ES2622062T3 - Ensayo y sistema de captura de híbrido de resultados rápidos - Google Patents
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- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
Abstract
Un método para determinar la presencia de una molécula de ácido nucleico diana en una muestra que incluye: a) suspender una muestra en un medio de recogida que incluye un detergente aniónico y un detergente no iónico; b) desnaturalizar una molécula de ácido nucleico diana; c) poner en contacto una o más sondas polinucleotídicas con la molécula de ácido nucleico diana en condiciones que permitan que las sondas y la molécula de ácido nucleico diana se hibriden o se unan, y d) capturar el híbrido de ácido nucleico bicatenario sobre un soporte sólido revestido con un primer anticuerpo específico para el híbrido de ácido nucleico híbrido bicatenario
Description
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DESCRIPCION
Ensayo y sistema de captura de tnbrido de resultados rapidos
Esta solicitud reivindica prioridad tanto a la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61.108.687, presentada el 27 de octubre de 2008, como a la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 61/174.848, presentada el 1 de mayo de 2009.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos, reactivos, sistemas y kits para determinar la presencia de un acido nucleico en una muestra.
Antecedentes de la invencion
La deteccion y caracterizacion de secuencias espedficas de acidos nucleicos y cambios de secuencia se han utilizado para detectar la presencia de secuencias de acido nucleico virales o bacterianas indicativas de una infeccion, la presencia de variantes o alelos de genes de mairnferos asociados con enfermedades y canceres y la identificacion de la fuente de los acidos nucleicos encontrados en las muestras forenses, asf como en las determinaciones de paternidad.
Por ejemplo, se han aislado y secuenciado el ARN o el ADN para muchos microorganismos y virus. Las sondas de acido nucleico han sido examinadas para un gran numero de infecciones. Se han utilizado previamente secuencias de acidos nucleicos detectables que se hibridan con secuencias complementarias de ARN o ADN en una muestra de ensayo. La deteccion de la sonda indica la presencia de una secuencia de acido nucleico particular en la muestra de ensayo para la cual la sonda es espedfica. Ademas de ayudar a la investigacion cientffica, pueden utilizarse sondas de aDn o ARN para detectar la presencia de virus y microorganismos tales como bacterias, levaduras y protozoos, asf como mutaciones geneticas relacionadas con trastornos espedficos en muestras de pacientes.
Las sondas de hibridacion de acido nucleico tienen las ventajas de una alta sensibilidad y especificidad frente a otros metodos de deteccion y no requieren un organismo viable. Las sondas de hibridacion pueden marcarse, por ejemplo con una sustancia radiactiva que se puede detectar facilmente, o con marcadores bioqmmicos tales como, por ejemplo, biotina, que permite su captura y deteccion. Las moleculas de acido nucleico tambien pueden ser capturadas por un primer anticuerpo que sea espedfico para dbridos de ADN, en el que los dbridos pueden comprender dbridos de ADN-ARN, dbridos de ADN-ADN o dbridos de ARN-ARN. Los Idbridos pueden detectarse posteriormente mediante un segundo anticuerpo marcado que puede estar, por ejemplo, marcado con un marcador bioqmmico tal como fosfatasa alcalina o cualquier otro marcador capaz de ser detectado.
Bhan P. et al, Nucleic Acids Research 25(16):3310-3317, 1997, describe oligonucleotidos antisentido que se unen selectivamente al ARN complementario pero no al ADN. Se refiere a la smtesis de los respectivos oligonucleotidos y analiza la inhibicion antisentido que se logra con los oligonucleotidos. El documento Wo 98/10263 describe un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que se basa en la captura hfbrida. La muestra puede estar comprendida en un medio de recogida/transporte que preserva los acidos nucleicos e inhibe a las nucleasas, tal como una solucion de sal caotropica, una solucion detergente que comprende SDS, o una solucion de agente quelante tal como EDTA. Los ensayos basados en captura hfbrida tambien se describen en Gentech Diagnostics: "Digene HBV Test Hybrid Capture II", 6 de junio de 2008, Hantz S. y col., Pathologie Biologie 56: 29-35, 2008 y Sandri MT, y col., Journal of Clinical Microbiology 44 (6): 2141-2146, 2006. El documento de EE.UU. 2008/200344 ensena un metodo de cribado de un sujeto humano de infeccion por el virus del papiloma que se basa en un ensayo de chips de protemas. Los tampones de extraccion de protemas tales como el tampon de lisis RIPA y sus variantes y su uso en el contexto de la extraccion de protemas y/o inmunoprecipitacion se describen en Boston BioProducts Inc.: "Protein Extraction buffers", 2 de Septiembre 2007, Bart: "General Principles of Immunoprecipitation", 31 de Julio 2008, Invitrogen: "Anti-V5 Antibody, Anti-V5-HRP Antibody", 1 de Enero 2001, documento AU 701781, documento WO 2006/050166 y documento Wo 2005/088311. El documento WO 98/59044 describe ensayos para la actividad de la primasa y para la identificacion de moduladores de la actividad de la primasa. El documento WO 2005/080602 describe metodos y kits de hibridacion para la deteccion y medicion de moleculas biologicas.
A medida que se acumula la secuencia de acidos nucleicos para los genes de seres humanos y de organismos patogenos, aumenta la demanda de pruebas rapidas, rentables y faciles de usar. Existe la necesidad de proporcionar metodos, composiciones y kits nuevos y eficaces para determinar acidos nucleicos diana de una manera rapida, rentable y fiable en areas geograficas donde el acceso a la atencion medica no este facilmente disponible. Tambien es necesario proporcionar estos ensayos en un formato de deteccion rapida que se pueda utilizar en pafses en desarrollo. Los metodos y ensayos de la presente invencion satisfacen estas necesidades y pueden utilizarse en sistemas manuales, parcialmente automatizados, automatizados y no automatizados.
El analisis clmico en pafses en desarrollo y areas geograficas donde el acceso a la atencion medica no esta disponible presenta desafms unicos. La invencion descrita en este documento logra una resolucion aceptable que equilibra la importancia de estos desafms en tales pafses y areas. Por ejemplo, la velocidad en la obtencion de
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resultados es particularmente importante en lugares donde las mujeres viajan grandes distancias para proporcionar espedmenes para el analisis. En tales lugares, es ventajoso que los resultados se obtengan a las varias horas o el mismo dfa mientras el paciente esta todavfa presente para evitar la perdida de seguimiento asociada con el viaje desde el hogar hasta el sitio de la prueba.
Otros factores que enfrentan los pafses en desarrollo son el costo de ejecutar el ensayo y la instrumentacion necesaria para ejecutar el ensayo. Las pipetas de repeticion y las pipetas simples son solo dos tipos de dispositivos que se utilizan rutinariamente en pafses desarrollados pero que son potencialmente prohibitivos en los pafses en desarrollo. En consecuencia, existe la necesidad de dispositivos y productos medicos que empleen alternativas mas baratas y mas facilmente accesibles en los pafses en desarrollo.
Sumario
Un aspecto se refiere a un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que contiene material biologico. El material biologico puede incluir una celula epitelial cervical o un acido nucleico de una celula cervical. Usando los metodos descritos, la determinacion de si una molecula de acido nucleico diana esta presente en una muestra se puede obtener relativamente rapidamente, por ejemplo dentro de un penodo de menos de aproximadamente dos o tres horas. La invencion puede definirse por las reivindicaciones.
De acuerdo con la reivindicacion 1, se proporciona un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que incluye:
a) suspender una muestra en un medio de recogida que incluya un detergente anionico y un detergente no ionico;
b) desnaturalizar una molecula de acido nucleico diana;
c) poner en contacto una o mas sondas polinucleotidicas con la molecula de acido nucleico diana en condiciones que permitan que las sondas y la molecula de acido nucleico diana se hibriden o se unan, y
d) capturar el dbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte solido revestido con un primer anticuerpo espedfico para el dbrido de acido nucleico dbrido de doble hebra.
De acuerdo con la reivindicacion 5, se proporciona una composicion que comprende:
(a) una muestra biologica suspendida en un medio de recogida, en el que dicho medio de recogida comprende un detergente anionico y un detergente no ionico;
(b) un reactivo de desnaturalizacion;
(c) al menos una sonda polinucleotfdica capaz de unirse a una molecula de acido nucleico diana;
(d) un soporte recubierto con un primer anticuerpo antidbrido; y
(e) un segundo anticuerpo que es espedfico para el dbrido de acido nucleico bicatenario o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo dbrido de acido nucleico bicatenario/anticuerpo de soporte solido; En el que el segundo anticuerpo esta marcado con un marcador detectable.
De acuerdo con la reivindicacion 9, se proporciona una composicion que comprende:
(a) una muestra biologica suspendida en un medio de recogida que comprende de aproximadamente 0,5 por ciento a aproximadamente 2,0 por ciento de NP-40, de aproximadamente 0,10 por ciento a aproximadamente 0,40 por ciento de desoxicolato de sodio y de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA y
(b) una sonda polinucleotfdica; y
(c) un soporte recubierto con un primer anticuerpo antidbrido.
De acuerdo con la reivindicacion 15, se proporciona un kit para la deteccion de una molecula de acido nucleico diana en una muestra, que comprende:
a) un medio de recogida que comprende un detergente anionico y un detergente no ionico;
b) un reactivo de desnaturalizacion;
c) un soporte recubierto con un primer anticuerpo antidbrido;
d) un reactivo de deteccion que comprende un segundo anticuerpo que es espedfico para el dbrido de acido nucleico bicatenario o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo dbrido de acido nucleico de doble cadena/anticuerpo de soporte solido, en el que el segundo anticuerpo esta marcado de forma detectable;
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e) un tampon de lavado a base de detergente; y
f) un segundo reactivo de deteccion que comprende un sustrato para el marcador en el segundo anticuerpo.
Las realizaciones y los aspectos que no caen bajo el alcance de las reivindicaciones tienen solo fines ilustrativos.
En un aspecto, un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra comprende:
a) suspender la muestra en un medio de recogida;
b) liberar moleculas de acido nucleico diana de la muestra en el medio de recogida;
c) convertir las moleculas de acido nucleico diana de doble hebra en moleculas de acido nucleico diana monocatenarias;
d) poner en contacto una o mas sondas con las moleculas de acido nucleico diana monocatenarias en condiciones que permitan que las sondas y las moleculas de acido nucleico diana monocatenario objetivo hibriden formando hforidos de acido nucleico de doble hebra;
e) capturar los hforidos de acido nucleico bicatenarios;
f) separar los hforidos de acido nucleico bicatenarios de moleculas de acido nucleico diana monocatenario no unidas; y
g) detectar los hfbridos de acido nucleico bicatenarios, indicando con ello la presencia del acido nucleico diana.
En un aspecto, el metodo puede ser predominantemente manual, requiriendo la intervencion humana. Otro aspecto se refiere a la deteccion rapida de moleculas de acido nucleico diana en una muestra. El metodo de deteccion puede ser automatizado, ya sea totalmente automatizado, o parcialmente automatizado - en otras palabras, requiere de alguna intervencion humana.
Otro aspecto se refiere a la deteccion de moleculas de acido nucleico diana en multiples muestras al mismo tiempo o dentro de un periodo de tiempo muy corto, por ejemplo en una maquina o una serie de maquinas.
Todavfa otro aspecto se refiere a un instrumento para ejecutar un metodo para la deteccion de una molecula de acido nucleico diana en una huella simple. El instrumento combina muchos, o todos, de otros instrumentos individuales que realizan los pasos del metodo.
Otro aspecto se refiere a un sistema portatil para evaluar la deteccion de una molecula de acido nucleico diana en una muestra.
Otro aspecto se refiere a un kit para la deteccion de una molecula de acido nucleico diana en una muestra.
Un aspecto adicional se refiere a reactivos dentro de un medio de recogida en el que se recoge una muestra que contiene una molecula de acido nucleico diana. La molecula de acido nucleico diana se pueden mantener en el medio de recogida con una degradacion minima de la molecula de acido nucleico diana durante un penodo de tiempo de semanas o meses. En un aspecto, el material de la muestra diana basado en ADN se puede mantener en el medio de recogida con una degradacion minima de la molecula de acido nucleico diana durante un periodo de tiempo de semanas o meses. En un aspecto, el medio de recogida basado en detergente permite el analisis y el procesado rapidos de una muestra.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra que el medio de co-separacion basado en detergente retiene las perlas magneticas en pocillos de placa de microtitulacion mejor que el medio de transporte de muestra o de recogida conocido (STM) (medio sin detergente).
La Figura 2 muestra que las muestras que tienen solo 0,2 pg de acido nucleico diana (ADN) por ml de muestra proporcionan una senal legible usando los metodos de la presente invencion.
La Figura 3 muestra la estabilidad de la muestra clmica a temperatura ambiente durante 21 dfas.
La Figura 4 muestra la estabilidad de la muestra clmica a 33°C durante 21 dfas.
La Figura 5 muestra que los resultados de las pruebas demuestran un S/N> 2,0 para un plasmido de VPH 16 de 0,2 pg/ml que es equivalente a 1000 copias de ADN de VPH 16.
La Figura 6 muestra un sistema para detectar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que incluye un calentador configurado para calentar multiples muestras; un luminometro; y un monitor.
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La Figura 7 muestra diferentes reactivos asociados con el ensayo de deteccion. Los viales de reactivo estan codificados por color para facilitar su uso y pueden incluirse en un kit.
La Figura 8 muestra un monitor utilizado junto con el sistema para detectar la presencia de moleculas de acido nucleico.
La Figura 9 muestra datos de estabilidad de 11 dfas para pastillas blandas suspendidas en un medio de recogida a base de detergente y almacenadas a temperatura ambiente.
Descripcion detallada
La presente descripcion cubre metodos, composiciones, reactivos, sistemas y kits para determinar rapidamente la presencia de una molecula de acido nucleico en una muestra. Los metodos, composiciones, reactivos, sistemas y kits se pueden utilizar con fines de diagnostico clmico, incluyendo, pero sin limitarse a, la deteccion e identificacion de organismos patogenos y la deteccion de una predisposicion genetica a una enfermedad particular.
