JP2013013416A - Dnaを精製するための固相担体を使用するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも約1Mの濃度のリチウム塩、少なくとも一種類の界面活性剤、および緩衝剤を含む、DNAを単離および精製するための処方物、その処方物はさらに、EDTAまたはクエン酸塩といったキレート剤を含みうる。および、純粋なおよび未分解のDNAを生物材料から精製するため、生物材料をDNA溶解溶液と接触させて混合物を生じる(DNA溶解溶液は7より大のpHで緩衝され、リチウム塩および少なくとも一種類の界面活性剤を含む);混合物をDNA添加溶液と接触させ;生物材料中に存在するDNAが固相担体と結合するように、混合物を固相担体と接触させ;固相担体を洗浄溶液で洗浄して、未分解のDNA以外の生物材料を除去し;純粋なおよび未分解のDNAを得るために、DNAをDNA溶出溶液で溶出する方法。
【選択図】なし
Description
本文書に関する研究は米国立衛生研究所グラント1 R43 CA106124−01によって支援された。米国政府は本発明に一定の権利を有しうる。
本文書は、参照により本開示に含まれる、2001年10月12日出願の米国特許出願公開第09/974,798号明細書の継続出願である2003年4月16日出願の米国特許出願公開第10/418,194号明細書の一部継続出願である2004年8月2日出願の米国特許出願公開第10/909,724号明細書の優先権を主張する。
生物試料からDNAを精製するための試薬、方法およびキットがここでは提供される。そのような生物試料は、典型的には含水混合物または乾燥の、DNAを含む生物材料を含み、原核または真核細胞の複雑な生物混合物を含む。典型的には、生物材料はまた、RNA、糖質、タンパク質、および脂質を含む。生物材料は、下記を含むがそれらに限定されない:全血のような体液、骨髄、ろ紙血、血清、血漿、バフィーコート調製物、唾液および脳脊髄液、口腔スワブ、培養細胞、固定細胞、頸部細胞スワブ、細菌の細胞懸濁液または組織ホモジネート、たとえば心臓、肝臓および脳のような固形動物組織、糞便および尿のような体老廃物、空気、水、堆積物または土壌から採取された環境試料、植物組織、酵母、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、原虫、リケッチア、および他の小型微生物細胞。これらの生物材料の溶解物、ホモジネート、または部分精製試料もまた使用されうる。一実施形態では、生物材料は核酸の粗混合物または部分精製混合物である。
試薬の4つの分類がここでは開示される。これらは、DNA溶解溶液、DNA添加溶液、DNA洗浄溶液、およびDNA溶出溶液である。これらの試薬は、適当な固相担体と併用され、実質的に純粋なおよび混入物を含まない未分解DNAを生じるために用いられる。フェノール、およびクロロホルムといった危険な物質、またはグアニジニウム塩、尿素などといった危険なカオトロピック物質を使用せずに、さまざまな生物材料からDNAを精製するために使用されうる試薬。
さまざまな固相担体が使用されうる。適当な固相担体は、ガラス繊維といったシリカを基礎とする担体、またはセルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリフッ化ビニリデンといったその他の材料、およびその組み合わせを含む。固相担体は、プラグフローまたは連続流DNA単離方法を可能にする容器に入れるかまたは固定することができる。代替的に、固相担体の材料は、チューブまたはプレートといった適当な容器に入れるかまたは固定することができる膜、ディスク、またはシリンダーといった独立の固相担体を作製するために、充填されうる。一実施形態では、固相担体は、生物材料との最適の接触を可能にするために、繊維状または粒子状である。固相担体の、試薬との使用に適したサイズは、生物材料の量に従って変化しうる。たとえば、ガラス繊維膜は、さまざまな量のDNAの結合、精製および溶出を可能にするためにさまざまなサイズに切ることができる。
ここではDNAを生物材料から精製するための方法が提供される。試薬および固相担体は、選択的な単離方法を与える。
最高品質の固相DNA精製製品を製造するために、製品はいくつかの点で極めて良好に機能すべきである。固相DNA精製製品は、効果的に純粋なDNA試料をさまざまな試料型から単離しおよびDNAの可能な最高収率を結果として生じるべきである。使い勝手が良いべきであり、つまり段階はあまり煩わしくてはならず、および成分は毒性であってはならずおよび容易に処分できる。さらに、本製品は利用者にとって経済的であるべきである。従って、溶液のための費用効果の高い成分を見出すことが最も重要であった。表1はここで評価された塩それぞれについてコストを示す。
