JP7421469B2 - 核酸の単離方法、核酸の単離キット、及び検査チップ - Google Patents
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Description
本発明は、核酸の単離方法に関する。以下、本発明の具体的な実施形態を説明することにより、本発明を明らかにする。
本発明の第1の実施形態に係る核酸の単離方法は、核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、抽出溶液中に核酸を分散する工程と、核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、洗浄溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程と、回収溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程と、を備える。上記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含む。上記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつpHが塩基性化合物の共役酸のpKa以下である。上記回収溶液は、pHが塩基性化合物の共役酸のpKa以上である。以下、それぞれの工程について説明する。
本発明の第1の実施形態に係る核酸の単離方法は、核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、抽出溶液中に核酸を分散する工程を備える。以下、本工程を「抽出工程」として説明する。
次に、本発明の第1の実施形態に係る核酸の単離方法は、核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程を備える。以下、本工程を「吸着工程」として説明する。
回収部3には、核酸を担持させ、回収するためのアニオン性吸着体4が配置されている。アニオン性吸着体4は、核酸を担持させるための担持体である。
次に、本発明の第1の実施形態に係る核酸の単離方法は、洗浄溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程を備える。また、上記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつpHが塩基性化合物の共役酸のpKa以下である。以下、本工程を「洗浄工程」として説明する。
上記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつpHが上記塩基性化合物の共役酸のpKa以下である。従って、上記洗浄溶液中において、上記塩基性化合物は一部が正に帯電したカチオンとして存在している。この場合、図3(a)に示すように、アニオン性吸着体4と核酸(通常、負に帯電している)との間に上記カチオンが架橋構造を形成することで、核酸を強固にアニオン性吸着体4に吸着させることができる。さらに、塩基性化合物がカチオンとして洗浄溶液中に溶解していることにより、核酸と均一に架橋構造を形成でき、核酸の回収率を高めやすくなる。
次に、本発明の第1の実施形態に係る核酸の単離方法は、回収溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程を備える。以下、本工程を「回収工程」として説明する。
なお、本発明の第1の実施形態に係る核酸の単離方法は、上述した工程以外の工程を任意で含んでいてもよい。例えば、上記吸着工程の後に、乾燥工程等のその他の工程を含んでいてもよい。
本発明の第2の実施形態に係る核酸の単離方法は、核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、抽出溶液中に核酸を分散する工程と、核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、回収溶液をアニオン性吸着体に接触させる工程と、を備える。抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつpHが塩基性化合物の共役酸のpKa以下である。回収溶液は、pHが塩基性化合物の共役酸のpKa以上である。
本発明は、核酸の単離キットにも関する。
本発明の第1の実施形態に係る核酸の単離キットは、抽出溶液と、洗浄溶液と、回収溶液と、アニオン性吸着体と、を含む。また、抽出溶液は、タンパク質変性剤を含む。洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつpHが塩基性化合物の共役酸のpKa以下である。回収溶液は、pHが塩基性化合物の共役酸のpKa以上である。第1の実施形態に係る核酸の単離キットであれば、上述の第1の実施形態に係る核酸の単離方法を用いることにより、アルコールを用いずとも、抽出溶液、洗浄溶液及び回収溶液により容易に核酸を単離することができる。
また、本発明の第2の実施形態に係る核酸の単離キットは、抽出溶液と、回収溶液と、アニオン性吸着体と、を含む。また、抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつpHが塩基性化合物の共役酸のpKa以下である。回収溶液は、pHが塩基性化合物の共役酸のpKa以上である。第2の実施形態に係る核酸の単離キットであれば、上述の第2の実施形態に係る核酸の単離方法を用いることにより、アルコールを用いずとも、抽出溶液及び回収溶液により容易に核酸を回収することができる。
本発明は、検査チップにも関する。
本発明の第1の実施形態に係る検査チップは、核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、洗浄溶液を保持する洗浄溶液保持部と、回収溶液を保持する回収溶液保持部と、アニオン性吸着体を含む回収部と、核酸分析部と、を備える。また、抽出溶液は、タンパク質変性剤を含む。洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつpHが塩基性化合物の共役酸のpKa以下である。回収溶液は、pHが塩基性化合物の共役酸のpKa以上である。
回収溶液によって核酸が単離された後、核酸分析部22において核酸の分析が行われる。核酸分析部22において行われる核酸の分析方法としては、特に限定されないが、例えば、PCR(Polymerase Chain Reaction)等が挙げられる。核酸の単離と分析とを迅速に行うため、核酸の分析に用いられる試薬が核酸分析部22にあらかじめ設けられていることが好ましい。このような核酸の分析に用いられる試薬としては、例えばPCR用のプライマーやポリメラーゼ等が挙げられる。
本発明の第2の実施形態に係る検査チップは、核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、回収溶液を保持する回収溶液保持部と、アニオン性吸着体を含む回収部と、核酸分析部と、を備える。抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつpHが塩基性化合物の共役酸のpKa以下である。また、回収溶液は、pHが塩基性化合物の共役酸のpKa以上である。
実施例1では、以下のようにして図1及び図2に示すチップ1を作製した。
まず、チップ1の系外において、ウイルス(ATCC社製のFluA H1N1;5000コピー)を表1に示す組成の抽出溶液500μLに添加し、核酸(RNA)を抽出溶液中に分散させた抽出溶液を得た。なお、表1に示す共沈剤(ポリアデニン)は、抽出溶液500μLあたり3μg添加した。次に、上記のRNAを含む抽出溶液150μLを回収部3に送液し、RNAをシリカ繊維に吸着させた。RNAを含む抽出溶液の送液後に、表1に示す洗浄溶液200μLを回収部3に送液し、シリカ繊維を洗浄した。