En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra. El metodo comprende:
a) suspender la muestra en un medio de recogida que comprende un detergente;
b) desnaturalizar la molecula de acido nucleico diana;
c) poner en contacto una o mas sondas polinucleotfdicas con la molecula de acido nucleico diana en condiciones que permitan que las sondas y la molecula de acido nucleico diana se hibriden, formando de este modo un tnbrido de acido nucleico bicatenario;
d) capturar el tnbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte solido revestido con un primer anticuerpo espedfico para el tnbrido de acido nucleico tnbrido bicatenario, formando de este modo un complejo tnbrido de acido nucleico bicatenario/soporte solido;
e) separar el complejo tnbrido de acido nucleico bicatenario/soporte solido de un acido nucleico no unido;
f) conjugar el complejo con un segundo anticuerpo que es espedfico para el tnbrido de acido nucleico bicatenario o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo tnbrido de acido nucleico bicatenario/anticuerpo de soporte solido; En el que el segundo anticuerpo esta marcado con un marcador detectable;
g) lavar el complejo de tnbrido de acido nucleico de doble cadena/anticuerpo de soporte solido con un tampon de lavado que comprende un detergente; y
ti) detectar el marcador en el segundo anticuerpo en el que la deteccion indica la presencia de la molecula de acido nucleico diana.
En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que incluye suspender una muestra en un medio de recogida que incluye un detergente; desnaturalizar una molecula de acido nucleico diana; poner en contacto una o mas sondas polinucleotfdicas con la molecula de acido nucleico diana en condiciones que permitan a las sondas y la molecula de acido nucleico diana tiibridarse o unirse y capturar el tnbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte solido revestido con un primer anticuerpo espedfico para el tnbrido de acido nucleico tnbrido de doble cadena.
En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que incluye suspender una muestra en un medio de recogida que incluye un detergente; desnaturalizar una molecula de acido nucleico diana; poner en contacto una o mas sondas polinucleotfdicas con la molecula de acido nucleico diana en condiciones que permitan a las sondas y la molecula de acido nucleico diana tiibridarse o unirse, capturar el tnbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte solido revestido con un primer anticuerpo espedfico para el tnbrido de acido nucleico tnbrido bicatenario y separar el complejo de tnbrido de acido nucleico de doble cadena/soporte solido del acido nucleico no unido.
En un aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que incluye suspender una muestra en un medio de recogida que incluye un detergente; desnaturalizar una molecula de acido nucleico diana; poner en contacto una o mas sondas polinucleotfdicas con la molecula de acido nucleico diana en condiciones que permitan a las sondas y la molecula de acido nucleico diana tiibridarse o unirse, capturar el tnbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte solido revestido con un primer anticuerpo espedfico para el tnbrido de acido nucleico tnbrido bicatenario, formando de este modo un complejo tnbrido de acido nucleico bicatenario/soporte solido; separar el complejo tnbrido de acido nucleico de doble cadena/soporte solido del acido nucleico no unido; y conjugar el complejo con un segundo anticuerpo que es espedfico para el tnbrido de acido nucleico bicatenario o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo tnbrido de acido nucleico bicatenario/anticuerpo de soporte solido.
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En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que incluye suspender una muestra en un medio de recogida que incluye un detergente; desnaturalizar una molecula de acido nucleico diana; poner en contacto una o mas sondas polinucleoddicas con la molecula de acido nucleico diana en condiciones que permitan a las sondas y la molecula de acido nucleico diana hibridarse o unirse, capturar el Idbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte solido revestido con un primer anticuerpo espedfico para el Idbrido de acido nucleico Idbrido bicatenario, formando de este modo un complejo Idbrido de acido nucleico bicatenario/soporte solido; y separar el complejo de Idbrido de acido nucleico de doble cadena/soporte solido del acido nucleico no unido; conjugar el complejo con un segundo anticuerpo que es espedfico para el Idbrido de acido nucleico bicatenario o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo Idbrido de acido nucleico bicatenario/anticuerpo de soporte solido; en el que el segundo anticuerpo esta marcado con un marcador detectable; y lavar el complejo de Idbrido de acido nucleico bicatenario/anticuerpo de soporte solido con un tampon de lavado que comprende un detergente.
En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el metodo:
a) suspender la muestra en un medio de recogida que comprende un detergente;
b) desnaturalizar la molecula de acido nucleico diana en la muestra;
c) formar un Idbrido de acido nucleico bicatenario poniendo en contacto al menos una sonda polinucleoddica con la molecula de acido nucleico diana;
d) formar un complejo de soporte Idbrido de acido nucleico bicatenario capturando el Idbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte, donde el soporte comprende un primer anticuerpo;
e) formar un complejo de Idbrido de acido nucleico bicatenario-soporte-segundo anticuerpo poniendo en contacto el complejo Idbrido de acido nucleico bicatenario-soporte con un segundo anticuerpo, en el que el segundo anticuerpo esta marcado con un marcador detectable;
f) lavar el complejo de Idbrido de acido nucleico bicatenario-soporte-segundo anticuerpo con un tampon de lavado; y
g) detectar el marcador en el segundo anticuerpo en el que la deteccion indica la presencia de la molecula de acido nucleico diana.
En un aspecto, el soporte solido comprende una perla paramagnetica modificada que esta recubierta o se tia unido a ella un primer anticuerpo inmunoespedfico para acidos nucleicos Idbridos bicatenarios. Se utiliza un campo magnetico para separar el complejo de acido nucleico bicatenario-perlas magneticas-anticuerpo del acido nucleico no unido.
En un aspecto, el metodo no incluye una etapa de pretratamiento de muestra. Por ejemplo, el medio de recogida basado en detergente permite reducir el tiempo de preparacion de la muestra lo que, a su vez, puede conducir a una deteccion acelerada de moleculas de acido nucleico diana. La muestra se puede analizar mediante metodos, ensayos o el aparato de la descripcion de una manera directa al ensayo. En un ejemplo, las etapas de purificacion no se realizan en la muestra antes de la evaluacion usando ensayos de la descripcion. En un aspecto, el lisado bruto se analiza directamente mediante los metodos, ensayos o el aparato de la descripcion. En otro aspecto, la muestra no experimenta una etapa de amplificacion de la diana.
Un aspecto se refiere a un metodo de diagnostico de cancer mediante la utilizacion de metodos, kits, ensayos y el aparato proporcionado en la presente memoria. En un aspecto, el cancer cervical se detecta identificando moleculas de acido nucleico asociadas con variantes de VPH y VPH. En otro aspecto, la neoplasia intraepitelial cervical (CIN) se puede cribar usando metodos, kits, ensayos, y el aparato proporcionado en la presente memoria. El cancer detectado puede tratarse posteriormente despues de ser diagnosticado por los metodos, kits, ensayos y el aparato proporcionado en la presente memoria. En un aspecto, el cancer diagnosticado es el cancer cervical y sus variantes.
En un aspecto, la descripcion proporciona una composicion que comprende una muestra biologica suspendida en un medio de recogida que comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica.
En un aspecto, la descripcion proporciona una composicion que comprende:
(a) una muestra biologica suspendida en aproximadamente de 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato sodico, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA, de
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aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de NaCI y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica; y
(b) al menos una o mas sondas polinucleotidicas.
En un aspecto, la descripcion proporciona una composicion que comprende:
(a) una muestra biologica suspendida en un medio de recogida que comprende de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato sodico, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 MM de EDTA, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica;
(b) al menos una o mas sondas polinucleotfdicas; y
(c) un primer anticuerpo.
En un aspecto, la descripcion proporciona una composicion que comprende:
(a) una muestra biologica suspendida en un medio de recogida que comprende de aproximadamente 0,5% a
aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 10 mM a
aproximadamente 50 mM de EDTA, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl, y de
aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica;
(b) un primer anticuerpo; y
(c) un segundo anticuerpo.
En un aspecto, la descripcion proporciona una composicion que comprende:
(a) una muestra biologica suspendida en un medio de recogida que comprende de aproximadamente 0,5% a
aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato sodico, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 10 mM a
aproximadamente 50 MM de EDTA, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl y de
aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica;
(b) al menos o una o mas sondas polinucleotfdicas;
(c) un primer anticuerpo; y
(d) un segundo anticuerpo.
En un aspecto, la descripcion proporciona una composicion que comprende:
(a) una muestra biologica suspendida en un medio de recogida, en el que el medio de recogida comprende al menos un detergente;
(b) un reactivo de desnaturalizacion;
(c) al menos una sonda polinucleotfdica capaz de unirse a una molecula de acido nucleico diana;
(d) un soporte recubierto con un primer anticuerpo; y
(e) un segundo anticuerpo marcado con un marcador detectable.
En un aspecto, cualquiera de las composiciones anteriores puede utilizarse con cualquiera de los medios de recogida descritos en la presente memoria.
En un aspecto, la muestra biologica en las composiciones anteriores es una muestra de celulas cervicales o una muestra de celulas cervicales humanas. En otro aspecto, las moleculas de acido nucleico en la muestra biologica estan desnaturalizadas. La muestra biologica en las composiciones anteriores puede exhibir estabilidad cuando se almacena en el medio de recogida durante al menos 21 dfas a 33°C. En un aspecto, el segundo anticuerpo se marca con un marcador detectable.
Muestra biologica
Los metodos de la presente invencion se pueden usar para detectar la presencia de una molecula de acido nucleico diana a partir de muestras, incluyendo, sin limitacion, un especimen o cultivo (por ejemplo, cultivos celulares, microbiologicos y virales) incluyendo muestras biologicas y ambientales. Las muestras biologicas pueden ser de un
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animal, incluyendo un ser humano, fluidas, solidas (por ejemplo, heces) o de tejido, asf como productos e ingredientes lfquidos y solidos de alimentos y piensos, tales como productos lacteos, verduras, carne y subproductos de carne y deshechos. Las muestras ambientales incluyen materiales ambientales tales como muestras de superficies, suelo, agua y muestras industriales, asf como muestras obtenidas de alimentos e instrumentos de proceso de productos lacteos, aparatos, kits, utensilios, artmulos desechables y no desechables.
Son particularmente preferidas las muestras biologicas que incluyen, aunque sin limitacion, celulas epiteliales cervicales (por ejemplo, una muestra obtenida de un hisopo cervical), celulas adenoides, celulas epiteliales anales, sangre, saliva, lfquido cefalorraqmdeo, lfquido pleural, leche, linfa, esputo y semen. La muestra puede comprender una molecula de acido nucleico bicatenario o puede comprender una molecula de acido nucleico monocatenario. Si esta presente una molecula de acido nucleico bicatenario, puede prepararse para el analisis de hibridacion por una variedad de metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, utilizando un alcali, usando proteinasa K/SDS, sales caotropicas. El proceso de preparacion de una molecula de acido nucleico bicatenario para el analisis de hibridacion implica generalmente convertirlo en una molecula de acido nucleico de cadena sencilla. Este proceso se conoce generalmente como desnaturalizacion. Sin embargo, tambien se contempla que una molecula de acido nucleico bicatenario pueda ser detectada sin desnaturalizacion, por ejemplo, a traves de una construccion de cadena triple.
La molecula de acido nucleico diana en una muestra puede ser ADN o ARN o ambos ADN y ARN. La molecula de acido nucleico diana puede estar contenida dentro de una molecula de acido nucleico mas grande. La deteccion de la molecula de acido nucleico diana o de la molecula de acido nucleico mas grande que contiene la molecula de acido nucleico diana se contempla en esta descripcion.
La muestra biologica puede comprender celulas cervicales, especialmente celulas cervicales humanas. La muestra puede recogerse con cualquier metodo o dispositivo conocido en la tecnica, incluyendo un dispositivo de recoleccion qmmicamente inerte tal como un hisopo con punta DACRON. Se pueden usar otros dispositivos de recoleccion aceptables incluyendo, pero no limitados a, un hisopo de algodon, un cepillo cervical, un hisopo flocado (un hisopo en forma de un hisopo de DACRON pero hecho con fibras de nylon permitiendo la recoleccion de mas celulas y la liberacion mas facil de celulas), escobilla cervical, mini escobilla, lavado, o cualquier dispositivo de recoleccion utilizado con frecuencia en pruebas de Papanicolaou.
En un aspecto, los metodos incluyen la recogida de una muestra de una mujer de mas de 30 anos de edad. El metodo tambien puede incluir la recoleccion de una muestra de una mujer de mas de 30 anos a traves de un frotis de Papanicolau o una prueba comparable. La muestra recogida por el frotis de Papanicolaou o una prueba comparable puede ser una muestra de celulas cervicales.
Una vez que se recoge la muestra, se puede colocar en un tubo de muestra. El tubo se puede sellar para evitar la contaminacion. El dispositivo de recogida (hisopo, cepillo, etc.) puede contener ademas un mecanismo mediante el cual se puede mover una vez que esta dentro del tubo de muestra. En un aspecto, el dispositivo de recogida contiene un inserto que puede ser movido usando un iman. En un aspecto, este inserto comprende un metal. En otro aspecto, este inserto comprende un material magnetico. El material magnetico incluye materiales paramagneticos, ferromagneticos y diamagneticos. Una ventaja de mover el dispositivo de recogida una vez que esta dentro del tubo de muestra es evitar que el dispositivo de recogida haga contacto con cualquier extractor de muestras o dispositivos de deteccion de muestras. Ejemplos de un dispositivo de extraccion de muestras incluyen pipetas, puntas de pipeta, botellas cuentagotas u otros dispositivos de extraccion de tecnologfa inferior. Ejemplos de dispositivos de deteccion de muestras incluyen sondas y puntas de sonda.