いくつかの塩化物塩の溶解度および性能を検討し、および2種類のリチウム塩すなわち塩化リチウムおよび臭化リチウムと比較した。緩衝剤および洗浄剤を基礎とするDNA溶解溶液の両方で得られる最大の溶解度を検討するため、DNA溶解溶液をその他の塩化物塩を用いて調製した。表2はこの研究で測定されたほぼ最大溶解度を示し、および『化学および物理学ハンドブック』(Handbook of Chemistry and Physics)(第62版、CRCプレス社(CRC Press)、フロリダ州ボカラトン(Boca Raton))から得られた20℃へ外挿された溶解度データ表および溶液データの熱の表と比較する。
適当に細胞を溶解し、およびまたDNA溶解溶液中で可溶なままである洗浄剤が特定された。ツイーン(Tween)、トリトン(Triton)、テルジトール(Tergitol)、ノニデット(Nonidet)およびイゲパール(Igepal)類の洗浄剤を、いくつかの界面活性剤化合物と共に調べた。
等容の第一のDNA溶解溶液(6M LiCl、5%トリトン(Triton)X−100、5%DGME(ジエチレングリコールモノエチルエーテル)、10mM EDTAを含む100 mMトリス、pH 8.8)を全血 試料へ加えた。完全なホモジナイズを達成するため、結果として生じる溶液をピペッティングで5回上下し、高速にて5回パルスボルテックスし、ピペッティングで20回上下し、および次いで再び5回パルスボルテックスした。ホモジナイズ後、血液の2倍容の第二のDNA溶解溶液(25mMクエン酸塩、2M LiCl、0.1% SDS、30%DGME、を含む5 mMトリス、pH 9.1)を試料へ加えた。試料は第一のDNA溶解溶液について記載したのと同一の過程を経て混合した。2種類の溶解溶液を用いたホモジナイズおよび溶解後、血液の4倍容のDNA添加溶液(10M LiCl、10%DGME、100mMトリス、pH7.9)を各試料に加えた。結果として生じる溶液を混合するためピペッティングで5回上下した。
全血試料からのDNAの単離に用いられる一実施形態は、まず血液試料中の赤血球を溶解し、次いで結果として生じる赤血球溶解物から遠心分離を用いて白血球を沈澱する。赤血球溶解物上清を流去しおよび白血球沈澱を洗浄および再沈澱した後、200μLのDNA溶解溶液(6M LiCl、5%トリトン(Triton)X−100、5%DGME(ジエチレングリコールモノエチルエーテル)、10mM EDTAを含む100mMトリス、pH8.8)を沈澱へ加えて、試料を完全にホモジナイズするためにDNA溶解溶液中でボルテックスおよびピペッティングによって白血球を溶解する。ホモジナイズ後、400μLのDNA添加溶液(10M LiCl、10%DGME、100トリス、pH7.9)を白血球溶解物へ加え、および混合物を、バスケット内にホウケイ酸ガラス繊維膜(ワットマン(Whatman)Dガラス繊維膜)が入った精製カラムへ加え、および2mL微量遠心管の中に入れた。微量遠心管を次いで7000×gにて1分間遠心した。溶解物の遠心分離後、400μLのDNA洗浄溶液(5mM EDTA、70%エタノールを含む100mMトリスHCl、pH7.6)をカラム 材料へ加え、および微量遠心機で最高速度にて1分間遠心した。DNA洗浄溶液添加および遠心分離段階を1回繰り返した。DNAを固相担体から溶出するために、膜の入ったバスケットを新しい微量遠心管へ移し、および50μLのDNA溶出溶液(1mM EDTAを含む10mMトリス、pH7.5)をカラムへ加え、および微量遠心機で最高速度にて1分間遠心した。同一の溶出チューブへ、DNA溶出溶液添加および遠心分離段階を1回繰り返した。
頸部細胞スワブ培地または固定頸部細胞から核酸を抽出することは典型的には困難であるため、それはここで開示される組成物および方法の効率を説明するために効果的に使用できる。しかし、当業者は、開示される組成物および方法はまた、広い範囲の生物試料を用いて効果的に使用でき、および本発明はいかなる試料型での使用にも限定されないことを理解する。
Claims (49)
- 少なくとも約1Mの濃度のリチウム塩;
少なくとも一種類の界面活性剤;および
緩衝剤
:を含む、DNAを単離および精製するための処方物。 - さらにキレート剤を含む、請求項1の処方物。
- キレート剤がEDTAまたはクエン酸塩であることを特徴とする請求項2の処方物。
- 処方物がカオトロープおよび/または強いカオトロピック物質を欠くことを特徴とする請求項1〜3のうちいずれかの処方物。
