellen des pH-Werts, der Dielektrizitätskonstante, der Löslichkeit oder Innenstärke kann die DNA oder RNA an den Wänden des Röhrchens immobilisiert und durch Waschen von Kontaminanten gereinigt werden und ist dann für die PCR oder andere analytische Techniken bereit.
  • Die Carboxylgruppen können weiter durch kovalente Kopplung einer anionischen Gruppe, wie Imidazol oder Polyhistidin, oder eines beliebigen starken oder schwachen Ionenaustauschers modifiziert werden, um die Bindung von Nukleinsäuren durch eine Ladungswechselwirkung zu ermöglichen. Dieses Röhrchen könnte dann verwendet werden, um die Isolierung von DNA aus Lösungen oder aus Rohproben, z. B. von Blut, zu verbessern. Wieder kann durch Einstellen des pH-Werts, der Dielektrizitätskonstante, der Löslichkeit oder Innenstärke die DNA oder RNA an den Wänden des Röhrchens immobilisiert und durch Waschen von Kontaminanten gereinigt werden und ist dann für die PCR oder andere analytische Techniken bereit.
  • Die Nukleinsäuren können in einem Niedrigsalzpuffer eluiert werden und sind dann für die PCR oder andere Analysen bereit.
  • Die Festphase kann mit einer Blutprobe durch Mischen mit der Festphase in einer Misch-/Rührvorrichtung oder durch Leiten der Blutprobe über die Festphase in Kontakt gebracht werden, oder die Festphase kann paramagnetisch sein und durch ein magnetisches Feld manipuliert worden sein. Wenngleich die Erfindung zur Auftrennung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus Blut besonders geeignet ist, kann sie auch mit einem Spektrum von Biomolekülen verwendet werden, insbesondere jenen, welche die Entfernung von Zellwandtrümmern oder unlöslichen Teilchen erfordern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Festphase in Form eines Granulats in einer Säule vor und die Blutprobe wird durch die Säule unter Anwendung eines Differenzialdrucks durch die Säule nach oben gezogen, die Blutprobe wird mit der Luft nach oben gezogen und das feste Granulatmaterial kann gewirbelt werden, wodurch die Misch- und Kontaktgeschwindigkeit erhöht und die Klumpenbildung minimiert wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Verwendung in einem Mehrfach-Mulden-Format geeignet, wobei eine Serie von Extraktionen aus unterschiedlichen Proben im Wesentlichen gleichzeitig stattfinden kann, was die Automatisierung des Extraktionsvorgangs erleichtern wird, indem es das Stattfinden einer schnellen Extraktion mit Hochdurchsatz ermöglicht und die Durchführung der kombinatorischen Chemie erlaubt. Dadurch wird es möglich, mit einem hohen Durchsatz in einer üblichen Anordnung einer Mikrotiterplatte, z. B. einer Anordnung von acht mal zwölf, eine große Anzahl von Probenarten automatisch zur gleichen Zeit zu behandeln.
  • Die Erfindung ist beispielhaft beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Extraktion von Nukleinsäuren aus Vollblut
  • Ein Ionenaustauscher mit veränderbarer Ladung wurde durch kovalente Kopplung von Polyhistidin an 100μm-Glaskügelchen unter Verwendung von Glutaldehyd durch Mischen von 1 Gramm der aminierten Glaskügelchen mit 0,01 Vol.-% Glutaldehyd in 0,1 M Natriumbicarbonat mit/bei einem pH-Wert von 8, enthaltend 20 mg Polyhistidin, hergestellt. Nach Inkubation über Nacht wurden die Perlen reichlich gewaschen, um das nicht kovalent gekoppelte Material zu entfernen, und in 10 mM MES, pH 5, enthaltend 0,1 Vol.-% Tween 20, aufbewahrt.
  • Etwa 300 mg der derivatisierten 100 μm-Glaskügelchen wurden in eine 1 ml Kunststoffsäule, die an beiden Enden umschlossen war, gegeben.
  • Eine Blutprobe wurde mit einem gleichen Volumen von 10 mM MES mit pH 5, enthaltend 1% Tween 20, Proteasen (200 μg/ml) und 1 mM EDTA, inkubiert. Nach beendetem Aufschluss wurde das Blut in der Säule, welche die Glaskügelchen enthielt, nach oben gesaugt und die DNA wurde immobilisiert, wodurch die kontaminierenden Proteine passieren konnten, um dann entsorgt zu werden.
  • Die Glaskügelchen, welche die immobilisierte DNA enthielten, wurden mit einem Puffer, umfassend 10 mM MES pH 5, enthaltend 1% Tween 20, und 1 mM EDTA gewaschen, und dies wurde so lange wiederholt, bis die Waschlösung farblos war.
  • Nach dem Waschen wurden die Kügelchen mit Luft getrocknet und die DNA wurde mit einer geringen Menge an 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, eluiert und in einem sterilen Röhrchen aufgefangen, bereit für die Analyse. Auf diese Weise wurden die DNA vom Blut getrennt.
  • Für unterschiedliche Biomoleküle lässt sich der Puffer etc. auf geeignete Weise modifizieren.
  • Beispiel 2
  • Ein Gramm carboxylierte paramagnetische Kügelchen wurden in 50 mM Imidazolpuffer mit einem pH-Wert von 6 gewaschen und dann mit 100 mg Polyhistidin in 50 ml eines 50 mM Imidazolpuffers mit einem pH-Wert von 6 gemischt. Ein chemisches Kopplungsmittel (EDC) wurde mit einer Endkonzentration von 5 mg pro ml zugesetzt und über Nacht gemischt. Die Kügelchen wurden in Wasser, 0,5 M Natriumchlorid, 1% Tween 20, 100 mM Tris-HCl mit pH 8 gewaschen und in 10 mM MES, 0,1% Tween 20 pH5 aufbewahrt.