La velocidad de este ensayo tambien es beneficiosa en el cribado de muestras de pacientes en areas de vida remotas. A menudo, los pacientes viajaran bastante lejos para visitar al medico o la clmica y probablemente no regresaran por algun tiempo despues. Por lo tanto, es deseable ser capaz de analizar al paciente y proporcionar los resultados mientras el paciente espera en la clmica. En algunas circunstancias, puede ser difmil seguir el rastro del paciente para proporcionar los resultados de la prueba y/o tratar al paciente despues de haber salido del consultorio del medico. Por lo tanto, los ensayos descritos proporcionan resultados durante un tiempo corto, por ejemplo, entre aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas, entre aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas, entre aproximadamente 3 horas a aproximadamente 5 horas, entre aproximadamente 4 horas a aproximadamente 8 horas, o entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente l2 horas. En otro aspecto, los ensayos descritos proporcionan resultados en menos de aproximadamente 2 horas, menos de aproximadamente 2,5 horas, menos de aproximadamente 3 horas, menos de aproximadamente 3,5 horas, menos de aproximadamente 4 horas, menos de aproximadamente 4,5 horas, menos de aproximadamente 5 horas, menos de aproximadamente 8 horas, menos de aproximadamente 12 horas y menos de aproximadamente 24 horas. Un tiempo de respuesta tan corto permite al medico proporcionar al paciente los resultados y/o el tratamiento el mismo dfa que el paciente esta en la clmica.
Tubo de muestra
Se puede utilizar cualquier tipo de tubo de muestra. Ventajosamente, el tubo de muestra puede estar cerrado o sellado para minimizar la contaminacion. El cierre puede ser permanente o extrafble. Ejemplos de cierres extrafbles incluyen tapones de presion, tapones roscados, septos de goma, papel aluminio y pelmulas. El cierre puede
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contener una o mas aberturas o perforaciones, que cuando se perforan pueden ser re-sellables. Una ventaja de un cierre que contiene tales aberturas o perforaciones es que el cierre no se vuelve ineficaz cuando es perforado, por ejemplo, por un dispositivo de extraccion de muestras o un dispositivo de deteccion de muestras. Una vez que se ha retirado el dispositivo de extraccion de muestras o el dispositivo de deteccion de muestras, el cierre vuelve a sellar, minimizando asf la contaminacion.
Almacenamiento de la muestra biologica
Una vez que la muestra esta en el tubo de muestra, la muestra puede almacenarse secandola con un sustrato, o en un medio conservante, o ambos. La desecacion se realiza mediante secado a presion o secado con productos qmmicos. Esto elimina la mayor parte del agua y es adecuado para la estabilidad a largo plazo. Alternativamente, la muestra puede ser liofilizada (secada por congelacion) con un sustrato como trehalosa para asegurar la estabilidad de la muestra.
Otra posibilidad es que la muestra se pueda almacenar suspendiendola en un medio conservante, conocido y evidente para un experto en la tecnica. El proposito del medio conservante es proteger los componentes biologicos que pueden degradarse. Por ejemplo, las celulas de muestra, la mezcla de sondas, el complejo anticuerpo:perlas utilizado en la etapa de captura y el anticuerpo secundario utilizado en la etapa de deteccion son todos susceptibles de degradacion. Un medio conservante en la etapa inicial de la recoleccion idealmente proporciona estabilidad e integridad de la muestra y puede afectar a las etapas posteriores en el proceso de captura y deteccion de acidos nucleicos. En un aspecto, la muestra puede almacenarse a temperatura ambiente, refrigerarse o congelarse antes o despues de la adicion del medio conservante.
Medios de recoleccion
En un aspecto, la muestra puede ser recogida y almacenada en un medio de recogida. El medio de recogida tiene varias funciones, incluyendo como medio conservante para conservar los acidos nucleicos e inhibir las nucleasas para prevenir la degradacion de los acidos nucleicos antes del analisis. En un aspecto, el medio de recogida contiene al menos un detergente. En otro aspecto, el medio de recogida contiene al menos dos detergentes, al menos tres detergentes, o al menos cuatro detergentes. En un aspecto, cada uno de los detergentes es diferente. En otro aspecto, el medio de recogida basado en detergente comprende dos detergentes diferentes, uno que es capaz de controlar la senal de fondo y otro detergente que mejora el comportamiento de las perlas magneticas, por ejemplo, la migracion a traves de una muestra viscosa. Debido a que el detergente mejora el comportamiento de las perlas, las perlas se pueden lavar con una variedad de dispositivos menos precisos, tales como una botella de chorros y una botella cuentagotas, sin causar demasiada rotura de las perlas. Tal metodologfa puede ser ventajosa para su uso en pafses en desarrollo en los que los fondos o el acceso a equipos tecnologicamente avanzados, tales como los dispositivos de pipeteado, pueden no estar disponibles.
Ademas, la presente invencion proporciona un ensayo robusto que puede soportar el uso de dispositivos de suministro de reactivos menos precisos. Los reactivos en este ensayo fueron disenados para ser robustos y soportar variabilidad en el suministro del volumen de reactivo. Por ejemplo, la etapa de neutralizacion del ensayo utiliza una solucion de pH neutro altamente tamponada para llevar el pH muy basico de la reaccion al intervalo de pH apropiado para la hibridacion con tolerancias de volumen muy grandes.
El uso de un medio de recogida a base de detergente para su uso en el ensayo puede incluir uno o mas detergentes. En un aspecto, se emplea calor durante las etapas de hibridacion, captura y deteccion del ensayo. Incluso con detergente y la aplicacion de calor, los anticuerpos utilizados en el ensayo siguen siendo funcionales.
La figura 1 demuestra que un medio de recogida basado en detergente mejora en gran medida la capacidad para evitar la perdida y la migracion de perlas magneticas durante la manipulacion en comparacion con los medios de recogida estandar. El medio de recogida a base de detergente puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir simplemente en uno, dos, tres o cuatro o mas detergentes. Los detergentes son conocidos en la tecnica y pueden incluir, pero no se limitan a, detergentes cationicos tales como, pero sin limitarse a, bromuro de cetilpiridinio, bromuro de cetiltrimetilamonio (colectivamente conocidos como compuestos de cetrimonio) y cloruros de alquilbencilidimetilamonio (conocidos colectivamente como compuestos de benzalconio), y sales de alquil-trimetil- amonio; detergentes anionicos tales como, pero no limitados a, dodecil sulfato de sodio (SDS) y Sarkosyl; y detergentes no desnaturalizantes tales como NP-40; y otros detergentes. NP-40 tambien se conoce como NP-40 de tipo Tergitol, que es nonil fenoxilpolietoxiletanol. El NP-40 no es lo suficientemente potente como para romper la membrana nuclear, pero puede romper la membrana plasmatica. Como tal, puede utilizarse para obtener el contenido citoplasmico de un cultivo celular.
Pueden usarse otros detergentes y una combinacion de detergentes, y ventajosamente su combinacion proporciona la capacidad de controlar el ruido de fondo y mejorar el comportamiento de las perlas magneticas (cuando el soporte solido empleado comprenda perlas magneticas). En ciertos aspectos, un detergente es un detergente anionico y el segundo detergente es un detergente no anionico. Por ejemplo, en un aspecto, la combinacion de detergentes no ionicos y anionicos ayuda a mantener un bajo ruido de fondo. En un aspecto, un medio de recogida a base de
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detergente comprende un detergente anionico tal como desoxicolato de sodio, que controla el ruido de fondo y NP- 40, lo que mejora el comportamiento de las perlas magneticas.
La combinacion de estos dos tipos de detergentes proporciona beneficios sinergicos mas alla de una simple combinacion de adicion de dos detergentes juntos: control del ruido de fondo, mejor comportamiento de las perlas y mayor velocidad de ensayo. La presencia de estos detergentes (en el medio de recogida a base de detergente) proporciona la capacidad para conseguir resultados de ensayo mas rapidos, pero no afecta negativamente al acido nucleico o al anticuerpo de captura durante las etapas analfticas posteriores.
Ademas, el medio de recogida a base de detergente mejora la retirada de la muestra del dispositivo de recogida a medida que la muestra se disuelve mas facilmente. Ademas, el medio de recogida a base de detergente mejora la homogeneidad de la muestra en comparacion con otros medios de recogida tales como, pero sin limitarse a, PRESERVCYT (utiliza una solucion al 40% de metanol), STM (utiliza un agente caotropico) y alcohol. El medio de recogida a base de detergente tambien redujo la viscosidad de la muestra despues de la mezcla (manual o automatizada).
La concentracion de NP-40 en el medio de recogida puede oscilar entre aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2.0%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,0%, asf como cualquier numero dentro de los rangos citados. En ciertos aspectos, el NP-40 esta presente en una concentracion de aproximadamente 0,8% a aproximadamente 1,5%; desde aproximadamente 0,9% hasta aproximadamente 1,2% y en ciertos aspectos es aproximadamente 1,0%. En otro aspecto, el NP-40 esta presente en una concentracion de aproximadamente 0,1%, aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente
aproximadamente 1,8%, aproximadamente 1,9%, o aproximadamente 2,0%. La concentracion de desoxicolato de sodio en el medio de recogida puede variar desde aproximadamente 0,10% hasta aproximadamente 0,40%, desde aproximadamente 0,20% hasta aproximadamente 0,30%, asf como cualquier numero dentro de los intervalos citados. En un aspecto, la concentracion de desoxicolato de sodio es de aproximadamente 0,10%, aproximadamente 0,15%, aproximadamente 0,20%, aproximadamente 0,25%, aproximadamente 0,30%, aproximadamente 0,35%, o aproximadamente 0,40%.
- 0,2%,
- aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,5%,
- 0,6%,
- aproximadamente 0,7%, aproximadamente 0,8%, aproximadamente 0,9%
- 1,0%,
- aproximadamente 1,1%, aproximadamente 1,2%, aproximadamente 1,3%,
- 1,4%,
- aproximadamente 1,5%, aproximadamente 1,6%, aproximadamente 1,7%,
El medio de recogida a base de detergente puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir simplemente en un tampon, dos detergentes, un quelante y un conservante. El tampon puede ser Tris-HCl en una concentracion de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM; de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 60 mM; desde aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 50 mM, y de aproximadamente 45 mM a aproximadamente 55 mM, asf como cualquier numero dentro de los intervalos citados. El tampon puede ser tambien Tris-HCl en una concentracion de aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 55 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 65 mM, aproximadamente 70 mM, o aproximadamente 75 mM.
Puede usarse cualquier conservante y la eleccion puede depender de factores tales como la funcionalidad deseada, minimizacion de los efectos secundarios, el coste, etc. Los conservantes adecuados incluyen gentomicina, ProClin, dimersol y azida sodica. La concentracion de los conservantes en el medio de recogida depende de factores tales como el tipo de conservante, su eficacia, sus efectos secundarios, etc. Por ejemplo, para la azida sodica, la concentracion de azida sodica puede variar desde aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 0,1%, desde aproximadamente 0,025% hasta aproximadamente 0,075%, y desde aproximadamente 0,04% hasta aproximadamente 0,06%, asf como cualquier numero dentro de los rangos citados. El conservante, por ejemplo, la azida sodica, tambien puede estar presente en aproximadamente 0,01%, aproximadamente 0,02%, aproximadamente 0,03%, aproximadamente 0,04%, 0,05%, aproximadamente 0,06%, aproximadamente 0,07%, aproximadamente 0,08%, aproximadamente 0,09%, o aproximadamente 0,10%.
En un aspecto, el medio de recogida a base de detergente comprende, consiste esencialmente en, o consta de 1,0% de NP-40, 0,25% de desoxicolato de sodio, 50 mM de Tris-HCl, 25 mM de EDTA, 150 mM de NaCl y 0,05% de azida sodica. En otro aspecto, el medio de recogida a base de detergente comprende, consiste esencialmente en, o consta de aproximadamente de 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris- HCl, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica. En otros aspectos, el medio de recogida a base de detergente comprende, consiste esencialmente en, o consta de aproximadamente de 0,8% a aproximadamente 1,5% de NP-40, de aproximadamente 0,20% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 60 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 40 mM de EDTA, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl, y de aproximadamente 0,025% a aproximadamente 0,075% de azida sodica. En aun otro aspecto, el medio de recogida a base de detergente comprende, consiste esencialmente en, o consta de aproximadamente de 0,9% a aproximadamente 1,2% de NP-40, de aproximadamente 0,20% a aproximadamente 0,30% de desoxicolato de sodio, de aproximadamente 30 mM a aproximadamente 60 mM de Tris-HCl, de aproximadamente
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20 mM a aproximadamente 30 mM EDTA, de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM de NaCI, y de aproximadamente 0,04% a aproximadamente 0,06% de azida sodica.
En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de NP-40 y EDTA. En otro aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de NP-40, EDTA y azida sodica. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de desoxicolato sodico, EDTA y azida sodica. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de aproximadamente NP-40, desoxicolato sodico, EDTA y azida sodica. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de NP-40, desoxicolato sodico, Tris-HCl, EDTA y azida sodica.
En otro aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40 y de 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA. En otro aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida de sodio. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato sodico, EDTA de 10 mM a aproximadamente 50 mM y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de aproximadamente de 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, de 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste esencialmente en, o consta de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato sodico, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA, y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica.
En un aspecto, el medio de recogida es un medio no caotropico. Es decir, por ejemplo, el medio de recogida no incluye un medio caotropico o sales caotropicas. Sin limitacion, en un aspecto, el medio de recogida no incluye clorhidrato de guanidina ni urea. Una ventaja potencial de usar un medio de recoleccion no caotropico es una mejor resuspension de una muestra, pruebas mas reproducibles y alfcuotas de ensayo mas uniformes con relacion a un medio que incluye un medio caotropico o sales caotropicas.
Una ventaja de usar un medio de recogida a base de detergente es que preserva la estabilidad de la muestra. Una muestra almacenada en un medio de recogida a base de detergente tal como se describe es estable durante al menos 31 dfas, y cuando se mantiene a temperaturas de 15°C a 33°C es estable durante al menos 21 dfas. En un aspecto, una muestra es estable cuando se congela en un medio de recogida a base de detergente a -20°C durante al menos seis meses. En otro aspecto, una muestra de celulas cervicales es estable durante al menos 31 dfas, durante al menos 21 dfas cuando se mantiene a temperaturas de 15 ° C a 33 ° C y durante al menos 6 meses en un medio de recoleccion a base de detergente a -20°C.