- リチウム塩が塩化リチウムであることを特徴とする請求項1〜4のうちいずれかの処方物。
- リチウム塩が約2〜10Mの濃度であることを特徴とする請求項1〜5のうちいずれかの処方物。
- 処方物が約7を上回るpHを有することを特徴とする請求項1〜6のうちいずれかの処方物。
- 処方物が約7ないし約9のpHを有することを特徴とする請求項1〜6のうちいずれかの処方物。
- 界面活性剤が約10〜40%v/vの濃度で存在することを特徴とする請求項1〜8のうちいずれかの処方物。
- 少なくとも一種類の界面活性剤がジエチルグリコールモノエチルエーテル(DGME)であることを特徴とする請求項1〜9のうちいずれかの処方物。
- DGMEが約5%ないし約35%v/vの濃度で存在することを特徴とする請求項10の処方物。
- 少なくとも一種類の界面活性剤が洗浄剤であることを特徴とする請求項1〜11のうちいずれかの処方物。
- 洗浄剤が陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性または非イオン性洗浄剤、またはその混合物であることを特徴とする請求項12の処方物。
- 洗浄剤が陰イオン性および非イオン性洗浄剤の混合物であることを特徴とする請求項12または13の処方物。
- 陰イオン性洗浄剤がSDSであることを特徴とする請求項13または14の処方物。
- SDSが0.05〜0.2%v/vの濃度で存在することを特徴とする請求項15の処方物。
- 洗浄剤がトリトン(Triton)−Xであることを特徴とする請求項12または13の処方物。
- 洗浄剤が0.05〜5.0% v/vの濃度で存在することを特徴とする請求項17の処方物。
- (a)DNAを含む生物材料をDNA溶解溶液と接触させて混合物を形成し、DNA溶解溶液は7より大のpHで緩衝されており、およびDNA溶解溶液はリチウム塩および少なくとも一種類の界面活性剤を含み;
(b)混合物をDNA添加溶液と接触させ;
(c)生物材料中に存在するDNAが固相担体へ結合するように、混合物を固相担体と接触させ;
(d)固相担体を洗浄溶液で洗浄し;および
(e)DNAをDNA溶出溶液で溶出する
:段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のDNAを生物材料から単離するための方法。 - DNA添加溶液がイソプロパノール、エタノールおよび/またはメタノールを含むことを特徴とする請求項19の方法。
- DNA添加溶液がアルコールの混合物を含むことを特徴とする請求項19または20の方法。
- DNA添加溶液が100%イソプロパノールを含むことを特徴とする請求項19または20の方法。
- DNA添加溶液が1Mより多いアルカリ金属塩を含むことを特徴とする請求項19〜22のうちいずれかの方法。
- 生物材料が頸部細胞試料であることを特徴とする請求項19〜23のうちいずれかの方法。
- 生物材料が全血であることを特徴とする請求項19〜23のうちいずれかの方法。
- 生物材料が培養細胞、固定細胞、および/または組織試料であることを特徴とする請求項19〜23のうちいずれかの方法。
- 洗浄溶液が約7より高いpHで緩衝されていることを特徴とする請求項19〜26のうちいずれかの方法。
- 溶解および/または洗浄溶液がカオトロープおよび/または強いカオトロピック物質を欠くことを特徴とする請求項19〜27のうちいずれかの方法。
- DNA溶解溶液がさらにキレート剤を含むことを特徴とする請求項19〜28のうちいずれかの方法。
- 固相担体がシリカ、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、またはポリフッ化ビニリデン、またはその組み合わせの成分を含むことを特徴とする請求項19〜29のうちいずれかの方法。
- 固相担体が、生物材料を固相担体と接触させる前に、RNアーゼ 溶液で前処理されていることを特徴とする請求項19〜30のうちいずれかの方法。
- 溶解溶液のリチウム塩が塩化リチウムまたは臭化リチウムであることを特徴とする請求項19〜31のうちいずれかの方法。
- 溶解溶液のリチウム塩が約1Mより高い濃度で存在することを特徴とする請求項19〜32のうちいずれかの方法。
- 溶解溶液のリチウム塩が2Mないし8Mの濃度で存在することを特徴とする請求項19〜33のうちいずれかの方法。
- 溶解溶液がさらにキレート剤を含むことを特徴とする請求項19〜34のうちいずれかの方法。
- キレート剤がEDTAまたはクエン酸塩であることを特徴とする請求項35の方法。