次に、核酸を回収した回収溶液のうち2μLを取り出し、TaqPath qPCR and RT-qPCR Master Mixes(Thermofisher社製)を用いて、PCR反応溶液を調整した。なお、PCR用のプライマーとしては、バイオサーチテクノロジー社製のPDM 2009 H1N1検出用プライマー(InfA,Universal Influenza a Primer)を用いた。
抽出溶液、洗浄溶液中に含まれる化合物の種類及び添加量を下記の表1のように変更したこと、さらに実施例6においては洗浄工程を設けなかったこと以外は、実施例1と同様にしてRNA回収率を求めた。結果を下記の表1に示す。なお、実施例2のDABCOの共役酸のpKaは4.2であり、実施例3のピペラジンの共役酸のpKaは5.7である。また、表1では、mol/LをMで表している。
比較例1では、洗浄溶液としてエタノール200μLを用いたこと以外は、実施例1と同様にしてRNA回収率を求めた。
比較例2では、RNAを含む抽出溶液の送液後に、洗浄溶液を送液しなかったこと以外は、実施例1と同様にしてRNA回収率を求めた。
2…流路
2a…上流側流路
2b…下流側流路
3…回収部
4…アニオン性吸着体
5…基板
5a…主面
5b…凹部
6…カバー部材
7…回収口
11…検査チップ
12…基板
12a,12b…第1,第2の面
13…封止シート
14…アニオン性吸着体
21A,21B…第1,第2の弁部
22…核酸分析部
23A~23C…マイクロポンプ
24A~24E…第1~第5の流路
25…抽出液保持部
26…洗浄液保持部
27…回収液保持部
28…回収部
29…廃液部
Claims (13)
- 核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、前記抽出溶液中に前記核酸を分散する工程と、
前記核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、
洗浄溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、
回収溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、
を備え、
前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み、
前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつpHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以下であり、
前記塩基性化合物が、メラミン、ピペラジン、及び1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンからなる群から選択される少なくとも1種を含有し、
前記回収溶液は、pHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以上である、核酸の単離方法。 - 前記抽出溶液は、価数が2価以上である金属カチオンをさらに含む、請求項1に記載の核酸の単離方法。
- 核酸を含む試料と抽出溶液とを混合し、前記抽出溶液中に前記核酸を分散する工程と、
前記核酸を含む抽出溶液を、アニオン性吸着体に接触させる工程と、
回収溶液を前記アニオン性吸着体に接触させる工程と、
を備え、
前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつpHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以下であり、
前記塩基性化合物が、メラミン、ピペラジン、及び1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンからなる群から選択される少なくとも1種を含有し、
前記回収溶液は、pHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以上である、核酸の単離方法。 - 前記塩基性化合物の共役酸のpKaが4以上、6以下である、請求項1~3のいずれか1項に記載の核酸の単離方法。
- 前記塩基性化合物が、メラミンである、請求項1~4のいずれか1項に記載の核酸の単離方法。
- 前記抽出溶液が、さらに両性イオン化合物を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の核酸の単離方法。
- 前記アニオン性吸着体にアルコールを含む溶液を接触させる工程を含まない、請求項1~6のいずれか1項に記載の核酸の単離方法。
- 抽出溶液と、
洗浄溶液と、
回収溶液と、
アニオン性吸着体と、
を含み、
前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み、
前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつpHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以下であり、
前記塩基性化合物が、メラミン、ピペラジン、及び1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンからなる群から選択される少なくとも1種を含有し、
前記回収溶液は、pHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以上である、核酸の単離キット。 - 前記抽出溶液は、価数が2価以上である金属カチオンをさらに含む、請求項8に記載の核酸の単離キット。
- 抽出溶液と、
回収溶液と、
アニオン性吸着体と、
を含み、
前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつpHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以下であり、
前記塩基性化合物が、メラミン、ピペラジン、及び1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンからなる群から選択される少なくとも1種を含有し、
前記回収溶液は、pHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以上である、核酸の単離キット。 - 核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、
洗浄溶液を保持する洗浄溶液保持部と、
回収溶液を保持する回収溶液保持部と、
アニオン性吸着体を含む回収部と、
核酸分析部と、
を備え、
前記抽出溶液は、タンパク質変性剤を含み
前記洗浄溶液は、塩基性化合物を含み、かつpHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以下であり、
前記塩基性化合物が、メラミン、ピペラジン、及び1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンからなる群から選択される少なくとも1種を含有し、
前記回収溶液は、pHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以上である、検査チップ。 - 前記抽出溶液は、価数が2価以上である金属カチオンをさらに含む、請求項11に記載の検査チップ。
- 核酸を含む抽出溶液を保持する抽出溶液保持部と、
回収溶液を保持する回収溶液保持部と、
アニオン性吸着体を含む回収部と、
核酸分析部と、
を備え、
前記抽出溶液は、タンパク質変性剤と、塩基性化合物とを含み、かつpHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以下であり、
前記塩基性化合物が、メラミン、ピペラジン、及び1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタンからなる群から選択される少なくとも1種を含有し、
前記回収溶液は、pHが前記塩基性化合物の共役酸のpKa以上である、検査チップ。
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