En un aspecto, el medio de recogida basado en detergente presenta una sensibilidad para detectar neoplasia intraepitelial cervical o cancer de al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% para una relacion de corte de 0,5 unidades luminosas relativas. En otro aspecto, el medio de recogida a base de detergente presenta una especificidad para detectar neoplasia intraepitelial cervical o cancer de al menos 80%, al menos 90%, o al menos 95% para una relacion de corte de 0,5 unidades luminosas relativas. En otro aspecto mas, el medio de recogida a base de detergente presenta una sensibilidad para detectar neoplasia intraepitelial cervical severa o moderada o cancer (CIN2+) de aproximadamente 90% y una especificidad de aproximadamente 84% para una relacion de corte de 0,5 unidades luminosas relativas. En un aspecto, el medio a base de detergente incluye de 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato de sodio, de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica.
Un medio de recogida a base de detergente tambien conduce a un rendimiento de ensayo mejorado bajo rigurosas condiciones de hibridacion y captura (por ejemplo, a temperaturas entre 65°-75°) con respecto al medio de recogida que contiene un desnaturalizante.
La presencia de uno, dos, tres, cuatro o mas detergentes puede reducir la viscosidad de la muestra, lo cual ayuda en la eliminacion de la fase lfquida de las perlas magneticas, asf como ayuda en la mezcla de la muestras.
En un aspecto, una muestra tal como sangre o una muestra de celulas cervicales exfoliadas puede ser recogida y suspendida en un medio de recogida a base de detergente. La muestra se puede recoger con un dispositivo de recoleccion qmmicamente inerte tal como un hisopo con punta DACRON. Se puede usar cualquier otro hisopo adecuado, tal como hisopos de fibra de nylon. La muestra puede almacenarse en un medio de recogida a base de detergente para evitar la degradacion de los acidos nucleicos antes del analisis y para mantener la estabilidad de la muestra.
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Las muestras pueden recogerse en otros medios de recogida conocidos y despues pueden utilizarse en los metodos descritos en la presente memoria. Ejemplos de otros medios de recogida incluyen PRESERVCYT, SUREPATH, DCM (Medio de Coleccion DIGENE) y STM (Muestra/Medio de Transporte de Muestras). Ciertos medios de recogida son espedficos de acido nucleico. Por ejemplo, no se usa DCM cuando el acido nucleico diana es ARN. Las muestras recogidas en algunos de estos medios pueden requerir tratamiento antes de que los acidos nucleicos en las muestras puedan ser detectados y analizados. Se conocen en la tecnica varios metodos de procesamiento de muestras (tambien conocidos como preparacion de las muestras). Por ejemplo, las muestras de celulas cervicales recogidas para analisis citologico en un medio tal como PRESERVCYT pueden combinarse con un tampon de lisis basado en detergente seguido por la adicion de perlas magneticas que comprenden superficies de union a acidos nucleicos. Ademas, se pueden combinar otras muestras de celulas recogidas en otros medios de recogida comunmente conocidos con un tampon de lisis basado en detergente seguido por la adicion de perlas magneticas que comprenden superficies de union a acidos nucleicos.
Moleculas de acido nucleico diana
Las moleculas de acido nucleico diana incluyen, sin limitacion, moleculas de acido nucleico encontradas en espedmenes o cultivos (por ejemplo, cultivos celulares, microbiologicos y virales) incluyendo muestras biologicas y ambientales. Las moleculas de acido nucleico diana se pueden encontrar en muestras biologicas de un animal, incluyendo un ser humano, fluidas, solidas (por ejemplo, heces) o tejidos, asf como productos e ingredientes lfquidos y solidos de alimentos y piensos, tales como productos lacteos, verduras, carne y subproductos de la carne, y residuos. Las moleculas de acido nucleico diana pueden encontrarse en muestras ambientales e incluir material ambiental tal como muestras de superficie, suelo, agua y muestras industriales, asf como muestras obtenidas de alimentos e instrumentos de procesos de lacteos, aparatos, equipos, utensilios, artfculos desechables y no desechables.
Las moleculas de acido nucleico diana que se encuentran en las muestras biologicas incluyen, pero no se limitan a, muestras cervicales (por ejemplo, una muestra obtenida de un hisopo cervical) o muestras de celulas cervicales, celulas adenoides, celulas epiteliales anal, sangre, saliva, lfquido cefalorraqrndeo, fluido pleural, leche, linfa, esputo, orina y semen. Las moleculas de acido nucleico diana pueden ser de otros virus, bacterias, micobacterias o plasmodios, por ejemplo citomegalovirus (CMV), herpes, VIH, H1N1, clamidia, gonorrea, Trichomonas vaginalis, Staphylococcus aureus, tuberculosis, coronavirus o influenza asociado con SARS. En un aspecto, las moleculas de acido nucleico diana son al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 98%, al menos 99% , o al menos 100% identicas a las moleculas de acido nucleico asociadas con una cualquiera de las muestras cervicales (por ejemplo, una muestra obtenida de un hisopo cervical) o muestras de celulas cervicales, celulas adenoides, celulas epiteliales anales, sangre, saliva, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido pleural, leche, linfa, esputo, orina y semen, otros virus, bacterias, micobacterias o plasmodios, por ejemplo citomegalovirus (CMV), herpes, VIH, HlNl, chlamydia, gonorrea, Neisseria gonorrhoeae (GC), Chlamydia trachomatis (CT), Trichomonas vaginalis, Staphylococcus aureus, tuberculosis, coronavirus asociado al SRAS o influenza.
En un aspecto, las moleculas de acido nucleico diana son virus del papiloma humano (VPH) e incluyen variantes geneticas del VPH. Una variante incluye polimorfismos, mutantes, derivados, modificados, alterados, o formas similares del acido nucleico diana. En un aspecto, el acido nucleico diana es un acido nucleico de VPH. En otro aspecto, el acido nucleico de VPH es ADN de VPH de un tipo de VPH de alto riesgo. En otro aspecto, el acido nucleico de VPH es ARN de VPH de un tipo de VPH de alto riesgo. En otro aspecto, los acidos nucleicos diana son cualquiera de los tipos de VPH de alto riesgo 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 82 o cualquiera de los tipos del VPH de bajo riesgo 6, 11, 40, 43, 53, 61, 67, 69, 70, 71, 72, 81 y 83.
En otro aspecto, la molecula de acido nucleico diana es al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% identica a moleculas de acido nucleico asociadas con cualquiera de VPH, variantes geneticas de VPH, ADN de VPH de un tipo de VPH de alto riesgo, o ARN de VPH de un tipo de VPH de alto riesgo. En otro aspecto, los acidos nucleicos diana son al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 98%, al menos 99%, o 100% identicos a moleculas de acido nucleico asociadas con cualquiera de los tipos de VPH de alto riesgo 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 , 66, 68 y 82 o cualquiera de los tipos de VPH de bajo riesgo 6, 11, 40, 43, 53, 61, 67, 69, 70, 71, 72, 81 y 83 del VPH de bajo riesgo.
Utilizando metodos de la presente invencion, la molecula de acido nucleico diana puede estar presente en concentraciones menores que aproximadamente 1 pg por ml, menos de aproximadamente 0,75 pg por ml, menos de 0,5 pg por ml, menos de 0,25 pg por ml e incluso tan bajo como 0,2 pg por ml. Como se ve en la FIG. 2 se obtiene una relacion senal/ruido excelente cuando se utilizo ADN de VPH-16 como molecula de acido nucleico diana presente a una concentracion de 0,2 pg por ml.
Como se ha indicado anteriormente, la molecula de acido nucleico diana puede ser ADN o ARN. Cuando la molecula de acido nucleico diana es ADN, la sonda es preferiblemente ARN y cuando el acido nucleico diana es ARN, la sonda es preferiblemente ADN. Sin embargo, se puede usar una sonda de ADN con molecula de acido nucleico
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diana de ADN y se puede usar una sonda de ARN con molecula de acido nucleico diana de ARN. Tambien como se ha indicado anteriormente, la molecula de acido nucleico diana puede determinar el medio de recogida utilizado.
Desnaturalizacion
Despues de que la muestra se recoge en un medio de recogida a base de detergente como se ha descrito anteriormente, la muestra puede tratarse con un reactivo de desnaturalizacion para hacer que la molecula de acido nucleico diana sea accesible a la hibridacion. En un aspecto, la muestra se desnaturaliza con una solucion alcalina. Se puede usar cualquier alcali que pueda llevar un pH de solucion a aproximadamente pH 12, aproximadamente pH 13 o aproximadamente pH 14. Ademas, se puede usar cualquier alcali que pueda llevar un pH de solucion a un intervalo de aproximadamente pH 12 a aproximadamente pH 13, de aproximadamente pH 12 a aproximadamente pH 14 y de aproximadamente pH 13 a aproximadamente pH 14. Las concentraciones adecuadas de alcali incluyen de aproximadamente 1,0 N a aproximadamente 2,0 N, de aproximadamente 1,25 N a aproximadamente 1,75 N, y de aproximadamente 1,25 N a aproximadamente 1,5 N, y aproximadamente 1,5 N, asf como cualquier numero dentro de los intervalos citados. Sin limitarse, los alcalis adecuados incluyen NaOH y KOH.
En un ejemplo, aproximadamente un volumen de la muestra suspendida en un medio de recogida a base de detergente puede tratarse con aproximadamente medio volumen de solucion de NaOH 1,75 N. Por ejemplo, en ciertos aspectos aproximadamente una almuota de 50 pl se elimina de una muestra suspendida en un medio de recogida a base de detergente y aproximadamente 25 pl de solucion de NaOH 1,75 N se anaden a la muestra de almuota de 50 pl. A temperatura ambiente, la muestra tratada con el reactivo de desnaturalizacion se puede mezclar mezclando a mano o agitando mecanicamente a aproximadamente 800 rpm, aproximadamente 900 rpm, aproximadamente 1000 rpm, entre aproximadamente 600 y aproximadamente 1000 rpm, o entre aproximadamente 600 y 1200 rpm. El pH de la muestra despues de la adicion del reactivo de desnaturalizacion puede ser de aproximadamente 14. En otro aspecto, el pH puede ser de aproximadamente pH 12 o pH 13. Dicho pH basico cortara y desnaturalizara la mayona del acido nucleico en la muestra. Ademas, el tratamiento alcalino puede interrumpir las interacciones entre peptidos y acidos nucleicos para mejorar la accesibilidad del acido nucleico diana y degradar la protema.
El tratamiento alcalino de la protema homogeneiza eficazmente la muestra para asegurar la reproducibilidad de los resultados del analisis para una muestra dada. Tambien puede reducir la viscosidad de la muestra para aumentar la cinetica, homogeneizar la muestra y reducir el fondo mediante la destruccion de cualquier acido nucleico endogeno de ARN de cadena sencilla, tubridos de ADN-ARN o tubridos de ARN-ARN en la muestra. Tambien ayuda a inactivar enzimas tales como RNasas y DNasa que pueden estar presentes en la muestra. Un experto en la materia apreciana que si ARN es el acido nucleico diana (en oposicion al ADN), pueden ser preferibles diferentes reactivos, incluyendo, pero sin limitarse a, extraccion con fenol y precipitacion con TCA/acetona, y extraccion con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo.
Pueden emplearse otros metodos de desnaturalizacion tales como la utilizacion de una etapa de calentamiento, por ejemplo, calentamiento de la muestra a aproximadamente 95°C para separar las cadenas de acido nucleico. Tambien se pueden usar enzimas como la helicasa.
En un aspecto, se anade NaOH de 1,5 N a 2,0 N a la muestra y se calienta. En otro aspecto, se anade NaOH 1,75 N a la muestra y se calienta. La muestra con reactivo de desnaturalizacion se puede calentar a aproximadamente de 60°C a 80°C durante aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 65°C a aproximadamente 75°C durante aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 67°C a aproximadamente 70°C durante aproximadamente 30 minutos, o a aproximadamente 70°C durante aproximadamente 30 minutos, o cualquier numero dentro de los intervalos citados. En otro aspecto, la muestra con reactivo de desnaturalizacion se calienta a aproximadamente
60°C a aproximadamente 80°C durante aproximadamente 20 a aproximadamente 40 minutos, o aproximadamente
65°C a aproximadamente 75°C durante aproximadamente 20 a aproximadamente 40 minutos, a aproximadamente
67°C a aproximadamente 70°C durante aproximadamente 20 a aproximadamente 40 minutos, o aproximadamente
70°C durante aproximadamente 20 a aproximadamente 40 minutos, o cualquier numero dentro de los intervalos citados. El objetivo de las condiciones de tiempo y temperatura descritas es proporcionar una desnaturalizacion maxima de la muestra en una cantidad minima de tiempo, dejando el acido nucleico diana en una condicion adecuada para llevar a cabo las etapas restantes de hibridacion, captura, lavado y deteccion. Por lo tanto, la muestra puede calentarse en el reactivo de desnaturalizacion durante aproximadamente 5 a aproximadamente 120 minutos, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 30 minutos, o cualquier numero dentro de los intervalos citados. Los expertos en la materia entenderan facilmente que pueden equilibrarse penodos mas largos de incubacion a temperaturas mas bajas o penodos mas cortos de incubacion a temperaturas mas altas para proporcionar un efecto similar a las condiciones descritas en la presente memoria.
Hibridacion e union de sondas
Despues de desnaturalizar la muestra que contiene el acido nucleico, se pone en contacto con una o mas sondas polinucleotfdicas bajo una condicion suficiente para que una o mas sondas polinucleotfdicas se hibriden con el acido nucleico diana en la muestra para formar un tubrido de acido nucleico bicatenario. La sonda puede ser ADN de
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longitud completa, truncado o sintetico o ARN de longitud completa, truncado o sintetico. Si el acido nucleico diana es ADN, entonces la sonda puede ser ARN y si el acido nucleico diana es ARN, entonces la sonda puede ser ADN. Preferiblemente, la o las sondas polinucleotidicas se diluyen en un diluyente de sonda que tambien puede actuar como un tampon de hibridacion neutralizante (para neutralizar el reactivo de desnaturalizacion basico).