- DNA溶解溶液が界面活性剤を約25〜35%v/vの濃度で含むことを特徴とする請求項19〜36のうちいずれかの方法。
- 界面活性剤が洗浄剤であることを特徴とする請求項19〜37のうちいずれかの方法。
- 洗浄剤が非イオン性洗浄剤であることを特徴とする請求項38の方法。
- 非イオン性洗浄剤がツイーン(Tween)、トリトン(Triton)、ノニデット(Nonidet)、イゲパール(Igepal)またはテルジトール(Tergitol)であることを特徴とする請求項39の方法。
- 洗浄剤が陰イオン性洗浄剤であることを特徴とする請求項38の方法。
- 陰イオン性洗浄剤がSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)またはN−ラウロイルサルコシンであることを特徴とする請求項41の方法。
- 界面活性剤が洗浄剤の混合物、または洗浄剤と可溶化界面活性剤の混合物であることを特徴とする請求項19〜37のうちいずれかの方法。
- 可溶化界面活性剤がDGMEであるであることを特徴とする請求項43の方法。
- (a)DNAを含む生物材料をDNA溶解溶液で前処理された固相担体と接触させ、DNA溶解溶液は7より大のpHで緩衝されており、およびDNA溶解溶液は界面活性剤およびリチウム塩を含み;
(b)DNA添加溶液を生物材料へ加え;
(c)実質的に未分解のDNAおよび非核酸生物物質を含む核酸を放出するために、生物材料を固相担体と接触させ、実質的に未分解のDNAを含む核酸が固相担体と結合し;
(d)固相担体を洗浄溶液で洗浄して未分解のDNAを含む結合した核酸以外の生物材料を除去し;および
(e)結合した未分解のDNAを固相担体からDNA溶出溶液で溶出する
:段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のDNAを生物材料から精製するための方法。 - (a)DNAを含む生物材料を第一のDNA溶解溶液と接触させ、第一のDNA溶解溶液は約7より大のpHで緩衝されておりおよび約5〜15%v/vの濃度の界面活性剤および1Mより高い濃度のDNA錯体化塩を含み;
(b)生物材料を第二のDNA溶解溶液と接触させ、第二のDNA溶解溶液は界面活性剤および1Mより高いDNA錯体化塩を含むことを特徴とし;
(c)混合物をDNA添加溶液と接触させ;
(d)混合物を固相担体と接触させ、生物材料由来の実質的に未分解のDNAを含む核酸が固相担体と結合し;
(e)固相担体をDNA洗浄溶液で洗浄して実質的に未分解のDNAを含む結合した核酸以外の生物材料を除去し、DNA洗浄溶液はDNA錯体化塩およびアルコールを含み;および
(f)実質的に未分解のDNAを固相担体からDNA溶出溶液で優先的に溶出すること
:を含む、赤血球溶解段階を使用せずに、実質的に純粋なおよび未分解のDNAを生物材料から精製するための直接溶解方法。 - 第二のDNA溶解溶液がさらにキレート剤を含むことを特徴とする請求項46の方法。
- (a)DNAを含む生物材料を約7より大のpHで緩衝されたDNA溶解溶液と接触させ、DNA溶解溶液は界面活性剤および1Mより高い濃度でDNA錯体化塩を含み;
(b)生物材料を固相担体と接触させ、実質的に未分解のDNAを含む核酸が固相担体と結合し;
(c)固相担体をDNA添加溶液と接触させ;
(d)固相担体をDNA洗浄溶液で洗浄して未分解のDNAを含む結合した核酸以外の生物材料を除去し、DNA洗浄溶液はDNA錯体化塩およびアルコールを含み;および
(e)実質的に未分解のDNAを固相担体からDNA溶出溶液で優先的に溶出すること
:を含む、実質的に純粋なおよび未分解のDNAを生物材料から精製するための方法。 - (a)DNAを含む固定頸部細胞を含む生物材料を約7より大のpHで緩衝されたDNA溶解溶液と接触させ、DNA溶解溶液は約25〜35%v/vの濃度の界面活性剤、キレート剤、および1Mより高いDNA錯体化塩を含み;
(b)混合物へアルコールを含む随意的なDNA添加溶液を加え;
(c)実質的に未分解のDNAを含む核酸および非核酸生物物質を放出させるために、生物材料を固相担体と接触させ、実質的に未分解のDNAを含む核酸を固相担体と結合させ;
(d)固相担体をDNA洗浄溶液で洗浄して未分解のDNAを含む結合した核酸以外の生物材料を除去し;および
(e)実質的に純粋なおよび未分解のDNAを得るために、結合した未分解のDNAを固相担体からDNA溶出溶液で優先的に溶出すること
:の段階を含む、実質的に純粋なおよび未分解のDNAを固定頸部細胞試料から精製するための方法。
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