  • Um DNA aus dem Blut zu extrahieren, wurden 1 mg Kügelchen mit Blut, das in 10% Tween 20 mit 25 mM MES, 1 mM EDTA mit pH 5 verdünnt worden war, vermischt. Die Kügelchen wurden mit einem Magneten separiert und durch erneutes Suspendieren in 1 mM MES, 0,1% Tween 20 gewaschen. Zum Eluieren der DNA wurden die Kügelchen in 10 mM Tris-HCl mit pH 8,5 resuspendiert und mit Hilfe eines Magneten getrennt, worauf die DNA in Lösung zurückblieb.

Claims (23)

  1. Ein Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäure aus einem Zelllysat, wobei das Verfahren folgendes umfasst:_ Herstellen eines Kontakts zwischen dem Zelllysat und einer Festphase bei einem ersten pH, bei dem die Festphase eine positive Ladung aufweist, so dass die Nukleinsäure eher an die Festphase als an Kontaminanten im Zelllysat bindet; Ablösen der Nukleinsäure bei einem zweiten, höheren pH über dem pKs der Festphase, um die positive Ladung zu invertieren oder zu neutralisieren und so die gebundene Nukleinsäure von der Festphase abzulösen; wobei es sich bei der Festphase um Controlled Pore Glass, ein Polysaccharid, ein keramisches Material, ein poröses Kunststoffmaterial, ein Kunststoffmaterial, Polystyrolkügelchen, paramagnetische Kügelchen oder einen porigen Kunststoffzapfen, der ein einzelnes Formteil oder einen Einsatz für einen Behälter darstellt, handelt; und wobei die Nukleinsäure unter Verwendung eines Niedrigsalzpuffers gelöst wird.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Zelllysat um Pflanzenzelllysat oder Tierzelllysat handelt.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Nukleinsäure um ein Plasmid handelt.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Nukleinsäure um DNA handelt.
  5. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei der Nukleinsäure um RNA handelt.
  6. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Zelllysat um ein Blutzelllysat handelt.
  7. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Kunststoffmaterial in Form einer Pipettenspitze, einer Mikrotiterplatte oder einer Mikrotiterplatte mit tiefen Kavitäten oder eines PCR_-Röhrchens vorliegt.
  8. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 6, wobei die eluierte Nukleinsäure für die Analyse oder Amplifikation unter Verwendung von PCR bereit steht, ohne dass weitere Reinigung erforderlich wäre.
  9. Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure bei einem pH von weniger als 6 an die Festphase bindet und bei einem pH von mehr als 8 von der Festphase abgelöst wird.
  10. Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäure bei einem im Wesentlichen neutralen pH an die Festphase bindet und bei einem pH von mehr als 10 von der Festphase abgelöst wird.
  11. Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Festphase aus einem Material gebildet wird, das eine natürliche Affinität für Nukleinsäuren aufweist.
  12. Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Festphase aus einem Material gebildet wird, dessen Oberfläche mit einem Wirkstoff behandelt ist, der eine positive Ladung einführt, um zu bewirken, dass die Nukleinsäuren an dieses binden oder um die Affinität desselben für Nukleinsäuren zu erhöhen.
  13. Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Festphase um ein Ionenaustauscherharz mit veränderbarer Ladung handelt, das eine positive Ladung aufweist, die durch Ändern des pHs auf einen Wert über dessen pKs invertiert oder neutralisiert werden kann.
  14. Das Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Ionenaustauscherharz ein Nukleotid, ein Polyamin oder eine Verbindung, die eine Imidazolgruppe enthält, umfasst.
  15. Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Oberfläche der Festphase mit Histidin oder einem Polyhistidin behandelt ist.
  16. Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Festphase eine Kunstoffoberfläche umfasst, die so modifiziert wurde, dass sie funktionelle Gruppen einschließt.
  17. Das Verfahren gemäß Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei es sich bei dem Kunststoffmaterial um Polypropylen handelt.
  18. Das Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Poylpropylenoberfläche durch Oxidieren der Oberfläche mit einem Oxidationsmittel modifiziert ist, um eine carboxylierte Oberfläche zu schaffen.
  19. Das Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Carboxylgruppen weiter durch kovalente Kopplung einer Anionenaustauschergruppe modifiziert werden, um die Bindung von Nukleinsäuren durch eine Ladungswechselwirkung zu ermöglichen.
  20. Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei es sich bei der Anionenaustauschergruppe um Imidazol, Polyhistidin oder einen starken oder schwachen Ionenaustauscher handelt.
  21. Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Festphase um ein PCR-_Röhrchen oder eine Mikrotiterplatte handelt, die verwendet wird, um kleine Mengen an Nukleinsäure zu isolieren und zu immobilisieren, wodurch ein Templat für anschließende PCR oder sonstige genetische Analyse und Manipulation gebildet wird.
  22. Das Verfahren gemäß einem der vohergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Festphase um eine Multiwellplatte handelt, wodurch ermöglicht wird, dass eine Reihe an Extraktionen von Nukleinsäure aus verschiedenen Proben im Wesentlichen gleichzeitig durchgeführt werden.
  23. Das Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, das des Weiteren das Amplifizieren dieser abgelösten Nukleinsäure unter Verwendung von PCR umfasst.
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