El diluyente de la sonda utilizado para las sondas de ADN o ARN diferira debido a los diferentes requisitos necesarios para la estabilidad del aDn frente al ARN. Por ejemplo, si las sondas son ARN, es preferible neutralizar primero la muestra y anadir la sonda o bien anadir la sonda de ARN y el agente neutralizante (diluyente de la sonda) a la muestra al mismo tiempo ya que el NaOH puede destruir el ARN. El diluyente de la sonda se puede usar para disolver y diluir la sonda y tambien ayudar a restaurar la muestra a aproximadamente un pH neutro, por ejemplo, de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 9, para proporcionar un entorno mas favorable para la hibridacion. Se puede utilizar un volumen suficiente de diluyente de la sonda, preferiblemente la mitad del volumen de la muestra, para neutralizar la muestra tratada con base.
En un aspecto, el diluyente de la sonda comprende un tampon, acido poliacnlico, NaOH y azida de sodio. El diluyente de la sonda puede comprender acido acetico. En un aspecto, el diluyente de la sonda comprende 2,2 M de BES (acido N,N-Bis (2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico), acido poliacnlico (PAA) 2,6%, NaOH 0,7 N y azida sodica al 0,05%. El diluyente de la sonda puede contener de aproximadamente 1,2 M a aproximadamente 2,6 M de BES, de aproximadamente 1,5 M a aproximadamente 2,5 M de BES; desde aproximadamente 1,75 M hasta aproximadamente 2,25 M BES; desde aproximadamente 2 M hasta 2,4 M de BES, o aproximadamente 2,2 M de BES, asf como cualquier numero dentro de los intervalos citados. En un aspecto, el diluyente de la sonda puede contener de aproximadamente 2% a aproximadamente 3,0% de PAA o, asf como cualquier numero dentro de los intervalos citados. En otro aspecto, la concentracion de PAA es de aproximadamente 2,2% a aproximadamente 2,7%. En aun otro aspecto, la concentracion de PAA es de aproximadamente 2,6%. En un aspecto adicional, el diluyente de la sonda puede contener de aproximadamente 0,6 N a aproximadamente 0,8 N de NaOH, por ejemplo, aproximadamente 0,7 N de NaOH. La concentracion de NaOH aumenta generalmente a medida que aumenta la cantidad de BES.
Para las sondas de longitud completa, se puede anadir una solucion alcalina calentada a la muestra, a continuacion se puede anadir el diluyente de la sonda a la muestra a temperatura ambiente y, a continuacion, se puede recalentar la muestra. Tal proceso puede inhibir la formacion de la estructura secundaria. Los anticuerpos tienden a unirse irreversiblemente a estructuras con estructura secundaria. Cuando se utilizan sondas no de longitud completa tales como sondas truncadas o sinteticas, el calentamiento de las soluciones o muestra puede no ser necesario debido a que los problemas de las estructuras secundarias no estan presentes. En un aspecto, la muestra no se calienta cuando se usa con sondas truncadas o sinteticas.
Despues del tratamiento con el reactivo de desnaturalizacion, se puede anadir a la muestra, en condiciones apropiadas, una alfcuota de tampon de neutralizacion, en un aspecto del diluyente de la sonda descrito, en el que se disuelven una o mas sondas, para permitir la hibridacion o union de la sonda y el acido nucleico diana. El tampon de neutralizacion puede contener una sola sal de tampon. En un aspecto, el tampon de neutralizacion no contiene mas de una sal tamponante unica. La condicion de hibridacion es suficiente para permitir que una o mas sondas polinucleotidicas se hibriden con una correspondiente secuencia de acido nucleico complementaria, si esta presente, en la muestra para formar un hforido de acido nucleico bicatenario.
Se emplean condiciones de hibridacion adecuadas para las sondas y diluyentes particulares descritos en la presente memoria. Por ejemplo, las sondas y los acidos nucleicos de la muestra pueden incubarse durante un tiempo de hibridacion, preferiblemente de al menos aproximadamente 5 a aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 minutos, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 minutos, o aproximadamente 10 minutos, asimismo como cualquier numero dentro de los intervalos citados suficientes para permitir que una o mas sondas polinucleotfdicas se hibriden con una secuencia de acido nucleico complementaria correspondiente. La condicion de hibridacion puede incluir una temperatura de hibridacion de al menos aproximadamente 65°C, de aproximadamente 68,5°C y de aproximadamente 67°C a aproximadamente 70°C, asf como cualquier numero dentro de los intervalos citados. Para un acido nucleico diana dado y una sonda dada, un experto en la tecnica puede determinar facilmente las condiciones de hibridacion deseadas mediante experimentacion rutinaria. Un experto en la tecnica apreciara ademas que el tiempo y la temperatura de hibridacion deben optimizarse, uno con respecto al otro. Asf, temperaturas de hibridacion mas altas pueden llevarse a cabo durante penodos de tiempo mas cortos y viceversa. Sin ser limitadas, las condiciones de hibridacion rigurosas pueden controlarse aumentando la temperatura, aumentando las condiciones ionicas por encima de 0,5 M (por ejemplo, NaCl) o reduciendo la concentracion de PAA. Como ejemplo no limitativo, las condiciones de hibridacion rigurosas pueden incluir la realizacion de una reaccion de hibridacion a temperaturas elevadas, tal como de al menos aproximadamente 65°C, al menos aproximadamente 68,5°C, entre aproximadamente 67°C y aproximadamente 70°C, y entre aproximadamente 69°C y aproximadamente 70°C. Las condiciones de hibridacion rigurosas tambien pueden incluir temperaturas elevadas, tales como de al menos aproximadamente 65°C, al menos aproximadamente 68,5°C y entre aproximadamente 67°C y aproximadamente 70°C.
En un aspecto no limitativo, la sonda es capaz de hibridar o unirse a moleculas de acido nucleico al menos 70%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos
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98%, al menos 99%, o 100% identicas a moleculas de acido nucleico asociadas con VPH, variantes geneticas de VPH, ADN de VPH de un tipo de VPH de alto riesgo, o ARN de VPH de un tipo de VPH de alto riesgo o cualquiera de los tipos de VPH de alto riesgo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 82 o cualquiera de los tipos de VPH de bajo riesgo 6, 11, 40, 43, 53, 61, 67, 69, 70, 71, 72, 81 y 83. En otro aspecto, la sonda es complementaria a VPH, variantes geneticas de VPH, ADN de VPH de un tipo de VPH de alto riesgo, ARN de VPH de un tipo de VPH de alto riesgo, o cualquiera de los tipos de VPH de alto riesgo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 82 o cualquiera de los tipos de VpH de bajo riesgo 6, 11, 40, 43, 53, 61, 67, 69, 70, 71, 72, 81 y 83.
En un aspecto, la muestra se suspende en un medio de recogida a base de detergente, el acido nucleico diana se desnaturaliza con un reactivo de desnaturalizacion y se hibrida con sondas de acido nucleico suspendidas en un tampon neutralizante. En otro aspecto, el tampon de neutralizacion es el diluyente de la sonda de la presente invencion. El diluyente de la sonda puede comprender 2,2 M de BES (acido N,N-bis(2-hidroxietil)-2- aminoetanosulfonico), acido poliacnlico al 2,6%, NaOH 0,7 N y azida de sodio al 0,05%.
Captura
Despues de permitir que las sondas se hibriden con la molecula de acido nucleico diana y formen un hnbrido de acido nucleico bicatenario, el hnbrido es capturado por una molecula que es espedfica para el hnbrido de acido nucleico bicatenario. Las moleculas espedficas para los hnbridos de acido nucleico bicatenarios incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, protemas tales como, pero sin limitarse a, RNAsa H, acidos nucleicos incluyendo, pero sin limitacion, aptameros o acidos nucleicos espedficos de secuencia. Los aptameros son tramos cortos de secuencias aleatorias que se seleccionan sucesivamente a partir de una biblioteca de secuencias por hibridacion con un objetivo, amplificacion de los aptameros hibridados y repeticion del proceso de seleccion. En un aspecto, la molecula espedfica para el hnbrido de acido nucleico bicatenario es capturada por un anticuerpo, conocido como anticuerpo antihnbrido.
En un aspecto, un primer anticuerpo antihnbrido se inmoviliza sobre un soporte usando tecnicas que son estandar en la tecnica. Ejemplos de soportes adecuados incluyen enlaces covalentes o adsorcion, por ejemplo, interacciones protema-protema, perlas de protema G, interaccion biotina-estreptavidina, EDAC para enlazar con un grupo carboxilo o tosilo, etc., o hibridacion directamente sobre el soporte solido usando, Por ejemplo, acidos nucleicos espedficos de secuencia en una columna de afinidad.
Los soportes incluyen, pero no se limitan a perlas, perlas magneticas, que como se ha indicado anteriormente incluyen perlas paramagneticas, diamagneticas, ferromagneticas, ferromagneticas y diamagneticas, columnas, placas, papel de filtro, polidimetilsiloxano (PDMS) y varillas de medicion. Puede utilizarse cualquier soporte siempre y cuando permita la extraccion de la fase lfquida y proporcione la capacidad de separar los anticuerpos unidos y no unidos. Las perlas magneticas son particularmente utiles porque pueden dejarse en la solucion y la fase lfquida puede extraerse o decantarse, si se aplica un campo magnetico para inmovilizar las perlas. Se prefieren perlas que sean pequenas y tengan un area superficial alta, tales como perlas de aproximadamente 1 pm de diametro. Tambien se pueden usar otras perlas que emplean conmutacion de carga o captura de sflice (en oposicion a campos magneticos).
Los hnbridos se incuban con el anticuerpo antihnbrido unido al soporte durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir la captura de los hnbridos de acido nucleico bicatenarios por los anticuerpos antihnbridos inmovilizados. En un aspecto, el soporte es una perla.
El anticuerpo antihnbrido puede ser monoclonal o policlonal. En un aspecto, el anticuerpo es monoclonal. En un aspecto, el anticuerpo se acopla al soporte mediante un enlace de hidrocloruro de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil]carbodiimida (EDAc). En un aspecto, el soporte es una perla de poliestireno. En un aspecto, el soporte o la perla acoplada al anticuerpo se diluye en un tampon de dilucion de perlas. El tampon de dilucion de perlas es util para minimizar la desnaturalizacion de las protemas en la perla. Un ejemplo de un tampon de dilucion de perlas comprende 6% de casema, 100 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl y 0,05% de azida de sodio.
En un aspecto, las perlas recubiertas con el anticuerpo antihnbrido se incuban con la muestra a aproximadamente 67°C a aproximadamente 70°C durante aproximadamente 30 minutos. En otro aspecto, las perlas y la muestra se incuban a aproximadamente 68°C a aproximadamente 69°C durante aproximadamente 30 minutos. En otro aspecto mas, las perlas y la muestra se incuban a aproximadamente 68,5°C durante 30 minutos. El tiempo de incubacion puede oscilar desde aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 60 minutos, desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 45 minutos, desde aproximadamente 20 minutos hasta aproximadamente 40 minutos, o cualquier numero dentro de los intervalos citados, y es generalmente inversamente proporcional a la temperatura. Los expertos en la tecnica entenderan que el tiempo de incubacion, la temperatura y/o las condiciones de agitacion pueden variar para conseguir cineticas de captura alternativas, segun se desee.
Despues de la captura del hnbrido acido nucleico/sonda diana tal como se ha descrito anteriormente, el hnbrido capturado se puede separar del resto de la muestra por lavado de los acidos nucleicos no capturados.
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Conjugacion
Otra etapa en el metodo puede implicar proporcionar un segundo anticuerpo que tambien es espedfico para hforidos de acidos nucleicos de doble cadena o, alternativamente, es espedfico para el primer anticuerpo. El segundo anticuerpo puede marcarse de forma detectable, directa o indirectamente, y puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal. En un aspecto, el segundo anticuerpo es monoclonal. En otro aspecto, el segundo anticuerpo esta marcado directamente con un marcador detectable y es monoclonal. El segundo anticuerpo se utiliza para detectar la presencia de dbridos de acido nucleico bicatenarios. En un aspecto, el segundo anticuerpo tiene un marcador que debe reaccionar con un sustrato para proporcionar una senal que puede ser detectada. El segundo anticuerpo puede disolverse en un tampon adecuado. En un aspecto, el tampon comprende TrisHCl 100 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, ZnCl2 0,1 mM, MgCh 1,0 mM, Tween 20 al 0,25%, RNasa A 0,2 mg/ml, hidroxipropil-b-ciclodextrina al 4% (ciclodextrina), tampon de dilucion de perlas al 30% tal como se discutio anteriormente, 0,05% de IgG de cabra, 0,05% de azida de sodio.
En un aspecto, la reaccion de conjugacion tiene lugar a temperatura ambiente. En un aspecto, la reaccion de conjugacion tiene lugar a temperatura ambiente durante entre aproximadamente 1 hora y 2 horas. En otro aspecto, la reaccion de conjugacion tiene lugar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. En otro aspecto, la reaccion de conjugacion tiene lugar a aproximadamente 37°C, aproximadamente 45°C o aproximadamente 50°C. En un aspecto, la reaccion de conjugacion tiene lugar a aproximadamente 37°C, aproximadamente 45°C, o aproximadamente 50°C, entre 35°C y aproximadamente 40°C, entre 40°C y aproximadamente 50°C durante entre aproximadamente 20 minutos y 40 minutos. En un aspecto, la reaccion de conjugacion tiene lugar a aproximadamente 37°C, aproximadamente 45°C, o aproximadamente 50°C durante entre aproximadamente 20 minutos y 40 minutos. En otro aspecto, la reaccion de conjugacion tiene lugar a aproximadamente 45°C durante aproximadamente 30 minutos.
Los expertos en la tecnica entenderan que puede usarse cualquier marcador detectable tal como, pero no limitado a, una enzima, molecula radiactiva, molecula fluorescente o partmula metalica tal como partmula de oro. En ciertos aspectos, el marcador detectable es fosfatasa alcalina. Se conocen metodos de conjugacion de un marcador a un anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede reducirse con ditiotreitol (DTT) para producir fragmentos de anticuerpo monovalentes. El anticuerpo reducido puede ser entonces directamente conjugado a la fosfatasa alcalina maleinada por los metodos de Ishikawa et al, J. Immunoassay 4: 209-237 (1983) y Means et al, Chem. 1: 2-12 (1990), y el conjugado resultante puede purificarse por HPLC. El conjugado tambien puede purificarse usando cualquier tipo de cromatograffa de exclusion de tamano. Una ventaja de la purificacion es que los conjugados de una protema a un anticuerpo pueden separarse de aquellos conjugados con otras proporciones de protema a anticuerpo.
En otro aspecto, los dbridos de acido nucleico bicatenarios pueden detectarse con un segundo anticuerpo antidbrido que no esta marcado directamente. Por ejemplo, el segundo anticuerpo puede ser una inmunoglobulina de raton que se detecta mediante un anticuerpo anti-raton de cabra marcado.
Lavado
Despues de la conjugacion con el segundo anticuerpo, la muestra se lava con un tampon de lavado basado. El tampon de lavado puede contener uno o mas detergentes o puede estar libre de un detergente. Si el tampon de lavado contiene un detergente, el detergente puede ser un detergente ionico o no ionico. Un ejemplo de un detergente no ionico es Triton-X. El detergente puede estar presente en el tampon de lavado a una concentracion de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 1,5%, o de aproximadamente 0,075% a aproximadamente 1,0%, o de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,75%, o aproximadamente 0,5% o cualquier numero dentro de los intervalos citados. Un ejemplo de un tampon de lavado adecuado comprende Tris 40 mM, pH 8,2, NaCl 100 mM, Triton-X100 al 0,5% y azida de sodio al 0,05%.
La muestra puede lavarse con el tampon de lavado de una a diez veces, o de tres a siete veces, o de cuatro a seis veces, o cinco veces, o cualquier numero dentro de los intervalos citados. La muestra tambien puede lavarse con un solo tampon de lavado o con multiples tampones de lavado. Cada lavado puede usar el mismo tampon de lavado o un tampon de lavado diferente. Por ejemplo, se puede usar un tampon de lavado que contiene detergente para un lavado mientras que se puede usar un tampon de lavado sin detergente para otro lavado. En un aspecto, uno de los tampones de lavado no incluye Triton.
Un beneficio del tampon de lavado que contiene detergente es los efectos positivos sobre el comportamiento de las perlas cuando se compara con tampones de lavado libres de detergente. El tampon de lavado que contiene detergente permite una union rapida, eficiente y resilente de las perlas al campo magnetico. La union de las perlas al campo magnetico es suficientemente fuerte para que las perlas permanezcan unidas mediante inversion ffsica y decantacion. Aunque los tampones de lavado libres de detergente generalmente no permiten la inversion ffsica sin perdida de perlas, pueden usarse para otros propositos. Un ejemplo del uso de un tampon de lavado libre de detergente es retirar o diluir un detergente en la muestra, reduciendo asf cualquier problema de deteccion probable.
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Deteccion
El marcador presente en el segundo o tercer, o mas anticuerpo se detecta para indicar asf la presencia de la molecula de acido nucleico diana. En la tecnica se conocen metodos para detectar diversos marcadores. Por ejemplo, los procedimientos de colorimetna, radiactividad, resonancia de plasmon de superficie o quimioluminiscencia se describen por ejemplo, Coutlee et al., J. Clin. Microbiol. 27: 1002-1007 (1989).
Por ejemplo, un conjugado de fosfatasa alcalina unida puede detectarse por quimioluminiscencia con un reactivo tal como un reactivo LUMI-PHOS 530 (Lumigen, Detroit, MI) o DR2 (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando un detector tal como un luminometro E/LUMINA (Source Scientific Systems, Inc., Garden Grove, CA), un luminometro OPTOCOMP I (MGM Instruments, Hamden, CT), o similares, tal como un Veritas Microplate Luminometer de Turner Biosystems. Las tecnicas de deteccion multiple tambien pueden usarse en secuencia o en paralelo. Por ejemplo, el conjugado puede ser detectado por quimioluminiscencia y fluorescencia. En otro aspecto, el conjugado puede ser detectado por quimioluminiscencia.
Los detectores que utilizan diferentes tecnicas de deteccion para el conjugado pueden ser reversibles o irreversiblemente unidos, por ejemplo de manera modular, a una maquina que sea capaz de realizar el metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra.
Como se describe en el presente documento, la deteccion del marcador en el segundo anticuerpo es indicativa de la presencia de una o mas de las moleculas de acido nucleico diana en la muestra que son complementarias a una o mas sondas. Despues del lavado, la muestra se suspende en un tampon de deteccion que contiene, por ejemplo, el sustrato para el marcador en el segundo anticuerpo.
En un aspecto, la muestra esta compuesta de celulas cervicales. El metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra de celulas cervicales comprende suspender la muestra en un medio de recogida a base de detergente y mezclar mezclando a mano. En otro aspecto, la mezcla es mecanica. Se separa una alfcuota de aproximadamente 50 pl de la muestra y se mezcla con aproximadamente 25 pl de un reactivo de desnaturalizacion. La muestra se mezcla mezclando a mano o agitando mecanicamente entre aproximadamente 600 a aproximadamente 1200 rpm durante aproximadamente 30 a aproximadamente 60 segundos y se calienta a aproximadamente 70°C durante aproximadamente 30 minutos. Las sondas de ARN de VPH de alto riesgo se preparan en un diluyente y se diluyen a aproximadamente 375 ng/ml. Se anaden aproximadamente 40 pl de la sonda diluida a la muestra en un bloque de calentamiento de 70°C. Las muestras se incuban adicionalmente a aproximadamente 68,5°C con agitacion a aproximadamente 1150 rpm durante aproximadamente 30 minutos. El sobrenadante puede eliminarse mediante una botella cuentagotas u otro dispositivo de baja tecnologfa. Se anaden aproximadamente 35 pl del reactivo de deteccion a la muestra. El reactivo de deteccion contiene un segundo anticuerpo que esta marcado. El segundo anticuerpo es espedfico para Idbridos de acido nucleico bicatenarios. La muestra que contiene el reactivo de deteccion se incuba a aproximadamente 45°C durante aproximadamente 30 minutos, se coloca en un estante magnetico durante aproximadamente 30 segundos a 3 minutos y el sobrenadante se decanta. En otro aspecto, la muestra que contiene el reactivo de deteccion se incuba a temperatura ambiente. Despues, la muestra se lava con tampon de lavado aproximadamente cuatro o cinco veces.
Anticuerpos antildbridos
Los Idbridos de acido nucleico bicatenarios formados de acuerdo con la presente invencion pueden ser capturados y detectados usando anticuerpos que son espedficos para Idbridos de acido nucleico de doble cadena. El anticuerpo es espedfico para Idbridos de doble hebra, tales como, pero sin limitarse a, ARN-ADN; ADN-ADN; ARN-ARN; y sus mfmicos, en los que los mfmicos se refieren a moleculas que se comportan de forma similar a los Idbridos de ARN- ADN, ADN-ADN o ARN-ARN. El anticuerpo Idbrido de acido nucleico de doble hebra, es decir, el anticuerpo antildbrido que se utiliza dependera del tipo de Idbrido de acido nucleico bicatenario formado. En un aspecto, el anticuerpo antildbrido es inmunoespedfico a Idbridos de ARN-ADN.
Los expertos en la tecnica entenderan que anticuerpos antildbridos policlonales o monoclonales pueden ser utilizados y/o acoplados a perlas y/o inmovilizados sobre un soporte en el presente ensayo como se describe a continuacion. El anticuerpo monoclonal preparado usando tecnicas estandar se puede usar en lugar de los anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por metodos que son estandar en la tecnica. En un aspecto, los anticuerpos utilizados para la captura y deteccion del acido nucleico diana son anticuerpos monoclonales. En un aspecto, los anticuerpos monoclonales soportan altas temperaturas de incubacion durante la etapa de captura. Sin ser limitadas, las temperaturas de incubacion de alta rigurosidad durante la etapa de captura pueden estar entre aproximadamente 65°C a aproximadamente 75°C o entre aproximadamente 68°C y aproximadamente 75°C. El primer y el segundo anticuerpos pueden ser iguales para la captura y la deteccion (es decir, producidos por la misma lmea celular de mieloma Idbrido) o pueden ser diferentes y producidos por diferentes lmeas celulares de mieloma Idbrido. En un aspecto, el primer y el segundo anticuerpos monoclonales utilizados para la captura y/o la deteccion son los mismos y son espedficos para Idbridos de ARN-ADN. Tambien se incluyen inmunofragmentos o derivados de anticuerpos espedficos para Idbridos bicatenarios, en los que dichos fragmentos o derivados contienen regiones de union del anticuerpo.
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Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo dbrido monoclonal anti-ARN-ADN derivado de celulas de mieloma fusionadas a celulas de bazo que estan inmunizadas con un dbrido de ARN-ADN. El anticuerpo espedfico dbrido puede purificarse por purificacion por afinidad contra Idbridos de ARN-ADN inmovilizados sobre un soporte solido, por ejemplo, como se describe en Kitawaga et al., Mol. Immunology, 19: 413 (1982); y la Patente de Estados Unidos N° 4.732.847.
Se pueden usar otros metodos adecuados para producir o aislar anticuerpos, incluyendo anticuerpos humanos o artificiales, incluyendo, por ejemplo, metodos que seleccionan anticuerpos recombinantes (por ejemplo, Fv o Fab de cadena sencilla, u otros fragmentos de los mismos) de una biblioteca o que dependen, tras la inmunizacion, de animales transgenicos (por ejemplo, ratones) capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos (vease, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255 (1993); y Pat. de EE.UU. N° 5.545.806 y Patente de EE.UU. N° 5.545.807).
En un aspecto, el acido nucleico diana a detectar es ADN (por ejemplo, ADN genomico de VPH o ADNc) o ARN (por ejemplo, ARNm, ARN ribosomico, ARN nuclear, ARN de transferencia, ARN viral, ARN nuclear heterogeneo) en el que la una o mas sondas polinucleotfdicas son polirribonucleotidos o polidesoxirribonucleotidos, respectivamente. En un aspecto preferido, los dbridos de acido nucleico bicatenarios son dbridos de ADN-ARN formados por hibridacion de aDn diana y ARN sonda, y pueden ser detectados usando un anticuerpo que sea inmunoespedfico a dbridos de ARN-ADN.
En un aspecto de la presente invencion, se utiliza un anticuerpo dbrido monoclonal anti-ARN-ADN derivado de una lmea celular de hibridoma. Tales lmeas celulares de hibridoma se describen en la Patente de EE.UU. N°. 4.865.980, Patente de EE.UU. N°. 4.732.847, y la Patente de EE.UU. N°. 4.743.535. Los anticuerpos monoclonales espedficos de dbridos se pueden preparar usando tecnicas que son estandar en la tecnica. El anticuerpo monoclonal especifico para dbridos se puede usar para capturar y detectar el acido nucleico diana.
Mientras que cualquier vertebrado puede ser utilizado para la preparacion de anticuerpos dbridos policlonales anti- ARN-ADN, se prefieren los de cabras o conejos. Preferiblemente, se inmuniza una cabra o conejo con un hfbrido poli (A)-poli(dT) sintetico inyectando el hfbrido en el animal de acuerdo con los procedimientos de inyeccion convencionales. Los anticuerpos policlonales se pueden recoger y purificar de la sangre del animal con anticuerpos espedficos para la especie del animal inmunizado de acuerdo con tecnicas de aislamiento de anticuerpos bien conocidas. Para la produccion de anticuerpos monoclonales, el bazo puede ser eliminado del animal despues de una cantidad de tiempo suficiente, y los esplenocitos pueden fusionarse con las celulas de mieloma apropiadas para producir los hibridomas. Los hibridomas pueden entonces ser seleccionados para la capacidad de secretar el anticuerpo antidbrido. Los hibridomas seleccionados se pueden utilizar entonces para la inyeccion en la cavidad peritoneal de un segundo animal para la produccion de fluido asdtico, que puede extraerse y utilizarse como una fuente enriquecida de los anticuerpos monoclonales deseados incorporados en este documento como referencia.
Sondas de polinucleotidos
Las sondas polinucleotfdicas estan disenadas para hibridarse o unirse con las moleculas de acido nucleico diana. En otro aspecto, las sondas polinucleotfdicas estan disenadas para unirse a moleculas de acido nucleico diana. En un aspecto, las sondas son capaces de hibridarse o unirse a variantes de alto riesgo de VPH y VPH. En un aspecto adicional, las sondas polinucleotfdicas son espedficas para las variantes de alto riesgo de vPh y VPH. Las sondas de acido nucleico de alto riesgo (HR) pueden incluir sondas para tipos de alto riesgo de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 82. En otros aspectos, las sondas de ARN o ADN son fragmentos. En un aspecto, las sondas tienen de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 kilobases de longitud, preferiblemente aproximadamente 7,5 kilobases, y pueden producirse usando un molde de plasmido usando un vector BLUESCRIPT. Sin embargo, otros plasmidos, vectores y metodos son conocidos en la tecnica y tambien podnan usarse para producir las sondas de ARN descritas en la presente memoria.
Las sondas pueden variar en una cantidad de aproximadamente 7,5 ng a aproximadamente 60 ng por tipo de VPH por ensayo, o de aproximadamente 20 ng a aproximadamente 45 ng por tipo de VPH por ensayo, o aproximadamente 30 ng de sonda para cada tipo de VPH por ensayo. Por lo tanto, en un aspecto, las sondas de HR consisten en o constan esencialmente de una o mas sondas para tipos de alto riesgo de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 , y 82 o los tipos 6, 11, 40, 43, 53, 61, 67, 69, 70, 71, 72, 81, y 83 del VPH de bajo riesgo, en los que se utilizan aproximadamente 30 ng de cada sonda por ensayo para la deteccion de la molecula de acido nucleico diana.
Las sondas de ARN pueden ser sondas cortas de ARN sintetico que se unen espedficamente solo a la molecula de acido nucleico diana. Ejemplos se describen en la solicitud de Pat. de EE.UU. N° 12/426.076, presentada el 17 de abril de 2009, cuyo contenido se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.
Reactividad cruzada
La presente invencion tambien proporciona composiciones de ensayo, sondas y condiciones en las que la reactividad cruzada entre conjuntos de sondas HR de VPH y tipos de VPH de bajo riesgo se reduce drasticamente cuando se compara con el ensayo estandar de VPH aprobado por la FDA y el conjunto de sondas. En un aspecto, el
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conjunto de sondas de HR de VPH se selecciona del grupo que consiste en tipos de alto riesgo de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 82 o los tipos 6, 11, 40, 43, 53, 61,67, 69, 70, 71, 72, 81 y 83 del VPH de bajo riesgo. Usando el presente ensayo con estas sondas VPH de HR, se reduce la reactividad cruzada entre los tipos de VPH de bajo riesgo y las sondas de VPH de alto riesgo. Vease, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. N° 12/426.076.
La presente invencion tambien proporciona un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana, tal como VPH, en una muestra en aproximadamente 2 horas o menos, aproximadamente 2,5 horas o menos, aproximadamente 3 horas o menos, aproximadamente 3,5 horas o menos, aproximadamente 4 horas o menos, aproximadamente 5 horas o menos, aproximadamente 6 horas o menos, aproximadamente 7 horas o menos, aproximadamente 8 horas o menos, aproximadamente 12 horas o menos, aproximadamente 24 horas o menos, en otros aspectos, menos de aproximadamente 3,5 horas para al menos 10 muestras usando los metodos discutidos anteriormente. Una razon por la que la presencia de VPH u otras moleculas de acido nucleico diana se puede determinar en cortos penodos de tiempo es porque el metodo no amplifica la molecula de acido nucleico diana antes de la deteccion. En lugar de la amplificacion de la diana, se puede usar la amplificacion de la senal para detectar con precision la presencia de VPH u otras moleculas de acido nucleico diana. En un aspecto, los metodos de la descripcion pueden incluir una etapa de amplificacion de senal. En un aspecto, los metodos de la descripcion no incluyen una etapa de amplificacion de la diana. En otro aspecto, los metodos de la descripcion pueden incluir una etapa de amplificacion de senal y ninguna etapa de amplificacion de la diana.
La presente descripcion tambien proporciona metodos y ensayos para detectar un cancer, por ejemplo, un cancer cervical, detectando la presencia de una molecula de acido nucleico diana, tal como VPH, en una muestra en aproximadamente 2 horas o menos, aproximadamente 2,5 horas o menos, aproximadamente 3 horas o menos,
aproximadamente 3,5 horas o menos, aproximadamente 4 horas o menos, aproximadamente 5 horas o menos,
aproximadamente 6 horas o menos, aproximadamente 7 horas o menos, aproximadamente 8 horas o menos, aproximadamente 12 horas o menos, aproximadamente 24 horas o menos, en otros aspectos, menos de aproximadamente 3,5 horas para al menos 10 muestras usando los metodos y ensayos discutidos anteriormente.
Los expertos en la tecnica entenderan que la presente invencion puede llevarse a cabo en un numero de
plataformas incluyendo, pero sin limitarse a, tubos, varillas de medicion, microarrays, microplacas, placas de 384
pocillos, otras placas de microlitros y sistemas microflmdicos. Los expertos en la tecnica entenderan que la presente, como pertinente para pafses en desarrollo, puede utilizar metodos de baja tecnologfa tales como botellas cuentagotas, bombillas de caucho, pipetas Pasteur o botellas de chorros para los pasos que implican el movimiento de lfquidos. Estos dispositivos proporcionan volumenes relativamente precisos dentro de los rangos aproximados que son necesarios para el ensayo. En un aspecto, los metodos de la descripcion no incluyen pipetadores automaticos u otros dispositivos de pipeteo accionados por batenas o energfa.
Otro aspecto de la presente invencion proporciona un medio de recogida en el que se recogen muestras que contienen el acido nucleico diana. El medio de recogida proporciona estabilidad de la muestra durante varios dfas, varias semanas o varios meses. Por ejemplo, el medio de recogida puede proporcionar estabilidad a la muestra durante al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, desde aproximadamente 1 semana hasta alrededor de 4 semanas, desde aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 3 meses, desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 4 meses, o desde aproximadamente 3 meses hasta 6 meses. En otro aspecto, el medio de recogida proporciona estabilidad de la muestra durante al menos 21 dfas a 33°C o al menos 6 meses a 20°C. En un aspecto, la muestra anterior es una muestra de celulas cervicales o una muestra de celulas cervicales humanas. En este documento se describen medios de recogida adecuados. En un aspecto, el medio de recogida comprende, consiste en, o consiste esencialmente en NP-40, desoxicolato, Tris-HCl, EDTA, NaCl y azida sodica. En otros aspectos, el medio de recogida comprende, consiste en, o consiste esencialmente en 1,0% de NP-40, 0,25% de desoxicolato de sodio, 50 mM de Tris-HCl, 25 mM de EDTA, 150 mM de NaCl y 0,05% de azida sodica.
Otro aspecto es un tampon de lavado que contiene detergente que comprende, consiste en, o esta constituido esencialmente por Tris 40 mM pH 8,2, NaCl 100 mM, Triton X-100 del 0,1% al 0,5% y azida sodica al 0,05%. Todavfa otro aspecto es un tampon de lavado libre de detergente que comprende, consiste en, o esta constituido esencialmente por Tris 40 mM pH 8,2, NaCl 100 mM y azida sodica al 0,05%.
Conversion de la muestra para la recuperacion, deteccion y analisis de las moleculas de acido nucleico
Un aspecto se refiere a la adicion de un medio de recogida a una muestra que se ha preparado previamente para el analisis de diagnostico. En un aspecto, la muestra a la que se anade el medio de recogida se ha preparado previamente utilizando un ensayo de citologfa basado en lfquidos (LBC). Los medios LBC pueden contener fijadores tisulares, tales como alcohol y formalina, que sirven para estabilizar la muestra, inhibir el crecimiento bacteriano, preservar la morfologfa celular y los grupos de diagnostico y asegurar la preparacion de un portaobjetos de citologfa de monocapa de tejido. Sin embargo, muchas composiciones utilizadas para conservar muestras biologicas, tales como SUREPATH, contienen alcohol o formalina, lo que puede ser perjudicial para el analisis de moleculas de acido nucleico. En un aspecto, los portaobjetos citologicos contienen muestras de celulas cervicales o cualquier otra
muestra biologica capaz de ser evaluada. En un aspecto, el medio de SUREPATH se utiliza para preparar la muestra de LBC.
Ademas de la preparacion citologica, las muestras de LBC pueden utilizarse para la deteccion de trastornos, tales como los patogenos comunes de transmision sexual, entre ellos el virus del papiloma humano (VPH), Neisseria 5 gonorrhoeae (GC) y Chlamydia trachomatis (CT), entre otros. Como complemento a su aplicacion como herramienta de cribado, las muestras de LBC pueden usarse para monitorear el aclaramiento viral de los pacientes despues del tratamiento para una enfermedad en particular, dando informacion para los seguimientos posteriores y regfmenes de tratamiento. En un aspecto, la prueba de VPH de muestras de LBC puede usarse para monitorear el aclaramiento viral de los pacientes despues del tratamiento para una enfermedad cervical.
10 En un aspecto, se recoge una muestra biologica y se conserva en un medio, tal como el medio SUREPATH. El medio conservado que contiene la muestra biologica se almacena hasta que se requiera un procesamiento adicional. Los medios conservados que contienen la muestra biologica se pueden retirar y suspender en agua formando de este modo un "granulo blando". Una parte del granulo blando puede ser eliminada y analizada en un portaobjetos. En un aspecto, la muestra se prepara usando un ensayo lCb. En lugar de anadir mas medio de 15 conservacion, tal como el SUREPATH, a la suspension de granulos blandos restante, el medio de recogida basado en detergente descrito en la presente memoria puede anadirse a la muestra biologica restante. Esto es ventajoso porque una muestra dispersada en el medio de recogida a base de detergente descrito en el presente documento puede analizarse directamente en un ensayo de deteccion de moleculas de acido nucleico. Ademas, la muestra biologica suspendida en el medio de recogida a base de detergente es estable durante al menos 11 dfas a 20 temperatura ambiente (Fig. 6).
Cualquiera de los medios de recogida basados en detergentes descritos son capaces de ser anadidos al granulo blando. En otro aspecto, se puede usar un medio detergente y quelante para resolubilizar el granulo. En un aspecto no limitativo, un medio de recogida que incluye de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 2,0% de NP-40, de aproximadamente 0,10% a aproximadamente 0,40% de desoxicolato sodico, de aproximadamente 25 aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM de Tris-HCl, de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de EDTA, de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 200 mM de NaCl y de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,10% de azida sodica para solubilizar el granulo blando. Despues de la adicion del medio de recogida a base de detergente, la muestra de granulos blandos se puede analizar conjuntamente con cualquiera de los metodos o ensayos descritos en la presente memoria.
30 Kit
Tambien se proporciona un kit para la deteccion de una molecula de acido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el kit, que consiste en, o que consiste esencialmente en:
a) un medio de recogida;
b) un reactivo de desnaturalizacion;
35 c) al menos una sonda polinucleotfdica;
d) una perla recubierta con un primer anticuerpo antitnbrido;
e) un reactivo de deteccion que comprende un segundo anticuerpo anti-poli tnbrido, en el que el segundo anticuerpo esta marcado de forma detectable;
f) un tampon de lavado; y
40 g) un segundo reactivo de deteccion que comprende un sustrato para el marcador en el segundo anticuerpo.
El medio de recogida, el reactivo de desnaturalizacion, la perla, el primer y el segundo anticuerpo, las sondas de polinucleotidos, los reactivos de deteccion y los tampones de lavado se han descrito previamente.
El kit tambien puede incluir instrucciones para describir procedimientos asociados con los metodos y ensayos descritos. El kit tambien puede incluir un medio para transcribir la informacion del paciente. En un aspecto, el medio 45 incluye papel, un ordenador o un dispositivo capaz de transmitir informacion del paciente. El kit puede incluir todos los componentes necesarios para completar los metodos en el mismo lugar donde se toma la muestra del paciente.
En un aspecto, el kit puede incluir reactivos codificados por color asociados con el ensayo de deteccion. Los frascos de reactivo estan codificados por colores para facilitar su uso y se pueden incluir en un kit. Las botellas de reactivo tambien se pueden identificar mediante sfmbolos, letras u otros identificadores conocidos.
50 Como los componentes individuales del kit se juntan en una plataforma facil de usar, una ventaja del kit descrito en este documento es que proporciona pruebas inmediatas de muestras. Esto permite una rapida determinacion de los resultados de los pacientes.
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En un aspecto, los metodos de la descripcion pueden incluir la recogida y el procesamiento de muestras de pacientes en el campo. En un aspecto, despues de que se recojan las muestras, se llevan a cabo algunos de los pasos del metodo en el mismo lugar donde se recogen las muestras de pacientes. En otro aspecto, todos los pasos del metodo pueden llevarse a cabo en el mismo lugar donde se recogen las muestras. La ubicacion puede ser un pueblo, una clmica, un laboratorio, o area comunal donde las personas reciban chequeos medicos y evaluaciones. La ubicacion puede ser permanente o temporal. En un aspecto, la molecula de acido nucleico se detecta en un lugar, tal como un laboratorio o una clmica, que es diferente del lugar donde se toman las muestras. En un aspecto, el kit esta disenado para su uso en un pafs en desarrollo o areas geograficas donde el acceso a la atencion medica no esta facilmente disponible.
Sistema
En un aspecto, la muestra puede analizarse usando un sistema portatil para detectar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra. El sistema portatil puede incluir un calentador configurado para calentar multiples muestras; un luminometro configurado para detectar la quimioluminiscencia de una molecula de acido nucleico diana sobre un soporte recubierto con un primer anticuerpo y conjugado con un segundo anticuerpo marcado con un marcador detectable; y un monitor configurado para informar datos de quimioluminiscencia (Fig.7). En un aspecto, el calentador es un calentador/agitador de combinacion. En un aspecto, el sistema esta configurado para analizar simultaneamente 90 muestras a la vez junto con 6 controles (96 muestras en total). En un aspecto, tanto el luminometro como el calentador estan configurados para analizar simultaneamente 90 muestras a la vez junto con 6 controles (96 muestras en total). El sistema tambien es capaz de informar los resultados de al menos 500 muestras a la vez. El sistema portatil y los reactivos asociados se exponen en las Figs. 6, 7 y 8.
Sin ser limitados, los componentes individuales del sistema portatil pueden ser transportados facilmente por un individuo, tal como un medico o un tecnico de laboratorio, y pesan menos de 4,5 Kg (10 libras), menos de 9,1 Kg (20 libras), menos de 13,6 Kg (30 libras), o menos de 18,1 Kg (40 libras). En otro aspecto, todo el sistema portatil para detectar moleculas de acido nucleico diana pesa menos de 9,1 Kg (20 libras), menos de 13,6 Kg (30 libras), menos de 18,1 Kg (40 libras) o menos de 22,7 Kg (50 libras) o menos de 45,4 Kg (100 libras) y esta disenado para un transporte facil.
El sistema portatil y de ensayo puede disenarse para su uso en el espacio o lugar donde se recolecten las muestras y requiere una pequena huella de espacio de trabajo en la mesa (por ejemplo, aproximadamente 25x50cm o menos). En un aspecto, el sistema portatil esta configurado para funcionar sin electricidad, red o agua corriente. El sistema portatil tambien puede funcionar completamente con batenas. El sistema portatil se puede disenar para su uso con el kit descrito, ensayos, con los metodos descritos en la presente memoria. En conjunto, el kit y el sistema portatil proporcionan una manera eficiente y rapida de analizar muestras y detectar muestras de acido nucleico en pafses en desarrollo u otras areas que pueden carecer de equipos de laboratorio sofisticados o instalaciones para analizar muestras de laboratorio.
Se observa que cuando se describen intervalos en la presente memoria, cualquier numero dentro de ese intervalo se contempla en las invenciones descritas en la presente memoria. Los ejemplos siguientes no pretenden limitar el alcance de la invencion. Los ejemplo no estan dentro del alcance de las reivindicaciones y son solamente para fines ilustrativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayo utilizando muestras cervicales y sondas de VPH
Se recogieron un total de 324 muestras cervicales recogidas por un medico en un medio de recogida a base de detergente y se ensayo para detectar la presencia de VPH de alto riesgo.
Una muestra de 1 ml se agito en vortice para homogeneizar la muestra y se retiro una almuota de 50 pl y se combino con 25 pl de reactivo de desnaturalizacion (NaOH 1,75 N) en la microplaca de ensayo. Esto se agito para mezclar y se incubo a 70°C durante 30 minutos para crear ADN de cadena sencilla. A esto se anadieron 40 pl de un tampon de neutralizacion (diluyente de sonda - 2,2 M de BES, 2,6% de PAA, 0,7 N de NaOH y 0,05% de azida sodica) que contema sondas de ARN para 16 tipos de VPH para crear un pH neutro y se incubaron a 68,5°C durante 10 minutos.
Despues de esto, se anadieron 10 pl de perlas paramagneticas conjugadas con anticuerpos (aproximadamente 1 pm de perlas SERADYN carboxiladas de Thermo Fisher) a la reaccion y se incubaron durante 30 minutos adicionales a 68,5°C. Las sondas de ARN y las moleculas diana de ADN que eran complementarias entre sf se unieron y crearon los hnbridos de ARN-ADN. Los hnbridos luego se capturaron por un anticuerpo espedfico hibrido de ARN-ADN recubierto sobre las perlas paramagneticas SERADYN.
Despues de la incubacion, las perlas paramagneticas se separan de la fase lfquida/sobrenadante por exposicion a un campo magnetico. El residuo sobrenadante se elimina por decantacion y se anaden 35 pl de reactivo de deteccion 1 (enzima conjugada de anticuerpo secundario que comprende un anticuerpo hnbrido monoclonal anti- ARN-ADN conjugado con fosfatasa alcalina) y se incuba a 45°C durante 30 minutos. El anticuerpo secundario se une al complejo de perlas paramagneticas conjugado con anticuerpo hnbrido ARN-ADN. El anticuerpo secundario no
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unido se elimina mediante lavado usando un tampon de lavado basado en detergente (Tris 40 mM, pH 8,2, NaCI 100 mM, Triton-X100 al 0,1% y azida sodica al 0,05%).
Un sustrato (sustrato basado en dioxetano de ABI, llamado DCP Star, con potenciador Emerald II) se anade a las perlas lavadas y los pocillos que contienen ADN de VPH de alto riesgo crean luz que es detectable por un luminometro y se mide en RLU (unidades de luz relativa). Se usa un patron positivo de ensayo que contiene 1 pg/ml de ADN de VPH para establecer el punto de corte positivo. Todos los valores RLU de la muestra se dividen por el valor RLU para el estandar positivo que crea un RLU/CO (RLU a valor de corte). Los resultados se dan en RLU/CO y cualquier cosa mayor o igual a 1,0 se considera positiva.
Ejemplo 2: Ensayo de estabilidad
Despues de las pruebas iniciales, las muestras se almacenaron a temperatura ambiente y a 33°C para observar la estabilidad de las muestras. Los ensayos se llevaron a cabo hasta 21 dfas despues de la recogida. Las Figs. 3 y 4 demuestran que el valor RLU/CO para cada muestra no cambia con el tiempo hasta 21 dfas. Un analisis 2x2 que comparo los resultados de la lmea de base con los resultados despues de 21 dfas de almacenamiento y el analisis del diagrama de dispersion demostro la linealidad de los valores rLu/CO con el tiempo. Basandose en estos datos, es posible concluir que las muestras recogidas y almacenadas a temperatura ambiente o 33°C durante 21 dfas proporcionan valores comparables de RLU/CO que los ensayados en la lmea de fondo. Usando la comparacion de modelos lineales mixtos de valores de RLU/CO frente a la temperatura de almacenamiento, los valores de P son 0,8803 para temperatura ambiente y 0,9517 para muestras almacenadas a 33°C indicando que los valores son iguales.
Ejemplo 3: Estudios del lfmite de deteccion
El lfmite de deteccion (LOD) de VPH 16 se midio por dilucion en serie del plasmido diana VPH-16 en el medio de recogida. Los resultados de la prueba demuestran una S/N> 2,0 para un plasmido de VPH 16 de 0,2 pg/ml que es equivalente a 1000 copias de ADN de VPH 16. Vease la FIG. 5. Ademas, se realizaron estudios de estabilidad de tres semanas en muestras clmicas a temperaturas elevadas para imitar las condiciones en un area sometida a temperaturas relativamente elevadas, tal como Ruanda. Todos los componentes del kit biologicamente labiles (sonda de ARN, anticuerpo de captura, conjugado de anticuerpo de deteccion/enzima y sustrato) se estabilizaron como parte del proceso de produccion y se monitorizaron para determinar la estabilidad durante 18 meses a 37°C.
Ejemplo 4: Conversion del granulado SUREPATH y recuperacion de acidos nucleicos
En este ejemplo, se describe el flujo de trabajo tfpico para la conversion de granulados de SUREPATH y la recuperacion de acido nucleico. El flujo de trabajo para los medios de SUREPATH incluye la recoleccion inicial de la muestra primaria, que puede ser utilizada para la recoleccion de celulas del epitelio cervical en una zona de transicion o punto de recogida de muestras. Se recoge un promedio de 2 x 108 celulas cervicales por cepillo, que se pueden conservar en 10 ml de medio SUREPATH en un vial de recogida. El vial se puede sellar y las celulas se incuban en el medio fijador a temperatura ambiente o 4°C hasta que se realice el procesamiento adicional. La suspension de celulas puede someterse luego a un esquema automatizado de purificacion de gradiente de densidad, y el sedimento celular resultante, con un numero de celulas total medio de 1,6 x 108 celulas, puede suspenderse en un volumen final de 1 ml de agua. Este granulo de agua puede denominarse "granulado blando" o "granulado blando no diluido".
200 pL del granulado blando se pueden utilizar en un protocolo de preparacion de portaobjetos automatizado para citologfas, dejando en promedio 1,3 x 108 celulas totales en un volumen de 800 pL. Despues de retirar la almuota de 200 pL para la preparacion del portaobjetos, se pueden anadir 1-2 ml de medio SUREPATH fresco a los restantes 800 pl de granulado blando para estabilizar y conservar el granulado blando en caso de que el portaobjetos deba ser rehecho. En la mayona de los casos, esta muestra de 2-3 ml restante se destruye despues de que se dan los resultados citologicos.
El medio a base de detergente descrito en el presente documento puede anadirse a los restantes 800 pl de granulado blando. Cualquiera de los medios de recogida basados en detergente descritos en el presente documento puede anadirse a los restantes 800 pl de granulado blando. En un aspecto, el medio pueden contener NP-40 al 1,0%, desoxicolato sodico al 0,25%, Tris-HCl 50 mM, EDTA 25 mM, NaCl 150 mM y azida sodica al 0,05%. Despues de la adicion del medio de recogida a base de detergente, la muestra de granulos blandos se puede analizar conjuntamente con cualquiera de los metodos o ensayos descritos en la presente memoria.
Claims (17)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un metodo para determinar la presencia de una molecula de acido nucleico diana en una muestra que incluye:a) suspender una muestra en un medio de recogida que incluye un detergente anionico y un detergente no ionico;b) desnaturalizar una molecula de acido nucleico diana;c) poner en contacto una o mas sondas polinucleoddicas con la molecula de acido nucleico diana en condiciones que permitan que las sondas y la molecula de acido nucleico diana se hibriden o se unan, yd) capturar el Idbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte solido revestido con un primer anticuerpo espedfico para el Idbrido de acido nucleico Idbrido bicatenario.
- 2. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende:a) suspender la muestra en un medio de recogida que comprende un detergente anionico y un detergente no ionico;b) desnaturalizar la molecula de acido nucleico diana;c) poner en contacto una o mas sondas polinucleoddicas con la molecula de acido nucleico diana en condiciones que permitan que las sondas y la molecula de acido nucleico diana se hibriden, formando de este modo un Idbrido de acido nucleico bicatenario;d) capturar el Idbrido de acido nucleico bicatenario sobre un soporte solido revestido con un primer anticuerpo espedfico para el Idbrido de acido nucleico Idbrido bicatenario, formando de este modo un complejo Idbrido de acido nucleico bicatenario/soporte solido;e) separar el complejo Idbrido de acido nucleico bicatenario/soporte solido de un acido nucleico no unido;f) conjugar el complejo con un segundo anticuerpo que sea espedfico para el Idbrido de acido nucleico de doble hebra o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo Idbrido de acido nucleico bicatenario/anticuerpo de soporte solido; en el que el segundo anticuerpo esta marcado con un marcador detectable;g) lavar el complejo de Idbrido de acido nucleico de doble cadena/anticuerpo de soporte solido con un tampon de lavado que comprende un detergente; yti) detectar el marcador en el segundo anticuerpo en el que la deteccion indica la presencia de la molecula de acido nucleico diana.
- 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que el soporte solido comprende perlas magneticas y preferiblemente comprende una perla paramagnetica modificada que esta recubierta o tiene unido a la misma el primer anticuerpo inmunoespedfico para acidos nucleicos Idbridos de doble tiebra y en el que se usa un campo magnetico para separar el complejo de acido nucleico bicatenario-perlas magneticas-anticuerpo del acido nucleico no unido.
- 4. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en el medio de recogida el detergente anionico es desoxicolato sodico y el detergente no ionico es NP-40.
- 5. Una composicion que comprende:(a) una muestra biologica suspendida en un medio de recogida, en el que dido medio de recogida comprende un detergente anionico y un detergente no ionico;(b) un reactivo de desnaturalizacion;(c) al menos una sonda polinucleoddica capaz de unirse a una molecula de acido nucleico diana;(d) un soporte recubierto con un primer anticuerpo antiIdbrido; y(e) un segundo anticuerpo que es espedfico para el Idbrido de acido nucleico bicatenario o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo Idbrido de acido nucleico bicatenario/anticuerpo de soporte solido; en el que el segundo anticuerpo esta marcado con un marcador detectable.
- 6. La composicion de la reivindicacion 5, en la que dido medio de recogida comprende NP-40, desoxicolato sodico y EDTA.
- 7. La composicion de la reivindicacion 5, en la que dido medio de recogida comprende de 0,5 por ciento a 2,0 por ciento de NP-40, de 0,10 por ciento a 0,40 por ciento de desoxicolato de sodio y de 10 nM a 50 mM de EDTA.510152025303540
- 8. La composicion de la reivindicacion 5, en la que dicha al menos una sonda polinucleotfdica se selecciona del grupo que consiste en sondas para tipos de alto riesgo del VPH 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 82.
- 9. Una composicion que comprende:(a) una muestra biologica suspendida en un medio de recogida que comprende de 0,5 por ciento a 2,0 por ciento de NP-40, de 0,10 por ciento a 0,40 por ciento de desoxicolato de sodio y de 10 mM a 50 mM de EDTA y(b) una sonda polinucleotidica; y(c) un soporte recubierto con un primer anticuerpo antihnbrido.
- 10. La composicion segun la reivindicacion 9, que comprende ademas:(d) un segundo anticuerpo que es espedfico para el hnbrido de acido nucleico bicatenario o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo hnbrido de acido nucleico de doble cadena/anticuerpo de soporte solido, en el que dicho segundo anticuerpo esta marcado con un marcador detectable.
- 11. La composicion de la reivindicacion 9, en la que dicho medio de recogida comprende ademas de 0,01 por ciento a 0,10 por ciento de azida sodica.
- 12. La composicion de la reivindicacion 5 o 9, en la que dicha muestra biologica es una muestra de celulas cervicales.
- 13. La composicion de la reivindicacion 5 o 9, en la que dicha muestra biologica es estable cuando se almacena en dicho medio de recogida durante al menos 21 dfas a 33°C.
- 14. La composicion segun la reivindicacion 5 o 9, en la que el soporte recubierto con el primer anticuerpo comprende perlas magneticas.
- 15. Un kit para la deteccion de una molecula de acido nucleico diana en una muestra, que comprende:a) un medio de recogida que comprende un detergente anionico y un detergente no ionico;b) un reactivo de desnaturalizacion;c) un soporte recubierto con un primer anticuerpo anti-hnbrido;d) anticuerpo que es espedfico para el hnbrido de acido nucleico bicatenario o espedfico para el primer anticuerpo para formar un complejo de hnbrido de acido nucleico de doble cadena/anticuerpo de soporte solido, en el que el segundo anticuerpo se marca de forma detectable,e) un tampon de lavado basado en detergente; yf) un segundo reactivo de deteccion que comprende un sustrato para el marcador en el segundo anticuerpo.
- 16. El kit de la reivindicacion 15, en el que dicho kit tiene una de las siguientes caractensticas:a) dicho medio de recogida comprende NP-40, desoxicolato y EDTA,b) dicho medio de recogida comprende NP-40, desoxicolato y EDTA y comprende ademas azida sodica;c) dicho tampon de lavado a base de detergente comprende de 0,5 por ciento a 2,0 por ciento de NP-40, de 0,10 por ciento a 0,40 por ciento de desoxicolato de sodio, de 25 mM a 75 mM de Tris-HCl, de 10 mM a 50 mM de EDTA, de 50 mM a 200 mM de NaCl, y de 0,01 por ciento a 0,10 por ciento de azida sodica;d) dicho tampon de lavado a base de detergente comprende Tris 40 mM, pH 8,2, NaCl 100 mM, Triton X-100 al 0,1 por ciento - 0,5 por ciento y azida sodica al 0,05 por ciento;e) el diluyente comprende BES, acido poliacnlico, NaOH y azida de sodio,f) el reactivo de desnaturalizacion es NaOH 1,75 N.
- 17. El kit de la reivindicacion 15, que comprende ademas al menos una sonda polinucleotidica capaz de unirse al virus del papiloma humano (HPV) y sus variantes geneticas, en donde, preferiblemente, dicha al menos una sonda polinucleotfdica se selecciona del grupo que consiste en sondas para tipos de alto riesgo de HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 82.
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